Функциональные комплексы "гость-хозяин" спин-меченых молекул с циклодекстринами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

004ь 145^7 //д правах рукописи

ИОНОВА Ирина Владимировна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ «ГОСТЬ-ХОЗЯИН» СПИН-МЕЧЕНЫХ МОЛЕКУЛ С ЦИКЛОДЕКСТРИНАМИ

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 2 ДЕК 2010

Москва-2010

004614537

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центре фотохимии РАН (ЦФ РАН).

Научный руководитель

доктор химических наук Лившиц Всеволод Аронович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Вассерман Александр Моисеевич

кандидат физико-математических наук Михалев Олег Иванович

Ведущая организация

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится -Л "9егаё/м ю /¿V в 7 7 часов на заседании диссертационного совета Д.002.012.02 при Учреждении Российской академии наук Институте химической физики им. Н. Н. Семенова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н. Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан " $ " ноября 2010 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

М. Г. Голубков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В последние годы проявляется большой интерес к построению и исследованию наноструктур на основе комплексов «гость-хозяин» с циклодекстринами (ЦД), обладающих различными функциями: хемосенсоров, сорбентов для хроматографии, переносчиков лекарственных соединений и др., а также возможностью регуляции этих функций. Примером таких структур могут служить трехкомпонентные и более сложные комплексы ЦД, содержащие две разные молекулы «гостей». В этих комплексах наблюдаются новые интересные эффекты за счет присутствия второго «гостя»: усиление флуоресценции, возникновение фосфоресценции, изменение каталитической активности и др. В связи с важностью таких функциональных структур первой задачей диссертации было исследование самоорганизации и «внутренних свойств» трехкомпонентных комплексов (вращательной динамики, полярности окружения) в зависимости от структуры ЦД и обеих молекул-гостей.

При образовании комплексов включения с ЦД увеличивается растворимость гидрофобных молекул в водной фазе. На этом свойстве основано большинство применений ЦД в химической технологии и медицине. Наряду с увеличением растворимости лекарственных соединений, их включение в полость ЦД позволяет реализовать пролонгированный эффект лекарственного препарата, а также его адресный транспорт к мишени в организме. Комплексы «гость-хозяин» холестерина и других стероидов с ЦД могут иметь важные применения при транспорте лекарственных стероидных соединений и регуляции уровня холестерина в плазме, биомембранах и других клеточных структурах. В связи с этим второй задачей диссертации было исследование особенностей использования ЦД в качестве транспортных наночастиц и модификаторов липидных мембран.

Обратимое связывание ЦД с различными органическими молекулами, сопровождающееся изменением их спектральных и химических свойств, привело к другому важному применению ЦД - в качестве молекулярных рецепторов в хемосенсорных материалах. При переходе от комплексов ЦД в растворе к сенсорным материалам необходима, как правило, иммобилизация ЦД на поверхности микрочастиц носителя, что может приводить к существенной модификации структуры и свойств комплексов. Поэтому третьей задачей диссертации явилось изучение особенностей комплексообразования ЦД , ковалентно связанных с поверхностью микрочастиц носителя.

Для решения перечисленных задач необходимо изучение не только структуры, но и молекулярной динамики этих систем. К началу выполнения данного исследования было опубликовано лишь небольшое число работ по динамике молекул-гостей в бинарных комплексах «гость-хозяин», сведения же о динамике молекул в трехкомпонентных комплексах и комплексах с ЦД, иммобилизованными на поверхности микрочастиц, насколько нам известно, вообще отсутствовали.

Одним из наиболее адекватных методических подходов к решению поставленных задач является ЭПР спектроскопия спиновых меток и зондов, которая обладает высокой чувствительностью к молекулярной динамике, полярности окружения и межмолекулярным взаимодействиям. В данной работе спиновые зонды использовались как спин-меченые аналоги 1) функциональных молекул-гостей при изучении трехкомпонентных комплексов «гость-хозяин», 2) биологически активных молекул - холестерина и липидов, 3) аналитов в моделях хемосенсорных структур.

Таким образом, настоящая диссертация посвящена изучению методом ЭПР структуры и молекулярной динамики супрамолекулярных комплексов ЦД со спин-мечеными молекулами и исследованию перспектив их применения в качестве функциональных структур и для изучения биологических объектов.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Государственных контрактов №02.523.11.3014 и №02.740.11.0113.

Научная новизна и выносимые на защиту положения.

Впервые получены трехкомпонентные комплексы «гость-хозяин» ЦЦ с двумя типами молекул-гостей - спин-мечеными индолами и углеводородами. Методом ЭПР и дополнительно с помощью квантово-химических расчетов установлены стехиометрия и структура комплексов. Впервые с использованием линейной по СВЧ полю и ЭПР спектроскопии с переносом СВЧ насыщения определены характер вращения и количественные параметры динамики спин-меченых «гостей» в комплексах в зависимости от структуры ЦД, спинового зонда и второй молекулы-гостя. Обнаружено существенное увеличение вращательной подвижности и гидрофобности окружения спин-меченых «гостей» в трехкомпонентных комплексах по сравнению с бинарными комплексами.

Впервые получены комплексы спин-меченых аналогов холестерина с ЦД. Из анализа спектров ЭПР и с помощью квантово-химических расчетов определены константы связывания и стехиометрия комплексов, их геометрическая структура и изменение формы за счет гидратации и агрегации в водном растворе. Показано, что коэффициент распределения спин-меченого аналога холестерина между ЦД и двухкомпонентной липидной мембраной чувствителен к ее фазовому состоянию. Установлен характер структурных изменений в биологических мембранах, содержащих и не содержащих холестерин, под действием циклодекстринов.

В связи с перспективами применения ЦД в качестве молекулярных рецепторов исследовано влияние ковалентного связывания ЦД с микрочастицами силикагеля на комплексообразующие свойства ЦД и динамику спин-меченых аналогов аналитов в комплексах с ЦД. Показано, что ковалентное связывание ЦД с микросферами силикагеля с помощью линкера приводит: 1) к изменению константы связывания спиновых зондов с ЦД, 2) к появлению двух состояний комплекса - адсорбированного и десорбированного с поверхности силикагеля, резко различающихся молекулярной подвижностью и полярностью окружения молекул-гостей.

Определены характер и количественные параметры подвижности для обоих состояний комплексов и спиновых зондов различной структуры.

Практическая значимость работы.

Практическая значимость диссертации определяется тем, что исследование фундаментальных задач в каждой главе диссертации имеет непосредственное отношение к конкретным или будущим применениям циклодекстринов. Так, обнаружение и количественное исследование эффекта увеличения вращательной и конформационной подвижности, а также увеличения гидрофобности окружения функциональной молекулы в присутствии второй молекулы-гостя в тройных комплексах позволяет осуществлять регуляцию этих свойств в функциональных супрамолекулярных системах.

Определение констант связывания спин-меченых аналогов холестерина с ЦД и коэффициентов распределения этих молекул между ЦД и мембраной позволяет определять свободные энергии переноса холестерина из водного раствора в липидную мембрану. Чувствительность коэффициента распределения спинового зонда к фазовым переходам и фазовому состоянию холестеринсодержащих липидных мембран позволяет использовать спин-меченые аналоги холестерина для определения фазовых границ в этих системах. Определение степени влияния самих ЦД на структуру мембран важно при использовании ЦД в медицине.

Установление характера влияния ковалентного связывания ЦД-рецепторов с микросферами силикагеля на локальное окружение и динамику в комплексах важно при построении модельных и реальных хемосенсоров.

Апробация результатов работы.

Материалы диссертационной работы докладывались на конференциях: AMPERE XIII NMR School (Zakopane, Poland, 5-11 июня 2005 г.), The X'^ International seminar on inclusion compounds (ISIC-10)(Ka3aHb, Россия, 18-22 сентября 2005 г.), XLVIII научная конференция МФТИ (Москва, Россия, 25-26 ноября 2005 г.), IV International Symposium "Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Казань, Россия, 13-17 мая 2006 г.), 50-я юбилейная научная конференция МФТИ (Москва, Россия, 23-27 ноября 2007 г.), IV молодежная школа-конференция "Магнитный резонанс и его приложения" (Санкт-Петербург, Россия, 3-7 декабря 2007 г.), The European EPR Federation Summer School in Advanced Techniques in EPR (St. Andrews, Scotland, 22-31 августа 2008 г.), The 5^ International Conference on Nitroxide Radicals (SPIN 2008) (Ancona, Italy, 7-11 сентября 2008 г.), The 7th European Federation of EPR Groups Meeting and Closing Meeting of COST P15 (EFEPR-2009) (Antwerpen, Belgium, 6-11 сентября, 2009 г.), The Is' International symposium on "Supramolecular chemistry for materials and life sciences" (Новосибирск, Россия, 29 июня - 3 июля, 2010 г.).

Публикации.

Основные результаты диссертации изложены в 5 статьях, опубликованных в центральных российских изданиях, и 11 тезисах докладов на конференциях и симпозиумах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, пятя глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах, содержит 20 таблиц и 45 рисунков. Список литературы включает 186 наименований.

Во введении кратко отражено состояние проблемы, изучаемой в диссертационной работе, сформулированы задачи и показана их актуальность, дается описание структуры диссертации и ее основного содержания.

В первой главе диссертации - литературном обзоре, кратко изложены современные данные о структуре комплексов «гость-хозяин» ЦД в растворе и твердой фазе. Рассмотрены методы исследования комплексов «гость-хозяин» с акцентом на метод спиновых меток, обсуждаются возможности этого метода при изучении структуры и молекулярной динамики комплексов включения, описаны основные результаты по комплексам ЦД, полученные данным методом за последние годы. Приведены краткие сведения о функциональных материалах на основе ЦД, в особенности о силикагелях, модифицированных ЦЦ, которые имеют отношение к пятой главе диссертации.

Во второй главе описаны экспериментальные методы, использованные в диссертационной работе. Приведены методики получения комплексов спин-меченых соединений с ЦД в растворе, твердой фазе и с ЦД, ковалентно связанными с микрочастицами силикагеля. Отдельный раздел посвящен липидным мембранам. В нем подробно изложены методики получения одно-, двух- и трехкомпонентных мембран, а также систем липцдная мембрана-ЦД. О писаны методика ЭПР измерений, применяемые методы анализа и моделирования спектров ЭПР. Дается краткое изложение методики квантово-химических расчетов, проведенных в работе.

Третья глава диссертации содержит результаты исследования методом ЭПР спектроскопии

Рис.1 Структуры спин-меченых пирролидиновым (I) и пиперидиновым (II)

«регуляторных» молекул, способных изменять свойства функциональной молекулы, использованы бензол (Б) и циклогексан (ЦГ)- Все комплексы с разными ЦД и двумя типами гостей (всего 8 составов) были получены в твердой фазе и изучены в широком температурном интервале.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

структуры и динамики трехкомпонентных комплексов (3- и у-ЦД с двумя типами молекул-гостей. В качестве моделей функциональных молекул-гостей использовали спин-меченые аналоги индола с

производных индола.

радикальными фрагментами (рис. 1). В качестве

уСО-И-СбН|з 2к'и Форма спектров ЭПР всех комплексов при комнатной

температуре свидетельствует о сильно заторможенном вращении молекул-гостей в ЦД (по сравнению со спектрами растворов). В качестве спектрального параметра подвижности использовали величину

Б = \-2Аг112Аа (/), где 2 - удвоенная г-

компонента тензора СТВ, 2Л21 - та же величина, частично усредненная вследствие молекулярного вращения.

Для всех комплексов были определены параметры гидрофобности окружения репортерской Ж)-группы. По аналогии с растворами безразмерный параметр гидрофобности в твердой фазе Лд. имеет вид:

И!!=(2А'г2-2А2г)/(2А2!'-2А2/){2), где 2Аа,2А;;,2АТа~ Рис. 2 Спектры ЭПР комплекса уЦД-

П-С6Н12 в твердой фазе при значения 2Агг соответственно для комплекса, в воде и различных температурах. Символами

и обозначены слабо и сильно неполярном растворителе (толуоле) при 77 К, когда иммобилизованные компоненты

спектра ЭПР соответственно. молекулярное движение можно считать отсутствующим в

шкале метода ЭПР. Безразмерный параметр лежит в интервале от 0 до 1. Граничные значения й5 соответствуют окружению в воде (А5=0) и толуоле = 1). Величины И3 для всех трехкомпонентных комплексов приведены в таблице I. Для сравнения в таблице 2 приведены значения для бинарных комплексов р- и у-ЦД с теми же спин-мечеными «гостями» I и II. Важный результат, следующий из сравнения таблиц 1 и 2, состоит в том, что локальное окружение в тройных комплексах существенно более гидрофобно, чем в соответствующих бинарных комплексах. Кроме того, параметр Аа зависит от типа второго "гостя" - для комплексов с ЦГ гидрофобность окружения >Ю-группы заметно выше, чем для соответствующих комплексов с Б. Эти результаты показывают, что третий компонент (ЦГ или Б) действительно входит в состав комплексов и, по-видимому, находится вблизи от спинового

зонда. Значения й5 > 1 можно объяснить тем, что в отсутствие молекулярного вращения МО-группа зонда занимает фиксированную ориентацию вблизи углеводорода, в которой гидрофобность может быть выше, чем усредненная по окружению гидрофобность в изотропном неполярном растворителе (толуоле). Данные таблицы 1 показывают также, что величины ЛЛ. для комплексов с (3-ЦД больше, чем для комплексов с у-ЦД. Во-вторых, значения для всех комплексов с I заметно выше, чем для комплексов с II.

Н,Гс

Спиновый зонд цд Третий компонент 2 А„\ПК) К

II р бензол 70,30 0,71

II р циклогексан 68,94 0,95

II У бензол 72,16 0,39

II У циклогексан 70,63 0,63

I Р бензол 69,65 0,895

I Р циклогексан 68,37 1,14

I У бензол 69,60 0,895

I У циклогексан 69,00 1,05

Спиновый зонд ЦД 2АГ{11К) К

II р 71,8 0,45

II У 72,64 0,315

I р 72,2 0,41

I У 72,32 0,38

Таблица 2 Параметры гидрофобности окружения (спин-меченых индолов II и I в бинарных комплексах с (3- и у-ЦД в твердой фазе. Средние погрешности при измерении параметров 2Аа- 0,15 Гс, при определении параметров й, - около 6%.

Таблица 1 Параметры гидрофобности окружения )

спин-меченых индолов II и I в комплексах с р- и у-ЦД Все отмеченные различия в параметре /г5 и углеводородами в твердой фазе. Средние

погрешности при измерении параметров 1А2г- 0,15 Гс, могут быть обусловлены различиями в при определении параметров А, - около 6%.

структуре комплексов, что было в качественной форме выявлено с помощью квантово-химических расчетов.

Молекулярная динамика. На рис. 2 показаны спектры ЭПР одного из полученных комплексов при разной температуре. Для комплексов у-ЦД наблюдаются два сигнала, два значения 2Агг, которым соответствуют два типа комплексов с различной подвижностью молекулы-гостя (¿1) и (¡2) (рис. 2). С увеличением температуры параметр 2А12 для -комплексов значительно уменьшается, а при температурах 60-65 °С форма -спектра приближается к области быстрых вращений.

Для определения количественных параметров подвижности необходимо выяснить характер движения молекулы-гостя. Для этой цели использована ЭПР спектроскопия с переносом СВЧ насыщения (ЭПР ПН). Этот подход основан на том, что спектры ЭПР ПН (Гз) существенно различны по форме для двух предельных моделей движения - быстрых либраций малой угловой амплитуды и медленных переориентаций в полном (или достаточно большом) телесном угле вследствие того, что в первом случае отсутствует перенос СВЧ насыщения [1]. В качестве диагностического параметра, чувствительного к характеру вращения, использовали отношение интенсивностей ¿"/£ (рис. 3). В модели быстрых либраций, как показывает расчет [1], это отношение больше нуля, что и наблюдается в эксперименте для всех трехкомпонентных комплексов с I. Это позволяет сделать качественный вывод, что характер движения I в комплексах представляет собой либрации малой амплитуды. В тройных комплексах с II параметр £"/£ имеет отрицательное значение, что, согласно расчетам, свидетельствует о медленном движении спин-меченого «гостя» в достаточно большом (или полном) телесном угле.

гЦД-1-С н

Лх

быстрые либрации ограниченной амплитуды

РЦД-П-С н

переориентация в полном телесном угле V

- эксперимент ■ расчет

3260 3280 3300 3320 3340 3360 Н,Гс (а)

3260 3280 3300 3320 3340 336С Н,Гс (б)

Рис. 3 Экспериментальные спектры второй гармоники поглощения в 90° фазе с модулирующим полем (Т2) при 295 К (сплошная кривая) и расчетные спектры (пунктир) для трехкомпонентных комплексов: (а) уЦД-1-Б и (б) рЦД-Н-Б. Ь,Ь- интенсивности в максимумах, соответствующих минимальной и максимальной скоростям изменения резонансного поля при изменении угла между осью г спиновой метки и направлением магнитного поля.

Были определены количественные параметры этих движений. Средние амплитуды либрации (Ав) находили из соотношения: ^¡п2 АО >= (А-, - А::)1(Л:: - (3), где А1 - перпендикулярная компонента тензора СТВ в отсутствие молекулярного движения (при 77 К). Коэффициенты вращательной диффузии П в трехкомпонентных комплексах определяли из калибровочной зависимости £(£>„), которую мы рассчитали с помощью программы Бьюдила и др.[2] в модели изотропной броуновской диффузии с использованием значений Аа, измеренных при 77 К, и индивидуальных ширин линий, найденных из спектров ЭПР комплексов.

7.77-1

ТЦД-1-С,Н|2_ А А 7,70-)

7.63-

2520-

515-&

< V

50-

А # гЦД-1-С.Н,

ж • -«•

. . в гЧД-1

150 200 250 300 350

Т, К (а)

Х-'-.

• - тЦД-н-с.н, А . уЦД-||-С Н

«7,56 -

I

I)

' 7,497.427.35-

0.0030 0,0033 0,003В 0,0039 0.0042,

1/т, к-' (®)

Рис. 4 Температурные зависимости (а) средних амплитуд либрационного движения (Ав) оси аксиальной анизотропии СТВ (оси г) для комплексов I с у-ЦД и (б) коэффициентов вращательной диффузии оя спин-меченого индола II в тройных комплексах с у-ЦД.

Амплитуды либраций, которые были определены впервые, оказались достаточно велики: 2025° при 300 К и намного больше, чем для бинарных комплексов (8° при 300 К) (рис. 4а). Коэффициенты вращательной диффузии II также значительны, они лежат в интервале 2 - 5-Ю7 с'1 в

области 230-330 К и довольно слабо зависят от температуры. Так, энергии активации величин для II в тройных комплексах с р- и у-ЦД лежат в интервале 1,2— 1,8 ± 0,2 ккап/моль (рис. 46).

Сравнение величин и Ад для комплексов разного состава обнаруживает следующие закономерности: 1) интенсивность молекулярного движения спин-меченых «гостей» в комплексах у-ЦД выше, чем в комплексах Р-ЦД, 2) выше для II по сравнению с I, 3) влияние природы второго «гостя» сильнее для комплексов с I, чем с II, причем подвижность для комплексов с I заметно выше в присутствии ЦГ, чем Б. В то же время для комплексов с II влияние природы второго «гостя» незначительно, и, в отличие от I, подвижность в присутствии Б несколько выше, чем в присутствии ЦГ. Наблюдаемые различия можно объяснить следующим образом. Большая подвижность в комплексах у-ЦД обусловлена большим размером полости у-ЦД по сравнению с р-ЦД. Большая подвижность II по сравнению с I обусловлена существенным вкладом в наблюдаемую подвижность внутримолекулярных переходов в пиперидиновом кольце II. Большая подвижность I в присутствии ЦГ по сравнению с Б, несмотря на то, что молярный объем ЦГ больше, чем у Б, обусловлена тем, что подвижность жесткой молекулы I в полости ЦД, по-видимому, в значительной степени определяется флуктуациями свободного объема вследствие конформационной подвижности ЦГ в отличие от жесткого Б. Незначительное влияние углеводорода на подвижность II может быть объяснено тем, что подвижность этого зонда в основном определяется внутримолекулярными переходами пиперидинового кольца.

Таким образом, совокупность результатов по полярности окружения и динамике спин-меченых "гостей" в комплексах Р- и у-ЦД подтверждает присутствие третьего компонента (ЦГ или Б) в составе изучаемых комплексов.

Квантово-химические расчеты. Методом РМЗ были рассчитаны структуры и энергии трехкомпонентных комплексов с (3- и у-ЦД. В этом методе не учитывается вклад гидрофобных взаимодействий в энергию связывания, однако можно сравнить устойчивость возможных структур комплексов, если для этих структур экспонирование молекул-гостей в водную фазу мало или приблизительно одинаково.

Объяснить увеличение вращательной подвижности спин-меченых индолов при введении дополнительной молекулы «гостя» в бинарные комплексы у-ЦД в рамках стехиометрии 1:1:1 весьма трудно. Тем не менее, были рассчитаны возможные структуры таких комплексов, в которых оба «гостя» (спиновый вднд и углеводород) находятся в полости одной молекулы у-ЦД, чтобы оценить энергии образования этих комплексов и сравнить их с энергиями структур 2(ЦЦ):1:1. Для р-ЦД расчеты со стехиометрией 1:1:1 не проводили, так как ранее было установлено, что более устойчивые комплексы с теми же спин-мечеными «гостями» даже в отсутствие углеводородов образуют димеры Р-ЦД.

Сравнение энергий комплексообразования для структур разной стехиометрии показало, что

образование комплексов стехиометрии 2(ЦД):1:1 энергетически более выгодно. Расчеты этих

комплексов при разных способах введения молекул-гостей показали, что для всех комплексов устойчивые состояния (с отрицательными энергиями комплексообразования) получаются при трех основных вариантах расположения гостей (рис. 5).

Рис. 5 Три варианта расположения «гостей» в полости димера р-ЦД комплекса РЦД-1-СбНб- Структуры рассчитаны методом РМЗ.

Найденные энергии и сравнение различных типов структур с данными по гидрофобности окружения спин-меченого «гостя» позволяют сделать вывод, что для большинства комплексов реализуется структура типа А, где расположение углеводорода вблизи МО-группы делает ее окружение гидофобным, что согласуется с экспериментом.

Для выяснения природы комплексов, ответственных за сильно иммобилизованные сигналы ЭПР (^-компонента, рис. 21. которые наблюдались в случае у-ЦД. было изучено в стационарном и кинетическом режимах влияние жидкой фазы углеводородов на спектры комплексов. Углеводород добавляли непосредственно в ампулу с образцом и спектры ЭПР регистрировали в разные моменты времени, начиная с 2 мин после добавления. Выдерживание твердофазных комплексов в жидком маловязком углеводороде приводит к следующему эффекту: с увеличением времени инкубации амплитуда -сигнала уменьшается, а амплитуда более заторможенного ¿2 -сигнала симбатно возрастает (рис. 6), при этом семейство спектров содержит изобестические точки, которые говорят о наличии двух состояний, переходящих одно в другое. Переход —» ¿2 имеет обратимый характер: при удалении жидкого углеводорода интенсивность ¡2 -сигнала падает, а -сигнала возрастает. Подобное поведение наблюдается для всех комплексов, где исходно присутствуют два типа сигналов.

Совокупность приведенных результатов - увеличение доли сильно иммобилизованного $2-сигнала при добавлении маловязких углеводородов, симбатное уменьшение доли комплекса, ответственного за 11 -сигнал, наличие изобестических точек и обратимость перехода ¿1 —» ¡2, можно объяснить только тем, что в присутствии жидкой фазы происходит включение второй молекулы углеводорода в уже существующий комплекс стехиометрии 2:1:1 (2ЦД:СЗ:УВ), т.е. образование комплекса состава 2:1:2.

уЦЦ-|-СД2

(1,мин)

3360 Н, Гс

Для сильно иммобилизованных комплексов 52 -типа были оценены подвижности спиновых зондов в полости у-ЦД. В случае I амплитуды либрации даже при 333 К не превышают 5-6°, т.е. происходит почти полная иммобилизация радикала при введении второй молекулы углеводорода. Значения £>я радикала II для комплексов 2уЦЦ-Н-2С6Н6 и 2уЦД-П-2СбН,2 в 610 раз меньше, чем для соответствующих .VI -комплексов.

Для проверки приведенной интерпретации

Рис. б Спектры ЭПР комплекса уЦД-1-СбНи в твердой фазе в отсутствие жидкой фазы ЦГ -

(1) и после инкубации с ЦГ в течение 2 мин были выполнены квантово-химические расчеты

(2), 60 мин (3), 3,2 часов (4), 27,4 часов (5). комплексов со стехиометрией 2:1:2. В результате На врезке: компонента т = -1 51- и ¡2-

сигналов с амплитудами А1 и А2. были получены 2 основных типа структур с

отрицательными энергиями комплексообразования (рис. 7). Из рис. 7 видно, что в обеих структурах молекулы углеводородов создают стерические препятствия для вращения спин-меченого индола, что согласуется с экспериментально наблюдаемым затормаживанием подвижности спиновых зондов в ¡2 -комплексах.

Рис.7 Структуры комплексов со стехиометрией 2:1:2, рассчитанные методом РМЗ:

(а) уЦД-П-С6Н6 -тип 1;

(б) уЦД-1-С6Н12 -тип 2

(а) (б)

Таким образом, исследование комплексов Р- и у-ЦД в твердой фазе с двумя типами молекул-гостей: спин-мечеными индолами и углеводородами (бензолом и циклогексаном), выявило влияние структуры ЦД, углеводорода и спинового зонда на стехиометрию комплексов, ориентацию спин-меченого «гостя» в полости, гидрофобность его окружения и молекулярную динамику. Обнаруженное увеличение вращательной подвижности и гидрофобности окружения спин-меченых «гостей» в тройных комплексах по сравнению с бинарными комплексами, зависит от природы

второй молекулы-гостя, что позволяет осуществлять регуляцию динамики и гидрофобности окружения функциональной молекулы-гостя.

В четвертой главе диссертации изучены закономерности образования и структуры комплексов ЦД в растворе со спин-мечеными аналогами холестерина - 3-доксил-17|5-гидрокси-5а-андростаном (А5Ь) и 3-доксил-5а-холестаном (СвЬ) (рис. 8). В качестве молекул-хозяев использовали гидроксипропил-рЦД (гп-рЦЦ), в котором в среднем 7- первичных ОН-групп замещены на гидроксипропильные остатки, и метил-р-ЦД (м-рЦД), где в среднем 7 первичных и б вторичных ОН-групп замещены на мегокси-группы.

Н,С, х> а ..СН,

7 ^ > 26

V -р л СН, н >

I н 1 н

СН,

сн,1 Н | 10

^ю ¿^в^: 15 -0;1 н

НэСЛ М-0-сн3

Образование комплексов с гп- и м-рЦД

проявляется, во-первых, в резком

увеличении растворимости обоих

аналогов холестерина в водной фазе. На

рис. 9 приведены спектры АБЬ в воде и

растворах гп- и м-РЦД. Видно, что за

АвЬ СЧСТ комш1ексо°бразования концен-

Рис. 8 Структуры спин-меченых аналогов холестерина: трация АЭЬ увеличивается почти на 3 холестана (СБЬ) и андростана (АвЬ).

порядка. Во-вторых, изменяется форма спектров ЭПР зонда: вследствие замедления вращательной диффузии при образовании комплекса возникает релаксационное уширение, что приводит к исчезновению суперсверхтонкой структуры, обусловленной протонами метальных групп зонда. В-третьих, уменьшается полярность окружения КО-группы, что видно по уменьшению константы сверхтонкого взаимодействия . Для всех комплексов методом

а51-и-11цд

3340 3360 Н, Гс

Рис. 9 Спектры ЭПР андростана растворимости были определены стехиометрия и константы

(АБЬ) в воде (концентрация А5Ь „ 1П

0,006 мМ) и в комплексах с связывания комплексов. На рис. 10 показаны зависимости

циклодекстринами: А8Ь-гп-рЦД суммарной концентрации зонда в растворе от концентрации (концентрация гп-рЦЦ - 4 мМ;

концентрация АБЬ - 1,76 мМ); АЭЬ- ЦД. Из рисунка видно, что в случае АБЬ зависимости м-рЦД (концентрация м-РЦД - 4

мМ; концентрация АБЬ - 2,3 мМ). хорошо описываются прямыми линиями, что

свидетельствует о стехиометрии 1:1 для обоих ЦД. Для комплексов СвЬ эти зависимости нелинейны. Моделирование показывает, что для СвЬ реализуются как комплексы 1:1, так и 1:2. Константы связывания всех комплексов даны в таблице 3. Значения для АБЬ значительно больше соответствующих величин для комплексов СЭЬ.

0,0024 л 0,0020

1 <

^ 0,000« а

0,0004 0,0000

Авц-м-рцД

'' АЗи-т-рЦД

.8 ■

0,000 0.001 0,002 0.003 0,004

идм (а)

¿0,08 §

^0,09 .

I

** 0,04 .

3 : |0,08 :

о 0,01 .

^0.00.

- ¿0,025

I

^0,020 I

¿0.015

0

3*010

1

со О,ОС»

0,10 0.15

(6)

0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

•Ч1ЦДМ (в)

Рис. 10 Зависимости концентрации (а) АвЬ в водном растворе от концентрации м-рЦД (•) и гп-РЦД (■); зависимости концентрации СвЬ в водном растворе от концентрации ЦД: С5Ь-гп-|ЗЦЦ (б), СБЬ-м-РЦД (в). Температура 295 К. Пунктирные линии - моделирование с использованием нелинейного метода наименьших квадратов. Константы комплексообразования, полученные из моделирования, приведены в таблице 3.

Это различие можно объяснить большими размерами СвЬ, который не умещается в одной молекуле гп-р-ЦД или м-р-ЦД, и часть его экспонирована в водную фазу, что приводит к дестабилизации комплекса за счет понижения энтропии окружающих молекул воды.

В то же время молекула АБЬ может быть практически полностью включена в полости обоих ЦД (см. ниже результаты квантово-химическнх расчетов).' Ббльшие значения К^ для комплексов обоих спиновых зондов с

Комплекс К, (М-1) К2 (М-1)

АЗЬ-гп-рЦД 1,06'Ю5 -

АвЬ-м-рЦЦ 2,1910' -

С81^гп-рЦД 410^ 1,1-ю1

СБЬ-м-рЦД 1,0-103 1,45-Ю4

Таблица 3 Константы связывания м-рЦД по сравнению с гп-рЦД могут быть связаны с спин-меченых андростана (АБЬ) и

холестана (СЭМ с гидроксипропил-рЦД ббльшими размерами гидрофобной полости м-рЦЦ за и метил-рЦД. К\ соответствует стехиометрии комплекса 1:1, К.2 - стехио- счет более полного замещения ОН групп на заместители, метрии 1:2. Средние погрешности при

определении К/, К2-6 %. Для определения локализации ЫО-группы молекул-

гостей в комплексах и ее доступности водорастворимым агентам были измерены параметры гидрофобности окружения и скорости спинового обмена с парамагнитными ионами никеля.

Спиновый обмен измеряли по уширению компонент СТВ спектра ЭПР в присутствии различных концентраций этих ионов. Константы скорости обмена (кех) для несвязанного радикала АБЬ и

Комплекс с,™ (Гс) А *е(Г ("С) кех (с-'М-')

АБЬ-НгО 15,8 0 0,42 5,0510®

А8Ь-гп-рЦД 14,93 0,3 0,7 4,210'

АЯЬ-м-ЩД 14,31 0,38 0,49 1,8-10'

СБ^гп-РЦД 14,91 0,36 1,62 7,610'

СБЬ-м-рЦД 14,31 0,38 0,88 2,8510'

Таблица 4 Параметры гидрофобности локального окружения Ш-группы (А), эффективные изотропные всех четырех комплексов приведены в времена корреляции вращения (тср) и константы скорости спинового обмена (ка) с ионами N1 для комплексов таблице 4. спин-меченых андростана (АвЬ) и холестана (СвЬ) с ,, ,

гидроксипропил-РОД и метил-рЦД. Средние погрешнос- Из таблицы видно, что для ти в определении величин а*. = ± 0,04 Гс. Средние комплексоа А5Ь и С8Ь с обоими цц относительные погрешности в определении величин т,д -

6%,ка~ 10%. константы скорости обмена в среднем

на порядок меньше значений кех для свободного зонда в воде. При этом величины кех для комплексов обоих радикалов с м-рЦД заметно меньше, чем для комплексов с гп-рЦД. Эти

результаты позволяют сделать вывод, что >Ю-группа в комплексах не экспонирована в водную фазу, а находится в полости ЦД или вблизи ее границы с водной фазой, причем в комплексах с м-РЦЦ она менее доступна для водорастворимых реагентов, чем в комплексах с гп-рЦД, благодаря большему размеру гидрофобной полости в м-РЦД. В таблице 4 приведены также значения параметра гидрофобности окружения ЫО-группы (А) и величины эффективного времени корреляции вращения спинового зонда в модели изотропного вращения, рассчитанные по формулам:

^=6.65-10-"'-ДЯ+1.((/+1//.1)1/2-1), (4); й = (5)

"От

где 1±1 - амплитуды компонент сверхтонкой гДе а>а»"ат значения ош,

структуры (СТС) т = ±1, ДЯ+1 - ширина соответственно, в комплексе, в воде и

низкопольной компоненты СТС между толуоле. В гидрофобном окружении экстремумами.

(толуоле) и воде величина к равна соответственно 1 и 0.

Видно, что для всех комплексов А значительно отличается от 0. При этом для комплексов с м-РЦЦ окружение 1>Ю-группы несколько более гидрофобно, чем для комплексов с гп-рЦД, что коррелирует с отмеченными различиями в скоростях спинового обмена у этих комплексов.

Для определения наиболее стабильной структуры комплексов были проведены квантово-химические расчеты. Методом РМЗ были рассчитаны энергии и геометрии комплексов при различных способах введения молекул-гостей. На рис. 11 приведены наиболее устойчивые структуры комплексов АБЬ-м-РЦД и С5Ь-гп-рЦ Д.

Видно, что для комплексов ЛБЬ МО-

группа находится примерно на границе

полостей ЦД и водной фазы, что

качественно согласуется с данными по

гидрофобности окружения и спиновому

обмену. Для СвЬ наиболее устойчива

структура со стехиометрией 1:2, где

спиновый зонд полностью включен в

Рис. 11 Наиболее устой- полость димера ЦД. чивые структуры комплексов СБЬ с гп-рЦД (а) Изучение вращательной диффузии

и АБЬ с м-рЦД (б), „„„

рассчитанные методом путем моделирования спектров ЭПР

РМЗ.

а позволяет оценить размеры и форму вращающейся частицы. Моделирование проводилось с использованием ранее цитированной программы Бьюдила и др. [2]. На рис. 12 приведены экспериментальные и расчетные спектры ЭПР, а в таблице 5 представлены коэффициенты вращательной диффузии комплексов вокруг коротких и длинной (-О//) осей. Из величин и й//у аппроксимируя комплексы круговыми цилиндрами и используя гидродинамическую теорию вращения цилиндров [3], были определены "гидродинамические"

размеры комплексов - длина и диаметр , которые также приведены в табл. 5. Из данных таблицы 5 следует, во-первых, что вращательная диффузия всех комплексов существенно анизотропна, причем отношения £Ы/2ЛМ значительно превышают отношения размеров вдоль геометрических осей комплексов, которые были определены из расчетных структур. Во-вторых, для комплексов обоих спиновых зондов с гп-рЦД вращательная диффузия вокруг обеих осей существенно медленнее, чем для комплексов с м-рЦД, что может быть обусловлено относительно большими гидродинамическими размерами вдоль длинной и коротких осей комплексов с гп-рЦД по сравнению с комплексами м-рЦД.

АЗЬгп-рЦД

Комплекс (10"' с') Щ (10-" с1) Р (град)

АвЬ-гп-РЦД 1,4 5,34 0 28,1 8,9

А5Ь-м-РЦД 2,34 6,7 0 21,9 8,8

С8Ь-гп-рЦД 0,69 1,9 0 32,5 13,4

СБЬ-м-риД 1,2 3,5 0 27,5 10,8

Таблица 5 Коэффициенты вращательной диффузии вокруг длинной молекулярной оси (О//) и вокруг коротких осей (ОД гидродинамические длина (Ьы) и диаметр (2Яьа) комплексов спин-меченых андростана (АБЬ) и холестана (СБЬ) с гидроксипропил-Р-ЦД (гп-рЦД) и метил-Р-ЦД (м-рЦД). определенные из моделирования спектров ЭПР Рис. 12 Экспериментальные спект- В°ЛНЬ1Х растворов комплексов и теории гидро-ры ЭПР комплексов (сплошные

™ * ^ " 8

центрация м^рЦД 4 С8Ь-м-рЦД Э™ особенности, по-видимому, обусловлены различиями в

(концентрация м-рЦД 20 мМ), СвЬ структуре обоих ЦД, а именно, менее полной гп-рЦД (концентрация гп-рЦД 20

мМ). модификацией ОН-групп в гп-рЦД, о которой говорилось

ранее. В результате, благодаря наличию свободных ОН-групп возможна ассоциация с другими молекулами гп-рЦД или молекулами воды, вследствие чего гидродинамические размеры этих комплексов возрастают вдоль длинной и коротких осей. В случае комплексов м-рЦД эффекты ассоциации проявляются, в основном, в увеличении длинной оси вращающегося комплекса. Таким образом, изучение вращательной динамики позволило выявить взаимодействия комплексов между собой и с молекулами растворителя, что трудно сделать другими методами.

Взаимодействие ЦД с липидными мембранами. Одним из важнейших применений ЦД может быть транспорт холестерина (Хол) в биологических системах и регуляция уровня Хол в мембранах. Возможность исследования таких процессов была изучена с помощью спин-меченого аналога холестерина - 3-доксил-17р-гидрокси-5а-андростана (АБЬ).

На рис. 13 показан спектр ЭПР этого зонда в мультибислойной мембране димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ). При добавлении 10 мМ гп-рЦД спектр ЭПР резко изменяется и по форме практически соответствует спектру комплекса андростана с гп-рЦД в водном растворе.

3320 3340 3360

Н, Гс

пмФх-лги Ранее в работе [4] было показано, что Р-ЦД при концентрациях

ДМФХ-АБ1.-ГП-РЦД

ниже 15 мМ не вызывает дезинтеграции мембран ДМФХ. Это означает, что добавление гп-рЦД приводит к переходу андростана из мембраны в водную фазу с образованием комплекса с гп-рЦЦ. Определение коэффициента распределения АБЬ между производными Р-ЦЦ и липидной мембраной при знании константы связывания АБЬ с ними (см. табл. 3)

ДМФХ-Хол-А31. т« 18,7 °С

Рис. 13 Спектры ЭПР андростана позволяет вычислить свободную энергию переноса этого (А8Ь) в чистой липидной мем- ,, „ , ,

бране ДМФХ (") и после анал°га Хол из водной фазы в мембрану, что практически гидроксипропил-рЩЦ-)РаСТВ°Ра невозможно сделать прямым методом вследствие его

чрезвычайно низкой растворимости в воде. Двухкомпонентные мембраны ДМФХ/Хол. Перенос АБЬ между мембраной и гп-рЦД в водном растворе имеет место и для двухкомпонентных мембран. Показано, что концентрация АБЬ в водной фазе, которая характеризует коэффициент распределения АвЬ между мембраной и гп-рЦД в растворе, резко изменяется в области сосуществования двух липидных фаз - жидкой неупорядоченной (Ь(1) и жидкой упорядоченной (Ьо) (рис. 14) . Этот результат, очевидно,

обусловлен тем, что растворимость зонда максимальна в областях фазового разделения. Наблюдаемый эффект может быть использован для определения фазовых границ в холестеринсодержащих липидных мембранах и, в частности, областей сосуществования Ы и Ьо фаз, где, как известно, формируются домены Ьо фазы (рафты),

воо ^......• выполняющие биологически важные функции в

плазматических мембранах.

0 10 20 30 40

холестерин, % Трехкомпонентные_мембраны_пальмитоил-

Рис. 14 Зависимость интенсивности сфингомиелин (ПСМУ пальмитоил-олеоил-фосфатидил-центральной компоненты спектра * ^ , .

ЭПР андростана (АвЬ) в водной фазе, холин (ПОПС)/ холестерин (Хол). Эти мембраны близко

содержащей 10 мМ гп-рЦД, от доли моделируют по ХИМИческому составу основные холестерина в двухкомпонентнои

мембране ДМФХ/Хол, к которой был компоненты наружных слоев клеточных мембран. В добавлен раствор ЦД. Разные фазы

липидной мембраны обозначены качестве спиновой метки использован фосфолипид, в символами: Ьс1 - неупорядоченная

жидкая фаза, Ьо - упорядоченная котором парамагнитная доксильная группа ковалентно

жидкая фаза, Ьс1+Ьо - область сосу- присоединена к одной из ацильных цепей в 14-ом ществования двух фаз. Обозначение

положении относительно карбоксильного атома углерода

фаз на графике соответствует зовой диаграмме системы ДМФХ/ Хол, приведенной в работе [51.

(14-РС8Ь).

1 - исходная мембрана

2 - после добавления м-рцД

3 - мембрана другого состава

3260 3280

3300 3320

Н, Гс

3340 3360

При выдерживании мембран с 10 мМ м-рЦД наблюдалось уменьшение параметра

анизотропии 2А„ в спектре ЭПР. Этот эффект можно

объяснить частичной экстракцией Хол из мембраны, что

приводит к уменьшению ее степени упорядоченности,

проявляющемуся в уменьшении 2А„. Количество

экстрагированного Хол было оценено путем сравнения

конечного спектра и спектров мембран с различным

содержанием Хол вдоль вертикальной прямой на фазовой

диаграмме. В зависимости от состава мембран

Рис. 15 Влияние метил-рЦД на спектр наблюдалась разная степень влияния ЦД, в некоторых ЭПР спиновой метки Н-РСЭЬ в

мембране состава 33%ПСМ/ случаях содержание Хол в мембране уменьшалось на 18 33%ПОПС/ 33%Хол. Исходный спектр

мембраны в отсутствие ЦД (1), спектр %• Более точное определение количества

той же мембраны после инкубации в ,

течение 120 мин с 10 мМ метил-рЦД экстрагируемого и вводимого в мембраны Хол методом

(2), спектр ЭПР мембраны состава ,

40%ПСМ/ 40%ПОПС/ 20%Хол (3), ЭПР возможно путем построения калибровочных

инкубации °с ^ц[д'е ™ То^тствус? зависимостей спектральных параметров от содержания

уменьшению содержания Хол в Хол в мембране, мембране на 13%. г

Таким образом, полученные результаты представляют интерес не только для изучения

взаимодействия липидных мембран с циклодекстринами, но и для разработки количественного

метода определения экстрагируемого из мембран или вводимого в них холестерина.

В пятой главе диссертации, в

Н,сЯз

'он, Нзс4чы^Нз

* н'с 5. СНз „А«

н К6С0

нз<=^Нз

Те мпо ил-капр ил ат (р/У

А'

ТеипоСП)

'N-0 /

"ген,

СНЭ 3

НзС^

'(СН2)М-

ннУ

НЭС-

Темпоил-пальмитамид СЛ)

НэС^

(СН2)7

и

НэС- N -сн3

СНэ

. - , - , , НэС ^ СНэ

Темпоил-изотиоцианат (Ш)

"з^Нэ

.-О

X

'^(СН2)10- -0 Темпоил-лаурат (V)

НзС-^0112)10"

5-доксил стеариновая

(VII)

л

НзС

..-О

(СН2)12^

-СООН

"3е , ,

Н3С N

131, V, 13

о"

0 >1-0 Ч™

СН, ■

16-докснл Нэ стеариновая к-та СШ)

связи с перспективами применения ЦД в качестве молекулярных рецепторов в хемосенсорах, исследовано влияние

иммобилизации ЦД на межфазной границе микрочастиц носителя (силикагеля) на динамику спин-СООН меченых молекул-гостей -аналогов аналитов и их комплексообразование с ЦД. В качестве носителя использованы микрочастицы силикагеля, с поверхностью которых были

Рис. 16 Структуры спиновых зондов (АПТМС) циклодекстрины двух типов: р-ЦД и фенил-рЦД.

ковалентно связаны через линкер 3-аминопропил-триметоксисилан

Методология работы состояла в использовании стабильных нитроксильных радикалов разной структуры, растворимости, заряда (рис.16) и исследовании спектров ЭПР этих зондов в зависимости от типа частиц, их концентрации и температуры.

Молекулярная динамика. На рис. 17 приведены спектры ЭПР зонда VI в присутствии трех типов микрочастиц силикагеля: с р-ЦД (С-РЦД), фенил-рЦД (С-ФрЦЦ) и аминопропильными группами (С-АП) на поверхности.

Рис. 17 Спектры ЭПР Темпоил-пальмитамида (VI) в суспензиях микрочастиц силикагеля с функциональными группами на поверхности: а) с Р-ЦД; б) с фенил-рЦД; в) с аминопропильными группами. Концентрация спинового зонда составляет 2-1(Г4 М.

Поскольку силикагели С-РЦД и С-ФРЦЦ могут содержать немодифицированные циклодекстринами аминогруппы на поверхности, нам представлялось важным в качестве сравнения исследовать спектры ЭПР тех же зондов на силикагеле, содержащем только аминопропильные группы. Этому условию удовлетворяет сорбент С-АП. Спектры частиц С-АП сильно отличаются от спектров С-РЦД и С-ФрЦД, содержащих ЦД (см. рис. 17): они слабее по интенсивности, содержат сигнал от свободных зондов в растворе и синглет в центральной области, обусловленный, по-видимому, агрегацией зондов на поверхности частиц. Подобные спектры наблюдаются и для других зондов на частицах С-АП. Таким образом, спектры ЭПР от частиц C-РЦД и С-ФРЦД принадлежат комплексам «гость-хозяин» с ЦД на поверхности частиц.

Из рис. 17а видно, что спектры VI на частицах С-РЦД содержат два типа сигналов, соответствующих сильно (s) и слабо (w) иммобилизованным спиновым зондам. Исследование температурных зависимостей спектров ЭПР показало, что на частицах С-ФрЦД с повышением температуры также проявляются два типа сигналов - s и w (см. рис. 18).

В спектрах ЭПР спиновых зондов III-VI и IX, у которых длинная ось радикала параллельна связи N0 (ось X в магнитной системе координат), а также в спектре доксил стеарата VIII, у которого длинная ось параллельна я-орбите неспаренного электрона (ось Z), также наблюдаются сигналы и» для обоих типов частиц.

С ростом температуры доля w -сигналов возрастает, а s-сигналов падает (рис. 18). Времена корреляции вращения для w -сигналов лежат в наносекундном диапазоне, поэтому они не могут принадлежать свободным зондам. Кроме того, поскольку интенсивности w -сигналов значительно возрастают с ростом температуры, они не являются перпендикулярными компонентами s -сигнала.

1 Т = 10 "С

2 Т = 16 "С

3 т = 22 °С

4 т = 35 "С

5 т = 50 °с

6 т = 59 "с

3280 3300 Н, ГС

Рис. 18 Спектры ЭПР

16-доксил

Следовательно, и<-сигналы также принадлежат комплексам «гость-хозяин», вращательная подвижность которых значительно выше, чем 5-сигналов.

Поскольку большая часть радикалов имеет несферическую форму, разумно считать, что их вращение в составе комплексов является анизотропным с осью симметрии вращения, параллельной длинной молекулярной оси. Для радикалов Ш-У1 связь N0 параллельна углеводородной цепи, которая является длинной осью и, по-видимому, этой цепью радикалы

стеариновой кислоты (VIII) в суспензии включаются в полость ЦД. Подтверждением этого частиц силикагеля с фенил-рЦД на

поверхности при различных температурах, предположения служит тот факт, что форма Символами s и w обозначены сильно и

слабо иммобилизованные компоненты спектров ЭПР этих радикалов в комплексах С-рЦД спектра ЭПР соответственно.

характерна для случая быстрого вращения вокруг

осиЛГ[6].

Наличие двух сигналов j и w с неизвестными коэффициентами вращательной диффузии, индивидуальными ширинами и мольным отношением s/w делает неоднозначным прямое моделирование спектров ЭПР. Поэтому мы определяли коэффициенты одноосной вращательной диффузии (R„) для сильно иммобилизованных спиновых зондов (i-сигналы) из калибровочных

зависимостей параметра S = 1- Azz / А22 от R//, рассчитанных с использованием программы Бьюдила и др. [2]. Для радикалов VII и VIII длинная ось молекулы параллельна оси Z .Вращение вокруг этой оси не должно изменять параметры Az7 и S. Следовательно, наблюдаемые изменения

А22, по-видимому, обусловлены либрационными движениями этой оси в комплексе с ЦД. Амплитуды быстрых либраций (ДО) радикалов VII и VIII определяли из соотношения (2). Значения В.ц и Ав для всех зондов представлены в таблице 6. Для большинства спиновых зондов наблюдается следующая закономерность: вращательная подвижность меток на частицах С- рЦД значительно выше, чем на частицах С-ФРЦД. Этот результат можно объяснить тем, что фенильные группы создают пространственные ограничения как для вращения молекулы «гостя» в полости ЦД, так и для комплекса в целом. Энергии активации вращения сильно иммобилизованных зондов в С-ФРЦД, определенные из температурных зависимостей R//, лежат в интервале 4-5 ккал/моль. Для w -сигналов при температурах 40-60 °С, когда форма спектра ЭПР соответствует области быстрых вращений, времена корреляции вращения в приближении изотропного вращения лежат в

Радикал Я/1, с"' (293 К); Дв, град. А (77 К)

с-рцд с-Фрцд с-рцд с-Фрцд

1 (1,9±0,2)-106 7,2-106 0,95 0,6

11 > 108 (3,5±1)-107 0,6 0,11

III (3,1±0,2)108 (2,0±0,4)-107 1,21 0,26

IV > 108 (2,45±0,3)-107 1,01 0,51

V > 108 (2,45±0,3)-107 - -

VI (5,3±0,3)-107 (2,15+0,25)-107 0,4" 0,35"

VII 19,2±0,3° 15,8±0,2° 0,54' 0,52"

VIII 20,5±0,4° 16,8±0,2° 0,85" 0,625"

IX (1,2±0,1)107 (1,1±0,1)-107 0,1" 0,11"

нтервалах 1,2-1,9 не для частиц С-РОД и 1,8-4,6 не для С-ФрЦД.

Полученные результаты

позволяют сделать заключения о природе и и» -состояний.

Возможны две альтернативные модели: (1) одно из состояний (5) соответствует радикалам,

адсорбированным на поверхности силикагеля, а второе (и>) комплексам с ЦД и (2) оба состояния

Таблица 6 Коэффициенты вращательной диффузии вокруг относятся к комплексам с ЦД.

длинной молекулярной оси (Д„), угловые амплитуды Следующие экспериментальные

либраций (АО) и параметры гидрофобности окружения (А)

сильно иммобилизованных зондов (¡-сигнал) на частицах С- данные свидетельствуют в пользу РЦД и С-ФрЦД. "Величина к рассчитана по уравнению (2),

исходя из среднего значения разности 2^-2^=8 Гс. второй модели: 1) резко различные

Средние относительные погрешности при определении , _

у , г г г « формы спектров спиновых зондов для

параметров й для спиновых зондов, связанных с С-РЦЦ * ^

-5%, с С-ФРЦД-11%. не содержащего ЦД сорбента С-АП и

исследуемых образцов С-РЦЦ, С-ФРЦД, 2) зависимость формы спектров ЭПР обеих компонент 5 и V! от структуры ЦД - рЦД и ФрЦД и, наконец, 3) температурные изменения: увеличение с ростом температуры интегральной интенсивности и>-сигнала и симбатное уменьшение интенсивности л -сигнала (см. рис. 18). Последний результат позволяет предположить, что обе компоненты соответствуют двум состояниям комплексов «гость-хозяин» с ЦД, находящимся в равновесии друг с другом: сильно заторможенная компонента (5) относится к комплексам, сорбированным на поверхности микрочастиц, а слабо заторможенная и>-компонента - к десорбированным комплексам, вращательная подвижность которых определяется конформационной гибкостью линкера. Эта гибкость и достаточная длина линкера делают также возможными переходы между к-и! -состояниями.

Полярность окружения. Наряду с молекулярной динамикой важными параметрами спин-меченых аналитов, полученными из спектров ЭПР, являются значения гидрофобности их локального окружения А (см. уравнение (4)). Значения А для э-сигналов приведены в таблице 6. Эти данные содержат два интересных и неожиданных результата. Во-первых, абсолютные значения А достаточно велики и для ряда зондов намного больше, чем для комплексов этих зондов с ЦД в растворах. Во-вторых, окружение в С-ФРЦД, как правило, более полярно, чем для частиц С-РЦД, хотя фенильные группы в С-ФрЦД должны увеличивать гидрофобность окружения. Интересно также, что гидрофобность окружения в десорбированных »-комплексах, судя по значениям изотропной константы СТВ, значительно меньше, чем в л -состояниях, и близка к значениям А для

комплексов в растворах. Эти результаты можно объяснить тем, что при 77 К ббльшая часть комплексов контактирует с поверхностью частиц, которая имеет гидрофобный характер. Фенильные группы стерически экранируют зонды от поверхности, в результате на частицах С-РЦД окружение более гидрофобно за счет свободного доступа к поверхности. Степень экранирования зондов зависит от их локализации в комплексе с ЦД; например, МО-группа катион-радикала IX не встраивается ни в РЦД, ни в ФРЦД, и параметры А имеют почти одинаковые низкие значения для С-рЦД и с-фрцд.

Константы комплексообразования. Для определения влияния поверхности микрочастиц на связывание спин-меченых молекул с ЦД были изучены изотермы связывания водорастворимых зондов II и IX с обоими типами частиц и в водных растворах Р-ЦД. Для зонда II константы связывания в растворе, на частицах С-рЦД и С-ФрЦД равны соответственно 1,2-Ю3, 2,1-Ю3 и 2,7-Ю3 М"1. Для зонда IX эти величины равны соответственно 1,2-10'', 3,2-Ю3 и 3,5-103 М"1. Эти результаты показывают, что 1) влияние поверхности на константу связывания сравнительно невелико по абсолютной величине и 2) знак этого влияния зависит от структуры зонда и характера его встраивания в комплексе с циклодекстрином. Нельзя исключить, поэтому, значительно более сильных эффектов поверхности для других аналитов и других способов иммобилизации циклодекстринов.

Конкурентное связывание спин-меченой молекулы и аналита с ЦД. На примере адамантанола в качестве аналита была изучена возможность детектирования диамагнитного аналита в водной

среде методом ЭПР. В присутствии аналита вследствие его конкуренции со спиновым зондом за молекулу «хозяина» (ЦД) следовало ожидать появления или увеличения интенсивности сигнала от свободного зонда. На рис. 19 показаны спектры радикала I в дисперсии частиц С-ФРЦД до и после добавления 0,2 мМ адамантанола. Видно, что в присутствии адамантанола сигнал от комплекса уменьшается, а от свободного зонда возрастает. Доля I, замещенного на адамантанол, составляет 24 %. Этот результат демонстрирует возможность создания парамагнитного сенсора для детектирования непарамагнитных и нефлуоресцентных молекул, в котором регистрация аналита производится по уменьшению доли связанного с ЦД спинового зонда или ковалентно связанной спиновой метки.

-1-С-ФрЦД

........1-С-ФрЦД-адамантанол

Н, Гс

Рис. 19 Спектры спин-меченого индола (I) в суспензии частиц С-ФРЦД: исходный спектр I без адамантанола (—), спектр I в присутствии адамантанола (.....). Концентрация спинового зонда в суспензии 2-Ю"4 М. Доля твердой фазы в суспензии 4% \у/\у.

Основные результаты и выводы:

1. Впервые получены и исследованы методом ЭПР трехкомпонентные комплексы Р- и у-ЦД с двумя типами молекул-гостей: спин-мечеными индолами различной структуры и углеводородами (бензол, циклогексан). Совокупность экспериментальных данных и квантово-химические расчеты показывают, что комплексы имеют стехиометрию 2ЦД:1 спиновый зонд: 1 углеводород, а в избытке углеводорода образуются комплексы со стехиометрией 2:1:2.

2. Установлено влияние структур ЦД, второго «гостя» (углеводорода) и самой функциональной молекулы (спинового зонда) на молекулярную динамику, гидрофобность окружения зонда и его ориентацию в полости. Тем самым экспериментально показана возможность существенной модификации и регуляции свойств функциональных молекул путем введения второго «гостя» в полость ЦД.

3. Впервые получены комплексы спин-меченых аналогов холестерина - андростана и холестана с ЦД различной структуры. Определены стехиометрия и константы связывания комплексов, параметры их динамической структуры; на основании экспериментальных данных и расчетов предложены пространственные структуры комплексов. Путем моделирования спектров ЭПР определены коэффициенты анизотропной вращательной диффузии комплексов, которые свидетельствуют об образовании ассоциатов комплексов с молекулами воды и ЦД в водных растворах.

4. Обнаружен обратимый перенос спин-меченого аналога холестерина между липидной мембраной и водным раствором ЦД. Коэффициент распределения зонда чувствителен к природе липидных фаз и фазовому разделению в двухкомпонентных холестеринсодержащих мембранах.

5. Обнаружено сильное влияние ЦД на форму спектров ЭПР липидных спиновых зондов в трехкомпонентных холестеринсодержащих мембранах, обусловленное экстракцией холестерина. Показана возможность количественного определения доли холестерина, экстрагируемого из мембраны или вводимого в нее с помощью ЦД.

6. Изучена молекулярная динамика спиновых зондов различной структуры в комплексах ЦД, ковалентно связанных с микрочастицами силикагеля. Обнаружено два состояния спиновых зондов с различной вращательной подвижностью и полярностью окружения. Совокупность результатов показывает, что сильно иммобилизованное состояние соответствует комплексу с ЦД, сорбированному на гидрофобных участках поверхности микрочастиц, а слабо иммобилизованное состояние — десорбированному комплексу, подвижность которого определяется конформационной гибкостью линкера. Определены параметры молекулярной динамики спин-меченых молекул-гостей в обоих состояниях.

7. Определены константы связывания (К) спиновых зондов разной структуры и заряда с микрочастицами силикагеля, содержащими ковалентно связанные Р-ЦД и фенил-рЦЦ. Влияние

поверхности на величину К сравнительно невелико по абсолютной величине, и знак этого влияния зависит от структуры зонда и характера его встраивания в комплекс с ЦД.

8. Обнаружено конкурентное связывание спин-меченых молекул и аналита с цикподекстринами, иммобилизованными на микрочастицах, которое может быть использовано для создания «парамагнитных» хемосенсоров.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Лившиц В. А., Демишева И. В., Дзиковский Б. Г., Авакян В. Г., Алфимов М. В. "Структура и молекулярная динамика трехкомпонентных комплексов циклодекстринов со спин-мечеными индолами и углеводородами в твердой фазе. ЭПР спектроскопия и квантово-химические расчеты." //Изв. АН, Сер. хим. - 2006. -№ 12.-С. 2081-2093. [Дгш. Chem. Bull., 2006, 55, №12, pp. 2161-2173 (Engl. Transl.)]

2. Демишева И. В., Лившиц В. А., Алфимов М. В. "Трехкомпонентные комплексы включения циклодекстринов со спин-мечеными индолами и углеводородами. Комплексы стехиометрии 2:1:2 и частичная диссоциация спин-меченых гостей в присутствии жидкой фазы углеводорода." // Изв. АН, Сер. хим. - 2006. - № 12. - С. 2094-2100. [Дим. Chem. Bull., 2006, 55, №12, pp. 2174-2180 (Engl. Transl.)]

3. Лившиц В. А., Демишева И. В., Алфимов М. В. "Исследование методами ЭПР спектроскопии и квантовой химии комплексов гость-хозяин спин-меченых аналогов холестерина с циклодекстринами". И Российские нанотехнологии. -2008. -Т.З - выпуск 7-8.-С. 6-15.

4. Лившиц В.А., Демишева И.В., Марш. Д. "Самоорганизация и фазовая структура трехкомпонентных липидных мембран. Исследование методом ЭПР спектроскопии спиновых зондов." // Российские нанотехнологии. - 2010. - Т. 5 - выпуск 9-10. - С. 27-34.

5. И. В. Ионова, М. В. Алфимов, В. А. Лившиц "Исследование методом ЭПР влияния ковалентной иммобилизации циклодекстриновых рецепторов на микрочастицах силикагеля на динамику и комплексообразование спин-меченых молекул-гостей." // Российские нанотехнологии. - 2010. - в печати.

6. Livshits V. A., Demisheva I. V., Avakian V. G. "Structure and guest molecular dynamics of the ternary complexes of |3- and y- cyclodextrins with spin-labeled indoles." II Xth International seminar on inclusion compounds (ISIC-IO) - Kazan. - Russia. - September 18-22, 2005. - P. 49.

7. Demisheva I. V., Livshits V. A. "Three-component P(y)-CD-spin labeled indole-hydrocarbon complexes. Guest partition and appearance of 2:1:2 stoichiometry in presence of liquid hydrocarbons." // Xth International seminar on inclusion compounds (ISIC-10) - Kazan. - Russia. -September 18-22, 2005. - P. 51.

8. Demisheva I. V., Livshits V. A. "Magnetic resonance study of structure and molecular dynamics of cyclodextrin ternary complexes." // AMPERE XIIINMR School - Zakopane - Poland. - June 5-10, 2005.-P. 65.

9. Демишева И. В., Авакян В. Г., Лившиц В. А., Алфимов М. В. " Трехкомпонентные комплексы гость/хозяин спин-меченых индолов с циклодекстринами и углеводородами как модель управляемой супрамолекулярной системы. Влияние структуры молекул гостей и ЦД на полярность окружения и динамику спин-меченого гостя." // XLVIII научная конференция МФТИ, Часть IV. - Москва. - Россия. - 25-26 ноября 2005 г. - С. 56-58.

10. Демишева И. В., Лившиц В. А., Алфимов М. В. "Динамика и распределение спин-меченого гостя в трехкомпонентных комплексах включения с циклодекстринами в присутствии жидкой фазы углеводорода." // XLVIII научная конференция МФТИ, Часть IV. - Москва. - Россия. -25-26 ноября 2005 г. - С. 59-61.

11. Livshits V. A., Demisheva I. V. "Non-linear EPR in studying dynamic heterogeneity of the ternary guest/host complexes with spin-labeled indoles and hydrocarbons." // IV International Symposium "Design and Synthesis of Supramolecular Architectures". - Kazan. - Russia. - May 13-17, 2006. -P. 105.

12. Демишева И. В., Лившиц В. А. "Исследование методом ЭПР комплексов включения спин-меченых производных андростана и холестана с циклодекстринами." // IVмолодежная школа-конференция "Магнитный резонанс и его приложения. " - Санкт-Петербург. - Россия. - 3-7 декабря, 2007 г. - С. 112-114.

13. Demisheva I. V., Livshits V. A., D. Marsh "Dynamic structure and phase behavior of the model lipid membranes, containing cholesterol. Spin label ESR study." // 4,h European EPR Federation Summer School in Advanced Techniques in EPR - St Andrews. - Scotland. - August 22nd - September 01", 2008.-P. 18.

14. V. A. Livshits, I. V. Demisheva "Guest/host complexes of spin-labeled biomolecules with cyclodextrins and their interaction with lipid membranes" // 5' International Conference on Nitroxide Radicals (SPIN 2008) - Ancona. - Italy. - 7-11 September, 2008. - L9.

15. I. V. Demisheva, M. V. Alfimov, V. A. Livshits "Complexation and molecular dynamics of spinlabels in guest/host complexes with cyclodextrin covalently bound to silica microparticles" // 7'h European Federation of E{R Groups Meeting and Closing Meeting of COST P15 (EFEPR-2009) -Antwerpen. - Belgium. - 6-11 September, 2009. - P. 34.

16. V.A. Livshits, L.V. Voronina, I.V. Demisheva, M.V. Alfimov "Sensor materials based on cyclodextrins immobilized on the silica microspheres. Fluorescence and spin-label ESR study." // The Iя International symposium on "Supramolecular chemistry for materials and life sciences". -Новосибирск.-Россия. -29 июня-3 июля, 2010. - P. 42.

Цитируемая литература

1 Лившиц, В.А. О возможности разделения амплитудных и частотных параметров молекулярного вращения с помощью ЭПР спектроскопии с переносом СВЧ насыщения / В.А. Лившиц, Ю.А. Бобров, Т.П. Кулагина // Ж. физич. хим. - 1986. - Т. 60. С. 1304-1306.

2 Budil, D.E. Non-linear least squares analysis of slow-motion EPR spectra in one and two dimensions using a modified Levenberg-Marquardt algorithm / D.E. Budil, S. Lee, S. Saxena, J.H. Freed // J. Magn. Reson. A. - 1996. -V. 120. P. 155-189.

3 Tirado, M.M. Rotational dynamics of rigid, symmetric top macromolecules. Application to circular cylinders / M. M. Tirado, J. G. De la Torre // J. Chem. Phys. - 1980. - V. 73. P. 1986-1993.

4 Anderson, T.G. Calorimetric measurement of phospholipids interaction with methyl-|3-cyclodextrm / T.G. Anderson, A. Tan, P. Ganz, J. Seelig // Biochem. - 2004. - V. 43. P. 2251-2261.

5 Almeida, P.F.F. Lateral diffusion in the liquid phases of dimyristoylphosphatidylcholine/ cholesterol lipid bilayers: a free volume analysis / P.F.F. Almeida, W.L.C. Vaz, Т.Е. Thompson // Biochem. -1992.-V. 31. P. 6739-6747.

6 Dzikovski, B. Multifrequency ESR study of spin-labeled molecules in inclusion compounds with cyclodextrins / B. Dzikovski, D. Tipikin, V. Livshits, K. Earle, J. Freed // Phys. Chem. Chem. Phys. - 2009. - V. 11. P.6676-6688.

Подписано в печать: 10.11.10 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769735 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 » '

1.1. Комплексы "гость-хозяин" циклодекстринов (ЦД) в растворе и в твердой фазе.

1.2. ЭПР-спектроскопия спиновых меток и зондов.

1.3. Сенсорные материалы на основе ЦД.

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Получение комплексов

2.1.1. Трехкомпонентные комплексы р- и у-ЦД в твердой фазе.

2.1.2. Комплексы включения производных р-ЦД со спин-мечеными аналогами холестерина в растворе.

2.2. Приготовление образцов для экспериментов по взаимодействию ЦД с липидными мембранами

2.2.1 Получение липидных мембран.

2.2.2. Приготовление образцов липидная мембрана - ЦД.

2.3. Приготовление образцов с микрочастицами двуокиси кремния, модифицированными ЦД.

2.4. Измерение и анализ спектров ЭПР.

2.5. Моделирование спектров ЭПР спиновых зондов.

2.6. Квантово-химические расчеты.

ГЛАВА 3 СТРУКТУРА И ДИНАМИКА СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ СПИН-МЕЧЕНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА С ЦИКЛОДЕКСТРИИАМИ

3.1. Полярность окружения спин-меченых "гостей" в трехкомпонентных комплексах {5- и у-ЦД.

3.2. Молекулярная динамика.

3.3. Квантово-химические расчеты.

3.3.1. Комплексы р-ЦД.

3.3.2. Комплексы у-ЦД.

3.4. Трехкомпонентные комплексы р- и у-ЦД в присутствии жидкой фазы углеводорода

3.4.1. Природа сильно иммобилизованных сигналов ЭПР. Комплексы включения стехиометрии 2:1:2.

3.4.2. Квантово-химические расчеты.

ГЛАВА 4 КОМПЛЕКСЫ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ СО СПИН-МЕЧЕНЫМИ

АНАЛОГАМИ ХОЛЕСТЕРИНА. ВЛИЯНИЕ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ НА СТРУКТУРУ И ДИНАМИКУ ХОЛЕСТЕРИНСОДЕРЖАЩИХ МЕМБРАН

4.1. Определение стехиометрии и констант связывания комплексов.

4.2. Квантово-химические расчеты. Геометрии комплексов.

4.3. Гидродинамические размеры комплексов. Образование ассоциатов комплексов с молекулами ЦД.

4.4. Взаимодействие ЦД с холестеринсодержащими липидными мембранами.

ГЛАВА 5 ДИНАМИКА И ЛОКАЛЬНОЕ ОКРУЖЕНИЕ СПИН-МЕЧЕНЫХ МОЛЕКУЛ

ГОСТЕЙ В КОМПЛЕКСАХ С ЦД, КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫМИ С МИКРОЧАСТИЦАМИ СИЛИКАГЕЛЯ. МОДЕЛЬ МАГНИТНОГО ХЕМОСЕНСОРА

5.1. Молекулярная динамика спиновых зондов в комплексах с иммобилизованными ЦД.

5.2. Гидрофобность окружения.

5.3. Влияние поверхности на комплексообразование ЦД.

5.4. Конкурентное связывание спин-меченой молекулы и аналита с ЦД.

ВЫВОДЫ.

В настоящее время проявляется большой интерес к исследованию циклодекстринов (ЦД), связанный с их уникальными свойствами. ЦД представляют собой макроциклы из глюкозных звеньев, соединенных эфирными связями [1-3]. Благодаря наличию гидрофобной полости ЦД образуют супрамолекулярные комплексы "гость-хозяин" с различными органическими соединениями, в которых могут существенно изменяться фото физические свойства и реакционная способность молекул-гостей [4-7]. Эта особенность структуры ЦД сделала их в последние годы объектом как многочисленных фундаментальных исследований, так и применений в химии, физике, химической и биотехнологии [8-12].

На основе комплексов ЦД могут быть построены наноструктуры, обладающие различными функциями: хемосенсоров, сорбентов для хроматографии, переносчиков лекарственных соединений и др., а также возможностью регуляции этих функций [11, 1315]. Одним из примеров таких структур могут служить трехкомпонентные и более сложные комплексы ЦД, содержащие две разные молекулы "гостей" [16-20]. В этих комплексах наблюдаются новые интересные эффекты за счет присутствия второго "гостя": изменение флуоресценции [19-23], возникновение фосфоресценции [24, 25]. В связи с важностью таких функциональных структур первой задачей диссертации было исследование самоорганизации и "внутренних свойств" трехкомпонентных комплексов (вращательной динамики, полярности окружения) в зависимости от структуры ЦД и обеих молекул-гостей.

При образовании комплексов "гость-хозяин" с ЦД резко увеличивается растворимость гидрофобных молекул в водной фазе [5]. На этом свойстве основано большинство применений ЦД в химической технологии и медицине [8, 9]. Наряду с увеличением растворимости лекарственных соединений, их включение в полость ЦД позволяет реализовать пролонгированный эффект лекарственного препарата, а также его адресный транспорт к мишени в организме [8]. Комплексы "гость-хозяин" холестерина и других стероидов с ЦД могут иметь важные применения при транспорте лекарственных стероидных соединений и регуляции уровня холестерина в плазме, биомембранах и других клеточных структурах [26-28]. В связи с этим второй задачей диссертации было исследование особенностей' использования ЦД в качестве молекул-хозяев для исследования комплексов "гость-хозяин" со спин-мечеными аналогами холестерина и взаимодействия этих комплексов с липидными мембранами.

Обратимое связывание ЦД с различными органическими молекулами, сопровождающееся изменением их спектральных и химических свойств, привело к другому важному применению ЦД - в качестве молекулярных рецепторов« в хемосенсорных материалах [14, 15, 29, 30]. При переходе от комплексов ЦД в растворе к сенсорным материалам необходима, как правило, иммобилизация ЦД на поверхности микрочастиц носителя, что может приводить к существенной модификации структуры и свойств комплексов. Поэтому третьей задачей диссертации явилось изучение особенностей комплексообразования ЦД, ковалентно связанных с поверхностью микрочастиц носителя.

Для решения перечисленных задач необходимо изучение не только структуры, но и молекулярной динамики этих систем. К началу выполнения данного исследования было опубликовано лишь небольшое число работ по динамике молекул-гостей в бинарных комплексах "гость-хозяин", см., например, [31-33], сведения же о динамике молекул в трехкомпонентных комплексах и комплексах с ЦД, иммобилизованными на поверхности микрочастиц, насколько нам известно, вообще отсутствовали.

Одним из наиболее адекватных методических подходов к решению поставленных задач является ЭПР спектроскопия спиновых меток и зондов, которая обладает высокой чувствительностью к молекулярной динамике, полярности окружения и межмолекулярным взаимодействиям [34]. В данной работе спиновые зонды использовались как спин-меченые аналоги 1) функциональных молекул-гостей при изучении трехкомпонентных комплексов "гость-хозяин", 2) биологически активных молекул - холестерина и липидов, 3) аналитов в моделях хемосенсорных структур.

Таким образом, настоящая диссертация посвящена изучению методом ЭПР структуры и молекулярной динамики супрамолекулярных комплексов ЦД со спин-мечеными молекулами и исследованию их применения в качестве функциональных структур и для изучения биологических объектов.

В« первой главе диссертации — литературном обзоре, кратко рассматриваются современные представления о структуре и свойствах комплексов "гость-хозин" ЦД в растворе и твердой фазе, а также методы их исследования. Особый акцент сделан на метод спиновых меток и зондов, обсуждаются возможности метода для изучения структуры и молекулярной динамики комплексов включения. Подробно изложены основные результаты, полученные с использованием ЭПР-спектроскопии спиновых меток и зондов, опубликованные за последние несколько лет. Приведены краткие сведения о сенсорных материалах на основе ЦД. Особое внимание уделено материалам на основе силикагеля, модифицированного ЦД, которые имеют отношение к пятой главе диссертации.

Во второй главе подробно описаны экспериментальные методы, использованные в диссертационной работе. Приводятся методики получения комплексов ЦД с различными спин-мечеными соединениями в растворе и твердой фазе, а также для случая микрочастиц силикагеля, модифицированного цикло декстрином. Отдельный раздел посвящен липидным мембранам, где подробно описывается их получение, а также приготовление образцов липидная мембрана-ЦД. Описаны методики ЭПР измерений и анализ спектров. Изложена краткая информация по квантово-химическим расчетам, проводимым в работе.

Третья глава диссертации содержит результаты исследования методом ЭПР-спектроскопии структуры и динамики трехкомпонентных комплексов р- и у-ЦД с двумя типами молекул-гостей: спин-мечеными аналогами индола с пирролидиновым и пиперидиновым радикальными фрагментами и углеводородами (бензолом, циклогексаном). Для всех комплексов были определены параметры гидрофобности окружения репортерской МО-группы спин-меченых "гостей". Проведен сравнительный анализ результатов по полярности окружения в трехкомпонентных и бинарных (без углеводорода) комплексах, изученных ранее. Исследована динамика спин-меченых "гостей" в трехкомпонентных комплексах и у-ЦД в широком температурном интервале. С использованием ЭПР-спектроскопии с переносом СВЧ насыщения установлен характер движения спин-меченых "гостей" в комплексах, определены количественные параметры подвижности. Из анализа экспериментальных данных установлено влияние структур ЦД, второго "гостя" (углеводорода) и самой функциональной молекулы (спинового зонда) на молекулярную динамику, гидрофобность окружения зонда и его ориентацию в полости. Для всех комплексов проведены квантово-химические расчеты. На основании расчетов и экспериментальных результатов по полярности окружения и вращательной подвижности предложены структуры комплексов.

В четвертой главе диссертации изучены закономерности образования и структуры комплексов ЦД в растворе со спин-мечеными аналогами холестерина (Хол) - 3-доксил-17р-гидрокси-5а-андростаном (АБЬ) и 3-доксил-5«-холестаном (СБЬ). В' качестве молекул-хозяев использовали гидроксипропил-рЦД (гп-рЦД) и метил-р-ЦД (м-рЦД). Определены стехиометрия и константы связывания комплексов, параметры их динамической структуры. На основании экспериментальных данных и квантово-химических расчетов предложены пространственные структуры комплексов. Путем моделирования спектров ЭПР определены коэффициенты анизотропной вращательной диффузии комплексов, из величин которых были оценены гидродинамические размеры комплексов с использованием гидродинамической теории вращения цилиндров [35].

Изучено взаимодействие гп- и м-(ЗЦД с одно-, двух- и трехкомпонентными липидными мембранами. С использованием спин-меченого аналога Хол - 3-доксил-17(3-гидрокси-5а-андростана (АБЬ) для мембраны димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) обнаружен обратимый перенос АБЬ между липидной мембраной и водным раствором гп-РЦД. Для мембран ДМФХ/Хол, где также наблюдался перенос АЭЬ в раствор, изучено распределение спинового зонда между мембраной и водным раствором гп-рЦД в зависимости от доли Хол в мембране. Обнаружено, что коэффициент распределения АЭЬ чувствителен к фазовому разделению в мембране ДМФХ/Хол. С использованием фосфолипида, спин-меченого доксильным фрагментом в 14-ом положении относительно карбоксильной группы (14-РС8Ь), изучено влияние м-рЦД на трехкомпонентные мембраны пальмитоил-сфингомиелин (ПСМ)/ пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолин (ПОПС)/ холестерин (Хол), близко моделирующие по составу наружные слои клеточных мембран. Влияние м-рЦД на мембраны проявляется в уменьшении параметра анизотропии 2А„ в спектре ЭПР, которое можно объяснить уменьшением степени упорядоченности липидного слоя за счет экстракции Хол из мембраны. Обнаружена зависимость степени влияния м-рЦД от состава мембран. Показана возможность количественного определения доли холестерина, экстрагируемого из мембраны или вводимого в нее с помощью м-рЦД.

В пятой главе диссертации представлены результаты исследования молекулярной динамики и полярности окружения спиновых зондов различной структуры в комплексах с Р-ЦД и фенил-рЦД, ковалентно связанными с микрочастицами силикагеля. Обнаружено два состояния спиновых зондов с различной вращательной подвижностью и полярностью окружения. Изучение температурной зависимости спектров ЭПР спиновых зондов и анализ параметров гидрофобности окружения зондов в комплексах позволили объяснить природу двух типов сигналов, наблюдаемых в спектрах ЭПР. Для спиновых зондов с различной растворимостью в воде определены константы связывания К с иммобилизованными Р-ЦД и фенил-рЦД на микрочастицах силикагеля. Полученные результаты показали незначительное влияние поверхности на связывание и зависимость К от структуры спинового зонда.

На примере адамантанола в качестве аналита изучена возможность детектирования диамагнитного аналита в водной среде методом ЭПР.

выводы

1. Впервые получены и исследованы методом ЭПР трехкомпонентные комплексы.р- и у-ЦД с двумя типами молекул-гостей: спин-мечеными индолами различной структуры и углеводородами (бензол, циклогексан). Совокупность экспериментальных данных и квантово-химические расчеты показывают, что комплексы имеют стехиометрию 2ЦЦ:1спиновый зонд: 1 углеводород, а в избытке углеводорода образуются комплексы со стехиометрией 2:1:2.

2. Установлено влияние структур ЦД, второго "гостя" (углеводорода) и самой функциональной молекулы (спинового зонда) на молекулярную динамику, гидрофобность окружения зонда и его ориентацию в полости. Тем самым экспериментально показана возможность существенной модификации и регуляции свойств функциональных молекул-гостей путем введения второго "гостя" в полость ЦД.

3. Впервые получены комплексы спин-меченых аналогов холестерина - андростана и холестана с ЦД различной структуры. Определены стехиометрия и константы связывания комплексов, параметры их динамической структуры; на основании экспериментальных данных и расчетов предложены пространственные структуры комплексов. Путем моделирования спектров ЭПР определены коэффициенты анизотропной вращательной диффузии комплексов, которые свидетельствуют об образовании ассоциатов комплексов с молекулами воды и ЦД в водных растворах.

4. Обнаружен обратимый перенос спин-меченого аналога холестерина между липидной мембраной и водным раствором ЦД. Коэффициент распределения зонда чувствителен к природе липидных фаз и фазовому разделению в двухкомпонентных холестеринсодержащих мембранах.

5. Обнаружено сильное влияние ЦД на форму спектров ЭПР липидных спиновых зондов в трехкомпонентных холестеринсодержащих мембранах, обусловленное экстракцией холестерина. Показана возможность количественного определения доли холестерина, экстрагируемого из мембраны или вводимого в нее с помощью ЦД.

6. Изучена молекулярная динамика спиновых зондов различной структуры в комплексах ЦЦ, ковалентно связанных с микрочастицами силикагеля. Обнаружено два состояния спиновых зондов с различной вращательной подвижностью и полярностью окружения. Совокупность результатов показывает, что сильно иммобилизованное состояние соответствует комплексу с ЦД, сорбированному на гидрофобных участках поверхности микрочастиц, а слабо иммобилизованное состояние - десорбированному комплексу, подвижность которого определяется конформационной гибкостью линкера. Определены параметры молекулярной динамики спин-меченых молекул-гостей в обоих состояниях.

7. Определены константы связывания (К) спиновых зондов разной структуры и заряда (I, II и IX, рис. 5) с микрочастицами силикагеля, содержащими ковалентно связанные р-ЦЦ и фенил-рЦД. Влияние поверхности на величину К сравнительно невелико по абсолютной величине, и знак этого влияния зависит от структуры зонда и характера его встраивания в комплекс с ЦД.

8. Обнаружено конкурентное связывание спин-меченых молекул и аналита с циклодекстринами, иммобилизованными на микрочастицах, которое может быть использовано для создания "парамагнитных" хемосенсоров.

1. Bender, M. L. Cyclodextrin chemistry / M. L. Bender, M. Momiyama Springer, Berlin, 1978.

2. Saenger, W. Structures of the common cyclodextrins and their larger analogues beyond the doughnut / W. Saenger, J. Jacob, K. Gessler, T. Steiner, D. Hoffmann, H. Sanbe, K. Koizumi, S. M. Smith, T. Takaha // Chem. Rev. 1998. -V. 98. P. 1787-1802.

3. Szejtli, J. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry / J. Szejtli // Chem. Rev. 1998. -V. 98. P. 1743-1754.

4. Szejtli, J. Comprehensive supramolecular chemistry / J. Szejtli Pergamon, Oxford, 1996. -V. 3.

5. Uekama, K. Cyclodextrin drug carrier systems / K. Uekama, F. Hirayama, T. Irie // Chem. Rev. 1998. -V. 98. P. 2045-2076.

6. Connors, K. A. The stability of cyclodextrin complexes in solution / K. A. Connors // Chem. Rev. 1997. -V. 97. P. 1325-1357.

7. Saenger, W. Cyclodextrin inclusion complexes: host-guest interactions and hydrogen-bonding networks / W. Saenger, T. Steiner // Acta Cryst. 1998. - V. A54. P. 798-805.

8. Challa, R. Cyclodextrins in drug delivery: an updated review / R. Challa, A. Ahuja, J. Ali, R. K. Khar // AAPS PharmSciTech. 2005. - V. 6(2). P. E329-E357.

9. Singh, M. Biotechnological applications of cyclodextrins / M. Singh, R. Sharma, U. C. Banerjee // Biotech. Advan. 2002. - V. 20. P. 341-359.

10. Braga, S. S. Solid state inclusion compound of S-ibuprofen in p-cyclodextrin: structure and characterization / S. S. Braga, I. S. Goncalves, E. Herdtweck, J. J. C. Teixeira-Dias // New J. Chem. 2003. - V. 27. P. 597-601.

11. Li, J. Cyclodextrin-based supramolecular architectures: syntheses, structures, and applications for drug and gene delivery / J. Li, X. J. Loh // Ad. Drug Deliv. Rev. 2008. -V. 60. P. 1000-1017.

12. Fakayode, S. O. Cyclodextrin host-guest chemistry in analytical and environment chemistry / S. O. Fakayode, M. Lowry, K. A. Fletcher, et. al. // Curr. Anal. Chem. 2007. -V. 3. P. 171-181.

13. Akiyama, T. Molecular imprinting of cyclodextrin on silica-gel support for the stationary phase of high-performance-liquid-chromatography / T. Akiyama, T. Hishiya, H. Asanuma, M. Komiyama // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2001. - V. 41. P. 149-153.

14. Prabaharan, M. Chitosan derivatives bearing cyclodextrin cavities as novel adsorbent matrices / M. Prabaharan, J. F. Mano // Carbohydr. Polym. -2006. -V. 63. P. 153-166.

15. Ogoshi, T. Chemical sensors based on cyclodextrin derivatives / T. Ogoshi, A. Harada // Sensors. -2008. V. 8. P.4961-4982.

16. Schneiderman, E., Binary and ternary complexes between lauryl hexaoxyethylene, benzoate and cyclodextrin. Part II. P-CD / E. Schneiderman,- B. Perly, E. Brooks, A. M. Stalcup // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2002. - V. 43. P. 43-50.

17. Massot, O. Selective photoreduction of nitrophenyl ethers by amines in ternary p-cyclodextrin complexes. A spectroscopic and mechanistic study / O. Massot, M. Mir, J. Bourdelande, J. Marquet // Phys. Chem. Chem. Phys. 2002. - V. 4. P. 216-223.

18. Kano, K. Three component complexes of cycloheptaamylose. Fluorescence quenching of pyrenes and naphthalenes in aqueous media / K. Kano, I. Takenoshita, T. Ogawa // Chem. Lett. 1980.-V. 9 P. 1035-1038.

19. Kano, K. Three-component complexes of cyclodextrins. Exciplex formation in cyclodextrin cavity / K. Kano, S. Hashimoto, A. Imai, T. Ogawa // J. Incl. Phenom. 1984. - V. 2. P. 737-746.

20. Kano, K. Fluorescence quenching of pyrene and naphthalene in aqueous cyclodextrin solutions. Evidence of three-component complex formation / K. Kano, I. Takenoshita, T. Ogawa//J. Phys. Chem. 1982. -V. 86. P. 1833-1838.

21. Hamai, S. Association of inclusion compounds in the systems of p-cyclodextrin-aniline-sodium 1-pyrenesulfonate and -pyrene / S. Hamai // J. Phys. Chem. 1988. - V. 92. P. 6140-6144.

22. Hamai, S Exciplex formation between perylene and N,N-dimethylaniline in a ternary inclusion compound with y-cyclodextrin in H20-ethanol (7:3) mixture / S. Hamai // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1991. -V. 64. P. 431-438.

23. Nazarov, V. B. Long-lived room temperature phosphorescence of a naphthalene-p-cyclodextrin-adamantane complex in the presence of oxygen / V. B. Nazarov, V. G. Avakyan, M. V. Alfimov, T. G. Vershinnikova // Russ. Chem. Bull. 2003. - V. 52. P. 916-922.

24. Becher, A. The y-amino butyric acid receptor B, but not the metabotropic glutamate receptor type-1, associates with lipid rafts in the cerebellum / A. Becher, J. H. White, R. A. J. Mcllhinney // J. Neurochem. -2001. V. 79. P. 787-795.

25. Frijlink, H. W. The effect of parenterally administered cyclodextrins on cholesterol levels in the rat / H. W. Frijlink, A. C. Eissens, N. R. Hefting, K. Poelstra, C. F. Lerk, D. K. F. Meijer // Pharrn Res. 1991. -V. 8. P. 9-16.

26. Williams, R. O. Characterization of an inclusion complex of cholesterol and hydroxypropyl-p-cyclodextrin / R. O. Williams, V. Mahaguna, M. Sriwongjanya // Europ. J. Pharm. Biopharm. 1998. - V. 46. P. 355-360.

27. Tanabe, T. Fluorescent cyclodextrin immobilized on a cellulose membrane as a chemosensor system for detecting molecules / T. Tanabe, K. Tourna, K. Hamasaki, A. Ueno // Anal. Chem. 2001. - V. 73. P. 1877-1880.

28. Tanaka, M. Preparation and retention behavior of cyclodextrin-bonded stationary phases on a Silica support without an unreacted spacer chain / M. Tanaka, M. Yoshinaga, M. Ito, H. Ueda // Anal. Sci. 1995. - V. 11 P. 227-231.

29. Heyes, S. J. 13C-CP/MAS NMR studies of the cyclomalto-oligosaccharide (cyelodextrin) hydrates / S. J. Heyes, N. J. Clayden, С. M. Dobson // Carbohydr. Res. 1992. - V. 233. P. 1-14.

30. Ripmeester, J. A. Crystalline P-cyclodextrin hydrate is non-stoichiometric with 10.5-12 waters per cyelodextrin molecule / J. A. Ripmeester // Supramol. Chem. 1993. - V. 2. P. 89-91.

31. Kitchin, S. J. Dynamic of p-cyclodextrin hydrate: solid state 2H NMR studies / S. J. Kitchin, Т. K. Halstead // Solid State NMR. 1996. - V.7. P. 27-44.

32. Берлинер, JI. Метод спиновых меток / под редакцией JI. Берлинера М. Мир, 1979.- 639 сс.

33. Tirado, М. М. Rotational dynamics of rigid, symmetric top macromolecules. Application to circular cylinders / M. M. Tirado, J. G. De la Torre // J. Chem. Phys. 1980. - V. 73. P. 1986-1993.

34. Schneider, H-J NMR studies of cyclodextrins and cyclodextrin complexes / H-J Schneider, F. Hacket, V. Rudiger, H. Ikeda // Chem. Rev. 1998, V. 98. P. 1755-1786.

35. Harata, K. Structural aspects of stereodifferentiation in the solid state / K. Harata // Chem. Rev.- 1998.-V. 98. P. 1803-1828.

36. Lipkowitz, К. B. Application of computational chemistry to the study of cyclodextrin / K. B. Lipkowitz//Chem. Rev. 1998.-V. 98. P. 1829-1874.

37. Gattuso, G. Synthetic cyclic oligosaccharides / G. Gattuso, S. A. Nepogodiev, J. F. Stoddart // Chem. Rev. 1998. -V. 98. P. 1919-1958.

38. Rekharsky, M. V. Complexation thermodynamics of cyclodextrins / M. V. Rekharsky, Y. Inoue // Chem. Rev. 1998. -V. 98. P. 1875-1918.

39. Gessler, K. Crystal structures of P-cyclodextrin complexed with ethylene glycol-8.0 H2O and glycerol-7.2 H2O / K. Gessler, T. Steiner, G. Koellner, W. Saenger // Carbohydr. Res.- 1993.-V. 249. P. 327-344.

40. Aree, T. Crystal structures of p-cyclodextrin complexes with formic acid and acetic acid / T. Aree, B. Schulz, G. Reck // J. Incl. Phen. Macrocycl. Chem. 2003. - V. 47. P. 39-45.

41. Bodor, N. Theoretical insights into the formation, structure and energetics of some cyclodextrin complexes / N. Bodor, P. Buchwald // J. Incl. Phen. Macrocyc. Chem. 2002. -V. 44. P. 9-14.

42. Anibarro, M.' X-ray structure of P-cyclodextrin-2,7-dihydroxy-naphthalene-4.6 H20: an unusually distorted macrocycle / M. Anibarro, K. Gessler, I. Uson, G. M. Scheldrick, W. Saenger // Carbohydr. Res. 2001. - V. 333. P. 251-256.

43. Ross, P. D. Thermodynamics of hydrogen bond and hydrophobic interactions in cyclodextrin complexes / P. D. Ross, M. V. Rekharsky // Biophys. J. — 1996. — V. 71. P. 2144-2154.

44. Hallen, D. Microcalorimetric titration of a-cyclodextrin with some straight-chain alkan-1-ols at288.15, 298.15 and 308.15 K/D. Hallen, A. Schon, I. Shehatta, I. Wadso //J. Chem. Soc. Faraday trans. 1992. -V. 88. P. 2859-2863.

45. Barone, G. Thermodynamics of formation of inclusion compounds in water. A-cyclodextrin-alcohol adducts at 298.15 K / G. Barone, G. Castronuovo, P. D. Vecchio, V. Elia, M. Muscetta// J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1986. -V. 82. P. 2089-2101.

46. Wiseman, T. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter / T. Wiseman, S. Williston, J. F. Brandts, L-N Lin // Anal. Biochem. -1989.-V. 179. P. 131-137.

47. Fielding, L. Determination of association constants (Ka) from solution NMR data / L. Fielding // Tetrahedron. -2000. V. 56. P. 6151-6170.

48. Spencer, J. N. Complex formation between a-cyclodextrin and amines in water and DMF solvents / J. N. Spencer, J. E. Mihalick, I. M. Paul, B. Petigara, Z. Wu // J. Solution Chem. 1996. -V. 25. P. 747-756.

49. Catena, G. C. Thermodynamic study on the effects of P-cyclodextrin inclusion with anilinonaphthalenesulfonates / G. C. Catena, F. V. Bright // Anal. Chem. 1989. - V. 61(8).-P. 905-909.

50. Barros, T. C. Complexation of naphthylethanols with p-cyclodextrin / T. C. Barros, K. Stefaniak, J. F. Holzwarth, C. Bohne // J. Phys. Chem. A. 1998. -V. 102. P. 5639-5651.

51. Christoff, M. Dynamics of complexation of flavone and chromone to P-cyclodextrin / M. Christoff, L. T. Okano, C. Bohne // J. Photochem. Photobiol. A. 2000. - V. 134. P. 169.

52. Dyck, A. S. M. Dynamics for the assembly of pyrene-y-cyclodextrin host-guest complexes / A. S. M. Dyck, U. Kisiel, C. Bohne // J. Phys. Chem. B. 2003. - V. 107. P. 1165211659.

53. Cramer, F. Inclusion compounds. XIX. la The formation of inclusion compounds of a-cyclodextrin in aqueous solution. Thermodynamics and kinetics / F. Cramer, W. Saenger, H-Ch Spatz // J. Am. Chem. Soc. 1967. - V. 89. P. 14-20.

54. Kobayashi, N. Fluorescence and induced circular dichroism studies on host-guest complexation between y-cyclodextrin and pyrene / N. Kobayashi, R. Saito, H. Hino, Y. Hino, A. Ueno, T. Osa // J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1983. - P. 1031-1035.

55. Claudy, P. Physicochemical characterization of cholesterol-p-cyclodextrin inclusion-complexes / P. Claudy, J. M. LetofFe, P. Germain, J. P. Bastide, A. Bayol, S. Blasquez, R. C. Rao, B. Gonzalez // J. Therm. Anal. 1991. - V. 37. P. 2497-2506.

56. Nagao, A. Infrared spectra of monosubstituted toluene derivatives in cyclodextrin: orientation of guest molecules in inclusion complexes / A. Nagao, A. Kan-no, M. Takayanagi // J. Molec. Struc. -2009. V. 929. P. 43-47.

57. Dodziuk, H. NMR studies of chiral recognition by cyclodextrins / H. Dodziuk, W. Kozminski, A. Ejchart // Chirality. 2004. - V. 16. P. 90-105.

58. Furo, I. CP-DD-MAS 13C-NMR investigation of anhydrous and hydrated cyclomaltooligosaccharides: the role of water of hydration /1. Furo, I. Pocsik, K. Tompa, R. Teeaar, E. Lippmaa // Carbohydr. Res. 1987. - V. 166. P. 27-33.

59. Lucarini, M. Dynamic aspects of cyclodextrin host-guest inclusion as studied by an EPR spin-probe technique / M. Lucarini, B. Luppi, G. F. Pedulli, B. P. Roberts // Chem. Eur. J. 1999. -V. 5. P. 2048-2054.

60. Livshits, V. A. Inclusion complexes of spin-labeled indoles with cyclodextrin in aqueous solutions / V. A. Livshits, B. G. Dzikovski, V. G. Avakyan, E. A. Samardak // Russ. Chem. Bull. 2005. - V. 54. P. 1169-1177.

61. Ionita, G. Inclusion complexes of cyclodextrins with nitroxide-based spin probes in aqueous solution / G. Ionita, A. Caragheorgheopol, H. Caldararu, L. Jones, V. Chechik // Org. Biomol. Chem. -2009. -V. 7. P. 598-602.

62. Chechik, V. Supramolecular complexes of spin-labelled cyclodextrins / V. Chechik, G. Ionita // Org. Biomol. Chem. -2006. V. 4. P. 3505-3510.

63. Daniel, J. M. Quantitative determination of noncovalent binding interaction using soft ionization mass spectrometry / J. M. Daniel, S. D. Friess, S. Rajagopalan, S. Wendt, R.

64. Zenobi // J. Mass. Spectrom. 2002. - V. 216. P. 1-27.i

65. Brodbelt, J. S. Probing molecular recognition by mass spectrometry / J. S. Brodbelt // Int. J. Mass Spectom. -2000. V. 200. P. 57-69.

66. Fujita, K. Guest-induced conformational change of p-cyclodextrin capped with an environmentally sensitive chromophore / K. Fujita, T. Ueda, T. Imoto, I. Tabushi, N. Toh, T. Koga // Bioorg. Chem. 1982. -V. 11. P. 72-84.

67. Takeo, K. Complexes of starch and its related materials with organic compounds. Part VII. Circular dichroism of inclusion compounds of cyclodextrins in aqueous solutions / K. Takeo, T. Kuge // Starch. 1972. - V. 24. P. 281-284.

68. Harata, K. Induced circular dichroism of cycloamilose complexes with meta- and para-disubstituted benzenes / K. Harata // Bioorg. Chem. 1981. - V. 10. P. 255-265.

69. Hamai, S. Pyrene excimer formation in y-cyclodextrin solution: association'of 1:1 pyrene-y-cyclodextrin inclusion compounds / S. Hamai // J. Phys. Chem. 1989. - V. 93. P. 65276529.

70. Hamai, S. Excimer formation in inclusion complexes of (3-cyclodextrin with 1-alkylnaphthalenes in aqueous solutions / S. Hamai, A. Hatamiya // Bull. Chem. Soc. Jpn. -1996.-V. 69. P. 2469-2476.

71. Sau, S. Higher-order cyclodextrin complexes: the naphthalene system / S. Sau, B. Solanki, R. Orprecio, J. Van Stam, C. H. Evans // J. Incl. Phen. Macrocycl. Chem. 2004. - V. 48. P. 173-180.

72. Kokkinou, A. Structure of the complex of (3-cyclodextrin with (3-naphthyloxyacetic acid in the solid state and in aqueous solution / A. Kokkinou, K. Yannakopoulou, I. M. Mavridis, D. Mentzafos // Carbohydr. Res. 2001. - V. 332. P. 85-94.

73. Hamai, S. Association of inclusion compounds of p-cyclodextrin in aqueous solution / S. Hamai // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1982. - V. 55. P. 2721-2729.

74. Evans, C. H. Naphthalene complexation by p-cyclodextrin: influence of added short chain branched and linear alcohols / C. H. Evans, M. Partika, J. van Stam // J. Inch Phenom. Macrocycl. Chem. -2000. -V. 38. P. 381-396.

75. Ward, W. H. Isothermal titration calorimetry in drug discovery / W. H. Ward, G. A. Holdgate // Prog. Med. Chem. 2001. -V. 38. P. 309-376.

76. Raffa, R. B. Drug-receptor thermodynamics: Introduction and application / edited by R. B. Raffa John Willey and Sons, New York, 2001.

77. Mura, P. Comparative study of ibuproxam complexation with amorphous p-cyclodextrin derivatives in solution and in the solid state / P. Mura, N. Zerrouk, M. Faucci, F. Maestrelli, C. Chemtod // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2002. - V. 54. P. 181-191.

78. Mura, P. Characterization of physicochemical properties of naproxen systems with amorphous p-cyclodextrin-epichlorohydrin polymers / P. Mura, M. Faucci, F. Maestrelli, S. Furianetto, S. Pinzauri // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. - V. 29. P. 1015-1024.

79. Liu, Y. Inclusion complexation and solubilization of paclitaxel by bridged bis(P~ cyclodextrin)s containing a tetraethylenepentaamino spacer // J. Ved. Chem. — 2003. — V. 46. P. 4634-4637.

80. Ammar, H. O. Inclusion complexation of glimepiride in dimethyl-p-cyclodextrin / H. O. Ammar, H. A. Salama, M. Ghorab, A. A. Mahmoud // Asian J. Pharm. Sci. 2007. - V. 2. P. 44-55.

81. Pokharkar, V. Ternary coplexation of carvediol, p-cyclodextrin and citric acid for mouth-dissolving tablet formulation / V. Pokharkar, A. Khanna, V. Venkatpurwar, S. Dhar, L. Mandpe // Acta Pharm. 2009. - V. 59. P. 121-132.

82. He, Y. Cyclodextrin-based aggregates and characterization by microscopy / Y. He, P. Fu, X. Shen, H. Gao // Micron. 2008. - V. 39. P. 495-516.

83. Munoz-Botella, S. Differentiating inclusion complexes from host molecules by trapping-mode atomic force microscopy / S. Munoz-Botella, M. A. Martin, B. del Castillo, L. Vazquez // Biophys. J. 1996. - V. 71. P. 86-90.

84. Ohira, A. Comparison of nanotube structures constructed from a-, (3-, and y-cyclodextrins by potential-controlled adsorption / A. Ohira, M. Sakata, I. Taniguchi, C. Hirayama, M. Kunitake // J. Am. Chem. Soc. -2003. V. 125. P. 5057-5065.

85. Miyake, K. Formation process of cyclodextrin necjlace-analysis of hydrogen bonding on a molecular level / K. Miyake, S. Yasuda, A. Harada, J. Sumaoka, M. Komiyama, H. Schigekawa//J. Am. Chem. Soc. -2003. -V. 125. P. 5080-5085.

86. Shigekawa, H. The molecular abacus: STM manipulation of cyclodextrin necklace / H. Shigekawa, K. Miyake, J. Sumaoka, A. Harada, M. Komiyama // J. Am. Chem. Soc. -2000.-V. 122. P. 5411-5412.

87. Nishijo, J. Interactions of cholesterol with cyclodextrins in aqueous solution / J. Nishijo, S. Moriyama, S. Shiota// Chem. Pharm. Bull. -2003. -V. 51. P. 1253-1257.

88. Kostense, A. S. Modeling and conformation analysis of p-cyclodextrin complexes / A. S. Kostense, S. P. van Helden, L. H. M. Janssen // J. Comp. Aid. Mol. Design. 1991. - V. 5. P. 525-543.

89. Steiner, T. A vibrating flexible chain in a molecular cage: crystal structure of the complex P-cyclodextrin-l,4-butanedioI-6.25 H2O / T. Steiner, G. Koellner, W. Saenger // Carbohydr. Res. 1992. -V. 228. P. 321-332.

90. Harata, K. The structure of the cyclodextrin complex. XVIII. Crystal structure of P-cyclodextrin-benzyl alcohol (1:1) complex pentahydrate / K. Harata, K. Uekama, M. Otagiri, F. Hirayama, Y. Ohtani // Bull. Chem. Soc. Ipn. 1985. -V. 58. P. 1234-1238.

91. Topchieva, I. N. Two-phase channel structures based on a-cyclodextrin-polyethylene glycol inclusion complexes /1. N. Topchieva, A. E. Tonelli, I. G. Panova, E. V. Matuchina,

92. F. A. Kalashnikov, V. I. Gerasimov, C. C. Rusa, M. Rusa, M. A. Hunt // Langmuir. 2004. -V. 20. P. 9036-9043.

93. Panova, I. G. The template co-crystallization1 of P-cyclodextrin with polymeric inclusion-complex /1. G. Panova, E. V. Matuchina, I. N. Topchieva // Polym. Bull. 2007. - V. 58. P. 737-746.

94. Ding, J. Structure of the y-cyclodextrin-l-propanol-14H20 inclusion complex / J. Ding, T. Steiner. W. Saenger // Acta Cryst. B. 1991. -V. 47. P. 731-738.

95. Chiesi-Villa, A. The crystal structure of the inclusion complex of the sodium salt of piroxicam with p-cyclodextrin / A. Chiesi-Villa, C. Rizzoli, G. Amari, M. Delcanale, E. Redenti, P. Ventura // Supramol. Chem. 1998. - V. 10. P. 111-119.

96. Mavridis, I. M. The crystal structure of the inclusion complex of P-cyclodextrin with 3,3-dimethylbutylamine /1. M. Mavridis, E. Hadjioudis // Carbohydr. Res. 1991. - V. 220. P. 11-21.

97. Caira, M. R. Inclusion of nonopiate analgesic drugs in cyclodextrin. II. X-ray of a 1:1 p-cyclodextrin Acetaminophen complex / M. R. Caira, D. R. Dodds // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. - 2000. -V. 38. P. 75-84.

98. Bas, G. L. Chiral conformations induced by cyclodextrin / G. L. Bas, C. de Rango, N. Rysanek, G. Tscoucaris // J. Incl. Phen. Macrocycl. Chem. 1985. -V. 2. P. 861-867.

99. Stezowski, J. J. Dimeric p-cyclodextrin complexes may mimic membrane diffusion transport / J. J. Stezowski, K. H. Jogun, E. Eckle, K. Bartels // Nature. 1978. -V. 274. P. 617-619.

100. Uekama, K. Crystal and molecular structure of 2:2 flurbiprofen- P-cyclodextrin complex / K. Uekama, F. Hirayama, T. Imai, M. Otagiri, K. Harata // Chem. Pharm. Bull. — 1983. — V. 31. P. 3363-3365.

101. Hamilton, J. A. Structure of a complex of cycloheptaamylose with 1-adamantane carboxylic acid / J. A. Hamilton, M. N. Sabesan // Acta. Cryst. 1982. - V. B38. P. 30633069.

102. Rontoyianni, A. The crystal structure of the inclusion complex of P-cyclodextrin with 4-tert-butylbenzoic acid / A. Rontoyianni, I. M. Mavridis, E. Hadjoudis, A. J. M. Duisenberg // Carbohydr. Res. 1994. -V. 252. P. 19-32.

103. Balabai, N. Orientational dynamics of P-cyclodextrin inclusion complexes / N. Balabai, B. Linton, A. Napper, S. Priyadarshy, A. P. Sukharevsky, D. H. Waldeck // J. Phys. Chem. B. 1998.-V. 102. P. 9617-9624.

104. Harata, К. Crystallographic evaluation of the mobility of 2-naphthoic acid included in heptakis(2,6-di-0-methyl)- P-cyclodextrin // K. Harata // Chem. Commun. 1999. - P. 191-192.

105. Retna Rai, C. y-cyclodextrin induced intermolecular eximer formation of thioflavin T / C. Retna Rai, R. Ramarai // Chem. Phys. Lett. 1997. - V. 273. P. 285-290.

106. Takeo, K. On the inclusion compounds of cyclodextrins with diethylether / К. Takeo, T. Kuge // J. Agr. Biol. Chem. 1972. - V. 36. P. 2615-2620.

107. Munzo de la Pena, A. Alcohol size as a factor in the ternary complexes formed with pyrene and P-cyclodextrin / A. Munzo de la Репа, Т. T. Ndou, J. B. Zung, K. L. Greene, D. H. Live, I. M. Warner// J. Am. Chem. Soc. 1991. -V. 113. P. 1572-1577.

108. Von Stam, J. 2-Naphthol complexation by p-cyclodextrin: influence of added short linear alcohols / J. von Stam, S. De Feiter, F. C. De Schryver, С. H. Evans // J. Phys. Chem. -1996. -V. 100. P. 19959-19966.

109. Franchi, P. The binding behavior of cyclodextrins toward a nitroxide spin probe in the presence of different alcohols as studied by EPR / P. Franchi, G. F. Pedulli, M. Lucarini // L. Phys. Chem. -2008. -V. 112. P. 6706-8714.

110. Кузнецов, A. H. Метод спинового зонда / A. H. Кузнецов М. Наука, 1976. — 209 сс.

111. Okazaki, М. Anisotropic rotation diffusion of di-tert-butylnitroxide in the inclusion complex of P-cyclodextrin in aqueous solution / M. Okazaki, K. Kuwata // J. Phys. Chem.- 1984. -V. 88. P. 4181-4184.

112. Kotake, Y. Bimodal inclusion of nitroxide radicals by P-cyclodextrin in water as studied by electron spin resonance and electron nuclear double resonance / Y. Kotake, E. G. Janzen // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. P. 2066-2070.

113. Лившиц, В. А. Комплексы гость/хозяин спин-меченых жирных кислот с циклодекстринами / В. А. Лившиц, О. В. Максимова, В. Ю. Рудяк, В. Г. Авакян, М. В. Алфимов // Росс. Нанотех. 2007. - Т. 2. N 9-10. С. 29-39.

114. Knyazev, A. A. Complexation of nitroxide radicals with cyclodextrins: kinetics of crystal complex formation / A. A. Knyazev, I. N. Karpov, О. I. Mikhalev, M. V. Alfimov // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2001. - V. 40. P. 77-82.

115. Розанцев, Э. Г. Свободные иминоксильные радикалы / Э. Г. Розанцев — М. Химия, 1970.-216 сс.

116. Вассерман, А. М. Спиновые метки и зонды в физико-химии полимеров / А. М. Вассерман, А. Л. Коварский М. Наука, 1986. - 245 с.

117. Okazaki, М. Molecular disposition of inclusion complexes of three aminoxyl radicals with P-cyclodextrin in aqueous solution / . Okazaki, K. Kuwata // J. Phys. Chem. — 1984. V. 88. P. 3163-3165.

118. Kotake, Y. Recognition ability of cyclodextrin for alkyl groups in nitroxides as studied by Electron Spin Resonance / Y. Kotake, E. G. Janzen // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. P. 5138-5140.

119. Sueishi, Y. Distinctive pressure effects on the association equilibrium in cyclodextrin group-inclusion complex as studied with Electron Paramagnetic Resonance / Y. Sueishi, H. Tobisako, Y. Kotake // J. Phys. Chem. B. 2004. - V. 108. P. 12623-12627.

120. Ionita, G. Inclusion complexes of cyclodextrins with biradicals linked by a polyether chain an EPR study / G. Ionita, V. Meltzer, E. Pincu, V. Chechik // Org. Biomol. Chem. -2007.-V. 5. P. 1910-1914.

121. Chechik, V. Bis spin-labelled cyclodextrins / V. Chechik, G. Ionita // New J. Chem. -2007.-V. 31. P. 1726-1729.

122. Livshits, V. A. Study of inclusion complexes of spin-labeled guest molecules with cyclodextrin / V. A. Livshits, B. G. Dzikovskii, A. B. Shapiro, M. V. Alfimov // Doklady Phys. Chem. 2003. - V. 389. P. 493-496.

123. Livshits, V. A. Guest-host complexes of spin-labeled indoles with cyclodextrins in the solid phase: an EPR study / V. A. Livshits, B. G. Dzikovski, E. A. Samardak, M. V. Alfimov // Russ. Chem. Bull. 2006. - V. 55. P. 238-246.

124. Knyazev, A. A. Cyclodextrin complexes as mediators of crystallization of the disperse phase of oil-in-water emulsions / A. A. Knyazev, O. I. Mikhalev, I. N. Karpov, M. V. Alfimov // Dokl. Phys. Chem. 2004. - V. 395. P. 98-100.

125. Han, Y. Improved spin trapping properties by p-cyclodextrin cyclic nitrone conjugate / Y. Han, B. Tuccio, R. Lauricella, F. A. Villamena // J. Org. Chem. - 2008. - V. 73. P. 7108-7117.

126. Ionita, G. Spin-labelled cyclodextrins as hosts for large supramolecular assemblies / G/ Ionita, V. Chechik // Org. Biomol. Chem. 2005. - V. 3. P. 3096-3098.

127. Franchi, P. Increasing the persistency of stable free-radicals: synthesis and characterization of a nitroxide based ljrotaxane / P. Franchi, M. Fani, E. Mezzina, M. Lucarini // Org. Lett.-2008.-V. 10. P. 1901-1904.

128. Ueno A. Review: fluorescent cyclodextrins for molecular sensing. / A. Ueno // Supramol. Sci. 1996. — V. 3. P. 31-36.

129. Phan, T. N. New silica gels functionalized with 2-hydroxy-3-methacryloyloxypropyl-b-cyclodextrin using coating or grafting methods // T. N. Phan, J. Bacquet, M. Laureynsb // Morcellet Phys. Chem. 1999. -V. 1. P. 5189-5195.

130. Bibby, A. Adsorption and separation of water-soluble aromatic molecules by cyclodextrin-functionalized mesoporous silica / A. Bibby, L. Mercier // Green Chem. 2003. - V. 5. P. 15-19.

131. Лисичкин, Г. В. Химия привитых поверхностных соединений / Г. В. Лисичкин, А. Ю. Фадеев, А. А. Сердан, П. Н. Нестеренко, П. Г. Мингалев, Д. Б. Фурман М. Физматлит, 2003. - 590 с.

132. Armstrong, D. W. / Cyclodextrin bonded phases for the liquid-chromatographic separation of optical, geometrical, and structural isomers / D. W. Armstrong, W. DeMond // J. Chromatogr. Sci. 1984. -V. 22. P. 411-415.

133. Fujimura, K. Retention behavior of some aromatic compounds on chemically bonded cyclodextrin silica stationary phase in liquid chromatography / K. Fujimura, T. Ueda, T. Ando // Anal. Chem. 1983. - V. 55. P. 446-450.

134. Lopatin, S. A. / S. A. Lopatin, V. P. Varlamov, O. A. Shpigun, E. N. Shapovalova, V. A. Davankov // R. F. Patent N 2203 730, Byull. Izobret. 2001. N 13.

135. Phan, T. N. T. New silica gels functionalized with 2-hydroxy-3-methacryloyloxypropyl-P-cyclodextrin using coating or grafting methods / T. N. T. Phan, M. Bacquet, J. Laureyns, M. Morcellet // Phys. Chem. Chem. Phys. 1999. -V. 1. P. 5189-5195.

136. Crini, G. Beta-cyclodextrin-copolymers coated on silica beads: synthesis, characterization and retention behavior in HPLC / G. Crini, Y. Lekchiri, L. Janus, M. Morcellet, N. Morin // Chromatographia. 1999. -V. 50. P. 661-669.

137. Crini, G. Macroporous polyamines containing cyclodextrin: synthesis, characterization, and sorption properties / G. Crini, L. Janus, M. Morcellet, G. Torri, A. Naggi, S. Bertini, C. Vecchi//J. Appl. Polym. Sci. 1998. -V. 69. P. 1419-1427.

138. Ng. S-C. Durable chiral sensor based on quartz crystal micro balance using self-assembled monolayer of permethylated P-cyclodextrin / S-C. Ng, T. Sun, H. S. O. Chan // Macromol. Symp. — 2003. V. 192. P. 171-181.

139. Yang, X. Molecular recognition and self-assembled polymer films for vapor phase detection of explosives / X. Yang, X-X. Du, J. Shi, B. Swanson // Talanta. 2001. - V. 54. P. 439-445.

140. Kataky, R. Functionalized a-cyclodextrins as potentiometric chiral sensors / R. Kataky, P. S. Bates, D. Parker//Analyst.-1992.-V. 117. P. 1313-1317.

141. Hooper. A. J. Solute-solvated cyclodextrin-bonded phase interactions as studied by the spin probe technique / A. J. Hooper, J. Heindl, P. Wright, M. P. Eastman, R. G. Kooser // J. Phys. Chem. 1992. -V. 96. P. 5495-5501.

142. Miller, С. Electron spin resonance studies under dynamic mobile phase conditions on chemically modified silica / C. Miller, R. Dadoo, D. G. Kosser, J. Gorse // J. Chromatography. 1988. - V. 458. P. 255-266.

143. Шапиро, А. Б. / А. Б. Шапиро, Б.- В. Розанов, Е. Г. Розанцев, Н. Ф. Кучерова, А. А. Оксанова, Н. Н. Новиков // Известия АН СССР, Сер. Хим. 1974. - С. 867. Bull. Acad. Sci. USSR. Div. Chem. Sci. - 1971. -V. 20. P. 784 (Engl. Transl.).

144. Birrel, G. B. Observation of z-axis anisotropic motion of a nitroxide spin label / G. B. Birrel, О. H. Griffith, D. French//J. Am. Chem. Soc. 1973. -V. 95 P. 8171-8172.

145. Buboltz, J. T. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange / J. T. Buboltz, G. W. Feigenson // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1417. P. 232-245.

146. Mateo, P. R. Liquid-crystalline phases of cholesterol/lipid bilayers as revealed by the fluorescence of trans-parinaric acid / C. R. Mateo, J.-C. Brochon, M. P. Lillo, A. U. Acuna // Biophys. J. 1993. - V. 65. P. 2237-2247.

147. Chiang, Y. W. New methods for determining tie-lines in coexisting membrane phase using spin-label ESR / Y. W. Chiang, J. Zhao, J. Wu, Y. Shimoyama, J. H. Freed, G. W. Feigenson// Biochim. Biophys. Acta-2005. -V. 1668. P. 99-105.

148. Loura, L. M. Fluid-fluid membrane microheterogeneity: a fluorescence resonance energy transfer study // Biophys. J. 2001. - V. 80. P. 776-788.

149. Anderson, T. G. Calorimetric measurement of phospholipids interaction with methyl-(3-cyclodextrin / T. G. Anderson, A. Tan, P. Ganz, J. Seelig // Biochem. 2004. - V. 43. P. 2251-2261.

150. Thomas, D. D. Rotational diffusion studied by passage saturation transfer electron paramagnetic resonance / D. D. Thomas, L. R. Dalton, J. S. Hyde // J. Chem. Phys. 1976. -V. 65. P. 3006-3024.

151. Кузнецов, A. H. / A. H. Кузнецов, В. А. Лившиц // Журнал Физической Химии. -1974.-Т. 48. С. 2295.

152. Lassman, G. Characterization of hydrophobic regions in proteins by spin-labeling technique / G. Lassman, B. Ebert, A. N. Kuznetsov, W. Damerau // Biochim. Biophys. Acta 1973. - V. 310. P. 298-304.

153. Замараев, К. И. Спиновый обмен / К. И. Замараев, Ю. Н. Молин, К. М. Салихов -Наука, Новосибирск, 1977. — 317 с.

154. Budil, D. Е. Non-linear least squares analysis of slow-motion EPR spectra in one and two dimensions using a modified Levenberg-Marquardt algorithm / D. E. Budil, S. Lee, S. Saxena, J. H. Freed // J. Magn. Reson. A. 1996. - V. 120. P. 155-189.

155. Лившиц, В. А. Анализ анизотропии вращения спиновых меток по спектрам Электронного парамагнитного резонанса с переносом СВЧ насыщения / В. А. Лившиц, Ю. А. Бобров // Теоретическая и экспериментальная химия. 1986. - Т. 22. С. 331-336.

156. Stewart, J. J. P. Optimization of parameters for semiempirical methods I. Method / J. J. P. Stewart//J. Comput. Chem. 1989. -V. 10. P. 209-220.

157. Nishijo, J. Interaction of Heptakis (2,3,6-Tri-0-methyl)-ß-cyclodextrin with Cholesterol in Aqueous Solution / J. Nishijo, S. Moriyama, S. Shiota, M. Kamigauchi, M. Sugiura // Chem. Pharm. Bull. 2004. -V. 52. P. 1405-1410.

158. Earle, K. A. 250-GHz electron spin resonance studies of polarity gradients along the aliphatic chains in phospholipid membranes / K.A. Earle, J.K. Moscicki, M. Ge, D.E. Budil, J.H. Freed//Biophys. J. 1994. -V. 66. P. 1213-1221.

159. Hustedt, E. J. Motions of short DNA duplexes: An analysis of DNA dynamics using an EPR-active probe / E. J. Hustedt, A. Spaltenstein, J. J. Kirchner, P. B. Hopkins, B. H. Robinson // Biochem. 1993. - V. 32. P. 1774-1787.

160. Livshits, V. A. Mechanism of relaxation enhancement of spin labeles in membranes by paramagnetic ion salts: dependence on 3d and 4f ions and on the anions / V. A. Livshits, B. G. Dzikovski, D. Marsh // J. Magn. Reson. 2001. - V. 148. P. 221-237.

161. Almeida, P. F. F. Lateral diffusion in the liquid phases of dimyristoylphosphatidylcholine/ cholesterol lipid bilayers: a free volume analysis / P. F. F. Almeida, W. L. C. Vaz, T. E. Thompson // Biochem. 1992. - V. 31. P. 6739-6747.