Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров

Кудринский, Алексей Александрович

Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Кудринский, Алексей Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров»

Автореферат диссертации на тему "Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров"

На правах рукописи Кудринский Алексей Александрович

ФОРМИРОВАНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРИВИТЫХ РЕЦЕПТОРНЫХ СЛОЕВ МИКРОМЕХАНИЧЕСКИХ И ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ СЕНСОРОВ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2009

003460498

Работа выполнена в лаборатории органического катализа кафедры химии нефти и органического катализа Химического факультета Московского государственного университета им. МБ. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Лисичкин Георгий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Зуев Борис Константинович,

Инсплут геохимии и аналитической химии им. В Л. Вернадского РАН

доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович,

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Институт физической химии и электрохимии им. АН. Фрумкина РАН

Защита диссертации состоится «13» февраля 2009 г. в 15 час. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. МБ. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, спр. 3, МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. МБ. Ломоносова.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайге Химического факультета МГУ им. МБ. Ломоносова «25» декабря 2008 г.

Автореферат разослан «25» декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.90,

кандидат химических наук < /<' М.С. Бобылева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из активно развивающихся приложений метода химического модифицирования поверхности является разработка химических и биосенсоров - аналитических устройств, включающих взаимодействующий с определяемым веществом рецегггорный слой, тесно связанный или интегрированный с физическим преобразователем. Каждый из известных сегодня типов сенсоров (электрохимические, полупроводниковые, оптические, масс-чувствительные и т. д.) обладает своими достоинствами и недостатками, поэтому представляет интерес не только совершенствование рецепторов известных типов, но и разработка новых селективных высокочувствительных сенсорных систем, раскрытие их потенциальных возможностей и преимуществ.

Селективность сенсора определяется наличием на поверхности преобразователя прочно зафиксированного слоя функциональных групп или молекул, способных специфично и, желательно, обратимо взаимодействовать с определяемым веществом - анали-том. Создание такого рецепторного слоя - необходимое, но не достаточное условие эффективности сенсора. Начиная с 1950-х годов практически единственными реакциями, используемыми для специфического определения концентрации биологически активных соединений, были взаимодействие ангаген-ангигело и гибридизация ДНК Затем, после открытия Эллингтоном в 1990 г. "аптамеров" (короткоцепочечных однотяжевых олигонуклеотидов, способных к селекгавному, а в некоторых случаях и специфичному, связыванию с определенными биологически активными соединениями) появилась возможность использования альтернативных комплексообразователей в составе рецепторного слоя сенсоров. Опубликованные работы, посвященные применению аптамеров в сенсорах, носят пока преимущественно иллюстративный характер, и подробных сведений о поведении аптамеров на рабочей поверхности сенсоров получено пока немного. Вместе с тем, знание строения и свойств прившых слоев аптамеров на поверхности рецептора позволит разработать более эффективные методики экспрессного определения различных биологически активных соединений в многокомпонентных объектах. Хорошо алгоритмизированный способ получения индивидуальных аптамеров (процедура БЕЬЕХ, предложенная Эллингтоном) в сочетании со сведениями о поведении иммобилизованных аптамеров в перспективе может создать предпосылки для разработки унифицированных методик экспресс-определения большого числа аналитов.

Наряду с открытием аптамеров в последние десятилетия произошел технологический прорыв в области изготовления кремниевых микроконсолей (кантилеверов) для атомно-снловой микроскопии, позволивший создать чувствительные тепловые, магнитные, масс-чувствителы гые сенсоры. Успешное использование кантилеверов для детектирования самых разных физических взаимодействий открывает широкие перспективы создания на их основе принципиально нового класса химических сенсоров - так называемых микромеханических сенсоров, в которых регистрируется изменение поверхностного натяжения на границе рецептор — окружающая среда. Потенциальные возможности микромеханических сенсоров и области, в которых возможно их наиболее эффективное применение, еще только предстоит выяснить.

Подавляющее большинство работ в области микромеханических сенсоров посвящено определению отдельно взятого аналиш с помощью соответствующего селективного комплексообразующего реагента, иммобилизованного на поверхности кантилевера. Влияние способа иммобилизации и структуры образующегося привитого слоя на величину аналитического сигнала и, как следствие, на чувствительность и другие характеристики сенсора зачастую систематически не исследуется. Также редко обсуждаются механизмы процессов, приводящих к изменению поверхностного натяжения в области привитого слоя. Лишь в самое последнее время начали появляться работы, свидетельствующие об определяющем влиянии расположения молекул реагентов в привитом слое на экспериментально определяемую величину отклика сенсора — поверхностного натяжения на границе рецепторного слоя с анализируемым раствором. Это позволяет предположить, что микромеханические устройства на основе кантилеверов могут служить не только в качестве средств инструментального экспресс-анализа, но и в качестве инструментов для изучения привитых слоев и физико-химических процессов в приповерхностном слое. Поэтому выявление того, какую информацию о них можно получить с помощью микромеханических устройств на основе кантилеверов, является, несомненно, интересной и актуальной в фундаментальном аспекте задачей.

Для этого необходимо на примере использования различных модификаторов поверхности и адсорбатов выявить основные закономерности возникновения аналитического сигнала в микромеханических сенсорах и установить степень влияния различных процессов, протекающих в привитых слоях, на поверхностное натяжение.

Цель и задачи работы. Основной целью работы было изучение физико-химических процессов в привитых рецепторных слоях микромеханических и пьезокварцевых сенсоров.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения привитого слоя в процессах модифицирования кантилевера на примере иммобилизации различных белков с помощью метода химической сборки на поверхности. Выявление вклада латеральных межмолекулярных взаимодействий в привитых слоях в поверхностное натяжение. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения в процессе структурной организации привитого слоя молекул лизоцима.

2. Разработка методов создания рецепторных слоев микромеханических сенсоров, способных к эффективному генерированию аналитического сигнала при селективной сорбции определяемого вещества. Изучение аналитических характеристик модельных микромеханических сенсоров для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови), морфина и антител к морфину.

3. Изучение комплексообразующей способности тромбин-связывающего апгамера, иммобилизованного на поверхности золота. Создание модельного пьезокарцевого сенсора для определения тромбина и оптимизация методики определения тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Поиск способов увеличения чувствительности разработанного сенсора.

Научная новизна. Установлены основные закономерности изменения поверхностного натяжения на границах раздела золото/метанол, золспо/вода,

кремний/вода в процессах физической адсорбции и хемосорбции белков и низкомолекулярных модификаторов поверхности. Пред ложена модель, описывающая зависимость поверхностного натяжения от степени заполнения поверхности ацсорбатом. Обнаружена агрегация лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота, кремния и слюды, происходящая в условиях, при которых агрегация белка в растворе не наблюдается (рНЗ,0, комнатная температура). Экспериментально подтверждено, что образование фибрилл лизоцима проходит через две стадии: конфор-мационный переход в молекуле белка и собственно агрегация. Измерена константа связывания тромбина с аптамером 5'-HS-T(CH2CH20)6T5CCAACGGTTGG-TGTGGTTGG-3', иммобилизованным на поверхности золота, Кь = 0,047 нМ"1.

Практическая значимость. В работе показано, что для микромеханических сенсоров с длительным сроком службы иммобилизация комплексообразующего реагента на кремниевой поверхности кантилевера является более предпочтительной, чем иммобилизация на отражающем слое, в то время как для одноразовых сенсоров этот фактор не является определяющим. Для эффективной работы микромеханических сенсоров при создании привитого слоя следует избегать образования полислоев модификатора В связи с этим при проведении химической сборки рецегпорного слоя на кремниевой поверхности кантилевера вместо традиционного 3-аминопропил-триэтоксисилана предложено использовать 3-аминопропилсилатран.

В работе показано, что при использовании тромбин-связывающего аптамера в составе чувствительного слоя пьезокварцевого сенсора можно селективно определять содержание тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Продолжительность работы разработанного сенсора существенно больше, чем пьезокварцевых сенсоров на основе ашител. Коэффициент чувствительности сенсора может быть существенно увеличен за счет предварительной иммобилизации молекул тромбина, содержащихся в анализируемом растворе, на поверхности наночастиц золота и серебра.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Малом полимерном конгрессе (Москва, 2005), International conference "Nanoscience and technology" (Switzerland, Basel, 2006), 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология" (Санкт-Петербург - Хилово, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), XIV и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007" (Москва, 2007) и "Ломоносов-2008" (Москва, 2008), Всероссийской конференции "Химический анализ" (Москва - Клязьма, 2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей и 10 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, также получен патент РФ на изобретение.

Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (174 источника). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и включает 7 таблиц и 70 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность проблемы и сформулированы цели и задачи работы.

Обзор литературы разделен на две основных части, в первой из которых подробно рассмотрены принципы работы и наиболее существенные достижения в области разработки микромеханических устройств. Во второй части приведены основные сведения об аптамерах, их структуре, свойствах, а также об использовании аптамеров в сенсорах различных типов.

Экспериментальная часть содержит раздел, в котором описано использованное в работе сенсорное оборудование: установка для измерения поверхностного натяжения с детектором на основе кантилевера для атомно-силовой микроскопии и проточно-инжекционная установка для пьезокварцевого микровзвешивания. В других разделах экспериментальной части приведены методики проведения измерений и приготовления образцов, а также охарактеризованы условия изучения образцов с использованием различных методов исследования: атомно-силовой микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, масс-спектрометрии, спектроскопии в видимой и УФ-области, лазерного светорассеяния.

Установка_для_измерения

поверхностного натяжения

Для измерения поверхностного натяжения в работе использовали микромеханическое устройство на основе кантилевера, сконструированное на физическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Кантилевер представляет собой упругую кремниевую консоль, с одной стороны покрытую тонким слоем золота (рис. 1). Консоль способна изгибаться под действием сил межмолекулярного взаимо-действия в поверхностном слое. Величина этого изгиба, то есть радиус кривизны консоли, определяется результирующим поверхностным натяжением (<зрез) - разностью поверхностного натяжения на верхней (ств) и нижней (ан) сторонах кантилевера:

®рез ' <5н

Величину изгиба кантилевера измеряли с помощью лазерной детектирующей системы, изображенной на рис. 2.

На зеркальную золотую поверхность консоли под углом направляли луч лазера так, чтобы отраженный луч попал в центр позиционного фотодиода. При изгибе консоли световое пятно, образованное отраженным лучем, смещается, в результате чего возникает различие в интенсивностях фототока, генерируемого верхней и нижней долями фотодиода, при этом разность потенциалов верхней и нижней долей позиционного фотодиода пропорциональна смещению луча в

№N4)

Рис. 1. Схематическое изображение кантилевера.

вертикальной плоскости. Сигнал с фотодиода регистрировали с интервалом 20 мс. При проведении экспериментов из измеренной разности потенциалов по калибровочной зависимости определяли смещение конца консоли и рассчитывали результирующее поверхностное натяжение (аре]) по формуле Стони: арез = К Дг, где Аг - смещение конца консоли, К - коэффициент пропорциональности, зависящий от геометрических размеров консоли и ее упругости. Общая схема установки для измерения поверхностного натяжения приведена на рис. 3.

1 - кантшевер,

2 - исходное положение консоли,

3 - изогнутая консоль, 4-лазер,

5 - позиционный фотодиод,

6 - система обработки сигнала

Рис. 2. Принцип действия оптической системы детектирования изгиба кантилевера.

Рис. 3. Схемы а) установки для измерения поверхностного натяжения и б) измерительной ячейки (1 - кантилевер, закрепленный в тефлоновом держателе, 2 - тефлоновая измерительная ячейка, 3 -стеклянное окно, 4 - шприц для ввода жидкости, 5 — красный полупроводниковый лазер (650-670 нм), 6 - зеркало, 7 - позиционный фотодиод, 8 - система обработки сигнала).

Наибольшую погрешность в измеряемую величину разности поверхностного натяжения на границе поверхность кантилевера - жидкость вносили фоновые колебания кантилевера, возникающие из-за механических колебаний жидкости и ячейки. Величина погрешности определения поверхностного натяжения с помощью описанной установки составила в среднем 0,5 мН/м.

Основные результаты работы

1. Изучение процессов химического модифицирования поверхности кантилевера

Наибольший практический интерес представляет изучение хемосорбции тех модификаторов, которые необходимы для иммобилизации на поверхности рецептора высокоселективных комплексообразующих реагентов, в частности, белков и нуклеиновых кислот. Один из широко распространенных методов ковалентного закрепления белков включает в себя предварительную функционализацию поверхности аминогруппами и последовательную обработку аминированной поверхности растворами глутарового альдегида и белка. В работе были изучены все стадии этого метода, необходимые для иммобилизации белка как на золотой, так и на кремниевой сторонах кантилевера.

Для создания слоя аминогрупп на кремниевой поверхности вначале был использован традиционный модификатор 3-аминопропилтриэтоксисилан, но из-за образования толстого и неоднородного по рельефу полисилоксанового слоя оказалось невозможным проводить корректные измерения поверхностного натяжения. Поэтому в качестве модификатора был использован недавно предложенный реагент 3-аминопропилсилатран, который, как было установлено в процессе выполнения работы, лишен упомянутых недостатков. Для создания аминогрупп на золотой поверхности кантилевера использовали 4-аминотиофенол (4-АТФ). Общая схема проведения ковалентного закрепления белков на кантилевере приведена на рис. 4.

Ниже будут подробно рассмотрены основные закономерности изменения результирующего поверхностного натяжения (арез) на каждой стадии иммобилизации. Под результирующим поверхностным натяжением в работе подразумевается разность величин поверхностного натяжения на золотой (рли) и кремниевой поверхностях кантилевера:

СХрез=СТАи

Таким образом, уменьшение результирующего поверхностного натяжения в процессе протекания реакции соответствует изгибанию консоли в сторону кремниевой поверхности.

кантилевер

Рис. 4. Схема иммобилизации белков на поверхности кантилевера.

'Дм

СНзОН. Ю^М, 12 ч

/I ^¿У

? 100 -

I 0 -

ь -100 -

о 0> -200 -

о -300 -

-400

1.1. Модифицирование кантилевера 4-аминотиофенолом

В процессе протекания реакции 4-АТФ с поверхностью золота в течение первого часа результирующее поверхностное натяжение оставалось на постоянном уровне, а затем начало уменьшаться вплоть до установления постоянного значения -345±5 мН/м (рис. 5). Полностью процесс адсорбции завершается в течение 8 часов с момента ввода 4-АТФ.

Вместе с тем, известно, что хемосорбция тиолов на поверхности золота обычно хорошо аппроксимируется кинетической моделью, в которой постулируется, что на поверхности существует фиксированное число эквивалентных адсорбционных центров. Первой стадией хемосорбции и, одновременно, лимитирующей стадией является взаимодействие молекулы адсорбата, например ЯБН, с вакантным адсорбционным центром:

ЯБН + А кадс > • А,

где коде - константа скорости адсорбции, А - адсорбционный центр.

Далее происходит диссоциация сорбированной молекулы тиола с образованием хемосорбированных атомов водорода, которые либо в несколько этапов окисляются кислородом воздуха, либо, в инертной атмосфере, образуют молекулы водорода. Кроме того, возможна и десорбция хемосорбированной молекулы тиола:

10 12 14 время, ч

Рис. 5. Зависимость результирующего поверхностного натяжения от времени при модифицировании кантилевера 4-АТФ.

• А + А-

->Ш-А + Н-А, Я8Н• А ^ )ЯБН + А

где к] - соответствующая константа скорости реакции, к^ес - константа скорости десорбции. Такая модель предсказывает экспоненциальное уменьшение количества вакантных адсорбционных центров с течением времени (9 - степень заполнения поверхности, кэфф - эффективная константа скорости, время):

вЦ) = \-е~кэфф*

С описанной моделью согласуются экспериментальные данные, полученные при изучении хемосорбции тиолов с помощью различных физико-химических методов. Тем не менее, с ее помощью нельзя описать наблюдаемый в процессе хемосорбции 4-АТФ индукционный период.

Постоянство поверхностного натяжения на начальном этапе хемосорбции алкилтиолов неоднократно упоминалось в работах многих исследователей. Тем не менее, до настоящего времени удовлетворительного объяснения этому явлению не было предложено. По-видимому, причину его возникновения нужно искать в особенностях формирования сил поверхностного натяжения в привитом слое.

1.2. Модель изменения поверхностного натяжения на межфазной границе твердое тело — жидкость в процессе адсорбции

Для объяснения наблюдаемого эффекта в работе была предложена модель расчета поверхностного натяжения, основанная на разложении сил поверхностного натяжения, действующих на произвольно выделенный на поверхности контур, на составляющие, отвечающие единичным межмолекулярным латеральным взаимодействиям.

Первым шагом на пути расчета изменения поверхностного натяжения в процессе адсорбции определенного вещества является попытка вычленить вклад этого вещества из суммарной величины поверхностного натяжения и рассматривать его независимо от вкладов других компонентов. Для этого требуется учесть межмолекулярные взаимодействия различных компонентов, присутствующих в приповерхностном слое. В случае адсорбции из раствора необходимо принять во внимание как минимум парные взаимодействия молекул адсорбат-адсорбат, адсорбат-растворитель и растворитель-растворитель.

О О 00 0 0

О О 0

^ О © 0 © 0 0

О с

О 0 0 0

О-

■молекула адсорбата,

<<¡0 —молекула

растворителя

| | -адсорбционный центр

Рис. 6. Схематичное изображение адсорбционного слоя с квадратной решеткой, стрелками обозначены силы поверхностного натяжения (Р), действующие на границы выделенного контура. либо

Рассмотрим упрощенную модель адсорбционного слоя. Предположим, что все адсорбционные центры на поверхности канти-левера эквивалентны и равномерно распределены по поверхности сорбента. Тогда каждый адсорбционный центр может контактировать либо с молекулами адсорбата А, либо с молекулами растворителя Б (рис. 6).

Выделим на поверхности кантилевера произвольный прямоугольный контур. Тогда, по определению поверхностного натяжения, на каждую из сторон этого контура будет действовать сила поверхностного натяжения, равная = о /, где / - длина соответствующей стороны. Сила Р направлена внутрь контура перпендикулярно его границе. На микроскопическом уровне сила Р складывается из латеральных межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое (рис. 7).

щ 0

Рис. 7. Формирование сил поверхностного натяжения в адсорбционном слое.

Для удобства рассмотрения примем, что адсорбционные центры на поверхности кантилевера образуют квадратную квазикристаллическую решетку и проведем границу контура между адсорбционными центрами. Тогда по обе стороны от границы будут расположены центры, связанные либо с молекулами адсорбата, либо с молекулами растворителя, причем наиболее сильное взаимодействие будет наблюдаться между молекулами, адсорбированными на смежных центрах адсорбции. Затем выберем один из центров адсорбции. Тогда, сложив силы латерального взаимодействия молекул, связанных с выбранным центром, с молекулами, находящимися по другую сторону границы контура, можно найти результирующую силу, действующую на участке контура, соответствующем выбранному адсорбционному центру (рис. 7, слева). Проведя аналогичную процедуру со всеми оставшимися центрами, примыкающими к границе контура, и просуммировав силы, отвечающие отдельным участкам контура, можно найти макроскопическую силу, действующую на рассматриваемую сторону контура (рис. 7, справа). Поделив абсолютное значение этой силы на длину стороны, можно рассчитать значение поверхностного натяжения на поверхности кантилевера, покрытой адсорбционным слоем. Описанный подход аналогичен методу расчета константы Гамакера, определяющей энергию когезии двух частей одной и той же фазы.

Для расчета поверхностного натяжения в двухкомпонентном адсорбционном слое, в отличие от расчета константы Гамакера, требуются не только сведения о величине силы межмолекулярного взаимодействия, но и сведения о распределении компонентов в адсорбционном слое. Очевидно, например, что в случае островкового распределения молекул адсорбата среди различных латеральных взаимодействий будут преобладать взаимодействия адсорбат-адсорбат и растворитель-растворитель, а число взаимодействий адсорбат-растворитель будет невелико. Напротив, в случае равномерного типа распределения взаимодействия адсорбат-растворитель при средних степенях заполнения поверхности будут преобладающими. Промежуточный случай реализуется при случайном типе распределения молекул в адсорбционном слое.

В работе были последовательно рассмотрены эти три основных типа распределения и показано, что зависимость поверхностного натяжения (су) от степени заполнения поверхности (9) определяется расположением молекул адсорбата на поверхности и в общем случае является нелинейной:

1. При островковом распределении: = С10 + <70 >

2. При случайном распределении: <Т — С\0 + С20 + СГ0;

где а о - поверхностное натяжение при отсутствии адсорбата,

С], С2, Сз, С4 — константы, зависящие от величины сил латерального

межмолекулярного взаимодействия.

Следует отметить, что результаты рассмотрения трех основных типов распределения с точностью до числового множителя применимы и для расчета поверхностного натяжения и в адсорбционных слоях с другими типами решеток, в частности, в слое с плотнейшей гексагональной упаковкой молекул адсорбата.

Итак, рассмотрев наиболее часто встречающиеся виды распределения молекул адсорбата можно перейти к первоначально поставленной задаче - описанию экспериментальных данных по изменению поверхностного натяжения с течением времени (a(i)) при образовании слоя 4-АТФ. В рамках предложенной модели кривые a(t) с индукционным периодом могут возникать как при случайном, так и при равномерном распределении молекул 4-АТФ в приповерхностном слое. Вместе с тем, при адсорбции достаточно гидрофобного 4-аминотиофенола из метанола, по-видимому, не следует ожидать существенного отталкивания между молекулами 4-АТФ, которое могло бы привести к равномерному распределению адсорбата. Таким образом, гипотеза о случайном распределении 4-АТФ на поверхности кантилевера представляется более вероятной. Экспериментальная кривая динамики изменения результирующего поверхностного натяжения при адсорбции 4-АТФ на начальном и среднем этапах хорошо описывается уравнением, предложенным для случайного распределения молекул, включая индукционный период (рис. 8). Небольшие отклонения наблюдаются только на финальном этапе сорбции, когда монослой уже практически сформировался.

100 -

X 0 -

О -100 -

-200 -

-300 -

-400 -

10 12 14 время, ч

Рис. 8. Аппроксимация зависимости результирующего поверхностного натяжения от времени при модифицировании кантилевера 4-АТФ в предположении случайного типа распределения молекул в адсорбционном слое

(-экспериментальные данные,

----аппроксимация).

1.3. Модифицирование кантилевера 3-аминопропилсилатраном

Для изучения применимости 3-аминопропилсилатрана (3-АПС) для модифицирования кремниевой поверхности свежеочищенный кантилевер был обработан водным раствором 3-АПС (167 мкМ), при этом результирующее поверхностное натяжение вначале уменьшалось, а через 20 минут после начала модифицирования стало увеличиваться (рис. 9а).

Такое изменение поверхностного натяжения с течением времени можно объяснить протеканием реакции 3-аминопропилсилатрана с силанольными группами в две стадии:

-Ж2

вЮг

$¡02

-ОН

-о—эг1-

он

(СН2)зМНг

-Ы(СН2СН20Н)з

/ /

аог/

/ /

I—<х.

.ОН (СН2ЬЖ2

р 150 -

I 100 -

о 50 -

о. О 0 -

-50 -

-100

ввод воды в ячейку

25 50 75 100 125 150

Поскольку БьОН группы проявляют кислотные свойства, то можно ожидать, что первая стадия процесса (собственно иммобилизация 3-АПС) будет протекать быстрее, чем гидролиз оставшихся связей 8ьО-С с отщеплением триэтаноламина, что и наблюдалось на опыте (рис. 9а).

Для доказательства того, что увеличение результирующего поверхностного натяжения связано со второй стадией процесса, для протекания которой не требуется

присутствия молекул 3-АПС в растворе, через 85 минут после начала модифицирования ячейка с канти-левером была промыта водой. После этого результирующее поверхностное натяжение продолжало расти в течение 30 минут, а затем перестало изменяться (рис. 96). Таким образом, зафиксированный рост поверхностного натяжения действительно связан с протеканием реакции гидролиза молекул 3-АПС, уже находящихся на поверхности.

Следует отметить, что ранее кинетические параметры взаимодействия 3-АПС с поверхностными силанольными группами не были известны, и предположение о существенном различии скоростей двух этапов реакции не было подтверждено экспериментально.

В работе было сделано предположение о том, что используя существенное различие скоростей хемосорбции 3-АПС и его дальнейшего гидролиза можно предотвратить образование полисилоксановых структур на поверхности. Для

время, мин

Рис. 9. Зависимость результирующего поверхностного натяжения от времени а) при модифицировании кремниевой поверхности кантилевера 3-аминопропил-триэтоксисиланом (тонкая линия) и б) после промывки водой ячейки с кантилевером (жирная линия).

этого нужно остановить процесс модифицирования поверхности в то время, когда силанольные группы уже прореагировали с 3-АПС, а выделение триэтаноламина в результате взаимодействия привитых молекул с водой или с частично гидролизованными молекулами 3-АПС еще только начинается. И действительно, при изучении поверхности свежесколотой слюды, обработанной водным раствором 3-АПС (167 мкМ) в течение 30 мин, с помощью атомно-силовой микроскопии, оказалось, что полученный таким способом привитый слой 3-АПС является достаточно ровным, средний размер неровностей рельефа не превышал 1 нм.

1.4. Модифицирование аминированной поверхности

Для иммобилизации белка на кантилеверах, несущих слой аминогрупп либо на золотой, либо на кремниевой поверхности, их обрабатывали 5%-ным водным раствором глутарового альдегида ОНС(СН2)3СНО, раствором белка (0,1 мг/мл конъюгата морфина с овальбумином в фосфатном буферном растворе с рН 7,0 или 10 мг/мл лизоцима в ацетатном буферном растворе с рН 4,5) и 50 мМ раствором трис-гидроксиметиламинометана для блокировки непрореагировавших аминогрупп. Во всех случаях модифицирование проводили до прекращения изменения результирующего поверхностного натяжения, что свидетельствовало об окончании процесса. Полноту протекания модифицирования контролировали с помощью атомно-силовой микроскопии.

Основной проблемой при изучении взаимодействия реагентов с поверхностью кантилевера было параллельное протекание хемосорбции на золотой и кремниевой поверхностях кантилевера. Тем не менее, в ряде случае удалось восстановить вид зависимости поверхностного натяжения от времени на конкретной стороне кантилевера (рис. 10). Сводные данные об изменении поверхностного натяжения при протекании различных процессов приведены в таблице 1.

40 50 время, мин

сорбция глутарового альдегида на

а) кантилевере, модифицированном 4-АТФ (а,);

б) кантилевере, модифицированном 3-АПС (02);

в) немодифицированном кантилевере (аз);

г) восстановленная зависимость поверхностного натяжения на золотой поверхности от времени при сорбции глутарового альдеги-

60 да на кантилевере, модифицированном 4-АТФ (а4), а4= 01- <т3.

Рис. 10. Зависимости результирующего поверхностного натяжения (а^ от времени.

Таблица 1. Характеристические параметры взаимодействия модификаторов с поверхностью кантилевера; Аар,„шх — максимальное изменение результирующего поверхностного натяжения в процессе взаимодействия;

ГА - глутаровый альдегид, 3-АПС - З-аминопропилсилатран, 4-АТФ - 4-амино-тиофенол, ЗП —золотая поверхность, КП - кремниевая поверхность_

Процесс A(Tptmaxi мН/м

Сорбция 4-АТФ -345±5

Сорбция 3-АПС 145±5

Сорбция ГА на немодифицированном кантилевере -80±5

Сорбция ГА на кантилевере, модифицированном 3-АПС -80±5

Сорбция ГА на кантилевере, модифицированном 4-АТФ 21±2

Сорбция ГА на золотой поверхности, модифицированной 4-АТФ, восстановленная зависимость 100±5

Сорбция конъюгата морфина с овальбумином на кантилевере с модифицированной ЗП 9±1

Сорбция лизоцима на кантилевере с модифицированной ЗП 24±2

Сорбция лизоцима на кантилевере с модифицированной КП -80±7

1.5. Агрегация лизоцима на поверхности кантилевера

В предыдущем разделе было показано, что микромеханические устройства могут быть успешно применены для изучения кинетики сорбции различных веществ на границе раздела твердое тело - жидкость. Получаемые при этом экспериментальные данные дополняют известные сведения о кинетике адсорбции, полученные с помощью традиционных методов, например, весового. Следует отметить, что существенным ограничением весового метода в исследовании процессов, протекающих на поверхности, является невозможность изучения процессов, протекающих без изменения массы сорбента, то есть протекающих только с участием молекул, находящихся в приповерхностном слое. Напротив, при изучении процессов на границе раздела твердое тело - жидкость с помощью микромеханических устройств такое ограничение должно отсутствовать. Вместе с тем, остаются пока открытыми вопросы о том, насколько существенно влияние процессов, протекающих внутри приповерхностного слоя, на поверхностное натяжение и достаточно ли чувствительности микромеханических измерителей поверхностного натяжения для получения достоверной информации о таких процессах. Для получения предварительных ответов на эти вопросы требуется исследование подходящих модельных реакций. В работе в качестве такого модельного процесса была выбрана агрегация белка лизоцима, протекающая при повышенной температуре и в слабокислой среде с образованием характерных фибрилл, которые носят название амилоидных.

Агрегация лизоцима изучалась в нескольких исследовательских группах. Было показано, что в растворе лизоцим начинает агрегировать при рН < 3,8 и температуре t > 57°С. В то же время, in vivo фибриллы образуются не в растворе, а на поверхности клеток, причем в более мягких условиях.

012345678

время, ч

Рис. 11. Изменение результирующего поверхностного натяжения в процессе агрегации лизоцима, иммобилизованного на а) золотой и б) кремниевой поверхностях кантилевера.

В связи с этим представляет интерес изучение конформационных переходов в молекулах белка, находящихся вблизи поверхности твердого тела.

В работе исследовалась агрегация лизоцима, иммобилизованного на золотой и на кремниевой поверхностях кантилевера через 4-аминотиофенол и 3 -аминопропилсилатран соответственно.

Кантилевер с иммобилизованным на золотой поверхности лизоцимом был помещен в ацетатный буферный раствор с рН 4,5, при этом в течение 8 часов поверхностное натяжение не изменялось. Затем ячейку с кантилевером заполнили глициновым буферным раствором (рН 3,0), при этом уже при комнатной температуре результирующее поверхностное натяжение начало изменяться: сначала уменьшалось, а затем, пройдя через минимум, начало увеличиваться (рис. 11а). Процесс реструктуризации привитого слоя продолжался

в течение нескольких часов. Постоянство арез при рН4,5 и деформирование консоли при рН 3,0 согласуются с литературными данными о том, что конформационный переход из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой происходит только при понижении кислотности среды до рН 3,8.

Для получения дополнительной информации о состоянии привитого слоя был исследован рельеф модельных образцов позолоченной слюды с иммобилизованным на поверхности лизоцимом. На образцах, находившихся в буферном растворе с рН 3,0 в течение 4,5 и 12 ч, были обнаружены фибриллы длиной до 10 мкм и высотой 2-10 нм с поверхностной плотностью 0,1 и 1 шт./мкм2 соответственно. В связи с этим, увеличение результирующего поверхностного натяжения на второй стадии процесса, соответствующее изгибанию консоли в сторону золотой поверхности, может быть объяснено возникновением значительных "стягивающих" напряжений в привитом слое в результате агрегации молекул лизоцима. На первой стадии процесса, напротив, в привитом слое преобладают силы отталкивания. Они, по-видимому, возникают вследствие того, что площадь, занимаемая на поверхности молекулами лизоцима, находящимися в конформации с неправильной укладкой, в которой вместо компактных а-спиралей присутствуют р-листы, больше площади, занимаемой нативными молекулами белка.

Полностью аналогичные исследования были проведены и в отношении лизоцима, иммобилизованного на кремниевой поверхности кантилевера. При этом, как и следовало ожидать исходя из результатов, полученных при

изучении реакций химического модифицирования кантилевера (раздел 1.4), ход зависимости результирующего поверхностного натяжения был полностью противоположным (рис. 116), при этом кинетические характеристики обеих стадий процесса фибриллообразования оказались достаточно близкими. Тем не менее, можно отметить, что процесс агрегации лизоцима, закрепленного на кремниевой поверхности кантилевера, проходит немного медленнее. Этот факт согласуется с результатами, полученными при исследовании поверхности модельных образцов слюды с иммобилизованным лизоцимом: поверхностная плотность фибрилл 0,1 шт./мкм2 достигается только по истечении 9 ч.

Таким образом, лизоцим, иммобилизованный как на золотой, так и на кремниевой поверхностях, агрегирует при комнатной температуре при рН 3,0, причем процесс агрегации сопровождается увеличением сил межмолекулярного притяжения в слое белка. Вместе с тем, в ряде работ отмечается, что ковалентное закрепление молекул белка на поверхности предотвращает их агрегацию. Это утверждение может быть справедливо для поверхности с расстоянием между соседними белковыми молекулами 10-30 нм (плотность прививки 0,001-0,01 молекул на нм2), которая получается при обработке слюды 3-аминопропилтриэтоксисиланом из газовой фазы. При иммобилизации лизоцима на кантилевере через глутаровый альдегид по описанным выше методикам плотность прививки белка, определенная с помощью атомно-силовой микроскопии, гораздо выше и составляет 0,04-0,1 мол./нм2. При таком плотном расположении молекул ковалентное закрепление лизоцима на поверхности золота не препятствует его агрегации, а, напротив, на поверхности кантилевера этот процесс протекает быстрее и в более мягких условиях (~12 часов при комнатной температуре), чем в растворе, где процесс образования фибрилл возможен только при повышенной температуре (57°С) и его длительность составляет несколько суток.

Возможной причиной агрегации иммобилизованного лизоцима может быть переход белка при иммобилизации на поверхности из нативной конформации в состояние с неправильной укладкой. Это состояние, при комнатной температуре неустойчивое в растворе, может стабилизироваться вблизи поверхности.

2. Сенсоры на основе микромеханических устройств

2.1. Микромеханический сенсор для определения морфина и обнаружения антител к морфину

На основе кантилевера с иммобилизованным на золотой поверхности конъюгатом морфина с овальбумином (условия иммобилизации описаны в разделе 1.4) в работе была показана принципиальная возможность реализации иммунохимического микромеханического сенсора для обнаружения поликлональных антител к опиатам в сыворотке крови человека, которое необходимо осуществлять для ранней диагностики наркомании, и для определения концентрации морфина.

Для изучения сенсорных характеристик модифицированного кантилевера в работе использовалась антителосодержащая сыворотка крови двух видов:

полученная при иммунизации кроликов конъюгатом овальбумина с морфином и сыворотка крови человека, больного опиатной наркоманией.

При обработке кантилевера, модифицированного конъюгатом морфина с овальбумином, антителосодержащими сыворотками крови человека и кролика, в обоих случаях наблюдалось увеличение результирующего поверхностного натяжения (табл. 2). Таким образом, кантилевер с иммобилизованным на поверхности конъюгатом морфина с овальбумином, по-видимому, может быть использован в качестве сенсора для обнаружения поликлональных антител к морфину.

Далее изучалась возможность использования модифицированного кантилевера для определения морфина: после завершения адсорбции антител из сыворотки крови и отмывки несвязавшихся антител кантилевер был инкубирован в растворах морфина с различной концентрацией.

При этом было установлено, что в растворах с концентрацией морфина более 50 мкг/мл происходит полная десорбция антител с поверхности, сопровождающаяся уменьшением результирующего поверхностного натяжения, по модулю равным наблюдавшемуся при адсорбции антител. Поэтому в дальнейшем для регенерации поверхности кантилевер обрабатывали последовательно раствором морфина с концентрацией 100 мкг/мл и фосфатным буферным раствором. Сводные данные по десорбции антител с поверхности кантилевера под действием растворов морфина приведены в таблице 2.

Из табл. 2 видно, что антитела человека и кролика десорбировались с поверхности при добавлении растворов морфина. Об этом свидетельствует изгибание кантилевера в противоположную сторону по сравнению с наблюдавшимся при адсорбции антител. Увеличение концентрации морфина в растворе ведет к увеличению аналитического сигнала сенсора (по модулю).

Таким образом, установлено, что отклик сенсора зависит от концентрации морфина в растворе. Это позволяет заключить, что модифицированный кантилевер может использоваться в качестве иммуносенсора для определения морфина. Эксперименты проводились на протяжении 3-4 недель, за это время

Таблица 2. Десорбция антител с поверхности модифицированного кантилевера под действием растворов морфина с различной концентрацией; ts.<jpe3 тах — максимальное изменение результирующего поверхностного натяжения в процессе взаимодействия,

сморф ~ концентрация морфина, t¿ec — время завершения десорбции антител_

Сморф, мкг/мл tdec, мин. Л&рез,таху мН/м

Антитела кролика, разведение 1:250 -120±5

3 -

10 80 5,0±0,5

50 50 110±5

Антитела человека, разведения 1:50 и 1:150 -80±5

3 70 13±1

10 60 30±2

50 20 50±5

843583 £0КУ Х500 гвша

Рис. 12. Микрофотографии модифицированного кантиле-вера, вид сверху, увеличение в 500 раз, квадратом выделена область падения лазерного луча.

кантилевер с иммобилизованным морфином не потерял способности к воспроизводимой сорбции и десорбции антител.

Для изучения влияния процессов химического модифицирования на морфологию отражающего слоя с помощью растрового электронного микроскопа были получены изображения поверхности кантилевера после проведения нескольких циклов определения морфина и антител к морфину. На изображении верхней (позолоченной) части модифицированного кантилевера отчетливо видна область, отличная по рельефу от основной поверхности (рис. 12). Микроструктура этого участка состоит из выпуклостей с диаметром основания 0,3-0,4 мкм. Появление неровностей рельефа вызвано, по-видимому, воздействием лазерного луча на отражающую поверхность. Поскольку при иммобилизации реагентов на золотой поверхности отражающий слой кантилевера является чувствительным элементом сенсора, химическая и морфологическая неоднородность этой поверхности может приводить к искажению результатов анализа и снижению чувствительности. Избежать этого можно, проводя иммобилизацию реагентов на нижней стороне кантилевера, например, с помощью предложенной в работе методике - через 3-аминопропилсилатран.

2.2. Микромеханический сенсор для определения тромбина

Для выявления возможности использования аптамеров в составе рецепторного слоя сенсоров в работе была предпринята попытка реализовать микромеханический сенсор с рецепторным слоем на основе аптамеров, а именно, сенсор для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови).

При изучении сорбции тромбина на поверхности кантилевера с иммобилизованным аптамером 5'-Н5-Т(СН2СН20)6ТТТТТССААСССТТССТ-ОТООТШО-З' было обнаружено, что зависимость результирующего поверхностного натяжения от времени также имеет индукционный период, в связи с чем экспресс-определение тромбина с помощью такого микромеханического сенсора произвести невозможно. Как и в случае с хемосорбцией 4-аминотиофенола, сорбция тромбина хорошо описывается в рамках предложенной в работе модели за исключением финального этапа.

3. Пьезокварцевый проточно-инжекционный сенсор для определения тромбина

Поскольку микромеханический сенсор на основе аптамеров оказался непригоден для практического применения, для выявления особенностей использования аптамеров в сенсорах в работе был реализован пьезокварцевый сенсор для определения тромбина. Пьезокварцевые сенсоры относятся к классу масс-чувствительных. Их применение основано на линейной зависимости частоты собственных колебаний тонкого диска от его массы. Частоту собственных колебаний кварцевого диска можно легко измерить с помощью явления пьезоэффекта. Для этого на противоположные стороны кристалла напыляют металлические электроды, к которым подключают соответствующую аппаратуру: генератор колебаний и частотомер.

Исследования взаимодействия тромбина с рецепторным слоем, состоящим из молекул аптамера, проводились в проточно-инжекционном режиме с помощью установки (рис. 13), включающей измерительную ячейку объемом 100 мкл, в которую был помещен пьезокварцевый кристалл (с золотыми электродами) с начальной собственной частотой колебаний 10МГц таким образом, что с поверхностью жидкости контактировала только одна сторона кристалла.

Рис. 13. Схема проточно-инжещионной установки для пъезокварцевого микровзвешивания.

На поверхности электрода, предварительно очищенного в горячей азотной кислоте, был хемосорбирован тромбин-связывающий аптамер (5')Н8-Т(СН2СН20)бТТТТТССААС00ТТС0Т0Т0СГГСС(3'), имеющий на 5'-конце БН-группу (10 мМ, диет, вода, 2 ч). Далее через проточную ячейку, в которую был помещен кристалл, пропускали поток буферного раствора (10 мМ НЕРЕЗ-ТЧаОН, 40 мМ КаС1, 10 мМ №N3, рН 7,4, НЕРЕБ - Ы-гидрокси-этилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота) со скоростью 100 мкл/мин, в который через инжектор вводили растворы тромбина различной концентрации (10-500 нМ) порциями по 1 мл.

На графиках зависимости изменения частоты колебаний кристалла (Д/) от времени, прошедшего после ввода тромбина в инжектор, присутствуют пики (рис. 14), которые соответствуют адсорбции тромбина на поверхности сенсора.

1 — насос,

2 - инжектор,

3 - измерительная ячейка с

пъезокварцевым кристаллом,

4 - генератор колебаний и частотомер,

5 — система обработки сигнала

Из рис. 14 видно, что частота колебаний

кристалла после выхода зоны тромбина из ячейки начинает плавно приближаться к исходному значению. Это свидетельствует о том, что вслед за адсорбцией тромбина проходит его частичная десорбция с поверхности электрода пьезокварцевого резонатора. Исходя из этого, было сделано предположение о том, что для регенерации поверхности сенсора может быть достаточно промывания ячейки рабочим буферным раствором. Для проверки этой гипотезы через разные промежутки времени после проведения первого адсорбционного измерения в ячейку повторно вводили пробу тромбина до тех пор, пока величина изменения частоты колебаний кристалла не сравнивалась с соответствующей величиной для первого адсорбционного измерения. В результате было установлено, что для полной десорбции тромбина с поверхности сенсора требуется промывка буферным раствором на основе НЕРЕБ в течение 2 часов. Такая длительная регенерация совершенно недопустима для экспрессных методов анализа. В связи с этим, регенерацию сенсора проводили пропусканием через ячейку глицинового буферного раствора (10 мМ глицин-ЫаОН, рН 8,7), в котором комплексы аптамер-тромбин разрушаются.

Было показано, что изменение частоты кристалла (Д/) в диапазоне концентраций тромбина от 25 до 500 нМ можно с хорошей точностью описать линейной функцией (рис. 15). При этом добавление вплоть до 40-кратного количества сывороточного альбумина в изучаемые растворы тромбина не приводит к изменению отклика сенсора. Время работы сенсора без замены кристалла составило около двух месяцев.

время, мин

Рис. 14. Графики зависимостей изменения частоты колебаний пьезокварцевого кристалла от времени при адсорбции растворов тромбина различных концентраций, Л/ - изменение частоты колебаний кристалла.

концентрация тромбина, нМ

Рис. 15. Концентрационная зависимость изменения частоты колебаний пьезокварцевого кристалла с иммобилизованным на поверхности аптамером при адсорбции тромбина, Л/ — изменение частоты колебаний кристалла.

0,06 ■

0,04 -

.о"

•л 0,02 -

Это намного дольше, чем время работы аналогичных сенсоров на основе антител и является существенным достоинством сенсора на основе аптамера. Погрешность определения тромбина с помощью предложенного сенсора не превышает 10%.

При линеаризации полученных экспериментальных данных в координатах, аналогичных координатам Скэтчарда (А//с - Л/), была оценена величина константы связывания аптамера с тромбином - Кь = 0,047 нМ1. Оказалось, что на поверхности сенсора наблюдается также и неспецифическая сорбция тромбина (рис. 16). Рис. 16. Определение константы

Тем не менее, чувствитель- связывания комплекса «аптамер-тром-ности разработанного сенсора бин» в координатах А//с - А/, аналогич-может быть недостаточно, так как ных координатам Скэтчарда, с - кон-для решения некоторых задач центрация тромбина, А{ - изменение медицинской диагностики необхо- частоты колебаний кристалла. димо определять тромбин в

концентрациях 1 нМ и ниже. В связи с этим возникает задача уменьшения предела обнаружения сенсора.

Одним из широко распространенных приемов увеличения чувствительности сенсоров на основе пьезокварцевых резонаторов с прямым способом детектирования является комбинация "утяжеления" молекул определяемого вещества с использованием конкурентного способа детектирования. Наилучшим образом для этого подходят наночастицы благородных металлов: золота и серебра.

В работе были получены конъюгаты тромбина с наночастицами золота и серебра различных размеров и, следовательно, массы. Сначала были синтезированы наночастицы (НЧ) серебра и золота, стабилизированные олигосахаридом хитозаном, и НЧ серебра, стабилизированные меркапто-янтарной кислотой. Синтез наночастиц осуществляли в водной среде путем восстановления раствора нитрата серебра А§Ж>з или золотохлороводородной кислоты НАиС14 боргидридом натрия №ВН4 в присутствии стабилизатора.

Конъюгат тромбина с НЧ серебра, стабилизированными меркаптоянтарной кислотой, был получен с помощью стандартного карбодиимидного метода, включающего активацию карбоксильных групп поверхности при взаимодействии НЧ с растворимым производным карбодиимида и последующую реакцию активированных карбоксильных групп с аминогруппами тромбина. По данным электронной микроскопии распределение частиц по размерам после иммобилизации тромбина на поверхности НЧ существенно не изменилось. Полноту протекания реакции (> 95%) контролировали путем спектрофотометрического определения концентрации непрореагировавшего тромбина по методу Брэдфорд после

отделения наночастиц центрифугированием (при проведении контрольных опытов было подтверждено, что тромбин при этом остается в растворе).

На наночастицах золота и серебра, стабилизированных хитозаном, тромбин был иммобилизован за счет нековалентных взаимодействий, тем не менее, тромбин прочно удерживался на поверхности таких НЧ. По данным электронной микроскопии изменения распределения частиц серебра и золота, стабилизированных хитозаном, по размерам после иммобилизации тромбина также не наблюдалось. Полнота протекания адсорбции тромбина на поверхности НЧ, стабилизированных хитозаном, определенная по методу Брэдфорд после отделения НЧ, также составила не менее 96-98%. Характеристики полученных конъюгатов тромбина с наночастицами приведены в табл. 3.

Изучение адсорбции конъюгатов тромбина с наночастицами серебра и золота проводили по той же методике, что и изучение адсорбции тромбина. Так же, как и при адсорбции тромбина, на графике зависимости частоты колебаний кристалла от времени, прошедшего после ввода раствора конъюгата тромбина с НЧ в инжектор, присутствует пик, соответствующий адсорбции и последующей десорбции конъюгатов.

Вместе с тем, максимальная величина изменения частоты колебаний кристалла (глубина пика) при адсорбции конъюгатов тромбина с наночастицами существенно больше, чем при адсорбции тромбина из раствора с той же концентрацией (табл. 3). При этом адсорбция наночастиц, не несущих на поверхности тромбин, минимальна - величина изменения частоты колебаний не превышает 15-30% от изменения частоты при адсорбции конъюгатов тромбина с соответствующими наночастицами.

Поскольку концентрации растворов наночастиц в проведенных адсорбционных экспериментах были различны, то для корректного сравнения полученных результатов необходимо использовать коэффициенты отклика сенсора (КО) - значения величины отклика сенсора (А/), приведенные к одной и той же концентрации наночастиц (снч) или тромбина:

Л/

ко =

'НЧ

Коэффициенты отклика сенсора увеличиваются симбатно с увеличением размера частиц (рис. 17), при этом для всех наночастиц значение КО больше, чем соответствующее значение для тромбина (КО = 0,01-0,03 Гц/нМ). Отклик сенсора при адсорбции тромбина, связанного с наночастицами, в расчете на единицу концентрации на 2-3 порядка выше, чем

2 1000 -Г

X 100 -

10 -

I 1 -

< 0,1 -

0,01 *

40 60 О, нм

Рис. 17. Влияние размера конъюгатов тромбина с наночастицами золота и серебра на отклик сенсора для определения тромбина (И — средний диаметр конъюгатов, Л//снч - коэффициент отклика сенсора, КО).

при адсорбции свободного тромбина, таким образом, полученные наночастицы могут быть использованы для увеличения чувствительности сенсора.

Таблица 3. Адсорбция наночастиц золота и серебра и конъюгатов тромбина с наночастицами на поверхности сенсора*____

Материал наночастиц Стабилизатор наночастиц Наличие тромбина на поверхности Средний диаметр частиц (D), нм Сич, нМ Отклик сенсора Ш Гц КО, Гц/нМ

Серебро МЯК есть 2-3 50 3,8 0,08

Серебро МЯК нет 2-3 50 1,1 0,02

Серебро хитозан есть 15 0,6 7,2 12

Серебро хитозан нет 15 0,6 1,4 2,3

Золото хитозан есть 55 0,03 15,4 510

Золото хитозан нет 55 0,03 1,6 53

* Случайная ошибка измерений отклика сенсора 10%. МЯК ~ меркапто-янтарная кислота; КО — коэффициент отклика сенсора, отношение отклика сенсора к концентрации определяемого вещества в исследуемом растворе; Сцч — концентрация наночастиц в пересчете на НЧсреднего диаметра.

Выводы

1. Установлены закономерности изменения поверхностного натяжения на границах раздела золото/метанол, золото/вода, кремний/вода в процессах физической адсорбции и хемосорбции некоторых белков и низкомолекулярных модификаторов поверхности, определены характерные времена протекания этих процессов. Предложена модель, описывающая зависимость поверхностного натяжения от степени заполнения поверхности адсорбатом при различных способах распределения молекул в приповерхностном слое.

2. Показано, что хемосорбция 3-аминопропилсилатрана на окисленной кремниевой поверхности протекает последовательно в две стадии: быстрое взаимодействие 3-аминопропилсилатрана с поверхностными силанольными группами и последующий медленный гидролиз с выделением триэтаноламина. Основываясь на различии скоростей стадий была предложена методика модифицирования поверхности кремния 3-аминопропилсилатраном, позволяющая избежать образования полисилоксановых слоев.

3. Обнаружена агрегация лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота, кремния и слюды, происходящая в условиях, при которых агрегация белка в растворе не наблюдается - pH 3,0, комнатная температура. Показано, что при высокой плотности прививки ковалентное закрепление молекул лизоцима не препятствует агрегации. Агрегация иммобилизованного лизоцима протекает в две стадии: конформационный переход в молекуле белка и

собственно образование агрегатов.

4. Показана возможность создания микромеханических иммуносенсоров для обнаружения антител к морфину в сыворотке крови. Разработан сенсор для определения концентрации морфина в водных растворах в диапазоне концентраций 3-50 мкг/мл.

5. Показано, что в точке падения лазерного луча в процессе модифицирования возможно протекание побочных реакций, приводящих к образованию полимолекулярных слоев на поверхности кантилевера.

6. Определена константа связывания тромбина с иммобилизованным тромбин-связывающим аптамером 5'-HS-T(CH2CH20)6T5CCAACGGTTGGTGT-GGTTGG-3', Кь = 0,047 нМ1.

7. Разработан сенсор для проточно-инжекционного определения тромбина в модельных растворах в диапазоне концентраций 10-500 нМ с относительной погрешностью, не превышающей 10%. Установлено, что продолжительность стабильной работы сенсора составляет 60 суток (==200 измерений). Показано, что присутствие 40-кратного избытка сывороточного альбумина не мешает определению тромбина.

8. Установлено, что тромбин может быть иммобилизован на наночастицах серебра, стабилизированных меркаптоянтарной кислотой, а также на наночастицах серебра и золота, стабилизированных хитозаном. Полученные конъюгаты обладают способностью к связыванию с аптамером и могут быть использованы для увеличения чувствительности сенсора для определения тромбина.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах;

1. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, A.A. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе. // Высокомолекулярные соединения. Серия Б. 2007. Т. 49. № 1. С. 125-129.

2. Г.В. Лисичкин, A.A. Кудринский. Привитые поверхностные соединения в химических и биосенсорах. // ЖОХ. 2007. Т. 77. № 3. С. 355-366.

3. А.Ю. Оленин, Ю.А. Крутяков, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин. Формирование поверхностного слоя наночастиц серебра в водных и водно-органических средах. // Коллоидный журнал. 2008. Т. 70. № 1. С. 78-84.

4. Ю.А. Крутяков, A.A. Кудринский. А.Ю. Оленин, Г.В. Лисичкин. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. // Успехи химии. 2008. Т. 77. № 3. С. 242-269.

5. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, Д.В. Багров, П.В. Горелкин, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул. // Датчики и системы. 2007. № 1.С. 18-21.

6. Г.А. Киселёв, A.A. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский, М.А. Мягкова, Г.К. Вертелов. Устройство и способ для качественного и количественного определения химических соединений и биологических

объектов. Патент РФ № 2327140.

7. Г.А. Киселёв, П.В. Горелкин, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Универсальный сенсор на основе атомно-силового микроскопа. // Материалы Малого Полимерного Конгресса, Москва, Россия, 29 ноября -

- 1 декабря 2005. С. 94.

8. G. Kiselev, A. Kudrinskii, Е. Ukraintsev, I. Yaminsky, G. Lisichkin. Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. // Proc. International conf. on nanoscience and technology. Basel, Switzerland, July 30 -

- August 4, 2006. P. 209-210.

9. E.B. Украинцев, Г.А. Киселёв, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии. // Материалы 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология", Санкт-Петербург - Хилово, Россия, 24 сентября - 1 октября 2006. С. 189-190.

10. A.A. Кудринский. Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В. Яминский, Г.В. Лисичкин. Разработка микромеханического сенсора для определения морфина. // Материалы 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология", Санкт-Петербург - Хилово, Россия, 24 сентября - 1 октября 2006. С. 260.

11. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Агрегация лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых лизоцим не агрегирует в растворе. // Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", секция "Химия", Москва, 11-14 апреля 2007. С. 410.

12. A.A. Кудринский. Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В. Яминский, Г.В. Лисичкин. Микромеханический сенсор для определения морфина. // Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", секция "Химия", Москва, 11-14 апреля 2007. С. 411.

13. A.A. Кудринский. Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В. Яминский, Г.В. Лисичкин. Определение морфина с помощью микромеханического сенсора. // Материалы XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Москва, 23-28 сентября 2007. Т. 4. С. 170.

14. A.A. Кудринский. Ю.А. Крутяков. Модель изгиба кантилевера в процессах адсорбции. // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", секция "Химия", Москва, 8-11 апреля 2008. С. 629.

15. A.B. Яковлев, A.A. Кудринский. Иммобилизованные аптамеры - новые модификаторы поверхности в биосенсорике. // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", секция "Химия", Москва, 8-11 апреля 2008. С. 630.

16. A.B. Яковлев, A.A. Кудринский. Г.В. Лисичкин. Проточно-инжекционное определение тромбина с помощью пьезокварцевого микровзвешивания. // Материалы Всероссийской конференции "Химический анализ", Москва - Клязьма, 21-25 апреля 2008. С. 101.

Подписано в печать 23.12.2008 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 788 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Кудринский, Алексей Александрович

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Принцип работы микромеханических устройств.

2.2. Микромеханические сенсоры и измерительные устройства.

2.3. Аптамеры.

2.4. Сенсоры для определения тромбина с рецепторным слоем на основе тромбин-связывающего аптамера.

2.4.1. Электрохимические сенсоры.

2.4.2. Пьезокварцевые сенсоры.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Реагенты.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Измерение поверхностного натяжения.

3.2.2. Пьезокварцевое микровзвешивание.

3.2.3. Регистрация спектров поглощения.

3.2.4. Получение и обработка микрофотографий.

3.2.5. Атомно-силовая микроскопия.

3.2.6. Масс-спектрометрия.

3.3. Методики.

3.3.1. Иммобилизация 3-аминопропилтриэтоксисилана на поверхности кантилевера.

3.3.2. Синтез 3-аминопропилсилатрана.

3.3.3. Иммобилизация белков на поверхности кантилевера.

3.3.4. Очистка пьезокварцевого кристалла.

3.3.5. Иммобилизация тромбин-связывающего аптамера на поверхности электродов пьезокварцевого кристалла.

3.3.6. Проведение адсорбционных измерений.

3.3.7. Синтез копъюгатов тромбина с наночастицами серебра, стабилизированными меркаптоянтарной кислотой.

3.3.8. Синтез копъюгатов тромбина с наночастицами серебра и золота, стабилизированными хитозаном.

3.3.9. Спектрофотометрическое определение концентрации тромбина по методу Брэдфорд.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Химическое модифицирование кантилевера.

4.1.1. Модифицирование 4-аминотиофенолом.

4.1.2. Модель изменения поверхностного натяжения на межфазной границе твердое тело - жидкость в процессе адсорбции.

4.1.3. Модифицирование 3-аминопропилтриэтоксисиланом.

4.1.4. Модифицирование 3-аминопропилсилатраном.

4.1.5. Модифицирование глутаровым альдегидом.

4.1.6. Иммобилизация белков на поверхности кантилевера.

4.1.7. Влияние природы модификатора на изменение поверхностного натяжения в процессе сорбции.

4.2. Агрегация лизоцима на поверхности кантилевера.

4.3. Иммунохимический микромеханический сенсор для определения морфина.

4.4. Микромеханический сенсор для определения тромбина.

4.5. Пьезокварцевый сенсор для определения тромбина.

4.5.1. Подготовка кристалла к проведению адсорбционных измерений.

4.5.2. Иммобилизация тромбин-связывающего аптамера на поверхности пьезокварцевого резонатора.

4.5.3. Оптимизация состава буферного раствора.

4.5.4. Оптимизация состава регенерирующего раствора.

4.5.5. Адсорбция тромбина на поверхности пьезокварцевого резонатора, покрытой тромбин-связывающим аптамером.

4.5.6. Синтез наночастиц серебра и золота.

4.5.7. Иммобилизация тромбина на поверхности наночастиц серебра и золота.

4.5.8. Адсорбция конъюгатов тромбина е наночастицами серебра и золота на поверхности пьезокварцевого резонатора, покрытой тромбин-связывающим аптамером.

5. Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров"

Одним из активно развивающихся приложений метода химического модифицирования поверхности является разработка химических и биосенсоров — аналитических устройств, включающих взаимодействующий с определяемым веществом рецепториый слой, тесно связанный или интегрированный с физическим преобразователем [1].

Каждый из известных сегодня типов сенсоров (электрохимические, полупроводниковые, оптические, масс-чувствительные и т. д.) обладает своими достоинствами и недостатками, поэтому представляет интерес не только совершенствование рецепторов известных типов, но и разработка новых селективных высокочувствительных сенсорных систем, раскрытие их потенциальных возможностей и преимуществ.

Начиная с 1950-х годов практически единственными реакциями, используемыми для специфического определения концентрации биологически активных соединений, были взаимодействие антиген-антитело и гибридизация ДНК. Затем, после открытия Элингтоном в 1990 г. "аптамеров" [3] - короткоцепочечных одпотяжевых олиго-нуклеотидов, способных к селективному, а в некоторых случаях и специфичному, связыванию с определенными биологически активными соединениями, - появилась возможность использования альтернативных комплексообразователей в составе рецепторного слоя сенсоров. Опубликованные работы, посвященные применению аптамеров в сенсорах, носят пока преимущественно иллюстративный характер, и подробных сведений о поведении аптамеров на рабочей поверхности сенсоров получено пока немного. Вместе с тем, знание строения и свойств привитых слоев аптамеров на поверхности рецептора позволит разработать более эффективные методики экспрессного определения различных биологически активных соединений в многокомпонентных объектах. Хорошо алгоритмизированный способ получения индивидуальных аптамеров (процедура SELEX, предложенная Элингтоном) в сочетании со сведениями о поведении иммобилизованных аптамеров в перспективе может создать предпосылки для разработки унифицированных методик экспресс-определения большого числа аналитов.

Наряду с открытием аптамеров в последние десятилетия произошел технологический прорыв в области изготовления кремниевых микроконсолей (кантилеверов) для атомно-силовой микроскопии, позволивший создать чувствительные тепловые, магнитные, масс-сенсоры. Успешное использование кантилеверов для детектирования самых разных физических взаимодействий открывает широкие перспективы создания на их основе принципиально нового кла!сса химических сенсоров - так называемых микромеханических сенсоров [4-7], в которых регистрируется изменение поверхностного натяжения на границе рецептор — окружающая среда. Потенциальные возможности микромеханических сенсоров и области, в которых возможно их наиболее эффективное применение, еще только предстоит выяснить.

Подавляющее большинство работ в области микромеханических сенсоров в настоящее время носит иллюстративный характер и посвящено определению отдельно взятого аналита с помощью соответствующего селективного комплексообразующего реагента, иммобилизованного на поверхности кантилевера [4-7]. Влияние способа иммобилизации и структуры образующегося привитого слоя на величину аналитического сигнала и, как следствие, па чувствительность и другие характеристики сенсора зачастую систематически не исследуется. Также редко обсуждаются механизмы процессов, приводящих к изменению поверхностного натяжения в области привитого слоя. Лишь в самое последнее время начали появляться работы [8, 9], свидетельствующие об определяющем влиянии расположения молекул реагентов в привитом слое на экспериментально определяемую величину отклика сенсора -поверхностного натяжения на границе рецепторного слоя с анализируемым раствором. Это позволяет предположить, что микромеханические устройства на основе кантилеверов могут служить не только в качестве средств инструментального экспресс-анализа, но и в качестве инструментов для изучения привитых слоев и физико-химических процессов в приповерхностном слое. Поэтому выявление того, какую информацию о них можно получить с помощью микромеханических устройств на основе кантилеверов, является, несомненно, интересной и актуальной в фундаментальном аспекте задачей.

В связи с этим, основной целью работы было изучение физико-химических процессов в привитых рецепторных слоях микромеханических и пьезокварцевых сенсоров.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

2. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения в процессе структурной организации привитого слоя молекул лизоцима.

3. Разработка методов создания рецепторных слоев микромеханических сенсоров, способных к эффективному генерированию аналитического сигнала при селективной сорбции определяемого вещества.

4. Изучение аналитических характеристик модельных микромеханических сенсоров для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови), морфина и антител к морфину.

5. Изучение комплексообразующей способности тромбин-связывающего аптамера, иммобилизованного на поверхности золота. Создание модельного пьезокварцевого сенсора для определения тромбина и оптимизация методики определения тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Поиск способов увеличения чувствительности разработанного сенсора.

6. Сравнительный анализ эффективности микромеханических и пьезокварцевых t сенсоров.

2. Обзор литературы

Основной целыо настоящей работы является изучение физико-химических процессов на поверхности рецепторов микромеханических и пьезокварцевых сенсоров, происходящих с участием традиционных (ш-замегценных алкилтиолов и алкилсиланов) и новых модификаторов поверхности (аптамеров и 0)-замешенных алкилсилатранов). В связи с этим, основное внимание в обзоре литературы уделено, во-первых, принципам работы и наиболее существенным достижениям в области разработки микромеханических устройств и, во-вторых, аптамерам: их структуре, свойствам и использованию аптамеров в сенсорах различных типов.

Заключение диссертации по теме "Физическая химия"

5. Выводы

2. Показано, что хемосорбция 3-аминопропилсилатрана на окисленной кремниевой поверхности протекает последовательно в две стадии: быстрое взаимодействие 3-аминопропилсилатрана с поверхностными силанольными группами и последующий медленный гидролиз с выделением триэтаноламина. Основываясь на различии скоростей стадий, была предложена методика модифицирования поверхности кремния 3-аминопропилсилатраном, позволяющая избежать образования поли-силоксановых слоев.

3. Обнаружена агрегация лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота, кремния и слюды, происходящая в условиях, при которых агрегация белка в растворе не наблюдается — рН 3,0, комнатная температура. Показано, что при высокой плотности прививки ковалентное закрепление молекул лизоцима не препятствует агрегации. Агрегация иммобилизованного лизоцима протекает в две стадии: конформационный переход в молекуле белка и собственно образование агрегатов.

4. Показана возможность создания микромеханичсских иммуносенсоров для обнаружения антител к морфину в сыворотке крови. Разработан сенсор для определения концентрации морфина в водных растворах в диапазоне концентраций 3-50 мкг/мл.

6. Определена константа связывания тромбина с иммобилизованным аптамером 5'-HS-T(CH2CH20)6T5CCAACGGTTGGTGTGGTTGG-3', Кь = 0,047 нМ-1.

7. Разработан сенсор для проточно-игокекционного определения тромбина в модельных растворах в диапазоне концентраций 10-500 нМ с относительной погрешностью, не превышающей 10%. Установлено, что продолжительность стабильной работы сенсора составляет 60 суток (-200 измерений). Показано, что присутствие 40-кратного избытка бычьего сывороточного альбумина не мешает определению тромбина.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Кудринский, Алексей Александрович, Москва

1. Кагтралл Р.В. Химические сенсоры. М.: Научный мир. 2000. 144 с.

2. Лисичкин Г.В., Фадеев А.Ю., Сердан А.А., Нестеренко П.Н., Мингалев П.Г., Фурман Д.Б. Химия привитых поверхностных соединений. М.: Физматлит. 2003. 592 с.

3. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. //Nature. 1990. V. 346. P. 818-822.

4. Fritz J., Bailer M.K., Lang H.P., Rothuizen H., Vettiger P., Meyer E., Guntherodt H.-J., Gerber Ch., Gimzewski J.K. Translating biomolecular recognition into nanomechanics. // Science. 2000. V. 288. P. 316-318.

5. Raiteri R., Grattarola M., Bcrger R. Micromechanics senses biomolecules. // Mat. Today. 2002. V. 5. Iss. 1. P. 22-29.

6. Lavrik N.V., Sepaniak M.J., Datskos P.G. Cantilever transducers as a platform for chemical and biological sensors. // Rev. Sci. Inst. 2004. V. 75. Iss. 7. P. 2229-2253.

7. Ziegler C. Cantilever-based biosensors. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 379. P. 946-959.

8. Braun Т., Backmann N., Vogtli M., Bietsch A., Engel A., Lang H.-P., Gerber C., Hegner M. Conformational change of bacteriorhodopsin quantitatively monitored by microcantilever sensors. // Biophys. J. 2006. V. 90. Iss. 8. P. 2970-2977.

9. Backmann N., Zahnd C., Huber F., Bietsch A., Pluckthun A., Lang H.-P., Guntherodt H.-J., Hegner M., Gerber C. A label-free immunosensor array using single-chain antibody fragments. //Proc. Natl. Ac. Sci. 2005. V. 102. Iss. 41. P. 14587-14592.

10. Binnig G., Quate C., Gerber C. Atomic force microscope. // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56. P. 930-933.

11. Devoe D.L., Pisano A.P. Modeling and optimal design of piezoelectric cantilever microactuators. // J. Microelectrochem. Sys. 1997. V. 6. Iss. 3. P. 266-270.

12. Piekarski В., Devoe D.L., Dubey M., Kaul R., Conrad J. Surface micromachined piezoelectric resonant beamfilters. // Sens. Act. A: Phys. 2001. V. 91. Iss. 3. P. 313-320.

13. Porter T.L., Eastman M.P., Pace D.L., Bradley M. Sensor based on piezoresistive microcantilever technology. // Sens. Act. A: Phys. 2001. V. 88. Iss. 1. P. 47-51.

14. Hagleitner C., Hierlemann A., Lange D., Kummer A., Kerness N., Brand O., Baltes H. Smart single-chip gas sensor microsystem. // Nature. 2001. V. 414. Iss. 6861. P. 293-296.

15. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2000. V. 74. P. 37-61.

16. Ratto T.V., Langry K.C., Rudd R.E., Balhorn R.L., Allen M.J., McElfresh M.W. Force spectroscopy of the double-tethered concanavalin-A mannose bond. // Biophysical Journal. 2004. V. 86. P. 2430-2437.

17. Tycko R. Insights into the amyloid folding problem from solid-state NMR. // Biochemistry. 2003. V. 42. Iss. 11. P. 3151-3159.

18. Strunz Т., Oroszlan K., Schafer R., Guntherodt H.-J. Dynamic force spectroscopy of single DNA molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1127711282.

19. Willemsen O.H., Sncl M.E., Cambi A., Greve J., De Grooth B.G., Figdor C.G. Bimolecular interactions measured by atomic force microscopy. // Biophysical Journal. 2000. V. 79. P. 3267-3281.

20. Gupta A., Akin D., Bashir R. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness. // Appl. Phys. Lett. 2004. V. 84. Iss. 11. P. 19761978.

21. Ilic В., Yang Y., Craighead H.G. Virus detection using nanoelectromechanical devices. // Appl. Phys. Lett. 2004. V. 85. Iss. 13. P. 2604-2606.

22. Yaminsky I.V., Kiselev G.A. Scanning probe microscopy of biomacromolecules: instrumentation and experiments. // Frontiers of multifunctional integrated nanosystems. Kluwer Academic Publishers. 2004. P. 123-130.

23. Ilic В., Czaplewski D., Zalalutdinov M., Craighead H.G. Single cell detection with micromechanical oscillators. // J. Vacuum Sci. Technol. B. 2001. V. 19. Iss 6. P. 2825-2828.

24. Ono Т., Li X., Miyashita H., Esashi M. Mass sensing of adsorbed molecules in sub-picogram sample with ultrathin silicon resonator. // Rev. Sci. Instrum. 2003. V. 74. Iss. 3. P. 1240-1246.

25. Nugaeva N., Gfeller K.Y., Backmann N., Lang H.P., Duggelin M., Hegner M. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection. // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 21. P. 849-856.

26. Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Rapid biosensor for detection of antibiotic-selective growth of Escherichia coli. // Applied and Environmental microbiology. 2005. V. 71. Iss. 5. P. 2626-2631.

27. Gfeller K.Y., Nugaeva N., Hegner M. Micromechanical oscillators as rapid biosensor for the detection of active growth of Escherichia coli. // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 21. P. 528-533.

28. Berger R., Fabian J.-H. Thermal analysis of nanogram quantities using a micromechanical cantilever sensor. // Proc. 30th North American Thermal Society Conference. Pittsburgh (USA), 23-25 September 2002. P. 68-73.

29. Wickramasinghe H.K. Progress in scanning probe microscopy. // Acta Mater. 2000. V. 48. Iss. l.P. 347-358.

30. Ilic B. Using a nanomechanical cantilever and atomic force microscopy to measure bacterial cell mass. // Microscopy and Analysis. 2003. P. 9-17.

31. Tamayo J., Humphris A.D.L., Malloy A.M., Miles M.J. Chemical sensors and biosensors in liquid environment based on microcantilevers with amplifed quality factor. // Ultramicroscopy. 2001. V. 86. Iss. 1-2. P. 167-173.

32. Su M., Li S., Dravid V.P. Microcantilever resonance-based DNA detection with nanoparticle probes. // Appl. Phys. Lett. 2003. V. 82. Iss. 20. P. 3562-3564.

33. Ekinci K.L., Yang Y.T., Roukes M.L. Ultimate limits to inertial mass sensing based upon nanoelectromechanical systems. // J. Appl. Phys. 2004. V. 95. Iss. 5. P. 26822689.

34. Naik Т., Longmire E.K., Mantell S.C. Dynamic response of a cantilever in liquid a solid wall. // Sens. Act. A. Phys. 2003. V. 102. Iss. 3. P. 240-254.

35. Dring A.L., Jones B.E. Integrated on-line multisensing of fluid flow using a mechanical resonator. // Sensors and Actuators. 2000. V. 85. Iss. 1. P. 275-279.

36. Sugawara Y., Ishizaka Т., Morita S., Imai S., Mikoshiba N. Simultaneous observation of atomically resolved AFM/STM images of a graphite surface. // Jpn. J. Appl. Phys. 1990. V. 29. Iss. 1. P. L157-L159.

37. Hochwitz Т., Henning A.K., Levery C. Imaging integrated circuit dopant profiles with force-based scanning Kelvin probe microscope. // J.Vac.Sci.Technol. B. 1996. V. 14. Iss. l.P. 440-446.

38. Saens J.J., Garcia N., Grutter P., Meyer E., Heinzelmann H., Wiezendanger R., Rosenthaler L., Hidber H.R., Guntherodt H.J. Observation of magnetic forces by the atomic force microscope. // J. Appl. Phys. 1987. V. 63. P. 4293-4295.

39. Martin Y., Wickramasinghe H.K. Magnetic imaging by "force microscopy" with 1000-A resolution. // Appl. Phys. Lett. 1987. V. 50. Iss. 20. P. 1455-1457.

40. Majumdar A., Lai J., Chandrachood M., Nakabeppu O., Wu Y., Shi Z. Thermal imaging by atomic force microscopy using thermocouple cantilever probes. // Rev. Sci. Instrum. 1995. V. 66. Iss. 6. P. 3584-3591.

41. Berger R., Gerber C., Lang H.-P., Gimzewski J.K. Micromechanics: A Toolbox for Femtoscale Science: «Towards a Laboratory on a Tip». // Microelectronic Engineering. 1997. V. 35. Iss. 1. P. 373-379.

42. Subramanian A., Oden P.I., Kennel S.J., Jacobson K.B., Warmack R.J., Thundat Т., Doktycz M.J. Glucose biosensing using an enzyme-coated microcantilever. // Appl. Phys. Lett. 2002. V. 81. Iss. 2. P. 385-387.

43. Gimzewski J.K., Gerber C., Meyer E., Schlittler R.R., Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor. // Chem. Phys. Lett. 1994. V. 217. P. 589594.

44. Stoney G.G. The tension of metallic films deposited by electrolysis. // Proc. R. Soc. London A. 1909. V. 82. P. 172-175.

45. Preissig F.J. Applicability of the classical curvature-stress relation for thin films on plate substrates. // J. Appl. Phys. 1989. V. 66. P. 4262-4268.

46. Godin M., Tabard-Cossa V., Grutter P. Quantitative surface stress measurements using a microcantilever. // Appl. Phys. Lett. 2001. Vol. 79, Iss. 4. P.551-553.

47. Berger R., Delamarche E., Lang H.P., Gerber C., Gimzewski J.K., Meyer E., Guntherodt H.-J. Surface stress in the self-assembly of alkanethiols on gold probed by a force microscopy technique. // Appl. Phys. A. 1998. V. 66. P. 55-59.

48. Raiteri R., Butt H.-J., Grattarola M. Changes in surface stress at the liquid/solid interface measured with a microcantilever. // Electrochim. Acta. 2000. V. 46. P. 157-163.

49. Godin M., Williams P.J., Tabard-Cossa V., Laroche O., Beaulieu L.Y., Lennox R.B., Grutter P. Surface stress, kinetics, and structure of alkanethiol self-assembled monolayers. // Langmuir. 2004. V. 20. Iss. 17. P. 7090-7096.

50. Hansen A.G. In situ scanning tunneling microscopy and microcantilever investigations of yeast cytochrome с on gold. // Ph.D. theses. Department of Chemistry Technical University, Denmark. 2002. 141 p.

51. Lavrik N.V., Tipple C.A., Sepaniak M.J., Datskos P.G. Gold nano-structured for transduction of biomolecular interactions into micrometer scale movements. // Biomedical Microdevices. 2001. V. 3. Iss. 1. P. 35-44.

52. Quist F., Tabard-Cossa V., Badia A. Nanomechanical cantilever motion generated by a surface-confined redox reaction. // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. Iss. 39. P. 10691-10695.

53. Pinnaduwage L.A., Boiadjiev V., Hawk J.E., Thundat T. Sensitive detection of plastic explosives with self-assembled monolayer-coated microcantilevers. // Appl. Phys. Lett. 2003. V. 83. Iss. 7. P. 1471-1473.

54. Datskos P.G., Sauers I. Detection of 2-mercaptoethanol using gold-coated micromachined cantilevers. // Sensors and Actuators B. 1999. V. 61. Iss. 1. P. 75-82.

55. Ji H.-F., Hansen K.M., Hu Z., Thundat T. Detection of pH variation using modified microcantilever sensors. // Sensors and Actuators B. 2001. V. 72. Iss. 3. P. 233-238.

56. Ji H.-F., Finot E., Dabestani R., Thundat Т., Brown G.M., Britt P.F. A novel selfassembled monolayer (SAM) coated microcantilever for low level cesium detection. // Chem. Commun. 2000. P. 457-458.

57. Ji H.-F., Thundat Т., Dabestani R„ Brown G.M., Britt P.F., Bonnesen P.V. Ultrasensitive detection of CrO/" using microcantilever sensor. // Anal. Chem. 2001. V. 73. Iss. 7. P. 1572-1576.

58. Ji H.-F., Yan X., McShane M.J. Experimental and theoretical aspects of glucose measurement using a microcantilever modified by enzyme-containing polyacrylamide. // Diabetes Technol. Ther. 2005. V. 7. Iss. 6. P. 986-995.

59. Wu G., Ji H., Hansen K., Thundat Т., Datar R., Cote R., Hagan M.F., Chakraborty A.K., Majumdar A. Origin of nanomechanical cantilever motion generated from biomolecular interactions. // PNAS. 2001. V. 98. Iss. 4. P. 1560-1564.

60. Moy V.T., Florin E.L., Gaub H.G. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. // Sciencc. 1994. V. 266. P. 257-259.

61. Ji H.-F., Thundat T. In situ detection of calcium ions with chemically modified microcantilevers. // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. P. 337-343.

62. Guanghua W., Datar 11.R., Hansen K.M., Thundat Т., Cote R.J., Majumdar A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers. // Nature Biotechnology. 2001. V. 19. P. 856-860.

63. Raiteri R., Grattarola ML, Butt H.-J., Skladal P. Micromechanical cantilever-based biosensors. // Sensors and Actuators B. 2001. V. 79. Iss. 2. P. 115-126.

64. Grogan C., Raiteri R., O'Connor G.M., Glynn T.J., Cunningham V., Kane M., Charlton M., Leech D. Characterisation of an antibody coated microcantilever as a potential immunobased biosensor. // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. P. 201-207.

65. Arntz Y., Seelig J.D., Lang H.P., Zhang J., Hunziker P., Ramseyer J.P., Meyer E., Hegner M., Gerber Ch. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array. //Nanotechnology. 2003. V. 14. P. 86-90.

66. Dutta P., Tipple С.Л., Lavrik N.V., Datskos P.G., Hofstetter H., Hofstetter O., Sepaniak M.J. Enantioselective sensors based on antibody-mediated nanomechanics. // Analytical Chemistry. 2003. V. 75. Iss. 10. P. 2342-2348.

67. Yan X., Xu X.K., Ji H.-F. Glucose oxidase multilayer modified microcantilevers for glucose measurement. // Anal. Chem. 2005. V. 77. Iss. 19. P. 6197-6204.

68. Pei J., Tian F., Thundat T. Glucose biosensor based on the microcantilever. // Anal. Chem. 2004. V. 76. Iss. 2. P. 292-297.

69. Marie R., Jensenius H., Thaysen J., Christensen C.B., Boisen A. Adsorption kinetics and mechanical properties of thiol-modified DNA-oligos on gold investigated by microcantilever sensors. // Ultramicroscopy. 2002. V. 91. P. 29-36.

70. Yang M., Yau H.C.M., Chan H.L. Adsorption kinetics and ligand-binding poperties of thiol-modifed double stranded DNA on a gold surface. // Langmuir. 1998. V. 14. P. 6121-6129.

71. Hagan M.F., Majumdar A., Chakraborty A.K. Nanomechanical forces generated by surface grafted DNA. //J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106. P. 10163-10173.

72. Liu F., Zhang Y., Ou-Yang Z.-C. Flexoelectric origin of nanomechanic deflection in DNA microcantilever system. // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. P. 655-660.

73. Savran C.A., Knudsen S.M., Ellington A.D., Manalis S.R. Micromechanical detection of proteins using aptamer-based receptor molecules. // Anal Chem. 2004. V. 76. Iss. 11. P. 3194-3198.

74. Moulin A.M., O'Shea S.J., Badley R.A., Doyle P., Welland M.E. Measuring surface-induced conformational changes in proteins. //Langmuir. 1999. V. 15. P. 8776-8779.

75. Betts T.A., Tipple C.A., Sepaniak M.J., Datskos P.G. Selectivity of chemical sensors based on micro-cantilevers coated with thin polymer films. // Anal. Chim. Act. 2000. V. 422. Iss. l.P. 89-99.

76. Toda M., Itakura A.N., Beuscher K., Graf K., Berger R. Surface stress of polyelectrolyte adsorption measured by micromechanical cantilever sensors. // J. Surf. Sci. Nanotech. 2006. V. 4. P. 96-99.

77. Hilt J.Z., Gupta A.K., Bashir R., Peppas N.A. Ultrasensitive biomems sensors based on patterned with environmentally responsive hydrogels. // Biomedical Microdevices. 2003. V. 5. Iss. 3. P. 177-184.

78. Bietsch A., Zhang J., Hegner M., Lang H.-P., Gerber C. Rapid functionalization of cantilever array sensors by inkjet printing. // Nanotechnology. 2004. V. 15. Iss. 8. P. 873-880.

79. Datskos P.G., Lavrik N.V., Sepaniak M.J. Detection of explosive compounds with the use of microcantilevers with nanoporous coatings. // Sensor Lett. 2003. V. 1. Iss. 1. P. 25-32.

80. Xu X., Thundat Т., Brown G.M., Ji H.-F. Detection of Hg2+ using microcantilever sensors. // Anal. Chem. 2002. V. 74. Iss. 15. P. 3611-3615.

81. Ji H.-F., Zhang Y., Purushotham V.V., Kondu S., Ramachandran В., Thundat Т., Haynie D.T. 1,6-Hexanedithiol monolayer as a receptor for specific recognition of alkylmercury. //Analyst. 2005. V. 130. P. 1577-1579.

82. Liu K., Ji H.-F. Detection of Pb2+ using a hydrogel swelling microcantilever sensor.//Anal. Sci. 2004. V. 20. Iss. 1. P. 9-11.

83. Zhang Y., Ji H.-F., Brown G.M., Thundat T. Detection of Cr042" using a hydrogel swelling microcantilever sensor. // Anal Chem. 2003. V. 75. Iss. 18. P. 4773-4777.

84. Lang H.P., Hegner M., Gerber C. Cantilever array sensors. // Mat. Today. 2005. V. 8. Iss. 4. P. 30-36.

85. Goeders K.M., Colton J.S., Bottomley L.A. Microcantilevers: sensing chemical interactions via mechanical motion. // Chem. Rev. 2008. V. 108. P. 522-542.

86. Carrascosa L.G., Moreno M., Alvarez M., Lechuga L.M. Nanomechanical biosensors: a new sensing tool. // Trends in Analytical Chemistry. 2006. V. 25. Iss. 3. P. 196206.

87. Киселев Г.А. Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой подложке. // Диссертация на соискание ученой степени канд. физ.-мат. наук, Физический ф-т МГУ. 2007. 138 с.

88. Yan X., Xu X.K., Ji H.-F. Glucose oxidase multilayer modified microcantilevers for glucose measurement. // Anal. Chem. 2005. V. 77. Iss. 19. P. 6197-6204.

89. Pei J., Tian F., Thundat T. Glucose biosensor based on the microcantilever. // Anal. Chem. 2004. V. 76. Iss. 2. P. 292-297.

90. Subramanian A., Odcn P.I., Kennel S.J., Jacobson K.B., Warmack R.J., Thundat Т., Doktycz M.J. Glucosc bioscnsing using an enzyme-coated microcantilever. // Appl. Phys. Lett. 2002. V. 81. Iss. 2. P. 385-387.

91. Thaysen J., Boisen A., Hansen O., Bouwstra S. Atomic force microscopy probe with piezoresistive read-out and a highly symmetrical Wheatstone bridge arrangement. // Sens. Act. A. Phys. 2000. V. 83. Iss. 1. P. 47-53.

92. Song S., Wang L., Li J., Zhao J. Aptamer-based biosensors. // Trends in Analytical Chemistry. 2008. V. 27. P. 108-117.

93. Спиридонова B.A., Копылов A.M. Аптамерные ДНК принципиально новые узнающие элементы для биосенсоров. // Биохимия. 2002. Т. 67. №6. С. 850-854.

94. Копылов A.M., Спиридонова В.А. Комбинаторная химия нуклеиновых кислот: SELEX. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. №6. С. 1097-1113.

95. Jayasena S.D. Aptamers: An emerging glass of molecules that rival antibodies in diagnostics. //Clinical Chemistry. 1999. V. 45. P. 1628-1650.

96. Beinaraviciute-Kellner R., Lipps G., Krauss G. In vitro selection of DNA binding sites for ABF1 protein from Saccharomyces cerevisiae. // FEBS letters. 2005. V. 579. Iss. 20. P. 4535-4540.

97. Misono T.S., Kumar P.K. Selection of RNA aptamers against human influenza virus hemagglutinin using surace plasmon resonance. // Anal. Biochem. 2005. V. 342. Iss. 2. P. 312-317.

98. Surugiu-Warnmark I., Warnmark A., Toresson G., Gustafsson J.-A., Bulow L. Selection of DNA aptamers against rat liver X receptors. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 332. Iss. 2. P. 512-517.

99. Lee S.K., Park M.W., Yang E.G., Yu J., Jeong S. An RNA aptamer that binds to the B-catenin interaction domain of TCF-1 protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 327. Iss. 1. P. 294-299.

100. Williams K„ Liu X.H, Lin H.Y., Ausiello D.A., Kim P.S., Bartel D.P. Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin. // PNAS. 1997. V. 94. Iss. 21. P. 11285-11290.

101. Mendonsa S.D., Bowser M.T. In vitro selection of aptamers with affinity for neuropeptide Y using capillary electrophoresis. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. Iss. 26. P. 9382-9383.

102. Gilbert B.A., Sha M., Wathen S.T., Rando R.R. RNA Aptamers that Specifically Bind to а К Ras-Derived Farncsylated Peptide. // Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. Iss. 6. P. 1115-1122.

103. Yang Q., Goldstein I.J., Mei H.-Y., Engelke D.R. DNA ligands that bind tightly and selectively to cellobiose. // PNAS. 1998. V. 95. Iss. 10. P. 5462-5467.

104. Srisawat Ch., Goldstein I.J., Engelke D.R. Sephadex-binding RNA ligands: rapid affinity purification of RNA from complex RNA mixtures. // Nucleic Acids Research. 2001. V. 29. Iss. 2. E4. 5 p.

105. Masud M.M., Kuwahara M., Ozaki H., Sawai H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. // Bioorg. Med. Chem. 2004. V. 12. Iss. 5. P. 1111-1120.

106. Wallace S.T., Schroeder R. In vitro selection and characterization of streptomycin-binding RNAs: recognition discrimination between antibiotics. // RNA. 1998. V. 4. Iss. l.P. 112-123.

107. Berens Ch., Thain A., Schroeder R. A tetracycline-binding RNA aptamer. // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. Iss. 10. P. 2549-2556.

108. Cowan J.A., Ohyama Т., Wang D., Natarajan K. Recognition of a cognate RNA aptamer by neomycin B: quantitative evaluation of hydrogen bonding and electrostatic interactions. //Nucleic Acids Research. 2000. V. 28. Iss. 15. P. 2935-2942.

109. Wang Y., Killian J., Hamasaki K., Rando R.R. RNA molecules that specifically and stoichiometrically bind aminoglycoside antibiotics with high affinities. // Biochemistry. 1996. V. 35. Iss. 38. P. 12338-12346.

110. Boiziau С., Dausse E., Mishra R.K., Duconge F., Toulme J.-J. Identification of aptamers against the DNA template for In Vitro transcription of the HIV-1 Tar element. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. Iss. 4. P. 369-380.

111. Le R., Mishra R.K., Toulme J.-J. Selective inhibition of cell-free translation by oligonucleotides targeted to a mRNA hairpin structure. // Nucleic Acids Research. 1998. V. 26. Iss. 10. P. 2273-2278.

112. Ток J.B., Cho J., Rando R.R. RNA aptamers that specifically bind to a 16S ribosomal RNA decoding region construct. // Nucleic Acids Research. 2000. V. 28. Iss. 15. P. 2902-2910.

113. Mannironi C., DiNardo A. Fruscoloni P. Tocchini-Valentini G.P. In vitro selection of dopamine RNA ligands. // Biochemistry. 1997. V. 36. Iss. 32. P. 9726-9734.

114. Vianini E., Gatto B. Palumbo M. In vitro selection of DNA aptamers that bind L-tyrosinamide. // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. Iss. 10. P. 2543-2548.

115. Stojanovic M.N., de Prada P., Landry D.W. Aptamer-based folding fluorescent sensor for cocaine. // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. Iss. 21. P. 4928-4931.

116. Hianik Т., Ostatna V., Sonlajtnerova M., Grman I. Influence of ionic strength, pH and aptamer configuration for binding affinity to thrombin. // Bioelectrochemistry. 2007. V. 70. P.127-133.

117. Hianik Т., Ostatna V., Zajacova Z., Stoikova E., Evtugyn G. Detection of aptamer-protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. V. 15. P. 291-291.

118. Bang G.S., Cho S., Kim B-G. A novel electrochemical detection method for aptamer biosensors. //Biosens. Bioelectron. 2005. V. 21. P. 863-870.

119. Radi A-E., Sanchez J.L., Baldrich E., O'SuIlivan C.K. Reagentless, reusable, ultrasensitive electrochemical molecular beacon aptasensor. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 117-124.

120. Hianik Т., Ostatna V., Zajacova Z. The study of the binding of globular proteins to DNA using mass detection and electrochemical indicator methods. // J. Electroanal. Chem. 2004. V. 564. P. 19-24.

121. Centi S., Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Aptamer-based detection of plasma proteins by an electrochemical assay coupled to magnetic beads. // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 1466-1473.

122. Cai H., Lee T.M-H., Hsing I-M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. // Sens. Act. B. 2006. V. 114. P. 433-437.

123. Liss M., Petersen В., Wolf H., Prohaska E. Aptamer-based Assays. // Anal. Chem. 2008. V. 79. P. 1082-1088.

124. Balamurugan S., Obubuafo A., Soper S.A., McCarlery R.L., Spivak D.A. Designing highly specific biosensing surfaces using aptamer monolayers on gold. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 6446-6453.

125. Liss M., Petersen В., Wolf H., Prohaska E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. //Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 4488-4495.

126. Ермолаева Т.Н., Калмыкова E.H. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы. // Успехи химии. 2006. Т. 75. С. 445-459.

127. Фадеев А.Ю., Ельцов А.А., Алешин Ю.К., Малышенко С.И., Лисичкин Г.В. Жидкостной химически модифицированный кварцевый резонатор как иммупосенсор. //Ж. физ. хим. 1994. Т. 68. № 2. С. 2071-2075.

128. Калмыкова Е.Н., Ермолаева Т.Н., Еремин С.А. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений. // Вестник Моск. ун-та, сер. хим. 2002. Т. 43. № 6. С. 399-403.

129. Kanazawa К.К., Gordon J.G. Frequency of a quartz microbalance in contact with liquid. //Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 1770-1771.

130. Медянцева Э.П., Халдеева Б.В., Будников Г.К. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы и перспективы. // Журн. анал. химии. 2001. Т. 56. № 10. С. 1015-1031.

131. Schlecht U., Malave A., Gronewold Т., Tewes М., Lohndorf М. Comparison of antibody and aptamer receptors for the specific detection of thrombin with a nanometer gap-sized impedance biosensor. //Anal. Chim. Acta. 2006. V. 573-574. P. 65-68.

132. Hamaguchi N., Ellington A., Stanton M. Aptamer beacons for the direct detection of proteins. //Anal. Biochem. 2001. V. 294, Iss. 2, P. 126-131.

133. С .A. Kretz, A.R. Stafford, J.C. Fredenburgh, J.I. Weitz. HD1, a thrombin-directed aptamer, binds exosite 1 on prothrombin with high affinity and inhibits its activation by prothrombinase. Hi. Biol. Chem. 2006. V. 281, Iss. 49, P. 37477-37485.

134. Shlyakthenko L.S., Potaman V.N., Sinden R.R., Gall A.A., Lyubchenko Y.L. Structure and dynamics of three-way DNA junctions: atomic force microscopy studies. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3472-3477.

135. Shlyakhtenko L.S., Gall A.A., Filonov A., Cerovac Z., Lushnikov A., Lyubchenko Y.L. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. // Ultramicroscopy. 2003. V. 97. P. 279-287.

136. Riener C.K., Stroh C.M., Ebner A., Klampfl C., Gall A.A., Romanin C., Lyubchenko Y.L., Hinterdorfer P., Gruber H.J. Simple test system for single molecule recognition force microscopy. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 479. P. 59-75.

137. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991. 543 с.

138. Beaucage S.L. Strategies in the preparation of DNA oligonucleotide arrays for diagnostic applications. // Current Medicinal Chemistry. 2001. V. 8. P. 1213-1244.

139. Schessler H.M., Karpovich D.S., Blanchard G.J. Quantitating the balance between enthalpic and entropic forces in alkanethiol/gold monolayer self assembly. // Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. Iss. 40. P. 9645-9651.

140. Peterlinz K.A., Georgiadis R. In situ kinetics of self-assembly by surface plasmon resonance spectroscopy. // Langmuir. 1996. V. 12. Iss. 20. P. 4731-4740.

141. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина E.A. Коллоидная химия. М.: Высшая школа. 2004. 446 с.

142. Yang G., Liu G. New insights for self-assembled monolayers of organothiols on Au(l 11) revealed by scanning tunneling microscopy. // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. Iss. 34. P. 8746-8759.

143. Stein P.E., Leslie A.G.W., Finch J.T., Turnell W.G., Mclaughlin P.J., Carrell R.W. Crystal structure of ovalbumin as a model for the reactive centre of serpins. // Nature. 1990. V. 347. P. 99-102, (PDB lova).

144. Konno T. Amyloid-induced aggregation and precipitation amyloid fibril of soluble proteins: an electrostatic contribution of the Alzheimer's 13(25-35) amyloid fibril. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2148-2154.

145. Stefani M. Protein misfolding and aggregation: new examples in medicine and biology of the dark side of the protein world. // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. V. 1739. P. 5-25.

146. Lyubchenko Y.L., Kransnoslobodtsev A., Shlyakhtenko L.S., Ukraintsev E., Zaikova Т.О., Keana J.F. W. Nanomedicine and protein misfolding diseases. // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2005. V. 1. P. 300-305.

147. Uversky V.N., Protein folding revisited. A polypeptide chain at the folding misfolding - nonfolding cross-roads: which way to go? // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 1852-1871.

148. Ohnishia S., Takanob K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. // Cell. Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 51 1-524.

149. Prusiner S.B. Prions. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 1336313383.

150. Hamada D., Dobson C.M. A kinetic study of 13-lactoglobulin amyloid fibril formation promoted by urea. // Protein Science. 2002. V.l 1. P. 2417-2426.

151. Kuwajima K., Yamaya H., Sugai S. The burst-phase intermediate in the refolding of B-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy. //J. Mol. Biol. 1996. V. 264. P. 806-822.

152. Kato A., Takagi T. Formation of intermolecular beta-sheet structure during heat denaturation of ovalbumin. // J. Agric. Food Chem. 1988. V. 36. P. 1156-1159.

153. Tani F., Murata M., Higasa Т., Goto M., Kitabatake N., Doi E. Molten globule state of protein molecules in heat-induccd transparent food gels. // J. Agric. Food Chem. 1995. V. 43. P. 2325-2331.

154. McAllister C., Karymov M., Kawano Y., Lushnikov A.Y., Mikheikin A., Uversky V.N., Lyubchenko Y.L. Protein interactions and misfolding analyzed by AFM force spectroscopy. // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. Iss. 5. P. 1028-1043.

155. Arnaudov L.N., de Vries R. Thermally induced fibrillar aggregation of hen egg white lysozyme. // Biophys J. 2005. V. 88. P. 515-526.

156. Czeslik C., Winter R. Effect of temperature on the conformation of lysozyme adsorbed to silica particles. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2001. V. 3. P. 235-239.

157. Shiraki K., Kudou M., Nishikori S., Kitagawa H., Imanaka Т., Takagi M. Arginine ethylester prevents thermal inactivation and aggregation of lysozyme. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 3242-3247.

158. Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 496-501.

159. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинстика. Практический курс. М.: Гранд. 1999. С. 351-353.

160. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера. 2005.355 с.

161. Evanoff D.D. Jr., Chumanov G. Synthesis and optical properties of silver nanoparticlcs and arrays. // ChemPhysChem. 2005. V. 6. P. 1221-1231.

162. Крутиков Ю.А., Кудринский A.A., Оленин АЛО., Лисичкин Г.В. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. // Успехи химии. 2008. Т. 77. № 3. С. 242-269.

163. Murugadoss A., Chattopadhyay A. A "green" chitosan-silver nanoparticle composite as a heterogeneous as well as micro-heterogeneous catalyst. // Nanotechnology. 2008. V. 19. P. 237-243.

164. Wu L., Shi C., Tian L., Zhu J. A one-pot method to prepare gold nanoparticle chains with chitosan. // J. Phys. Chem. Lett. 2008. V. 112. P. 319-323.

165. Wang В., Chen K., Jiang S., Reincke F., Tong W., Wang D., Gao C. Chitosan-mediated synthesis of gold nanoparticles on patterned poly(dimethylsiloxane) surfaces. // Biomacromolecules. 2006. V. 7. P. 1203-1209.

166. Huang H., Yang X. Synthesis of chitosan-stabilized gold nanoparticles in the absence/presence oftripolyphospate. //Biomacromolecules. 2004. V. 5. P. 2340-2346.

167. Guo R., Zhang L., Zhu Z., Jiang X. Direct facile approach to the fabrication of chitosan-gold hybrid nanospheres. // Langmuir. 2008. V. 24. P. 3459-3464.

168. Xing R., Liu S., Yu H., Guo Z., Wang S., Li C., Li Z., Li P. Salt-assisted acid hydrolysis of chitosan to oligomers under microwave irradiation. // Carbohydrate Research. 2005. V. 340. P. 2150-2153.