Физико-химические основы получения гидрогелевых композиций на основе пектина и зеина кукурузы

Насриддинов, Абубакр Саидкулович

Физико-химические основы получения гидрогелевых композиций на основе пектина и зеина кукурузы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Насриддинов, Абубакр Саидкулович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Душанбе МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Физико-химические основы получения гидрогелевых композиций на основе пектина и зеина кукурузы»

Автореферат диссертации на тему "Физико-химические основы получения гидрогелевых композиций на основе пектина и зеина кукурузы"

005017927

На правах рукописи

ІІАСРИДДШІОВ АБУБЛКР САИДКУЛОВИЧ

Физнко-хнмическпс основы получения гндрогелевых композиций на основе пектина и зенна кукурузы

02.00.04 -Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 ДПР 2012

Душанбе -2012

005017927

Работа выполнена в лаборатории «Высокомолекулярные соединения: Института химии им. В.И. Никитина Академии наук Республики Таджикистан.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Мухидинов Зайнидднн Камарович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Исобаев Музафар Джумаевич

кандидат химических наук, доцент Раджабов Умарали Раджабович

Ведущая организация: Таджикский Национальный университет

кафедра физической и коллоидной хими;

Защита диссертации состоится «11» апреля 2012 г. в 12.00 часов і заседании диссертационного совета ДМ 047.003.01 при Институте химі им. В.И. Никитина АН РТ по адресу: 734063, Душанбе, ул. Айни, 299 e-mail: gidchem(a]Iist.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института хими им. В. И. Никитина Академии наук Республики Таджикистан по адресу: 734063, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2.

Автореферат разослан: «10» марта 2012 г.

^(cterf

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук ^ Касымова Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Трехмерно сшитые биополимерные гидрогели являются наиболее привлекательными объектами исследования в качестве носителей активных веществ и гелей-абсорбентов. Благодаря уникальному набору физико-химических свойств, они широко применяются в различных областях медицины, сельского хозяйства, биотехнологии, электроники и т.д.

Уровень организации пористой структуры гидрогелей можно контролировать путем изменения смешанных составов биополимеров, их поперечных связей и способности набухать в различных средах. Путем изменения пористости геля можно достичь эффективности инкапсулирования лекарственных веществ (JIB), пищевых ингредиентов (ПИ) и высвобождения этих веществ из гидрогелевых матриксов посредством контролируемой диффузии. На самом деле, эффективность гидрогелей, в качестве систем доставки JIB (СДЛ), зависит от фармакокинетических параметров ЛВ и ПИ в практических условиях: чем дольше скорость высвобождения, тем эффективнее созданная система.

В настоящее время в рационе питания большинства населения преобладает высокое потребление жиров, Сахаров и углеводов. К тому же, ухудшающаяся экологическая обстановка приводит к резкому увеличению заболеваний желудочно - кишечного тракга (ЖКТ), печени, поджелудочной железы, сердечно - сосудистой системы, заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ (ожирение, сахарный диабет и др.). Следует отметить, что создание носителей JIB и продуктов питания нового поколения в настоящее время немыслимо без применения пищевых и биологически активных добавок, обладающих детоксикационными и радиопротекторными свойствами.

Перспективными исходными реагентами для получения таких гидрогелей являются полисахариды и белки. Разработка физико-химических основ получения функциональных материалов для хранения и упаковки сельскохозяйственных продуктов, и особенно для безопасной доставки J1B в нужный участок организма, представляет чрезвычайно актуальную научно-техническую задачу современной науки.

В связи с этим, изучение физико-химических особенностей формирования комплексов пектина различной природы с зеином кукурузы, для создания новых композиционных систем, способных осуществлять контролируемое высвобождение находящихся в них компонентов, представляет собой актуальную задачу.

Работа проводилась в соответствии с планом НИР Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан «Поиск и создание новых полимерных материалов и биологически активных веществ на базе продуктов синтетического и растительного сырья» (ГР №0106ТД414) и проекта МНТЦ Т-1419.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является физико-химическое обоснование процессов получения гидрогелевых микросфер на основе зеина кукурузы и пектина, с участием сшивающих металлов (кальция и цинка), и изучение диффузии и кинетики высвобождения активного ингредиента из них.

Для выполнения поставленной цели были решены следующие задачи:

• изучено влияние состава растворителя и состояния исходного сырья на выход зеина кукурузы и его физико-химическую характеристику;

• разработаны физико-химические методы анализа компонентного состава зеина;

• изучено формирование пектин-зеиновых гидрогелей на основе различных пектинов и зеина с участием ионов двухвалентных металлов (Са2+ и Zn2+);

• изучено влияние типа пектина, соотношения компонентов на выход гидрогелевых микросфер, степень их набухания и адсорбцию модельного вещества;

• выявлены общие закономерности в выборе оптимальной матрицы-носителя гидрогелевых микросфер с максимальной степенью адсорбции модельного JIB;

• изучены процесс диффузии и кинетика высвобождения модельного JIB из гидрогелевых микросфер.

Научная новизна работы; S впервые, методом турбидиметрического титрования (ТТ) определён фракционный состав зеина кукурузы, указывающий на широкое молеку-лярно-массовое распределение макромолекул зеина и существование пяти макромолекулярных фракций; S методом ТТ и ИК-Фурье спектроскопии изучен процесс формирования комплексов и установлено, что в системе пектин/зеин образуются два типа комплексов: ионотропное, пектин-Са2+- зеин, и лиотропное, посредством электростатического, гидрофобного взаимодействий и коацерва-ции двух биополимеров; ■S найден оптимизированный состав гидрогелей с низкомолекулярным яблочным пектином, пролонгирующий выход лекарств до 48 и более часов, что является важным для доставки ЛВ в кишечник; S на основании кинетических исследований установлено, что с увеличением доли зеина в составе полимерной композиции, диффузия JIB замедляется и она становится лимитирующей стадей высвобождения JIB из матрицы.

Положения, выносимые на защиту:

> физико-химические основы формирования пектин-зеиновых гидрогелей с участием ионов двухвалентных металлов (Са2+ и Zn2+) и пектина из различных источников;

> разработка оптимальных условий для получения гидрогелевых микросфер с максимальной степенью адсорбции модельного JIB;

> изучение процесов диффузии и кинетики высвобождения модельного ЛВ из гидрогелевых микросфер.

Практическая значимость работы. Физико-химические аспекты {юрмирования гидрогелевых композитов на основе низкометилированных НМ)-пектинов и зеина кукурузы способствуют созданию гелеобразующих материалов, природных носителей лекарственных средств и сорбентов, которые могут найти применение в пищевой и фармацевтической отраслях промышленности.

Разработанные методики анализа фракционного состава зеинов кукурузы с применением гель электрофореза и турбидиметрии, могут быть применены при анализе гидрофобных белков из растительного материала.

Метод турбидиметрического титрования, как удобный инструмент, может быть использован для характеристики фракционного состава белков и изучения процесса формирования пектин-белковых комплексов.

Вклад автора в проведенное исследование состоял в подборе и анализе научной литературы, разработке методов анализа, проведении экспериментов, обработке экспериментальных данных, обсуждении и оформлении полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей и 9 тезисов докладов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной науч-прак. конференции «Перспективы развития науки и образования в XX I веке», (Душанбе, 2008г.); The 9th International Hydrocolloids Conference, Singapore, 15-19 June 2008; Международной научной конференции «Современные тенденции в химии полимеров», (Алматы, 2008г.); The 2nd International Symposium on Edible Plant Resources and Bioactive ingredients. Urumqi, China, July 28-August, 2010; The 16th Gum and Stabilisers for the Food Industry, Wageningen, the Nitherlands, 28 -June-l-July, 2011; 14th IUPAC International Symposium on Macromolecular Complexes (MMC), University of Helsinki, Helsinki, Finland, 14-17 August, 2011.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой отечественной и зарубежной литературы, включающего 108 источников. Работа изложена на 100 страницах компьютерного текста, содержит 21 рисунков и 13 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Литературный обзор

Обобщены и проанализированы литературные данные, по характеристике пектинов и зеина кукурузы, формированию и свойствам перекрестно-сшитых гидрогелей и применению биополимерных носителей. На основании существующих теоретических и экспериментальных исследований сформулированы методологические подходы к формированию и свойствам перекрестно-сшитых гидрогелей; гидрогелей на основе пектина и белков как носителей ПИ и ЛВ; поперечно сшитых гидрогелей на основе пектина и ионов двухвалентных металлов Zn2+ и Са2+; применению биополимерных носителей для доставки ЛВ в ЖКТ.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Описаны характеристика исходных материалов, способы очистки и методы контроля степени их чистоты. Приведены методы получения зеина кукурузы и пектинов из растительных материалов и физико-химические методы для их характеристики. Описана процедура формирования гидрогеле-вых микросфер на основе пектина и зеина кукурузы и метод определения молекулярных масс пектинов.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

1. Выделение и характеристика биополимеров

Результаты исследований показали, что в семенах кукурузы, выращенной в условиях Таджикистана, содержится 7.2% общего белка, из них 50% составляют пищевые растительные белки. Установлены оптимальные условия выделения зеина кукурузы с максимальным выходом и растворимого в этаноле.

Показано, что высоковольтный электрофорез в ПААГ при рН 3.1 в присутствие мочевины даёт хорошее разрешение и может быть использован при исследовании компонентного состава зеинов кукурузы.

По дифференциальной кривой турбидиметрического титрования установлено существование пяти макромолекулярных фракций, с узким молеку-лярно-массовым распределением (ММР). Профиль и распределение этих фракций указывают на наличие в зеине двух полипептидов: а-зеина (24 kDa и 26 kDa); у-зеина (22 kDa); Р-зеина (17 kDa) и 5-зеина, соответственно. Таким образом, показано, что для определения ММР протеинов, метод турбидиметрического титрования, может быть альтернативным в сравнении с такими дорогостоящими методами, как гель хроматография, ультрацентрифугирование и светорассеивание.

В работе были использованы пектиновые полисахариды из яблок и подсолнечника, полученные разработанным нами методом быстрого гидролиза-экстракции в автоклаве под давлением, и коммерческие цитрусовые

пектины (CP Kelco, США). Концентрирование и очистку пектиновых веществ при этом проводили методом диа-ультра-фильтрации. Качество пектина определяли путем измерения молекулярной массы методом гель-проникающей хроматографии на хроматографе с высоким разрешением (Waters, USA). Молекулярная масса пектинов определялась одновременно с помощью программного обеспечения ASTRA 5.3.2.15 (Wyatt Ttechnology) и Breez (Waters).

2. Исследование комплексообразования НМ-пектина и зеина кукурузы

Турбидиметрическое титрование зеина пектинами

В работе использовали как ионотропный, так и лиотропный процессы г елеобразования для изучения механизма комплексообразования между зеи-ном кукурузы и НМ-пектинами с помощью турбидиметрического метода.

Ионотропное гелеобразование низкометилированного пектина с участием ионов кальция является основой при создании носителей лекарственных препаратов. Однако высокая степень набухаемости пектина в физиологических условиях может способствовать преждевременному распаду, вследствие расширения размера пор геля. Предотвратить данный процесс можно за счет увеличения водостойкости пектина, которая достигается в комбинации с водостойкими материалами. Одним из таких материалов является спирторастворимый белок зерна кукурузы - зеин.

Наряду с НМ - яблочным пектинам также использовали коммерческий ЦНМ - пектин (GENU LM-12CG из CP Kelco, СЭ 38).

Поскольку зеин растворяется в этаноле, а пектин в воде, мы использовали процесс ионотропного гелеобразования пектина с ионами кальция для вовлечения зеиновых кластеров в матрикс геля.

В данном случае стабилизированные ионами кальция межфазные адсорбционные слои, содержащие зеин и пектиновые цепи, обеспечивают исключительно высокую устойчивость гидрогелей. Для получение гидрогеля, 1,020 г. зеина растворяли в 30 мл этанола (94 %), путем предварительного замачивания порошка зеина для гидратации биополимера в 20 мл этанола подогретого до 40-50°С и промешивали, затем раствор центрифугировали при 6000 об/мин (4300g), объем раствора доводим до 100 мл. Не растворившуюся фракцию белка (около 17%) вычитывали при коррекции концентрации зеина.

Процесс образования комплексов контролировали методами: кондук-тометрии (на приборе WTW GmbH Laboratory pH meter inoLab ph conductivity meter inoLab cond Level 1), pH метрии (на приборе WTW GmbH Laboratory pH-meter inoLab pH Level 1) и турбидиметрии (на приборе 2100 AN IS, HACH, USA). Комплексы получали путём постепенного добавления раствора пектина в 75% раствор этанола, содержащего зеин и хлористый

кальций, при постоянном перемешивании. Количество Са2+ брали в расчёте -25 мг на 1 гр. Пекина. Полученные данные показывают, что образование 3/П комплексов проходит в узком интервале рН.

На рис. 1 представлены дифференциальные кривые турбидиметриче-ского титрования раствора зеина различной концентрации, в присутствии 0,0028% СаС12, 0,1 % раствором пектина.

Рис. 1. Дифференциальные кривые турбидиметрического титрования зеина 0,1% раствором пектина в присутствии 0,0028% СаС12.

Во всех случаях рН растворов уменьшается от 5,5-6,0 до 3,5-4,0, что указывает на связывание ионов кальция в результате высвобождения ионов водорода карбоксильных групп пектина и протеина.

При низкой концентрации зеина появляется лишь слабое помутнение, из-за высокой скорости взаимодействия ионов кальция с полигалактуроно-выми кислотами. С увеличением концентрации зеина и одновременно с уменьшением активности ионов кальция, наблюдается постепенный рост мутности растворов зеин-пектиновых комплексов, который проходит через максимум, указывающий на завершение процесса комплексообразования при оптимальном соотношении зеина и пектина равном 12. Дальнейшее прибавление раствора зеина к раствору пектина приводит к образованию второго пика мутности при соотношении зеина и пектина 27.

На рис. 2. представлены кривые турбидиметрического титрования зеин-пектиновых комплексов в присутствии повышенной концентрации (0 028 %)СаС12.

Как видно, с увеличением концентрации СаС12 на порядок, дифференциальная единица нефелометрического помутнения по отношению к объемной доле пектина (ДТ2/Ду) при концентрации зеина 0,36 значительно увеличивается от 7000 до 11500. В данных условиях второй максимум на кривых исчезает, так как при взаимодействии пектина с кальцием весь зеин вовлекается в комплекс.

В то же время, увеличение концентрации зеина приводит к образованию двух максимумов, указывающих на образование различных комплексов.

ПТ2Л)и

Зеин/Пектин

Максимальная точка здесь появляется при соотношении зеина и пектина 13, для первого типа (пек-тин-Са2+"зеин), и 27, для второго типа (3/П) комплексов.

—Змш- 0,07% -•- Згин- 0,36% -й- Зеті- 0,53%

Рис. 2. Дифференциальные кривые турбндиметрического титрования зеина 0,1% раствором пектина в присутствии 0,028% СаС12.

Бимодальное распределение кривых, вероятно, связано с образованием двух видов комплексов: пектин-Са2+"зеин и 3/П, поскольку при увеличении концентрации зеина (0.53%) наблюдается увеличение интенсивности второго пика. На рисунках также заметен сдвиг максимумов проявления мутности с возрастанием как концентрации зеина, так

и ионов кальция, что связано с регулируемостью процесса гелеоброзования в данной системе.

ХЦ5. ст-1

Рис. 3. Кондуктометрические кривые титрования: верхняя линия 0,1% раствор зеина 0,1% раствором пектина; нижняя - 0,1% раствор пектина 0,1% раствором зеина.

ол

12,5 Звин/Пектин

25,0 тт

На кривых кондуктометрическо-го титрования (рис. 3) не наблюдается резкое изменение электропроводности раствора комплексов, что позволяет предполагать что, комплексообразова-ние происходит не за счёт электростатических взаимодействий, а за счёт ко-ацервации биополимеров.

Таким образом, можно заключить, что методом турбидиметрического итрования, как наиболее простого инструмента для изучения процесса об-іазования пектин-белкового комплекса, дана количественная оценка состава и структуры комплекса. Первый тип пектин-зеинового комплекса образуется I результате электростатического взаимодействия, в основном посредством юперечного связывания кальция с пектиновыми цепями при соотношении еина и пектина до 17. Второй тип, вероятно, формируется путем гидрофоб-

ных взаимодействий или комплексных коацерваций двух биополимеров при соотношении зеина и пектина более 25.

3. Формирование гидрогелевых микросфер на основе зеина и пектина с инкапсулированным лекарственным веществом

А. Гидрогелевые микросферы на основе цитрусового НМ-31 пектина и зеина.

Задача настоящего исследования состояла в разработке условий получения пектин-зеиновых комплексов с инкапсулированным лекарством для возможного их применения в качестве лекарственного средства при лечении кишечных заболеваний.

В работе использовали пектины выделенные из цитрусов: ЦНМ-31 (GENU 12CG-CP Kelco,) и НМ-9 (GENU L/200-CP Kelco); В качестве модельного лекарства использовали нестероидный противовоспалительный препарат пироксикам (РХ). Для получения смешанных гелей также использовали лактоглобулин (Lg), выделенный из молочной сыворотки.

Пектин-зеиновые комплексы формировались путём постепенного добавления раствора пектина к 75% спиртовому раствору зеина, содержащего РХ и СаС12 при комнатной температуре. Количество зеина варьировалось от 50 до 1000 мг, пектина от 200 до 350 мг, РХ 20 мг, во всех экспериментах, за исключением 5 при соотношении 3/П-1.4:1 (200 мг). Полученные комплексы промывали водой, 50% спиртом для удаления несвязанных компонентов и высушивали при 25-30°С до постоянного веса.

Для определения РХ, связанного в комплексы, отбирали 15 мг сухого материала, добавляли 10 мл 75% этанола, содержащего 0.4% NaOH, 0.5% Твин-20, термостатировали при 37° С в течение ночи и в аликвотах по калибровочному графику, построенному по стандартному РХ, определяли общее содержание РХ на спектрофотометре (UV 1 Thermo Spectronic, Англия) при 355 нм.

В табл. 1 представлено соотношение основных компонентов, взятых для формирования комплексов с цитрусовым пектином и их характеристика: вес комплекса, степень набухания и количество связанного РХ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что степень насыщения РХ в комплексах зависит от соотношения 3/П: чем больше зеина в комплексе, тем больше степень связывания РХ.

На рис. 4 показано влияние зеина на выход микросфер, степень их набухания и содержание инкапсулированного РХ. При всех соотношениях 3/П, с увеличением содержания зеина от 1 до 5, эффективность инкапсулирования увеличивается от 9.8 до 93.8 масса.%.

Таблица 1

Соотношение компонентов для получения пектин-зеиновых комплек-____сов н их характеристика__

№ Зеин, СаС12 РХ, Пектин, 3/П V, Выход Степень Кол-во

мг (2%), мг мг соот-е мл компл., набух-я инкапс.

мл % РХ

1 50 1 1.24 20 300 1:6 30 17,5 139.0 12.4

2 100 1.24 20 300 1:3 30 16,7 179.0 9.8

3 250 1.03 20 250 1:1 30 38,5 49.0 37.0

4 500 1.03 20 350 1.4:1 32 46,0 33.2 57.0

5 500 1.03 200 350 1.4:1 32 57,0 13.9 51.7

6 500 1.03 20 250 2:1 30 57,1 19.4 72.6

7 1000 0.83 20 200 5:1 30 65,6 7.5 93.8

В то же время, необходимо отметить, что желаемый эффект не был достигнут при увеличении количества РХ в 10 раз при соотношении 3/П =1.4:1. Это, по-видимому, связано с природой биополимеров и плотностью упаковки гидрофобных участков полимерной цепи. В данном случае можно утверждать, что в образовании комплексов участвуют энтальпийные факторы.

Рис. 4. Зависимость выхода микросфер, степени набухания и содержания РХ от соотношения 3/П.

Следует отметить, что на свойства комплексов протеин/полисахарид оказывают влияние природа биополимеров, их соотношение, молекулярная масса, плотность заряда и ряд других факторов. В случае пектин-зеиновых комплексов следует предполагать, что взаимодействие происходит посредством ионных и водородных связей, поскольку гидрофобные взаимодействия незначительны.

Результаты турбидиметрического титрования в присутствии ионов кальция показали, что с увеличением концентрации СаС12 весь зеин вовлекается в комплекс. В то же время с увеличением концентрации зеина образуются два типа комплексов: пектин-Са2+- зеин и 3/П. Первый тип образуется, возможно, в результате электростатического взаимодействия, за счет поперечного связывания Са2+ с пектиновыми цепями. Второй тип, вероятно, пу-

Выход комплекса -100 -

80 -

- РХ в комплексе -

- Набухания

=г

о. 60

40 -

1 2 3 4 5 3/П Соотношение

тем слабых гидрофобных взаимодействий или коацервации двух биополимеров.

Как известно, одним из важных показателей для эффективного капсу-лирования лекарственного средства является степень набухания комплексов. Результаты наших исследований показали (табл. 1), что степень набухания зависит от соотношения зеина и пектина в комплексе: чем выше соотношение 3/П, тем больше степень набухания. Высокая степень набухания отмечалась в комплексах с соотношением 3/П = 1:6 и 1:3. Предполагается, что данные комплексы будут проявлять кинетику преждевременного распада с высвобождением лекарственного средства в условиях ЖКТ. Чем выше содержание зеина, тем ниже степень набухания, при этом вес комплексов заметно увеличивается. Наиболее оптимальными соотношениями 3/П являются — 1.4:1 и 2:1. Необходимо отметить, что для доставки лекарственного средства в область прямой кишки требуется, чтобы инкапсулированное лекарство оставалось неповрежденным в верхней части ЖКТ и белковый мат-рикс был защищен от воздействия протеаз.

Для получения комплексов с инкапсулированным лекарством, стойких в верхней части ЖКТ, нами осуществлялась модификация экспериментов путем изменения соотношения 3/П, концентрации сшивающих металлов, РХ и технологии получения комплексов. С этой целью комплексы формировались путем добавления раствора пектина, содержащего РХ к 75%-му спиртовому раствору зеина, содержащего СаС12 или 2п804, причем РХ и сшивающие металлы брали вдвое больше.

В. Гидрогелевые микросферы на основе цитрусового НМ-9 пектина и зеина

В данной части работы в качестве НМ пектина использовали выскомо-лекулярный цитрусовый НМ-9 пектин. Для сравнительной оценки в ряде экспериментов, ионы кальция заменяли на ионы цинка. Были получены также смешанные комплексы, включающие лактоглобулин — З/П/Т^. В этом случае к раствору пектина с РХ добавляли и эту смесь, по каплям, приливали к спиртовому раствору зеина с СаС12 и без СаС12. Полученные, таким образом, гидрогелевые комплексы промывали трижды 50% спиртом и высушивали. Содержание инкапсулированного РХ определяли последовательной экстракцией 75% этанолом и фосфатным буфером при рН 6.4. В табл. 2 представлено содержание основных компонентов для получения комплексов, содержащих пектин, зеин с инкапсулированным РХ.

3/П микросферы формировались двумя способами: а) путём добавления раствора пектина (12мл) к 75 об.% спиртовому раствору зеина (15мл), содержащему РХ и СаС12 (из расчета 30 мг Са2+ на 1 г пектина) при комнатной температуре и перемешивании; б) путем прикапывания водного раствора пектина (12 мл), содержащего РХ в Змл 75 об.% спирта к 13 мл

смеси 75 об.% спиртового раствора зеина и солей двухвалентных металлов (СаС12, ZnS04), причем РХ и сшивающие металлы брали вдвое больше. Концентрация зеина варьировалась от 50 до 1000 мг, пектина от 200 до 350 мг, РХ - 20 и 50 мг, во всех экспериментах, за исключением комплекса с соотношением 3/П =1.4:1, где РХ брали в избытке (200 мг). Полученные комплексы промывали водой, 50 об.% этанолом, для удаления несвязанных компонентов, и высушивали при 25-30°С до постоянного веса.

Таблица 2

3/П гидрогелевые микрокапсулы на основе цитрусового НМ-9 пектина

3/П, мас- М2\% РХ, Выход Степень Сод-e РХ

саовое Са2+ Zn2+ мг геля, набухания в компл-се,

соотн-е % %

2:1 3.70 50 66.70 13.69 75.80

1:3 3.56 50 64.20 29.10 81.80

1.2:1 2.02 50 46.60 21.00 95.20

1:1 1.26 50 34.50 11.50 66.00

1:1 2.44 50 76.30 10.33 66.00

1:1 2.57 20 35.70 11.00 53.30

1:3 1.85 50 61.20 31.10 86.00

1:2 1.08 50 28.60 19.50 52.80

1.2:1 1.27 50 45.00 16.00 80.60

3:1 1.08 50 34.50 5.80 80.60

Количество РХ связанного в комплексы, определяли по калибровочному графику, построенному по стандартному РХ, на спектрофотометре при 355 нм, по ранее описанному методу. Полученные микросферы отличались по структуре в зависимости от свойств пектинов. Были получены хорошо сформированные гидрогелевые микросферы, в форме шариков (табл. 2).

На рис. 5 продемонстриро-

100

я 8.

в 50

—Ф-Вьгжд комплекса -И-Пироксикам в юмп. -А—Степень набухания^

Соотношение 3/П

ван характер изменения основных параметров гидрогелевых микросфер, полученных на основе цитрусового пектина НМ-9.

Рис. 5. Зависимость выхода комплекса, в присутствии ионов Саг+, степени набухания и содержания РХ от соотношения 3/П.

Полученные данные показывают, что регулируя содержанием

ионов Са2+, можно получать комплексы с оптимальным выходом и высокой степенью инкапсулирования JIB.

Как видно, при высоком содержании одного из биополимеров, выход комплексов и содержание РХ имеют максимальные значения; а при равных соотношениях, эти параметры проходят через минимум.Как и в комплексах с цитрусовым НМ-31 пектином, полученных по первому способу, в данном случае степень набухания микросфер уменьшается с увеличением массовой доли зеина.

На рис. 6 показано влияние количества ионов Са2+ в микросферах, с соотношением 3/П 1:1, на выход и содержание адсорбированного РХ. Как видно, максимальный выход комплекса наблюдается при содержании Са2+

2,02% , в то время как РХ больше адсорбируется при увеличении ионов Са2+ до 2,44%.

о. в

о а

Выход комплекса РХ в комплексе

Са2+, %

Рис. 6. Влияние количества ионов Са2+ на выход гидрогеле-вых микросфер и содержание инкапсулированного РХ: пектин цитрусовый НМ-9; соотношение 3/П = 1:1.

При замене ионов Са2+ на

ионы гп (3/П = 1.2 и 3) масса гидрогелевых микросфер уменьшается незначительно, а степень насыщения РХ при соотношении 3/П 1.2 понижается от 95 до 80 масса %; а с увеличением доли пектина (3/П 1:3), наоборот, увеличивается от 81 до 86 масс. % (рис. 7).

100

Я о а.

-♦-выход комплекса

пироксикам в комп. " Степень набухания комп.

0,0

1,3

Соотношеие 3/П

2,5

Рис. 7. Зависимость выхода микросфер, степени набухания и содержания РХ от соотношения 3/П: пектин цитрусовый — НМ-9, сшивающий металл Zn2+.

В данном случае, как

видно, характер изменения кривых такой же, как и на рис 5. за исключением значения степени набухания. Полученные данные подтверждают предположение о том, что ионы гп2+, по сравнению с ионами Са2+, как сшивающие металлы, способствуют образованию более компактной структуры с пекти-

ном, что представляется важным при создании носителей JIB стойких к деградации в верхней части ЖКТ.

С. Гидрогелевые микросферы на основе яблочных ВМ- и НМ-псктинов и зенна.

3/П микросферы с ВМ-ЯПМ и НМ-ЯПШ яблочными пектинами с соотношением 3/П 1:2, 1:1 и 6:1, были получены при аналогичных условиях. Из данных табл. 3 следует, что комплексы с ВМ-ЯПМ пектином отличались большим весом и степенью набухания.

Из представленных данных, очевидно, что с увеличением содержания ионов Са2+ в реакционной смеси повышался выход микросфер. При замене ионов Са2+ на ионы Zn2+, степень насыщения микросфер ЛВ при соотношении 3/П 1:1 заметно увеличивалась, при этом выход несколько уменьшался, что подтверждает об образовании различных по структуре комплексов.

Как видно, с увеличением доли зеина в комплексе, количество захваченного ЛВ, также как в предыдущих случаях, проходит через минимум, а затем увеличивается, хотя выход микросфер на основе яблочного НМ-ЯПШ пектина заметно уменьшается. Однако, по сравнению с микросферами, полученные на основе цитрусового НМ-9 пектина, выход микросфер и содержание РХ с яблочным пектином почти в два раза меньше.

Таблица 3

3/П гидрогелевые микросферы на основе яблочных пектинов

(ВМ-ЯПМ и НМ-ЯПШ) и их характеристика _

3/П, Тип м2+,% РХ, Выход Степень Сод-е РХ

массо- пектина Са Zn2+ мг геля, % набух-я в геле,

вое со- %

отн-е

1:2 ВМ-ЯПМ 1,78 20 26,50 26.14 58.75

1:1 ВМ-ЯПМ 2,57 20 36,30 27.74 32.50

6:1 ВМ-ЯПМ 3,52 20 43,90 30.16 39.00

1:2 НМ-ЯПШ 1,78 20 30,90 5,25 66.00

1:1 НМ-ЯПШ 2,57 20 33,90 8,94 61.10

1:1 НМ-ЯПШ 1,62 20 25,00 16.71 71.50

1:6 НМ-ЯПШ 3,52 20 29,30 22.70 70.20

Степень связывания РХ в комплексы на основе НМ яблочного пектина НМ-ЯПШ в присутствии ионов двухвалентных металлов была больше, чем у ВМ-ЯПМ пектина. Эти отличия, как уже отмечалось, связаны с особенностями структуры полисахарида, образующего с зеином коацерваты, способные захватывать ЛВ.

Если при формировании микросфер с использованием НМ-пектинов комплексы образуются, в основном, за счет поперечных связей с ионами

двухвалентных металлов, то в случае с ВМ-пектином, за счет гидрофобнь взаимодействий биополимеров. Это гипотеза подтверждается исчезновен] ем полосы в области 1745 см"1 в ИК спектрах комплекса (рис.8), котору относят к валентным колебаниям карбонильных групп метилированнь карбоксильных групп пектина (-СООСН3). Анализ ИК-Фурье спектров 3/ комплекса показал, что участие -СН3 группы в формировании комплекса с< провождается расширением соответствующих полос валентных колебаний, именно, 2928 и 2966 см"1 для -СН3 группы, а также усиление эфирных (С-С С, валентных колебаний) групп в области 1115 см"1.

Таким образом, в результате исследований определены оптимальнь условия получения микросфер на основе природных биополимеров - пеюп на и зеина с инкапсулированным ЛВ. Показано, что на процесс образован! комплексов, степень насыщения микросфер лекарством влияют приро; биополимеров, ИХ соотношение, присутствие двухвалентных металлов И М1 лекулярная масса пектина.

Рис. 8. ИК Фуре спектры комплекса зеин /пектин 1:1- (1); Зеина (CAS9010 Sigma) -(2) и пектина ПВШ-40-(3)

При формировании микросфер с использованием НМ-пектинов кої плексы образуются, в основном, за счет поперечных связей с ионами дву валентных металлов, а в случае с ВМ-пектином, за счет гидрофобных взаі модействий биополимеров. В результате получен ряд микросфер, на осної биоразрушающихся и биосовместимых полимеров - пектина и зеина, коті рые могут найти применение при создании носителей J1B с контролируемы высвобождением.

4. Оценка процесса диффузии и кинетики высвобождения активного ингредиента из гидрогелей на основе различных пектинов и зеина

Как показали предыдущие исследования фармакокинетики данных систем, разработанные гидрогели открывают широкие возможности для использования их в качестве носителей лекарств, позволяющих уменьшить курсовую дозу и частоту проявлений побочных эффектов.

Одна из основных задач данной работы заключалась в исследовании процесса диффузии и кинетики высвобождения модельного лекарства из разработанных нами гидрогелей в виде микросфер на основе пектин - зеино-вых комплексов, поперечно сшитых ионами двухвалентных металлов, в кислых и щелочных средах.

Получение таких комплексов основывалось на идее создания целенаправленной системы доставки ЛВ, которая обеспечит целостность его в кислой (физиологической среде желудка) и щелочной (среда тонкой кишки) средах. Механизм действия такой системы основан на том, что пектин, стабилизированный поперечными связями ионами металла, способен защитить протеин от воздействия протеаз в верхней части ЖКТ. Зеин, в свою очередь, располагаясь на поверхности и внутри полимерной сетки, будет препятствовать набуханию пектинового геля и быстрому высвобозвдению лекарства. Однако следует учитывать, что скорость диффузии лекарства будет также зависеть от типа пектина и пектин-протеинового взаимодействия, плотности упаковки полимерной цепи и структуры самих биополимеров.

Для исследования кинетики процесса были приготовлены буферы с рН 1.2 (НС1/ КС1 0.2М) и рН 6.4 (0.2М фосфатный буфер). Высушенные комплексы помещали в диализные мешки в количествах 50 мг, заливали 50 мл буфера рН 1.2 и рН 6.4 и помещали в прибор для определения растворимости ЛВ при 37°С. Через определённые промежутки времени замеряли на спектрофотометре, экстинкцию растворов при 355 нм и по калибровочному графику, построенному по стандартному РХ, определяли количество высвобожденного лекарства (М^. Общее количество вовлеченного лекарства в гидрогелевые комплексы (Мо), определяли, как описано в работе.

Представляло интерес исследовать способность данных систем сдерживать влияние протеаз во время прохождения через верхнюю часть ЖКТ. С этой целью изучалась кинетика выхода РХ, из полученных 3/П микросфер, в искусственно созданной среде желудка и кишечника.

На рис. 9. представлена кинетика высвобождения РХ из 3/П микросфер с высоким и низким содержанием цитрусового пектина в условиях, моделирующих среду желудка.

Известно, что ЛВ, адсорбированный на поверхности геля пектината кальция, практически полностью высвобождается за короткий период времени. Видно, что добавление зеина - гидрофобного полимера, несколько замедляет выход модельного вещества-РХ. Полученные результаты подтвер-

ждают представленную выше точку зрения: из микросфер с высоким соотношением пектина 3/П (1:6 и 1:3) высвобождалось около 40-50 вес. % РХ в

первые 6 часов инкубации в среде желудка, а оставшееся JIB при этих условиях, высвобождалось по линейному механизму.

Рис. 9. Кинетика высвобождения РХ из 3/П микросфер на основе цитрусового пектина НМ-31 при рН 1.2

и -,-,-,-j-:-,

О 5 10 15 20 25 Это ГОВОрИТ О ТОМ, ЧТО

t,4ac гидрогели формировались как

за счет поперечных связей пектин-Са2+, так и за счет гидрофобных взаимодействий пектина с зеином.

С увеличением зеина в составе полимерной композиции (3/П 1:1, 1.4:1, 2:1, 5:1) диффузия ЛВ замедляется и только 20 вес. % РХ десорбируется за тот же промежуток времени, остальная часть из микросфер высвобождалась по линейному механизму.

Рис. 10. Кинетика высвобождения РХ из 3/П микросфер на основе цитрусового пектина НМ-31 при рН 6.4.

Несмотря на высокое содержание зеина, гидрогели не подвергались воздействию фермента, присутствующего в составе исследуемой среды.

При инкубации гидрогелевых микросфер в фосфатном буфера, рН 6.4, соответствующего среде толстого отдела кишечника, наблюдаются небольшие изменения только в начачьном периоде времени и кинетические кривые имеют линейный характер, затем изменяются со временем (рис. 10).

Количество высвободившегося ЛВ выше, чем при рН 1.2 и достигает 55-75% от общего количества адсобированного ЛВ. Заметное отличие наблюдается для микросфер 3/П с соотношением 1:1. Если количество высвободившегося ЛВ при рН 1.2 составляло 38% за 24 часа инкубации, то за этот же промежуток времени выход ЛВ при рН 6.4 достигает 72%.

0,8 0,7 -0,6 0,5

5 0,3 0,2 0,1

-*-3/П_1:6 -Н-3/П_1.4:1

-»-В/П 1:3

-*-3/П_1:1 -*-3/П_5:1

t час

Можно предполагать, что РХ адсорбируется на поверхности пектинового геля, а не внутри зеиновых кластеров. В данном случае механизм высвобождения JIB в основном определятся степенью набухания гидрогелей. Замедленный выход ЛВ связан с стерическим препятствием молекул свободного зеина и связанного с пектином: чем больше их в гидрогеле, тем медленнее высвобождается ЛВ.

Кинетика высвобождения РХ из 3/П комплексов с низкомолекулярным яблочным пектином НМ-40, сформированных ионами Са2+ и Zn представлена на рис. 11. 1,оо

•*-3/П(1:1)Са —3/n(2:l)Zn

t, час

Рис. 11. Кинетика высвобождения РХ из пектнн-зенповых микросфер на основе яблочного пектина НМ-40 при рН 1.2 (до 3 часов, рН 1.2) и рН 6.4 (от 3 до 36 часов).

По сравнению с ранее изученными комплексами, включающими высокомолекулярные пектины, кинетика выхода ЛВ из данной системы при рН 6.4 имела прямолинейный характер, что соответствует кинетики выхода по механизму нулевого порядка. Общее количество РХ высвобожденное из гидрогелевых комплексов составляло менее 20 вес % после 8 часовой инкубации в условиях, моделирующих среду ЖКТ.

Таким образом, гидрогели с низкомолекулярным НМ-40 яблочным пектином, по сравнению с гидрогелями на основе цитрусового пектина, пролонгировали выход ЛВ до 48 и более часов, что является важным для доставки большинство ЛВ в кишечник.

Кинетика процессов, протекающих в системах гидрогель-раствор, представляет собой один из самых сложных разделов физической химии полимерных систем. Устоявшихся теорий в области изучения кинетики набухания гидрогелей, существует не так много. Сложность количественного описания кинетики высвобождения ЛВ связана с необходимостью учета специфики состояния полимерной композиции, т.е. ее структуры и морфологии. Более того, среди научных и патентных публикаций в указанной области лишь крайне ограниченное число работ описывает транспорт в терапевтических матрицах, полученных из смесевых композиций.

Количественная оценка процесса высвобождения ЛВ из СДЛ на основе цитрусового пектинов НМ-31 проводилась путем анализа данных, с использованием классического уравнения для реакции первого порядка.

Хигуши разрабатывал модель для диффузного высвобождения препарата из пористой матрицы, при условии, когда препарат находится в избытке.

й = (1) где: 2 количество высвободившегося ЛВ, к- константа и / -время. В этой псевдо установившейся модели мы предполагаем, что растворение препарата не влияет на скорость его высвобождения; то есть, выход препарата можно контролировать процессом диффузии во внешний раствор являющимся относительно быстрым. Для системы с полным погружением,' где общая концентрация раствора не равна нулю, кинетическое уравнение имеет кубическую форму:

/=тг=3 К/'1 - 3 (К/пу+(К/'У ма

(2)

где: ^ фракция материала, выпущенного во времени 1 и Кг константа скорости выпуска. Это выражение может быть преобразован в линейной форме:

Значение константы скорости высвобождения препарата находят графически из наклона кривой, характеризующей линейную зависимость левой части вышеупомянутого выраже-

а-л)1'3 1,20

0,60

1,000

3,000 Г1/2

5,000

ния, как функции квадратного корня времени (рис. 12 и 13).

Рис. 12. Зависимость (Ы,)"3 от квадратного корня времени для цитрусового пектина НМ-31 при рН 1.2.

Полученные, таким образом, константы скорости выхода ЛВ представлены в табл. 4-6.

Таблица 4

„ ж аилиц

Уравнение прямой линии и значения константы скорости выхода ЛВ из

Зеин/Пектин Уравнение (1-/,)"3=1 -к/п Я2 Кг*102ч-"2

5:1 у = -0,0148х + 0,9836 0,8903 1.49

2:1 у = -0,0132х +0,9458 0,9339 1.32

1.4:1 у = -0,0153х+ 1,0005 0,9123 1.50

1:1 у =-0,0241х +0,9509 0,8810 2.41

1:3 у = -0,0481х + 0,9118 0,8767 4.81

1:6 у = -0,0732х + 0,9847 0,8687 7.32

Таблица 5

Уравнение прямой линии н значения константы скорости выхода ЛВ

Зеин/Пектин Уравнение (1-/,?" = \-к/п R2 Кг *102 ч-1/2

5:1 у = -0,0325х + 0,9656 0,8219 3.25

2:1 у = -0,0232х + 0,9293 0,8713 2.32

1.4:1 у =-0,0281х +0,9629 0,8626 2.81

1:1 у =-0,0711х +0,9699 0,8308 7.11

1:3 у = -0,0771х +0,9309 0,8865 7.71

1:6 у = -0,0744х + 0,8846 0,8758 7.44

Таблица 6

Уравнение прямой линии и значения константы скорости выхода ЛВ из

Зеин/Пектин Уравнение (1-/)'" =\-к/п R* Кг *102 ч-1/2

2:1 у = -0,0148х+ 1,0184 0,9707 1.48

1:1 у = -0,0454х + 1,0592 0,9750 4.54

1:6 у = -0,0181х+ 1,0207 0,9919 1.81

Выход ЛВ в кислой среде рН 1.2 несколько меньше, чем в щелочной (рН 6.4), что указывает на влияние набухания полимерной цепи, в данном случае пектина, в матриксе гидрогеля на процесс диффузии ЛВ.

Рассчитанные параметры кинетики транспорта РХ из выбранных 3/П

микросфер на основе цитрусо-вого-НМ31 и яблочного-НМ40 пектинов находятся в полном соответствии с уравнением (3).

Рис. 13. Зависимость (l-f,)1/3 от квадратного корня времени для яблочного пектина НМ-40 при рН 1.2.

Зависимость фракции вы-t-v* шедшего ЛВ из гидрогелей от

корня квадратного времени имеет линейный характер, с коэффициентам корреляции 0.86-0.99. Это указывает на диффузионный характер процесса высвобождения активного ингредиента из гидрогелевых микросфер.

На рис. 14 представлена зависимость константы скорости высвобождения РХ (уравнение 3) из пектин-зеиновых микросфер на основе цитрусового пектина НМ-31 при рН 1.2 и 6.4. Вклад степени набухания пектиновых цепей, четко продемонстрирован на примере зависимости константы скорости

выхода JIB из гидрогелей с 10 цитрусовым НМ 31 пекти-

ном.

? 5

«рН12 У= 1,0735х+ 1,0995

R' = 0,9793 * рН 6.4 У = -0,4484x2+ 3,6738х+ 1,4152 R" = 0,7845

Рис. 14. Зависимость константы высвобождения РХ (уравнение 3) из микросфер на основе цитрусового пектина НМ-31 от соотношения пектин/зеина.

0,0

4,0

Пестин/Зеин

8,0

Из кривых зависимости константы выхода активного ингредиента из микросфер на основе цитрусового пектина НМ-31 в исследуемых средах, представленного на рис. 14, четко видно, что константа скорости выхода РХ из изученных СДЛ прямолинейно возрастает с увеличением доли пектина в гидрогелях, но описывается различными уравнениями. У яблочного пектина этот вклад заметно сказывается, почти на порядок, на увеличение константы скорости выхода JIB, при контакте гидрогелей с щелочной средой, приводящей к диссоциации свободных карбоксильных групп, что способствовало набуханию цепей и диффузии JIB во внешний раствор.

Для анализа выхода JIB из СДЛ на основе яболчного пектина быль применен уравнение кинетики нулевого порядка (4).

«г*' -

где, kd -константа выхода JIB.

Оценка применимости уравнение (4) доказано определением коэффициента достоверности (R2) для гидрогелей НМ-ЯПШ и представлены в табл.7. Хорошая достоверность уравнение (4) с коэффициентом Rb>0,90 указывает на справедливость примененого моделя, описывающий уревнением процесса выхода JIB по механизму нулевого порядка.

Почти одинаковые скорости высвобождения ЛВ из гидрогелей на основе яблочного пектина указывают на преимущественном образования зеин-пектинового комплекса по сравнению с гидрогелями с цитрусовыми НМ-пектинов, а также вклада дифузии и релаксации полимерного матрикса в данном случае.

Таблица 7

Уравнение прямой линии и значения константы скорости выхода JIB из

Зеин/Пектин Уравнение = kjt) M<xi R kj*l02 ч-1

1:6 у = 0,0203х + 0,3224 0,9135 2.03

1:1 у = 0,0192х +0,3324 0,9264 1.92

2:1 у = -0,1227х +0,3329 0,9332 2.01

Диффузия адсорбированных веществ в полимерном матриксе зависит от множества факторов, включая морфологию сети, состав и набухание полимеров, содержание воды, концентрацию растворенных веществ и др. В случае с пектином, также и от природы иона двухвалентного металла, образующего поперечные связи с цепочками пектина. Эти основополагающие факторы могут комбинироваться, вызывая химическое или физическое влияние, замедляющее диффузию растворенного вещества.

Учитывая, что механизм высвобождения JIB зависит от структуры полимерной композиции, ее физического состояния, которые в свою очередь зависят от соотношения биополимеров, проводили оценку механизма диффузии JIB по уравнению Ритгер-Пеппаса:

M/M„=k,f (5)

где: к 1 переменная константа, п константа характеризирующая коэффициент диффузии и механизм транспорта JIB. Это уравнение используется для оценки совместного (парного) вклада диффузии, подчиняющегося закону Фика и высокоэластичной релаксации полимерной системы. При л=0.5 она диффузионная, при л>0.5 показывает аномальный транспорт, не подчиняющийся закону Фика, при /1=1.0 предполагает релаксационно-контролируемый транспорт, или так называемый «случай И» .

С целью приближения результатов в реальных условиях при транспорте JIB в ЖКТ решение уравнения (5) проводили также для двух участков кинетических кривых: для малого времени эксперимента, до 4 часов инкубации в среде желудка (рН 1.2), и для большего времени, после 5 часов инкубации в среде кишечника. Значения параметров Кг и я, полученные таким образом, разделились при условии М/Мж<0.5 и Mt/Mo>0.5 (табл. 8).

На основе анализа механизм высвобождения JIB, с использованием полученных результатов, можно сделать вывод, что десорбция РХ в кислых условиях (рН 1.2) при малом времени, только из микросфер при соотношении 3/П 3:1, носит диффузионный характер (п=0.54), в то время как при других изученных соотношениях 3/П, указывает на аномальный характер диффузии слабо подчиняющийся закону Фика.

С увеличением рН среды (6.4) происходит ионизация свободных карбоксильных групп биополимеров, приводящая к набуханию полимерной

сетки, поэтому в механизм десорбции JIB при кишечном моделировании, кроме того, вносят свой вклад также релаксационные эффекты. В данных условиях Mt/M„>0.5 механизм высвобождения JIB носит только диффузионный характер и изменяется от соотношения 3/П (табл. 8). Однако рост константы диффузии, вероятно, связан со степенью заполнения гидро-гелевых носителей: с возрастанием количества РХ в гидрогелях скорость диффузии растет.

Таблица 8

Параметры уравнения (5), К, и и для 3/П микросфер, полученных на основе цитрусового пектина НМ-31 при рН, моделирующих

Зеин/Пектин РХ в компл., % М,/Мм<0.5, рН 1,2 Mt/Mo>0.5,pH 6,4

k*102, min1 п R2 к*102, min"1 п R2

1:6 12.4 1.32 0.69 0.99 0.47 0.08 0.92

1:3 19.8 1.48 0.54 0.99 0.93 0.16 0.85

1:1 37.0 1.70 0.67 0.99 1.05 0.18 0.73

2:1 72.6 1.75 0.60 0.92 1.47 0.24 0.80

5:1 93.8 1.50 0.62 0.99 1.52 0.24 0.95

На основе анализа представленных результатов можно предполагать, что РХ адсорбированный на поверхности микросфер будет высвобождаться в первые часы инкубации по механизму диффузии и растворения ЛВ независимо от рН среды. Высокая степень высвобождения происходит вследствие релаксации полимерной сетки при воздействии напряжения в процессе набухания полимера в условиях среды. Кроме того, гидрофобные взаимодействия протеина с РХ должны еще больше замедлять выход ЛВ из полимерной сетки. С увеличением содержания зеина, при рН 1.2, должны усиливаться релаксационные процессы полимерной сетки за счет ионизации аминогрупп, однако этот процесс, из-за малого количества аминогруп в зеине, заметного влияния на скорость диффузии не оказывает. В то время как при рН 6.4, с увеличением доли зеина, наблюдается рост скорости диффузии как из-за высокой степени заполнения гидрогелей РХ, так и за счет ионизации карбоксильных групп (в основном пектина). Необходимо отметить, что в микросферах с большим содержанием зеина, высвобождение ЛВ происходит скорее по механизму кооперативной десорбции: чем больше степень заполнения ЛВ микросфер, тем больше скорость диффузии.

Наблюдаемая двухступенчатая скорость высвобождения РХ из комплексов обусловлена, вероятно, различным механизмом взаимодействия РХ с пектином и зеином, который был показан ранее.

Таким образом, на основании кинетических исследований, установлен процесс формирования зеин-пектиновых гидрогелей с различными пектина-

ми, выявлен механизм процесса высвобождения модельного JIB из них, путем изменения типа и соотношением биополимеров, что позволяет регулировать скоростью диффузии и является необходимым при создании матричных пролонгированных систем для контролируемого высвобождения JIB. Установлено, что лимитирующую роль в процессе высвобождения РХ из гидрогелевых микросфер играет диффузия терапевтического агента в матрице, что подтверждается низкой величиной экспонента в уравнении Ритге-ра-Пепасса.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения комплексов в виде гидрогелевых микросфер, стабилизированных поперечными связями ионами металла и гидрофобными участками зеина, способных защитить JIB от воздействия кислой среды верхней части ЖКТ, и препятствующих набуханию пектинового геля.

2. Впервые, методом турбидиметрического титрования определён фракционный состава зеина кукурузы, который указывает на широкое молеку-лярно-массовое распределение макромолекул зеина и наличие пяти макромолекулярных фракций.

3. Методом ТТ и ИК-Фурье спектроскопии установлено, что в системе зе-ин/пектин образуются два типа комплексов: ионотропное, пектин-Са -зеин, и лиотропное, посредством электростатического и гидрофобного взаимодействий или коацервации двух биополимеров.

4. Установлено, что выход и степень насыщения комплексов JIB зависит от соотношения 3/П: чем больше зеина в комплексе, тем больше степень связывания J1B.

5. Найдены оптимизированные составы гидрогелей с низкомолекулярным НМ-40 яблочным пектином, которые в сравнении с гидрогелями на основе цитрусового пектина, пролонгировали выход лекарств до 48 и более часов, что является важным для доставки протеиновых лекарств в кишечник.

6. На основании кинетических исследований установлено, что при замене ионов кальция ионами цинка и введение в полимерный матрикс гидрофобного полимера, диффузия JIB замедляется, что подтверждается низкой величиной экспонента в уравнении Ритгера-Пепасса.

7. На основе анализа кинетических данных, выявлен механизм процесса высвобождения модельного JIB из гидрогелевых 3/П микросфер в кислых и щелочных растворах, что позволяет регулировать скоростью диффузии.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Мухидинов З.К., Насридцинов А.С., Штанчаев А.Ш., Тешаев Х.И., Xai ков Д.Х. Турбидиметрическое титрование зеина кукурузной муки // } клады АН РТ. 2007. т. 9. №50, С. 725-730.

2. Мухидинов З.К., Насридцинов А.С., Усманова С.Р. Штанчаев А.Ш., ' шаев Х.И. Халиков Д.Х., Образование Зеин-Пектиновых комплексе! Материалы III Международной науч.-прак. конф. «Перспективы развт науки и образования в XX I веке». Душанбе-2008.. С. 170-173.

3. Muhiddinov Z.K., Khalikov D.Kh, Teshaev Kh.I. and Nasriddinov A.S. So Hydrodynamic Properties of Pectin in Dilute Solution// The 9th Internatio Hydrocolloids Conference. 15-19 June 2008, Singapore, p. 47-48.

4. Мухидинов 3.K., Fisman M.L., Горшкова P.M., Насридцинов A.C., Xai ков Д.Х. Молекулярная масса пектинов, полученных в автоклаве // > мический журнал Казахстана. 2008, Алматы. № специальный выщ (21). С. 60-65.

5. Мухидинов З.К., Штанчаев А.Ш, Насридцинов А.С., Бобокалонов Д. Тешаев Х.И. Ха-ликов Д.Х. Нерастворимые комплексы белков молочи сыворотки с различными пектинами // Доклады АН РТ. 2008. т. 8. № С. 607-614.

6. Мухидинов 3. К., Касымова Г.Ф., Бобокалонов Д.Т., Насридцинов А. Халиков Д.Х, Тешаев Х.И., Лин-Шу Лиу. Гидрогелевые микросферы основе биоразрушающих полимеров, как носители лекарственн средств. // Изв АН РТ. отделение физико-математических, химических, г логических и технических наук. 2009. №1 (134). С. 59-65.

7. Muhiddinov Z.K., Nasriddinov A.S., Kasivova G. F., Jonmurodov A. S., 1 L.S. Composites from corn zein and different pectin for nutrient and drug < livery // The 2nd International Symposium on Edible Plan Resources and 1 Bioactive Ingredients. Urumqi China July 28-August, 2010. p. 153-154.

8. Muhiddinov Z.K., Fishman M. L., Avloev Kh. Kh., Norova M. Т., Nasrid nov A.S. and Khalikov D. Kh. Effect of Temperature on the Intrinsic Viscos and Conformation of Different Pectins // Polymer Science,2010 (NATUR POLYMERS) Ser.A, 2010 . №52, 12. C. 1257-1263.

9. Muhiddinov Z.K., Nasridinov A., Gorshkova R., Khalikov D., Fishman Molar mass and molar mass distribution of pectin from different sources Abstract Book, 14th IUPAC International Symposium on Macromoleci Complexes (MMC), University of Helsinki. Helsinki, Finland, August 142011. №№4 (141). p. 110.

10. Muhiddinov Z.K., Kasimova G.F., Nasriddinov A.S., Teshaev Kh.I, LS 1 Pectin-Zein Hydrogel for delivery of Drug and Nutrient // The 16th Gum e Stabilizers for the Food Industry. Wageningen, the Nitherlands 28th June-July, 2011.

Разрешено к печати 29.02.2012 г. Сдано в печать 07.03.2012 г. Формат 60x841/16 Гарнитура Times New Roman. Объем 1,75 .л. Бумага офсетная. Печать офсетная Заказ № 27/12 Тираж 100 экз.

Издательство «Истеъдод» 734025, г. Душанбе, проспект Рудаки, 36. Тел: 992 37 2219543, e-mail: istedod2010@mail.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Насриддинов, Абубакр Саидкулович, Душанбе

61 .12-2/396

и *

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН Институт химии им В.И. Никитина

На правах рукописи

Насриддинов Абубакр Саидкулович

Физико-химические основы получения гидрогелевых композиций на основе пектина и зеина кукурузы

02.00.04 -Физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Мухидинов 3. К

Душанбе - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ СОКРАЩЕНИЙ..................... 5

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................6

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..................................................11

1.1. Краткая характеристика пектина и зеина.................................11

1.1.1. Пектин.......................................................................................11

1.1.2. Белки семян злаковых культур.................................................11

1.1.3. Структура зеина.......................................................................12

1.1.4. Применение зеина......................................................................14

1.2. Формирование и свойства перекрестно-сшитых гидрогелей.........................................................................................................15

1.2.1. Характеристика гидрогелей....................................................16

1.2.2. Методы формирования гидрогелей.......................................18

1.3. Гидрогели на основе пектина и бежов как носители пищевых

ингредиентов и лекарственных веществ....................................................21

1.4. Поперечно сшитые гидрогели на основе пектина и ионов двухвалентных металлов хн2+ и Са2+.........................................................24

1.5. Применение биополимерных носителей для доставки ЛВ в желудочно-кишечный тракт..........................................................................27

ГЛАВА 2. МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................................................................31

2.1. Сбор и подготовка исходного сырья..........................................31

2.2. Выделение зеина из кукурузной муки.......................................31

2.2.1. Обезжиривание кукурузной муки............................................31

2.2.2. Выделение кукурузного масла..................................................32

2.2.3. Определение общего белка в обезжиренной муке кукурузы 32

2.2.4. Выделение зеина из обезжиренной муки кукурузы................32

2.2.5. Выделение зеина кукурузы методом Т.Б.Осборна................33

2.2.6. Электрофорез зеина в 7.5% ПААГ..........................................33

2.2.7. Электрофорез зеина в ПААГ, содержащем БИЗ-Ыа.............33

2.3. Турбидиметрическое титрование зеина кукурузы...................34

2.4. Выделение и характеристика пектинов различного происхождения................................................................................................35

2.4.1. Выделение пектина из растительного сырья........................35

2.5. Характеристика пектиновых полисахаридов..........................36

2.5.1. Модифицированный титриметрический метод.................36

2.5.2. Фотометрическое определение метоксильных групп.........37

2.5.3. Определение уроновых кислот с помощью мета-гидрокси дифенильного метода...................................................................................38

2.5.4. Определение молекулярных масс пектинов............................39

2.5.5. ИК-Фуръе спектроскопия........................................................40

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................41

3.1. Выделение и характеристика биополимеров............................41

3.1.1. Выделение и характеристика зеинов кукурузы.....................41

3.1.2. Турбидиметрическое титрование зеина кукурузной муки... 49

3.1.3. Получение, очистка и характеристика пектиновых полисахаридов................................................................................................52

3.2. Исследование комплексообразования НМ-пектина и зеина кукурузы............................................................................................................56

3.2.1. Турбидиметрическое титрование зеина пектинами...........56

3.2.2. Формирование гидрогелевых микросфер на основе зеина и

пектина с инкапсулированным лекарственным веществом.................61

А. Гидрогелевые микросферы на основе цитрусового НМ-31 пектина и зеина.............................................................................................61

B. Гидрогелевые микросферы на основе цитрусового НМ-9 пектина и зеина.............................................................................................65

C. Гидрогелевые микросферы на основе яблочных ВМ- и НМ-пектинов и зеина...........................................................................................69

3.3. Кинетика высвобождения пироксикама из гидрогелей на

основе низкометилированного цитрусового пектина и зеина..............72

ВЫВОДЫ....................................................................................................88

Список наиболее часто встречающихся сокращений

БПК- белок полисахаридного композита

ВМ - высокометилированный

ГК- галактуроновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

JIB- лекарственные вещества

ММ - молекулярная масса

ММР - молекулярно-массовое распределение

НМ - низкометилированный

1111- пектиновые полисахариды

3/П - зеин/пектин

ПИ- пищевые ингредиенты

ПААГ - полиакриламидный гель

11110 - полипропилен оксид

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭО - полиэтилен оксид

РХ - пироксикам

СД - систем доставки лекарственные вещества

СЭ - степень этерификации

ТТ - турбидиметрическое титрование

ВВЕДЕНИЕ

Уровень организации пористой структуры гидрогелей можно контролировать путем изменения смешанных составов биополимеров, их поперечных связей и способности набухать в различный средах. Путем изменения пористости геля можно достичь эффективности инкапсулирования лекарственных веществ (ЛВ), пищевых ингредиентов (ПИ) и высвобождения этих веществ из гидрогелевых матриксов посредством контролируемой диффузии. На самом деле, эффективность гидрогелей, в качестве систем доставки J1B (СДЛ), зависит от фармакокинетических параметров JIB и ПИ в практических условиях: чем дольше скорость высвобождения, тем эффективнее созданная система.

В настоящее время в рационе питания большинства населения преобладает высокое потребление жиров, Сахаров и углеводов. К тому же, ухудшающаяся экологическая обстановка приводит к резкому увеличению заболеваний желудочно - кишечного тракта (ЖКТ), печени, поджелудочной железы, сердечно - сосудистой системы, заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ (ожирение, сахарный диабет и др.). Следует отметить, что создание носителей ЛВ и продуктов питания нового поколения в настоящее время немыслимо без применения пищевых и биологически активных добавок, обладающих детоксикационными и радиопротекторными свойствами.

сельскохозяйственных продуктов, и особенно для безопасной доставки ЛВ в нужный участок организма, представляет чрезвычайно актуальную научно-техническую задачу современной науки.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является физико-химическое обоснование процессов получения гидрогелевых микросфер на основе пектина и зеина кукурузы, с участием сшивающих металлов (кальция и цинка), и изучение диффузии и кинетики высвобождения активного ингредиента из них.

Для выполнения поставленной цели были решены следующие задачи:

• разработаны физико-химические методы анализа компонентного состава зеина;

• изучено формирование пектин-зеиновых гидрогелей на основе различных пектинов и зеина с участием ионов двухвалентных металлов (Са2+ и Ъъ2+);

• изучены процесс диффузии и кинетика высвобождения модельного JIB из гидрогелевых микросфер.

Научная новизна работы;

S впервые, методом турбидиметрического титрования (ТТ) определён фракционный состав зеина кукурузы, указывающий на широкое молекулярно-массовое распределение макромолекул зеина и существование пяти макромолекулярных фракций; S методом ТТ и ИК-Фурье спектроскопии изучен процесс формирования комплексов и установлено, что в системе пектин/зеин образуются два типа комплексов: ионотропное, пектин-Са2+ - зеин, и лиотропное, посредством электростатического, гидрофобного взаимодействий и коацервации двух биополимеров; •S найден оптимизированный состав гидрогелей с низкомолекулярным яблочным пектином, пролонгирующий выход лекарств до 48 и более часов, что является важным для доставки ЛВ в кишечник;

V на основании кинетических исследований установлено, что с увеличением доли зеина в составе полимерной композиции, диффузия ЛВ замедляется и она становится лимитирующей стадей высвобождения ЛВ из матрицы.

Положения, выносимые на защиту:

• физико-химические основы формирования пектин-зеиновых гидрогелей с участием ионов двухвалентных металлов (Са2+ и Zn2+) и пектина из различных источников;

• разработка оптимальных условий для получения гидрогелевых микросфер с максимальной степенью адсорбции модельного ЛВ;

• изучение процесов диффузии и кинетики высвобождения модельного ЛВ из гидрогелевых микросфер.

Практическая значимость работы. Физико-химические аспекты формирования гидрогелевых композитов на основе низкометилированных (НМ)-пектинов и зеина кукурузы способствуют созданию гелеобразующих материалов, природных носителей лекарственных средств и сорбентов, которые могут найти применение в пищевой и фармацевтической отраслях промышленности.

Разработанные методики анализа фракционного состава зеина кукурузы с применением гель электрофореза и турбидиметрии, могут быть применены при анализе гидрофобных белков из растительного материала.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей и 9 тезисов докладов.

Hydrocolloids Conference, Singapore, 15-19 June 2008; Международной научной конференции «Современные тенденции в химии полимеров», (Алматы, 2008г.); The 2nd International Symposium on Edible Plant Resources and Bioactive ingredients. Urumqi, China, July 28-August, 2010; The 16th Gum and Stabilisers for the Food Industry, Wageningen, the Nitherlands, 28 -June-1-July, 2011; 14th IUPAC International Symposium on Macromolecular Complexes (MMC), University of Helsinki, Helsinki, Finland, 14-17 August, 2011.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Краткая характеристика пектина и зеина

1.1.1. Пектин

Пектин, один из главных структурных полисахаридов клеточных стенок растений, состоит из чередующих остатков а (1-4) - связанных аО-галактуроновых кислот с областями содержащими модули из -4) - а - Б-Оа1А (1-и-2) - аЬ-КЬар (1- [1, 2]. Области, состоящие из гомогалактуронановых цепей в литературе упоминаются как "гладкие" области, в то время как зоны, богатые остатков рамнозы называют "волосатыми" областями, поскольку последний сахар остаток несет нейтральные боковые цепочки из олигосахаридов, часто составленные из В-Оа1р, Ь-Ага£ Б-Ху1 и других. Присутствующие нейтральные сахара, которые связаны как боковые цепочки с макромолекулой пектина и разрывом главной цепи рамнозой, образуют разветвленную структуру пектина - рамногалактуронан. Первоначально, значительная часть карбоксильных групп остатков галактуроновых кислот главной цепи полисахарида этерифицирована метанолом. Пектины, в которых степень этерификации (СЭ) галактуроновых остатков > 50 %, известны как высоко метилированные (ВМ) и <50 % оценены как низко метилированные (НМ). Пектиновые полисахариды клеточных стенок растений относятся к самых сложных полимерам, известным в растительной клетке [3,4]. Степень этой сложности и ее роль в родной среде, все еще полностью не выяснена [5].

1.1.2. Белки семян злаковых культур

Белки семян злаковых культур обладают высокой биологической ценностью и представляют интерес, прежде всего как полноценный продукт питания. Кроме того, они отличаются полиморфизмом и широко используются как эффективные белковые маркеры в генетике и селекции [68]. Благодаря уникальным физико-химическим, механическим и

биологическим свойствам, спектр их применения в последние годы значительно возрос, в частности в области медико-биологических полимеров при создании лекарственных средств с целенаправленным транспортом [9]. Растительные белки совместно с другими полимерами, как вспомогательные вещества, способны значительно увеличить время действия и снизить токсичность вводимых в организм лекарственных препаратов. В этом плане интерес представляют белки семян кукурузы, выращенной в условиях Таджикистана. Большую часть общих белков кукурузы составляют спирторастворимые белки -зеины. Это многокомпонентные белки с высоким содержанием таких аминокислот как пролин и глютамин. За счёт высокого содержания лейцина, изолейцина, валина и фенилаланина имеют большое число гидрофобных групп. Незначительное содержание основных аминокислот лизина и аргинина определяют низкий электростатический заряд молекул. За счёт гидрофобного взаимодействия и водородных связей зеины обладают большой агрегирующей способностью. Зеины, выделенные из муки семян экстракцией водным этанолом, представляют смесь, состоящую из ковалентно-связанных полимеров и высокомолекулярных агрегатов [10].

1.1.3. Структура зеина.

Исследования показали, что зеины, основные белки зерна кукурузы, синтезируются на полисомах, которые прикрепляются на поверхности эндоплазматического ретикулума или вакуолей. Это многокомпонентные белки, с высокой агрегирующей способностью состоят из четырёх различных классов: а-, (3-, у- и 5-зеины, отличающихся по молекулярной массе и расположению в белковых тельцах. Растворимость зеинов зависит от последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка, а-зеин составляет 75-85% общего количества белка, построен из двух полипептидных цепей массой 23 000-24 ООО и 26 500-27 000 Ба

соответственно, р-зеин (17 500 Ба) и у-зеин (21 800 Ба) составляют 10-15% и 5-10% от общего количества белка, соответственно [10]. у -зеин состоит из трёх доменов: КГ-концевого пролина - богатого домена, центральной части и большого С- концевого цистеина - богатого домена [11]. у-Ъет, белок кукурузы с N-концевым пролиновым остатком повторяющийся домен (у -гКРЬШ), расположен на поверхности протеиновых тел. Пептиды в молекуле зеина в водном растворе принимают спиральную конформацию типа полипролин II (РРП) структуру в которой спираль имеет длину 15.3 пш и диаметр 1.2 шп (рис.1.1а) [11].

Рисунок 1.1. (а) Единственная молекула октамера смоделирована приспосабливаясь к структуре РРН. Гидрофобные аминокислоты лейцин и валин в боковой цепи выделены в белый кружочки и полярный (протонированные) гистидин в боковой цепи как лопасти.

(Ь) Схематический наклонный обзор агрегирования мицелл продемонстрирует формирование большего диаметра суперструктур в форме цилиндра.

Предполагают, что у -ТЫРЯ!) может быть сформирован амфипатическими спиралями, заряженными гистидином в боковой цепи, который является гидрофильным, а также валином и лейцином в боковой цепи - гидрофобными остатками. Зеин может формировать различные агрегаты диаметрами от 6 до 20 пш цилиндрической формы (рис 1.1 в).

Нами [12], для исследования полипептидного состава и агрегирующих свойств зеинов, был проведён электрофорез белков в 14% ПААГ, содержащим который позволил выявить около 7 компонентов,

отнесённых к а-, (3-, у- зеинам и их димерам и тетрамерам.

1.1.4. Применение зеина.

На протяжении последних лет белки семян злаковых культур интенсивно исследуются, что имеет большую значимость для решения вопросов, связанных не только с получением полноценного продукта питания