Химические реакции кинуренина и его производных - молекулярных УФ-фильтров хрусталика тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Копылова Людмила Владимировна

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ КИНУРЕНИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ -МОЛЕКУЛЯРНЫХ УФ-ФИЛЬТРОВ ХРУСТАЛИКА

01.04.17 - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2011 1 6 июн 2011

4850021

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте «Международный томографический центр» Сибирского отделения РАН

Научный руководитель

доктор химических наук Центалович Юрий Павлович

Официальные оппоненты

доктор химических наук Воронцов Александр Валерьевич

кандидат химических наук Поздняков Иван Павлович

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится " 29 " июня 2011 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Учреждении Российской академии наук Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Учреждений Российской академии наук Института химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН и Института «Международный томографический центр» Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан " 26 " мая 2011 г.

Зам. председателя диссертационного совета доктор химических наук, профессор

Н.П. Грицан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Патогенез катаракты - сложный и во многом неизученный процесс. Катаракта — помутнение хрусталика глаза - развивается у более половины населения земного шара, перешагнувшего рубеж 65 лет. Механизм возникновения и развития этого заболевания до сих пор остаётся невыясненным. Существует предположение, что основной причиной, вызывающей модификацию белков хрусталика - кристаллинов - является окислительный стресс, а также нарушение обмена веществ (например, при сахарном диабете). Только в последние годы в научной литературе появился ряд работ, в которых предполагается, что процесс модификации белков хрусталика может быть связан с реакциями кинуренинов (КГ\Г) - молекул с небольшим молекулярным весом, находящихся в хрусталике в свободном состоянии. Эти соединения, по строению близкие к природным аминокислотам, обладают полосой поглощения в области 300-400 нм и короткими временами флуоресценции. Благодаря вышеуказанным свойствам эти соединения в хрусталиках глаз выполняют функцию светофильтров, защищая сетчатку глаза от УФ-облучения. Фотохимические и термические реакции кинуренинов приводят к образованию реакционных частиц - триплетных молекул и ненасыщенных кетонов, соответственно, а в ходе метаболизма молекулярных фильтров образуются продукты, фотохимическая и термическая активность которых может быть существенно выше, чем у исходных молекул. Предполагается, что кинуренины, подвергнувшиеся фотохимическому возбуждению или термическому разложению, могут присоединяться к кристаллинам, вызывая их многочисленные модификации, что ведет к агрегации белков и понижению их растворимости.

Химические реакции кинуренина и его производных к настоящему моменту изучены мало; в литературе отсутствует информация о полной схеме реакций данных соединений при физиологических условиях, моделирующих условия в хрусталике глаза. Вследствие этого исследование реакций кинуренина и его производного - дезаминированного кинуренина, в присутствии различных субстратов является очень актуальной задачей. Установление детальных механизмов химических реакций, приводящих к модификации белков хрусталика, может способствовать разработке медицинских препаратов, позволяющих ингибировать окислительные процессы в хрусталике, и, возможно, задерживать развитие катаракты.

Данная работа направлена на изучение химических и фотохимических реакций производных кинуренина при физиологических условиях. В работе с использованием комплекса химико-физических методов (оптическая спектроскопия, лазерный импульсный фотолиз, масс-спектрометрия, ВЭЖХ) исследована реакционная способность промежуточного про-

3

дукта разложения кинуренина - карбоксикетоалкена (СКА). Изучены реакции СКА с рядом аминокислот и антиоксидантов, определена структура аддуктов кинуренина с модельными биологическими молекулами, присутствующими в хрусталике, а также предпринята попытка модифицирования модельного белка молекулами кинуренина. С использованием комплекса химико-физических методов исследована стабильность, а также фотохимические и фотофизические свойства полученных соединений. Развита методика определения количества триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных.

Основными целями данной работы являются:

1. Установление механизма дезаминирования кинуренинов при различных значениях рН среды.

2. Разработка методик получения дезаминированного кинуренина и его аддуктов с аминокислотами и антиоксидантами, входящими в состав хрусталика и изучение стабильности синтезированных аддуктов с использованием методов химической физики.

3. Разработка методики модификации модельного белка молекулами кинуренина и анализ фотофизических свойств кинуренина, присоединенного к аминокислотам и к модельному белку.

4. Развитие физико-химических методов определения уровня триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных в зависимости от возраста и степени развития катаракты.

Научная новизна работы.

Установлен механизм дезаминирования кинуренинов в зависимости от кислотности среды. Впервые предложена методика синтеза и выделения дезаминированного кинуренина (СКА). С использованием комплекса химико-физических методов изучены реакции дезаминированного кинуренина при физиологических условиях, и установлено, что наибольшая константа скорости реакции СКА с аминокислотами наблюдается для аминокислоты цистеи-на и антиоксиданта глутатиона. Исследована термическая стабильность аддуктов кинуренина с лизином, гистидином, цистеином и глутатионом и установлено, что наиболее стабильным является аддукт с лизином.

Установлено, что при увеличении заместителя в молекуле кинуренина наблюдается увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни синглетного возбужденного состояния молекулы. Например, при присоединении кинуренина к модельному белку лизо-циму, наблюдается семикратное увеличение квантового выхода флуоресценции и тринадца-

тикратное увеличение времени жизни синглетного возбужденного состояния кииуренина. Это указывает на меньшую устойчивость по отношению к УФ излучению молекул кинури-нина, присоединенных к белку.

Развиты физико-химических методы определены уровни триптофана и его метаболита кииуренина в хрусталиках глаз крыс. Полученные данные свидетельствуют о том, что окислительный стресс организма, приводящий к развитию катаракты, влияет на концентрацию кииуренина и триптофана в хрусталиках крыс.

Практическая ценность. Полученные результаты по исследованию реакций присоединения СКА к аминокислотам и антиоксидантам могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов катарактогенеза, а также при разработке препаратов, предотвращающих или замедляющих процесс образования катаракты. Разработанная методики исследования небелкового состава в хрусталиках подопытных животных может быть усовершенствована и применена для исследования хрусталиков человека с различными степенями развития катаракты.

Личный вклад соискателя. Автор диссертации участвовал в постановке задач, решаемых в диссертационной работе, разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций. Все результаты, представленные в диссертации, получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Оригинальные экспериментальные результаты получены автором с использованием целого ряда химико-физических методов исследования: кинетической оптической спектроскопии, ВЭЖХ, лазерного импульсного фотолиза, кинетической флуоресцентной спектроскопии и масс-спектрометрии.

Апробация паботы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных симпозиумах и конференциях: International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry «Photoradchem-2007» (Коттаям, Керала, Индия, 8-11 февраля 2007 г.), VI Voevodsky Conference «Physics and Cbemistry of Elementary Chemical Processes» (Черноголовка, Россия, 25-28 июня 2007 г.), International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules «ISRIUM-2007» (Аскона, Швейцария, 19-24 августа 2007 г.), I Международная конференция «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине» (Туапсе, Россия, 3-9 октября 2007 г.), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008 г.), XX и XXI Симпозиумы «Современная химическая физика» (Туапсе, Россия, 2008-2009 гг.), Всероссийская конференция молодых ученых и III школа им. академика Н.М. Эмануэля

«Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, Россия, 1-3 октября 2008 г.), 15th International Congress on Photobiology «1СР-2009» (Дюссельдорф, Германия, 18-23 июня 2009 г.), 18th International Mass Spectrometry Conference «IMSC-2009» (Бремен, Германия, 31 августа - 4 сентября 2009 г.), Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 9-13 сентября 2009 г.), Central European conference on photochemistry «СЕСР 2010» (Бад Хофгаштайн, Австрия, 7-11 февраля 2010 г.), ХХШ IUPAC Symposium on Photochemistry (Феррара, Италия, 11-16 июля 2010 г.), IV Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спеетрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, Россия, 10-14 октября 2010 г.).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях в российских и международных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также в 15 тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 199 наименований. Работа изложена на 123 страницах, содержит 7 таблиц, 30 рисунков и 7 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении отражена актуальность-проблемы, решению которой посвящена данная диссертация, сформулированы основные цели работы и дано описание структуры диссертации.

В первой главе представленной диссертации приведен литературный обзор, в котором описаны свойства кинуренинов (KN) - УФ-фильтров хрусталика, их взаимодействие с биологически важными молекулами. В первом и втором разделах главы описаны строение и белковый состав хрусталика глаза млекопитающих, а также отмечена связь модификаций белков хрусталика с процессом развития катаракты. Третий раздел главы посвящен описанию входящих в состав хрусталика низкомолекулярных соединений, к которым относятся антиоксиданты, а также УФ-фильтры кинуренины - метаболиты аминокислоты триптофан. Четвертый раздел главы представляет собой анализ фотохимических свойств кинуренина. В ходе фотохимических реакций происходит образование высокореакционного триплетного состояния молекулы кинуренина. Дезактивация данного состояния может происходить в присутствии тушителей, в качестве которых могут выступать аминокислоты и антиоксиданты, входящие в состав хрусталика. В разделе также приведен анализ фотостабильности кинуренина. В пятом разделе дано описание термических реакций с участием молекулы кину-

ренина. Обсуждается два пути прохождения термических реакций - декарбоксилирование и дезаминирование молекулы кинуренина. Продуктом реакции дезаминирования является высокореакционное соединение - карбоксикетоалкен (СКА), которое может претерпевать реакцию циклизации с образованием желтого производного. В присутствии нуклеофилов, таких как аминокислотные остатки белков либо антиоксиданты, в хрусталике может происходить реакция присоединения СКА к субстратам. Таким образом, данные соединения способны модифицировать аминокислотные остатки белков хрусталика. Шестой раздел посвящен описанию катаракты у подопытных животных. В разделе описаны линии подопытных крыс: линия Вистар является контрольной линией, линия ОХУБ - специально выведенные крысы, страдающие от раннего развития катаракты. Приведены концентрации производных кинуренина в хрусталиках крыс Вистар, а также в хрусталиках крыс, у которых катаракта вызвана введением различных препаратов. Показана зависимость соотношения кристаллинов - белков хрусталика - от степени развития катаракты у животных.

о

т— *

242016 128 4 0

% ■

200

10 11

Время (часы)

РН

Рисунок 1. а) Кинетические кривые термического разложения в анаэробных условиях при различных значениях рН: Д - рН 6.6; ♦ - рН 8,5; о - рН 9; ■ - рН 9.7. Сплошные линии; расчет моноэкспоненциальной функцией. Ь) рП-завнсимость константы скорости разложения при I "37 °С.

Во второй главе описан синтез используемого дезаминированного кинуренина (СКА), а также синтез аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом. Подробно описаны используемые в работе методы исследования и методики проведения экспериментов. Медленные термические реакции исследовались путем инкубирования растворов при различных значениях рН среды, температуре, а также при добавлении субстратов. Для анализа полученных соединений и продуктов реакций, а также для измерения констант скорости реакций использовались такие методы, как оптическая (УФ и видимый спектр) и кинетическая оптическая спектроскопии, высокоэффективная жидкостная хроматография

7

(ВЭЖХ), масс-спектрометрия. Приведено описание методики определения концентрации белка в растворе с использованием метода Бредфорда, а также методика определения свободных тиолов в растворе с использованием реактива Эллмана. Также перечислено программное обеспечение, использованное для анализа данных.

Третья глава посвящена исследованию механизма реакции дезаминирования кинуре-нинов и изучению кинетики реакции дезаминированного кинуренина (СКА) с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике. Рассмотрена стабильность синтезированных аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом.

В первой части главы исследована рН-зависимость реакции дезаминирования кинуренина (КЫ) и 3-гидроксикинуренина (ЗОНКЫ). На Рис. 1а представлены кинетические кривые спада концентрации КЫ при различных значениях рН среды. Термостатирование буферного раствора КЫ было проведено в анаэробных условиях при 37 "С. Кинетические зависимости хорошо описываются моноэкспоненциальной функцией, на Рис. 1а сплошными линиями показаны расчетные кривые. На Рис.1Ь показана рН-зависимость константы скорости дезаминирования кинуренина. Аналогичный эксперимент был проведен для изучения реакции дезаминирования ЗОНКЫ.

Хроматографический анализ продуктов реакций показал, что при элиминировании аминогруппы боковой цепи КМ и ЗОНКЫ образуются ненасыщенные соединения СКА и ЗОНСКА и циклические соединения КМ желтый и ЗОНКЫ желтый, соответственно. На Схеме 1 показана реакция дезаминирования для кинуренинов, которая представляет собой Дезаминирование при рН 5.5-11.2:

:0—н \ продукт дезаминирования: nh/

Hueso R= Н: СКА

н /при рН 5.5-8 R = ОН: ЗОНСКА

Схема 1. Механизм дезаминирования кинурениио в при различной кислотности среды.

отщепление аминогруппы от a-атома углерода и протона от р-атома углерода. При этом формируется ненасыщенное соединение с л-связью, которой не было в исходном соединении. Основность растворителя является одним из условий, определяющих скорость разложения кинуренинов: при низких значениях рН в растворе присутствует вода - слабое основание, тогда как при высоких значениях рН в растворе присутствует сильное основание - гидро-

ксильный анион (ОН"). При рН среды выше 8 наблюдается ускорение реакции за счет основного катализа реакции.

Во второй части главы описаны термические реакции кинуренина и.промежуточного продукта термолиза KN - ненасыщенного соединения СКА. Выделение продуктов термолиза KN осуществлялось с помощью полупрепаративной ВЭЖХ. Выделенные вещества были лиофилизованы, анализ и идентификация были проведены с помощью оптической спектроскопии и хромато-масс-спектрометрического метода. Для определения константы скорости разложения СКА, а также констант скорости взаимодействия СКА с антиоксидантами и аминокислотами было проведено инкубирование буферных растворов СКА (Т = 37 СС, рН 7.0) с различными субстратами и последующим хроматографическим анализом полученных смесей.

Основной реакцией термолиза СКА в отсутствие субстратов является циклизация с образованием KN желтого. Константа скорости разложения СКА и образования KN желтого составила 1ц (37 °С) = (1.6±0.4)х Ю"6 с"1 (Рис. 2).

Константы скорости взаимодействия СКА с биологическими молекулами были определены для следующих аминокислот: А'-ацетил-Ь-трпптофана (N-ас-Тгр), Л'-ацетил-Ь-тирозина (N-ас-Туг), ' N-ацетил-Ь-гистидина (N-ac-His), лизина (Lys), N-ацетил-Ь-метионина (N-ac-Met) и антиоксидантов - аскорбиновой кислоты (AscAc) и НАД. При добавлении к раствору СКА тирозина, триптофана и метионина не наблюдалось заметного влияния на спад концентрации СКА. Установлено, что константа скорости реакции с этими аминокислотами не превышает 10'6 с"'.

На Рис. 2 в качестве примера представлены кинетические кривые спада концентрации СКА в присутствии гистидина, НАД и аскорбиновой кислоты. Спад сигнала СКА хорошо описывается моноэкспоненциальной зависимостью согласно уравнению (1):

[СКА] = [CKAloXexpiM-kpISub]), (1)

20 40 60 80

Время (часы)

Рисунок 2. Кинетические кривые изменения концентрации СКА, полученные при ВЭЖХ анализе инкубированных растворов СКА (Т = 37 °С, рН 7.0): • - СКА без добавления субстратов; о - СКА в присутствии 41.8 иМ .V-ас-Н«; Ж - СКА в присутствии 42.0 мМ I.-АзсАс; а - СКА в присутствии 41.7 мМ НАД. Сплошные линии показывают моделирование согласно уравнению (1).

где [СКА] - концентрация СКА, [Sub] - концентрация добавляемой аминокислоты или анти-оксиданта, к4- константа скорости циклизации СКА, Ц, - константа скорости реакции с соответствующим субстратом. Расчетные кривые показаны на Рис. 2 сплошными линиями, полученные константы скорости представлены в Таблице 1.

Для определения констант скорости реакции СКА с антиоксидантом глутатионом (GSH) и аминокислотой цистеином (Cys) был применен метод кинетической оптической спектроскопии. Константы скорости реакции СКА с GSH и Cys при 37 °С представлены в Таблице 1. Кроме того, для реакций СКА с глутатионом и цистеином исследована температурная зависимость констант скорости присоединения в диапазоне температур от 24 °С до 65 "С. Зависимости констант скорости реакций от температуры в координатах Аррениуса хорошо описываются линейной функцией, что позволяет определить значения предэкспонен-циальных множителей /1gsh = (1.8±0.7)х105 М"'с'', Асys= (2.7±0.9)х108 М"'с'' и энергий активации реакции £gsh = 29.2±5.6 кДж/моль, Ecys = 40.4±5.7 кДж/моль. Хроматографический анализ растворов после прохождения реакций показал, что основными продуктами реакций СКА с субстратами являются аддукты KN-R (где R - добавляемый субстрат), которые элюи-руются с хроматографической колонки в виде дублетов.

Третья часть главы представляет собой исследование реакций разложения синтезированных аддукгов кинуренина с аминокислотами лизином, гистидином, цистеином и антиоксидантом глутатионом (Схема 2), которое было проведено с использованием метода инкубирования буферных растворов в анаэробных условиях при Т = 37 °С и рН 7.0 с последующим хроматографическим анализом.

Схема 2. Структуры аддуктов кинуренина с аминокислотами лизин (Lys), гистиднн (His), цистеин (Cys) и антиоксидантом глутатионом (GSH).

При исследовании реакции разложения аддукта KN-Lys было показано, что это соединение является стабильным, и после 200 часов инкубирования разложение исходного соединения не превышает 7 %. Для аддукта с гистидином наблюдается более высокая степень разложения - 50 % к 460 часам инкубирования. Наибольшая скорость разложения аддуктов наблюдается для KN-Cys и K.N-GSH, где присутствует сульфидная связь. Константы скорости разложения всех исследованных соединений приведены в Таблице 1.

СООН

о

Таблица 1. Константы скорости разложения аддуктов (ирми|) и константы скорости присоединения деза-мннированного кинуренина к различным молекулам (кр) при физиологических условиях (Т = 37 °С, рН

Соединение кр, М 'с1

КЫ-Ьув < кг7 (2.3±0.6)х 10'4

КЫ-Ш (3.4±1.0)х10"7 (1.2±0.3)х10-4

КЫ-Л'-ас-Ш (3.8±1.2)х10"7 -

КЫ-Суз (1.7±0.4)х10"5 36±4

КМ-бЗН (5.8±0.7)х10"6 2.1±0.2

Из полученных в работе результатов можно сделать вывод, что при прохождении термических реакций основные продукты дезаминирования УФ-фильтров в первую очередь будут реагировать со свободными глутатионом и цистеином, содержащимися в хрусталике, а также с цистеиновыми остатками белков хрусталика. Ввиду нестабильности связи дезамини-рованного кинуренина с цистеином накопление модификаций может происходить на лти-новых и гистидиновых аминокислотных остатках белков хрусталика.

В четвертой главе описаны фотофизические свойства кинуренина, присоединенного к различным молекулам, присутствующим в хрусталике, а также проведено модифицирование модельного белка лизоцима молекулами дезами-нированного кинуренина с последующим анализом фотофизических свойств полученного соединения.

В первой части главы описана методика проведения модифицирования лизоцима (НЕУУЬ) молекулами дезаминированного кинуренина (СКА). Масс-спектрометрический анализ полученного модифицированного лизоцима (тНЕ\УЬ) показал, что лизоцим модифицирован по лизино-вым аминокислотным остаткам в 1 и 33 положениях в составе белка.

Вторая часть главы включает в себя исследование ультрабыстрой динамики возбужденных состояний синтезированных аддуктов КЫ-Ьуэ, КЫ-Суэ, КЫ-ЬНв и К1Ч-08Н с использованием установки для измерения флуоресценции в пикосекундном временном диапазоне, а

11

Время (пс)

Рисунок 3. Временные профили флуоресценции КМ-НЬ, К1Ч-С8Н в максимуме эмиссии на 500 нм (я); временные профили промежуточного поглощения К^, Ю-СБН в максимуме поглощения 579 нм (Ь).

также лазерный импульсный фотолиз в микро- и пикосекундной временных шкалах. Исследование проведено в различных растворителях (НгО, МеОН, ЕЮН, ДМФ, ДМСО). На Рис. 3 представлены временные профили флуоресценции и промежуточного поглощения для кину-ренина и его аддукгов с гистидином и глутатионом в водном растворе. Основным различием в динамике флуоресценции и промежуточного поглощения для KN и его аддукгов с аминокислотами и антиоксидантами является более быстрая эволюция сигнала кинуренина по сравнению с аддуктами (Рис. 3 (а) - флуоресценция, 3 (Ь) - промежуточное поглощение). Данные, полученные для флуоресценции и промежуточного поглощения, были обработаны с помощью процедуры глобальной подборки параметров. Для всех аддуктов было достигнуто хорошее совпадение расчетных и экспериментальных данных при использовании трех экспонент. Полученные временные константы, рассчитанные по данным как флуоресценции, так и промежуточного поглощения, представлены в Таблице 2. Временные константы Х\ и тг, полученные в результате глобальной обработки данных, могут быть отнесены к релаксации фотовозбужденной молекулы из термически возбужденного синглетного состояния в S| состояние, а тз - наибольшая временная константа - к времени жизни нижнего возбужденного синглетного состояния молекулы.

Таблица 2. Фотофизические свойства водных растворов KN, его аддуктов с аминокислотами лизином (KN- Lys), цистеином (KN-Cys), гистидином (KN-His) и антиоксидантом глутатионом (KN-GSH) при комнатной температуре: Т|, Т2 и Тз - временные константы; Фр - квантовый выход флуоресценции. Стан-

Ф . % F Т ,nc ne t3» ne

a* b** a* b** a* b**

KN 0.08 0.9 1.0 4.5 5.4 27 26

KN-Lys 0.07 1.1 1.1 4.7 4.2 28 29

KN-Cys 0.12 0.9 1.3 8.5 9.5 44 41

KN-His 0.15 1.2 1.5 6.4 8.5 49 47

KN-GSH 0.15 1.3 1.1 7.2 8.8 47 46

а* - для флуоресценции, дайна волны возбуждения 400 им

Ь** - для промежуточного поглощения, длина волны возбуждения 400 нм

Увеличение временной' константы 11 от КИ к аддукту КЫ-ввН коррелирует с увеличением размера молекулы, и, соответственно, увеличением времени конформационной релаксации. Аналогичные расчеты были проведены для данных, полученных в других растворителях. Для КЫ-вЗН в МеОН по сравнению с водными растворами наблюдается увеличение константы т3 от 47 до 380 пс, в ЕЮН -до 790 пс, в ДМФ - до 1050 пс, в ДМСО - до 1500 пс.

Сильная зависимость от растворителя временной константы Тз указывает на участие водородных связей в механизме ультрабыстрой дезактивации возбужденных состояний.

В третьей части главы описаны фотохимические и фотофизические свойства лизоци-ма, модифицированного молекулами дезаминированного кинуренина (тНЕУ/Ц. На Рис. 4 представлены временные зависимости флуоресценции тШМЬ и КЫ в максимумах полос эмиссии на длинах волн 480 и 500 нм, соответственно. Профиль флуоресценции тНЕ\М* существенно отличается от КЫ, для тНЕ\УЬ наблюдается более медленный спад сигнала. На вставке в Рис. 4 показан спад флуоресценции тНЕ\УЬ на коротких временах; для КЫ в данном временном диапазоне наблюдается растущий сигнал, связанный с сольватационной релаксацией. Следует заметить, что для тНЕХУЬ не было зафиксировано растущего сигнала ни на одной из использованных длин волн (480, 500 и 520 нм). Измерения были проведены на длинах волн, которые относятся к низкоэнергетической части полосы эмиссии, поэтому можно сделать вывод, что релаксационную динамику с участием растворителя зафиксировать не удается из-за более быстрого процесса, ведущего к гибели синг-летного возбужденного состояния. Анализ полученных временных профилей был проведен с использованием свёртки суммы трех экспоненциальных функций, как и в случае анализа данных для аддуктов кинуренина. Наиболее хорошее совпадение было достигнуто с учетом временных констант Т|, тг и тз, представленных в Таблице 3. Константа т4 получена методом времякоррелированного счета

Исследования динамики флуоресценции и поглощения тНЕ\¥Ь показали, что гибель возбужденного синглетного состояния кинуренинов, присоединенных к лизоциму, имеет многокомпонентный характер. Самую быструю компоненту (около 1 пс), по видимому, следует отнести к реакции переноса электрона между фотовозбужденным кинуренином и близлежащими аминокислотными остатками. Вторая, третья и четвертая компоненты динамики возбужденного состояния могут быть отнесены к возбужденным молекулам кинуренинов, в

0.0 '--------------------------------

О 100 200 300 400 500 600

Время (пс)

Рисунок 4. Временная зависимость флуоресценции Гц11 ГА\1. (1) и 1*34 (2) в пикосекундном временной диапазоне, записанная в максимумах эмиссии (тНЕ\УЬ - 480 им, - 500 нм.). Вставка: динамика флуоресценции на коротких временах.

ближайшем окружении которых отсутствуют подходящие доноры электронов. Полученные временные константы следует относить к молекулам кинуренина, присоединенным к различным аминокислотным остаткам в лизоциме, и, соответственно, имеющим различное локальное окружение.

Таблица 3. Фотофнзическне свойства водного раствора лизоцима, модифицированного дезамннирован-ным кннуренином (т11Г\\ ( ) при комнатной температуре: Т], т> Тз н Т4 — временные константы; Фр —

<v% tj, пс 1 , пс т}, пс т4, пс

mHEWL 0.54 0.9 (0.20)а 34 (0.36)а 360 (0.44)а

380 (0.72)ь 2 (0.25)ь

а - для флуоресценции, длина волны возбуждения 400 /ш Ь - для метода ВКСФ, длина волны возбуждения 395 нм

В скобках указаны вклады соответствующих каналов в дезактивацию возбужденного состояния.

Полученное значение для тг близко ко времени жизни синглетного состояния аддуктов в воде, т.е. эту константу можно приписать кинуренинам, присоединенным к внешней поверхности лизоцима; временная константа тз сравнима с временем жизни флуоресценции аддуктов в ЕЮН, и ее можно отнести к молекулам кинуренинов, частично погруженным в глобулярную структуру белка; значение Т4 - сравнимо с временем жизни флуоресценции КМ в

апротонных растворителях, т.е. относится к кинуренинам, присоединенным к аминокислотном остаткам внутри белковой глобулы.

На Рис. 5 показаны спектры промежуточного поглощения, полученные при фотолизе водного раствора тНЕ\\'Ь (1.3х10'4 М, рН 6.4, анаэробные условия, длина волны облучения 355 нм), через 80 не и 4 мкс после импульса лазера. Сразу после импульса лазера наблюдается спектр промежуточного поглощения с максимумом полосы поглощения на 430 нм и просветление в области 360 нм, что соответствует исчезновению исходного кинуренина. Сигнал с максимумом на 430 нм отнесен к триплетному состоянию кинуренина, связанного с лизо-цимом. После импульса лазера наблюдается монотонный спад на длинах волн короче 320 нм

Время (мкс)

' С00а00о000"000с00°000000"^

80 не А мкс

3D0 350 400 450 500 550 600 650

Длина волны (нм)

Рисунок 5. Спектры промежуточного поглощения, полу.ченные через 80 не и 4 мкс после импульса лазера при фотолизе водного раствора mllEWL (1.3x10' 4 М, pH 6.4, анаэробные условия). Длина волны возбуждения 355 нм.

и длиннее 380 нм при параллельном образовании полосы промежуточного поглощения с максимумом на 330 им, которая представляет собой суперпозицию поглощения анион-радикала кинуренина (полоса поглощения на 300 нм) и радикала триптофана Тгр' (полосы поглощения на 330 и 510 нм), образовавшегося в ходе депротонирования радикала ТгрН'+ (рКа = 4.3, полосы поглощения на 330 и 570 нм). Квантовый выход триплетных состояний КЬ), присоединенного к белку, был определен относительно квантового выхода триплетов свободного кинуренина, и составил 3.4±0.5 %. Расчеты были проведены в предположении, что коэффициенты экстинкции исходного кинуренина и кинуренина, присоединенного к белку, одинаковы и составляют -3700 М"'см"'.

Следует отметить, что квантовый выход флуоресценции и триплетов кинуренина, кова-лентно связанного с белком, существенно выше, чем для свободного. Таким образом по данным, полученным в работе, можно предположить, что такие молекулы кинуреншгов являются лучшими фотосенсибилизаторами и тем самым могут влиять на процесс развитие катаракты.

Пятая глава посвящена исследованию уровней триптофана и кинуренина в хрусталиках экспериментальных жнвотных, в качестве которых были использованы крысы линий Вистар - контрольная линия, и ОХУ8 -специально выведенные крысы, у которых проявления первых признаков катаракты наблюдаются в возрасте 1.5-2 месяца. Исследования были проведены с использованием хромато-масс-спектрометрического метода. На Рис. 6 представлена хроматограмма небелкового экстракта хрусталика 15-дневной крысы ОХУЭ, записанная на длине волны 254 нм. Сигнал на 5.9 минуте был отнесен к кинуре-нину, присутствующему в хрусталике крысы. Сигналы на хроматограмме (Рис. 6) с временами удерживания на хроматографической колонке 10.2 и 14.6 минут были отнесены к триптофану (Тгр) и ^/-ацетил-триптофану {Ы-ас-Тгр), соответственно. Концентрации кинуренина и триптофана в небелковых экстрактах хрусталиков были

Тгр

I кы

О 04|

Тгр

200 зоо мю ;

Дпипа юпны (нм)

кы

А/-ас-Тгр

14

6 8 10 12 Время (мин)

Рисунок 6. Хроматограмма небелкового экстракта хрусталика 15-дневнон крысы лшши ОХУБ, полученная на длине волны 25-1 нм. На вставках представлены спектры оптического поглощения кинуренина (КМ) и триптофана (Тгр), входящих в состав хрусталика: сплошные линии - спектры КМ и Тгр из экстракта, пунктирные линии -спектры растворов КМ и Тгр.

рассчитаны по площади соответствующих пиков на хроматограмме с использованием калибровочной прямой растворов KN и Тгр с известной концентрацией. Хроматографические исследования были проведены для 63 крыс OXYS и 57 крыс Вистар в возрасте от I до 720 дней. Для исследования каждого возраста было использовано 4-6 хрусталиков крыс OXYS и 4-6 хрусталиков крыс Вистар. Концентрации кинуренина и триптофана для каждой пары хрусталиков были определены независимо; далее было проведено усреднение результатов для крыс одной линии и одного возраста. Результаты, полученные для концентраций кинуренина в хрусталиках крыс обеих линий, представлены на Рис. 7. Аналогичные результаты был получены для концентрации триптофана в хрусталиках крыс линий Вистар и OXYS разного возраста. Анализ данных, полученных для крыс линии Вистар, показывает, что уровень триптофана у таких крыс увеличивается в 3 раза к 7 дню жизни, достигая своего максимального значения. С возрастом концентрация триптофана медленно убывает, и к 2 месяцам снижается до 40 % от максимального уровня. Начиная с 2-месячного возраста, уровень триптофана остается неизменным в хрусталиках крыс обеих линий. Достаточно высокий уровень Тгр был

обнаружен в хрусталиках новорожденных крыс OXYS. Установлено, что в первые 20 дней после рождения концентрация триптофана у крыс OXYS на порядок выше, чем у крыс Вистар, однако у крыс обеих линий старше 1 месяца разница в концентрации триптофана становится статистически незначимой.

В хрусталиках крыс линии OXYS концентрация кинуренина сохраняется неизменной (на уровне 1 мкг/r) до 1.5 месяцев жизни, затем постепенно спадает до уровня 0.1 мкг/г хрусталика. В хрусталиках крыс линии Вистар концентрация кинуренина значительно ниже (у 7-дневной крысы - 0.4 мкг/г, у новорожденной крысы - 0.05 мкг/г), чем у крыс линии OXYS такого же возраста; однако в первые 10 дней после рождения уровень кинуренина у крыс линии Вистар резко возрастает с последующим плавным спадом. В возрасте 10, 15 и 20 дней уровень кинуренина в хрусталиках крыс линии Вистар отличается от крыс линии OXYS в 6.6, 2.1 и 1.7 раз, соответственно. В

Рисунок 7. Содержание кинуренина в хрусталиках крыс линии Вистар (белые прямоугольники) и ОХУв (заштрихованные прямоугольники) различного возраста. Концентрация определена в мкг/г хрусталика.

* - статистически значимые межлинейные различия.

хрусталиках крыс обеих линий в возрасте старше 1 месяца межлинейные различия становится статистически незначимыми.

Интересным является сравнение динамики изменения концентрации КЫ и Тгр в процессе формирования глаза. Первые 20 дней после рождения - это важный период в развитии хрусталика глаза. Существует предположение, что введение препаратов, вызывающих развитие катаракты, может быть особенно эффективным в первые 20 дней развития хрусталика, когда ткани являются наиболее восприимчивыми к внешним воздействиям.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что на стадии формирования катаракты, когда помутнение хрусталика становится заметным, разница в содержании триптофана и кинуренина у крыс линий Вистар и ОХ УЗ незначительна. Стоит отметить, что в первые три недели жизни животных разница в содержании этих компонентов достаточно велика. Полученные данные свидетельствуют о том, что окислительный стресс организма, приводящий к развитию катаракты, влияет на концентрацию кинуренина и триптофана в хрусталиках крыс. Таким образом, различие в уровнях этих соединений в хрусталике может являться индикатором окислительного стресса организма.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1) Синтезированы производные кинуренина - дезаминированный кинуренин (СКА), ад-дукты дезаминированного кинуренина с аминокислотами лизином, гистидином, цис-теином и антиоксидантом глутатионом; проведено модифицирование модельного белка лизоцима молекулами кинуренина.

2) Предложен механизм дезаминирования кинуренинов в зависимости от кислотности среды. В щелочных растворах отщепление аминогруппы осуществляется под действием сильного основания - гидроксильных ионов с образование енолят-аниона кинуренинов. В кислых растворах элиминирование аминогруппы происходит под действием молекул воды - слабого основания; как следствие, в кислых растворах скорость дезаминирования уменьшается.

3) Измерены константы скорости присоединения СКА к аминокислотам лизину, гисти-дину, цистеину и антиоксиданту глутатиону. Установлено, что наиболее высокая константа скорости наблюдается для реакции с цистеином и глутатионом, в то время как для остальных соединений константа скорости реакции на несколько порядков ниже. Таким образом, наиболее уязвимым для присоединения дезаминированных УФ-фильтров является цистеиновый аминокислотный остаток в составе белков, а защитную функцию может выполнять глутатион.

4) Исследованы реакции разложения аддуктов дезаминированного кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами. Установлено, что наиболее стабильными аддуктами кинуренина являются аддукты с лизином и гистидином. Установлено, что квантовый выход и время жизни флуоресценции для аддуктов имеют более высокие значения, что связано с наличием заместителя в боковой цепочке кинуренина.

5) Показано, что модифицирование модельного белка лизоцима молекулами дезаминированного кинуренина происходит по лизиновым аминокислотным остаткам в составе белка. В молекуле кинуренина, ковалентно связанной с белком, наблюдается значительное увеличение квантового выхода и времени жизни флуоресценции, а также квантового выхода триплетного состояния по сравнению со свободным кинуренином.

6) Определен уровень триптофана и кинуренина в хрусталиках крыс Вистар и OXYS различных возрастов. Наибольшие различия содержания Тгр и KN наблюдаются в первые три недели жизни животных, тогда как уже к четвертой неделе межлинейные различия становятся незначительными. Таким образом, изменения в кинурениновом пути превращений триптофана в хрусталике могут являться индикатором окислительного стресса организма, приводящего к развитию катаракты.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Снытникова, О.А., Шерин, П.С., Копылова, Л.В., Центалович, Ю.П. Кинетика и механизм реакций фотовозбужденного кинуренина с молекулами биологических соединений II Изв. АН, Серия Химическая. 2007. 4. 704-710.

2. Kopylova, L.V., Snytnikova, О.А., Chernyak, ЕЛ., Morozov, S.V., Tsentalovich, Y.P. UV filter decomposition. A study of reactions of 4-(2-aminophenyl)-4-oxocrotonic acid with amino acids and antioxidants present in the human lens // Exp. Eye Res. 2007. 85. 242-249.

3. Kopylova, L.V., Snytnikova, O.A., Chernyak, E.I., Morozov, S.V., Forbes, M.D.E., Tsentalovich, Y.P. Kinetics and mechanism of thermal decomposition of kynurenines and biomolecular conjugates: Ramifications for the modification of mammalian eye lens proteins // Org. Biomol. Chem. 2009. 7. 2958-2966.

4. Snytnikova, O.A., Kopylova, L.V., Chernyak, E.I., Morozov, S.V., Kolosova, N.G., Tsentalovich, Y.P. Tryptophan and kynurenine levels in lenses of Wistar and accelerated-senescence OXYS rats // Mol. Vis. 2009. 15.2780-2788.

5. Sherin, P.S., Grilj, J., Kopylova, L.V., Yanshole, V.V., Tsentalovich, Y.P., Vauthey, E. Photo-physics and photochemistry of UV filter kynurenine covalently attached to amino acids and to a model protein II J. Phys. Chem. B. 2010. 114. \ 1909-11919.

6. Sherin, P.S., Snytnikova, O.A., Tsentalovich, Y.P., Kopylova, L.V., Sagdeev, R.Z. The intermediates of kynurenine formed under UV irradiation - triplet state and radicals // Abstract of the International Conference on Frontiers of Radiation and Photochemistry (Photoradchem-2007), 8-11 February 2007, Kottayam, Kerala, India., p. 55-56.

7. Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Kopylova, L.V., Sagdeev, R.Z., Tsentalovich, Y.P. Photochemical Reactions of Kynurenine // Abstract of the VII Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes", 25-28 June 2007, Chernogolovka, Russia, p. 128-129.

8. Tsentalovich, Y.P., Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Kopylova, L.V., Sagdeev, R.Z. Thermal and photochemical reactions of kymirenines - implications for the human cataract // Abstract of the International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (ISRIUM-2007), 19-24 August 2007, Monte-Verita, Ascona, Switzerland.

9. Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Kopylova, L.V., Tsentalovich, Y.P. Kynurenine reactive intermediates. Reactions of kynurenine triplet excited state // Abstract of the International Symposium on Reactive Intermediates and Unusual Molecules (ISRIUM-2007), 19-24 August 2007, Monte-Verita, Ascona, Switzerland.

10. Копылова, Л.В., Снытникова, О.А., Шерин, П.С., Черняк, Е.И., Морозов, С.В., Центалович, Ю.П., Сагдеев, Р.З. Термические и фотохимические реакции УФ-фильтров хрусталика глаза // Сборник тезисов I Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине», 3-9 октября 2007 г., г. Туапсе, Россия, с. 44

11. Центалович, Ю.П., Снытникова, О.А., Шерин, П.С., Копылова, JI.B., Черняк, Е.И., Морозов, С.В., Сагдеев, Р.З. Пост-трансляционная модификация белков хрусталика молекулярными УФ-фильтрами // Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск, Россия, с. 412.

12. Копылова, J1.B., Снытникова, О.А., Шерин, П.С., Черняк, Е.И., Морозов, С В., Центалович, Ю.П. Реакции УФ фильтров, содержащихся в хрусталике человеческого глаза // Сборник тезисов XX Симпозиума "Современная химическая физика", 15-26 сентября 2008, Туапсе, Россия, с.21.

13. Копылова, Л.В., Снытникова, О.А., Шерин, П.С., Черняк, Е.И., Морозов, С В., Центалович, Ю.П. Роль антиоксидантов в предотвращении модификации белков хрусталика ки-нуренипом и его производными // Сборник тезисов Всероссийской конференции молодых

ученых и III школы им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», 1-3 октября 2008, Москва, Россия, с.249-250.

14. Sherin, P.S., Kopylova, L.V., Snytnikova, O A., Tsentalovich, Y.P., Grilj, J., Vauthey, E. Photochemistry of kynurenine - UV filter of the human eye II Abstract of the 15th International Congress on Photobiology (ICP-2009), 18-23 June 2009, Dusseldorf, Germany, p. 94.

15. Kopylova, L.V., Snytnikova, O.A., Tsentalovich, Y.P., Kolosova, N.G., Mesheryakova I., Rumyantseva Y.V. Study of cataract development: metabolite and protein content in rat lenses // Abstract of the 18,h International Mass Spectrometry Conference (IMSC-2009), 31 August -04 September 2009, Bremen, Germany, p 87, PWA 141.

16. Копылова, Л.В., Снытникова, О.А., Колосова, Н.Г., Румянцева, Ю.В., Мещерякова, И.А., Черняк, Е.И., Морозов, С.В., Центалович, Ю.П. Протеомика и метаболомика хрусталика крыс Wistar и OXYS в процессе катарактогенеза // Сборник тезисов Научной конференции «Медицинская геномика и протеомика», 9-13 сентября 2009, Новосибирск, Россия, стр. 39.

17. Копылова, Л.В., Снытникова, О.А., Колосова, Н.Г., Румянцева, Ю.В., Мещерякова, И.А., Центалович, Ю.П. Изучение процесса развития катаракты: химический состав хрусталика // Сборник тезисов XXI симпозиума «Современная химическая физика», 25 сентября - 6 октября 2009, Туапсе, Россия, стр. 109.

18. Tsentalovich, Y.P., Snytnikova, О.А., Sherin, P.S., Kopylova, L.V., Yanshole, V.V. Photochemical and thermal reactions of UV filters contained in the human lens // Abstract of the Central European conference on photochemistry (CECP 2010), 7-11 February 2010, Bad Hof-gastein, Austria, p. 43, 024.

19. Kopylova, L.V., Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Chernyak, Е.1., Morozov, S.V., Tsentalovich, Y.P. Photochemical and therman reactions of UV-filter kynurenine (KN) and KN-derived compounds contained in the human lens // Abstract of the ХХШ IUPAC Symposium on Photochemistry, 11-16 July 2010, Ferrara, Italy, p. 271.

20. Черепанов, И.В., Копылова, Л.В., Колосова, Н.Г., Центалович, Ю.П. Изучение возрастных и катарактаяьных изменений в протеомном составе хрусталиков экспериментальных крыс /1 Сборник тезисов IV Всероссийской конференции-школы «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», 10-14 октября 2010, Звенигород, Россия, стр. 114-115.

Подписано в печать 19.05.2011г. Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1,5 Объем 24 стр. Тираж 130 экз. Заказ № 98

Отпечатано ИП Илюшин Р.В. 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ry

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Строение и состав хрусталика.

1.2. Белки хрусталика - кристаллины.

1.3. Низкомолекулярные соединения в хрусталике.

1.3.1. Антиоксиданты в хрусталике: глутатион и аскорбат.

1.3.2. Триптофан и его метаболиты.

1.3.3. Хрусталик и ультрафиолетовое (УФ) излучение.

1.3.4. Функции УФ-фильтров.

1.4. Кинуренины: фотохимические реакции.

1.4.1. Фотостабильность кинуренина и его производных.

1.4.2. Фотолиз кинуренина.

1.4.3. Тушение триплетного состояния кинуренина.

1.5. Кинуренины: термические реакции.

1.5.1. Дезаминирование и декарбоксилирование.

1.5.2. Циклизация.

1.5.3. Автоокисление 30HKN.

1.5.4. Присоединение к аминокислотным остаткам белков.

1.6. Катаракта у подопытных животных.

1.7. Постановка задачи.

Глава II. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и реактивы.

2.2. Синтезы.

2.2.1. Синтез дезаминированного кинуренина (CICA).

2.2.2. Синтез аддуктов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом.

2.3. Инкубирование.

2.3.1. Образование аддуктов.

2.3.2. Разложение аддуктов.

2.3.3. Разложение KN и 30HKN.

2.4. Выделение небелковых экстрактов из хрусталиков.

2.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

2.6. Кинетическая оптическая спектроскопия.

2.7. Определение концентрации белка в растворе с использованием метода Бредфорда.

2.8. Определение концентрации свободных тиолов с использованием реактива Эллмана.

2.9. Масс-спектрометрия.

2.10. Статистическая обработка результатов.

Глава III. Дезаминированный кинуренин и его реакции с биологическими молекулами. Стабильность аддуктов.

3.1. Введение.

3.2. рН-зависимость реакции разложения ЮЧ и ЗОНЮЧ.

3.3. Механизм дезаминирования.

3.4. Выделение продуктов термолиза КЫ.

3.5. Определение констант скорости реакций СКА с аминокислотами и антиоксидантами.

3.6. Кинетическая оптическая спектроскопия. Определение констант скорости взаимодействия СКА с глутатионом (СБН) и цистеином (СуБ).

3.7. Разложение аддуктов КК-Ьув, КИ-Ш;, КЫ-Суя, КЫ-ОБН.

3.8. Анализ кинетических зависимостей.

4.2. Синтез аддуктов КТЧ с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом.74

4.3. Модифицирование модельного белка лизоцима молекулами кинуренина.75

4.4. Масс-спектры исходного (НЕ\УЬ) и модифицированного (тНЕ\УЬ) лизоцима.76

4.5. Анализ спектров оптического поглощения и масс-спектров НЕ\УЬ и тНЕ\\гЬ.77

4.6. Фотохимия и фотофизика кинуренинов.81

4.6.1. Оптическая спектроскопия аддуктов.81

4.6.2. Ультрабыстрая динамика возбужденных состояний К1Ч-Ьу5, ЮЧ-Суэ, К^-Шэ и К>1-С8Н.83

4.6.3. Фотофизические свойства аддуктов КМ-ЬуБ, КЫ-Суэ, КМ-Шб, КИ-ОБН.86

4.6.4. Ультрабыстрая динамика возбужденного состояния mHEWL.87

4.6.5. Лазерный импульсный фотолиз mHEWL.88

4.6.6. Фотофизические и фотохимические свойства лизоцима, модифицированного кинуренином.91

4.7. Заключение.93

Глава V. Триптофан и кинуренин в хрусталиках экспериментальных животных.94

5.1. Введение.94

5.2. Небелковые экстракты из хрусталиков крыс.94

5.3. Уровень триптофана (Тгр) в хрусталиках крыс линий Вистар и OXYS.95

5.4. Уровень кинуренина (KN) в хрусталиках крыс линий Вистар и OXYS.97

5.5. Возрастная зависимость уровня Тгр и KN в хрусталиках крыс линий Вистар и OXYS.98

5.6. Заключение.100

Выводы.101

Список литературы.102

Приложение 1.118

Список используемых сокращений

АФК - активные формы кислорода

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВКСФ - времякоррелированный счет фотонов

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФ - диметилформам ид кДа - кило Дальтон

ЛИФ - лазерный импульсный фотолиз

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

УФ - ультрафиолетовый

30HCKAG - O-ß-D-гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутеновая кислота 30HKG - O-ß-D-гликозид 3-гидроксикинуренина

30HKG-GSH - глутатионовый аддукт O-ß-D-гликозида 3-гидроксикинуренина 30HKN - 3-гидроксикинуренин »

30HKN yellow - 2-карбокси-8-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин ACN - ацетонитрил

AHA - 4-(2-аминофенил)-4-оксобутановая кислота

AHBG - O-ß-D-гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутановая кислота AscAc - аскорбиновая кислота

СКА - 4-(2-аминофенил)-4-оксокротоновая (оксобутеновая) кислота

Cys - цистеин

DTT — дитиотреитол

GSH - глутатион восстановленный

GSSG - глутатион окисленный

HEWL - куриный лизоцим

His - гистидин

HQN - гидроксихинолин

IAA - йодацетамид

IDO - индолами-2,3-диоксигеназа

KN - кинуренин

KN yellow - 2-карбокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин KN-Cys - аддукт кинуренина с цистеином KN-GSH - аддукт кинуренина с глутатионом

KN-His - аддукт кинуренина с гистидином KN-Lys - аддукт кинуренина с лизином Met - метионин mHEWL - куриный лизоцим, модифицированный молекулами кинуренина

MS/MS спектр - тандемный масс-спектр

N-ас- - vV-ацетилирование

NFK - 7^-формилкинуренин

-Вое - iV-трет-бутоксикарбонилирование

Тгр - триптофан

Туг - тирозин

XAN - ксантуреновая кислота

Введение

В настоящее время потеря остроты зрения является одной из значимых проблем для населения земного шара. Наиболее распространенными заболеваниями глаза являются возрастная катаракта, глаукома и макулодистрофия сетчатки [1]. Несмотря на большой прогресс в разработке новых методов профилактики потери зрения за последнее десятилетие, эти заболевания остаются основными причинами слепоты в мире. В зоне риска находятся, в основном, пожилые люди, однако, как показывает статистика, с каждым годом увеличивается число молодых людей, страдающих от потери зрения [2]. Ранее считалось, что снижение остроты зрения - это исключительно возрастной процесс, который начинает проявляться в среднем возрасте и прогрессирует в ходе старения организма. Дополнительные факторы, такие как диабет, курение, облучение ультрафиолетом (УФ) могут значительно ускорить разрушительные процессы в глазу человека, а также повлиять на состояние организма в целом. При попадании УФ-излучения в ткани хрусталика может происходить их повреждение по различным фотохимическим механизмам. Процесс развития катаракты связан с постепенным помутнением хрусталика, что приводит к снижению остроты зрения. На сегодняшний день основными способами лечения слепоты' являются оперативная замена хрусталика на искусственный, либо нормализация глазного давления при глаукоме. Ежегодно в мире проводятся миллионы операций по улучшению зрения, но, как известно, оперативное вмешательство способно как улучшить состояние зрения, так и привести к полной его потере. В настоящее время не существует лекарства, способного полностью предотвратить образование катаракты, поэтому исследование возрастных и катарактальных изменений в составе хрусталиков является актуальной задачей, и результаты, полученные в ходе таких исследований, могут являться значительным этапом в разработке методов лечения и профилактики катаракты.

Помутнение хрусталика возникает в результате повреждения белков, составляющих хрусталик: теряется его прозрачность, образуются нерастворимые агрегаты, на которых происходит рассеивание световых лучей; при этом изображение дефокусируется. Сам хрусталик представляет собой прозрачное тело и выполняет функцию биологической линзы. Прозрачность хрусталика обусловлена отсутствием органелл в волокнистых клетках (волокнах) хрусталика. Хрусталик на 30-40 % состоит из белков [3-7], а основную массу хрусталика составляет вода. Хрусталик млекопитающих увеличивается в размерах за счет образования новых слоев ткани вокруг первоначально сформированного ядра.

В человеческих хрусталиках присутствует группа соединений с низким молекулярным весом, поглощающих большую часть УФ-облучения в диапазоне от 300 нм до 400 нм [8-11]. Эти соединения - кинуренин (КЫ), 3-гидроксикинуренин (ЗОНКЫ), 0-$-О-гликозид 3-гидроксикинуренина (ЗОНКв) и гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутановой кислоты (АНВв) - являются метаболическими продуктами аминокислоты триптофан. В человеческом хрусталике они выполняют функцию УФ-фильтров, защищая хрусталик и сетчатку от фотоиндуцированных повреждений, а также повышая зоркость за счет снижения хроматических аберраций. Предполагается, что ковалентное присоединение таких соединений к белкам хрусталика может приводить к окрашиванию белков, возникновению перекрестных связей и, в конечном итоге; к развитию катаракты. При развитой катаракте наблюдается заметное окрашивание - хрусталики становятся оранжевыми или коричневыми [12,13]. Существует предположение, что ковалентное присоединение кинуренинов к белкам может происходить по различным механизмам.

В течение долгого е^ремени кинуренины считались фотохимически инертными соединениями. Единственным исключением были фотохимические реакции Ы-формилкинуренина [14,15]. Было показано, что при фотолизе этого соединения образуется триплетная возбужденная молекула, способная реагировать непосредственно с субстратом. Кроме того, А^-формилкинуренип под УФ-излучением способствует образованию высокореакционного синглетного кислорода [10]. Флетчер с соавторами [16,17] излучали влияние свободных радикалов на процесс старения организма на примере старения хрусталика. Было показано, что окисление тканей хрусталика активными формами кислорода (АФК) может вести к развитию возрастной (сенильной) катаракты. Фотовозбуждение других кинуренинов приводит к образованию синглетного возбужденного состояния, которое релаксирует в основное в пикосекундном временном диапазоне [9]. На основе этих наблюдений были сделаны выводы, что в хрусталиках млекопитающих кинуренины не являются фотосенсибилизаторами, и поглощаемая световая энергия расходуется в процессах, не приводящих к повреждению ткани. Однако в последствии было обнаружено, что в водных растворах кинуренина под действием УФ-облучения с квантовым выходом порядка 2 % образуется короткоживущий интермедиат-триплетное возбужденное состояние ТК>1 [18]. Присутствующие в хрусталике глаза аминокислоты и антиоксиданты могут взаимодействовать с ТКЫ. Такие фотохимические реакции могут приводить как к модифицированию белков хрусталика, так и к изменению нормальной функции УФ-фильтров [19,20]. Важно отметить, что в этом случае аминокислоты могут являться потенциальными мишенями для фотоокисления.

Другим возможным каналом модифицирования белков хрусталика является термическое разложение кинуренинов. Ранее было показано, что кинуренины способны претерпевать реакцию спонтанного дезаминирования с образованием ненасыщенных соединений, обладающих высокой реакционной способность [21,22]. В результате последующих реакций может произойти ковалентное присоединение таких молекул к белкам хрусталика, что приводит к необратимым изменениям в тканях, и может явиться причиной образования катаракты. В настоящее время в литературе представлено недостаточное количество данных для детального описания механизмов таких реакций. Стоит отметить, что большинство исследований заболеваний органов зрения проводится в медицинских учреждениях, а результаты носят, прежде всего, качественный характер. Создание моделей, максимально приближенно описывающих процессы, которые могут происходить при развитии катаракты, позволит разработать новые методы ингибирования вредоносных реакций в тканях хрусталика. Таким образом, исследования термических реакций с участием дезаминированных кинуренинов в хрусталике глаза являются актуальной задачей на сегодняшний день. Сравнение уровня УФ-фильтров в хрусталиках с различной степенью катаракты позволит определить связь этих соединений с развитием патологии. Результаты таких исследований могут внести вклад в понимание процессов, происходящих в хрусталике с возрастом, а также в ходе развития катаракты.

Настоящая работа посвящена исследованию реакций дезаминированного кинуренина с биологически важными молекулами при физиологических условиях, установлению уровня УФ-фильтров в хрусталиках подопытных животных. Исследования были проведены с использованием метода ВЭЖХ, кинетической оптической спектроскопии, а также масс-спектрометрическими методами.

Целями данной работы является:

1) Разработка методик синтеза и выделения дезаминированного кинуренина и его аддуктов с аминокислотами и антиоксидантами, входящими в состав хрусталика; анализ стабильности синтезированных аддуктов;

2) установление детального механизма дезаминирования кинуренинов при различных значениях рН среды;

3) разработка методики модифицирования модельного белка молекулами кинуренина, определение положения модифицирования, анализ фотофизических свойств кинуренина, присоединенного к аминокислотам и модельному белку;

4) развитие физико-химических методов для определения уровня триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных в зависимости от возраста и степени развития катаракты.

Настоящая диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы.

Выводы

1. Синтезированы производные кинуренина - дезаминированный кинуренин (СКА), аддукты дезаминированного кинуренина с аминокислотами лизином, гистидином, цистеином и антиоксидантом глутатионом; проведено модифицирование модельного белка лизоцима молекулами кинуренина.

2. Предложен механизм дезаминирования кинуренинов в зависимости от кислотности среды. В щелочных растворах отщепление аминогруппы осуществляется под действием сильного основания - гидроксильных ионов с образование енолят-аниона кинуренинов. В кислых растворах элиминирование аминогруппы происходит под действием молекул воды - слабого основания; как следствие, в кислых растворах скорость дезаминирования уменьшается.

3. Измерены константы скорости присоединения СКА к аминокислотам лизину, гистидину, цистеину и антиоксиданту глутатиону. Установлено, что наиболее высокая константа скорости наблюдается для реакции с цистеином и глутатионом, в то время как для остальных соединений константа скорости реакции на несколько порядков ниже. Таким образом, наиболее уязвимым для присоединения дезаминированных УФ-фильтров является цистеиновый аминокислотный остаток в составе белков, а защитную функцию может выполнять глутатион.

4. Исследованы реакции разложения аддуктов дезаминированного кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами. Установлено, что наиболее стабильными аддуктами кинуренина являются аддукты с лизином и гистидином. Установлено, что квантовый выход и время жизни флуоресценции для аддуктов имеют более высокие значения, что связано с наличием заместителя в боковой цепочке кинуренина.

5. Показано, что модифицирование модельного белка лизоцима молекулами дезаминированного кинуренина происходит по лизиновым аминокислотным остаткам в составе белка. В молекуле кинуренина, ковалентно связанной с белком, наблюдается значительное увеличение квантового выхода и времени жизни флуоресценции, а также квантового выхода триплетного состояния по сравнению со свободным кинуренином.

6. Определен уровень триптофана и кинуренина в хрусталиках крыс Вистар и ОХУ5 различных возрастов. Наибольшие различия содержания Тгр и КМ наблюдаются в первые три недели жизни животных, тогда как уже к четвертой неделе межлинейные различия становятся незначительными. Таким образом, изменения в кинурениновом пути превращений триптофана в хрусталике могут являться индикатором окислительного стресса организма, приводящего к развитию катаракты.

5.6 Заключение

Представленные результаты свидетельствуют о том, что на стадии формирования катаракты, когда помутнение хрусталика становится заметным, разница в содержании триптофана и кинуренина у крыс линий Вистар и ОХУ8 незначительна. Стоит отметить, что в первые три недели жизни животных разница в содержании этих компонентов достаточно велика. Полученные данные свидетельствуют о том, что окислительный стресс организма, приводящий к развитию катаракты, влияет на концентрацию кинуренина и триптофана в хрусталиках крыс. Таким образом, различие в уровнях этих соединений в хрусталике может являться индикатором окислительного стресса организма.

1. Foster, A., Gilbert, С., Johnson, G. Changing patterns in global blindness: 1998-2008 // Community eye health. 2008. 21. 37-39.

2. Brian, G., Taylor, H. Cataract blindness-challenges for the 21st century // Bull. World Health Organ. 2001. 79. 249-256.

3. Wood, A.M., Truscott, R.J.W. Ultraviolet filter compounds in human lenses: 3-hydroxykynurenine glucoside formation// Vis. Res. 1994. 34. 1369-1374.

4. Bova, L.M., Wood, A.M., Jamie, J.F., Truscott, R.J.W. UV filter compounds in human lenses: the origin of 4—(2-amino-3-hydroxyphcnyl)^l—oxobutanoic acid O-beta-D-glucoside // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999. 40. 3237-3244.

5. Bova, L.M., Sweeney, M.H., Jamie, J.F., Truscott, R.J.W. Major changes in human ocular UV protection with age II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. 42. 200-205.

6. Fagerholm, P.P., Philipson, B.T., Lindstrom, B. Normal human lens the distribution of protein II Exp. Eye Res. 1981. 33. 615-620.

7. Bodurka, J., Buntkowsky, G., Olechnowicz, R., Gutsze, A., Limbah, H. Investigation of water in normal and dehydrated rabbit lenses by 1H NMR and calorimetric measurements // Colloids Surf. A. Physicochem. Eng. Asp. 1996. 115. 55-62.

8. Taylor, L.M., Aquilina, J.A., Willis, R.H., Jamie, J.F., Truscott, R.J. Identification of a new human lens UV filter compound IIFEBS Lett. 2001. 509. 6-10.

9. Dillon, J., Atherton, S.J. Time resolved spectroscopic studies of the intact human lenses // Photochem. Photobiol. 1990. 51. 465-468.

10. Dillon, J., Wang, R.H., Atherton, S.J. Photochemical and photophysical studies on human lens constituents // Photochem. Photobiol. 1990. 52. 849-854.

11. Pileni, M.P., Walrant, P., Santus, R. On a possible excited state proton transfer in N-formylkynurenine derivatives // Chem. Phys. Lett. 1976. 42. 89-92.

12. Pileni, M.P., Santus, R., Land, E.J. On the photosensitizing properties of N formylkynurenine and related compounds // Photochem. Photobiol. 1978. 28. 525-529.

13. Fletcher, A.E. Free radicals, antioxidants and eye diseases: evidence from epidemiological studies on cataract and age-related macular degeneration // Ophthalmic Res. 2010. 44. 191-198.

14. Tsentalovich, Y.P., Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Forbes, M.D. Photochemistry of kynurenine, a tryptophan metabolite: properties of the triplet state // J. Phys. Chem. A. 2005. 109. 3565-3568.

15. Dillon, J. The photochemistry of lens protein // Lens Res. 1983. 1. 133-145.

16. Dillon, J. Photolytic changes in lens proteins // Curr. Eye Res. 1984. 3. 145-150.

17. Taylor, L.M., Aquilina, J.A., Jamie, J.F., Truscott, R.J.W. UV filter instability: consequences for the human lens // Exp. Eye Res. 2002. 75. 165-175.

18. Tsentalovich, Yu.P., Snytnikova, O.A., Forbes, M.D.E., Chernyak, E.I., Morozov, S.V. Photochemical and thermal reactivity of kynurenine // Exp. Eye Res. 2006. 83. 14391445.

19. Berman, E.R. Gross anatomy and structure of the eye lens // Biochemistry of.the eye. New York: Plenum press. 1991. 201-211.

20. Bernal, A., Parel, J.M., Manns, F. Evidence for posterior zonular fiber attachment on the anterior hyaloid membrane II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. 47. 4708-4713.

21. Harding, J.J. Cataract Biochemistry, Epidemiology and Pharmacology. London: Chapman and Hall. 1991. 233-235.

22. Bron, A.J., Vrensen, G.F., Koretz, J., Maraini, G., Harding, J.J. The ageing lens // Ophthalmologica. 2000. 214. 86-104.

23. Dillon, J. The photophysics and photobiology of the eye // J. Photochem. Photobiol. B. 1991. 10. 23-40.

24. Gaillard, E.R., Zheng, L., Merriam, J.C., Dillon, J. Age-related changes in the absorption characteristics of the primate lens II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. 41. 1454-1459.

25. Harrington, V., Srivastava, O.P., Kirk, M. Proteomic analysis of water insoluble proteins from normal and cataractous human lenses II Mol. Vis. 2007. 13. 1680-1694.

26. Hecht, E. Optics, 2nd ed. San Francisco: Addison Wesley. 1987. 178. ISBN 0-201-11609-X.

27. Pierscionek, B.K., Belaidi, A., Bruun, H.H. Refractive index distribution in the porcine eye lens for 532 nm and 633 nm light // Eye (Lond). 2005. 19. 375-381.

28. Groenen, P.J.T.A., Merck, K.B., de Jong, W.W., Bloemendal, H. Structure and modifications of the junior chaperone a-crystallin // Eur. J. Biochem. 1994. 225. 1-19.

29. Han, J., Schey, K. MALDI tissue imaging of ocular lens a-crystallin II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. 47. 2990-1996.

30. Vermorken, A.J., Hilderink, J.M., van de Ven, W.J., Bloemendal, H. Lens differentiation. Crystallin synthesis in isolated epithelia from calf lenses II J. Cell Biol. 1978. 76. 175183.

31. Harding, J.J., Dilley, K.J. Structural proteins of the mammalian lens: a review with emphasis on changes in development, aging and cataract // Exp. Eye Res. 1976. 22. 1-73.

32. Horwitz. J. Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89. 10449-10453.

33. Horwitz, J. Alpha-crystallin II Exp. Eye Res. 2003. 76. 145-153.

34. Bloemendal, H., de Jong, W., Jaenicke, R., Lubsen, N.H., Slingsby, C., Tardieu, A. Ageing and vision: structure, stability and function of lens crystallins // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004. 86. 407-485.

35. Bloemendal, H., de Jong, W.W. Lens proteins and their genes // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. 41. 259-281.

36. Sharma, K.K., Santhoshkumar, P. Lens aging: Effects of crystallins // Biochim. Biophys. Acta. 2009. 1790. 1095-1108.

37. Ma, Z.X., Hanson, S.R.A., Lampi, K.J., David, L.L., Smith, D.L., Smith, J.B. Age-related changes in human lens ciystallins identified by HPLC and mass spectrometry // Exp. Eye Res. 1998.67.21-30.

38. Srinivasan, A.N., Nagineni, C.N., Bhat, S.P. Alpha A-crystallin is expressed in non-ocular tissues II J. Biol. Chem. 1992. 267. 23337-23341.

39. Iwaki, T., Kume-Iwaki, A., Goldman, J.E. Cellular distribution of alpha B-crystallin in non-lenticular tissues II J. Histochem. Cytochem. 1990. 38. 31-39.

40. Aarts, H.J., Lubsen, N.H., Schoenmakers, J.G.G. Crystallin gene expression during rat lens development // Eur. J. Biochem. 1989. 183.31-36.

41. Ueda, Y., Duncan, M.K., David, L.L. Lens proteomics: the accumulation of crystalline modifications in the mouse lens with age // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. 43. 205215.

42. Lampi, K.J., Ma, Z., Shih, M., Shearer, T.R., Smith, J.B., Smith, D.L., David, L.L. Sequence analysis of pA3, PB3 and pA4 crystallins completes the identification of the major proteins in young human lens II J. Biol. Chem. 1997. 272. 2268-2275.

43. Berbers, G.A.M., Hoekman, W.A., Bloemendal, H., de Jomg, W.W., Kleinschmidt, T., Braunitzer, G. Homology between the primary structures of the major bovine P-crystallin chains II Eur. J. Biochem. 1984. 139. 467-479.

44. Siezen, R.J., Anello, R.D., Thomson, J.A. Interactions of lens proteins. Concentration dependence of beta-crystallin aggregation // Exp. Eye Res. 1986. 43. 293-303.

45. Lampi, K.J., Shih, M., Ueda, Y., Shearer, T.R., David, L.L. Lens proteomics: analysis of rat crystalline sequences and two-dimensional electrophoresis map II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. 43. 216-224.

46. Voorter, C.E., De Haard-Hoekman, W.A., Hermans, M.M., Bloemendal, H., de Jong, W.W. Differential synthesis of crystallins in the developing rat eye lens // Exp. Eye Res. 1990. 50.429-437.

47. Harding, J.J. Biochemistry of the eye. London: Chapman and Hall. 1997. 94-134.

48. Peek, R., Kraft, H.J., Klok, E.J., Lubsen, N.H., Schoenmakers, J.G. Activation and repression sequences determine the lens-specific expression of the rat gamma D-crystallin gene // Nucleic Acids Res. 1992. 20. 4865-4871.

49. Peek, R., McAvoy, J.W., Lubsen, N.H., Schoenmakers, J.G. Rise and fall of crystallin gene messenger levels during fibroblast growth factor induced terminal differentiation of lens cells // Dev. Biol. 1992. 152. 152-160.

50. Wang, X., Garcia, C.M., Shui Y.B., Beebe, D.C. Expression and regulation of alpha-, beta-, and gamma-crystallins in mammalian lens epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. 45. 3608-3619.

51. Xi, J., Farjo, R., Yoshida, S., Kern, T.S., Swaroop, A., Andley, U.P. A comprehensive analysis of the expression of crystallins in mouse retina // Mol Vis. 2003. 9. 410-419.

52. Huang, Q., Ding, L., Phan, K.B., Cheng, C., Xia, C., Gong, X., Horwitz, J. Mechanism of cataract formation in aA-crystallin Y118D mutation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009. 50. 2919-2926.

53. Andley, U.P., Mathur, S., Griest, T.A., Petrash, J.M. Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alpha A-crystallin II J. Biol. Chem. 1996. 271. 31973-31980.

54. Bova, M.P., Ding, L.L., Horwitz, J., Fung, B.K.K. Subunit exchange of alpha A-crystallin II J. Biol. Chem. 1997. 272. 29511-29517.

55. Horwitz, J., Huang, Q.L., Ding, L., Bova, M.P. Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties // Methods Enzymol. 1998. 290. 365-383.

56. Lee, G.J., Vierling, E. A small heat shock protein cooperates with heat shock protein 70 systems to reactivate a heat-denatured protein // Plant Physiol. 2000. 122. 189-198.

57. Giblin, F.J., McCready, J.P., Reddan, J.R., Dziedzic, D.C., Reddy, V.N. Detoxification of H2O2 by cultured rabbit lens epithelial cells: participation of the glutathione redox cycle // Exp. Eye Res. 1985. 40. 827-840.

58. Giblin, F.J. Glutathione: a vital lens antioxidant // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. 16. 121-135.

59. Rathbun, W.B., Bovis, M.G., Holleschau, A.M. Species survey of glutathione peroxidase and glutathione reductase: search for an animal model of the human lens // Ophthalmic Res. 1986. 18. 282-287.

60. Harding, J.J. Free and protein-bound glutathione in normal and cataractous human lenses // Biochem. J. 1970. 117. 957-960.

61. Rathbun, W.B., Murray, D.L. Age-related cysteine uptake as rate-limiting in glutathione synthesis and glutathione half-life in the cultured human lens // Exp. Eye Res. 1991. 53. 205-212.

62. Pau, H., Graf, P., Sies, H. Glutathione levels in human lens: regional distribution in different forms of cataract // Exp. Eye Res. 1990. 50. 17-20.

63. Reddy, V.N., Giblin, F.J. Metabolism and function of glutathione in the lens // Ciba Found Symp. 1984. 106. 65-87.

64. Goodenough, D.A. The crystalline lens. A system networked by gap junctional intercellular communication // Semin Cell Biol. 1992. 3. 49-58.

65. Reim, M., Heuvels, В., Cattepoel, H. Glutathione peroxidase in some ocular tissues // Ophth. Res. 1974. 6. 228-234.

66. Heath, H: The distribution and possible functions of ascorbic acid in the eye // Exp. Eye Res. 1962. 1. 362-367.

67. Varma, S.D., Ets, Т.К., Richards, R.D. Protection against superoxide radicals in rat lens // Ophthalmic Res. 1977. 9. 421-431.

68. Снытникова, O.A., Шерин, П.С., Копылова, JI.B., Центалович, Ю.П. Кинетика и механизм реакций фотовозбужденного кинуренина с молекулами биологических соединений II Изв. АН. Сер. хим. 2007. 4. 704-710.

69. Andersson, М., Grankvist, A. Ascorbate-induced free radical toxicity to isolated islet cells Hint. J. Biochem. Cell. Biol. 1995. 27. 493-498.

70. Garland, D. Role of site-specific, metal-catalyzed oxidation in lens aging and cataract: a hypothesis II Exp. Eye Res. 1990. 50. 677-682.

71. Garland, D., Zigler, J.S.Jr., Kinoshita, J. Structural changes in bovine lens crystallins induced by ascorbate, metal, and oxygen // Arch. Biochem. Biophys. 1986. 251. 771-776.

72. Yeum, K.J., Taylor, A., Tang, G., Russell, R.M. Measurement of carotenoids, retinoids, and tocopherols in human lenses // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. 36. 2756-2761.

73. Dickerson, J.E. Jr., Lou, M.F. Free Cysteine Levels in Normal Human Lenses // Exp. Eye Res. 1997. 65.451-454.

74. Choy, C.K., Cho, P., Chung, W.Y., Benzie, I.F. Water-soluble antioxidants in human tears: effect of the collection method // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. 42. 31303134.

75. Johnson, H.E., Crosby, D.G. Indole-3-acetic Acid II Org. Synth. 1973. 5. 654.

76. Truscott, R.J., Augusteyn, R.C. Oxidative changes in human lens proteins during senile nuclear cataract formation // Biochim. Biophys. Acta. 1977. 492. 43-52.

77. Wood, A.M., Truscott, R.J.W. UV filters in human lenses: tryptophan catabolism // Exp. Eye Res. 1993.56.317-325.

78. Cooper, G.F., Robson, J.G. The yellow colour of the lens of man and other primates // J. Physiol. 1969. 203. 411-417.

79. Snytnikova, O.A., Sherin, P.S., Tsentalovich, Y.P. Biphotonic ionization ofkynurenine and 3-hydroxykynurenine // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2007. 186. 364-368.

80. Bando, M., Nakajima, A., and Satoh, K. Spectrophotometric estimation of 3-OH L-Kynurenine O-beta-Glucoside in the human lens // J. Biochem. (Tokyo). 1981. 89. 103109.

81. Nemeth, H., Toldi, J., Vecsei, L. Role of kynurenines in the central and peripheral nervous systems // Curr. Neurovasc. Res. 2005. 2. 249-260.

82. Lapin, I.P. Depressor effect ofkynurenine and its metabolites in rats II Life Sci. 1976. 19. 1479-1484.

83. Lapin, I.P. Kynurenines and seizures // Epilepsia. 1981. 22. 257-265.

84. Eastman, C.L., Guilarte, T.R. Cytotoxicity of 3-hydroxykynurenine in a neuronal hybrid cell line //Brain Res. 1989. 495. 225-231.

85. Moroni, F. Tryptophan metabolism and brain function: focus on kynurenine and other indole metabolites // Eur. J. Pharm. 1999. 375. 87-100.

86. Takikawa, O., Littlejohn, T.K., Truscott, R.J. Indoleamine 2,3-dioxygenase in the human lens, the first enzyme in the synthesis of UV filters // Exp. Eye Res. 2001. 72. 271-277.

87. Shirao, Y., Shirao, E., Iwase, T,, Inoue, A., Matsukawa, S. Comparison of non-tryptophan fluorophores in protein-free extract of brunescent and non-brunescent human cataract // Jpn. J. Ophthalmol. 2000. 44. 198-204.

88. Malina, H.Z., Martin, X.D. Deamination of 3-hydroxykynurenine in bovine lenses: a possible mechanism of cataract formation in general // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1995. 233. 38-44.

89. Malina, H.Z., Martin, X.D. Xanthurenic acid derivative formation in the lens is responsible for senile cataract in humans // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1996. 234. 723-730.

90. O'Sullivan, W.J., Smithers, G.W. Stability constants for biologically important metal-ligand complexes // Methods Enzymol. 1979. 63. 294-336.

91. Hains, P.G., Gao, L., Truscott, R.J. The photosensitiser xanthurenic acid is not present in normal human lenses // Exp. Eye Res. 2003. 77. 547-553.

92. Dilley, B.L. Sources and measurement of ultraviolet irradiation // Methods. 2002. 28. 413.

93. Balasubramanian, D. Ultraviolet radiation and cataract // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. 16. 285-297.

94. Taylor, H.R., West, S.K., Rosenthal, F.S., Muñoz, B., Newland, H.S., Abbey, H„ Emmett, E.A. Effect of ultraviolet radiation on cataract formation // N. Engl. J. Med. 1988. 319.1429-1433.

95. Coliman, G.W., Shore, D.L., Shy, C.M., Checkoway, H., Luria, A.S. Sunlight and other risk factors for cataracts: an epidemiologic study // Am. J. Public. Health. 1988. 78. 1459-1462.

96. West, S.K., Duncan, D.D., Muñoz, B., Rubin, G.S., Fried, L.P., Bandeen-Roche, K., Schein, O.D. Sunlight exposure and risk of lens opacities in a population-based study: the Salisbury Eye Evaluation project // JAMA. 1998. 280. 714-718.

97. Neale, R.E., Purdie, J.L., Hirst, L.W., Green, A.C. Sun exposure as a risk factor for nuclear cataract // Epidemiology. 2003, 14, 707-712.

98. Ortwerth, B.J., Chemoganskiy, V., Olesen, P.R. Studies on singlet oxygen formation and UVA light-mediated photobleaching of the yellow chromophores in human lenses // Exp. Eye Res. 2002. 74. 217-229.

99. Dillon, J., Skonieczna, M., Mandal, K., Paik, D.C. The photochemical attachment of the o-glucoside of 3-hydroxykynurenine to alpha-crystallin: a model for lenticular aging // Photochem. Photobiol. 1999. 69. 248-253.

100. Krishna, C.M., Uppuluri, S., Riesz, P., Zigler Jr, J.S., Balasubramanian, D. A study of the photodynamic efficiencies of some eye lens constituents // Photochem. Photobiol. 1991. 54.51-58.

101. Collier, R., Zigman, S. The gray squirrel lens protects the retina from near-UV radiation damage II Prog. Clin. Biol. Res. 1987. 247. 571-585.

102. Walrant, P., Santus, R., Grossweiner, L.I. Photosensitizing properties of N-formylkynurenine // Photochem. Photobiol. 1975. 22. 63-65.

103. Reszka, K.J., Bilski, P., Chignell, C.F., Dillon, J. Free radical reactions photosensitized by the human lens component, kynurenine: an EPR and spin trapping investigation // Free Radie. Biol. Med. 1996. 20. 23-34.

104. Sherin, P.S., Tsentalovich, Y.P., Snytnikova, O.A., Sagdeev, R.Z. Photoactivity of kynurenine-derived UV filters// J. Photochem. Photobiol. B. 2008. 93. 127-132.

105. Buxton, G.V., Greenstock, C., Helman, W.P., Ross, A.B. Critical review of rate constants for reaction of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals in aqueous solution II J. Phys. Chem. Ref. Dat. 1988. 17. 513-886.

106. Kasama, K., Takematsu, A., Arai, S. Photochemical reactions of triplet acetone with indole, purine, and pyrimidine derivatives H J. Phys. Chem. 1982. 86. 2420-2427.

107. McNulty, R., Wang, H., Mathias, R.T., Ortwerth, B.J., Truscott, R.J.W., Bassnett, S. Regulation of tissue oxygen levels in the mammalian lens // J. Physiol. 2004. 559. 883898.

108. Tokuyama, T., Senoh, S., Sakan, T., Brown Jr., K.S., Witkop, B. The photoreduction of kynurenic acid to kynurenine yellow and the occurrence of 3-hydroxy-L-kynurenine in butterflies// J. Am. Chem. Soc. 1967. 89. 1017-1021.

109. Taylor, L.M., Aquilina J,A., Jamie, J.F., Truscott, R.J. Glutathione and NADH, but not ascorbate, protect lens proteins from modification by UV filters If Exp. Eye Res. 2002. 74. 503-511.

110. Tokuyama, T., Senoh, S., Hirose, Y., Sakan, T. Kynurenine yellow // J. Chem. Soc. Jpn. 1958. 79. 752-761.

111. Mizdrak, J., Hains, P.G., Kalinowski, D., Truscott, R.L.W., Davies, M.J., Jamie, J.F. Novel human lens metabolites from normal and cataractous human lenses // Tetrahedron. 2007. 63. 4990-4999.

112. Roberts, J.E., Wishart, J.F., Martinez, L., Chignell, C.F. Photochemical studies on xanthurenic acid II Photochem. Photobiol. 2000. 72. 467-471.

113. Roberts, J.F., Finley, E.L., Patat, S.A., Schey, K.L. Photo-oxidation of lens protein with xanthurenic acid: a putative chromophore for cataractogenesis II Photochem. Photobiol. 2001. 74. 740-744.

114. Yanshole, V.V., Sherin, P.S., Gritsan, N.P., Snytnikova, O.A., Mamatyuk, V.I., Grilj, J., Vauthey, E., Sagdeev, R.Z., Tsentalovich, Y.P. Photoinduced tautomeric transformations of xanthurenic acid II Phys. Chem. Chem. Phys. 2010. 12. 9502-9515.

115. Okuda, S., Nishiyama, N., Saito, H., Katsuki, H. Hydrogen peroxide-mediated neuronal cell death induced by an endogenous neurotoxin, 3-hydroxykynurenine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93. 12553-12558.

116. Chiarugi, A., Rapizzi, E., Moroni, F., Moroni, F. The kynurenine metabolic pathway in the eye: studies on 3-hydroxykynurenine, a putative cataractogenic compound // FEBS Lett. 1999. 453. 197-200.

117. Vazquez, S., Garner, B., Sheil, M.M., Truscott, R.J.W. Characterization of the major autoxidation products of 3-hydroxykynurenine under physiological conditions // Free Radic. Res. 2000. 32. 11-23.

118. Stutchbury, G.M., Truscott, R.J.W. The modification of proteins by 3-hydroxykynurenine // Exp. Eye Res. 1993. 57. 149-155.

119. Aquilina, J.A., Truscott, R.J.W. Cysteine is the initial site of modification of alpha-crystallin by kynurenine // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 276. 216-223.

120. Malina, H.Z. Xanthurenic acid provokes formation of unfolded proteins in endoplasmic reticulum of the lens epithelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. 265. 600605.

121. Eastman, C.L., Guilarte, T.R. The role of hydrogen peroxide in the in vitro cytotoxicity of 3-hydroxykynurenine H Neurochem. Res. 1990. 15. 1101-1107.

122. Ogawa, T., Matson, W.R., Beal, M.F., Myers, R.H., Bird, E.D., Milbury, P., Saso, S. Kynurenine pathway abnormalities in Parkinson's disease // Neurology. 1992. 42. 17021706.

123. Reynolds, G.P., Pearson, S.J. Increased brain 3-hydroxykynurenine in Huntington's disease II Lancet ii. 1989. 334. 979-980.

124. Pearson, S.J., Reynolds, G.P. Increased concentrations of a neurotoxin, 3-hydroxykynurenine, in Huntington's disease // Neurosci. Lett. 1992. 144. 199-201.

125. Sardar, A.M., Bell, J.E., Reynolds, G.P. Increased concentrations of the neurotoxin 3-hydroxykynurenine in the frontal cortex of HIV-1-positive patients // J. Neurochem. 1995. 64. 932-935.

126. Vazquez, S., Aquilina, J.A., Jamie, J.F., Sheil, M.M., Truscott, R.J.W. Novel protein modification by kynurenine in human lenses II J. Biol. Chem. 2002. 277. 4867-4873.

127. Hood, B.D., Garner, B., Truscott, R.J.W. Human lens coloration and aging. Evidence for crystallin modification by the major ultraviolet filter, 3-hydroxykynurenine glucoside II J. Biol. Chem. 1999. 276. 32547-32550.

128. Lerman, S., Borkman, R. Spectroscopic evaluation and classification of the normal, aging and cataractous lens // Ophthalmic Res. 1976. 8. 335-353.

129. Parker, N.R., Korlimbinis, A., Jamie, J.F., Davies, M.J., Truscott, R.J.W. Reversible binding of kynurenine to lens proteins: potential protection by glutathione in young lenses //Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. 48. 3705-3713.

130. Snytnikova, O.A., Fursova, A.Zh., Chernyak, E.I., Vasiliev, V.G., Morozov, S.V., Kolosova, N.G., Tsentalovich, Y.P. Deaminated UV filter 3-hydroxykynurenine O-beta-D-glucoside is found in cataractous human lenses // Exp. Eye Res. 2008. 86. 951-956.

131. Aquilina, J.A., Truscott, R.J. Identifying sites of attachment of UV filters to proteins in older human lenses //Biochim. Biophys. Acta. 2002. 1596. 6-15.

132. Korlimbinis, A., Truscott, R.J.W. Identification of 3-hydroxykynurenine bound to protein in the human lens. A possible role in age-related nuclear cataract // Biochemistry. 2006. 45.1950-1960.

133. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. Free radicals in biology and medicine / Eds. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. UK: Oxford University Press. 1989. 284-330.

134. Moffat, B.A., Landman, K.A., Truscott, R.J.W., Sweeney, M.H.J., Pope, J.M. Age related changes in the kinetics of water transport in normal human lenses // Exp. Eye Res. 1999. 69. 663-669.

135. Sweeney, M.H., Truscott, R.J.W. An impediment to glutathione diffusion in older normal human lenses: a possible precondition for nuclear cataract // Exp. Eye Res. 1998. 67. 587-595.

136. Butenandt, A., Schafer, W. Ommochromes / Recent progress in the chemistry of natural and synthetic colouring matters and related fields; edited by Gore T.S.; Joshi B.S.; Sunthaukar S.V.; Tilak, B.D.; New York: Academic Press, 1962. 13-33.

137. Shang, F., Nowell, T.Jr., Gong, X., Smith, D.E., Dallal, G.E., Khu, P., Taylor, A. Sex-linked differences in cataract progression in Emory mice // Exp. Eye Res. 2002. 5. 109111.

138. Nishimoto, H., Uga, S., Miyata, M., Ishikawa, S., Yamashita, K. Morphological study of the cataractous lens of the senescence-accelerated mouse // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1993.231.722-728.

139. Noriaki, N., Noriko, Т., Akira, K., Yoshimasa, I. Involvement of DNase II-Like Acid DNase in the Cataract Formation of the UPL Rat and the Shumiya Cataract Rat // Biol. Pharm. Bull. 2006. 29. 2367-2371.

140. Solov'eva, N.A., Morozkova, T.S., Salganik, R.I. Development of a rat subline with symptoms of hereditary galactosemia and study of its biochemical characteristics // Genetika. 1975. 11 .63-71.

141. Непомнящих, JI.M., Семёнов, Д.Е., Соловьёва, H.A., Салганик, Р.И. Клеточные механизмы генетически детерминированной гипертрофической кардиомиопатии у крыс линии W/SSM // Бюл.Экспер. Биол. 1994. 118. 547-551.

142. Kolosova, N.G., Lebedev, P.A., Aidagulova, S.V., Morozkova, T.S. OXYS rats as a model of senile cataract // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. 137. 249-251.

143. Kolosova, N.G., Lebedev, P.A., Fursova, A.Zh., Morozkova, T.S., Gusarevich, O.G. Prematurely aging OXYS rats as an animal model of senile cataract in human // Adv. Gerontol. 2003. 12. 143-148.

144. Marsili, S., Salganik, R.I., Albright, C.D., Freel, C.D., Johnsen, S., Peiffer, R.L., Costello, M. Cataract formation in a strain of rats selected for high oxidative stress // Exp. Eye Res. 2004. 79. 595-612.

145. Rumyantseva, Yu.V., Fursova, A.Zh., Fedoseeva, L.A., Kolosova, N.G. Changes in physicochemical parameters and a-crystallin expression in the lens during cataract development in OXYS rats II Biochemistry (Moscow). 2008. 73. 1467-1475.

146. Kolosova, N.G., Lebedev, P.A., Dikalova, A.E. Comparison of antioxidants in the ability to prevent cataract in prematurely aging OXYS rats // Bull. Exp. Biol. Med. 2004. 139. 397-399.

147. Raju, T.N., Kanth, V.R., Reddy, P.U.M. Influence of kynurenines in pathogenesis of cataract formation in tryptophan-deficient regimen in Wistar rats // Indian J. Exp. Biol. 2007. 45.543-548.

148. Zarnowski, T., Rejdak, R., Zielinska-Rzecka, E., Zrenner, E., Grieb, P., Zagorski, Z., Junemann, A., Turski, W.A. Elevated concentrations of kynurenic acid, a tryptophan derivative, in dense nuclear cataracts // Curr. Eye Res. 2007. 32. 27-32.

149. Sakthivel, M., Elanchezhian, R., Thomas, P.A., Geraldine, P. Alterations in lenticular proteins during ageing and selenite-induced cataractogenesis in Wistar rats // Mol. Vis. 2010. 16. 445-453.

150. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 72. 248-254.

151. Riddles, P.W., Blakeley, R.L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)—a reexamination // Anal. Biochem. 1979. 94. 75-81.

152. Riddles, P.W., Blakeley, R.L., Zerner, B. Reassessment of Ellman's reagent I I Methods Enzymol. 1983. 91. 49-60.

153. Riener, C.K., Kada, G., Gruber, H.J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine // Anal. Bioanal. Chem. 2002. 373. 266276.

154. Garner, B., Vazquez, S., Griffith, R., Lindner, R.A., Carver, J.A., Truscott, R.J.W. Identification of glutathionyI-3-hydroxykynurenine glucoside as a novel fluorophore associated with aging of the human lens II J. Biol. Chem. 1999. 274. 20847-20854.

155. Aquilina, J.A., Truscott, R.J.W. Kynurenine binds to the peptide binding region of the chaperone ap-crystallin II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 285. 1107-1113.

156. Aquilina, J.A., Carver, J.A., Truscott, R.J.W. Oxidation products of 3-hydroxykynurenine bind to lens proteins: relevance for nuclear cataract // Exp. Eye Res. 1997. 64. 727-735.

157. Ervin, L.A., Dillon, J., Gaillard, E.R. Photochemically modified a-crystallin: a model system for aging in the primate lens // Photochem. Photobiol. 2001. 73. 685-691.

158. Ellman, G.L. Tissue sulfhydryl groups II Arch. Biochem. Biophys. 1959. 82. 70-77.

159. Vazquez, S., Parker. N.R., Sheil, M.M., Truscott, R.J.W. Protein-bound kynurenine decreases -with the progression of age-related nuclear cataract // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. 45. 879-883.

160. Korlimbinis, A., Aquilina, J.A., Truscott, R.J.W. Protein-bound and free UV filters in cataract lenses. The concentration of UV filters is much lower than in normal lenses // Exp. Eye Res. 2007. 85. 219-225.

161. Sherin, P.S., Grilj, J., Tsentalovich, Y.P., Vauthey, E. Ultrafast excited-state dynamics of kynurenine, a UV filter of the human eye II J. Phys. Chem. B. 2009. 113. 4953-4962.

162. Lang, B., Angulo, G., Vauthey, E. Ultrafast solvation dynamics of coumarin 153 in imidazolium-based ionic liquids II J. Chem. Phys. A. 2006. 110. 7028-7034.

163. Furstenberg, A., Vauthey, E. Ultrafast excited-state dynamics of oxazole yellow DNA intercalators// J. Phys. Chem. B. 2007. 111. 12610-12620.

164. Jarzeba, W., Walker, G.C., Johnson, A.E., Kahlow, M.A., Barbara, P.F. Femtosecond microscopic solvation dynamics of aqueous solutions // J. Phys. Chem. 1988. 92. 70397041.

165. Jimenez, R., Fleming, G.R., Kumar, P.V., Maroncelli, M. Femtosecond solvation dynamics of water II Nature. 1994. 369. 471-473.

166. Bent, D.V., Hayon, E. Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. III. Tryptophan II J. Am. Chem. Soc. 1975. 97. 2612-2619.

167. Bryant, F.D., Santus, R., Grossweiner, L.I. Laser flash photolysis of aqueous tryptophan HJ.Phys. Chem. 1975. 79. 2711-2716.

168. Baugher, J.F., Grossweiner, L.I. Photolysis mechanism of aqueous tryptophan // J. Phys. Chem. 1977. 81. 1349-1354.

169. Redpath, J.L., Santus, R., Ovadia, J., Grossweiner, L.I. The role of metal ions in theradiosensitivity of metalloproteins. Model experiments with bovine carbonic anhydrase II Int. J. Radiant. Biol. 1975. 28. 243-253.

170. Posener, M.L., Adams, G.E., Wardman, P., Cundall, R.B. Mechanism of tryptophan oxidation by some inorganic radical-anions: a pulse radiolysis study. // J. Chem. Soc., Faraday Trans. II. 1976. 72. 2231-2239.

171. Volkert, W.A., Kuntz, R.R., Ghiron, C.A., Evans, R.F. Flash photolysis of tryptophan and Nacetyl-L-tryptophanamide; the effect of bromide on transient yields // Photochem. Photobiol. 1977.26.3-9.

172. Feitelson, J., Hayon, E., Treinin, A. Photoionization of phenols in water. Effects of light intensity, oxygen, pH, and temperature//./ Am. Chem. Soc. 1973. 95. 1025-1029.

173. Costantino, G. New promises for manipulation of kynurenine pathway in cancer and neurological diseases II Expert Opin. Ther. Targets. 2009. 13. 247-258.

174. Koch, H.R., Ohrloff, C., Bours, J., Riemann, G., Dragomirescu, V., Hockwin, O. Separation of lens proteins in rats with tryptophan deficiency cataracts // Exp. Eye Res. 1982. 34. 479-486.

175. Wegener, A., Golubnitschaja, O., Breipohl, W., Schild, H.H., Vrensen, G.F.J.M. Effects of dietary deficiency of selective amino acids on the function of the cornea and lens in rats II Amino Acids. 2002. 23. 337-342.

176. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens // Exp. Eye Res. 2009. 88. 133-139.

177. Fris, M., Midelfart, A. Postnatal biochemical changes in rat lens: an important factor in cataract models // Curr. Eye Res. 2007. 32. 95-103.