Гидрофобизованные препараты водорастворимых физиологически активных белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ОД

г '

ТЮРИНА Ольга Петровна = ^

ГИДРОФОБИЗОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ БЕЛКОВ

02.00.15 - химическая кинетика и катализ, 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

^ <

ш<ч>

J

МОСКВА ■ 2000

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Д.х.н., в.н.с. Ларионова H.H. Официальные оппоненты: д.х.н., проф. Каплун А.П.

к.х.н., с.н.с. Мелик-Нубаров Н.С.

Ведущая организация: Российский кардиологический научно-

производственный комплекс МЗ РФ

Защита состоится "/^Г" мая 2000 г. в 16 часов на заседании диссертационного Ученого Совета Д 053.05.76 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " //' 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.х.н. Сакодынская И.К.

Актуальность проблемы. Одной из важных и актуальных проблем фармакологии является создание лекарственных препаратов с повышенной адсорбцией на мембранах и проникновением внутрь клеток. Отвечающая этим требованиям системы доставки белковых и пептидных лекарственных средств обычно получают путем гидрофобизации, которая основана на взаимодействии белков и полипептидов с компонентами мембраны (фосфолипидами, жирными кислотами и т.д.) или их производными.

Данная работа посвящена разработке методов ковалентной и нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков на примере основного панкреатического ингибитора протеиназ (BPTI) и трипсина, которые нашли широкое применение в качестве лекарственных средств.

Трипсин входит в состав лекарственных форм, улучшающих процессы пищеварения, а также для лечения бронхо-легочных и гнойно-воспалительных заболеваний, что связано с его неполитическим действием. Применение BPTI основано на его способности подавлять активность таких протеиназ как трипсин, химотрипсин, калликреин, плазмин, эластаза, что обуславливает его использование в качестве лекарственного средства при различных патологических состояниях, связанных с дисбалансом системы протеолиза.

Существенным недостатком нативного трипсина является его нестабильность по отношению к изменениям рН среды, температурным факторам, денатурирующим агентам, автолизу. Кроме того, т vivo трипсин связывается с ингибиторами крови и тканей. Это, в свою очередь, отражается на времени действия фермента и требует повторения лечебных процедур. Биодоступность BPTI низка, в связи с тем, что ингибитор быстро выводится из организма. Для достижения необходимой концентрации требуется многократное введение высоких доз, что не всегда оправдано с медицинской и экономической точки зрения.

В связи с этим актуальным является систематическое изучение физико-химических свойств липидизированных препаратов BPTI и трипсина, их биологической активности и взаимодействия с клетками, что позволит выявить общие закономерности процессов гидрофобизации водорастворимых белков и сделать обоснованные предложения о путях повышения эффективности лекарственного воздействия данных белков.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка и оптимизация методов ковалентной и нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков. Известно, что наиболее перспективные методы гидрофобизации — это ацшшрование производными карбоновых кислот, конъюгация и комплексообразование с фосфолипидами. В зависимости от использования того или иного способа гидрофобизации можно получить препараты белков с различными характеристиками, от которых будет зависеть конечная лекарственная форма, а также способ и доза введения. Белки, содержащие радикал жирной кислоты, способны связываться с сывороточным альбумином и дольше циркулировать в кровотоке, таким образом данные препараты являются перспективными для внутривенного или внутримышечного введения. Благодаря своим мукоадгезивным свойствам, т.е. сродством к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, ацилированные препараты белков могут быть использованы интраназально. Что касается фосфолипидов, то они являются биодеградируемой матрицей, способной к постепенному высвобождению лекарственного средства и могут быть предложены для перорального введения.

Однако при ковалентной гидрофобизации белков необходимо учитывать многочисленные факторы, влияющие на биологическую активность белка. Более того, получение модифицированных препаратов, содержащих небольшое (1-3) количество гидрофобных радикалов, представляет собой довольно сложную задачу. С другой стороны, нековалентная гидрофобизация белков позволяет, если не полностью избежать, то существенно уменьшить необратимые негативные изменения физико-химических характеристик модифицированных белков.

В связи с этим поставлены следующие основные задачи: 1) Разработка метода ацилирования ВРТ1 производными жирных кислот, позволяющего осуществлять регуляцию числа вводимых остатков жирных кислот, и отделения полученных препаратов от нативного белка и других веществ. Исследование физико-химических свойств модифицированных препаратов ВРТ1 и их взаимодействия с мембраной.

2) Синтез водорастворимых конъюгатов ВРТ1 на основе мультиламеллярных везикул фосфатидилэтаноламина с высоким сохранением активности белка и выходом.

3) Нековалентная гидрофобизация водорастворимых белков - трипсина и ВРТ1 путем комплексообразования с мультиламеллярными везикулами (МЛВ) липидов из бобов сои. Характеристика свойств липидов (размер, структура) и свойств белков (активность, стабильность) в полученных препаратах. Выбор оптимальных условий образования комплексов МЛВ с указанными белками для получения препаратов с наилучшими вышеперечисленными характеристиками.

Научная новизна. 1) Разработан метод ацилирования водорастворимых белков производными жирных кислот в системе органических растворителей, позволяющий препаративно получать препараты с регулируемым количеством вводимых жирнокислотных радикалов. На примере ВРТ1, модифицированного Ы-гидроксисукцинимидньши эф ирами олеиновой и стеариновой кислот в смеси органических растворителей диметилсульфоксид-диметилформамид-диоксан-пиридин, получены препараты ингибитора, содержащие от 1 до 3 ацилированных аминогрупп. Показано, что модификация ВРТ1 по одной аминогруппе с предварительной обратимой защитой активного центра практически не влияет на антитриптическую активность гидрофобизованных препаратов. С увеличением числа ацилированных аминогрупп до трех антитриптическая активность ингибитора уменьшается до 28 % от первоначальной. Увеличение гидрофобности модифицированного ингибитора относительно нативного продемонстрировано спектральным методом и распределением в системе вода-тритон Х-114. Найдено, что абсорбция гидрофобизованного ингибитора монослоем Сасо-2 клеток на один или два порядка в зависимости от препарата выше по сравнению с нативным.

2) Впервые изучено влияние модификации ВРТ1 производными жирных кислот на специфичность белкового ингибитора. Показано, что введение цис-ненасышенных олеоильных радикалов в молекулу ингибитора значительно увеличивает эффективность ингибирования эластазы лейкоцитов человека (Н,ЬЕ), в то время как введение насыщенных стеароильных радикалов приводит к полной потере антиэластазной активности при сохранении антитриптической активности.

Таким образом, перспективность использования в качестве лекарственного препарата олеоильных производных BPTI связана не только с увеличением их адсорбции на мембранах клеток, но и с увеличением сродства к такому медиатору воспалительных процессов как HLE.

3) Усовершенствован метод модификации водорастворимых белков фосфатидилэтаноламином с помощью водорастворимого карбодиимида. На примере BPTI, варьируя значение pH, соотношение реагентов и используя обратимую защиту активного центра молекулы белка цитраконовым ангидридом, были получены препараты с высоким выходом и сохранением ингибирующей активности.

4) Впервые разработан метод нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков, основанный па явлении агрегации МЛВ и последующего их осаждения под действием белков, что позволяет получать белок-липидные комплексы, не содержащие примесей исходных не связавшихся компонентов. Для комплексов МЛВ липидов из сои с трипсином и BPTI был определен состав, размер, структура, активность. Найдено, что в условиях, близких к физиологическим, изученные белки частично или полностью восстанавливали свою биологическую активность. Более того, было продемонстрировано, что включение трипсина в фосфолипидные агрегаты предотвращает его автолиз.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Proceed. Infi. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (Boston, USA, 1999), Symp. on Lipid and Surfactant Dispersed Systems (Moscow, 1999), 6-я Международная конференция "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1999), Proceed. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (Las Vegas, USA, 1998), International Conference "Biocatalysis-98" (Puschino, 1998), International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formulation (Bejing, China, 1998), II Съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997), IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997), IV Конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 1997), Юбилейная научная конференция МАТХТ, посвященная Преображенскому H.A., (Москва, 1996).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного основным методам ковалентной и нековалентной

гидрофобизации белков, влиянию гидрофобизации на физико-химические свойства модифицированных препаратов и перспективности гидрофобизации водорастворимых белков - трипсина и BPTI; экспериментальной части; результатов и их обсуждения; выводов и списка цитированной литературы (244 ссылки). Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, включая 38 рисунков и 26 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У

1. Ковалентная гидрофобизация BPTI

1.1. Ацилмрование BPTI производными жирных кислот

На поверхности молекулы BPTI находится 5 свободных NHi-rpynn (Lys в положениях 15, 26, 41, 46 и Argl), одна из которых - Е-ЫНг-группа остатка Lys 15 -входит в состав активного центра. Ее модификация приводит к полной потере активности белком, поэтому для получения высокоактивного гидрофобизованного препарата необходимо предварительно обратамо защитить данную группу. Предварительные эксперименты показали, что наиболее простым и эффективным методом защиты E-NFk-rpynnbi BPTI является ее цитраконилирование (схема 1).

Схема 1

q nh2 ^^NH

^BPTi)— NH2 + Vo pH 8l°( BPTI 'CH'

N"2 ""^МН, О

ЦА

При подборе условий реакции необходимо было учитывать следующие требования: после цитраконилирования при максимально возможной в данных условиях потере ингибирующей активности ВРТ1 должны оставаться свободные 13 >4Н2-группы для последующей модификацшш. Для этого при проведении реакции с цитраконовым ангидридом варьировались такие параметры, как концентрация белка, мольное соотношение [ЦА] : [ВРТ1] (от 2 : 1 до 4 : 1).

Ацилирование ВРТ1 проводит! в системе органических растворителей диметилсульфоксид-диметилформамид-пирндин-диоксан (7 : 1 : 1 : 0,1). Белок растворяли в смеси диметилсульфоксид-диметилформамид, т.к. предварительно было показано, что активность белка в этой среде сохраняется высокой (около 70 %). Пиридин использовали в качестве катализатора, диоксан - в качестве растворителя для ацилирующего реагента.

В качестве модифицирующих агентов использовали К-гидроксисукцини-мидные эфиры стеариновой и олеиновой кислот. Как было показано ранее, такие реагенты, являясь одними из самых реакционноспособных модификаторов, достаточно устойчивы как в водной, так и в органической среде. Реакцию проводили с эквимольным по отношению к числу свободных ЫНг-групп количеством реагента, и на следующей стадии удаляли цитраконовую защиту (схема 2).

Схема 2

Полученные препараты белка выделялись из реакционной среды осаждением холодным ацетоном или путем вакуумной отгонки растворителей, последнее позволило получить препараты с более высоким выходом и сохранением активности.

Для отделения препаратов гидрофобизованных белков от нативного нами был применен простой и быстрый метод, основанный на известном принципе изоионного осаждения. Согласно этому принципу, некоторые белки способны осаждаться из водных растворов при рН, близком к величине их р1, за счет «слипания» белковых глобул. Из данных табл. 1 видно, что изоионное осаждение после снятия цитраконовой защиты наблюдается только для гидрофобных препаратов ВРИ. Следовательно, в данном случае модифицированные белки имеют более низкие значения р1, чем нативный белок (р! ВРТ1 — 10,5), что

связано, по-видимому, с уменьшением общего положительного заряда за счет модификации ^'Нг-групп. Важно, что при помощи изоионного осаждения оказывается возможным получить активный модифицированный препарат, содержащий только одну ацилированную жирной кислотой аминогруппу.

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле было показано отсутствие нативного ингибитора в выделенных гидрофобизованных образцах. Препараты ВРТ1, содержащие одну модифицированную аминогруппу, сохраняют 85 - 93 % антитриптической активности цитраконилированного ВРИ, выдержанного в среде ацилирования без-добавления ацилирующих реагентов, и децитраконилированного (обозначен - ВРИ'). Следовательно, модификация ВРТ1 по одной аминогруппе практически не влияет на активность гидрофобизованных препаратов. С увеличением числа ацилированных аминогрупп активность препаратов ВРТ1 снижается.

J Доказательством большей гидрофобности модифицированных препаратов ВРИ, являются результаты распределения этих образцов в двухфазной системе вода — тритон Х-114 (табл.1). С увеличением числа модифицированных аминогрупп наблюдается тенденция к увеличению содержания препаратов в органической фазе. Стеароил-ВРТ1 проявляет меньшее сродство к водной фазе по сравнению с олеоил-ВРТ1, что связано с отсутствием ненасыщенной связи в гидрофобном радикале.

Таблица 1

Свойства гидрофобизованных препаратов ВРТ1

Препарат Число Способность к Остаточная Выход Содержание Содержание

модпф-ных осажденшо активность по белка в фазе белка в

1ЧН2-г|>упп белка, % белку, тритона водной фазе,

% Х-114, % %

ВРТ1 — 100 — 37 59

ВРТ11 — 70 (100)" 80 (98)" 28 72

олеоил -ВРТ1 1 + (рН 8-10) 65 (95)' 35 (75)" 62 38

олеоил -ВРТ1 3 + ( рН < 8) 20 15 76 24

сгеаронл - 1 + (рН 8-10) 60 (87)' 23 (70)" 67 33

стеароил - 3 + ( рН < 8) 20 21 80 20

*В скобках указаны свойства препаратов, полученных использованием вакуумной отгонки органических растворителей.

Исследование захвата препаратов ВРТ1 монослоем Сасо-2 клеток, проведенное совместно с группой профессора \У. ЗЬеп (Лос Анжелес, США), используя радиоактивно меченые белки, свидетельствует о большем сродстве к мембране ацилированных производных ВРТ1 (рис. 1). Клеточный захват (Олеоил)3 -ВРТ1, (Стеароил)з-ВРТ1 бьш в 40 и 20 раз выше соответственно по сравнению с нативным белком.

2 0 0

ВРТ1 (Олеоил)з-ВРТ1 (С теароил)3-ВРТ1

Рис. 1. Захват препаратов ВРТ1 монослоем Сасо-2 клеток (нг/ч/мт клеточных белков).

Известно, что ковалентная гидрофобизация может приводить к изменению кинетических параметров у ферментов или ингибиторов. В связи с этим в данной работе было изучено влияние ацилирования ВРТ1 на его константу ингибирования НЬЕ. Из данных таблицы 2 видно, что модификация ВРТ1 производными олеиновой кислоты приводит к увеличению сродства к эластазе. Для стеароильных производных белка взаимодействия с НЬЕ не наблюдалось. По-видимому, присутствие цис-ненасыщенной связи в гидрофобном радикале создает конформацию цепи, наиболее благоприятную для эффективного связывания с ферментом. Одним из основных недостатков ВРТ1 как лекарственного средства является его низкое сродство к эластазе, поэтому повышение эффективности ингибирования НЬЕ является важным результатом.

Таблица 2

Константы ингибирования НЬЕ препаратами ВРТ1

Препарат белка К!, МКМ

ВРТ1 4,2± 0,6

Олеоил-ВРТ! 0,27+0,07

(Олеоил)з-ВРТ! 0,82±0,15

Стеаропл-ВРТ1 не ингибирует

(Стеароил)з-ВРТ! не ингибирует

Таким образом, в результате данной работы синтезированы активные, очищенные от нативного белка и других примесей гидрофобные производные ВРТ1, содержащие от 1 до 3 модифицированных аминогрупп, обладающие большей эффективностью ингибирования эластазы в случае олеоильных производных белка и повышенным сродством к мембранам Сасо-2 клеток.

1.2. Ковалентная гидрофобизация ВРТ1 фосфатидилэтаноламином

Оптимизирован предложенный ранее метод модификации белков соевым фосфатидилэтаноламином с использованием в качестве активирующего агента водорастворимый карбодиимид. С целью сохранения высокой активности конъюгата и предотвращения белок-белковой сшивки ВРТ1 предварительно и "обратимо был защищен по всем аминогруппам цнтраконовым ангидридом (схема 3). Результатом данной реакции является присоединение к молекуле белка радикалов метилмалеиновой кислоты со свободной карбоксильной группой, которая способна вступать в реакцию с карбодиимидом, помимо основных карбоксильных групп, принадлежащих четырем радикалам аспарагиновой (2) и глутаминовой аминокислот (2). Эта побочная реакция может приводить к потере активности белка, т.к. не будет происходить удаление защиты аминогруппы. Известно, что максимум реакционноспособности карбоксильных групп в данной реакции достигается при рН = рКа ±1. Значения рКа метилмалеиновой кислоты, аспарагиновой и глутаминовой аминокислот равны соответственно 5,7 - 6,2, и « 4,0. Исходя из этих значений, для проведения сшивки между цитраконилированным ВРТ1 и соевым ФЭ с помощью водорастворимого

карбодиимида (ЕОС) был выбран рН 4,0, при котором более реакционноспособными оказываются карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой аминокислот.

Схема 3

В ходе реакции наблюдалось образование осадка, поэтому выделение конъюгата после снятия цитраконовой защиты осуществлялось центрифугированием. Далее осадок диспергировали при рН 8,0 (при кислых . значениях рН осадок не диспергировался). Методом электрофореза было показано, что растворенный осадок представляет собой белок-липидный конъюгат, не содержащий нативного белка

Из данных таблицы 3 видно, что с уменьшением количества используемого ЕЭС уменьшается осаждение белка и, следовательно, увеличивается мольное соотношение ФЭ/ВРТ1, т.е. на каждую везикулу фосфолипидного препарата приходится меньшее количество молекул белка. Эти данные хорошо согласуются с вышеприведенными рассуждениями об участии в реакции карбоксильных групп остатков метилмалеиновой, аспарагиновой и глутаминовой кислот в зависимости от концентрации ЕБС: чем меньше точек связывания, тем меньше белка осаждается в составе конъюгата.

Таблица 3

Влияние [ЕБС] на активность и выход конъюгатов

[ЕЭС]/[ВРТ1], Сохранение Выход, % ФЭ/ВРТ1 в конъюгате,

м/м ■ ингибирующей активности, % моль/моль

100 15 100 30: 1

50 25- 100 30: 1

40 55 85 ■ 35: 1

30 85 75 40: 1

10 100 70 45: 1

Таким образом, разработан метод ковалентной модификации ВРТ1 фосфатидилэтаноламином с помощью водорастворимого карбодиимида, получены препараты с высоким выходом и сохранением активности, содержащие до 45 молекул фосфолипида на молекулу белка.

2. Нековалентная гидрофобизация водорастворимых белков мультиламеллярныма везикулами соевых фосфолипидов

Известно, что мультиламеллярные везикулы (МЛВ) фосфолипидов широко используются в качестве носителей белковых лекарственных средств, а также как самостоятельные лекарственные средства для лечения атеросклероза, хронического гепатита, бронхо-легочных заболеваний (в составе масляных ингаляций), а также для профилактики рака (в качестве пищевой добавки). В настоящей работе липидные препараты МЛВ были выбраны таким образом, что каждый следующий образец отличался от предыдущего на один фосфолшшдный или нефосфосфолипидньш компонент (таблица 4). Водные дисперсии данных препаратов были охарактеризованы по размеру методом турбидиметрии (размеры лигшдных агрегатов составили 0,5-2 мкм).

Таблица 4

Состав липидных препаратов

Препарат Количество фосфолипидов, % от массы препарата Другие компоненты, % от массы препарата Содержание индивидуальных фосфолипидов , % от суммы всех фосфолипидов

Жирные кислоты Сапонины, сапогенины Белки ФХ ФЭ ФИ ФГ ' л-ФХ

ЛП-1 59±3 8±1 30 4,5±0,5 42±2 20±2 18±2 13±1 7+1

ЛП-2 87±3 11+1 3,5+0,3 42±2 20±2 18±2 13+1 7+1

лп-з 98±2 56±2 20+2 8±1 8±1 7±1

ЛП-4 98±2 44+2 22±2 34±2

ЛП-5 98±2 67±3 33±2

ЛП-6 98+2 98±2

*ФХ — фосфапиплхолнн, ФЭ — фосфатидилэтаноламин, ФИ — фосфатидилнношт, ФГ — фосфатидилглн церии, л-ФХ — лшо-ФХ.

Нековалеитная гидрофобизация водорастворимых белков - трипсина и ВРТ1 соевыми МЛВ была основана на явлении агрегации фосфолипидных везикул под действием белка. Необходимо заметить, что данный подход позволил получить белок-липидные комплексы в "чистом" виде, т.е. отделить их не только от несвязавшегося белка, но и от несвязавшихся фосфолипидов, что невозможно осуществить гель-фильтрацией, широко применяющейся для такого рода целей. Комплексообразование проводили при двух значениях рН - 3,0 и 8,0. Выбор именно этих значений рН обусловлен несколькими факторами:

1) влиянием рН среды на суммарный заряд молекул основных белков -трипсина и ВРТ1 (при понижении рН ниже 10,5 суммарный положительный заряд на молекулах белков увеличивается);

2) влиянием рН среды на заряд молекул фосфолипидов (рКа многих кислых липидов лежит в районе 2-4, следовательно, при повышении рН среды суммарный отрицательный заряд на поверхности фосфолипидных агрегатов увеличивается);

3) влиянием рН среды на фазовое состояние фосфолипидов (например, кислые липиды способны подвергаться Ьа-Нц переходу при понижении рН среды до значения их рКа;

4) влиянием рН среды на активность трипсина и ВРТ1 (при рН 8,0 трипсин и ВРТ1 обладают наибольшей биологической активностью).

Осадки, полученные при рН 3,0 и 8,0, для дальнейших исследований диспергировали при рН 8,0. Размеры везикул комплексов, определенные методом гурбидиметрии, составили 1-2 мкм. Методом электрофореза в полиакриламидном геле было показано, что при диспергировании в трис-НС1 буфере (рН 8,0) комплексы, образованные при различных значениях рН и с различными липидными препаратами, не разрушаются. Большая гидрофобность белков в составе комплексов по сравнению с нативными была показана исследованием их распределения в системе тритон Х-114- вода (таблица 5).

Таблица 5

Относительная константа распределения комплексов трипсина и ВРТ1

в системе тритон Х-114 - вода

Липидный Кр (ВРТ1+Фосфолипиды) /Кр Кр (Тр+Фосфолипиды) /Кр

препарат рНЗ,0 рН 8,0 рН 3,0 рН 8,0

ЛП-1 10,0 — 11,0 5,6

ЛП-2 3,1 5,6 2,4 2,2

ЛП-3 5,4 6,0

*КР = [белок тритон Х-1]4' [беЛОк]воаа

Из данных таблицы 6 видно, что добавление белков ко всем фосфолипидным образцам независимо от рН среды приводило практически к полному осаждению фосфолипидов. Содержание белков в осажденных комплексах зависело от рН среды и типа фосфолипидного препарата. Так, при переходе от рН 8,0 к рН 3,0 наблюдали увеличение осаждения трипсина и ВРТ1 для каждого липидного препарата. Кроме того, количество связавшегося белка возрастало при увеличении содержания отрицательнозаряженных компонент в липщшых препаратах. Полученные данные хорошо согласуются с представлением об электростатической природе связывания данных белков с фосфолипидами. Этот тип взаимодействия может осуществляться между положительно заряженными аминокислотными остатками молекулы белка (лизин, аргинин) и отрицательно заряженными головками фосфолипидов.

Таблица б

Состав ВРТ1-Н трнпсин-липидных комплексов

Липидный препарат Осаждено в комплексе, вес. % от исходного

Фосфолипиды ВРТ1 Фосфолипиды Трипсин

рН 3,0 рН 8,0 рНЗ,0 рН 8,0 рН 3,0 рН 8,0 рН 3,0 рН 8,0

ЛП-1 96+2 96±3 70+3 20±5 90+5 90+5 65±3 33±2

ЛП-2 96±3 96±1 60+4 52±2 90±5 90±5 45±3 22+2

ЛП-3 98±2 94±3 50±2 26±3 90+5 90±5 36±2 18+2

ЛП-4 97+3 96+2 65±5 37+2 — — — —

ЛП-5 95+4 93 ±2 30+2 10±3 — — — —

ЛП-6 68±3 — 10±3

Для полной характеристики физико-химических свойств комплексов было изучено влияние белков на структуру лииидов методом 31Р ЯМР спектроскопии широких линий (рис. 2).

Рис. 2.31Р ЯМР спектры липидных и белок-липидных препаратов: А - ЛП-1, ЛП-6; В - ЛП-5; С - ЛП-2, ЛП-3, ЛП-4; О - ЛП-2,3,4+белок, рН 3,0, ЛП-3 +белок, рН 8,0.

Из полученных данных следует, что 1) белки оказывают одинаковое влияние на структуру МЛВ; 2) добавлеше белков вызывало значительные изменения в структуре фосфолипидов (частичный или полный сдвиг бислоя в изотропную фазу) только в случае образцов фосфолипидов, изначально содержащих две фазы: бислой и изотропную (для ЛП-2, ЛП-3 и ЛП-4, рН 3,0). Такое структурное поведение может быть связано с тем, что положительно заряженные белки способны нейтрализовать отрицательно заряженные головки фосфолипидов, в результате фосфолипиды группируются в более компактную с большей гидрофобной поверхностью структуру (кубическую или ромбическую). Этот факт представляет интерес в связи с гипотезой о том, что небислойные структуры играют роль в перемещении липидов через бислой, в слиянии мембран, а также при экзо- и эндоцитозе белков.

Данные по изучению активности ВРТ1- и трипсин-липидных комплексов, образованные при рН 3,0 и рН 8,0 представлены на рис. 3. ВРТ1 в составе комплексов через 1 час после получения проявлял минимальную активность. При концентрации трипсин-липидных комплексов вплоть до 0,1 мг/мл белок в их составе не обладал ферментативной активностью. При дальнейшем разбавлении происходила десорбция фермента, обусловленная уменьшением размеров фосфолипидных везикул. Для восстановления "скрытой" активности исследовали влияние на активность белок-липидных комплексов ионного детергента дезоксихолата натрия (ДОХ). Используемая нами концентрация ДОХ - 2,5 % соответствует ее физиологической концентрации в дуоденальном содержимом. Это позволяет соотнести наблюдаемые нами эффекты с возможным поведением белок-липидных комплексов в тонком кишечнике.

Согласно результатам, представленным на рис. ЗА, инкубирование трипсин-липидных комплексов в концентрации 0,3 мг/ мл в растворе детергента приводило к повышению активности трипсина до 45%. В случае действия детергента на разбавленные растворы комплексов (концентрация 0,05 мг/мл), активность трипсина в растворе достигала 70%. Таким образом, наблюдали аддитивность между действием разбавления и детергента на восстановление активности трипсина в составе белок-липидных комплексов.

рН 3,0

рН 8,0

* 100-,

А

у 80-

5 60-

*

< 40-

20-

0-

М 0,3 мг/мл I I 0,3 мг/мл + ДОХ ЕГ~И 0,05 мг/мл

0,05 мг/мл + ДОХ

ЛП-1

ЛП-2

Л

лп-з

Ю0-|

£ 80-

ё

о 60-

5

1 40.

20-

ВЯ 0,3 мг/мл I I 0,3 мг/мл + ДОХ Г;':. 10,05мг/мл НИИ 0,05 мг/мл + ДОХ

ЛП-1

в

ЛП-2

лп-з

р

юо * 80

£ 60 | 40-< 20

через 1 час I I через 1 неделю [™Э через 1 час + ДОХ ЛП-З

ЛП-2

ЛП-4

1

1М через 1 час лп 4

юо-, I I через 1 неделю

Я П -5

ЛП-5

ЛП-1

Рис. 3. Активность трипсин- (А) и ВРТ1-липидных комплексов (Б), осажденных прирН 8,0 и 3,0.

При действии ДОХ на ВРТЬлипидные комплексы активность ингибитора возрастала относительно исходной для всех образцов, и наблюдалась та же тенденция - в случае белок-липидных комплексов, полученных при рН 8,0 активность выше (рис. ЗБ). Методом электрофореза было показано отсутствие нативных белков в дисперсиях белок-липидных комплексов после добавления ДОХ, т.е. при действии ионного детергента белки остаются в составе комплексов.

С другой стороны, нам удалось показать для некоторых образцов, что взаимодействие ингибитор-липид обратимо при изучении активности ВРТ1-липидных комплексов через неделю после их получения (комплексы хранились при 0°С, ВРИ не теряет своей активности в растворе в течение недели при 0° С). Было найдено, что активность появлялась только у комплексов, образованных ЛП-

4 и ЛП-5, причем вплоть до 100 % (рис. ЗБ), что, согласно данным электрофореза в системе Reisfeld, обусловлено появлением нативного белка. Известно, ' что мультиламеллярные везикулы характеризуются неоднородностью по размерам, и существует равновесие между фракциями разных размеров. По-видимому, высвобождение нативного белка происходит в процессе измельчения данных липидных агрегатов, что было продемонстрировано методом упругого светорассеяния: в случае ЛП-4 и ЛП-5 после недели хранения наблюдается уменьшение вклада фракции с размером более 1 мкм с 60-70 % до 20-30 %.

Более того, важно подчеркнуть, что 100 % восстановление активности означает отсутствие инактивации молекул ингибитора при взаимодействии с ЛП. В остальных образцах белок полностью оставался в составе комплексов, что говорит о стабильности белок-липидных комплексов, образованных ЛП-1, ЛП-2 и ЛП-3.

Отличительной чертой трипсина является его нестабильность в условиях максимальной активности (pH 8,0), что обусловлено процессом автолиза. Ранее для получения стабильной формы трипсина применяли связывание его с различными носителями. В настоящей работе для стабилизации трипсина использовали его комплексообразование с фосфолипидами. Влияние липидов на стабильность трипсина в составе комплекса изучали методом флуоресцентной спектроскопии при длине волны 295 нм, селективно возбуждающей остатки триптофана в белке. Спектры флуоресценции нативного трипсина при обоих значениях pH среды в начальный момент времени и при pH 3,0 через 4 ч инкубации были идентичны и имели максимум в области 330 нм (рис.4А). Напротив, после инкубирования трипсина в течение 4 ч при pH 8,0 (25° С), когда происходит автолиз молекул фермента и полная потеря активности, максимум флуоресценции смещается к 355 нм (рис. 4А), что говорит о переходе остатков триптофана, находящихся внутри нативной глобулы белка в гидрофобном микроокружешш, в полярное водное микроокружение. При инкубировании белок-липидных комплексов в этих же условиях пик при 355 нм появлялся лишь спустя двое суток (рис. 4Б). Более того, фермент в присутствии липидов через 4 ч при pH 8,0 сохранял активность на том же уровне относительно исходной. По-видимому, комплексообразование между трипсином и липидами сои стабилизирует белок,

предотвращая процесс автолиза трипсина за счет пространственного разделения молекул фермента в липидных агрегатах.

Рис. 4. Спектры флуоресценции нативного трипсина (А) и трипсина-липидного комплекса с ЛП-1 (Б), [трипсин] при инкубации 1мг/мл.

В итоге получены комплексы ВРТ1 и трипсина с соевыми лшшдами с высоким выходом, с определенным составом, размерами, структурой, способные восстанавливать активность в условиях, близких к физиологическим. Сравнивая вышеперечисленные параметры у комплексов с различными липидными препаратами и учитывая другой немаловажный параметр - стоимость, можно рекомендовать для дальнейших исследований в качестве лекарственного препарата - комплекс белков с экстракционными липидами (ЛП-1), полученный при рН 3,0.

19 ***

Таким образом, в представленной работе разработаны три метода ковалентной и нековалентной гидрофобнзации, позволяющие препаративно получать модифицированные белки с высоким выходом и активностью, полностью очищенные от примесей. Более того, необходимо подчеркнуть, что данные методы могут быть применены и к другим белкам, учитывая ограничения для каждого:

1) для ацилирования в среде органических растворителей — растворение белка в этой среде и сохранение его конформации;

2) для конъюгирования с ФЭ с помощью карбодиимида — сохраните активности белка после его модификации по карбоксильным группам остатков глутаминовой-и аспарагиновой кислот;

3) для комплексообразования с МЛВ фосфолипидов — способность белка вызывать агрегацию фосфолипидных везикул.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод ковалентной гидрофобнзации водорастворимых белков производными жирных кислот в смеси органических растворителей. С использованием ТчГ-гидроксисукцинимидного эфира олеиновой и стеариновой кислот в системе диметилсулъфоксид-диметилформамид-диоксан-пиридин получены активные гидрофобизованные препараты ВРТ1 с высоким выходом, содержащие от 1 до 3 аминогрупп, ацилированных остатками жирных кислот.

2. Увеличение гидрофобности ацилированных препаратов ВРТ1 по сравнению с нативным показано спектральным методом, их распределением в двухфазной системе тритон Х-114- вода и их захватом монослоем Сасо-2 клеток.

3. Оптимизирован метод конъюгации водорастворимых белков с фосфатидилэтаноламином с использованием бифункционального агента — карбодиимида. На примере ВРТ1 синтезированы высокоактивные конъюгаты с высоким выходом, содержащие от 30 до 45 молекул фосфатидилэтаноламина на молекулу белка.

4. Разработан метод нековалентной гидрофобнзации водорастворимых белков мультиламеллярными везикулами фосфолипидов, основанный на явлении

агрегации МЛВ под действием белков. Получены комплексы на примере ВРТ1 и трипсина с лшщцными препаратами из сои.

5. Найдено, что состав белок-липидных комплексов зависит от рН среды образования и содержания отрицательнозаряженных компонент в липидных препаратах. Продемонстрировано влияние белков на структурную организацию водных дисперсий липидных препаратов, изначально формирующих в водной среде две фазы — бислой и изотропную.

6 Исследована зависимость активности ВРТ1- и трипсин-липидных комплексов от добавления 2,5 % ДОХ, от времени хранения ВРТ1-липидных комплексов в в щелочном растворе и от концентрации трипсин-липидных комплексов. Сделан вывод об отсутствии инактивации молекул белков при комплексообразовании и восстановлении активности белков в составе комплексов вплоть до 70 % в условиях, близких к физиологическим в дуоденальном содержимом.

7. Показано, что комплексообразование трипсина с липидами сои стабилизирует белок, предотвращая его автолиз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

.1. Larionova N.I., Moroz N.A., Tyurina О.Р. Molecular design, characterization and pharmacological activity of conjugates of protein proteinase inhibitors. // S.'T.P. Pharma Sciences, 1999, v. 9, № 1, c. 65-80.

2. Тюрина О.П., Малых Е.В., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. (1998). // Модификация основного панкреатического ингибитора протеиназ производными жирных кислот. Биоорганическая химия, т. 24, № 5, с. 301-304.

3. Малых Е.В., Тюрина О.П., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Влияние гидрофобизащш основного панкреатического ингибитора протеиназ на эффективность ингибирования трипсина быка и эластазы лейкоцитов человека. // Биохимия, 1998, т. 63, № 10, с. 1317-1319.

4 Мартынова О.М., Сорокоумова Г.М., Селшцева А.А., Алексеева С.Г., Тюрина О.П., Швец В.И. Определение периферических полипептидов, содержащихся в липидных экстрактах сои, и изучение их влияния на структурную организацию фосфолипидов. // Бюллетень экспериментальной биохимии и медицины, 2000, т. 129, № 2, с. 159-162.

5. Дябина О.С., Селшцева А. А., Сорокоумова Г.М., Тюрина О.П., Ларионова Н.И., Швец В.И. Фосфолипиды сои: физико-химические свойства водных дисперсий и взаимодействие с ингибиторами протеаз. // Тез.докл., Юбилейная научная конференция МАТХТ, посвященная Преображенскому Н.А., Москва, 1996, с. 139-141.

6 Казанская Н.Ф., Мороз Н.А., Тюрина О.П., Потешнова Е.В., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Взаимодействие трипсина с гликозилированными и гидрофобными конъюгатами апротинина. // Тез.докл., II Съезд биохимического общества РАН, Москва, 1997, с. 34.

7. Казанская Н.Ф., Тюрина О.П., Потешнова Е.В., Воробьев Д.А., Ларионова Н.И., Мороз Н.А., Хромов Г.Л., Гладышева И.П., Балабушевич Н.Г. Мембранотропные и биоадгезивные антипротеолитики широкого спектра действия. // Тез.докл., IV Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 1997, с. 55.

8. Тюрина О.П., Потешнова Е.В., Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф. Модификация основного панкреатического ингибитора протеиназ производными жирных кислот. // Тез.докл., IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов" Москва, 1997, с. 123.

9. Селишева А.А., Тюрина О.П., Сорокоумова Г.М., Алексеева С.Г., Швец В.И., Ларионова Н.И. Регуляторная функция белок-липидного взаимодействия на примере комплекса между белковыми ингибиторами протеиназ и фосфолипидами сои. // Тез.докл., II Съезд Биохимического Общества РАН, Москва, 1997, с. 64.

10. Martynova О.М., Tiourina О.Р., Alekseeva S.G., Sorokoumova G.M., Selischeva A.A., Larionova N.I., Shvets V.I. Study on properties of lipid-protein complexes between trypsin and soybean phospholipids. // International Conference "Biocatalysis-98", Puschino, Russia, 1998, p. 45.

11. Tyurina O.P., Malykh E.V., Selischeva A.A., Sorokoumova G.M., Sharf T.I., Larionova N.I. Lipidation of protein proteinase inhibitors. // International Conference "Biocatalysis-98", Puschino, Russia, 1998, p. 64.

12. Larionova N.I., Malykh E.V., Tiourina O.P. Fatty acid derivatives of protein proteinase inhibitors. // Proceed. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.: 25, 1998, Las Vegas, USA, p. 243-244.

13. Tyurina O., Malykh E., Shen W.-C., Larionova N.I. Increase of cellular uptake by conjugation of protein protease inhibitors with fatty acids. // International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formulation, 1998, Bejing, China, p.91-92.

n Tyurina O.P., Selischeva A.A., Sorokoumova G.M., Sharf T.I. Complexes and conjugates of soybean phospholipids with aprotinin.// International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formulation, 1998, Bejing, China, p. 89-90.

15. Tiourina O., Malykh E, Larionova N. and Shen W.-C. Lipidation of protein proteinase inhibitors for improving their cell membrane absorption. // Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.: 26, 1999, Boston, USA, p. 863-864.

16. Tiourina O., Martynova 0., Selischeva A., Zhatikov P. and Larionova N. Preparation and characterization of soybean lipid dispersed systems with trypsin. // Symp. on Lipid and Surfactant Dispersed Systems, Moscow, 1999, p. 221-222.

17. Мартынова O.M., Тюрина О.П., Сорокоумова Г.М., Селшцева А.А., Алексеева С.Г., Ларионова Н.И. Стабилизация трипсина при образовании комплекса с фосфолипидами сои. //Тез.докл., 6-я Международная конференция "Наукоемкие химические технологии", Москва, 1999, с. 190-191.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КОВАЛЕНТНАЯ ГИДРОФОБИЗАЦИЯ БЕЛКОВ/ПЕПТИДОВ

1.1. Методы ковалентной гидрофобизации белков/пептидов

1.1.1. Использование фосфолипидов.

1.1.2. Ацилирование белков/пептидов производными органических кислот и аминов.

1.2. Среды для ковалентной гидрофобизации белков/пептидов, производными жирных кислот.

1.3. Влияние ковалентной гидрофобизации на физико - химические свойства белков/пептидов

ГЛАВА 2. НЕКОВАЛЕНТНАЯ ГИДРОФОБИЗАЦИЯ БЕЛКОВ ФОСФОЛИПИДАМИ

2.1. Классификация и физико-химические характеристики фосфолипидов.

2.1.1. Модельные системы липидов.

2.1.2. Основные фазовые состояния водно-липидных смесей.

2.1.3. Методы изучения полиморфизма липидов.

2.1.4. Методы определения средних размеров липидных агрегатов

2.1.5. Агрегация липидных везикул.

2.2. Комплексообразование водорастворимых белков с фосфолипидами

2.2.3. Влияние нековалентной гидрофобизации фосфолипидами на активность и стабильность белков

ГЛАВА 3. КОВАЛЕНТНАЯ И НЕКОВАЛЕНТНАЯ

ГИДРОФОБИЗАЦИЯ БЕЛКОВ КАК СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ИХ СРОДСТВА К МЕМБРАНЕ И ПРОНИКНОВЕНИЯ ВНУТРЬ КЛЕТОК.

ГЛАВА 4. ВОДОРАСТВОРИМЫЕ БЕЛКИ - BPTI И ТРИПСИН КАК ОБЪЕКТЫ ГИДРОФОБИЗАЦИИ

4.1. Структура и свойства молекул BPTI и трипсина.

4.2. Перспективность гидрофобизации BPTI и трипсина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. Исходные вещества.

5.2. Методы исследования

5.2.1. Модификация BPTI производиыми жирных кислот:

A) в системе ДОХ-Н?()-диоксан.

Б) в системе обращенных мицелл АОТ-НтО-октан.

B) в среде органических растворителей ДМСО-ДМФА-диоксаи-пиридин.

5.2.2. Отделение BPTI, ацилированного производными жирных кислот, от нативного белка путем изоионного осаждения .;.

5.2.3. Определение содержания аминогрупп в ацилированных препаратах BPTI.'.

5.2.4. Модификация BPTI фосфатидилэтаноламином с помощью водорастворимого карбодиимида.

5.2.5. Получение мультиламеллярных и моноламеллярных везикул

5.2.6. Получение комплексов трипсина с фосфолипидными препаратами.

5.2.7. Получение комплексов BPTI с фосфолипидными препаратами (мультиламеллярными везикулами и малыми моноламеллярными везикулами).•.'.

5.2.8. Определение содержания фосфолипидов по методу Васьковского

5.2.9. Определение содержания белка в гидрофобизованных препаратах

A) метод Бредфорд

Б) метод Jloypu

B) модифицированный метод Jloypu

5.2.10. Определение активности трипсин-липидных комплексов.

5.2.11. Определение антитриптической активности

A) ацилированных препаратов BPTI.

Б) BPTI-липидных комплексов.

B) BPTI-липидных комплексов в присутствии ДОХ.

5.2.12. Фазовое распределение гидрофобизованных препаратов BPTI и трипсина в системе вода-тритон Х-114.

5.2.13. Электрофорез препаратов белков в полиакриламидном гече (Ds-Na-электрофорез и электрофорез в системе Reisfeld)

5.2.14. Определение константы ингибирования эластазы лейкоцитов человека препаратами BPTI.

5.2.15. Гель-фильтрация комплексов BPTI с малыми моноламеллярными везикулами (ММВ).

5.2.16. Измерение зависимости светорассеяния малых моноламеллярных везикул (ММВ) от концентрации ВРТ1.

5.2.17. Вторая производная спектров УФ поглощения ацилированных препаратов ВРТ1.

5.2.18. Регистрация спектров флуоресценции трипсина и трипсин липидных комплексов.

5.2.19. Определение размера ММВ методом квази-упругого светорассеяния.

5.2.20. Определение размера МЛВ и белок-липидных комплексов методом турбидиметрии.

5.2.21. Метод 31Р-ЯМР спектроскопии высокого разрешения.

5.2.22. Метод 31РЯМР спектроскопии широких линий.

5.2.23. Изучение захвата ацилированных препаратов ВРТ1 монослоем

Сасо-2 клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. КОВАЛЕНТНАЯ ГИДРОФОБИЗАЦИЯ ВРТ1 6.1. Ацилирование ВРТ1 производными жирных кислот

6.1.1. Реакционные среды ацилирования ВРТ1.

6.1.2. Влияние органических растворителей на свойства нативного препарата ВРТ1.#

6.1.3. Выбор оптимальных условий для модификации ВРТ1 и выделения ацилированных препаратов в среде органических растворителей

6.1.4. Сравнительные характеристики гидрофобизованных препаратов

ВРТ1.

6.1.5. Ингибирование эластазы лейкоцитов человека препаратами ВРТ1.

6.1.6. Изучение захвата препаратов ВРТ1 монослоем Сасо-2 клеток

6.2. Модификация ВРТ1 фосфатидилэтаноламином с помощью карбодиимида.;.

ГЛАВА 7. НЕКОВАЛЕНТНАЯ ГИДРОФОБИЗАЦИЯ ВРТ1 И

ТРИПСИНА.

7.1. Характеристика липидных препаратов.

7.1.1. Состав фосфолипидного экстракта сои (ЛП-1).

7.1.2. Состав фосфолипидного экстракта сои, обработанного 0,1 М

N.аС1 (ЛП-2).

7.1.3. Модельные системы фосфолипидов.

7.1.4. Размер фосфолипидных агрегатов липидных препаратов сои в воде.

7.1.5. Структурная организация липидных препаратов сои в воде

7.2. Комплексообразование BPTI и трипсина с соевыми липидами

7.2.1. Гель-фильтрация BPTI-липидных комплексов.

7.2.2. Изучение агрегации ММВ под действием BPTIметодом турбидиметрии.

7.2.3. Оптимизация параметров комплексообразования BPTI и трипсина с соевыми фосфолипидами

7.2.4. Влияние трипсина и BPTI на размер и структуру фосфолипидов

7.2.5. Изучение гидрофобности белок-липидных комплексов.

7.2.6. Изучение состава трипсин- и BPTI-липидных комплексов.

7.2.7. Зависимость активности трипсина от концентрации его комплексов с липидами.

7.2.8. Изучение активности трипсин- и BPTI-липидных компле>ссв в присутствии детергентов.,.

7.2.9. Исследование стабильности трипсина в составе комплексов с липидами.

ВЫВОДЫ.

Одной из важных проблем фармакологии является создание лекарственных препаратов с повышенной адсорбцией на мембранах и проникновением внутрь клеток. Отвечающая этим требованиям системы доставки белковых и пептидных лекарственных средств обычно получают путем гидрофобизации, которая основана на взаимодействии белков и полипептидов с компонентами мембраны (фосфолипидами, жирными кислотами и т.д.) или их производными.

Данная работа посвящена разработке методов ковалентной и нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков на примере основного панкреатического ингибитора протеиназ (ВРТ1) и трипсина, которые нашли широкое применение в качестве лекарственных средств.

Систематическое изучение физико-химических свойств липидизированных препаратов ВРТ1 и трипсина, их биологической активности и взаимодействия с клетками позволит выявить общие закономерности процессов гидрофобизации водорастворимых белков и сделать обоснованные предположения о путях повышения эффективности лекарственного воздействия данных белков. 9

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

151 ВЫВОДЫ

1. Разработан метод ковалентной гидрофобизации водорастворимых белков производными жирных кислот в смеси органических растворителей. С использованием 1Ч-гидроксисукцинимидного эфира олеиновой и стеариновой кислот в системе диметилсульфоксид-диметилформамид-диоксан-пиридин получены активные гидрофобизованные препараты ВРТ1 с высоким выходом, содержащие от 1 до 3 аминогрупп, ацилированных остатками жирных кислот.

2. Увеличение гидрофобности ацилированных препаратов ВРТ1 по сравнению с нативным показано спектральным методом, их распределением в двухфазной системе тритон Х-114- вода и их захватом монослоем Сасо-2 клеток.

3. Оптимизирован метод конъюгации водорастворимых белков с фосфатидилэтаноламином с использованием бифункционального агента — карбодиимида. На примере ВРТ1 синтезированы высокоактивные конъюгаты с высоким выходом, содержащие от 30 до 45 молекул фосфатидилэтаноламина на молекулу белка.

4. Разработан метод нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков мультиламеллярными везикулами фосфолипидов, основанный на явлении агрегации МЛВ под действием белков. Получены комплексы на примере ВРТ1 и трипсина с липидными препаратами из сои.

5. Найдено, что состав белок-липидных комплексов зависит от рН среды образования и содержания отрицательнозаряженных компонент в липидных препаратах. Продемонстрировано влияние белков на структурную организацию водных дисперсий липидных препаратов, изначально формирующих в водной среде две фазы — бислой и изотропную.

6. Исследована зависимость активности ВРТ1- и трипсин-липидных комплексов от добавления 2,5 % ДОХ, от времени хранения ВРТ1-липидных комплексов в в щелочном растворе и от концентрации трипсин-липидных комплексов. Сделан вывод об отсутствии инактивации молекул белков при комплексообразовании и восстановлении активности белков в составе комплексов вплоть до 70 % в условиях, близких к физиологическим в дуоденальном содержимом.

7. Показано, что комплексообразование трипсина с липидами сои стабилизирует белок, предотвращая его автолиз.

1. Sinha D. and Karush F. Attachment to membranes of exogenous immunoglobulin conjugated to a hydrophobic anchor. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1979, v. 90, p.554-560.

2. Бурлакова Е.Б. Липиды, структура, биосинтез, превращения и функции. М., Наука, 1977, с. 16-27.

3. De Kruijff В. and Cullis P.R. Cytochrome с specifically induces non-bilayer structures in cardiolipin-containing model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 602, p.477-490.

4. Несмеянова M.A. О возможном участии кислых фосфолипидов в транслокации секретируемых белков через цитоплазматическую мембрану бактерий. Мол. Биол., 1982, т. 16, с. 821-828.

5. Sinha D. and Karush F. Specific reactivity of lipid vesicles conjugated with oriented anti lactose antibody fragments. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 684, p. 187.

6. Jansons V.K. and Mallet P.L. Targeted liposomes: a method for preparation and analysis. Anal. Biochem., 1981, v. Ill, p. 54-68.

7. Weissig V. A new hydrophobic anchor for the attachment of proteins to liposomal membranes. FEBS Lett., 1986, v. 202, p. 86-95.

8. Thompson N.L., Brien A.A. and McConnel H.M. Covalent linkage of a synthetic peptide to a fluorescent phospholipid and its incorporation into supported phospholipid monolayers. Biochem. Biophys. Acta, 1984, v. 772, p. 10-15.

9. Bogdanov A.A., Klibanov A.L. and Torchilin V.P. Protein immobilization on the surface of liposomes via carbodiimide activation in the presence of N-hydroxysulfosuccinimide. FEBS Lett., 1988, v. 231, p. 381-384.

10. Niedermann G., Weissig V., Sternberg B. and Lasch J. Carboxyacyl derivatives of cardiolipin as four-tailed hydrophobic anchors for the covalent coupling of hydrophilic proteins to liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1070, № 2, p. 401-408.153

11. Левашов А.В., Кабанов А.В., Хмельницкий Ю.Л., Березин И.В., Мартинек К. Химическая модификация белков водо-нерастворимыми реагентами. Докл. АН СССР, 1984, т. 278, с. 246-249.

12. Goldmacher V.S. Immobilization of protein molecules on liposomes. Anchorage by artificially bound unsaturated hydrocarbon tails. Biochem. Pharmacol., 1983, v. 32, p. 1207-1210.

13. Москвичев Б.В., Поляк М.С. Иммобилизованные ферменты, Изд-во Университет МГУ, 1991, с. 45.

14. Plou F.J. and Ballesteros A. Acylation of subtilisin with long fatty acyl residues affects its activity and thermostability in aqueous medium. FEBS Lett., 1994, v. 339, p. 200204.

15. Ohshima A., Narita H. and Kito M. Phospholipid reverse micelles as a milieu of an enzyme reaction in an apolar system. J. Biochem., 1983, v. 93, p. 1421-1425.

16. Кабанов A.B., Клибанов А.Л., Торчилин В.П., Мартинек К., Левашов А.В. Эффективность ацилирования аминогрупп белка хлорангидридами жирных кислот в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Биоорган. Химия, 1987, т. 13, с. 1321-1324.

17. Hornebeck W., Moczar Е., Szecsi J. and Robert L. Fatty acid peptide derivatives as model compounds to protect elastin against degradation by elastases. Biochem. Pharmacology, 1985, v. 34, p. 3315-3321.

18. Bijsterbosch M.K., Schouten D. and van Berkel T.J. Synthesis of the dioleoyl derivative of iododeoxyuridine and its incorporation into reconstituted high density lipoprotein particles. Biochemistry, 1994, v. 33, p. 14073-14080.

19. Гауптман 3., Грефе Ю., Ремане X. "Органическая химия" М: Химия, 1979, с. 595.

20. Lapidot Y., Rappoport S., Wolman Y. Modified aminoacyl-tRNA. 3. A general procedure for the synthesis of dipeptidyl transfer RNA. J. Lipid Research, 1967, v. 8, p. 142-145.154

21. Shorn M., Atsushi S., Keigo Y. Lipophilic peptide synthesis of lauroylthyrotropin-releasing hormone and its biological activity. Pharm. Res., 1991, v. 8, № 5, p. 649-652.

22. Visser L. and Blout E. R. The use of p-nitrophenyl N-tert-butyloxycarbonyl-L-alaninate as substrate for elastase. Biochem. Biophys. Acta, 1972, v. 268, p. 257-260.

23. Максименко A.B. Модифицированные препараты супероксидцисмутазы и каталазы для защиты сердечно-сосудистой системы легких. Успехи Совр. Биологии, 1993, т. 113, с. 351-364.

24. Ekrami Н.М., Kennedy A. and Shen Wei-Chiang. Water-soluble fatty acid derivatives as acylating agents for reversible lipidization of polypeptides. FEBS Lett., 1995, v. 371, p. 283-286.

25. Vogt Т. С. В., Killian J. A., Demel R. A. and Kruijff B. Synthesis of acylated gramicidins and the influence of acylation on the interfacial properties and conformation behavior о gramicidin A. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1069, p. 157-164.

26. Turner A.J. Lipid modification of protein. Oxford University Press., 1992, p. 210.

27. Gordon J.I., Duronio R.J., Rudnick D.A., Adams S.P. and Gokel G.W. Protein N-myristoylation. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 8647-8650.

28. Wilcox C., Hu J.S. and Olson E.N. Acylation of proteins with myristic acid occurs cotranslationally. Science, 1987, v. 238, p. 1275-1278.

29. Sefton B.M. and Buss J.E. The covalent modification of eukaryotic proteins with lipid. J. Cell Biology, 1987, v. 104, p. 1449-1453.

30. Gaudin Y., Tuffereau C., Benmansour A. and Flamand A. Fatty acylation of rabits virus proteins. Virology, 1991, v. 184, p. 441-444.

31. Торчилин В.П., Клибанов A.JI. Способ улучшения связывания гидрофильного белка с липосомами. Биоорган. Химия, 1980, т. 6, с. 791-793.

32. Melik-Nubarov N.S., Shikshnis V.A., Slepnev V.I., Shchegolev A.A., and Mozhaev V.V. Correlation of enzyme thermostability and its surface hydrophobicity (using a modified alpha-chymotrypsin as an example). Mol. Biol., 1990, v. 24, № 2, p. 346-57.155

33. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A. and Kabanov V.A. Catalytic properties and conformation of hydrophobized a-chymotrypsin incorporated into bilayer lipid membrane. FEBS, 1999, v. 461, p. 141-144.

34. Robert S., Domurado D., Thomas D. and Chopineau J. Optimization of RNase A artificial hydrophobization in AOT reversed micelles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, v. 196, p. 447-454 .

35. Peng Q.Q. and Luisi P.L. The behavior of proteases in lecithin reverse micelles. Eur. J. Biochem., 1990, v. 188, p. 471-480.

36. Поверхностно-активные вещества. Справочник под ред. А.А.Абрамзона, Изд-во Университет МГУ, 1979.

37. Левашов А.В. Катализ ферментами в системе обращенных мицелл. Дисс. . докт.хим.наук. М., 1990.

38. Мартинек К., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Березин И.В. Принципы стабильности ферментов в среде органических растворителей. ДАН СССР, 1977, т. 236, с. 920. 923.

39. Кабанов А.В., Наметкин С.Н., Левашов А.В., Мартинек К. Биол. мембраны, 1985, т. 2, с. 985-995.

40. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов А.В., Сергеева М.В., Мартинек К., Хмельницкий Ю.Л. Биохимия, 1991, т. 56, с. 1923-1945.

41. Muneaki Н., Kanji Т. and Yoshiaki К. Covalent modification of insulin by fatty acid derivatives. Pharm. Res., 1989, v. 6, № 2, p. 171-175.

42. Huang A. Characterization of antibody covalently coupled to liposomes. Biochim Biophys. Acta, 1982, v. 684, p. 140.

43. Ando Y, Inoue M., Utsumi Т., Morino Y. and Araki S. Synthesis of acylated SOD derivatives which bind to the biomembrane lipid surface and dismutate extracellular superoxide radicals. FEB, 1988, v. 240, p. 216-220.

44. Szoka F. and Papahadjopoulos D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles. Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 1980, v. 9, p. 467-508.

45. Mueller P., Chien T.F. and Rudy B. Formation and properties of cell-size lipid bilayer vesicles. Biophys. J., 1985, v. 44, p. 375-381.

46. DeamerW. and Uster P.S. Liposome preparation: methods and mechanism, 1984, In: Liposomes (M.J. Ostro, Ed.), pp. 27-51, Marcel Dekker, New York.156

47. Hope M.J., Bally M.B., Mayer L.D., Janoff A.S. and Cullis P.R. Generation of multilamellar and unilamellar phospholipid vesicles. Chem. Phys. Lipids, 1986, v. 40, p. 89-107.

48. Huang C.-H. Studies on phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characteristics. Biochemistry, 1969, v. 8, p. 344-351.

49. Goormaghtigh E. and Scarborough G.A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochemistry, 1986, v. 159, p. 122-131.

50. Enoch H.G. and Strittmatter P. Formation and properties of 1000-A diameter, single-bilayer phospholipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 76, p. 145-149.

51. Mimms T., Zampighi G., Nozaki Y., Tanford C. and Reynolds J.A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry, 1981, v. 20, p. 833-840.

52. Aeno M., Tanford C. and Reynolds J.A. Phospholipid vesicle formation using nonionic detergents with low monomer solubility. Kinetic factors determine vesicle size and permeability. Biochemistry, 1984, v. 23, p. 3070-3076.

53. Alpes H., Allman K., Plattner H., Reichert J., Riek R. and Schulz S. Formation of large unilamellar vesicles using alkyl maltoside detergents. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v. 862, p. 294-302.

54. Parente R. A. and Lentz B.R. Phase behavior of large unilamellar vesicles composed of synthetic phospholipids. Biochemistry, 1984, v. 23, p. 2353-2362.

55. MacDonald R.I. and MacDonald R.C. Lipid mixing during freeze-thawing of liposome membranes as monitored by fluorescence energy transfer. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v. 735, p. 243-251.

56. Papahadjopoulos D., Vail W.J., Jacobson K. and Poste G. Cochleate lipid cylinders: formation by fusion of unilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 394, p. 483-491.

57. Kantor H.L. and Prestegard J.H. Fusion of phosphatidylcholine bilayer vesicles; role of free fatty acid. Biochemistry, 1978, v. 17, p. 3592-3597.

58. Scotto A.W. and Zakim D. Reconstitution of membrane proteins. Spontaneous association of integral membrane proteins with preformed unilamellar lipid bilayers. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 4066-4075.157

59. Hauser H., Gains N. and Muller M. Yesiculation of unsonicated phospholipid dispersions containing phosphatidic acid by pH adjustment: physicochemical properties of the resulting unilamellar vesicles. Biochemistry, 1983, v. 22, p. 4775-4781.

60. Yoshikawa W., Akutsu H. and Kyogoku Y. Light-scattering properties of osmotically active liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v. 735, p. 397-406.

61. Cullis PR. and de Kruijff B. Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 559, p. 399-420.

62. Janiak M.J., Small D.M. and Shipley G.G. Nature of the thermal pretransition of synthetic phospholipids: dimyristoyl- and dipalmitoy 11 ecithin. Biochemistry, 1976, v. 15, p. 4575-4580.

63. Franks N.P. Structural analysis of hydrated egg lecithin in cholesterol bilayers. X-ray diffraction. J. Mol. Biol., 1976, v. 100, p. 345-358.

64. Schmidt F.O., Bear R.S. and Clark G. X-ray diffraction studies on nerve. Radiology, 1935, v. 25, p. 131-151.

65. Finean J.B. and Burge R.E. The determination of the Fourier transform spectroscopy of the myelin layer from a study of swelling phenomena. J. Mol. Biol., 1963, v. 7, p. 672682.

66. Blaurock A.F. and Worthington C.R. Treatment of low angle X-ray database from planar and concentric multilayer structures. Biophys. J., 1966, v. 6, p. 305-312.

67. Shipley G.G. Recent X-ray diffraction studies of biological membrane components. Biological Membranes, 1973, v. 2, p. 1-89.158

68. Deamer D.W., Leonard R., Tardieu A. and Branton D. Lamellar and hexagonal lipid phase visualized by freeze-etching. Biochim. Biophys. Acta, 1970, v. 219, p. 47-60.

69. Verklej A.J., Humbel В., Studer D. and Muller M. Lipid particle systems visualized by thin-section electron microscopy. Biochim. Biophys. Acta, 1985, v. 812, p. 591-594.

70. Cullis P.R. and de Kruijff B. Polymorphic phase behaviour of lipid mixtures as detected by 31P NMR. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 507, p. 207-218.

71. Burnell E.E., Cullis P.R. and de Kruijff B. Effects of tumbling and lateral diffusion on31phosphatidylcholine model membrane P-NMR lineshapes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 603, p. 63-69.

72. Saunders L. Molecular aggregation in aqueous dispersions of phosphatidyl and lysophosphatidylcholines. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v. 125, p. 70-75.

73. Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. M.Просвещение, 1987, с. 815

74. Henderson Т.О., Glonek Т. and Myers Т.С. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy of phospholipids. Biochemistry, 1974, v. 13, p. 623-628.

75. Seddon J.M. Structure of the inverted hexagonal (Нц) phase, and non-lamellar phase transitions of lipids. Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1031, p. 1-71.

76. Schurtenberger P. and Hauser H. Characterization of size distribution of unilamellar vesicles by gel filtration, quasielastic light scattering and electron microscopy. Biochim. Biophys. Acta, 1984, v. 778, p. 470-480.

77. Larrabee A.L. Time-dependent changes in the size distribution of distearoylphosphatidylcholine vesicles. Biochemistry, 1979, v. 18, p. 3321-3326,

78. Povaliy T.M., Popova E.G. and Gusev S.A. New method of all membrane cholesterol marking for scanning electron microscopy. Scanning, 1991, v. 13, p. 249-253.

79. Hallett F.R., Watton J. and Krijgsman P. Vesicle sizing. Number distribution by dynamic light scattering. Biophys. J., 1991, v. 59, p. 357-362.

80. Кленин В.И., Щегалев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Издательство Саратовского Университета, 1977, с. 176.159

81. Berne B.J. and Pecora W.R. Dynamic light scattering, Ed. Wiley J., Elsevier Science, New York, 1976, Chap 10.

82. Warner G. Theory of light scattering from vesicles. Colloid Polym. Sci., 1983, v. 261, p. 508-519.

83. Lasic D.D. Liposomes: from physics to applications, Ed. Thompson V., 1993, Elsevier Science, Amsterdam-London-N.Y.-Tokyo, p. 210.

84. Kachar B., Fuller N. and Rand R.P. Morphological responses to calcium-induced interaction of phosphatidylserine-containing vesicles. Biophys. J., 1986, v. 50., p. 779788.

85. Leventis R., Gagne J., Fuller N., Rand R.P. and Silvius J.R. Divalent cation induced fusion and lipid lateral segregation in phosphatidylcholine-phosphatidic acid vesicles. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 6978-6987.

86. Wilschut J. and Hoekstra D. Membrane Fusion: lipid vesicles as a model system. Chem. Phys. Lipids, 1986, v. 40, p. 145-166.

87. Akabas M.H., Cohen F.S. and Finkelstein A. Separation of the osmotically driven fusion event from vesicle-planar membrane attachment in a model system for exocytosis. J. Cell Biol., 1984, v. 98, p. 1063-1071.

88. Lucy J. A. and Ahkong Q.F. An osmotic model for the fusion of biological membranes. FEBS Lett., 1986, v. 199, p. 1-11.

89. Feigenson G.W. On the nature of calcium ion binding between phosphatidylserine lamellae. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 5819-5825.

90. Wilschut J. and Hoekstra D. Membrane fusion: from liposomes to biological membranes. TIBS, 1984, v. 9, p. 479-483.

91. McDonald R.I. Membrane fusion due to dehydration by polyethylene glycol, dextran, or sucrose. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 4058-4066.

92. Sugar I.P., Foster W. and Neumann E. Model of cell electrofusion: membrane electroporation, pore coalescence and percolation. Biophys. Chem., 1987, v. 26, p. 321335.160

93. Kim J. and Kim H. Fusion of phospholipid vesicles induced by a-lactalbumin at acidic pH. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 7867-7874.

94. Morgan C.G., Fitton J.E. and Yianni Y.P. Fusogenic activity of 8-hemolysin from Staphylococcus aureus in phospholipid vesicles in the liquid-crystalline phase. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v. 863, p. 129-138.

95. Murata M., Nagayama K. and Ohnishi S. Membrane fusion activity of succinylated melittin is triggered by protonation of its carboxyl groups. Biochemistry, 1987, v. 26, p. 4056-4062.

96. P. Геннис. Биомембраны: молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997, 622 с.

97. Nicholls P. and Malviya A.N. External and internal binding of cytochrome с by liposomes. Biochem. Soc. Trans., 1973, v. 1, p. 372-375.

98. Smith R., Separovic F., Milne T.J., Whittaker A., Bennett F.M., Cornell B.A. and Makriyannis A. Structure and orientation of the pore-forming peptide, melittin, in lipid bilayers. J. Mol. Biol., 1994, v.241, p. 456-466.

99. Batenburg A.M., Van Esch J.H. and de Kruijff B. Melittin-induced changes of the macroscopic structure of phosphatidylethanolamines. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 2324-2331.

100. Dempsey C.E. The actions of melittin on membranes. Biochim.Biophys.Acta, 1990, v. 1031, p. 143-161.

101. McKnight C.J., Rafalski M. and Gierasch L.M. Fluorescence analysis of tryptophan-containing variants of the lamB signal sequence upon insertion into a lipid bilayer. Biochemistry, 1991, v. 30, № 25, p. 6241-6246.

102. Moll T.S. and Thompson Т.Е. Semisynthetic proteins: model systems for the study of the insertion of hydrophobic peptides into preformed lipid bilayers. Biochemistry, 1994, v. 33, № 51, p. 15469-15482.

103. Zhang Y., Lewis R.N., McElhaney R.N. and Ryan R.O. Calorimetric and spectroscopic studies of the interaction of Manduca sexta apolipophorin III with161zwitterionic, anionic, and nonionic lipids. Biochemistry, 1993, v. 32, № 15, p. 39423952.

104. Gericke A., Smith E.R., Moore D.J., Mendelsohn R. and Storch J. Study of interaction between fatty acid binding protein and model membrane. Biochemistry, 1997, v. 36, №27, p. 8311-8317.

105. Ito M., Feng J., Tsujino S., Inagaki N., Inagaki M., Tanaka J., Ichikawa K., Hartshorne D.J. and Nakano T. Interaction of smooth muscle myosin phosphatase with phospholipids. Biochemistry, 1997, v. 36, № 24, p. 7607-7614.

106. Jung J.E. and Kim H. Interaction of water-soluble form of apoproteolipid of bovine brain myelin with phospholipid vesicles. J. Biochem., 1990, v. 107, № 4, p. 530-534.

107. Batenburg A.M., Hibbeln J.C., Yerkleij A.J. and de Kruijff B. Melittin induces Hn phase formation in cardiolipin model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1987, v. 903, № 1, p. 142-154.

108. Mendz G.L., Miller D.J. and Ralston G.B. Interactions of myelin basic protein with palmitoyllysophosphatidylcholine: characterization of the complexes and conformations of the protein. Eur. Biophys. J., 1995, v. 24, № 1, p. 39-53.

109. Sackmann E. Physical foundations of the molecular organization and dynamics of membranes. Biophysics, Springer-Verlag, New-York, 1983, p. 425-457.

110. Pearson L.T., Edelman J. and Chan S.I. Statistical mechanisms of lipid membranes: protein correlation functions and lipid ordering. Biophys. J., 1984, v. 45, p. 863-871.

111. Mouritsen O.G., Bloom M. and Mattress A. Model of lipid-protein interactions in membranes. Biophys. J., 1984, v. 46, p. 141-153.

112. Peschke J., Riegler J. and Mohwald H. Quantitative analysis of membrane distortions induced by mismatch of protein and lipid hydrophobic thickness. Eur. Biophys. J., 1987, v. 14, p. 385-391.

113. Sackmann E., Kotulla R. and Heiszler F.-J. On the role of lipid bilayer elasticity for the lipid-protein interaction and the indirect protein-protein coupling. Can. J. Biochem. Cell Biol., 1984, v. 62, p. 778-788.162

114. Morrow M.R., Huschilt J.C. and Davis J.H. Simultaneous modeling of phase and calorimetric behaviour in an amphiphilic peptide/phospholipid model membrane. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 5396-5406.

115. Pearson L.T., Chan S.I., Lewis B.A. and Engelman D.M. Pair distribution functions of bacteriorhodopsin and rhodopsin in model bilayers. Biophys. J., 1983, v. 43, p. 167174.

116. Yu K.-Y., Baldanare J.J. and Chien H. Physical-chemical studies of phospholipids and poly(amino acids) interactions. Biochemistry, 1974, v. 13, p. 4375-4381.

117. Hartmann W. and Galla H.J. Binding of polylysine to charged bilayer membranes. Molecular organization of lipid/peptide complex. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 509, p. 474-490.

118. Hartmann W., Galla H.J. and Sackmann E. Direct evidence of charge-induced lipid domain structure in model membranes. FEBS Lett., 1977, v. 78, p. 169-172.

119. De Kruijff B. and Cullis P.R. The influence of poly-L-lysine on phospholipid polymorphism. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 601, p. 235-240.

120. Killian J.A. and de Kruijff B. Importance of hydration for gramicidin-induced hexagonal Hn phase formation in dioleoylphosphatidylcholine model membranes. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 7890-7898.

121. Taraschi T.F., de Kruijff B„ Verkleij A. and Van Echteld C.J.A. Effect of glycophorin on lipid polymorphism: a 31P-NMR study. Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 685, p. 153-161.

122. Birell G.B. and Griffith O.H. Cytochrom c induced lateral phase separation in diphosphatidylcholineand cardiolipin spin-labelled model membrane. Biochemistry, 1976, v. 15, p. 2925-2929.163

123. De Kxuijff B. and Cullis P.R. Cytochrom C specifically induces nonbilayer structures in cardiolipin containing model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, v. 602, p. 477-490.

124. Fraser P.E., Rand R.P. and Deber C.M. Bilayer-stabilizing properties of myelin basic protein in dioleoylphosphatidylethanolamine systems. Biochim. Biophys. Acta, 1989, v. 983, №1, p. 23-29.

125. Habermann E. Bee and wasp venoms. Science, 1972, v. 177, p. 314-322.

126. Dawson C.R., Drake A.F., Helliwell J. and Hider R.C. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1987, v. 510, p. 75-86.

127. Dufourcq J., Faucon J.F., Fourche G., Dusseux J.L., Le Haire M. and Krzywicki G. Morphological changes of phosphatidylcholine bilayers induced by melittin: vesicularization, fusion, discoidal particles. Biochim. Biophys. Acta, 1986, v. 502, p. 33-48.

128. Epand R.M. and Sturtevant J.M. A calorimetric study of peptide-phospholipid interactions: the glucagon-dimyristoylphosphatidylcholine complex. Biochemistry, 1981, v. 20, p. 4603-4606.

129. Anantharamaiah G.M., Jones J.L., Brouillette C.G., Schmidt C.F. and Chung B.H. Studies of synthetic peptide analogs of the amphipathic helix: structures of complexes with dimyristoylphosphatidylcholine. J. Biol. Chem., 1985, v. 260, p. 10248-10225.

130. Clarke S. The size and detergent binding of membrane proteins. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 5459-5469.

131. Tatulian S.A., Biltonen R.L. and Tamm L.K. Structural changes in a secretory phospholipase A2 induced by membrane binding: a clue to interfacial activation. J. Mol. Biol. , 1997, v. 268, № 5, p. 809-815.

132. Slater S.J., Kelly M.B., Taddeo F.J., Rubin E. and Stubbs C.D. The modulation of protein kinase C activity by membrane lipid bilayer structure. J. Biol. Chem., 1994, V. 269, v 7, p. 4866-4871.164

133. Kent C., Carman G.M., Spence M.W. and Dowhan W. Regulation of eukaryotic phospholipid metabolism. FASEB J., 1991, v. 5, p. 2258-2266.

134. Collins D. and Cha Y. Interaction of recombinant granulocyte colony stimulating factor with lipid membranes: enhanced stability of a water-soluble protein after membrane insertion. Biochemistry, 1994, v. 33, № 15, p. 4521-4526.

135. Fleury L., Ollivon M., Puisieux F. and Barratt G. Preparation and characterization of dipalmitoylphosphatidylcholine liposomes containing interleukin-2. Braz. J. Med. Biol. Res., 1995, v. 28, № 5, p. 519-529.

136. Dabrowska A., Terlecki G., Czapinska E. and Gutowicz J. Interaction of bovine heart pyruvate kinase with phospholipids. Biochim. Biophys. Acta, 1995, v. 1236, p. 299-305.

137. Goldmann W.H., Niles J.L. and Arnaout M.A. Interaction of purified human proteinase 3 (PR3) with reconstituted lipid bilayers. Eur. J. Biochem., 1999, v. 261, p. 155-162.

138. Rourke A.M., Cha Y. and Collins D. Stabilization of granulocyte colony-stimulating factor and structurally analogous growth factors by anionic phospholipids. Biochemistry, 1996, v. 35, № 36, p. 11913-11917.

139. Bider M.D., Cescato R., Jeno P. and Spiess M. High-affinity ligand binding to subunit HI of the asialoglycoprotein receptor in the absence of subunit H2. Eur. J. Biochem., 1995, v. 230, p. 207-212.

140. Tanford C. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science, 1978, v. 200, p. 1012.

141. Kabanov A.V. Lipid modification of proteins and their membrane transport. Biochem. Mol. Biol. Internat. ,1993, v. 29, p. 944-947.

142. Kabanov A.B., Levashov A.V., Alakhov V.Y., Kravtsova T.N. and Martinek K. Lipid modification of proteins and their membrane transport. Collection Czech. Chem. Commun., 1989, v.54, p. 835-837.

143. Targeting of drugs, advances in system constructs. (Gregoriadis G., McCormack B. and Poste G„ Edc.) NATO ASI Series, 1994, p. 207.

144. Zalipsky S., Brandeis E., Newman M.S. and Woodle M.C. Long circulating, cationic liposomes containing amino-PEG-phosphatidylethanolamine. FEBS Lett., 1994, v. 353, p. 71-74.

145. Lee J. and Low P.S. Folate-mediated tumor cell targeting of liposome-entrapped doxorubicin in vitro.Biochem. Biophys. Acta, 1995, v. 1233, p. 134-144.

146. Швец В.И., Краснопольский Ю.М., Каплун А.П., Степанов А.Е. Биотехнологические подходы к развитию терапевтических и диагностических препаратов липидной природы. Вопр. Мед. Химии, 1997, т. 43, № 5, с. 416-424.

147. Szoka F.C. The future of liposomal drug delivery. Biotechnol. Appl. Biochem., 1990, v. 12, p. 496-500.

148. Торчилин, В.П., Клибанов, А.Л. Липосомы как средства направленного транспорта лекарств. Журн. Всесоюзного Хим. общества им. Менделеева, 1987, т. 32, с. 502-514.

149. Gregoriadis G; Florence А.Т. Liposomes and cancer therapy. Cancer Cells, .1991 v. 3, p. 144-146.

150. Peeters P.A.M., Claessens C.A.M., Eling W.M.C. and Crommelin D.J.A. Immunospecific targeting of liposomes to erythrocytes. Biochem. Pharmacol., 1988, v. 37, p. 2215-2222.

151. Forssen E.A. Liposomes as drug carriers. Ed. Gregoriadis G., Elsevier, New York, 1988, p. 180.

152. Gregoriadis G., Leathwood P.D. and Ryman B.E. Enzyme entrapment in liposomes. FEBS Lett., 1971, v. 14, p. 95-116.166

153. Gregoriadis G. and Ryman B.E. Fate of protein-containing liposomes injected into rats. An approach to the treatment of storage diseases. Eur. J. Biochem., 1972, v. 24, p. 485-498.

154. Gregoriadis G. and Neerunjun D.E. Control of the rate of hepatic uptake and catabolism of liposome-entrapped proteins injected into rats. Possible therapeutic applications. Eur. J. Biochem., 1974, v. 47, p. 179-190.

155. Juliano R.L. and Stamp D. Effects of particle size and charge on the clearance of liposomes and liposome-encapsulated drugs. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1975, v. 63, p. 651-670.

156. Ivey H.H. Liposomes and Immunobiology. Ed. Shmidt V., Elseiver, N.Y., 1980, p. 301.

157. Gregoriadis G. and Ryman B.E. Lysosomal localization of P-fructofuranosidase-containing liposomes injected into rats. Some implications in the treatment of genetic disorders. Biochem. J., 1972, v. 129, p. 123-140.

158. Allen T.M. and Hansen C. Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1068, p. 133-145.

159. Allen T.M., Hansen C. and Rutledge J. Liposomes with prolonged circulation times: factors affecting uptake by reticuloendothelial and other tissues. Biochim. Biophys. Acta, 1989, v. 981, p. 27-42.

160. Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.P. and Huang L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett., 1990, v. 268, p. 235-242.

161. Clinique H.J. Liposome as drug delivery system in the treatment of infections in patients with cancer. Infection, 1988, v. 16, № 3, p. 141-147.

162. Weinstein J.N. Liposomes and local hyperthermia: selective delivery of methotrexate to heated tumors. Science, 1979, v. 204, p. 188.

163. Марголис Л.Б., Намиот B.A., Клюкин Л.М. Сортировка клеток при использовании магнитолипосом. Биофизика, 1983, т. 28, с. 884.

164. Каплун А.П., Сон Л.В., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как системы доставки лекарств. Вопр. Мед. Химии, 1999, т. 45, № 1, с. 3-12.167

165. Kassel В., Radicevic R., Berlow S., Peanasky R.J., Laskowski M.Sr. The basic trypsin inhibitor of bovine pancreas. I. An improved method of preparation and amino acid composition. J. Biol. Chem., 1963, v. 238, p. 3274-3286.

166. Wlodawer A., Nachman J., Gillilan, G. L., Gallagher W. And Woodward, C. Structure of form /III crystals of bovine pancreatic trypsin inhibitor. J.Mol.Biol., 1987, v. 198, p. 467-478.

167. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. М.: Наука, 1983, с. 39.

168. Березин И.В., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. Взаимодействие четырех форм трипсина со специфическим субстратом и панкреатическим ингибитором. Биохимия, 1970, т. 35, с. 983-988.

169. Belorgey D., Dirrig S., Amouric M., Figarella С. And Bieth J.G. Inhibition of human pancreatic proteinases by mucus proteinase inhibitor, eglin с and aprotinin. Biochem. J., 1996, v. 313, p. 555-560.

170. Barthel T. and Kula M.-R. Rapid purification of DesPro(2)-Vall5-Leul7 aprotinin from the culture broth of a recombinant Saccharomyces Cerevisiae. Biotechnol. Bioeng., 1993, v. 42, p. 1331-1336.

171. Yu J.X., Chao L. and Chao J. Prostasin is a novel human serine proteinase from seminal fluid. Purification, tissue distribution, and localization in prostate gland. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, № 29, p. 18843-18848.

172. Fritz H., Fink E. and Truscheit E. Kallikrein inhibitors. Federation Proceedings, 1979, v. 38, № 13, p. 2753-2759.

173. Rezaie A.R., Xuhua H. And Esmon C.T. Thrombomodulin increases the rate of thrombin inhibition by BPTI. Biochemistry, 1998, v. 37, p. 693-699.

174. Kassel B. Bovine trypsin-kallikrein inhibitor (Kunitz inhibitor, basic pancreatic trypsin inhibitor, polyvalent inhibitor from bovine organs). Methods Enzymol., 1970, v. 19, p. 844-852.

175. Schroeder D.D. and Shaw E. Chromatography of trypsin and its derivatives. Characterization of anew active form of bovine trypsin. J. Biol. Chem., 1968, v. 243, p. 2943-2949.168

176. Davis R. and Whittington R. Aprotinin. A review of its pharmacology and therapeutic efficacy in reducing blood loss associated with cardiac surgery. Drugs, 1995., v. 49, №6, p.954-983.

177. Robert S., Wagner B.K., Boulanger M. and Richer M. Aprotinin. Ann. Pharmacother., 1996, v. 30 № 4; p. 372-380.

178. Общее обезболивание при обширных хирургических операциях в онкологии. Методические рекомендации. М.; 1992.

179. Sharma J.N., Amrah S.S. and Noor A.R. Suppression of hypotensive responses of Captopril and enalapril by the kallikrein inhibitor aprotinin in spontaneously hypotensive rats. Pharmacology, 1995, v. 50, № 6, p. 363-369.

180. Quereshi A., Lamont J., Burke P., Grace P. and Bouchier-Hayes D. Aprotinin: the ideal anti-coagulant? Eur. J. Vase. Surg., 1992, v. 6 № 3, p. 317-320.

181. Wendel H.P., Heller W. and Gallimore M.J. Influence of heparin, heparin plus aprotinin and hirudin on contact activation in a cardiopulmonary bypass model. Immunopharmacology, 1996, v. 32, № 1-2, p. 57-61.

182. Жирнов О.П. Молекулярные механизмы протеолитического процессинга вирусных белков и проблема антивирусной химиотерапии и конструирования вакцин. Молекулярная биология, 1988, т. 22, Jte 3, с. 581-600.

183. Голяндо П.Б., Овчаренко A.B., Жирнов О.П. Ингибирование репродукции вируса гриппа апротинином. Вопросы вирусологии, 1992, т. 37, № 3, с. 144-146.

184. Жирнов О.П., Овчаренко A.B., Голяндо П.Б., Свиногеева Т.П., Долгова Г.В., Никитин A.B. Антивирусный аэрозоль апротинина. Общее воздействие на организм при ингалляционном введении. Антибиотики и химиотерапия, 1994, т. 39, № 5, с. 25-32.

185. Ларионова Н. И., Казанская Н. Ф., Митюшина Г. В., Блидченко Ю. А., Владимиров В. Г. Фармакокинетика основного поливалентного ингибитора протеаз, связанного с карбоксиметиловым эфиром декстрана. Хим. фарм. журнал, 1984, № 10, с. 1167-1172.

186. Стручков В.И., Григорян А.В., Гостинцев В.К. Протеолитические ферменты в гнойной хирургии. М.: Медицина, 1970, с. 408.

187. Машковский М.Д. Лекарственные средства, Изд-во Медицина, 1993, т. 2, с. 57.

188. Von Specht B.U. and Brendel W. Preparation and properties of trypsin and chymotrypsin coupled covalently to poly(N-vinylpyrrolidone). Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 484, p. 109-114.

189. Линденбаум Г.М., Миргородская О.А. Химическая модификация трипсина водорастворимыми декстранами. Прикл. Биохим. Микробиол., 1978, т. 14, № 5, с. 719-723.

190. Березин И.В., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. К вопросу об определении константы равновесия реакции трипсин-ингибитор трипсина из легочной ткани крупного рогатого скота. Биохимия, 1070, т. 35, № 2, с. 261-269.

191. Chase Т. and Shaw Е. P-Nitrophenyl-p-guanidinobenzoate НС1: a new active site titrantfor trypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, v. 29, p. 508-514.

192. Baugh R.J. and Travis J. Regulation of the leukocyte proteinases by the human plasma proteinase inhibitors. Biochemistry, 1976, v. 15, p. 836-841.

193. Кейтс M. Техника липидологии. M.: Мир, 1975, 138-164.

194. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, т. 1, 1981, с. 606.

195. Кабанов А.В. Химическая модификация водорастворимых белков (ферментов для придания им мембраноактивных свойств. Дисс. . канд.хим.наук М., 1987.

196. Сахаров И. Ю. Физико-химическое изучение модифицированных форм основного панкреатического ингибитора трипсина. Дисс.канд. хим. наук М. 1981

197. Fields R. The measurement of amino groups in proteins and peptides J. Biochem., 1971, v. 124, p. 581-590.

198. Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Сахаров И.Ю., Березин И.В. Растворимые высокомолекулярные производные панкреатического ингибитора трипсина. Биохимия, 1979, т. 44, вып. 11, стр. 2033-2038.170

199. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin-layer microchromatography of lipids. J. Chromatog. 1972. v. 65. p.451-455.

200. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 1976, v. 72, p. 248-254.

201. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.

202. Rodriguez-Vico F. A procedure for eliminating interferences in the Lowry method of protein determination. Anal. Biochem., 1989, v. 183, p. 275-278.

203. Schwert G.W. and Takenaka Y. A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin. Biochem. Biophys. Acta, 1955, v. 16, p. 570-576.

204. Bordier C. J. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, № 4, p. 1604-1607.

205. Reisfeld R.A., Lewis U.I. and Williams D.E. Disc-electrophoresis of basic proteins and peptides on polyacrylamide gels. Nature, 1962, v. 195, p. 281-290.

206. Fioretti E., Angeletti M. and Cottini M. T. Binding of basic pancreatic trypsin inhibito and related isoinhibitors to leukocytic elastase. Determination of thermodynamic parameters. J. Mol. Rec., 1989, v. 2, №. 3, p. 142-146.

207. Andrieux K., Lesieur S., Ollivon M. and Grabielle-Madelmont C. Methodology for vesicle permeability study by high-perfomance gel exclusion chromatography. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 1998, v. 706, № 1, p. 141-147.

208. Шевченко A.A., Кост O.A., Казанская Н.Ф. Количественный метод оценки доступности водному растворителю остатков триптофана в молекуле белка. Биоорг. Химия, 1994, т. 20, с. 263-267.

209. Dlouha V., Pospisilova D., Meloun В. And Sorm F. On proteins XCIV. Primary structure of basic pancreatic trypsin inhibitor from beef pancreas. Collection Czech. Chem. Commun., 1965, v. 30, p. 1311-1315.

210. Скоупс P. Методы очистки белков. M.: Мир, 1985.

211. Bonnie М. and Merck М. Z. Inhibition of HLE by cis-unsaturated fatty acids. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977, v. 75, №. 1, p. 194-199.171

212. Hoare D.J. and Koshland D.E. A method for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, № 10, p. 2447-53.

213. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991, с. 481.

214. Rand R.P. and Gupta S.S. Cardiolipin forms hexagonal structures with divalent cations. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 255, p. 484-493.

215. Wolf W.J. and Thomas B.W. Ion-exchange chromatography of soybean saponins. J. Cromatogr., 1971, v. 57, p. 281-293.

216. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука, 1965, 35-65с.

217. Bhamidipati S.P. and Hamilton J.A. Interactions lysopalmitoylphosphatidylcholine with phospholipids: a 13C and 31P NMR study. Biochemistry, v. 34, № 16, p. 5666-5677.

218. Liu D. and Huang L. Trypsin-induced lysis of lipid vesicles: effect of surface charge and lipid composition. Anal. Biochem., 1992, v. 202, p. 1-5.

219. Yagle P. Hydration and the lamellar to hexafonal II phase transition of phosphatidylethanolamine. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 7518-7522.

220. Van Paridon P.A., de Kruijff В., Ouwerkerk R. and Wirtz K.W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: a 31P-NMR study. Biochim.Biophys. Acta, 1986, v. 877, № 1, p. 216-219.

221. Farren S.B., Hope M.J. and Cullis P.R. Polymorphic phase preferences of phosphatidic acid: A 31P and 2H NMR study. Biochim. Biophys. Res. Communs,1983, v. Ill, p. 675-682.

222. White S.H. and Wimley W.C. Hydrophobic interactions of peptides with membrane interfaces. Biochim.Biophys.Acta, 1998, v. 1376, p. 339-353.

223. Кученкова O.E., Ярославов A.A., Кабанов B.A. Размер отрицательно заряженных липосом кардинально влияет на их поведение при взаимодействии с полилизином. ДАН, 1999, т. 369, № 6, с. 778-780.172

224. Foster R.L. Preparation and properties of a soluble trypsin-dextran conjugate Experientia, 1975, v. 31, № 7, p. 772-783.