Фотохимические реакции триптофана и его природного метаболита кинуренина тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

□03469207

На правах рукописи

Шерин Пётр Сергеевич

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ТРИПТОФАНА И ЕГО ПРИРОДНОГО МЕТАБОЛИТА КИНУРЕНИНА

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск - 2009

1 А М;

003469207

Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель

доктор химических наук, Цеиталович Юрпй Павлович

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, профессор Соколова Ирина Владимировна

кандидат физико-математических наук, Глебов Евгений Михайлович

Ведущая организация

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится "_3_" июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 при Институте Химической Кинетики и Горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан " 24 " апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук

Онищук А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Исследование первичных фотореакций с участием аминокислот - структурных единиц белков - является важной задачей для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живой природе. Аминокислота триптофан, присутствующая в составе многих белков, обладает наибольшим поглощением в диапазоне длин волн 260-310 нм среди всех аминокислот. Фотоионизация триптофана считается одним из важнейших каналов фотоиндуцированного окисления белковых молекул и может являться начальной стадией развития многих заболеваний. Фотохимия триптофана широко изучалась на протяжении нескольких последних десятилетий, однако до сих пор остаются открытыми несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана. Прежде всего, остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а также природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции. Таким образом, детальное исследование механизма фотоионизации триптофана представляется важной и актуальной задачей.

Кинуренин и его производные, обнаруженные в хрусталике глаза, являются природными метаболитами аминокислоты триптофан. Фотохимические реакции этих соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения обладают поглощением в диапазоне 300-400 нм и являются очень слабыми фотосенсибилизаторами. На этом основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами, предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было сообщено, что кинуренин может выступать в роли фотовосстановителя и фотоокислителя ряда биологически значимых соединений, однако механизмы этих реакций остаются неизвестными. Исследования термических реакций кинурешшов показали, что эти соединения являются нестабильными при физиологических условиях; спонтанное дезаминирование приводит к образованию реакционных соединений, которые могут ковалентно связываться с белками хрусталика. Белки, модифицированные молекулами УФ фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что кинуренины могут участвовать в реакциях фотоповреждения белков хрусталика, что, в свою очередь, может давать существенный вклад в развитие катаракты. Таким образом, исследование механизмов фотореакций кинуренинов является актуальной задачей для фотохимии, биологии и медицины.

Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинуренина, изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и исследованию возможных реакций этих частиц с молекулами, содержащимися в хрусталике глаза.

Целями данной работы являются:

(1) Исследование влияния параметров среды (температура, рН среды, растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.

(2) Исследование механизма ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, рН среды, температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.

(3) Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина, образующегося под действием УФ излучения, по отношению к ряду соединений, содержащихся в хрусталике глаза.

(4) Исследование фотохимической активности ковалентно связанных аддукгов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике глаза.

Научная новизна работы. Впервые разделены вклады в однофотонную ионизацию триптофана от нерелаксированного предфлуоресцентного и релаксированного нижнего синглетных возбужденных состояний. Показано, что квантовый выход фотоионизации из состояния *8 увеличивается с уменьшением температуры, что обусловлено конкуренцией между фотоионизацией из состояния и колебательной релаксации —> Бь Релаксация является термически активируемым процессом, при этом энергия активации не зависит от свойств используемых растворителей.

Установлено, что ультрабыстрый безизлучательный переход —> Бо в молекуле кинуренина обусловлен межмолекулярными взаимодействиями посредством водородных связей между фотовозбужденным кинуренином и молекулами растворителя. Впервые зарегистрировано триплетное состояние кинуренина, изучены фотохимические свойства этого интермедиата. Показано, что фотоионизация кинуренина протекает по двухфотонному механизму; триплетное состояние является предшественником этой фотореакции. Установлены механизмы и измерены константы скорости реакций тушения триплетного состояния кинуренина рядом аминокислот и антиоксидантов, присутствующих в хрусталике глаза. Показано, что кинуренин, ковалентно связанный с аминокислотами, проявляет большую фотохимическую активность, чем в свободном состоянии.

Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для дальнейших фундаментальных исследований фотохимических систем с участием триптофана и кинуренина. В работе установлен механизм эффективной УФ защиты молекулами кинуренина, что может быть использовано при разработке новых материалов с высокой степенью защиты от УФ излучения. Данные о фотохимической активности кинуренина могут быть востребованы при разработке лекарственных препаратов для терапевтического лечения и/или замедления развития ранних стадий катаракты.

Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Весь объём экспериментальных исследований выполнен лично автором или при его непосредственном участии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях и симпозиумах: XVI-XVIII, XX симпозиумах "Современная Химическая Физика" (Туапсе, Россия, 2004-2006, 2008 г.), 9th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Оксфорд, Великобритания, 11-17 сентября 2005 г.), 5th Research Workshop on Diffusion Assisted Reactions (Новосибирск, Россия, 13-19 августа 2006 г.), Porquerolles International Conference on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (остров Поркероль, Франция, 29 сентября 2006 г.), An International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry (Коттаям, Керала, Индия, 8-11 февраля 2007 г.), Современные Подходы к Проблемам Физикохимии и Катализа (Новосибирск, Россия, 16-19 мая 2007 г.), VII Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Черноголовка, Россия, 25-28 июня 2007 г.), 6th Aegean Summer School in Visual Optics (Ираклион, Греция, 26 июня - 1 июля 2007 г.), International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (Аскона, Швейцария, 19-24 августа 2007 г.), I Международная Конференция «Физико-Химические Методы Исследования Нанообъектов в Химии, Биологии и Медицине» (Туапсе, Россия, 3-9 октября 2007 г.), Central European Conference on Photochemistry (Бад Хофгаштайн, Австрия, 10-14 февраля 2008 г.), XXIX European Congress on the Molecular Spectroscopy (Опатия, Хорватия, 31 августа - 5 сентября 2008 г.).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 статьях, а также в 22 тезисах международных и российских симпозиумов и конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 185 наименований. Работа изложена на 133 страницах, содержит 51 рисунок, 12 таблиц и 1 схему.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.

Глава I представляет собой обзор литературы, посвященной фотохимическим реакциям триптофана и кинуренина. В первом разделе рассматриваются фотофизика и фотохимия индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены основные фотохимические реакции, а также свойства триплетных состояний и радикалов, образующихся при фотолизе этих молекул. Особое внимание уделено фотоионизации триптофана. Приведено обсуждение возможных механизмов фотоионизации (одно- или двухфотонный процессы) и природы фотовозбужденных состояний, предшествующих этой реакции. Во втором разделе представлен обзор термических и фотохимических реакций кинуренина и его производных, которые могут иметь место в хрусталике глаза. Рассмотрены известные на сегодняшний день фотохимические свойства кинуренинов; показано, что кинуренины являются эффективными молекулярными УФ фильтрами. Отдельное внимание уделено обзору различных механизмов, ответственных за быструю дезактивацию возбужденных состояний в органических молекулах. Рассмотрена термическая нестабильность кинуренинов и последующие реакции с участием продуктов распада, которые могут приводить к образованию новых УФ фильтров или ковалентному присоединению кинуренинов к белкам хрусталика. Обсуждается связь между термическими превращениями кинуренинов и их фотохимической активностью, а также возможная роль этих процессов в катаракгогенезе.

В главе II подробно описаны используемые в работе методы исследования (стационарная и времяразрешенная оптическая спектроскопия) и методики проведения экспериментов. Исследование динамики промежуточного поглощения с наносекундным временным разрешением было проведено с помощью установки лазерного импульсного фотолиза, созданной в МГЦ СО РАН (возбуждение: 266, 308, 355 нм; регистрация: 240-670 нм; временное разрешение 10 не), которая оборудована температурной приставкой, позволяющей проводить эксперименты в диапазоне температур 200-360 К. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения с фемтосекундным временным разрешением было осуществлено с помощью соответствующих установок, расположенных в университете г. Женева, Швейцария (возбуждение: 400 нм; регистрация флуоресценции 420-620 нм; регистрация промежуточного поглощения 360-750 нм; временное разрешение 200 фс).

Глава III настоящей диссертации посвящена исследованию влияния параметров среды (температура, рН, растворитель) на механизм однофотонной ионизации водных растворов триптофана.

Зависимость квантового выхода фотоионизации триптофана от энергии импульса лазера показала, что в наших экспериментальных условиях при энергии импульса лазера меньше 20 мДж вклад от двухфотонной ионизации становится пренебрежимо мал. В этих условиях были получены зависимости квантовых выходов фотоионизации от температуры для Л'-ацетил-Л-триптофана (А'АТгрН) и ¿-триптофана (¿-ТгрН). Эксперименты были проведены в кислой и нейтральной средах с целью разделения вкладов от нерелаксированного предфлуоресцентного и релаксированного Б] синглетных возбужденных состояний в общий процесс ионизации. В кислых условиях фотоионизация из нижнего синглетного состояния 81 подавлена процессом протонирования индольного кольца через растворитель, в то время как в нейтральной среде одпофотонная ионизация происходит из обоих состояний и Бь

0.06

ш 0.04

■о ш

е

X 0.02

со

Яш

-«Я

X 1Н (этанол/вода 10/1) О ТгрН (метанол/вода 10И) ■ ТгрН (этанол/вода 10/1)

200

250 300

Температура, К

350

2.8 3.2 3.6 4.0 4.4 4.8 1Яемпература, 103/К

Рис. 3.1.я. Зависимости квантового выхода фотоионизации от температуры для 1Н и ¿-ТгрН в кислых растворах (рН 0.1). X: Щ в смеси этанол/вода 10/1, О: ¿-ТгрН в смеси метанол/вода 10/1, Я: ¿-ТгрН в смеси этанол/вода 10/1. б. Зависимость 1п(1/Ф*„„„ - 1) от 1/Т для ¿-ТгрН в смеси этанол/вода 10/1.

В кислых растворах с увеличением температуры наблюдается небольшое уменьшение квантового выхода ионизации из состояния для ¿-ТгрН и А'АТгрН. Этот эффект может быть отнесен к конкуренции двух ультрабыстрых процессов — ионизации из состояния и релаксации —> Бь Для подробного исследования этого эффекта были получены зависимости квантового выхода ионизации для индола (Ш) и ¿-триптофана (¿-ТгрН) в различных растворителях в широком диапазоне температур (Рис. 3.1.а). Квантовый выход ионизации из состояния (Ф'т„) может быть записан следующим образом:

С

Ф......=-

(3.1)

Предполагая, что константа скорости ионизации из состояния ( к'ион ) является независимой от температуры, а константа скорости релаксации (кр) зависит от температуры согласно закону Аррениуса, было получено следующее выражение:

1п(-1--1) = 1П(4£-)-— (3.2)

Ф к КГ

^ыон ион

На Рис. 3.1.6 представлена зависимость выхода ионизации /,-ТгрН в смеси этанол/вода 10/1 в координатах Аррениуса. Полученные результаты хорошо описываются линейной зависимостью, что позволяет получить значения энергии активации Ер и 1п{Ар! к[т ), представленные в Табл. 3.1. Можно видеть, что для всех исследованных систем значение Ер составляет величину около 4.5 кДж/моль и почти не зависит от свойств используемых растворителей (Табл. 3.1). Предположительно, релаксация —>- 81 включает в себя образование короткоживущего комплекса, состоящего из фотовозбужденной молекулы триптофана и молекул растворителя, в котором перенос колебательной энергии происходит в результате столкновения молекул растворителя с индольным кольцом.

Табл. 3.1. Значения энергии активации Ер и ¡п(Ар/к'ио„) ¡¡¡¡я константы скорости релаксации -» в! для молекул 1Н и 1-ТгрН в различных растворителях.

Соединение Растворитель Ер, кДж/моль 1п (А,/к\т)

1Н Метанол/вода 10/1 Эганол/вода 10/1 4.2 ±1.3 4.8 + 1.4 5.2 ± 0.4 5.5 + 0.5

¿-ТгрН Метанол/вода 10/1 Этанол/вода 10/1 2-пропанол/вода 10/1 Метанол 4.911.2 6.2 ±1.5 4.6 + 1.6 4.3 ±1.3 5.510.4 6.1 ±0.6 5.4 + 0.5 5.3 ±0.5

В главе IV представлены результаты исследования фотопроцессов, протекающих в молекуле кинуренина (КК).

В первом разделе проведено исследование динамики гибели синглетных возбужденных состояний кинуренинов на пикосекундном масштабе времени в различных растворителях. На Рис. 4.1 .а приведены временные профили флуоресценции на синем крае, в центре и на красном крае полосы эмиссии, наблюдаемые при фотолизе водного раствора кинуренина. Быстрый спад сигнала в синей области и соответствующий рост сигнала в красной области спектра являются следствием сольватационной релаксации, которая приводит к сдвигу спектра в красную область, так называемому динамическому сдвигу Стокса. Этот сдвиг можно явно видеть по эволюции спектра флуоресценции во времени,

представленной на Рис. 4.1.6. В дальнейшем наблюдается монотонная гибель сигнала без изменений в форме спектра. Обработка полученных результатов была проведена одновременно для всех десяти измеренных временных профилей флуоресценции, используя свертку суммы трех экспоненциальных функций и функции Гаусса, описывающей профиль импульса лазера. Полученные временные константы х\ = 0.9 пс, п = 4.5 пс, тз = 27.1 пс были отнесены: ц - к диффузионному перемещению молекул воды около фотовозбужденной молекулы КИ, тг - изменению геометрии молекулы КМ в возбужденном состоянии и гз - времени жизни состояния Бь Динамика промежуточного поглощения К>1, исследованная на этом же масштабе времени, качественно совпадает с

450 500

Длина волны, нм

Рис. 4.1. Фотолиз КИ в Н20, рН 6.6 при комнатной температуре, а. Временные профили флуоресценции, б. Временная эволюция спектров флуоресценции, нормализованных по интенсивности, в. Спектры промежуточного поглощения.

эволюцией флуоресценции: начальный сдвиг спектра в синюю область вследствие сольватационной релаксации сопровождается монотонной гибелью сигнала (Рис. 4.1.в).

Аналогичные измерения были проведены для КК в смеси Ме0Н/Н20 10/1 (по объему) и в ДМСО. Наблюдаемая эволюция спектров флуоресценции и промежуточного поглощения качественно совпадает с результатами, представленными на Рис. 4.1. При переходе от воды к ДМСО время жизни состояния Э] возрастает почти на два порядка, что можно видеть по данным, представленным в Табл. 4.1 и на Рис. 4.2. Эксперименты в дейтерированной воде показали увеличение времени жизни состояния Б] в 1.6 раза по сравнению с водой (Табл. 4.1).

Полученные значения времени жизни и квантового выхода флуоресценции были использованы для оценки констант скорости излучательной (А,/,,,) и безизлучательной гибели (квг) состояния Б г.

(4.1)

кф, = Фф, IЬ

*£г=а-Ф*)/*з (4-2)

Как можно видеть из Табл. 4.1, значение кф, не зависит от растворителя, тогда как значение квг увеличивается на два порядка по величине при переходе от ДМСО к воде. Столь существенное увеличение квг в протонных растворителях совпадает с ростом способности растворителя быть донором водородной связи, что может быть описано эмпирическим сольватохромным параметром а Камлета и Тафта, приведенным в Табл. 4.1.

Наблюдаемый изотопный эффект и сильная зависимость от свойств растворителя указывают на существенную роль межмолекулярных водородных связей в ультрабыстрой дезактивации состояния Б).

£ 10 а*

о ш а. о

>ч

-а 0.5 .а

в

о

X

ш

5

0.0 1.0

0.5

0.0

ДМСО

^Ме0Н/Н20

3

ДМСО

Ме0Н/Н20

б

25 50 75 Время, пс

100

Рис. 4.2. а. Временные профили флуоресценции КИ в максимумах эмиссии, б. Временные профили промежуточного Природа этих эффективных взаимодействий поглощения ЮЧ в максимумах поглощения.

заключается в наличии неподеленнои пары электронов на атоме азота анилиновои группы кинуренина. В возбужденном состоянии происходит перераспределение электронной плотности в молекуле кинуренина, что увеличивает кислотность аминогруппы и основность карбонильной группы и приводит к образованию комплекса из молекул растворителя и КЫ, связанного межмолекулярными водородными связями.

Табл. 4.1. Фотофизические свойства КМ в различных растворителях при комнатной температуре: а - сольватохромный параметр Камлета и Тафта; гэ — время жизни состояния Фф» - квантовый выход флуоресценции; кф, и к^— константы скорости флуоресценции и безизлучательной гибели состояния Эь соответственно. Погрешность измерений: 10 %.

Растворитель а г3, пс кф,, с'1 квг, с1

Н20 (рН 6.6) 1.17 27.1 0.082 З.ОхЮ7 3.7хЮ10

020 - 43.5 0.135 З.ЫО7 2.3хЮ10

Ме0Н/Н20 (10/1) 0.93 172 0.51 З.ОхЮ7 5.8х109

ЕЮН 0.83 480 2.3 4.8х107 2.0x109

ДМФ 0 1390 5.3 3.8х107 б.8х108

ДМСО 0 2260 9.0 4.0x107 4.0х108

Схема. 4.1. Механизм ультрабыстрой дезактивации состояния кинуренина.

В предельном случае возможен межмолекулярный перенос протона, как это отражено на Схеме 4.1. Отсутствие сигнала от протонированного состояния Б) в спектрах промежуточного поглощения не позволяет полностью отказаться от данного механизма, т.к. этот интермедиат может быстро гибнуть в процессе обратного переноса протона с образованием основного состояния КМ

Второй раздел главы IV посвящен исследованию фотохимических свойств триплетного состояния кинуренина. При фотолизе, сенсибилизированном ацетоном, были зарегистрированы спектры промежуточного поглощения, отнесенные к суперпозиции спектра поглощения триплетного кинуренина ТКИ (в кислой среде ТКЫН2+) и спектра выгорания исходного соединения КИ (Рис. 4.3.а). Расчет наблюдаемых временных профилей промежуточного поглощения позволил установить значения коэффициентов экстинкции £г(430) триплетных состояний кинуренина: 3700 М~'см~' для нейтрального и 3500 М~'см~' для протонированного состояния. Зависимость отношения промежуточного поглощения на 480 нм к поглощению на 430 нм от значения рН среды (Рис. 4.3.6) была

Рис. 4.3. Фотолиз КЫ, сенсибилизированный ацетоном (1 х 10"4 М КИ в смеси вода/ацетон 10/1). а. Спектры промежуточного поглощения при рН 7.0 (О) и рН 0.1 (■), наблюдаемые через 3 мкс после импульса лазера, б. рН зависимость отношения поглощения ТКИ на 480 нм к поглощению на 430 нм, измеренным через 2 мкс после импульса лазера.

использована для определения значения константы кислотно-основного равновесия рКаг = 4.7, которая была отнесена к анилиновой группе кинуренина.

Прямой фотолиз водных растворов кинуренина показал, что квантовый выход триплетных состояний КЫ в нейтральной среде составляет величину Фт~ 0.018+0.004, в то время как в кислой среде выход близок к единице. Столь значительная разница была отнесена к протонированию анилиновой группы кинуренина, что делает невозможным частичный перенос заряда с атома азота на ароматическую систему и, как следствие, делает невозможным быстрый безизлучательный переход —>■ Бо посредством межмолекулярных водородных связей. При переходе от протонных растворителей к апротонным значение Фг увеличивается (в ДМСО Фг = 0.33±0.06), что связано с отсутствием межмолекулярных водородных связей в апротонных растворителях.

Третий раздел главы IV посвящен изучению механизма фотоионизации водного раствора кинуренина. В ходе проведенных исследований были получены индивидуальные спектры поглощения короткоживущих частиц кинуренина: триплетного состояния, катион радикала и аддукта сольватированного электрона с кинуренином (Рис. 4.4.а). Аналогично были получены спектры интермедиатов 3-гидроксикинуренина (ЗОНКМ).

Линейная зависимость квантового выхода фотоионизации КК и ЗОНКЫ от энергии импульса лазера (Рис. 4.4.6) указывает на двухфотонный механизм ионизации. Поскольку синглетные возбужденные состояния и ЗОНКЫ обладают временем жизни много меньшим (27.1 и 9.6 пс, соответственно), чем длительность импульса лазера (8 не), то наиболее вероятным интермедиатом, предшествующим фотоионизации, является триплетное состояние.

20

240 320 400 480 560 640 Длина волны, нм

0.03

ч

о

ш 0.02

0.01

■ КЫ, I = 266 нм

□ ЗОНКМ, X = 266 НМ • КЧ \ = 355 нм О ЗОКЫНД = 355 нм

0 40 80 120 160 Энергия импульса лазера, мДж

Рис. 4.4. а. Спектры поглощения интермедиатов, наблюдаемые при фотолизе водных растворов КИ, рН 7.0. О: аддукт электрона К№Г; ■: триплетное состояние ТКИ; А: катион радикал КЫ'+. б. Зависимость квантового выхода фотоионизации от энергии импульса лазера. ■: КИ, фотолиз на 266 нм; □: ЗОНКЫ, фотолиз на 266 нм; •: КХ, фотолиз на 355 нм; О: ЗОНКИ, фотолиз на 266 нм.

Опираясь на полученные результаты, общая схема реакций, имеющих место при фотолизе КИ и ЗОНК.Ь[, может быть представлена в следующем виде:

М—"ш > ГМ—>М'* +е~т, (4.3)

^-»М'" (4.4)

М-+Н+^=>МН> (4.5)

Глава V диссертации посвящена исследованию реакций тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза. В качестве тушителей были использованы антиоксиданты аскорбат и глутатион, аминокислоты триптофан, тирозин, гистидин, метионин и цистеин, а также молекулярный кислород. Было показано, что основными тушителями триплетного состояния кинуренина являются аскорбат, триптофан и тирозин; полученные значения констант скорости тушения представлены в Табл. 5.1.

Механизм тушения триплетного состояния кинуренина был определен из анализа спектров промежуточного поглощения и динамики промежуточного поглощения, наблюдаемой в буферных и небуферных водных растворах. В результате было установлено, во всех исследуемых реакциях механизм тушения заключается в переносе электрона с молекулы тушителя на молекулу кинуренина, с последующим быстрым депротонированием катион радикала тушителя. Единственным исключением является реакция с кислородом, энергии на молекулу кислорода.

Глава VI посвящена сравнительному анализу фотохимической активности кинуренина и его аддуктов с аминокислотами гистидином (Нв-КМ), лизином (Ьуэ-КМ), цистеином (Суэ-КМ) и антиоксидантом глутатионом (ОвН-КЫ); химические структуры которых приведены на Рис. 6.1.

Динамика гибели фотовозбужденных состояний аддуктов в различных растворителях, наблюдаемая методами оптической спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением, демонстрирует качественное согласие с эволюцией возбужденных состояний кинуренина (см. Рис. 4.1). Единственным отличием является увеличение времени жизни

Табл. 5.1. Константы скорости тушения (кт) триплетного состояния кинуренина аминокислотами и антиоксидантами.

Соединение кт, М"'с''

¿-аскорбат (8.5 ± 1.2)х108

¿-глутатион восстановленный < 5х105

уУ-ацетил^-триптофан (3.3 ± 0.6)х108

¿-триптофан (2.6 ± 0.7)х108

ТУ-ацетил-Ь-тирозин (6.7 ± 1.5)х107

¿-цистеин < 106

А'-ацетил^-гистидин < 106

Л'-ацетил^-метионин < 106

Кислород (2.1 ±0.5)х109

в которой происходит перенос триплетной

соон соон Тин

0н2 соон ^^Г'Г0

О НМ о ? Ш2 О N О в-

СООН (Г СООН и ^^Г СООН гГ ^т^ — соон

Н 1 1 1 .О

МН2 ИНг ^Н2

Ьуз-КЫ Суз-КЫ Ш-КИ СБН-КЫ

Рис. 6.1. Химические структуры аддуктов КЫ с аминокислотами лизин (Ьуз-КИ), цистеин (Суз-КЫ) и гистидин (ЬПз-ЮЧ), а также с антиоксидантом глутатионом (СЗН-КИ).

состояния при переходе от Ьуз-КЫ к СБН-КЫ, что отражено в Табл. 6.1. Спектры поглощения триплетных состояний и радикалов аддуктов качественно совпадают со спектрами интермедиатов кинуренина, представленных на Рис. 4.4.а. Как и квантовый выход флуоресценции, квантовый выход триплетных состояний демонстрирует увеличение при переходе от Ьуэ-КЫ к ОБН-КИ (Табл. 6.1). Механизм этих изменений заключается в ослаблении и/или блокировании части межмолекулярных водородных связей между молекулами растворителя и хромофорной частью аддуктов, что приводит к уменьшению скорости безизлучательного перехода —> 8о.

Табл. 6.1. Время жизни состояния (гз), квантовые выходы флуоресценции (Ф^) и триплетных состояний (Фг), анаэробного (фАг) и аэробного (ф0г) фоторазложения водных растворов УФ фильтров. Погрешность измерений: 10 %.

Соединение Т3, ПС Ф,/ш % Фг, % Фаг

КИ 27.1 0.082 1.8 1.1х10'3 З.8х10"3

ЗОНКИ 9.6 0.016 <0.5 <\оъ 4.8х10~2

Ьуэ-КЫ 27.7 0.071 1.8 З.ЗхЮ-3 5.1х10"3

Суз-КИ 44.2 0.120 2.5 6.9x10'3 1.2x10"2

Ш-КИ 48.5 0.151 3.4 8.4x10'3 7.6х10"2

ОБН-КЫ 47.3 0.154 3.4 7.6х10"3 1.1х10'2

Анаэробный и аэробный фотолиз водных растворов аддуктов кинуренина (Рис. 6.2) приводит к фоторазложеншо исходных соединений. Как можно видеть на Рис. 6.2 наиболее фотохимически стабильными соединениями при анаэробном фотолизе являются КИ и ЗОНШ; в присутствии кислорода фоторазложение всех исследуемых соединений ускоряется. Квантовый выход фоторазложения был определен по наклону прямой, описывающей экспериментальные данные; полученные результаты представлены в Табл. 6.1. Как и в предыдущих исследованиях, выход анаэробного фоторазложения увеличивается при переходе от Ьуз-КЫ к ОБН-КЫ. Отметим, что значение выхода

анаэробного фоторазложения {фЛг) на три порядка по величине меньше выхода триплетных

состояний (Фг), что еще раз подтверждает высокую эффективность кинуренинов в качестве молекулярных УФ фильтров.

Рис. 6.2. Разложение УФ фильтров при 22°С, рН 7.1. (□) фоторазложение в анаэробных условиях; (•) фоторазложение в аэробных условиях; (Ж) темновое аэробное окисление, (а) КД (б) ЗОНКЛ, (в) Ьуз-КЩг) Суя-КЛ, (д) Шз-КЫ, (е) С5Н-КК

ВЫВОДЫ

1. Проведено разделение вкладов в однофотонную ионизацию триптофана от нерелаксированного и релаксированного синглетных возбужденных состояний. Квантовый выход ионизации из состояния возрастает с уменьшением температуры, что обусловлено конкуренцией между фотоионизацией из состояния и релаксацией

—> Б]. Определены параметры Аррениуса для константы скорости релаксации 5ь показано, что энергия активации не зависит от свойств используемых растворителей.

2. В протонных растворителях синглетное возбужденное состояние в] кинуренина быстро гибнет в результате ультрабыстрой внутренней конверсии, обусловленной межмолекулярными взаимодействиями с молекулами растворителя посредством водородных связей. Результатом быстрой дезактивации состояния Б] является малый квантовый выход химически активного триплетного состояния Т1 кинуренина,

которое было впервые зарегистрировано в данной работе. В апротонных растворителях, в отсутствии межмолекулярных водородных связей, время жизни состояния Si существенно возрастает, что приводит к увеличению выхода реакционного состояния Tj. Использование высоких интенсивностей возбуждающего излучения приводит к двухфотонной ионизации кинуренина с поглощением второго кванта света триплетным состоянием TV

3. Механизм тушения триплетного состояния кинуренина Ti рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза, заключается в переносе электрона с молекулы тушителя на молекулу кинуренина. Единственным исключением является реакция с молекулярным кислородом, в которой происходит перенос тришетной энергии на молекулу кислорода. Обнаружено, что наиболее эффективными тушителями являются аминокислоты триптофан и тирозин, а также антиоксидант аскорбат.

4. Ковалентное присоединение кинуренина к гистидину, лизину, цистеину и глутатиону приводит к увеличению фотохимической активности исследуемых аддуктов: увеличению квантовых выходов флуоресценции, триплетного состояния и анаэробного фоторазложения.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. P.S. Sherin, J. Grilj, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, Ultrafast excited-state dynamics of kynurenine, a UV filter of the human eye II J. Phys. Chem. B, 113 (2009) 4953-4962.

2. P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, R.Z. Sagdeev, Photoactivity of kynurenine-derived UV filters II J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 93 (2008) 127-132.

3. O.A. Снытникова, П.С. Шерин, Л.В. Копылова, Ю.П. Центалович, Кинетика и механизм реакций фотовозбужденного кинуренина с молекулами биологических соединений // Изв. Акад. Наук. Серия Химическая, 4 (2007) 704-710.

4. O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, Biphotonic ionization of kynurenine and 3-hudroxykynurenine II J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 186 (2007) 364-368.

5. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, Competition between ultrafast relaxation and photoionization in excited prefluorescent states of tryptophan and indole II J. Chem. Phys., 125 (2006) 144511 (4 pages).

6. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, M.D.E. Forbes, Photochemistry of kynurenine, a tryptophan metabolite: properties of the triplet state // J. Phys. Chem: A, 109 (2005) 3565-3568.

7. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Tryptophan photoionization from prefluorescent and fluorescent states // Chem. Phys. Lett., 391 (2004) 44-49.

8. P.S. Shcrin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, The excited-state dynamics of kynurenine - UV filter of the human eye // Abstract of the XXIX European Congress on the Molecular Spectroscopy (EUCMOS-2008), August 31 - September 05, 2008, Opatija, Croatia, p. 112.

9. P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, E. Vauthey, The ultrafast photochemistry of kynurenine И Abstract of the Central European Conference on Photochemistry (CECP-2008), February 10-14, 2008, Bad Hofgastein, Austria, p. 47.

10. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, P.S. Sherin, L.V. Kopylova, R. Sagdeev, Thermal and photochemical reactions of kynurenines - implications for human cataract // Abstract of the International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (ISR1UM-2007), August 19-24, 2007, Ascona, Switzerland.

11. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, The influence of ultrafast relaxation on the photoionization of tryptophan II Abstract of the International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (ISRIUM-2007), August 19-24, 2007, Ascona, Switzerland.

12. P.S. Sherin, L.V. Kopylova, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Photoreactions of kynurenine: implications for cataract development // Abstract of the 6th Aegean Summer School in Visual Optics, June 26 - July 01, 2007, Heraklion, Crete, Greece.

13. П.С. Шерин, O.A. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование ультрабыстрых процессов ионизации и колебательной релаксации методом лазерного импульсного фотолиза // Сборник тезисов всероссийская конференции "Современные подходы к проблемам физикохимии и катализа", 16-19 мая, 2007, Новосибирск, Россия, с. 104.

14. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, L.V. Kopylova, R.Z. Sagdeev, The intermediates of kynurenine formed under UV irradiation - triplet state and radicals II Abstract of the International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry, February 08-11, 2007, Kottayam, Kerala, India, pp.55-56.

15. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, R.Z. Sagdeev, Ultrafast processes in photoexcited tryptophan - ionization and thermal relaxation II Abstract of the International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry, February08-11, 2007, Kottayam, Kerala, India, p.138.

16. П.С. Шерин, O.A. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование ультрабыстрых реакций фотовозбужденных состояний триптофана, ионизации и колебательной релаксации // Сборник тезисов XVIII Всероссийского Симпозиума "Современная химическая физика", 22 сентября - 03 октября, 2006, Туапсе, Россия, с. 126.

17. О.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, P.S. Sherin, M.D.E. Forbes, R.Z. Sagdeev, Primary processes in the photochemistry of kynurenine II Abstract of the Porquerolles International Conference on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (PICORIUM-2006), September 2-9, 2006, Porquerolles Island, France.

18. P.S. Sherin, O.A. Snytnikova, Yu.P. Tsentalovich, Tryptophan photoionization and thermal relaxation in condensed phase II Abstract of the 5th Research workshop on diffusion assisted reactions, August 13-19, 2006, Novosibirsk, Russia, 031.

19. П.С. Шерин, Ю.П. Центалович, Исследование фотохимических реакций кинуренина с участием некоторых соединений, содержащихся в хрусталике глаза II Сборник тезисов XVII Всероссийского Симпозиума "Современная химическая физика", 18-29 сентября, 2005, Туапсе, Россия, с. 216.

20. О.А. Snytnikova, P.S. Sherin, Yu.P. Tsentalovich, M.D.E. Forbes, Photoexciied states of aqueous tryptophan and reaction of triplet tryptophan with nucleotides: LFP and TR-CIDNP study II Abstract of the 9th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, September 11-17, 2005, Oxford, UK, p. 121.

21. П.С. Шерин, О.А. Снытникова, Ю.П. Центалович, Исследование механизма однофотонной фотоионизации триптофана методом лазерного импульсного фотолиза И Сборник тезисов XVI Всероссийского Симпозиума "Современная химическая физика", 20 сентября - 01 октября 2004, 2004, Туапсе, Россия, с. 114-115.

Подписано к печати 20 апреля 2009 г. Тираж 100 экз. Заказ № 845. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Фотофизические и фотохимические процессы в молекулах индола, триптофана и их производных.

1.1.1. Спектроскопия основного состояния.

1.1.2. Первичные фотопроцессы в молекуле триптофана.

1.1.3. Фотоионизация индола и триптофана.

1.2. Термические и фотохимические реакции кинуренина и его производных

1.2.1. УФ фильтры хрусталика глаза.

1.2.2. Термические реакции.

1.2.3. Кинуренин и его производные в процессах старения хрусталика глаза и катарактогенезе.

1.2.4. Фотохимические реакции.

1.2.5. Механизмы ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний в органических молекулах.

1.3. Постановка задачи.

Глава II. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и реактивы.

2.2. Стационарные методы исследования.

2.2.1. Оптическая спектроскопия.

2.2.2. Фотолиз.

2.2.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

2.3. Времяразрешенные методы исследования.

2.3.1. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз.

2.3.2. Фемтосекундный лазерный импульсный фотолиз.

2.3.3. Время-коррелированный счет фотонов (ВКСФ].

2.3.4. Флуоресценция с фемтосекундным временным разрешением (ир-conversion].

2.4. Программное обеспечение.:.

2.5. Анализ данных флуоресценции.

Глава III. Фотоионизация водных растворов индола, триптофана и их производных.

3.1. Введение.

3.2. Однофотонная ионизация триптофана и его производных.

3.2.1. Зависимость выхода ионизации от энергии лазерного излучения.

3.2.2. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для TV-ацетилтриптофана (TVATrpH) и L-триптофана (L-TrpH}.

3.2.3. Зависимость квантового выхода внутримолекулярного переноса протона (БПП] от температуры для L-TrpH.

3.2.4. Реакции синглетного возбужденного состояния триптофана.

3.2.5. Численное моделирование полученных результатов.

3.3. Конкуренция между фотоионизацией из состояния *S и релаксацией *S-»Si в молекулах индола и триптофана

3.3.1. Зависимость квантового выхода радикалов индола и L-триптофана от температуры в различных растворителях.

3.3.2. Механизм колебательной релаксации *S-»Si.

4.2. Спектроскопия основного состояния.55

4.3. Ультрабыстрая динамика гибели синглетных возбужденных состояний KN и 30HKN.60

4.3.1. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения KN.56

4.3.2. Квантовый выход флуоресценции KN и его зависимость от температуры.68

4.3.3. Исследование эволюции флуоресценции и промежуточного поглощения 30HKN.71

4.3.4. Релаксационная динамика состояния Si.72

4.3.5. Механизм ультрабыстрого безизлучательного перехода Si—>So.72

4.4. Фотохимические свойства триплетного состояния KN.75

4.4.1. Фотолиз KN, сенсибилизированный ацетоном.75

4.4.2. Прямой фотолиз KN в водных растворах.81

4.4.3. Зависимость квантового выхода триплетного состояния KN от растворителя.82

4.5. Двухфотонная ионизация KN и 30HKN.86

4.5.1. Спектры промежуточного поглощения интермедиатов KN и 30HKN.86

4.5.2. Механизм фотоионизации KN и 30HKN.92

4.6. Заключение.94

Глава V. Реакции тушения триплетного состояния кинуренина рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза.96

5.1. Введение.96

5.2. Методика экспериментов.96

5.3. Реакции тушения триплетного состояния KN.97

5.3.1. Аскорбат.97

5.3.2. Глутатион восстановленный.99

5.3.3. Триптофан.101

5.3.4. М-ацетил-Z.-тирозин.102

5.3.5. ЛГ-ацетил-£-гистидин, М-ацетил-/,-метионин, L-цистеин.103

5.3.6. Кислород.103

5.4. Заключение.104

Глава VI. Фотохимическая активность аддуктов кинуренина с аминокислотами гистидином, лизином, цистеином и антиоксидантом глутатионом.106

6.1. Введение.106

6.2. Спектроскопия основного состояния.107

6.3. Ультрабыстрая динамика гибели состояния Si.109

6.4. Триплетные состояния и радикалы.112

6.5. Фоторазложение водных растворов аддуктов.114

6.6. Заключение.118

Выводы.119

Список литературы.120

Список используемых сокращений фл флуоресценция ион ионизация

ИКК интеркомбинационная конверсия

ВК внутренняя конверсия

ВПП внутримолекулярный перенос протона

БГ безизлучательная гибель

L-ТгрН L-триптофан iVATrpH N-ацетил-Ь-триптофан

IH индол

KN кинуренин

30HKN 3-гидроксикинуренин

СКА карбоксикетоалкен

Ас ацетон

AsH2 аскорбат

GSH глутатион

НАДН никотинамидадениндинуклеотид

Cys цистеин

Lys лизин

His гистидин

Введение

Ультрафиолетовое излучение Солнца, достигающее поверхности нашей планеты, в небольших дозах оказывает благотворное воздействие на здоровье человека - повышает активность иммунной системы, стимулирует выработку витамина Д, а также ряда гормонов, таких как мелатонин и серотонин («гормон бодрости»). Длительная недостаточность ультрафиолетового излучения может приводить к так называемому «световому голоданию» или «зимней депрессии» — заболеванию, сопровождающемуся нарушением обмена веществ, снижению иммунитета, быстрой утомляемости и т.д. Избыточные дозы облучения могут также оказывать негативное воздействие на человеческий организм - фотоповреждения белковых молекул могут приводить к изменению активности или гибели клеток, что в результате может приводить к развитию таких заболеваний как рак кожи, злокачественная меланома, катаракта и другие. В настоящее время механизмы возникновения и развития этих заболеваний остаются, во многом, неизвестными.

По степени воздействия на ткани живых организмов, ультрафиолетовое излучение делится на три диапазона - ближний, УФ-А (315-400 нм), средний УФ-Б (280-315 нм) и дальний ультрафиолет УФ-С (280-100 нм). Коротковолновое УФ-С излучение потенциально является наиболее опасным для белковых молекул, т.к. оно может приводить к прямому фотораспаду молекулы белка и/или прямой фотоионизации большинства аминокислот, являющихся структурными единицами этих макромолекул. К счастью, УФ-С излучение практически полностью поглощается озоновым слоем и верхними слоями атмосферы. Излучение УФ-Б диапазона, на 90% поглощаемое земной атмосферой, является более мягким, однако оно также способно инициировать необратимые изменения в функционировании белков посредством фотоионизации таких ароматических аминокислот, как триптофан и тирозин. И, наконец, длинноволновое УФ-А излучение может приводить к фотоповреждениям клеточных структур посредством сенсибилизирования реакционных форм кислорода, свободных радикалов и/или прямой реакции хромофоров с аминокислотными остатками белков. УФ-А излучение является наиболее опасным для живых существ, поскольку оно достигает поверхности Земли с минимальными потерями.

Кожа и органы зрения человека в наибольшей степени подвержены воздействию солнечного ультрафиолетового излучения. Наиболее злокачественные заболевания этих органов, такие как рак и катаракта, развиваются примерно у половины населения земного шара, перешагнувшего рубеж 65 лет [1,2]. Широкое распространение этих заболеваний обуславливает их высокую социальную и экономическую значимость. Выявляемые клинически изменения соответствуют, как правило, необратимым стадиям заболевания, когда терапевтическое вмешательство малоэффективно. Хирургическое вмешательство является основным методом лечения этих заболеваний, т.к. лекарств, способных устранить злокачественную раковую опухоль или восстановить прозрачность хрусталика, в настоящее время не существует. Важно отметить, что большая часть ведущихся в мире исследований производится научными группами медицинской и биологической направленности. В результате их деятельности накоплен значительный материал об изменениях химического состава, морфологии и ряда других важнейших свойств кожи и органов зрения в процессах развития этих заболеваний. Тем не менее большая часть этих данных имеет качественный характер, не позволяющий создать адекватную модель химических процессов, протекающих в соответствующих тканях. Таким образом, исследование первичных фотореакций, протекающих в тканях человеческого организма, является актуальной задачей для понимания механизмов развития различных заболеваний, индуцированных солнечным УФ излучением, а также разработки лекарственных препаратов, направленных на ингибирование нежелательных процессов.

Ткани кожи и органов зрения обладают различным белковым составом, однако большая часть белков содержит аминокислоту триптофан, который является основным хромофором белковых молекул в УФ-Б диапазоне. Фотоионизация триптофана может приводить к фотоинактивации ферментов и фотоиндуцированному повреждению белков, что, как уже было отмечено, может являться начальной стадией развития различных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования фотохимии триптофана на протяжении нескольких последних десятилетий, несколько фундаментальных вопросов, касающихся фотоионизации триптофана, остаются открытыми. Прежде всего остаются невыясненными механизм однофотонной ионизации, а.также природа возбужденного состояния, являющегося предшественником этой фотореакции.

Защита органов зрения от солнечного ультрафиолетового излучения осуществляется преимущественно группой низкомолекулярных соединений, содержащихся в хрусталике глаза. Эти соединения - кинуренин и его производные - являются природными метаболитами аминокислоты триптофан и обладают поглощением в УФ-А диапазоне. Фотохимические реакции этих соединений мало изучены. Было показано, что эти соединения являются очень слабыми фотосенсибилизаторами; на этом основании был сделан вывод, что кинуренины являются молекулярными УФ фильтрами, предохраняющими хрусталик и сетчатку глаза от фотоповреждений. Механизм эффективной УФ защиты в настоящее время остается невыясненным. Недавно было 7 показано, что фотовозбужденные состояния кинуренина могут окислять ряд биологически важных соединений, таких как цистеин и НАДН, т.е. они способны наносить фотоповреждения органическим молекулам ближайшего кружения. Исследования термических реакций кинуренинов показали, что эти соединения являются нестабильными при физиологических условиях. Спонтанное дезаминирование приводит к образованию химически активных ненасыщенных соединений, которые могут присоединяться к нуклеофильным аминокислотным остаткам белков - гистидину, лизину и цистеину. Белки, модифицированные молекулами УФ фильтров, демонстрируют заметную фотохимическую активность и способны образовывать реакционные формы кислорода при аэробном фотолизе. Эти сообщения показывают, что, несмотря на эффективную защиту от УФ излучения, кинуренины могут участвовать в реакциях фотоповреждения белков хрусталика и развития катаракты. В настоящее время механизмы этих реакций остаются неизвестными.

Отметим, что фотохимические реакции гомогенных растворов триптофана и кинуренина могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофан присутствует преимущественно в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (меж- и внутриклеточное пространство, плотная упаковка белков хрусталика) могут существенно отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и кинуренина и их реакций является необходимым для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живых организмах.

Настоящая работа посвящена исследованию динамики и механизмов фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекулах триптофана и кинуренина, изучению спектральных и фотохимических свойств короткоживущих промежуточных частиц, образующихся в результате фотолиза этих соединений, и возможных реакций этих частиц с молекулами локального окружения. Исследования проводились с использованием методов времяразрешенной оптической спектроскопии (УФ и видимый диапазон длин волн) в широком временном диапазоне: от нескольких сотен фемтосекунд до нескольких десятков часов.

Целями данной работы являются:

1) Исследование влияния параметров среды (температура, рН среды, растворитель) на механизм однофотонной ионизации триптофана.

2) Исследование механизма ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний кинуренина, а также механизма фотоионизации. Определение влияния внешних условий (растворитель, изотопное замещение, значение рН среды, температура) на исследуемую фотофизику кинуренина.

3) Изучение реакционной активности триплетного состояния кинуренина, образующегося под действием УФ излучения, по отношению к ряду соединений, содержащихся в хрусталике глаза.

4) Исследование фотохимической активности ковалентно-связанных аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике глаза.

Настоящая диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы.

Выводы

1. Проведено разделение вкладов в однофотонную ионизацию триптофана от нерелаксированного *S и релаксированного Si синглетных возбужденных состояний. Квантовый выход ионизации из состояния *S возрастает с уменьшением температуры, что обусловлено конкуренцией между фотоионизацией из состояния *S и релаксацией *S—>Si. Определены параметры Аррениуса для константы скорости релаксации *S—»Si; показано, что энергия активации не зависит от свойств используемых растворителей. I

2. В протонных растворителях синглетное возбужденное состояние Si кинуренина быстро гибнет в результате ультрабыстрой внутренней конверсии, обусловленной межмолекулярными взаимодействиями с молекулами растворителя посредством водородных связей. Результатом быстрой дезактивации состояния Si является малый квантовый выход химически активного триплетного состояния Т] кинуренина, которое было впервые зарегистрировано в данной работе. В апротонных растворителях, в отсутствии межмолекулярных водородных связей, время жизни состояния Si существенно возрастает, что приводит к увеличению выхода реакционного состояния Ть Использование высоких интенсивностей возбуждающего излучения приводит к двухфотонной ионизации кинуренина с поглощением второго кванта света триплетным состоянием Т[.

3. Механизм тушения триплетного состояния кинуренина Ti рядом соединений, присутствующих в хрусталике глаза, заключается в переносе электрона с молекулы тушителя на молекулу кинуренина. Единственным исключением является реакция с молекулярным кислородом, в которой происходит перенос триплетной энергии на молекулу кислорода. Обнаружено, что наиболее эффективными тушителями являются аминокислоты триптофан и тирозин, а также антиоксидант аскорбат.

4. Ковалентное присоединение кинуренина к гистидину, лизину, цистеину и глутатиону приводит к увеличению фотохимической активности исследуемых аддуктов: увеличению квантовых выходов флуоресценции, триплетного состояния и анаэробного фоторазложения.

6.6. Заключение

В Главе VI данной работы проведен сравнительный анализ фотохимической активности KN и его аддуктов с аминокислотами гистидин, лизин, цистеин и антиоксидантом глутатионом. Было показано, что ковалентное присоединение молекулы KN к аминокислотам и глутатиону приводит к увеличению времени жизни состояния Si, а также квантового выхода триплетных состояний и анаэробного фоторазложения. Фотохимическая активность аддуктов увеличивается в следующей последовательности: Lys-KN, Cys-KN, His-KN и GSH-KN. Механизм этих изменений заключается в уменьшении эффективности безизлучательного перехода Si—>So за счет ослабления и/или блокирования части межмолекулярных водородных связей, связывающих хромофорные части аддуктов с молекулами растворителя. Таким образом, показано, что переход из свободного в связанное состояние может играть ключевую роль в фотохимической активности УФ фильтров в хрусталике глаза и их участии в развитии катаракты.

Более существенное увеличение фотохимической активности кинуренина можно ожидать в случае ковалентного присоединения к значительно более массивным белковым молекулам. В этом случае фотохимическая активность УФ фильтров, по-видимому, будет зависеть от места присоединения к белку. Результаты настоящей работы показывают, что время жизни состояния Si молекулы KN сильно зависит от возможности образовать межмолекулярные водородные связи. УФ фильтры, связанные с внутренними или внешними частями белков, будут обладать разным доступом к молекулам растворителя и, следовательно, будут обладать различной фотохимической активностью. Можно предположить, что УФ фильтры, находящиеся внутри структуры белка, будут вызывать наибольшие повреждения для ткани хрусталика. Подтверждение этого предположения будет являться темой дальнейших исследований соискателя.

1. "Sun Protection" National cancer institute's cancer trends progress report, 2007 Update // www.cancer.org, 15 April 2008.

2. World Health Organization. Global initiative for the prevention of avoidable blindness. WHO/PBL/97.61. Geneva: WHO, 1997.

3. P. Бенсассон, Э. Лэнд, Т. Траскот, Флеш-фотолиз и импульсный радиолиз. Применение в биохимии и медицинской химии, пер. с англ. // М: Мир, (1987) с. 165— 175.

4. A.D. McLaren, О. Hidalgo-Salvatierra, Quantum yields for enzyme inactivation and the amino acid composition of proteins // Photochem. Photobiol., 3 (1964) 349-352.

5. S. Zigman, Near UV light and cataracts // Photochem. Photobiol., 26 (1977) 437-441.

6. D.V. Bent, E. Hayon, Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. III. Tryptophan II J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 2612-2619.

7. R.J. Robbins, G.R. Fleming, G.S. Beddard, G.W. Robinson, P.J. Thistlethwaite, G.J. Woolfe, Photophysics of aqueous tryptophan: pH and temperature effects // J. Am. Chem. Soc., 102(1980) 6271-6279.

8. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, R.Z. Sagdeev, Properties of exited states of aqueous tryptophan II J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 162 (2004) 371-379.

9. J. Eisinger, G. Navon, Fluorescence quenching and isotope effect of tryptophan // J. Chem. Phys., 50 (1969) 2069-2077.

10. E.P. Kirby, R.F. Steiner, The influence of solvent and temperature upon the fluorescence of indole derivatives II J. Phys. Chem., 74 (1970) 4480-4490.

11. R. Klein, I. Tatischeff, M. Bazin, R. Santus, Photophysics of indole. Comparative study of quenching, solvent, and temperature effects by laser flash photolysis and fluorescence // J. Phys. Chem., 85 (1981) 670-677.

12. Y. Chen, B. Liu, M.D. Barkley, Trifluoroethanol quenches indole fluorescence by excited-state proton transfer // J. Am. Chem. Soc., 117 (1995) 5608-5609.

13. J. Feitelson, The formation of hydrated electrons from the excited state of indole derivatives // Photochem. Photobiol., 13 (1971) 87-96.

14. J.R. Lakowich, Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed. II Springer, (2006).

15. F.D. Bryant, R. Santus, L.I. Grossweiner, Laser flash photolysis of aqueous tryptophan // J. Phys. Chem., 79 (1975) 2711-2716.

16. R. Santus, L.I. Grossweiner, Primary products in the flash photolysis of tryptophan // Photochem. PhotobioL, 15 (1972) 101-105.

17. W.A. Volkert, R.R. Kuntz, C.A. Ghiron, R.F. Evans, Flash photolysis of tryptophan and N-acetyl-L-tryptophanamide; the effect of bromide on transient yields // Photochem. PhotobioL, 26 (1977) 3-9.

18. I. Saito, H. Sugiyama, A. Yamamoto, S. Muramatsu, T. Matsuura, Photochemical hydrogen-deuterium exchange reaction of tryptophan. The role in nonradiative decay of singlet tryptophan II J. Am. Chem. Soc., 106 (1984) 4286-4287.

19. H. Shizuka, M. Serizawa, H. Kobayashi, K. Kameta, H. Sugiyama, T. Matsuura, I. Saito, Excited-state behavior of tryptamine and related indoles. Remarkably efficient intramolecular proton-induced quenching// J. Am. Chem. Soc., 110(1988) 1726-1732.

20. H.-T. Yu, W.J. Colucci, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley, Fluorescence quenching in indoles by excited-state proton transfer II J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 8449-8454.

21. Б.Н. Никольский, Справочник химика. Том 1 // JI.-M.: Государственное научно-техническое издательство химической литературы, (1962).

22. J. Feitelson, Е. Hayon, A. Treinin, Photoionization of phenols in water. Effects of light intensity, oxygen, pH, and temperature II J. Am. Chem. Soc., 95 (1973) 1025-1029.

23. J.L. Redpath, R. Santus, J. Ovadia, L.I. Grossweiner, The role of metal ions in the radiosensitivity of metalloproteins. Model experiments with bovine carbonic anhydrase // Int. J. Radiant. Biol., 28 (1975) 243-253.

24. M.L. Posener, G.E. Adams, P. Wardman, R.B. Cundall, Mechanism of tryptophan oxidation by some inorganic radical-anions: a pulse radiolysis study. // J. Chem. Soc., Faraday Trans. II, 72 (1976) 2231-2239.

25. H.B. Steen, Wavelength dependence of the quantum yield of fluorescence and photoionization of indoles II J. Chem. Phys., 61 (1974) 3997-4002.

26. A. Bernas, D. Grand, E. Amouyal, Photoionization of solutes and conduction band edge of solvents. Indole in water and alcohols H J. Phys. Chem., 84 (1980) 1259-1262.

27. L.I. Grossweiner, A.M. Brendzel, A. Blum, Multiple pathways of tryptophan photoionization // Chem. Phys., 57 (1981) 147-155.

28. M. Bazin, L.K. Patterson, R. Santus, Direct observation of monophotonic photoionization in tryptophan by excited by 300-nm radiation. A laser photolysis study II J. Phys. Chem., 87(1983) 189-190.

29. B. Finnstroem, F. Tfibel, L. Lindqvist, One- and two-proton ionization of aqueous tryptophan by the harmonics of the Nd laser// Chem. Phys. Lett., 71 (1980) 312-316.

30. D.N. Nikogosyan, H. Gorner, Photolysis of aromatic amino acids in aqueous solution by nanosecond 248 and 193 nm laser light II J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 13 (1992) 219-234.

31. F. Saito, S. Tobita, H. Shizuka, Photoionization mechanism of aniline derivatives in aqueous solution studied by laser flash photolysis // J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 106(1997) 119-126.

32. J.C. Mialocq, E. Amouyal, A. Bernas, D. Grand, Picosecond laser photolysis of aqueous indole and tryptophan // J. Phys. Chem., 86 (1982) 3173-3177.

33. J. Peon, G.C. Hess, J.-M.L. Pecourt, T. Yuzawa, B. Kohler, Ultrafast photoionization dynamics of indole in water II J. Phys. Chem., 103 (1999) 2460-2466.

34. F. Gai, R.L. Rich, J.W. Petrich, Monophotonic ionization of 7-azaindole, indole and their derivatives and the role of overlapping excited states // J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 735— 746.

35. I. Tatischeff, R. Klein, Influence of the environment on the excitation wavelength dependence of the fluorescence quantum yield of indole // Photochem. Photobiol., 22 (1975) 221-229.

36. L.I. Grossweiner, Y. Usui, Flash photolysis and inactivation of aqueous lysozyme // Photochem. Photobiol., 13 (1971) 195-214.

37. J.F. Baugher, L.I. Grossweiner, Photolysis mechanism of aqueous tryptophan // J. Phys. Chem., 81 (1977) 1349-1354.

38. R. Katoh, Dependence of photoionization quantum yield of indole and tryptophan in water on excitation wavelength // J. Photochem. Photobiol. A: Chem., 189 (2007) 211-217.

39. L.P. McMahon, W.J. Colucci, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley, Deuterium isotope effects in constrained tryptophan derivatives: implications for tryptophan photophysics // J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 8442-8448.

40. R. van Heyningen, Fluorescent glucoside in the human lens // Nature, 230 (1971) 393-394.122

41. R.J.W. Truscott, A.M. Wood, J.A. Carver, A new UV-filter compound in human lenses // FEBSLett., 348 (1994) 173-176.

42. A.M. Wood, R.J.W. Truscott, UV filters in human lenses: tryptophan catabolism И Exp. Eye Res., 56(1993)317-325.

43. A.M. Wood, R.J.W. Truscott, Ultraviolet filter compounds in human lenses: 3-hydroxykynurenine glucoside formation // Vision Res., 34 (1994) 1369-1374.

44. F. Moroni, Tryptophan metabolism and brain function: focus on kynurenine and other indole metabolites // Euro J. Pharm., 375 (1999) 87-100.

45. O. Hayaishi , R. Yoshida, O. Takikawa, Indoleamine dioxygenase a possible biological function // Prog. Tryptophan Serotonin Res., (1984) 33-42.

46. L.M. Bova, M.H. Sweeney, J.F. Jamie, R.J.W. Truscott, Major changes in human ocular UV protection with age // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 42 (2001) 200-205.

47. M.H.J. Sweeney, R.J.W. Truscott, An impediment to glutathione diffusion in older normal human lenses: a possible precondition for nuclear cataract // Exp. Eye Res., 67 (1998) 587— 595.

48. B.A. Moffat, K.A. Landman, R.J.W. Truscott, M.H.J. Sweeney, J.M. Pope, Age-related changes in the kinetics of water transport in normal human lenses // Exp. Eye Res., 69 (1999)663-669.

49. R.J.W. Truscott, Human cataract: the mechanisms responsible; light and butterfly eyes // Int. J. Biochem. Cell Biol., 35 (2003) 1500-1504.

50. R.J.W. Truscott, Age-related nuclear cataract oxidation is the key // Exp. Eye Res., 80 (2005)709-725.

51. L.M. Taylor, J.A. Aquilina, J.F. Jamie, R.J.W. Truscott, UV filter instability: consequences for the human lens // Exp. Eye Res., 75 (2002) 165-175.

52. Yu.P. Tsentalovich, O.A. Snytnikova, M.D.E. Forbes, E.I. Chernyak, S.V. Morozov, Photochemical and thermal reactivity of kynurenine // Exp. Eye Res., 83 (2006) 14391445.

53. L.M. Bova, A.M. Wood, J.F. Jamie, R.J.W. Truscott, UV filter compounds in human lenses: the origin of 4-(2-amino-3-hydroxyphenyl)-4-oxobutanoic acid O-beta-D-glucoside // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 40 (1999) 3237-3244.

54. J.A. Zoltewicz, L.S. Helmick, J.K. O'Halloran, Covalent amination. Substituent effects on the site of addition of ammonia to quaternized pyridines and pyrazines // J. Org. Chem., 41 (1976) 1303-1308.

55. T. Tokuyama, S. Senoh, T. Sakan, K.S.Jr. Brown, B. Witkop, The photoreduction of kynurenic acid to kynurenine yellow and the occurrence of 3-hydroxy-L-kynurenine in butterflies II J. Am. Chem. Soc., 89 (1967) 1017-1021.

56. T. Tokuyama, S. Senoh, Y. Hirose, T. Sakan // J. Chem. Soc. Jpn., 79 (1958) 752.

57. J. Mizdrak, P.G. Hains, D. Kalinowski, R.J.W. Truscott, M.J. Davies, J.F. Jamie, Novel human lens metabolites from normal and cataractous human lenses // Tetrahedron, 63 (2007) 4990-4999.

58. L.M. Taylor, J.A. Aquilina, J.F. Jamie, R.J.W. Truscott, Glutathione and NADH, but not ascorbate, protect lens proteins from modification by UV filters // Exp. Eye Res., 74 (2002) 503-511.

59. J.A. Aquilina, R.J.W. Truscott, Identifying sites of attachment of UV filters to proteins in older human lenses II Biochim. Biophys. Acta, 1596 (2002) 6-15.

60. S. Vazquez, J.A. Aquilina, J.F. Jamie, M.M. Sheil, R.J.W. Truscott, Novel protein modification by kynurenine in human lenses II J. Biol. Chem., 277 (2002) 4867-4873.

61. B. Garner, S. Vazquez, R. Griffith, R.A. Lindner, J.A. Carver, R.J.W. Truscott, Identification of glutathionyl-3-hydroxykynurenine glucoside as a novel fluorophore associated with aging of the human lens II J. Biol. Chem., 274 (1999) 20847-20854.

62. P.G. Hains, J. Mizdrak, I.M. Streete, J.F. Jamie, R.J.W. Truscott, Identification of the new UV filter compound cysteine-L-3-hydroxykynurenine O-P-D-glucoside in human lenses // FEBSLett., 580 (2006) 5071-5076.

63. J.A. Aquilina, R.J.W. Truscott, Cysteine is the initial site of modification of alpha— crystallin by kynurenine // Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (2000) 216-223.

64. A. Korlimbinis, R.J.W. Truscott, Identification of 3-hydroxykynurenine bound to protein in the human lens. A possible role in age-related nuclear cataract // Biochemistry, 45 (2006)1950-1960.

65. N.R. Parker, A. Korlimbinis, J.F. Jamie, M.J. Davies, R.J.W. Truscott, Reversible binding of kynurenine to lens proteins: potential protection by glutathione in young lenses II Invest. Ophthalmol. Vis. Set, 48 (2007) 3705-3713.

66. B.D. Hood, B. Garner, R.J.W. Truscott, Evidence for crystalline modification by the major ultraviolet filter, 3-hydroxy-kynurenine O-P-D-glucoside // J. Biol. Chem., 274 (1999) 32547-32550.

67. J.A. Aquilina, J.A. Carver, R.J.W. Truscott, Oxidation products of 3-hydroxykynureninebind to lens proteins: relevance for nuclear cataract // Exp. Eye Res., 64 (1997) 727—735.12471.