Гидроксибензиламинопроизводные жирных кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 ОД

. Г'. ^лО

2 Ц

' _!ЮСК03СШ ОРЛЕ! ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ШЕСППТГ ТСШОЯ ЙГЛ1ЧЕСКОП ТЕХНОЛОГИ) им, М.В. ЛСШН0С03А Спо!Ц!алиэнр08ап:шП совз? Д 063.-и,ох

Ш ртзях руяотхн ЛУРЬЕ ЕЛЕНА ВРЬЕВНА

Г]Щ3С1СС1'1ББК31!ЛШ&ГОПР0113ВОШМ; ШШ& КИСЛОТ. СШТГЕЗ И СВОЙСТВА

02.соло - йюоггаккчоская хпги, Х1«а!п лрирожих и фганояогяч&скн активных _ееи',зств

- . АЗГ0РБЭ5РДГ диссертанта на еэясйанив ученой сгеяейи кандидата хтшоск'сс наук

130спв1 1993 г.

Работа выполнена на кафодро биоюхпалопю псковского икституга • тонкой »адиоской тохнмоиш ш. 11 В. Ломоносова.

11ауЧ1ШЭ руководители»

доктор химических наук, '. .. КАПЛУН Л.П.

докзор хишчссквд наук, профцссор Е2ЕЦ В.И.

доктор хшжояа наук,

профессор 'Сшрнов Л.Д

доктор шлшгсекп»

водувдт «тучииП согр'/Л".;«*. '^Гиус:,'.:;; И^В,

Еодукай организация*

Институт СиоорганичеоксЗ «ашаиш. 11Йи!Ейшк'1Ша. ФЙ.

Защита состоится Л¡1553'г. о

«а сасодшш Споцкаяшироаашкуо »Соа'эга 'Д'053.<41 .

при Московской инеигсут© :

им. Н. В. Ломоносова по адрглул а^^ЙШ, (Цр^Ь^р^гсБрВо.г-^б.

О дассертацной ¿:эио лшкогьей !о~<&&иог®ко$ ай5* им. Н.В.Лоюкосоза (швы, Этакое, Ц. 'Парогозская^уа,,) Авторз^ораг рацзман ¡1993. т.

Ученый секрагарь

Слециализпрозаинагр Совоха хавдвдат химических ларе,- -

старший научный 'сотрудник " " Лютик А.И,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Наиболее распространенными типами модифицированных кирних- кислот являются их ерогатчческие производив. | приэлекаюгзю вшпгате бкохгозтов со врвшн классических .работ ! Франца Кноопа. Эти аналоги шрних кислот используется для изучения | мэтаболнзма липвдсз, как флуоресцентные и фзтоакиширувмыв зонды ! при исследовании мэкбран, а такяэ в качестве диагностических ,

средств. ... .....

Особь'П ннтерос представляет методы получения згирноароматичес- -

mix кислот, позволяема синтезировать иодафщироватше гоиологи j

i

. гарных'кислот. В случао несобранных зондов набор гомологов распгря- 1 от диапазон зондирования по толпцшо неибраиы, а для диагностичос- - j

mix препаратов откризает вознзаюсть выбора вещества, наиболее ¡

i

подходяеэго по (^¡эико-хш.этескнм свойствам. Такш! удобными иэто- 1 дап синтеза, напряюр, флуорэсцоитно-иэчешшх гирних кислот является ацплиропашио пояиздкличоских углеводородов дшеарбоновыми кис-сотаии и ашшфозание/йцшфованко соотвотствукзиа флуоресцентным! производным! а-аМЯНОККСЯОТ.

Универсальных методов получония гшрноарсматичесшк кислот с г.рплышм остатком, подходяезм для ззодегош изотогошх деток на пос--

Сокравдши: дп - ¡ьгидроксибензил-о-ашшокарбонопыв кислоты, гдо п - количество атокоо углерода в боковой цепи; «A4, да, av, ad, аз, до - п-гидроксибэшил-а-амшокарбонозыо кислоты, пояучешшэ кон-доксадиеп салицилового альдегида с а-аишоиаслягегоЯ кислотой,—Ala,-val, Аар, Glu il ser, соответственно» AnD, дпвг, Ani - соответствующие дейтеро-, бром- и кодпроизводные» ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия; JKK - жирные кислоты; ПОЛ - перекненое окислениэ липидов; ПЭТ - позигронная эмиссионная топография; ФХ - ; фосфатидилхолин; гФХ - гидрированный фосфагидплхолш!.

ледней стадии синтеза, до начала представляемой раббти не было известно.

Таким образом, разработка общих методов синтеза гомологического ряда аналогов жирных кислот с ароматической группой, активированной для введения изотопных меток; является актуальной задачей.

Цель работ заключалась в разработке метода синтеза теологического ряда аналогов вирных кислот с с-арильной группой, активированной для введения брома"и иоде, отработке методов получения соответствую®« иод- и бромпроизводных, изучения физико-химических и биологических свойств полученных соединений.

Научная новизна и практическая ценность работ. Предложен простой способ получения гидроксибензилышх производных жирных кислот, с подобью которого бил получен ряд К001К ; соединений - и-гидроксибензкл-а- и -о-амидакарбоновых нирных кислот. Отработаны методы введения о ароматический фрагмент I, вг и . 2н. Полученные соединения оказались удобными маркерами дйя изучения метаболизма лирных кислот благодаря легкости введения радиоактивных изотопов иода (*231, 1311) и брош (^вг). Эти же соединения могут бить использованы в топографических исследованиях,

Изучена особенности взаимодействия полученных соединений с модельными шмбракама и их влияние на перекисное окизленио липидов. Спектральные свойства дают возможность рассматривать галогонпроиз-водные 1ьгидроксибенэил-с- и -а-ашнокарбоновых кислот в качестве тушителей флуоресценции. /

Биологические исследования показали, что синтезированные соединения включаются в метаболизм жирных кислот 1п у1уо« ингибируют р-окисление природных жирных кислот и являются субстратами ферментов ^-окисления» по-разному распределяются в липидных фракциях различных органов и тканей. В качестве новоГч> диагностического средства для исследования секреторной функции почек запатентовано

синтезированное соединенна, имэппзе разную скорость выведения из почек в нордо л патологии.

защиту выносятся следующие основные полого ниш г. Метод синтеза н-гидроксибеизил-и-шшокарбоноашс кислот восстановительны:! алкиаировшшем о-аишгакислот гидрокснбензальде-гидами.

2. Разработка методов получения 3',5'-д!ш0д- и з',5'-днбром-гьпгдроксибонзил-й-аьмнокарбоиозы}! кислот, адаптированных для вве-Д9КИЯ КОРОТКОЖИВУВДХ изотопов.

3. Физико-химические исследования синтезированных соединений, о том число в составе (¿эмйран (особенности воздействия н-гидро?,сибепэиа-аникокарбоновизс кислот на модояышо кэибраш, закономерности иэ^эиэиил способности кнгибировать ПОЛ в зависимо- j стн от их строения и условия среди).

4. Исследование способности полученных соодиношШ участвовать

з р-окисяеюш Ифных икс кот , ' '

Публики?®. По материалам диссертации опубликована одна статья, тозисы доклада и получены полозитояыше росошт о выдаче : дзу>: патентов.

Апробация работ». Материал« работи частично доловеиы на iv ¡ Всесоюзной конференции "ЛкмннесцэиишЯ анализ в мздцщшо ц биологии" (Москва, 1992) и на iv Всесошной конференции "Еиоангиошшшт" (ifocm»a, i992). i

C-JtQí.1 работа. Диссертационная работа изложена иа ¿¿^ страницах «апшошгеного текста, содержит /^рисунков, /^таблиц, Я- схем, ¡ сшгсок литературы включает //^-ссылок.

0CH0BHQS СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ В методах диагностики in vivo чаще всего фиксируются различное распределение вещества, обладающего контрастными свойствами (рент-

гоногра{зш, р-сцинтиграфил, г-тоиэграфня, ГОТ и др.), или фармако-кикетйуескио параметры маркерного лосэства (напришр, скорость выведения), что отражает особенности штаболизма при патологиях. Для увеличения вероятности визуализации изшиаиип при п&тологш по сравненив с нормой необходимо выбрать. маркерное вещество с невысокой скорость» ыотаболизш. В качестве такого "диагностического* субстрата хорооо подходят жирные кислоты, поскольку ош: находятся во всех Тканях п:зого организма, и их катаболизм представляет собой каскад последовательных реакций (р-окислешю). Однако, в молекуле жирной кислоты нот репортерше групп, позволяв®« следить за ее превращениям;!. Поэтому молекула моди&щировашшх шедших кислот долЁва содержать акцепторную группу дап введения шток, и гояа-телыго, чтоби она находилась в конца углеводородной шш Ш, Это | обеспечиэает контроль за превракэшгями молекулы иа протяшши всего процесса катаболизма. Наиболее подходясрй акцепторной группой, по гстаыу кззнкэ, является фэнолышЯ (рагшнт, позволяющий в мягких условиях к за короткое время вводить изотопы, исдояьзувеиэся в качестве шток в диагностике 131г, 7Ссг и др.).

Для исследования шгаболизш 221 в организма полезно сшиоэиро-вс?ь серию гомологов, различающихся по длине цеп». Из о-оамэпрюак Ш,' пригодных для конденсации с ароматическим фрагментом, шшболао доступным! явлЯклся о-амзшокислоты. В этой случао в качество ^испольного фрагыэнта могут выступать гидроксибензальдегиди, гидрс-кснбензоГшая кислота в гидрокскбоизилгалогениды. Гндроксибенанль-ные производные авмокнелот более продпочтитольны, т.к. их ароматическое кольцо не содерял елетроноакцепторных заизстителой в отличие от соответствующих бонзоняьних аналогов. Крою того гидро-ксибенэилгалогениды менее доступны, чем гидроксибензальдегиды, и алхшшровакие ими сопрякэно с большие! методическими трудностями.

Таким образом, ш предлагаем удобный метод, синтеза гомологи-

чоского ряда аналогов ЯК, адаптированных для введения короткохиву-дах изотопов, который состоит в последовательной конденсации ги-дроксибензальдегида (х) с о-аминокислогой (И), восстановлении альдинина (Ш) и посдсдуоцэм введении репортврных групп в н-гидроксибенэилашкокарбонозую кислоту (iv, схемы 1 и 2).

2.1. Сщпоз и-ридроксибетаил-шяшокарбонових кислот и пх фйкко-каотоскко свойства.

Схема х.

[-^у-СНвМ-Л • соон

♦ т^Й'СООН

я

(I) (1Г)

(xv)

я

(iii)

-ССОН

Вторкчп-!Ш9 аш!-1Ш (IV) в \ П' Вторичн-1Шо акции (IV) а В'

Л2 г-ом -сн,- Л7 2-011 -сн-

лз Л4 . А6 2-0Н г-он 8-ОИ -(СН,),- -ссн,ь- ло г-он ¿Н(С"з)а * -сн-¿н, ¿ООН

аэ г-он -(СН3)в- АЕ г-он -СИ-

Аи лгг ДА алз 2-011 г-ск г-он г-он -(СН,)10--(СН,>М- -сн--сн- ¿НзСН;, лз . рА4 г-ок 4-ОН 4-Н(СН,)а (ОНа)з СООН •сн-¿н,он -(СН,)3- -(СНа)э-

I

- с -

Для синтеза ы-гидроксибонзнл-о-ашнокарбоновых кислот (iv) в качестве ароматических альдегидов (г) были использованы 2- и 4-гидроксибензальдегиды, а такжо _4-д1шэтш1ашнобвизальдегид» для исследования зависимости свойств полученных вторичных ттп (iv) от строения их алифатической части крош ряда о-аминокислот были использованы и а-аминокислоты (схеш 1).

Получение альдиминов<1П) проводили при ,20°С в сухой метаноле, поскольку скорость реакции в кэнэо полярных растворителях, например, в хлороформе, была очень мала. Нагревание нежелательно из-за

возможного диспропорционирования альдегида. Использование ьэяеку-

■ ' • 1 1

лярных сот в качестве водоотштащего сродству не дало существенного повьгалшя выхода. По данным ТСХ равновесно наступало по возне, чом через 2 часа. Дльдтшни (их) были окраганы в зшлтый дает, при нейтральных и щелочных рН флуорзсцироэали. Последующе соеста-иовленне боргндридон'натрия приводило к вторичным ашкам (IV). Пры< осаздеиаа из водного раствора?наон в изоэпектричоскоЯ точке получали* хронографически чистые оеоства с выходои 50-802.

Индивидуальность продуктов контролировали по ТСХ в системах хлорофоры«ызтанол«вода (65«2Э«4) и н-бутанолIуксусная кислота«еода (С'1 Х'11')1! а тек» т дашши элементного. анализа. Все соединения (IV)- имели характерные электронные -спектры с полосаш поглосуннп 2141 № 275 ни. В ИК-спэктрах полученных соединений (IV) набладалксь полоси поглоцэния, соответствующие карбоксилу, 1ароматическим С-Н связям и гпдроксильноП группе. Наиболее полную ш1форцаидо о' строении н-гидроксибонзил-акаиокарбоновых ш:слот (iv) получал;! из ХН-ШР спектров. Так, в случае А4~ наблюдали сигналы «этиленовых протонов в виде триплетов при 2.60 ы.д. 12-СН^1^и 3.25 ц.д. (4-СН2), в виде цуяьтиплета 2.10 ы.д., (З-СН^) и в виде синглета при 4.40 м.д. (5-СН2), а сигналы ароматических протонов в виде кульгипдегов при 7.15 м.д< (3\ 5») и 7.50 (4•, б1) (рис. 1а).

«.- % а »- 1

п

ц

_I

(о) Я Я н

-4-1-

А_

(б) П и Пг

—Т—

ь. о

—(— 7.9

о.с

—1---г—

3.0 4.0 грн

I

3.0

г

г.о

Рис.1, ^-ЯМР спэктри А4 (а) н Л4вг (б) и 5 « 2пс1 в 2Н^0.

Поскольку молекулы н-гидроксибенэпл-а- к -о-ашнокарбоновых кислот одновременно содержат карбоксильную, фснольиуп и ашшо группу, то они иогут находиться в раствора в различных ионных формах. Поэтому наш! били исследованы кислотио-осдавние'свойства Полуниных соединений - найдены три различных рК и опрэделош! их изоэяектричоские точки, соответствующее' трап переходам (рис.2). Кислотно-основные свойства изучали титрование» 4*10 М растворов соодагаений (iv) раствором 0.2 н. пс1 от рН и.о до рн 2.0, рК фэ-нолыгсй группа определяли по сгэсанип полос поглощэння в УЗ-"спектрах при изшненшГрН~от 97б5~д'о~и7007 Как""н—ожидалось, при" измэнеиш! рН в области диссоциации фзнольного гвдроксила менялся вид УФ-спектров» вместо полосы Л-максимушм поглощзния..275 нм_.прк_ увеличении рН появлялись два полосы поглощения с максимумами 236

до и 290 ш .

н-Гадрохсибензия-ошнокарбоиовш кмсяоти íiw) плохо растворили

в ацетоне, хлороформа и намного лучсг d ¡¿этаноло. líe о соединения,

крош АН и А12, хорошо растворами в растворах взлочэй п кислот.

♦ ♦ -

CHjMHRCOO* CHjlUIRCCO* СИаМНаПСОО" CHjNHJRCOOH

Puc.2. Схема пароходов различит: кошш форы'Ап о завшаости от рН. Типичная кривая титрования Ап на примере klZ.

2.2. Элокзрофшькоо заюцзюю в раду ^гцдрокспбеизш-агашкарбо- j вовшмшсвот.

Для ИСПОЛЬЗОВАНИЯ К- гидроксибонэыь о- CiüIHOÍtapOOHOBlQC №0Ш '

I

(27) в качестве диагностических препаратов и иаркеров для исследования метаболизма ЕК ш vivo необходимо введение рапорторнш: ; групп. В качестве репортершве групп каш <5ш»: выбраны следувщиё " изотопы, детектируемые различными методами* радионуклиды иода (г-сцинтиграфия, у-томографм, измерение радиоактивности продук-

тов штаболизт), изотоп 76вг (ПЭТ) ц дейтерий (2Н-ЯКР-споктроско-пия).

Для.i.qtoriix рзпорторшлс групп, в том числе и радионуклидов, ко-латольпо пводоцкэ ttx на послэдквП-стадо сшггоза. Как ухе отмечалось З1:гэ, вцбор ароттичоской. шяюионты (фэнолишй врагнэнт) определяется условиями введения изотопных мгок. Ks всах галогенов ¡год обладает самэЯ низкой реакционной способнсстьи в реакциях , элоктробильного замэцэшш. Только в случае реакции о активными субстратам, такии! как'фгнолц, реакция иодирования проходит а илгких условиях. При виборо кэтодоз ваедошк! радионуклидов иода и бронз i"i исыглхи. пз того, что роакодя" "Кягна проходить быстро (для 123i т4/ «13 ч, дял 7бвг Tt/ я 15 ч), а исходны»:! реагонташ

/ з / J

дял генерирования олсктрофиышх частиц ДОЛ23Ш б1ГТЬ ОбЫЧ1ШО MOSO-кулприь'з (lopi.bj рдионупгг'лоа 1азг и 7iur - rtr и вг3, соотвотстсон-ПО. Галсгйнироваши долгл:о бить тозшолспгчэскн простим, чтобн его tVKSfO било осусзствлять нопоерэдетввм» з условиях клиишш.

§т:ш условиям отвочаэт.иодлравашт с поюсъв Kici2, получаемого эр зультато окисяитолыю-воссгаиовитвльиоП реакции иэяду ki и ^Юд Я растворе KCl. НэдпрушШ лгоот нопоерздетоошю добавляли к гэло'шоьг/раствору СОЭД1Ш91ШЯ (iv) (exeta 2), а образовавшиеся . йодпр^рводшо осаздаги иа раствора о игозлсктрическоП точко.

Дяя. получекй бро131рои8водкых ^гадрокопбспзил-аг.зшоксрбоноси:: тгслот(ехе?п 2) ¡гапЗолсэ подходпишм оказалось использование пшо-бромида itatpnn, 'исходным роагеитои дал синтеза которого поляэтея эдзгзнтарнил бром. &пвг выделяли такса ос&здэнкзи.

Индивидуальность иод- и броипроизводных подтверждали дашшш ТСХ и эяекентого анализа. В У О-спектрах пояучешшх соединений наблюдался батохроютй "сдвиг длинноволновой полоси поглосания по сравнению со спектрами исходних дп. В 1H-filiP спектрах иод- и брои-пронзводнизг фиксировались сигналы только ароматических протонов в

положениях 4' и б' (рис.10),

Незначительное время реакция иодирования (около 1 часа) и Оро-мирования (2-3 часа) и простота получения галогеипроиэводных Ап делает предлагаемые методы пригодными для получение радиофармацевтических препаратов с короткоживущида изотопами (123х и 76вг).

Схема 2.

(IV) Т* (V)

Печенные соединения (V). В' Ж"

АЭХ -(СН,),- 1

мх -(СН,),- 1

А. 61 -(СИ,),- 1

кп -(СН,)»-

МП -(СН,)4в-

А121 -<сн,)44-

КА42 -сн- I

¿н,сн,

ААВг -сн-1 вг

¿н,

А4Вг -(СН,),- Вг

А»ВГ -(СН,),- В г

А11ВГ -{СН,)1В-

*ЭО -1СН,),- *н

А40 -(СН,),- »н

АбО «н

А90 >н

А1Ю -(СН.Ь,-

А120 -(СН,)»»-

- и -

Для получения дейтеро-меченных производных »-гидроксибензил-аюшокарбонових кислот (схема 2), которые использовали при изучении взаимодействия Ап с фосфолипидными мембранами (раздел 2.3), применили известная ¡.»год кислотно-катализируемого изотопного обмена. Полноту изотопного обмена фиксировали по спектрам 1Н-ЯМР| в случае полного изотопного обмена исчезали сигналы протонов в орто-и пара-положениях к фэнольному гидроксилу и уменьшалась цульти-плетность двух оставшихся. Таким образом, спектры были аналогичны спехтрам галогензамгщенных Ап. Чистоту полученных апэ (схема 2) так*е контролировали по УФ-спектрам« коэффициент молярной экстинк-ции полученных соединения отличался от исходных не более, чем на 5».

2.3. Изучение влияния ы-гидроксибензил-ашинокарбоновых кислот н их производных на модельные мембраны.

Воздействие биологически активных соединений на модельные мембраны является их важной характеристикой. Это обусловлено, в частности. тем, что воздействие вещества на клетку начинается с его взаимодействия с плазматическими мембранами, которое можно охарактеризовать с помощь» следушцис параметров« коэффициент распределения, локализация по толщине бислоя, влияние на упорядоченность различных сегментов фэсфолипидов, состояние гидратной оболочки мембраны, скорость перекиского окисления липидоз и т.п. Поэтому нами были проведены исследования, цельо которых было выявление характера взаимодействия синтезированных соединений с модельными мембранами. Для этого были выбраны следующие методы: ДСК, и

^Н-ЯМР спектроскопия. С помощью ДСК можно исследовать фазовые переходы гель-жидкий кристалл, происходящие в мембране, и сравнить относительные изменения при,взаимодействии с ней гомологичных соединений. Методом 31Р-ЯМР спектроскопии удобно контролировать

структурами организации ыэибра«!, сфор;л!розашшх из иоленуя £ос£о-лтидоп. 2Н-ЯП? спектроскопия погволпот получать ивфориацй» о моделях двккэния d камбрсиз соединения, содорЕацп; ядра. дейтерия, опродолять состоять гидраигой оболочки 'tauöpauu.

Количественной 'характеристикой, oipasacssß сродство "вошства в кэмЗраио, является когф^тиэнт распределения (Кр). Он тюказизсгт-,. кскья часть весзства находится в яипндиой, а какая - .в содиоП ,фа-осх, и вычисляется по формуле' (l)i V. '

Кр « ся / Сц Ц),

где сд. св- концентрации вс^зства и дшпкдноП и в^водное'фазах..

Для определения койдфгщкгитоо распределения сззрств,_ «ад спэк-тралышо свог.гтва в яипидной'и г. одно Я фаво на рагкнчавтся, дргбу-.. стся полнее ил« частично:; раздиешм'. {аз. использсЕг^п шюды центрифугирования и равиоьсснэго диализа, в иоторих концзнтраиза An определяли по УФ-спектраы.. Дашше. призед&шыз а ' таблица х. подтьорадавт общую оакоиомарность" - .пйвизашю сродства An к smio-сомам из яичного SX по «эре . увеяшешя их гадро^обшети.' Iükzü uoeho отштить, что развот&лешш'э соединения Д xvi ¿а»аг '¿ошша Кр по сравнения о лоразватвлсш&у.:! (аЛ4, Av u Li).. .

В случао различия спсктральшс характеристик. -в лишгдкоп и »одной фазах Кр ьосет бигь опраделоп из дапнаи спо;;тров. 1Ьпра«р, по соотносгииа плоздой у оке го и Ejpiuoro сцлалад в спзк-

траг: д^йтеропрошводгт' An (сур. 15). • ' ,

Различие d ко5{фяз»8Щйх распродолеиг«, onpcrAoscjuas разшла. шюдаш. ногат бить обмевм» • ссздускжа факторам. 'Заюдз^'а»;' значения Кр о опили с цзитрцфугирозапьи по ердвпоц^з с равкмас-ниу диализом очевидно свяааки с кзеодкш ссаздекием . lassKX- лило* , сом. Н поэтому ютод цгнтрпфугкровашш обглио кгпогмуохся для во-

c3ctb с hp»l. ü^npiosp, для илорпроюзсна, у которого кр а 1600. .

« 13 -

I -

■' ~~ Таблица l.

. К08ф|лциэцти распре ДОЛ 91!!!Я СОЗДИНвНИЯ ( IV).

2H-fi*P спектро- Цэнтри&гир-ова- Равновесный

Соединение скопия (UgO/íK H1ÎÎ (Н20/$Х диализ (ît20/0X

20011 коль/КОЛЬ) . 500»! ЮЗЬ/1ШЬ) 0300:1 |.оль/>лоль)

Кр 5Х/Ап юль/гагь з .кзивраке Hp ФХ/Ап 1ЮЕЬ/[.ЮЛЬ а маибране Кр ФХ/An ЮЛЬ/ЮЛЬ a мэибране

A4 • 1.4 -. 37 1.4 76 24 200

АС 2.4 11 6.4 • 19 25 272

■ А5 15.7 S 50 6 60 104

. All 17.0 б - . 144 38

Л12 17.5 ' S • 207 5- 255 54

С.А4 ' - Ï.S 33 1 " -

А'/ ■ ' - ' - - ' sa-, 121

Л2 29 230

Ир, пояучзнннэ в ЯГ? спектроскопии, значительно нэньсэ, чей в прэдыдуггк. случаях. ПороятнэЯ всего ото обусловлено соэюаноЯ стабкоп tnrxorpnponamuj узкого п трокого сигналов, воонихаюЯ а частности при усилетш узких сигналов пэ огносэкиа к пфоким в 5урьо-пектроскошш. Крою того, коэ№эд!9нт распределения постоянен в' разбазгзшшх растворах, пока не Настуг&т насыцеиио одной .из (Таэ. При дсстиезнш насилия в atapuirioîî фазе Кр будет укапаться. Рассчиташ!нз к0ш;снтрац!ш; An в яптпдноГ) gase покасизсот, ".то,

- о*

г.о всоП гидшости, з зкспзр!йянтах цэитрнфугпровшгя и 41-Я!? спектроспшгл прокехода, намшэико лягаадгоЯ фаз». D этих случаях состновзкия га я 8 кул ОХ на i ¡.»лекулу An для АО, Аи и Ais практически ПЭ ¡13!£5нявтся ПрИ рЗЗКИХ ЗНаЧвШИХ Кр (габл.1). СраВ!135шэ сначзниЯ Кр я ССОГКОС31ШЯ 5Х/Ап з ¡-подах центрифугирования и рав-

новесного диализа говорит о том, что, по-видимому, условия эксперимента (соотношение Н20/ФХ/Ап) центрифугирования является гранич-ними для насыщения липидной фази, и уменьшение Кр в Н-ЯНР спектроскопии происходит вследствие увеличения концентрации An в водной фазе. Таким образом, наиболее достоьерными являются значения Кр, определенные в методе равновесного диализа.

Нахождение коэффициента распределения является достаточно сложноп задачей. Неоднозначность результатов объясняется несоответствием реальной системы идеальному случаю разделения Саз, в котором каждая фаза определяется как ограниченная часть системы со своими уникальными физическими и химическими параметрами, что в реальном случае практически недостижимо.

Известно, что липидные мембраны способны претерпевать фазовые переходы типа гель-жидкий кристалл. Фазовое состояние липидно-го компонента в мембране во многом определяет ее функциональную активность. Лля выявления возможных изменений в .фазовом поведении мембран, происходящих при взаимодействии с ней синтезированных соединений, использовали ДСК. Кроме того, метод ДСК удобен тем, что для оценки воздействия веществ на мембрану не требуется их специальных модификаций. Сравнение калориметрических кривых фазовых переходов ю* дисперсий гФХ в o.l M фосфатном буфере (рН «.75) без добавления и с добавлением 10« (мольных) A4, аА4. 4i2 по отношению к гФХ показало, что асе исследуемые соединения значительно снижали энтальпии фазовых переходов, причем этот эффект зависел от концентрации соединений, длины цепи и места присоединения арильного радикала. Наименьшее воздействие оказывает короткая A4 : эффект, достигаемый при 20% мольной концентрации A4, в случае соединений Ai2 и аА4 наблюдался уже при 10* мольной концентрации. При этом температура фазовых переходов оставалась постоянной, что свидетельствует о нехаотропности исследуемых веществ, т.е. они не нарушают упо-

1^|(!<Шости мембраны. Измегзкия энтальпии фазовых переходов при добавлении A4 обратны изменениям, наблюдаемым при гидратации фосфо-липидных мембран. Tax. энтальпия перехода в районе 60°С после гидратации гФХ увеличилась с 0.09 ккал/моль до 4.17 ккал/моль, а в дисперсии гОХ с юХ A4 снова уменьшилась до о.зо ккал/моль. т.е. встраивание An в мембрану, по-видимому, может приводить к некоторой дегидратации мембраны.

Для проведения 3JP-KiP- и %-ЯМР-исследований использовали дейтеропроизводные ы-гидроксибензил-амннокарбоновых кислот'. Методам! гН- и 31Р-ЯМР спектроскопии изучали мембраны, сформированные из яичного ®Х и соединений ряда A4D-A120 с мольными соотношениями ФХ/АлО ОТ 5|1 ДО 20>1. Сформированные в процессе приготовления модельных мембран сухие пленки состава ФХ/AnD были гидратированы так. чтобы соотношение ^С/ФХ в препаратах составляло последователь-

Рис .3. Экспериментальный 31Р-ЯМР спектр (1) и соответствующий ему теоретический спектр (2) мембран ^О/ФХ/Або (so«s:i моль/моль/моль) при темпера-

туре 25 С. Рассчитанные зна- - ко ма, 20ii, зоа, soil, чения параметров тензора что по8вОЛяло изучать динаыи-

анизотропии химического сдвига ядер Зх

8U- 36.0» S2J 833—14.2.

Р составляют (и.д.) ческоа поведение мембрано-свя--11.9J занных Ало в процессе гидрата-

ции мембран.

'эксперименты проводились совместно с н.с. . к.х.н. П.В.Дубовским, нитхт.

Во всех случаях получены спзктры 3*Р-5ШР, 'близкие к споктрац шмбран из чистого АХ. Эти спектры ^Р-ЯЦР с высоким козф£:шон7оы корреляции (0.97) аппроксимировались теоретическими рднокомпокеит-ными спохтрами (рис. 3) с 'рассчитанными главными риачокияьш токзо-ра анизотропии химического сдвига ядер фосфора 1» 1,2,3) такими, что параштр анизотропии химического сдвига ¿o Uo » « g^j^-i/2(Sjj+Sjj)) составлял величину "50.и.д., 4jo соответствует бислойиой структуре убран. Херовая корреляция окспэрикэнталь-, 1шх и теоретических спектров свидетельствует о том, что встранва-иио AnD в мэмбратш ке приводит к нпрувеиии бислойноЛ структуру. Ддлоо эти образца исследовались ттодом Н-ЯМР спектроскопии.

2Н-Я1!Р-споктры 1ш»йр£и из смзсоп СХ/and во всом йсследовшшои диапазоне соотиосзнШ! 0Х/лпО, независимо от стопэки гвдратащш шмЗраи, характеризовались суперпозицией двух шяононт« "спрокоП" составлявши и "узклго* изотропного сшила.. Bsísctbjo, находятся в шибраио, даот вфокий сигнал,' а в растворе - уэкнЯ. Таким образом, наличие двух с оставляющие спектра соответствует двум состояниям вещества - в 1амЗргиз я в Еодо (рас. 4).

Получеюшо спэктрц свидотопьстзуэт об щ&г.01£щрц кграктерэ движ01сш дзйтсрирэбшчдх '0&г1шгоз соодщшшш A4D-A12D в ' баслодх 6Х. Шракзтру порядка, вычислении Ц5,2Н-ЖР спзктров, к? противоречат аксмашшв ф>рыэ двигзшде восэств в бкегое. С узезгкйшгэм

длины цэпз В ряду A4U-Ü12D' ОСТйТОЧИЗО квсдрупольпоо рзсрп13ш2э

возрастало с io кГц до зо кГц, что указязаот иа уганьелего nosii-чоства дщ&кнэской стспсш: свободы шлакуя в бяслоо с уселичекг.зи длини иепи.

Исследование воздействия н-гидроксибензил-аюшокарбоновш:. кислот и их дейтеропроиэводных на модоыышэ юмбраны показало, что встраивание до 20% иэлышх ксследуеюх соединения в мэмбрану не нарукает бислопную организация шьйраны. Распределение * векзетв

2

И£)ЯЬ/ШЛЬ/ШЛЬ) (а) И Н„0|ФХ|А9О {25015x1 НОЛЬ/).»ль/моль) (б) при 65°С.

дезду липидноЛ и водной фазами'зависит от количества углеродных гто!ив и каста присоединения арилыюго радикала. Были найдены ус-рзвия насицения липидноП фазы. Возможному' поведении. исследует соединений в, шмЗране соответствует анизотропное движение дейтери-роватшх фрагизнтов как составной части липосом и аксиальная фориа ригаиия, где подвиаиость молекул зависит от количества углеродных атсмо^в жиркокислотной цепи.

Крош дойтэропроизводних арнлйиршх кислот (схема 2), в качество зондов в шмбранних исследованиях могут бить пспользозаш их брокпроизводиыо. Нами было показано, что Апвг являются тушителями флуоресценции пирен-меченого ФХ в составе липосом из яичного ФХ. В То же время сами Ап обладают флуоресценцией (лва£ 270 ни, хва зю нм), которая зависит от длины' цапи и рН.

Строение ксследуешх соединения имеет некоторое сходство с фе-нолышмл антиоксидантака и, исходя из возможной локализации! фе-цольного гвдроксила полученных весеств в мембране в области жирно-кислотных остатков, естественно предположить, что полученные соединения могут оказаться эффективными ингибиторами перекисного окисления липвдов в мембране. Для проверки этого предположения мы исследовал« влияние гидроксибензальных производных жирных кислот на интенсивность окисления фосфолипидов в различных сдельных системах! аскорбат-зависимое окисление яичного ОХ в липосомах, в ыи-целляриых системах (яичный ФХ/ Тритон Х-хоо, 1:2 моль/модь) при различных рН, а таксе в гомогенате мозга крыс. Интенсивность окис-летая фосфосипидов определяли, , измеряя' концентраций малонового альдегида (по оптической плотности его. комплекса с тиобарбитуровой кислотой). Под аитиокислительной активность» синтезированных соединений ку покимачи величину, ссответствувцув относительному умэньпею® оптической плотности образца по отношения к контрола (формула 2):

А » (0о . в) / В0 (2),

где А - актиокнс литерная активность, оо - оптическая плотность при 535 (ш (пропорциональна концентрации комплекса тно-барбитуровсй кислот^с иалоновш альдегидом) в контроле, о -оптическая плотность при 535 нм с образце ( о присутствии Ап).

При аско"бат-оас.".>1»» е$исдвщш в яипосокдх и гоюгенате 1»зга криз набхвдая:сь схол;э закоионэрвости. Так, антшекслителыш ак-тгазкость росла с- увеияэяиеи длины цепи (рис.5) к при введении объекшх агиасгитедзВ (г) в ароматическое кольцо, Литиокислитеяь-ная способность получении соединений была исследована при различных рН для аскорбат-зависимого окисления в мицеллярных системах. Было показано, что какскюльная антиокислительная активность наб-свдалась при рН, соответствуем изозлектршеской точке исследуемого соединения. л

Рис. б. Зависимость ангиокислигелыюЛ активности (dq-d)/do or количества углеродных атомой в цепи в моноламэллярных липо-couax (1) ив гомогенате шага крыс (2). dq - оптическая плотность при 535 ни в контроле, d - в образце, п - число ато'»ов углерода в цепи.

*! • • 2.4. Биологические свойства пОлучсшшх соедаиешй!2.

Клтабодизм Й( представляет собой многоступенчатый, 'достаточно длительный биох!М!ческ!!й процесс, характерный для всех тканей ор-** ram!3!'i. Оц во шюгоы определяется потребностями клеток в энергии.

которие зависят от типа клеток, их биологического состояния, а . *ак£0 возкоашх патологий. Таким образом, интенсивность метаболизма ЗЕК в тех или иных органах и клетках иокет служить одним из мар-

г г

керних процессов, позволяющих оценить состояние клеток. Цель этой . части работы - исследование возшагостк использования синтезиро-• ванных соединений для изучения нетатаболизма ЕК в орга1шзмэ. Нами

2 " '

Исследования проводились ~ совместно с сотрудниками Института Биофизики РАН к.б.н. В.А.Матвеевым Щ(.х.н. 6.Н.Кулаковым.

100 sobo 70

во

К 60 40

30

20 10 O

¡tí

4 в O ti 12 Числа О-лхоиоо а Лглгг-ггП т*™

Рис.6. Выведение ап у крыс с мочой при внутривенном педешш о.2 мл 0.1Я раствора Ап. Анализ прововодили штодон электрофореза на ацетатцеллюлоэной пленке (боратный буфэр, рН 8.6, 350 В, 25 минут), в качестве свидетелей использовали кислоты, шчекные 1351. По оси ординат - количество вецзст-ва в леизке.^ююи видо в процентах к исходному количеству (через 5 часов поело введения).

с помощь» ап1251 было показано, что иодпроиэводныо подвергаются с организме р-окислении. Так, A4i и A3i выводятся из организма в кз-изменешшн видо. Кислоты с болеа длинной цепь» с четным числом атомов углерода (Абх, Ai2i) превращаются в кислоты с кэиышш числом ьтокп углорода, праямуюствеино в А4х, с. кис лота с пачоткял ЧИСЛОМ йТОШВ - В Молоху А3х. ТйКЕЗ бш обнару^зно, что сг.орзс?« катаболнзш кислот возрастает с увеmmmmt кпт:и цепа (ркс. 6). По-видимоыу, это объясняется том, что скороеvü />ои1.:агш1л зависит от удаленности фэиольного фрагмонта от карбоксильной группа. Чзм короче цепь и соответственно блике карбоксильная группа к Онкольному <{рагг.анту, тем мзньвэ стопонь деструкции кислот. То, что Ап могут быть субстратами р-окисления, косвенно подтверждается их ии-гибированкем р-окисления ц-14с]-сгоариновой и (1-"си> лайковой

- 2.1 -

кислот (рис. 7).

0.9 О-в 0.7 0.8 0.6

ОЛ 0.1 О

РПС.7. ВЛИШШО А61 на ИНТОНСИПНОСТЬ ОКПСЛОШШ [1-14С1-ОЛе!ШОВОП (1) и (1- 1/}С 1-стеариновоП (2) кислот в организмо крыс. По оси ординат - изменение концентрации зо времзнн I1 С] С02 в ,выдыхаемой воздухе в опытной группе яиотных, приведенное к 'концентрации 114С]'С02 а контрольной группе. Опытная группа - пгаотныэ, которым внутрибрюшшо вводена кислота А61 (20 иг в 0.2 ия филологического раствора) и 1 С-нэчошшо щше кислоты, контрольная группа - только шченние аирные кислоты.

Нами такхе изучалось распределение Аш по лигащшм фракциям различных-органов и тканей крыс. Радиоактганость весэств измеряли на ТСХ после хроштографш яипидши {ракшгай, выделенных из соответствуют« тканей з систеьах ; гексан^фяргуксусная кислота (90|Ю:2) и хлорофорМ|ШтайоД|Вода <б5|25|4). Приведенные результаты (табл.2) могут свидетельствовать о том, что Аш включаются и в другие биохимические пути, характерные для ¿ирных кислот.

Отчетливые ^-сцинтиграмма почек были получены при внутрибрюпиЯ' ном введении одного из синтезированных соединений; юченного

Таблица 2.

Распределение A5U5i d лнпидних фракциях различных органов и тканей {за i00« принята суммарная радиоактивность в липидной фракции).

Процент включения радиоактивности о липидные фракции.

Орган, Фосфо- Эфири Тригли- Холе - Мирные

ткань липиди холе -стерина цериди стерин кислоты

Печень 90 ' 4 2 2 2

Плазма крови 27 26 26 14 7

Скелетные МмШЦЦ 25 4 5 57 8

Сордечная мышца 09 5 0 5 1

Легкие S ' а ' 1 2 2

(123ц. Как показали специаяышо исследования, разница в скорости его выведения через почки в норме-и патологии заметно выше, чей у 11311]-иодгштурала (стандартного средства для диагностики секрг-торноП функции почок), и, следовательно, получонноо соединенно является более чувствительным средством по сравнению с ни;.? для ра-дионуклид"ой оценки секреторной Функции почок (рис. 8).

Во Всссовзкоы Научном Цзотре по безопасности б53ояогичосгш активных веществ (Купавна, Кэсковскал оба.) был проводе» анализ корреляции структуру и свойств синтезирования соединений на оскова-о

нии экспертной системы, включавшей описание ю ооо химических соединений с охарактеризованной активностью. Тег:, для АС возможна противоопухолевая активносты АЛ может быть регулятором яипидного обмена» противобактериальной и противопротозойноЯ активностями могут обладать'Au к Auij все Ani перспективны для изучений проти-

поглнстнпго действия. 10

i 1.5 г г.б а з.б

Ркс. б. Изюкенно концентрации /п123х и 131i иодгиппурана в мочо кролика» 1. а - 1311-иодгиппуранг з, 4 - Ап 123* норма» 2, <",- патология.,

э1> 1, 3 -

Таким образом, предложенные соединения могут стать удобными инструментами для изучения метаболизма Ш ln vivo и, следовательно,,шркераш при исследовании процессов, связанных с нарусением метаболизма ЕН. Синтезированные .соединения прзволяют существенно рассфнть возможности моделей Фр&кид Кноопа. Это обусловлено увеличением чувствительности определения продуктов р-окислония благодаря введение радиоактивных изотопов в ароматический фрагмент.

ВЫВОДЫ

а. Разработан удобный способ получения гомологического ряда производных КК с о-фенольной группой восстановительным алкилированием о-аминокислот гидроксибензальдегидами.

2. Предложен метод получения" З'б'-дииод- и 3'5'-дибром-к-гидроксибензил-аминокарбоновых кислот, адаптированный для введения короткояивущих изотопов.

3. Показано, что полученные соединения встраиваются в фосфол'ипид-ный бислой, не нарушая его структуры, и могут быть использованы в качестве зондов в флуоресцентных и гН-Ш> исследованиях фосфоли-пидных мембран.

4. Показано, что сшпезированныо соединения участвуют в процессах метаболизма, присущих ЕК, и могут быть использованы в качество маркеров nmi изучении этих процессов in vivo.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях!

1. Лурье Е.Ю., ДубовскиП П.В., Каплун А.П., Оксинойд О.Э., Шзец В. II. ВзаимодеПствие гидроксифенильных производных гарных кислот с мембранами и их антиокислительная активность.// Биологическио КЗМбраны. -1992. -7.9. -К 12. С. 1206-1210.

2. Матвеев В.А., Лурье E.D., Каплун Л.П., Кулаков В.П., Еаоц В.И. Препарат для исследования почек.// Положительное рэшш:о от 28.oi.93 о выдаче патента РоссuneкоЯ Федерации по заявка

Н 5034352/14.

3. Лурье E.D., Каплун А.П., Кулаков В.Н., Ыатвеев В.А., Шзец O.Ii. и-(Гидроксибеизил)ашжжислоты и их под производные в качество субстратов формашгоо р-окислония и радиоактивных маркеров, обладающее актиокислительныш свойствам.// Полоютелыгое решила 15.02.93 о выдаче патоцта Российской Содеращш ко заявке н 5041620/04.

4. Лурье E.D., Каплун Л.П., ДубовскиП П.В., Кулаков В.П., Инхеов В. А.. Оксшюйд 0.3., Шзец Б. И. Аналоги аминокислот с антиокислителыюП актившетыз.// Тез. докл. iv конференции "Биоантиоксидант". -Москва, 1992. -Г. i. -С.218.

Зак.82 тир. 80 зкз.Ротапринт ШП'лГ им.Ломоносова