Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов

Чжан Сяолэй

Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Чжан Сяолэй АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.05 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов»

Автореферат диссертации на тему "Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА Физический факультет

На правах рукописи

005007940

Чжан Сяолэй

Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов

Специальность 01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

2 6 ЯНЗ Ш1

Москва 2012

005007940

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Петрова Галина Петровна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Фадеев Виктор Владимирович (физический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова)

доктор физико-математических наук,

Иванов Андрей Валентинович (Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН)

Ведущая организация: Институт проблем нефти и газа РАН

Защита диссертации состоится «15» Февраля 2012 г. в 16-30 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501.001.45 при МГУ имени М. В. Ломоносова по адресу: Россия, 119991, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 5 (19 корпус НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ имени М.В. Ломоносова), ауд. 2-15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «13» Января 2012г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501.001.45 при МГУ имени М.В. Ломоносова кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Белки представляют собой асимметричные заряженные частицы, состоящих из одной или нескольких полипептидных цепей. Как известно, они обладают большими дипольными моментами (например, для сывороточного альбумина дипольный момент составляет 480 единиц Дебая) и большими молекулярными массами (они могут составлять от 500 до миллионов единиц Да). Белки играют решающую роль практически во всех биологических процессах, и выполняют различные функции, такие, как ферментативный катализ, транспорт и накопление, координированное движение, механическую опору, иммунную защиту, генерирование и передачу нервных импульсов, регуляцию роста и дифференцировки клеток.

Металлы являются одним из необходимых элементов для участия в жизнедеятельности биосистем. Однако некоторые металлы с точки зрения безопасности считаются токсичными для организма. При попадании даже в небольших дозах в питьевую воду, кровь, и другие биологические жидкости они способны нарушить нормальное состояние физиологических процессов. Особенно нужно отметить, что в последние годы большое количество химических средств, содержащих различные ионы металлов, используется для медицины.

В последнее время было обнаружено, что при наличии ионов металлов, особенно тяжелых, в водных растворах молекулы белков способны к образованию кластеров. Причем физико-химические свойства растворов влияют на размеры и молекулярную подвижность этих белковых кластеров. Этот процесс с точки зрения медицины часто является признаком многих заболеваний в организме человека.

В качестве примера, молекулы гадотериновой кислоты и гадодиамида обладают гадолиний-содержащими хелатными структурами, которые используются при магнитно-резонансной томографии. За последние два десятилетия, они считались безопасными и эффективными для медицинской визуализации. Но современные результаты свидетельствуют о наличии гадолиния в коже и мягких тканях у больных с почечной недостаточностью, даже с текущим гемодиализом. Нефрогенный системный фиброз (НСФ), который был описан в 1997 г, является недавно открытым редким заболеванием неизвестной этиологии, которое поражает пациентов с почечной недостаточностью. Развитие НСФ стали непосредственно связывать с воздействием гадолиний-содержащих магнитно-резонансных контрастных средств в 2006 г.

Учитывая вышеперечисленные факты, с точки зрения экспериментальной молекулярной оптики и спектроскопии, актуальность данной работы связана с изучением характера молекулярного движения и межмолекулярного взаимодействия в водных растворах биологических макромолекул при воздействии различных внешних факторов (рН, концентрация макромолекул, температура, ионы металлов, гадолиний-содержащие хелатные комплексы)

Для исследования молекулярной подвижности дисперсных частиц в водных растворах широко используется информативный оптический метод -фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света, который также называют динамическим рассеянием света (ДРС).

Цели диссертационной работы

Исследование особенностей оптических свойств и молекулярно-динамических процессов, проходящих в растворах биологических макромолекул при воздействии различных параметров среды (рН, температура, концентрация биологических макромолекул, ионная сила) методом фотонной корреляционной спектроскопии.

Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач:

1. Сравнение особенностей молекулярной подвижности макромолекул коллагена и пепсина в чистом водном растворе при изменении рН;

2. Исследование экспериментального явления - возникновения белковых кластеров в растворах пепсина, содержащих различные ионы металлов: калий, кобальт, свинец, цинк, цезий и рубидий;

3. Исследование изменений молекулярной подвижности макромолекул пепсина в чистом водном растворе в зависимости от изменения температуры при различных концентрациях;

4. Изучение изменений динамических параметров сывороточного альбумина при воздействии гадолиний-содержащих хелатных комплексов (гадотериновая кислота и гадодиамид).

Защищаемые положения

1. На основании данных работ по методу фотонной корреляционной спектроскопии молекулярного рассеяния света было получено, что коэффициент межмолекулярного взаимодействия имеет минимальное значение при рН 1,6 в чистом водном растворе пепсина; причем эффективная масса пепсина (Мэфф=35 ООО Да) от рН не зависит. Впервые была определена изоэлектрическая точка пепсина р11,6 по зависимости коэффициента межмолекулярного взаимодействия от показателя раствора рН.

2. Метод фотонной корреляционной спектроскопии молекулярного рассеяния света позволяет наблюдать образование белковых дипольных кластеров в водных растворах молекул пепсина, содержащих такие ионы металлов, как калий, кобальт, свинец, цинк, цезий и рубидий.

3. Обнаружено, что в области температур 298-320 К в чистом водном растворе молекул пепсина при нагревании наблюдается увеличение

подвижности молекул с выходом на насыщение.

4. Впервые выявлен физический механизм токсического воздействия ионов гадолиния, входящего в хелатную структуру гадодиамида, на сывороточный альбумин.

Научная новизна диссертации определяется рядом новых экспериментальных результатов, полученных в данной работе с помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии:

1. Методом фотонной корреляционной спектроскопии проведено исследование оптических свойств водных растворов коллагена и пепсина при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН и температура.

2. Впервые определена изоэлектрическая точка макромолекул пепсина - р1 1,6 методом фотонной корреляционной спектроскопии. Для определения изоэлектрической точки пепсина исследовалась зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия от рН раствора. Экстремум этой зависимости наблюдается при значении рН 1,6, где суммарный заряд на поверхности пепсина имеет нулевое значение.

3. Впервые оптическим методом (ДРС) обнаружено и детально исследовано образование дипольных кластеров молекул пепсина при воздействии различных ионов металлов (калия, кобальта, свинца, цинка, цезия и рубидия).

Практическая значимость

растворах, содержащих различные ионы металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Изученное в работе поведение биологических макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей позволяет установить молекулярный механизм патологических изменений в биологических объектах, связанный с токсическим воздействием ионов металлов на живые объекты. Материалы диссертации могут быть использованы при разработках способов контроля качества органических жидкостей и оптических методов диагностики различных заболеваний, а также для создания диагностических приборов.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на конференциях: Международные конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008, 2011» (Москва, 2008, 2011), The XII International Conference on Laser Application in Life Science (Finland, 2010), III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Москва 2010), 7th meeting: "NMR in Heterogeneous Systems" (Saint Petersburg, 2010), The 18th International Conference on Advanced Laser Technologies ALT 10 (The Netherlands, 2010) , 19th International Conference on Advanced Laser Technologies - ALT'11 (Bulgaria, 2011), Научная конференция «Ломоносовские чтения - 2011» (Москва, 2011).

Публикация

По материалам диссертационной работы имеется 14 публикаций, в числе которых 5 статей в российских и международных научных журналах.

Личный вклад автора

Все результаты данной диссертационной работы получены автором лично или при его непосредственном участии.

Достоверность результатов

Достоверность полученных научных результатов обеспечивается достаточным уровнем строгости разработанных физико-математических моделей, использованием в экспериментах апробированных методик измерения, высокоточной цифровой аппаратуры, компьютерных методов анализа и обработки экспериментальных данных, а также согласованностью результатов теоретического анализа с результатами экспериментальных исследований автора и других исследователей.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, и списка литературы, содержащего 100 наименований. Объем работы составляет 121 страницу, включая 45 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введение дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит общие сведения о химическом составе и строении белковых макромолекул, и их физических свойствах.

Изложены основные положения теории Дебая-Хюккеля, описывающей поведение полиэлектролитов в растворе в свете простейшей модели твердых сфер, погруженных в сплошную среду и взаимодействующих по закону Кулона. Согласно этой теории, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий.

Введены понятия ионной силы, водородного показателя среды и изоэлектрической точки, определена связь водородного показателя с поверхностным зарядом макромолекулы.

Представлены все виды связей, которые возникают внутри атомов одной молекулы и атомов разных молекул. Кроме того, особое внимание уделено межмолекулярным взаимодействиям (слабые взаимодействия) - индукционным, ориентационным и дисперсионным взаимодействиям.

Во второй главе описываются основы рассеяния света макромолекул. Изложены общие понятия рассеяния света и основные положения теории Рэлеевского рассеяния света на флуктуациях концентрации растворенного вещества. Освещены особенности влияния анизотропии рассеивающих частиц на деполяризацию рассеянного света и ослабление света в растворах.

Рассеяние называется рэлеевским, если линейные размеры рассеивающих частиц меньше, чем А/20, где Я - длина световой волны.

Согласно теории Рэлея-Дебая, для угла рассеяния в = 90°, рэлеевский коэффициент рассеяния может быть представлен как:

Я90=^ = сЯЛЩДк) 'о*

где К(йу) = 3+ЗДу - фактор Кабанна, йу - коэффициент деполяризации.

3—4 Ау

47Г2Л02(§2)2 дп

Величина Н = —называется оптической постоянной раствора, ---

ас

инкремент показателя преломления.

Если положения рассеивающих центров коррелированы, то при конечных концентрациях всегда будет существовать межмолекулярное взаимодействие. Согласно теории Дебая, интенсивность рассеянного света можно выразить через флуктуации концентрации частиц, которые зависят от химического потенциала. В этом случае для разбавленных растворов макромолекул имеет место соотношение:

сНК 1

— = -+2Вс + -й90 М

Метод дает возможность прямого определения молекулярной массы М,

для чего необходимо измерить Я9о при нескольких концентрациях, и

сНК

экстраполировать полученную зависимость —— = f(c) к концентрации с= 0.

«90

Наклон этой прямой, равный 2В, позволяет вычислить второй вириальный коэффициент В , который характеризует степень отклонения поведения раствора от идеального и служит мерой межмолекулярного взаимодействия в растворе.

При такой экстраполяции молекулярная масса равна:

ГсЯГ1

_ ген

1ДдП-

9<НС_0

В третьей главе описывается метод фотонной корреляционной спектроскопии, позволяющий определить коэффициент трансляционной диффузии 0£ дисперсных частиц в жидкости путем анализа спектра флуктуаций интенсивности рассеянного света. Хаотическое броуновское

движение частиц раствора вызывает микроскопические флуктуации их локальной концентрации. При прохождении лазерного луча через такую среду часть света будет рассеяна на этих неоднородностях. Флуктуации интенсивности рассеянного света будут соответствовать флуктуациям локальной концентрации частиц. Временная автокорреляционная функция, согласно определению, имеет следующий вид:

1 Г*т

С(т) = (/(0) • /(I - т)) = ^ - ] /(0)/(е - г) Л

В соответствии с гипотезой Онзагера, релаксация микроскопических флуктуаций концентрации к равновесному состоянию может быть описана

первым законом Фика (уравнением диффузии):= —0с7с(г, Г). Отсюда видно, что С(т) экспоненциально затухает во времени, и характерное время релаксации однозначно связано с Таким образом, корреляционная функция интенсивности рассеянного света имеет вид:

С(т) = аехр + Ь

В соответствии с решением уравнения диффузии, обратное время

1 9 /ЧотЛ .

корреляции равно: - = £^<Г . гДе Ч= ) ~ волновой вектор

рассеянного света.

Коэффициент трансляционной диффузии заряженных молекул может отличаться от Б нейтральных молекул согласно формуле:

0, = Во{1 + (2ЯМ-[ч])с}

где М - масса частиц, В - коэффициент межмолекулярного взаимодействия. [77] = 1нпс_»о^р _ характеристическая вязкость. Для сферических

КТ

незаряженных частиц, согласно закону Стокса-Эйнштейна: й = где Я -радиус частицы, Т- температура.

Глава четвертая содержит литературный обзор, посвященный современным результатам по исследованию трехкомпонентных растворов макромолекул. Глава состоит из трех разделов.

В первом разделе изложена теория Скэтчарта, в которой рассмотрено взаимодействие макроионов в растворе, содержащем кроме низкомолекулярного растворителя еще и третью компоненту - сильный электролит. Согласно Скэтчарду, парные взаимодействия в таких растворах описываются вторым вириальным коэффициентом в разложении для свободной энергии, выражение для которого имеет вид:

М| Чтз 2 4+2fo3m3'

где VI - удельный объем растворителя, Z — заряд макроиона, М2 - его масса, т3 - концентрация ионов соли, параметры Р22 . Рн, Рзз определяются, соответственно, взаимодействием между макроионами, взаимодействием между макроионами и ионами соли и взаимодействием только между ионами соли.

Второй раздел посвящен результатам работ по изучению особенностей белковых растворов, содержащих ионы металлов с различными ионными радиусами с помощью оптических методов и атомной силовой микроскопии (АСМ).

В третьем разделе изложены результаты работ по изучению водных растворов белков при воздействии некоторых синтетических полимеров с помощью оптических методов.

Глава пятая содержит подробное описание экспериментов и результаты исследования водных растворов белков при воздействии различных внешних факторов методом фотонной корреляционной спектроскопии. Она включает в себя несколько параграфов.

Объекты исследования и подготовка образцов:

В работе были исследованы следующие белки (на базе препаратов "Serva" и "Sigma"): коллаген первого типа из коровьей кожи, пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи, бычий сывороточный альбумин (БСА). сопутствующими добавками послужили различные соли металлов ([РЬ(СН3СОО) • 3Н20], [Eu(N03)3 ■ 5Н20], ZnCl2, KCl, RbCl, CsCl, CoCl, FeCl}) и гадолиний-содержащие хелатные комплексы (гадотериновая кислота, гадодиамид). Приведены краткие описания биохимических и физико-химических свойств исследуемых веществ и их соединений. Для регулирования pH среды применялись слабые растворы соляной HCL или уксусной кислоты СН3СООН, и щелочи КОН. Подробно изложены методика и условия приготовления исследуемых систем с заданными параметрами.

Описание экспериментальной установки

Представлена схема спектрометра Photocor Complex (рис. 1), основанного на методе фотонной корреляционной спектроскопии. Подробно изложены технические характеристики отдельных агрегатов спектрометра. Кроме того, описаны программное обеспечение работы Photocor Complex и методики обработки экспериментальных данных (метода обратных задач) , с помощью которых осуществляется управление процессом измерения и обработка результатов измерения.

Коррелятор

Рис. 1. Схема спектрометра Photocor Complex. 13

В данной работе спектрометр работает в гомодинном режиме. Источником света в установке служит диодный лазер с длиной волны 647 нм. Рассеянный под углом 90° свет регистрируется ФЭУ. Необходимая температура в термостате поддерживается терморегулятором, управляемого с помощью компьютера.

Результаты и обсуждения

В дальнейших разделах представлены основные результаты исследования белковых растворов при воздействии различных внешних факторов, полученные методом фотонной корреляционной спектроскопии.

На рисунке 2 показана зависимость В(рН) для пепсина, имеющего минимум вблизи рН 1,6. Согласно теории Скэтчарда, коэффициент В изменяется с ростом суммарного заряда на макромолекуле по параболическому закону ~ Т} (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке (2=0). Поскольку изоэлектрическая точка пепсина находится в очень кислой среде (р1 1,6), основные эксперименты в данной работе проводились только при рН> 1,6.

В соответствии с формулой = £)0{1 + (2ВМ - [*?])с}, коэффициент зависит от коэффициента межмолекулярного взаимодействия В, эффективной массы М, характеристической вязкости [??] и концентрации молекул. По результатам эксперимента, молекулярная масса пепсина почти не изменяется в зависимости от рН. Согласно литературным данным, характеристическая вязкость в чистом водном растворе пепсина составляет [77] = 7 см3/г . Коэффициент межмолекулярного взаимодействия В и коэффициент трансляционной диффузии должны быть связаны линейной зависимостью.

На рисунке 3 (кривая 1) представлена зависимость коэффициента трансляционной диффузии от рН для чистого водного раствора пепсина при рН> 1,6. Минимальное значение было обнаружено при рН 1,6. С ростом заряда на поверхности молекул пепсина коэффициент увеличивается.

1514-1 13312«

"б»-

О «

сГ 9"

1А

Рис. 3. Зависимость коэффициента трансляционной диффузии от рН. Кривая 1: для чистого водного раствора пепсина, кривая 2-4: для водных растворов пепсина с добавлением ионов калия при Т=298 К

(кривая 2 - 1x1с4 моль/л, кривая 3 - 1хЮ"3 моль/л, кривая 4 - 1хЮ"2 моль/л)

рН

В отличие от зависимости 0((рН~) для водного раствора пепсина (рис. 3,

кривая 1), зависимость Ос(рН) для растворов коллагена (рис. 4) существенно

отличается. Т.е. вблизи изоэлектрической точки (р15,8) коэффициент имеет

максимальное значение, а не минимальное. Этот эффект связан с

характеристической вязкостью - величина [77] коллагена (1150 см3/г) в 164 раза превышает значение [77] для пепсина (7 см3/г). В связи с этим, при увеличении суммарного заряда на поверхности молекул модуль \2ВМ — [т/]| уменьшается, соответственно, коэффициент тоже уменьшается.

Для водных растворов пепсина с добавлением соли KCl наблюдается уменьшение коэффициентов трансляционной диффузии (рис. 3, кривые 2-4) по сравнению с зависимостью Dt(pH) для чистого водного раствора пепсина (рис. 3, кривая 1). Этот эффект связан с образованием белковых дипольных кластеров при добавлении ионов калия с большим ионным радиусом (1,3 А). При этом положительно заряженные ионы металла прочно связываются с отрицательными группами на поверхности молекул пепсина. Между молекулами возникают силы диполь-дипольного притяжения вместо кулоновского отталкивания. Вблизи изоэлектрической точки коэффициент трансляционной диффузии имеет минимальное значение. При этом, с ростом ионной силы раствора коэффициент трансляционной диффузии уменьшается.

Кроме того, сравнительные эксперименты были проведены для растворов пепсина при наличии различных ионов металлов вблизи изоэлектрической точки (рис. 5). Обнаружено, что коэффициент 01 уменьшается и максимальное падение £>( (почти в два раза) наблюдается при добавлении ионов свинца.

8"|рерм1(Р| КС1«Р С0«Р РЬ»Р 2п»р Са»Р ЙЬ«Р

"шс»1шшГ|ШИ т»и> Ч пи Й>1»т|Г°-,Мто|/|

Рис. 5. Сравнительные величины коэффициентов

трансляционной диффузии для чистого водного раствора пепсина (1) и с добавлением различных солей - калия (2), кобальта (3), свинца (4), цинка (5), цезия (6) и рубидия (7) (рН 1,6,

сто/,6ец=0,001 моль/л, 12стал6ец=0,01

моль/л). Т=298 К.

На рисунке 6 показана температурная зависимость коэффициента трансляционной диффузии для чистого водного раствора пепсина. Коэффициент с ростом температуры в диапазоне 7=298-320 К достигает максимума (с выходом на насыщение), причем, чем меньше концентрации пепсина, тем быстрее достигается максимум коэффициента трансляционной диффузии при увеличении температуры. Максимум коэффициента трансляционной диффузии при различных концентрациях пепсина имеет одно и то же значение (£>,= 1,9х10"6 см2/сек). Кроме того, кривые зависимости 0( — /(Г) не изменяются при концентрации пепсина выше 10 мг/мл.

Рис. 6. Зависимость коэффициента трансляционной диффузии О, от температуры для чистого водного раствора пепсина при различных концентрациях (рН 4,6): кривая 1 - с=2,8 мг/мл; 2 -с=5 мг/мл; 3 - с=10 мг/мл; 4 -с=15 мг/мл.

При исследовании динамических параметров молекул альбумина в чистом водном растворе и в растворах с добавлением гадотериновой кислоты и хлорида железа получены нелинейные зависимости Оь(рН) с минимумом вблизи изоэлектрической точки рН 4,8 (рис. 7). Видно, что эти зависимости Ос(рЯ) схожи по характеру и по значению.

Рис. 7. Зависимость коэффициент трансляционной диффузии от показателя рН для чистого водного раствора альбумина (кривая 1), с добавлением гадотериновой кислоты (1=0,05 ммоль/мл) (кривая 2), с добавлением соли хлорида железа РеС13 (1=0,004 моль/л) {кривая 3).

Однако при воздействии гадолиний-содержащих хелатных комплексов гадодиамида на молекулы альбумина, коэффициенты трансляционной диффузии резко падают (рис. 8). Причем с ростом концентрации гадодиамида коэффициент уменьшается.

Это может быть связано с тем, что в растворе гадодиамида существует определенное количество свободных ионов гадолиния, при воздействии которого на альбумин образуются белковые кластеры.

Как было показано ранее а нашей лаборатории, наличие в растворе ионов с большим ионным радиусом приводит к образованию макромолекулярных комплексов. Ионный радиус СМ3! гораздо больше, чем у ионов Ре3+: 11С(13+=0,938 А (близок по величине к радиусу трехвалентного иона европия ЯЕц34=0,95 А), 11Ре3+=0,64 А. Крупные рассеивающие частицы обладают меньшей подвижностью и большим гидродинамическим радиусом. Это и является причиной, почему коэффициент трансляционной диффузии при добавлении ионов железа (рис. 7, кривая 3) больше коэффициента трансляционной диффузии при воздействии свободных ионов гадолиния на молекулы альбумина (рис. 8).

Рис. 8. Зависимость коэффициента трансляционной диффузии от рН для водных растворов БСА (с=1 т/мл) при воздействии гадодиамида. Кривая 1 - концентрация гадодиамида ц=0,002 ммоль/мл; Кривая 2 -р=0,01 ммоль/мл; Кривая 3 -ц=0,05 ммоль/мл; Кривая 4 - ц=0Д ммоль/мл. Т=298 К.

В отличие от гадодиамида, ионы гадолиния из структуры гадотериновой

кислоты более прочно связаны со своими хелатными комплексами.

Основные результаты и выводы:

1. С помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии получено, что рН - зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия В для водных растворов пепсина имеет экстремум при рН 1,6. Из этого следует, что изоэлекгрическая точка данного типа пепсина равна 1,6.

2. Выявлено, что коэффициент трансляционной диффузии уменьшается вблизи изоэлекгрической точки пепсина в водных растворах, содержащих ионы калия, кобальта, свинца, цинка, цезия и рубидия, с ростом ионной силы раствора. Наиболее заметное падение коэффициента трансляционной диффузии пепсина наблюдается вблизи изоэлекгрической точки при добавлении ионов свинца, что связано с образованием белковых дипольных кластеров.

3. Впервые показано, что наиболее токсическое воздействие на макромолекулы пепсина оказывают ионы свинца.

4. Оптическим методом (ДРС) обнаружено, что в области температур 298320 К в чистом водном растворе пепсина при нагревании наблюдается увеличение коэффициента трансляционной диффузии с выходом на насыщение - максимальное значение Dt= 1,9x10"6 см2/сек.

5. Оптическим методом (ДРС) обнаружено образование дипольных кластеров альбумина в водных растворах, содержащих гадолиний-содержащие хелатные комплексы гадодиамида. С ростом концентрации гадодиамида коэффициент трансляционной диффузии уменьшается. Это может быть связано с тем, что в растворе гадодиамида существуют определенное количество свободных ионов гадолиния.

6. Впервые показано, что использование гадодиамида для улучшения контраста визуализации при исследованиях с помощью МРТ не является безопасным для организма. Существует риск возникновения ряда заболеваний, что является важным выводом для медицины.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. I.A. Perfil'eva, G.P.Petrova, Y.M.Petrusevich, A.V.Boiko, M.S.Ivanova, Zh. Xiaolei "Dynamic properties of collagen molecules in water and salt solutions" // Int. Conf. Advanced Laser Technologies "ALT-07", Proc. SPIE, 2008, 7022, 70220W-1.

2. Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич, И.А. Перфильева, М.С. Иванова, Чжан Сяолэй «Молекулярная подвижность в растворах коллагена, содержащих ионы с различными ионными радиусами» // вестник МГУ, Сер. 3. Физика. Астрономия. 2008. №4. С. 68-70. (Moscow State University Phys. Bull. 2008. Vol. 63. №4. P. 296-298).

3. Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич, М.А.Гурова, И.А. Перфильева, Т.Н. Тихонова, К.В. Федрова, Чжан Сяолей «Физический механизм токсического воздействия тяжелых металлов на белки и ферменты» // Мед. Физика, 2010, №2 (46), С. 101-104.

4. Сяолэй. Чжан, Г.П. Петрова, [Ю.М. ПетрусевиЧ И.А. Сергеева «Изменение динамических параметров сывороточного альбумина при воздействии гадотериновой кислоты» // Мед. Физика, 2011, №3. С. 65-71.

5. Сяолэй Чжан, Г.П. Петрова, [Ю.М. Петрусевич! И.А. Сергеева «Исследование молекулярной подвижности фермента пепсина методом фотонной корреляционной спектроскопии» // Вестник МГУ. Физика. Астрономия. 2012. №1.

Тезисы докладов:

6. Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич, И.А. Перфильева, М.С. Иванова, Чжан Сяолэй «Молекулярная подвижность в растворах коллагена, содержащих ионы металлов с различными ионными радиусами» // Международная конференция студентов, аспирантов, и молодых ученых по фунтаментальным наукам «Ломоносов-2008», Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Апрель 2008, Сборник тезисов докладов, С. 111-112.

7. G.P.Petrova, Y.M.Petrusevich, K.V. Fedrova, I.A. Sergeeva, T.N. Tikhonova, Zh. Xiaolei «Physical mechanism of "poisoning" the proteins and enzymes by heavy metals» // The XII International Conference on Laser Application in Life Science, (Oulu, Finland) June 2010, Book of abstracts, P. 140.

8. Чжан Сяолэй, Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич «Метод рассеяния света в определении ферментативных кластеров, образующихся при воздействии тяжелых металлов» // III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Июнь 2010, Сборник тезисов докладов, Том 3, С. 148150.

9. Yurii М. Petrusevich, Galina P. Petrova, Alexander M. Makurenkov, Helen E. Berlovskaya, Zhang Xiaolei «Formation of Protein and Enzyme Clusters in Solutions Induced by Small Concentrations of Heavy Metals Ions» // 7th meeting: "NMR in Heterogeneous Systems", June 28 - 28 July 2010, P. 24.

10. G.P. Petrova, Yu.M. Petrusevich, M.A. Gurova, I.A. Sergeeva, S.E. Sergeev, T.N. Tichonova, K.V. Fedorova, Zhang Xiaolei «Mechanism of heavy metal ions toxic influence on proteins and enzymes studying by different laser optical methods» // The 18th International Conference on Advanced Laser Technologies ALT10 (Egmond ann Zee, The Netherlands) , 11-16 Sept 2010, Book of abstracts, P. 53

11. K.V. Fedorova, M.A. Gurova, Z. Xiaolei, G.P. Petrova, Yu.M. Petrusevich «Static and dinamic light scattering in investigation of interaction charge macromolecules enzymes and some metals» // The 18th International Conference on Advanced Laser Technologies ALT 10

(Egmond ann Zee, The Netherlands) , 11-16 Sept 2010, Book of abstracts, P. 160

12. Чжан Сяолэй, |Ю.М. Петрусевич!, Г.П. Петрова «Исследование молекулярной подвижности в растворах пепсина методом динамического рассеяния света» // Международная конференция студентов, аспирантов, и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2011», Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова. Апреля 2011, Сборник тезисов докладов, С. 177.

13. G. Petrova, М. Gurova, I. Sergeeva, T.Tichonova, К. Fedorova, Z. Xiaoley «Poisonous effect of low concentration of heavy metal ions on some enzumes in the solutions» // 19th International Conference on Advanced Laser Technologies - ALT 11 (Golden Sands, Bulgaria), 3-8 September 2011, Book of abstracts, P. 108.

14. Чжан Сяолэй, Петрова Г.П. «Особенности молекулярной подвижности фермента пепсина в водных растворах при воздействии различных внешних факторов» // Сб. расширенных тезисов Ломоносовские чтения. Секция физики. (Ноябрь, 2011) С. 122-124.

Подписано в печать 07.01.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1507. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Чжан Сяолэй

Введение

Глава 1 Основные свойства белковых молекул

1.1. Общее представление о белковых молекулах

1.2. Поведение белковых молекул в растворе

Теория Дебая - Хюккеля

1.3. Основные виды взаимодействий молекул

Глава 2 Молекулярное рассеяние света в растворах белковых молекул

2.1. Основные положения теории рассеяния света

2.2. Теория Рэлея - Дебая. Определение молекулярного веса и межмолекулярного взаимодействия

Глава 3 Метод фотонной корреляционной спектроскопии

3.1. Спектральная плотность тепловых молекулярных флуктуаций

3.2. Временные корреляционные функции и пространственно временная корреляционная функция Ван-Хова

3.3. Связь корреляционных функции с оптическим спектром. Соотношение Зинерта

3.4. Определение коэффициента трансляционной диффузии с помощью корреляционных функции

3.5. Время корреляции. Метод измерений спектра автокорреляционной функции рассеянного света. Гомодинный и гетеродинный метод

3.6. Связь между коэффициентом трансляционной диффузии и статическими параметрами

3.7. Теория Джеймса - Эванса

Глава 4 Трехкомпонентные лиотропные системы (обзор)

4.1. Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах

4.2. Изучение статических параметров в водных растворах, содержащих малые ионы металлов

4.3. Изучение образования молекулярных комплексов в водных растворах различных белков, содержащих водорастворимые синтетические полимеры

Глава 5 Экспериментальное исследование водных белковых растворов методом фотонной корреляционной спектроскопии

5.1. Материалы исследования и процедура подготовки образцов для измерений

5.2. Описание экспериментальной установки

5.3. Эксперименты и обсуждения

5.3.1. Исследование водных растворов молекул коллагена

5.3.1.1. Экспериментальные результаты

5.3.1.2. Обсуждение результатов

5.3.2. исследование водных растворов молекул пепсина

5.3.2.1. Экспериментальные результаты

5.3.2.2. Обсуждение результатов

5.3.3. Исследование водных растворов молекул сывороточного альбумина

5.3.3.1. Экспериментальные результаты

5.3.3.2. Обсуждение результатов 105 Заключение 112 Литература

Введение диссертация по физике, на тему "Фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света в белковых растворах при воздействии различных внешних факторов"

У , I.

Белковые макромолекулы играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем, поэтому изучение физических параметров этих макромолекул в водных растворах с помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии является весьма интересной задачей молекулярной оптики.

Поверхность биологических макромолекул содержит многочисленные заряженные группы, причем величину заряда можно изменять в широких пределах путем изменения рН раствора [1]. Кроме того, размер и масса строго определена для каждого вида биополимеров. . '( ■ Электростатическое взаимодействие между молекулами полярного растворителя и заряженными группами биологических макромолекул оказывает существенное влияние на характер броуновской динамики молекул. С точки зрения экологии и медицины представляет интерес изучение влияния ионов металлов на растворы биологических макромолекул.

Актуальность темы исследования связана с изучением особенностей молекулярной подвижности и межмолекулярного взаимодействия в лиотропных биологических системах, такими являются \ , растворы биологических макромолекул.

Металлы являются одним из необходимых элементов для участия в жизнедеятельности биосистем. Однако некоторые металлы с точки зрения безопасности считаются токсичными для организма. При попадании даже в небольших дозах в питьевую воду, кровь, и другие биологические жидкости они способны нарушить нормальное состояние физиологических процессов. Особенно нужно отметить, что в последние годы большое V • \ ;. количество химических средств, содержащих различные ионы металлов, используется для медицины.

В последнее время было обнаружено, что при наличии ионов металлов, особенно тяжелых, в водных растворах молекулы белков способны к образованию кластеров [2-5]. Причем физико-химические свойства растворов влияют на размеры и молекулярную подвижность этих белковых кластеров. Этот процесс с точки зрения медицины часто является признаком многих заболеваний в организме человека.

В качестве примера, молекулы гадотериновой кислоты и гадодиамида обладают гадолиний-содержащими хелатными структурами, которые используются при магнитно-резонансной томографии. [6]. За последние два десятилетия, они считались безопасными и эффективными для медицинской визуализации. Но современные результаты свидетельствуют о наличии гадолиния в коже и мягких тканях у больных с почечной недостаточностью, даже с текущим гемодиализом [7]. Нефрогенный системный фиброз (НСФ), который был описан в 1997 г, является недавно открытым редким заболеванием неизвестной этиологии, которое поражает пациентов с почечной недостаточностью. Развитие НСФ стали непосредственно связывать с воздействием гадолиний-содержащих магнитно-резонансных контрастных средств в 2006 г. [8].

Для исследования молекулярной подвижности дисперсных частиц в водных растворах широко используется информативный оптический метод - фотонная корреляционная спектроскопия молекулярного рассеяния света, который также называют динамическим рассеянием света (ДРС) [9].

Основной целью данной работы было исследование оптических свойств и молекулярно-динамических процессов, проходящих в растворах биологических макромолекул при воздействии различных внешних 1 у параметров среды (рН, температура, концентрация биологических макромолекул, ионная сила) методом фотонной корреляционной спектроскопии.

Исходя из общей цели, в диссертации с помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии ставился ряд практических задач:

2. Исследование экспериментального явления возникновения белковых 11 > кластеров в растворах коллагена и пепсина, содержащих различные ионы металлов: калий, кобальт, свинец, цинк, цезий и рубидий;

3. Исследование изменений молекулярной подвижности макромолекул пепсина в чистом водном растворе в зависимости от температур при различных концентрациях;

4. Изучение изменений динамических параметров сывороточного альбумина при воздействии гадолиний-содержащих хелатных комплексов (гадотериновая кислота и гадодиамид);

11 у 1

5. Наблюдение динамических процессов разрушения дипольных кластеров сывороточного альбумина при нагревании.

Научная новизна диссертации определяется рядом | ^ Л экспериментальных результатов, полученных в данной работе с помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии:

2. Впервые определена изоэлектрическая точка макромолекул пепсина - р1 1,6 методом фотонной корреляционной спектроскопии. Для определения изоэлектрической точки пепсина исследовалась 11 < • зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия от рН раствора. Экстремум этой зависимости наблюдается при значении рН 1,6, где суммарный заряд на поверхности пепсина имеет нулевое значение.

1 V .

4. Впервые выявлен физический механизм токсического воздействия ионов гадолиния, входящего в хелатную структуру гадотериновой кислоты и гадодиамида, на сывороточный альбумин.

5. Впервые обнаружено разрушение дипольных кластеров сывороточного альбумина, образовавшихся в водных растворах, содержащихся ионы цезия при воздействии температуры (от 303 до 323 К).

1 V . , .

Защищаемые положения

1. На основании данных работ по методу фотонной корреляционной спектроскопии молекулярного рассеяния света было получено, что У коэффициент межмолекулярного взаимодействия имеет * 1 • минимальное значение при рН 1,6 в чистом водном растворе пепсина; причем эффективная масса пепсина (МЭфф=35 ООО Да) от рН не зависит. Впервые была определена изоэлектрическая точка пепсина р! 1,6 по зависимости коэффициента межмолекулярного взаимодействия от показателя раствора рН.

1 V" , содержащих такие ионы металлов, как калий, кобальт, свинец, цинк, ' цезий и рубидий.

3. Обнаружено, что в области температур 298-320 К в чистом водном растворе молекул пепсина при нагревании наблюдается увеличение подвижности молекул с выходом на насыщение.

4. Впервые выявлен физический механизм токсического воздействия ионов гадолиния, входящих в хелатную структуру гадодиамида, на сывороточный альбумин.

5. Обнаружено, что нагревание растворов сывороточного альбумина, 1 '( / содержащих ионы цезия, приводит к разрушению дипольных кластеров в области температур 303-323 К И ,

Практическая ценность

Полученные с помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии результаты способствуют развитию представлений об оптических и молекулярно-динамических процессах, происходящих в белковых растворах, содержащих различные ионы металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Заключение диссертации по теме "Оптика"

Основные результаты и выводы:

1. С помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии получено, что рН - зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия В для водных растворов пепсина имеет экстремум при рН 1,6. Из этого следует, что изоэлектрическая точка данного типа пепсина равна 1,6.

2. Выявлено, что коэффициент трансляционной диффузии уменьшается вблизи изоэлектрической точки пепсина в водных растворах, содержащих ионы калия, кобальта, свинца, цинка, цезия и рубидия, с ростом ионной силы раствора. Наиболее заметное падение коэффициента трансляционной диффузии пепсина наблюдается вблизи изоэлектрической точки при добавлении ионов свинца, что связано с образованием белковых дипольных кластеров.

3. Впервые показано, что наиболее токсическое воздействие на макромолекулы пепсина оказывают ионы свинца.

4. Оптическим методом (ДРС) обнаружено, что в области температур 298-320 К в чистом водном растворе пепсина при нагревании наблюдается увеличение коэффициента трансляционной диффузии с выходом на

6 2 насыщение - максимальное значение Dt= 1,9 х 10" см /сек.

7. С помощью метода фотонной корреляционной спектроскопии получено,

112 что в водных растворах альбумина, содержащих ионы цезия, коэффициент трансляционной диффузии увеличивается при нагревании. Заметный рост коэффициента трансляционной диффузии наблюдается в диапазоне температур 303-323 К, что, вероятно, связано с разрушением дипольных белковых нанокластеров.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Чжан Сяолэй, Москва

1. Петрова Г.П. Оптические спектральные методы исследования жидкостей и растворов (часть 1). — М.: физ. Фак. МГУ, 2008, С. 29.

2. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. // Gen. Physiol, and Biophys. 1998, 17, N2, P. 97.

3. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. // Вестн. Моск. Ун-та. Физ. Астрон. 1998, № 4, С. 71 (Moscow University Phys. Bull. 1998, № 4, P.01 41. Ji).

4. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. «Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния» // Квант, электрод. 2002, 32, № 10, С. 897-901.

5. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н. и соавт. «Физичесике методы исследования воздействия ионов свинца на белки в растворах» // Вестн. Моск. Ун-та. Физ. Астрон. 2003, № 2, С. 42-46.

6. Зубарев А.В., Гажонова В.Е. «Диагностические возможности магнитно-резонансной, ультразвуковой и рентгеновской ангиографии при исследовании сосудов почек» // Мед визуализация. 2003, № 1, С. 106-121.

7. Cowper S.E., Robin H.S., Steinberg S.M., et al. " Scleromyxoedema-like cutaneous dieases in renal-dialysis patients" // Lancet. 2000, 356, P. 1000-1001.

8. Grobner T. "Gadolinium a specific trigger for the development of nephrogenic fibrosing dermopathy and nephrogenic systemic fibrosis?" // Nephrol Dial Transplant. 1745, 21, P. 1104-1108.

9. Камминса Г., Пайк Э.Р. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. -М.: Наука, 1978.

10. Ю.Ленинджер А. Биохимия. М., 1974.

11. Страйер Л.Б. Биохимия. — М.: Мир, 1984.12.http://www.xumuk.ru/biochem/36.html.

12. Tanford Ch. "Physical Chemistry of Macromolecules" // Willey, New York, 1961.

13. Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров. -M.: Изд. Химия, 1965.

14. Bier J. "Electrophoresis"//N.Y., 1968.

15. Мартин Р. Введение в биофизическую химию. М.: Мир, 1966.

16. Edsall J.T. et al. "Light Scattering in Solutions of Serum Albumin: effects of charge and ionic strength" // J. of American Chem. Soc., 1950, V.72, P. 464.

17. Steinhard J., Zaiser E.M. // Adv. Protein Chem., V. 10, P. 152.

18. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов B.C. Физическая химия. М.: высшая школа, 1981, С. 103.

19. Волькенштейн М.В. Молекулярная оптика. -М.: ГИТТЛ, 1951.

20. Фабелинский И.Л. Молекулярное рассеяние света. М.: Наука, 1965.22."Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков, инженеров и врачей. Неорганические и элементоорганические соединения" // 7-е изд. т.З, Л., Химия, 1977, С. 608.

21. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. «Электростатические взаимодействия в растворах биополимеров по данным рэлеевского рассеяния света» // Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр., 1994, Т.35, № 3, С. 45-50.

22. Долин П.А. Справочник по технике безопасности. М.: Энергоатомиздат, 1985, С. 824.

23. Cabannes J. "La diffusion moleculaire de la lumiere" // Paris, 1929.

24. Дебай П. Избранные труды. М., 1987, С. 363.

25. Цветков В.Н. и др. Структура макромолекул в растворах. — М., 1964.

26. Berne B.J., Harp G.D. // Advan. Chem. Phys. 1970, V. 17. P. 63-226.

27. Ревокатов О.П., Гангардт М.Г. Проблемы магнитного резонанса. М.: Наука, 1978, С. 147-165.

28. Ван Кампен Н.Г. Стохастические процессы в физике и химии. М.: Высшая школа, 1990.31 .Хорстхемке В., Лефевр Р. Индуцированные шумом переходы. М.: Мир, 1987.

29. Резибуа П., Ленер М.Де. Классическая теория жидкостей и газов. М.: Мир, 1987.

30. Климонтович Ю.Л. Статистическая физика. -М.: Наука, 1982.

31. Bart V.T., Sergey S. "Wave scattering in complex media: From theory to applications" // 2002, P. 170.

32. Redouane В., Robert P. "Soft-matter characterization" // 2008, P. 340.

33. Dhont J.K.G. "An introduction to dynamics of colloids" //2003, P. 134.

34. Cummins H.Z. "In photo correlation and L. B. spectroscopy" // Plenum Press, N.Y.-L. 1974.

35. Петрусевич Ю.М. Взаимодействие биополимеров в растворе. Докт дисс. М. 1992.

36. Scatchard G.J., Batchelder А.С., Brown A. "Osmotic equilibrium in solution of serum albumin and sodium chloride" // J. Am. Chem. Soc. 1946, 68, P.2315-2323.

37. Scatchard G.J. "The attraction of protein for small molecules and ions" // Ann. N.Y. Acad. Sci., 1949, V. 51, P. 2315.

38. Edsall J.T. et al. "Light Scattering in Solutions of Serum Albumin: effects of charge and ionic strength" // J. of American Chem. Soc., 1950, V. 72, P. 4641.

39. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P. "Electrostatic Interaction in Biopolymer Solutions Investigated by NMR and Laser Light Scattering" // SPIE, 1993, Vol. 1884, P. 70-76.

40. Петрова Т.П. Молекулярная подвижность и межмолекулярные взаимодействия в оптически анизотропных жидких системах. Докт. Дисс. М. 1999.

41. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. "Molecular Clusters in Water Protein Solutions in The Presence of Heavy Metal Ions" // General Physiology and Biophysics, 1998, V. 17(2), P. 97-104.

42. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P. "Electrostatic Interaction in Biopolymer Solutions Investigated by NMR and Laser Light Scattering" // SPIE, 1993, Vol. 1884, P. 70-76.

43. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Ширкова И.И., Ревокатов О.П. «Взаимодействие сывороточного альбумина с водой при различных концентрациях водородных ионов по данным рэлеевского рассеяния» // Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр, 1987, Т. 28, № 2, С. 59-63.

44. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P., Evseevicheva A.N. "Instability of Proteins in The Solution at The Presence of Toxic Heavy Metals" // Ecology of Cities. Int. Conf. Proceedings, Rhodes, Greece, 1998, P. 304-313.

45. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. «Физические методы мониторинга токсических тяжелых металлов» // II Всероссийская научная конференция: Физические проблемы экологии, Москва, 1999, Тезисы докладов, Т. 1.

46. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Гурова М.А., Перфильева И.А., Тихонова Т.Н., Федрова К.В., Чжан Сяолей «Физический механизм токсического воздействия тяжелых металлов на белки и ферменты» // Мед. Физика, 2010, №2 (46), С. 101-104.

47. Xia J., Paul L. Dubin "Dynamic and electrophretic light scattering of a water-soluble complex formed between pepsin and poly (ethylene glycol) " // Macromolecules, 1993, № 26, P. 6688-6690.

48. Shinji A., Atsushi Т., etc. "Formation of an intrapolymer complex from human serum albumin and poly (ethylene glycol)" // Langmuir, 1999, № 15, P. 940947.

49. Kazuyuoshi Ogawa, Atsushi Nakayama, Etsuo kokufuta " Electrophoretic behavior of ampholitic polymers and nanogels " // J. Phys. Chem. 2003, № 107, P. 8223-8227.

50. Toshiyuki Matsudo, Kazuyoshi Ogawa, Etsuo Kokufuta " intramolecular complex formation of poly (N-isopropylacrylamide) with human serum albumin " // Biomacromolecules, 2003, № 4, P. 728-735.

51. Etsuo Kokufuta, Hiroichi Nishimura "Complexation of pepsin poly (ethylene glycol)" // Polymer bulletin, 1991, № 26, P. 277-282.

52. Пилипенко A.T. «Натрий и калий» // Справочник по элементарной химии. -Киев: Наукова думка, 1978, С. 316—319.

53. Дроздов А. «Яростные металлы» // Энциклопедия для детей. — М.: Химия Аванта, 2002, С. 184—187.

54. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия. — М.: Высшая школа, 2001.

55. Некрасов Б.В. Основы общей химии. — М.: Химия, 1974.

56. Спицын В.И., Мартыненко Л.И. Неорганическая химия. —М.: МГУ, 1991, 1994.64.http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A5%D0%BB%D0%BE%Dl%80%D0%B8 %D0%B4%D 1 %86%D0%B5%D0%B7%D0%B8%D 1 %8F

57. Лидин Р.А., Андреева J1.JL, Молочко В.А. Константы неорганических веществ: справочник. — М.: Дрофа, 2006, С. 685.

58. Brewer А.К. "The high рН therapy for cancer tests on mice and humans " // Pharmacology Biochemistry & Behavior, 1984, T. 21, № 1, C. 1-5.

59. Low J.C., Wasan K.M., Fazli L., Eberding A., Adomat H., Guns E.S.

60. Assessing the therapeutic and toxicological effects of cesium chloridefollowing administration to nude mice bearing PC-3 or LNCaP prostate cancer xenografts " // Cancer Chemother Pharmacology, 2007, T. 60, № 6, C. 821-829.

61. Cesium Chloride. Complementary and Alternative Medicine: Herbs, Vitamins, and Minerals. American Cancer Society. Архивировано из первоисточника 18 августа 2011. Проверено 13 мая 2011.

62. Государственный реестр лекарственных средств. Министерство здравоохранения и социального развития РФ. Архивировано из первоисточника 18 августа 2011. Проверено 13 мая 2011.

63. Гончаров А.И., Корнилов М.Ю. Справочник по химии. Киев: Вища школа, 1977.

64. Перельман В.И. Краткий справочник химика. — М.: Химия, 1964.

65. Перельман. Ф.М. Рубидий и цезий. М.: АН УССР, 1960. С. 140.11980.http://ru.wikipedia.org/wiki/%D5%EB%EE%F0%E8%E4%E6%E5%EB%E5 %E7%E0(III)81 .http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%96%D0%B5%D0%BB%D0%B5%D0%B7 %D0%BE

66. Rajaram R.K., Mohana Rao J.K. " Crystal structure of lead acetate trihydrate " // Zeitschrift fur Kristallographie. Vol. 160, No. 3-4, P. 225-233.

67. Рипан P., Четяну И. Неорганическая химия. Химия металлов. М.: Мир, 1971, Т. 1.С. 561.84.http://ru.wikipedia.org/wiki/%C5%E2%F0%EE%EF%E8%E9

68. Eyre D.R. "Collagen: molecular diversity in the bodys protein scaffold" // Science. 1980, No. 207, P. 1315-1322.

69. Bornstein P., Traub W. " The chemistry and biology of collagen " // In: Neurath H. and Hill R. L. (eds.), Academic Press, The Protein (3rd ed), vol. 4, P. 411-632.

70. Ramachandran G.N., Reddi A.H. "Biochemistry of collagen" // Plenum, 1976.

71. Gross J. "Collagen biology: structure, degradation, and diease" // Harvey Lecture. 68, P. 351-432.

72. Patrickios C.S., Yamasaki E.N. "Analytical Biochem" // 1995, V. 231, P. 82-91.

73. Chaiyavat Chaiyasut, TaKao Tsuda. // Chromatography. 2001, V. 22, N 2.91 .Neurath H., Bailey K. " The Proteins " // 1954, V. 2. Part. A.92.http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/pepsin.html

74. Коротько Г.Ф. «Желудочное пишеворение в технологическом ракурсе» // Кубанский научный медицинский Вестник. 2006, № 7-8 (88-89), С. 17.

75. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров. М.: Изд. Наука, 1973.

76. Tang J., Sepulveda P., Marciniszyn J. Jr., etc. // Proc Natl Acad Sei USA, 1973, 70, P. 3437.

77. Sepulveda P., Marciniszyn JJr., Liu D., Tang J. // J Biol Chem. 1975, 250, P. 5082.

78. Wright AK, Thompson MR. " Hydrodynamic structure of bovine serum albumin determined by transient electric birefringence" // J. biophys. 1975, 15, P. 137-141.

79. Нейрат Г., Бейли К. Белки. М.: ИЛ, 1958.

80. Уайт Л. и др. Основы биохимии. -М.: 1981, Т. 1.

81. High WA, Ayers RA, Chandler J, et al. "Gadolinium is detectable within the tissue of patients with nephrogenic systemic fibrosis" // J Am Acad Dermatol. 2007, 56.