Липиды термофильных бактерий Новой Зеландии

Лагутин, Кирилл Александрович

Липиды термофильных бактерий Новой Зеландии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Лагутин, Кирилл Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Липиды термофильных бактерий Новой Зеландии»

Автореферат диссертации на тему "Липиды термофильных бактерий Новой Зеландии"

На правах рукописи

005531233

Лагутин Кирилл Александрович

ЛИПИДЫ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИИ НОВОЙ ЗЕЛАНДИИ

02.00.10 — Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток — 2013

- '< кюл ш

005531233

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет»

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор,

члсн-коррсспондснт РАН Васьковскнй Виктор Евгеньевич

Официальные оппоненты: Имбс Андрей Борисович

Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, заместитель директора по научной работе

Дмитренок Павел Сергеевич

Кандидат химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, заведующий лабораторией инструментальных и радиоизотопных методов анализа

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «3» июля 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 2314-050, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан « 29 » мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

Актуальность проблемы. Важность исследования липндов термофильных бактерий определяется как интересами фундаментальной науки, так и прикладными задачами. На сегодняшний день информация о составе жирных кислот и полярных липидов широко используется для таксономических целей на всех уровнях, от вида до типа. Некоторые липиды, обнаруженные у термофильных бактерий, обладают биологической активностью. Новые, необычные полярные липидь: указывают на наличие еще неизвестных биосинтетических путей. Присутствие известных ранее липидов свидетельствует о наличии ферментов, функционирующих при высоких температурах, аналогичных найденным ранее у мезофильных организмов.

К сожалению, о составе липидов большей части описанных термофильных бактерий либо ничего не известно, либо эти сведения носят фрагментарный характер и не всегда надежны. Большая часть известной информации опубликована микробиологами в связи с требованиями к описанию новых видов. Благодаря этому информация о жирных кислотах недавно описанных бактерий доступна, хотя и не всегда достоверна, поскольку обычно используемые в таких случаях автоматизированные системы позволяют обнаружить лишь уже известные компоненты, но не могут помочь в случае обнаружения новых, ранее неизвестных соединений.

Таким образом, получение новых фундаментальных знаний о составе липидов термофильных бактерий, включая установление строения новых липидов, является актуальной темой современной биохимии липидов.

Новая Зеландия, наряду с Иеллоустонским национальным парком (США), Камчаткой (Россия) и Исландией является районом мира, богатым геотермальными зонами - местообитанием термофилов, что открывает широкие возможности для исследований в области биохимии липидов термофильных бактерий.

Цели н задачи исследования. Целью настоящей работы являлся анализ и установление строения неизвестных ранее липидов, обнаруженных нами в некоторых недавно культивированных термофильных бактериях, выделенных из геотермальных зон Новой Зеландии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить состав жирных кислот и фосфолипидов впервые культивированных термофильных бактерий видов Chthonomonas calidirosea и Thermogemmatispora sp. (штамм Т81).

2. Установить структуры неизвестных ранее жирных кислот и фосфолипидов бактерий видов Chthonomonas calidirosea и Thermogemmatispora sp. (штамм Т81).

3. Определить структуру главного фосфолипида (PL2) бактерий видов Meiothermus ruber и Thermus spp. и уточнить строение фосфогликолипидов этих бактерий.

4. Оценить возможность использования обнаруженных жирных кислот и фосфолипидов для хемосистематики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ненасыщенные ЖК бактерии вида С. calidirosea представлены только А5-моноенами. Бактерия также содержит новую циклопропановую кислоту — 5,6-метилен гексадскановую кислоту.

2. Бактерия вида Thermogemmatispora sp. (штамм Т81) содержит ряд ранее не описанных диметилразветвленных кислот, включая 12,17-диметилоктадекановую кислоту. Данная кислота является хемотаксономическим маркером для бактерий рода Thermogemmatispora.

3. Бактерия вида С. calidirosea содержит построенные на основе фосфатидил-Д-глицероилалкиламина фосфогликолипиды, сходные по строению с фосфогликолипидами бактерии вида Deinococcus radiodurans.

4. Впервые установлены структуры фосфолипидов бактерий видов М. ruber и Thermus spp.. Структура главного фосфолипида (PL2) установлена как N-

ацетилглюкозаменил фосфатидилглицероилалкиламин и его аналог, построенный на 1,2-диоле.

5. На примере бактерий видов Geobacillus stearothermophilus, М. ruber и Thermits spp. было показано, что фосфолипиды бактерий могут являтся более эффективными маркерами таксономического положения, чем жирные кислоты.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые был определен состав жирных кислот бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmalispora sp. (штамм Т81). Методами масс-спектрометрии и ЯМР были установлены структуры девяти неизвестных ранее жирных кислот. Был определен состав простых липидов бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmalispora sp. (штамм Т81). Было показано, что простые липиды бактерии вида С. calidirosea содержат набор терпеноидов - производных сквалена, включая частично и полностью циклизованные производные. Впервые был определен состав фосфолипидов бактерий видов С. calidirosea, Thermogemmalispora sp. (штамм Т81), и установлено строение главного фосфолипида бактерий видов М. ruber и Thermus spp. Фосфолипиды бактерии вида С. calidirosea были идентифицированы с использованием методов химической модификации, масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии как фосфатидил-Л-глицероилалкиламины с различным гликозилированием. Это первое обнаружение подобных липидов за пределами типа Deinococcus-Thermus. Для каждого фосфолипида был впервые обнаружен аналог, содержащий гидроксилированный алкиламин. Из десяти описанных липидов лишь два были описаны ранее у бактерии вида D. radiodurans. Я-конфигурация глицериновой кислоты была установлена с использованием 31Р-ЯМР и синтетических аналогов. Установлена структура главного фосфолипида бактерии вида М. Ruber, последние 30 лет традиционно обозначавшегося как PL2 - 2'-0-(1,2-диацил-$л-глицеро-3-фосфо)-3'-О-(а-.№-ацетил-глюкозаминил)-Лг-глицероил алкиламин. Впервые

фосфатидилглицероилалкиламин и глюкозаминил фосфатидилглицероилалкиламин были обнаружены в бактериях родов Meiothermus и Thermus.

Полученные данные по составу жирных кислот могут быть использованы для хемосистематики бактерий на уровне рода. На примере бактерий родов Meiothermus и Thermus было показано, что в некоторых случаях фосфолипиды могут быть более предпочтительными маркерами таксономического положения, чем жирные кислоты. Также нами показана возможность использования 31Р-ЯМР для установления стереохимических особенностей строения фосфолипидов, что может быть использовано при исследовании строения неизвестных фосфолипидов.

Апробация работы. Основные результаты были представлены на 102-й ежегодной конференции the American Oil Chemists' Society (Цинциннати, США, 2011), 8-м ежегодном конгрессе the European Federation for the Science and Technology of Lipids (Мюнхен, Германия, 2010), 9-м ежегодном конгрессе the European Federation for the Science and Technology of Lipids (Роттердам, Нидерланды, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в зарубежных рецензируемых журналах и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов, получена основная часть результатов, опубликованы статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов, Списка цитируемой литературы и Приложений. Работа изложена на 147 страницах, содержит 9 таблиц и 53 рисунка. Список литературы включает 249 цитируемые работы.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим руководителям чл.-корр. РАН В.Е. Васьковскому и к.х.н. М.В. Высоцкому за поддержку на всех этапах выполнения диссертационной работы; Dr. A. MacKenzie за помощь в интерпретации ЯМР спектров; Dr. J. Ryan за выращивание микробиальной биомассы для исследований; Dr. G. Painter, Dr. В. Dyer и Dr. В. Compton за предоставление синтетических образцов; Dr. Y. Lu за получение масс-спектров (ESI-MS); Dr. Н. Wong за запись ЯМР спектров; Dr. I. Sims за помощь в ГЖХ-МС анализе Сахаров; Dr. К. Johnson за аминокислотный анализ; Dr. М. Stott, Dr. X. Morgan и Karen Houghton (GNS) за предоставление образцов термофильных бактерий.

Список сокращений:

COSY — корреляционная спектроскопия; ESI-MS — элсктроспрсй-ионизационная масс-спектрометрия; GNS — Институт геологических и ядерных исследований; НМВС -гетероядерная многополосная корреляция; HSQC — гетероядерная одноквантовая корреляция; TOCSY — тотальная корреляционная спектроскопия; ГЖХ — газожидкостная хроматография; ГЖХ-МС — газовая хроматография-масс-спектрометрия; ДФГ — дифосфатидилглицерин; ДМДС — диметилдисульфидные аддукты; МЭЖК — метиловые эфиры жирных кислот; ТСХ — тонкослойная хроматография; ФГ — фосфатидилглицерин; ФГАА — фосфатидилглицероилалкиламин; ФИ — фосфатидилинозитол; ФИМ — фосфатидилинозитол маннозид; ФХ — фосфатидилхолин; ФЭ — фосфатидилэтаноламин; ЭДЦ — эквивалентная длина цепи; ЯМР — ядерный магнитный резонананс

Основное содержание работы

Липиды бактерии вида Chthonomonas calidirosea

Анализ жирных кислот показал, что насыщенные кислоты составляют 78,7%, а разветвленные кислоты, преимущественно изо- и антеизо-строения, составляют практически половину - 49,2%, от суммы жирных кислот бактерии Chthonomonas calidirosea. Жирные кислоты содержали 5,2% неизвестной жирной кислоты с ЭДЦ(ВР20)= 17,27, строение которой было позже определено как 5,6-метилен гексадекановая кислота. Ненасыщенные жирные кислоты были представлены исключительно моноенами, как разветвленного, так и неразветвленного строения, в сумме составлявшими 21,3% (Таблица 1). Положение двойной связи было определено с использованием диметилдисульфидных (ДМДС) аддуктов МЭЖК (Рис. 1).

Рис. 1. Масс-спектр ДМДС-аддукта метилового эфира кислоты 16:1 А5.

Д5 положение двойной связи было установлено для всех главных мононенасыщенных жирных кислот бактерии вида С. саНсИгоэеа. Правильность идентификации была подтверждена с использованием пирролидидов ЖК. Цис-конфигурация двойной связи была подтверждена отсутствием поглощения в районе 960680 см"1 в инфракрасном спектре.

За исключением следовых количеств бета-гидроксимиристиновой кислоты (3-НО-14:0) гидрокси кислоты в образце отсутствовали.

Таблица 1. Состав жирных кислот бактерии вида С. calidirosea.

ЖК ЭДЦ(вр20) ЭДЦ<вр!) % от суммы ЖК*

14:0 13,98 14,00 0,4

/15:0 14,50 14,64 1,0

ai 15:0 14,67 14,74 0,5

15:0 15,00 15,00 0,4

¿16:0 15,52 15,65 4,4

16:0** 16,00 16,00 25,8

16:1Д5 16,16 15,67 8,8

¡17:0 16,52 16,65 19,3

ш'17:0 16,68 16,74 13,5

Л 7:1Д5 16,68 16,40 6,8

ш'17:1Д5 16,82 16,48 0,7

17:0 17,00 17,00 0,8

5,6-метилен 16:0 17,27 16,86 5,2

¿18:0 17,52 17,65 1,2

6г18:1 17,78 17,50 0,9

18:0** 18,00 18,00 3,6

18:1 Д5 18,14 17,74 3,2

¿19:0 18,51 18,64 0,9

ш'19:0 18,69 18,73 0,3

¿19:1 18,69 18,37 0,9

* приведены ЖК с содержанием более 0,2%

** отмеченные ЖК были также обнаружены в питательной среде

Ранее бактериальные цис-мононенасыщенные жирные кислоты Д5 серии были найдены японским ученым Канеда, который обнаружил серию подобных кислот в трех психрофильных видах Bacillus, при этом 16:1Д5 и а/17:1Д5 были главными ненасыщенными ЖК. Позже он отмечал, что хотя ненасыщенные жирные кислоты необходимы для поддержания жидкостности мембраны на приемлемом уровне, было неожиданно встретить Д5 положение двойной связи у психрофильных бактерий, поскольку температура фазового перехода ФХ с двумя 16:1Д5 значительно выше, чем ФХ с двумя 16:1Д9 или 16:1Д11. В этом смысле обнаружение нами Д5 ненасыщенности согласуется с наблюдениями о том, что липиды термофильных бактерий насыщены жирными кислотами, имеющими более высокую температуру плавления, а мембраны из таких липидов имеют более высокую температуру фазового перехода, чем у мезофильных и психрофильных бактерий.

Циклопропановые жирные кислоты, обнаруженные в бактериях, обычно принадлежат цис-9,10-метилен- или цис-11,12-метилен группам. Поскольку биосинтез циклопропановых кислот в бактериях осуществляется путем метиленирования двойной связи S-аденозилметионином, как мы и ожидали, циклопропановое кольцо было расположено в 5,6-положении. Поиск с использованием Reaxys® (сервис Elsevier Properties RA) и SciFinder® (сервис Chemical Abstracts) показал, что 5,6-метиленовая гексадекановая кислота не была обнаружена в природе ранее.

ГЖХ-МС анализ фракции нейтральных липидов показал присутствие углеводородов и отсутствие триглицеридов, восков и других простых липидов (см. Рис. 2.). Главной группой углеводородов являлись сквален, его частично гидрированные производные и продукты циклизации сквалена. Степень ненасыщенности скваленов была

определена при помощи ГЖХ-МС. Полностью насыщенный углеводород - сквалан, обнаружен не был.

CkIOH \

-JVJ

Днплоптев

Ск2Н Ск4Н

jlLL

Днплоптерол

у-полнполатетраеи ^_^^

Рис. 2. Хроматограмма фракции нейтральных липидов Chthonomonas calidirosea, полученная на ГЖХ-МС. СкЮН — декагидросквален; Ск8Н — октагидросквален; СкбН — гексагидросквален; Ск4Н — тетрагидросквален; Ск2Н — дигидросквален; Ск - сквален.

Сквален и частично гидрированные сквапены были обнаружены в ряде бактерий. В большинстве случаев структура частично гидрированных скваленов не была установлена. Исключением является идентификация ди- и тетрагидроскваленов в экстремальной бактерии вида Halobacterium cutirubrum. Масс-спектры дигидросквалена и одного из обнаруженных нами изомеров тетрагидросквалена практически полностью совпадали с опубликованными для 2,6,10,15,19,23-гексаметил-т/>анс-2,6,10,14,18-тстрасозапентаена и 2,6,10,15,19,23-гексаметил-т/мгнс-6,10,14,18-тетрасозатетраена из бактерии вида Н. cutirubrum соответственно.

Несколько фракций, полученных при помощи препаративной ВЭЖХ, полярных липидов бактерии вида С. calidirosea, содержали несколько производных бактериогопанполиолов. На основании данных QTOF MS их структуры были установлены как: бакгериогопантетрол, бактериогопанпентол, циклитоловые эфиры бактериогопантетрола и бактериогопанпентола, гуанидин-замещенные циклитоловые эфиры бактериогопантетрола и бактериогопанпентола.

Как ациклические тритерпены, в том числе сквалены, так и циклические, например, гопаноиды (в частности, диплоптен, диплоптерол и бакгериогопанполиолы), чрезвычайно широко распространены в бактериях. Гопаноиды являются функциональным аналогом стеринов у бактерий. Было показано, что как бактериогопанполиолы, так и более простые тритерпены, участвуют в стабилизации мембраны, особенно в сложных внешних условиях (кислая среда, повышенная температура и т.п.). Хотя они часто встречаются у отдельных групп бактерий, например, у цианобактерий и метанотрофных бактерий, определенной закономерности между присутствием гопаноидов и таксономическим положением на сегодняшний день не выявлено.

Двумерная ТСХ общего липидного экстракта после обработки молибдатным реагентом показала полное отсутствие обычных фосфолипидов и присутствие 11 фосфолипидов с необычной подвижностью на ТСХ (Рис. 3). Пятно ql не было обнаружено нами ни в одной фракции в ходе дальнейшей работы, поэтому мы сосредоточили свое внимание на остальных 10 фосфолипидах.

Масс-спектр фракции фосфолипидов, полученный в режиме регистрации отрицательных ионов, показал присутствие нескольких серий гомологов в районе m/z 986, 1160, 1175, 1189, 1234. Такие молекулярные веса были значительно выше, чем средняя молекулярная масса (-750 Да) большинства обычных фосфолипидов.

РЖ ФХ

1 ФКФЦ.^

Рис. 3. Двумерная ТСХ фосфолипидной фракции общих липидов бактерии вида С. calidirosea (обнаружение - молибдатный реагент). Слева - система растворителей, используемая в нашей лаборатории для разделения обычных фосфолипидов (отмечено обычное положение нормальных фосфолипидов). 1-е направление (дважды): Хлороформ-метанол-аммиак (25% водный раствор)-бснзол (65:30:6:20, по объему). 2-е направление: Хлороформ-этилацетат-ацетон-изопропанол-этанол-метанол-вода-уксусная кислота

(30:6:6:6:16:28:6:2, по объему). Справа - система растворителей для фосфолипидов на основе фосфатидилглицероилалкиламина. 1-е направление: Хлороформ-метанол-аммиак (25% водный раствор) (70:30:4, по объему). 2-е направление: Хлороформ-уксусная кислота-ацетон-метанол-вода (10:2:4:2:1, по объему).

Мы обратили внимание, что в МС/МС-спектрах гомологов можно было наблюдать сигналы, соответствующие потере различных гликозидных групп — 180 Да (гексоза), 221 Да (/V-ацетилгексозамин, Рис. 4). Другой особенностью данных фосфолипидов являлось то, что даже в полностью де-О-ацилированных образцах оставались молекулярные виды с разницей в массе в ±14 Да. Это позволяло предположить, что в составе фосфолипидов имеются апкильные цепи, присоединенные не сложноэфирной связью. Поиск в литературе привел нас к работам Андерсона с соавторами, в которых они описали ряд фосфогликолипидов, построенных на базе фосфатидилглицероилалкиламина. Молекулярные массы фосфогликолипидов, обнаруженных у бактерии вида D. radiodurans, были очень близки к обнаруженным нами.

Для установления структур с использованием препаративной ВЭЖХ, твердофазной экстракции и препаративной ТСХ были выделены индивидуальные фосфолипиды либо фракции, содержащие преимущественно один компонент. Структуры индивидуальных липидов были установлены с использованием методов химической модификации в сочетании с QTOF MS, 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР, 'H-'H-COSY, 'H-13C-HSQC, ГЖХ-МС. MC/MC спектры фосфолипидов в режиме отрицательной ионизации были очень информативны (см. Рис. 4).

Все фосфолипиды были также построены на основании фосфатидилглицероилалкиламина (ФГАА). Главным отличием между спектрами фосфолипидов было наличие фрагментных ионов, соответствующих потере различных моносахаридных остатков. Мы идентифицировали следующие моносахариды - глюкозу, jV-ацетилгексозамин, N-аланилглкжозамин и ксилозу (см. Рис. 6). Также был найден и свободный фосфатидилглицероилалкиламин. Для каждого из фосфолипидов был обнаружен более полярный аналог, построенный на базе фосфатидилглицероил-3-гидроксиапкиламина.

-С|5НзтСН=С=0 .по -905 4——

j-221 -С.зН27СН=С=0"" -15:0 460

[17:0]" [15:0]'»«

» i J

\ 6S4

933

ли

•w SKJ 'i'r, МО ПОП >n 'w ., ,w

Рис. 4 МС/МС-спектр Л'-ацетилглюкозаминил-фосфатидилглицероилалкиламина, обнаруженного в бактерии вида С. calidirosea.

Лиггады N, Q и Р (Рис. 6) были выделены в чистом виде, и их структура изучена с помощью 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР, 'H-13C-HSQC, 'Н-3,Р-НМВС. Корелляции в пределах спиновых систем изучались с помощью 'H-^C-HSQC-TOCSY и 'H-'H-COSY. Идентификация сигналов проводилась на основании сравнения спектров выделенных липидов со спектрами синтетических аналогов, спектрами соединений, содержащих аналогичные фрагменты, а также на основании сравнения с литературными данными. Для удобства сравнения спектров различных фосфолипидов на основании фосфатидилглицероилалкиламииов мы использовали сквозную нумерацию (см. Рис. 6 и Таблица 2).

Сигналы 'Н-ЯМР спектра липида N, идентифицированного как N-ацетилглюкозаминил фосфатидилглицероилгидроксиалкиламин, можно было объединить в две большие группы: первая группа 5 3,00-5,50, содержащая сигналы глицерина, глицериновой кислоты и №ацетилглюкозамина, и вторая группа 8 0,50-2,50, содержащая сигналы алифатических групп. В обеих группах ряд сигналов перекрывался. Ниже мы отметим некоторые особенности спектров.

В отличие от синтетических стандартов мы наблюдали расщепление сигналов метиленовых протонов в а- и р-положении алкиламина, что, вероятно, связано с присутствием рядом гидроксила. Подобный эффект также наблюдается и у жирных кислот, содержащих гидроксил на расстоянии двух-трех связей от карбоксильной группы.

Как и для других моносахаридов, а-конфигурация Л'-ацетилглюкозамина была определена на основании величины константы спин-спинового взаимодействия аномерного протона (J=3.5Hz). Сигнал ацетильной группы был определен как синглет с химическим сдвигом 2,05 ррш. не имеющий корреляций в спектре COSY.

Следует отметить, что сигналы Н5 и НЗ коррелировали с сигналом фосфора в 'Н-3|Р-НМВС спектре: это показывает, что яи-глицсро-З-фосфат присоединен именно по второму положению глицериновой кислоты. Хотя теоретически нельзя было исключить возможность присутствия ли-глицеро-1 -фосфата в составе фосфолипидов С. calidirosea, фосфолипиды, построенные на основании зя-глицеро-1 -фосфата, найдены лишь у архей.

Химические сдвиги, определенные для липида N, были очень близки к опубликованным для Л^ацетилглюкозаминил фосфатидилглицероилалкиламина (см. Рис 6 и Таблица 2), с учетом отсутствия гидроксилирования в алкиламине.

Липид Q был выделен с чистотой более 80%, вторым компонентом в смеси был липид N. Спектры 'Н-ЯМР и 13С-ЯМР липида Q, идентифицированного как глюкозил фосфатидилглицероилалкиламин, были похожи на спектры описанного выше липида N. Основные отличия были связаны с присутствием глюкозы, а не /V-ацетилглюкозамина, и с отсутствием гидроксилирования в алкиламине. Величина константы спин-спинового взаимодействия аномерного протона (J=3.6Hz) указывает на а-конфигурацию. Полное отнесение сигналов приведено в Таблице 2.

Липид Р был выделен с чистотой более 90%. Сигналы 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР спектров липида Р, идентифицированного как TV-аланилглюкозаминил

фосфатидилглицероилалкиламина, были похожи на спектры описанного выше липида N. Основным отличием было замещение аминогруппы глюкозамина аланином, а не ацетильной группой. Алании, как и ожидалось, был представлен двумя сигналами, коррелировавшими в спектре COSY: Н2" - квартет на 4,02 ppm (1Н, 6,9Hz), НЗ" - дуплет на 1,49 ppm (ЗН, 6,9Hz). Как и в остальных случаях, величина константы спин-спинового взаимодействия аномерного протона (J=3,6 Hz) указывала на а-конфигурацию. Полное отнесение сигналов можно найти в Таблице 2.

Таблица 2. Данные 'Н- и 13С-ЯМР для липидов N, Р и Q, выделенных из бактерии вида С. calidirosea (CDCb/MeOH, ТМС). Также приведены литературные данные для их ближайших аналогов: Липид 6 - JV-ацетилглюкозаминил ФГАА (Huang Y. & Anderson R, 1989), PGLI - iV-ацстилглюкозаминил ФГАА (Yang Y.-L. et al., 2006).

Липид N Липид P Липид Q Липид 6 Липид PGLI

_ _аналог липида M аналог липида М

Глицерин

1 (СНг) 4.17/4.40 4.14/4.36 4.16/4.40 4.18/4.43 4.03/4.27

63.0 62.4 63.0 62.8 62.6

2 (СН) 5.24 70.9 5.20 70.3 5.24 70.8 5.25 70.8 5.12 7 0.3

3 (СН2) 4.02* 64.1 3.96* 63.7 4.02* 64.3 4.03 64.0 3.89 62.8

Глицерат HHHKWij* ' - 1 ■ 111

5 (СН) 4.75* 75.5 4.60* 74.7 4.73* 75.6 4.74 75.4 4.64 75.3

6 (CHi) 1 : : 3.80/3.87 68.5 3.87/3.92 68.5 3.86/3.94 68.8 3.81/3.92 68.4 3.67 68.1

Моносахарид

7 (СН) 4.78 97.7 4.90 96.9 4.89 99.0 4.84 97.6 4.75 97.2

8 (СН) 3.93 3.87 3.35 3.94 3.80

54.1 53.9 72.8 54.2 53.5

9 (СН) 3.70 72.4 3.65 71.1 3.64 74.4 3.64-3.85 72.4 3.62 71.7

10 (СН) 3.36 71.6 3.39 70.7 3.28 71.1 3.38 71.5 3.39 70.4

11 (СН) 3.68 70.3 3.54 72.3 3.58 72.5 3.64-3.85 72.1 3.55 72

12 (СНз) 3.72/3.82 3.72/3.76 3.70/3.79 3.64-3.85 3.64

62.0 61.4 61.7 61.9 61.1

2' (СНз) 2.05 22.6 - 2.06 22.4 \

2" (СИ) - 4.02 49.2 - - -

3" (СИ) - 1.49 16.5 - - яяниннв

Алкиламин

13 (СИ.) 3.31/3.46 37.1 3.30/3.42 36.7 3.20 39.4 3.24 39.6 3.70 39.4

14 (СШ) 1.55/1.73 1.53/1.70 1.50 1.55 1.43

36.7 36.2 29.4 г 27.4

15 (СИ/СИ2) 3.60 70.1 3.58 69.7

16 (С Иг) 1.45 37.8 1.43 37.3 ........| ...................... - I

17 (СИ:) яшшшшшяш 1.45 26.1 1.43 25.6 1- -

Жирные

кислоты

оСНг 2.33 2.31 2.30 2.33 2.21

ннввнни 34.5 34.0 34 1 34.3 34.1

(1С Иг 1.62 25.2 1.58 24.7 1.58 24.7 1.62 - * 1.50 24.9

-(СНг)п- 1.22-1.38 1.21-1.31 1.22-1.32 1.1-1.4 1.12-1.25

ннишшшмян 28.9-31.1 28.5-30.6 28.7-30.7 + + 28.7-29.6

* Сигналы коррелировали с сигналом фосфора в 'Н-31Р-НМВС спектре; | Сигналы попадают в неразрешенную группу сигналов -(СНг)д-; I Соответствующие химические сдвиги не приведены в указанных статьях;

Таким образом, на основании данных 'Н- и 13С-ЯМР мы подтвердили правильность результатов, полученных в масс-спектрометрических экспериментах, уточнили конфигурацию моносахаридного остатка, а также тот факт, что моносахаридный остаток присоединен по третьему положению глицериновой кислоты, а диацилглицерофосфат по второму. Также мы установили положение гидроксильной группы в фосфатидил-глицероилгидроксиалкиламине.

Стереохимию глицериновой кислоты определяли путем сравнения химических сдвигов фосфора для природного соединения и синтетического стандарта в спектре 3|Р-ЯМР. Ранее Высоцкий и МакКензи показали, что метод 31Р-ЯМР позволяет различать диастереомеры ацилированных фосфатидилглицеринов.

При сравнении химических сдвигов выделенного природного липида Е с фосфатидил-5-глицероилалкиламином (1) и фосфатидил-Я-глицероилалкиламином (2) стало очевидно, что химические сдвиги последнего соединения и природного липида совпадают. Чтобы подчеркнуть это, мы решили последовательно добавить синтетические аналоги к природному липиду Е (Рис. 5).

Результаты этого эксперимента показывают, что глицериновая кислота в свободном фосфатидилглицероилалкиламине имеет й-конфигурацию. Можно предположить, что и остальные липиды имеют такую же структуру. Такое предположение можно сделать на том основании, что: во-первых, Андерсон в работе с липидами бактерии вида О. гас/юс/игапя показал, что фосфатидилглицероилалкиламин является биосинтетическим предшественником остальных гликозилированных липидов, во-вторых, в работах по гликозилированным фосфатидилглицероилалкиламинам как из бактерии вида Д гас!ю(]игап$, так и из бактерий родов ГАегтнх и МеюМегтия, была установлена такая же конфигурация глицериновой кислоты.

Рис. 5. Спектры 31Р-ЯМР фракции, содержащей деацилированиые липид Е и его синтетические аналоги: липид Е (А), фосфатидил-5-глицероилалкиламин, (1) (Б), липид Е + фосфатидил-5-глицероилалкиламин (1) (В), липид Е + фосфатидил-5-глицероилалкиламин (1) + фосфатидил-Д-глицероилалкиламин (2) (Г).

,Х

|—о с15н31

°ТН й г0'

1—О-Р-О -4-Н

он

ОН /=0

нм~г н

На1С

А,

с«н,.

Я г°н

—О-Р-О—Н

он )=0 нг^с н

Таким образом, на основании вышеприведенных данных структуры всех фосфолипидов, обнаруженных в бактерии вида С. саЧсИгохеа, были установлены как - 2'-0-(1,2-диацил-я7-глицеро-3-фосфо)-№-Л-глицероилалкиламин и 2'-С-(1,2-диацил-«п-глицсро-3-фосфо)-Лг-Л-глицсроил-3"-гидроксиалкиламин и их гликозилированныс производные (Рис. 6).

Главной отличительной особенностью фосфолипидов бактерий вида С. саИсИгозеа стало обнаружение 3-гидроксиалкиламинов. Все обнаруженные ранее липиды, построенные на базе ФГАА, имели в составе алкиламины без дополнительных функциональных групп. Интересно, что в исследовании, посвященном алкиламинам бактерии вида О. гасЛос/игапя, Андерсон специально подчеркнул отсутствие гидрокси групп. В другой работе он показал, что жирные кислоты являются биосинтетическим предшественниками алкиламинов. Причем биосинтез осуществляется таким образом, что углерод карбоксильной группы становится первым углеродом в алкиламине. В случае с 3-гидроксиалкиламинами, предшественниками должны быть (З-гидрокси кислоты. Мы не обнаружили присутствие бета-гидрокси кислот в бактерии вида С. саИсИгояеа, за исключением следовых количеств бешя-гидрокси миристиновой кислоты, видимых лишь при помощи хроматомасспектрометра. Мы также не обнаружили присутствие ненасыщенных алкиламинов, несмотря на значительное количество мононенасыщенных жирных кислот, около 21%. Таким образом вопрос биосинтеза алкиламинов требует дополнительных исследований.

Другой особенностью фосфолипидов бактерии вида С. саИсИговеа стало разнообразие моносахаридных остатков. Из 4 обнаруженных нами гликозильных групп, лишь Л'-ацетилглюкозамии был обнаружен ранее в фосфолипидах бактерий видов ТИегтш/МеюМегтш врр. и Пешососсги врр. Помимо Л'-ацетилглюкозамина в фосфолипидах бактерии вида С. саИсИгояеа были также обнаружены остатки Ы-

аланилглюкозамина, глюкозы и ксилозы. У бактерии вида В. гас!юс1игапсе был обнаружен фосфатидилглицероилалкиламин, содержащий галактозу, тогда как мы обнаружили глюкозу. Липиды, содержащие ксилозу - гораздо более редкое явление в природе. Они встречаются обычно в составе гораздо более сложных соединений, таких как бактериальные липополисахариды, например, у бактерий видов ЯЫгоЫит 1ецит'то5агит и Мухососсия хаШЬив. Липиды, содержащие Л'-аланилглюкозамин, обнаружены нами впервые.

Рис. 6. Структуры фосфолипидов, обнаруженных в бактерии вида С. calidirosea. Структуры липидов N, Q и Р были изучены с помощью 'Н-ЯМР, 13С-ЯМР, 'H-13C-HSQC, 'Н-3|Р-НМВС. Для них приведена сквозная нумерация, использованная в Таблице 2.

Из 10 фосфолипидов, обнаруженных в бактерии вида С. calidirosea, лишь свободный ФГАА и ./V-ацетилглюкозаминил ФГАА были обнаружены в других организмах раньше. Остальные 8 фосфолипидов были обнаружены впервые.

Липиды бактерий видов Meiothermus ruber и Therm us spp.

Состав жирных кислот был определен для М. ruber (WRG6.9), T. filiformis (WKT37.6) и T. filiformis (MOK.14.7) (см. Таблицу 4). Для всех образцов было характерно значительное количество кислот разветвленного строения — около 90%. Более половины от суммы жирных кислот составляли кислоты изо-ряда. Отличительной особенностью состава ЖК бактерии вида М. ruber являлось наличие небольшого количества мононенасыщенных, а также альфа- и бета-гидроксикислот. Такой состав жирных кислот, а также отличия между жирными кислотами бактерий родов Meiothermus и Thermus, соответствуют литературным данным.

Анализ имеющейся на сегодняшний день информации по составу и строению сложных липидов бактерий, относящихся к родам Meiothermus и Thermus, показал, что два основных вопроса, остающихся без ответа на сегодняшний день, касаются строения главного фосфолипида, известного в литературе как PL2, и положения гликозилировання глицериновой кислоты в фосфогликолипидах бактерий родов Meiothermus и Thermus. Мы поставили своей целью ответить на данные вопросы.

Для изучения строения фосфолипидов бактерий родов Meiothermus и Thermus мы выбрали 2 объекта - М. ruber (WRG6.9) и T. filiformis (МОК14.7). Для каждого объекта с помощью препаративной ТСХ из общего линидного экстракта мы выделили главный фосфолипид (Рис. 7, ФЛЗ), известный в литературе как PL2, а также 2 минорных фосфолипида с большей подвижностью на ТСХ (Рис. 7, ФЛ1 и ФЛ2). Все фосфолипиды были проанализированы с использованием QTOF MS в режиме регистрации отрицательно

заряженных ионов. Липиды, выделенные в количествах более 1мг, были также проанализированы с использованием методов ЯМР.

А Б

ФЛ1 ФЛ1 Рис. 7. Одномерная ТСХ индивидуальных

фл2 Флг фосфолипидов, выделенных из общих липидов

флз флз бактерий видов М. ruber (WRG6.9) (А) и Т. filiformis

(МОК14.7) (Б). Обнаружение - молибдатный реагент.

Масс-спектр главного компонента фракции ФЛ1 в обоих случаях соответствовал масс-спектру фосфатидилглицсроилалкиламина (Липид Е), выделенного из бактерии вида С. calidirosea. Главным отличием масс-спектра фосфолипида ФЛ1, выделенного из бактерии вида Т. filiformis, было присутствие нескольких ионов с молекулярной массой меньше на 58 Da. Главным из них был компонент с m/z 914,8. Масса и спектр данного компонента соответствовали ФГАА, имеющего длинноцепочечный 1,2-диол вместо глицерина. Сложные липиды, построенные на базе 1,2-диола, уже находили в бактериях родов Meiothermus и Thermits. Ключевые фрагменты в МС/МС-спектре депротонированной молекулы с m/z 914,8 совпадали с ожидаемыми фрагментами для спектра подобного фосфолипида.

Молекулярная масса и фрагментация главного компонента фракций ФЛ2 у обеих бактерий совпадали и соответствовали масс-спектру синтетического глюкозаминил-ФГАА. Как и в случае с липидами ФЛ1, масс-спектр очень близко соответствал картине распада, наблюдавшейся для всех гликозилированных

фосфатидилглицероилалкиламинов, обнаруженных в бактерии вида С. calidirosea. Следует отметить, что в масс-спектре фракции ФЛ2, выделенной из бактерии вида Т. filiformis, нам не удалось обнаружить присутствия гексозаминил-фосфатидилглицероилалкиламина, построенного на базе 1,2-диола. Анализ моносахаридов показал, что фракция ФЛ2, выделенная из бактерии вида М. ruber, содержит галактозамин, а фракция ФЛ2, выделенная из бактерии вида Т. filiformis, -глюкозамин.

Последним мы проанализировали главный фосфолипид (ФЛЗ), выделенный из бактерий видов М. ruber и из Т. filiformis. Масс-спектр главного компонента в обоих случаях соответствовал масс-спектру TV-ацетилгсксозаминил ФГАА (Липид М, см. Рис. 6), выделенного из бактерии вида С. calidirosea. Как и в случае фракции ФЛ1, главным отличием масс-спектра фосфолипида ФЛЗ, выделенного из Т. filiformis, было присутствие нескольких ионов с молекуляной массой меньше на 58 Da. Главным из таких компонентов был фосфолипид с m/z 1117,9. Поиск в литературе показал, что в бактериях видов М. ruber, М. taiwanensis, Т. oshimai и Т. filiformis был обнаружен фосфолипид с такой же молекулярной массой, соответствующий N-ацетилгексозаминил-

фосфатидилглицероилалкиламину, но имеющий в составе длинноцепочечный 1,2-диол вместо глицерина.

Другое подтверждение присутствия N-ацеталгексозаминил-

фосфатидилглицероилалкиламина, построенного на базе 1,2-диола, в бактерии вида Т. filiformis мы обнаружили в спектре протонного ЯМР (Рис. 8). В протонном ЯМР-спектре фосфолипида ФЛЗ из бактерии вида М ruber можно было наблюдать только сигнал метанового протона глицерина с химическим сдвигом 5 5,24, тогда как в спектре фосфолипида ФЛЗ из бактерии вида Т. filiformis, помимо сигнала метанового протона глицерина, также можно было наблюдать и сигнал метанового протона 1,2-диола с химическим сдвигом д 5,04.

Соотношение этих сигналов позволило нам оценить молярное соотношение N-ацетилгексозаминил-фосфатидилглицероилалкиламинов, построенных на базе глицерина, и 1,2-диолов во фракции ФЛЗ бактерии вида Т. filiformis как 74% и 26% соответственно. Интересно, что в спектре протонного ЯМР гексозаминил-фосфатидилглицероилалкиламина (ФЛ2), выделенного из бактерии вида Т. filiformis, сигнал метанового протона 1,2-диола отсутствовал, что согласуется с данными масс-спектрометрии.

Рис. 8. Фрагмент 'Н-ЯМР спектра фосфолипида (ФЛЗ), выделенного из М. ruber (А) и Т. filiformis (Б).

'Н-ЯМР, 13С-ЯМР, 'H-'3C-HSQC, 'H-'H-COSY, 'Н-3'Р-НМВС. определенные для данного липида, были очень близки к

Анализ моносахаридов во фракциях ФЛЗ показал, что в отличии от гексозаминил-ФГАА (фракция ФЛ2), N-ацетилгексозаминил-ФГАА, выделенные как из бактерии вида М. ruber, так и из бактерии вида Т. filiformis, содержат глюкозамин. N-ацетилгексозаминил-ФГАА, описанные ранее в бактериях, относящихся к родам Thermus и Meiothermus, также содержат глюкозамин.

Структура N-ацетилглюкозаминил-ФГАА, выделенного из М. ruber, была также изучена с помощью Химические сдвиги,

опубликованным для Л'-ацетилглюкозаминил-фосфатидилглицероилалкиламина (см. липид 6 и липид PGL1 в Таблице 2), а также к сдвигам липида N с учетом отсутствия гидроксилирования в алкиламине. Отметим, что метиленовые протоны, расположенные в третьем положении глицерина, и метановый протон глицериновой кислоты коррелировали с сигналом фосфора в 'Н-31Р-НМВС спектре, что показывает, что sn~ глицеро-3-фосфат присоединен именно по второму положению глицериновой кислоты.

Количественный анализ фосфолипидов бактерий видов М. ruber и Т. filiformis был проведен с использованием 31Р-ЯМР (см. Таблицу 3).

Таблица 3. Состав фосфолипидов бактерии бактерий видов М. ruber и Т. filiformis.

М. ruber, % Т. filiformis, %

GlcNAc-ФГАА 87 59

GlcNAc-диолФГАА - 18

GalN-ФГАА 13 -

GIcN-ФГАА - 19

ФГАА след. 4

диолФГАА - след.

Общее содержание фосфолипидов 24 26

Строение главного фосфолипида, известного в литературе как PL2, было установлено как jV-ацетилглюкозаминил-фосфатидилглицероилалкиламин, построенный на базе глицерина, или глицерина и длинноцепочечных 1,2-диолов. В отношении положения гликозилирования глицериновой кислоты было установлено, что, как и в липидах бактерий вида С. calidirosea, по второму положению глицериновой кислоты присоединен sn-глицеро-З-фосфат, а по третьему — гликозильная группа. Об этом свидетельствует корреляция сигналов в спектре 'Н-31Р-НМВС. Другим свидетельством

было совпадение химических сдвигов липидов бактерий видов С. calidirosea, М. ruber и Т. filiformis.

Обнаружение биологического загрязнения методом 31Р-ЯМР.

Мы работали с одним видом бактерии рода Meiothermus и двумя видами (тремя штаммами) бактерии рода Thermus. Всего у нас было пять образцов, выращенных в два приема в совершенно одинаковых условиях. Для каждого образца был проанализирован состав жирных кислот и фосфолипидов.

Состав жирных кислот всех образцов был практически одинаков, за исключением гораздо более низкого содержания кислот /14:0 и я/15:0, а также повышенного содержания а/17:0 в двух образцах - "Т. filiformis (WKT37.6, 1ая партия)" и "Т. brockianus (WKT32.35)", по сравнению с остальными образцами (см. Таблицу 4). Мы изначально объяснили это видовыми и штаммовыми отличиями, а также возможным отличием в условиях культивирования. Но после анализа фосфолипидов выяснилось, что содержание и состав фосфолипидов у двух вышеупомянутых бактерий значительно отличается как от литературных данных, так и от данных по остальным образцам. Общее содержание фосфолипидов в образцах "Т. filiformis (WKT37.6, 1ая партия)" и "Т. brockianus (WK.T32.35)" составляло 68% и 43%, соответственно. При этом главными фосфолипидами, около 35—40% каждый, являлись ДФГ и ФЭ, также присутствовали 3 не идентифицированных минорных фосфолипида (Рис. 9). Содержание фосфолипидов в трех остальных образцах - Т. filiformis (WKT37.6), Т. filiformis (МОК14.7) и М. ruber (WRG6.9), колебалось от 19,5% до 24,0%, а содержание главного фосфолипида (N-ацетилглюкозаминил-ФГАА) составляло не менее 70%, в данных образцах полностью отсутствовали обычные фосфолипиды, в том числе ДФГ и ФЭ (Рис. 10). Кардинально отличающийся состав фосфолипидов между указанными группами образцов указывал на то, что мы имеем дело с разными, неродственными группами бактерий

Одним из вероятных объяснений было бактериальное загрязнение образцов. Поиск в литературе термофильных бактерий, содержащий значительные количества ДФГ и ФЭ, позволил нам обнаружить вероятного кандидата - Geobacillus stearothermophilus. Согласно литературным данным, общее содержание фосфолипидов должно было составлять -65% от общих липидов, из которых на ДФГ и ФЭ должно было приходиться -30% и -25% соответственно, при температуре инкубации 60°С. Эти данные были очень похожи на результаты анализа фосфолипидов в образцах "Т. filiformis (WKT37.6, 1ая партия)" и "Т. brockianus (WKT32.35)".

дд

Рис. 9. Спектры 31Р-ЯМР общих липидов, выделенных из следующих бактерий: "Т. filiformis (WKT 37.6, 1ая партия)" (А); "Т. brockiams (WKT32.35)" (Б); Т. filiformis (МОК14.7) (В); Т. filiformis (WKT 37.6) (Г); М. ruber (WRG6.9) (Д).

Для проверки этой гипотезы в тех же условиях был выращен образец бактерии вида й. з/еаго/ИеппорИНиз (МЗМ22.10). Результаты анализа жирных кислот и фосфолипидов данного образца подтвердили наше предположение о бактериальном загрязнении. Состав жирных кислот (см. Таблицу 4) и фосфолипидов бактерии вида С. ¡¡еагоМегторкИия практически полностью совпадал с таковыми для образцов "Т. /¡И/огтЬ (\VKT37.6, 1ая партия)" и "Т. Ъгоскшпиз (WK.T32.35)"

Таблица 4. Состав жирных кислот бактерий родов МеюЛегтт и ТЪегтт. Состав жирных кислот бактерии вида С. ¡¡еапИкеппоркИи.ч, а также бактерий, имевших сходный состав фосфолипидов. ______

жк эдц (TGwax) М. ruber (WRG6.9) Т. filiformis (WKT37.6) Т. filiformis (МОК14.7) "Т. filiformis (WKT37.6, 1ая партия) "Г. brockiartus (WKT32.35) G. stearothermophilus (NGM22.10)

/14:0 13.56 1.2 1.5 1.8 0.4 0.5 0.6

14:0 14.03 0.8 0.3 0.2 0.5 1.6 0.5

¿15:0 14.53 27.8 20.6 20.0 20.4 14.3 26.3

а/15:0 14.70 10.8 10.3 10.1 3.6 5.5 6.1

/15:1 14.80 0.6 - - - - -

15:0 15.02 1.2 0.4 1.3 0.6 4.7 0.4

/16:0 15.52 7.4 12.1 18.0 13.1 12.8 10.8

/16:1 15.76 0.7 - - - - -

16:0 16.00 5.4 2.2 2.1 9.8 17.3 5.5

16:1п-9 16.25 0.6 - - - - -

/17:0 16.50 19.9 31.6 23.8 25.2 16.4 22

ai 17:0 16.67 10.3 13.5 13.3 19.6 20.5 24.2

/17:1 16.77 2.4 - - - - -

а/17:1 16.95 0.6 - - - - -

17:0 16.98 0.6 0.3 след. 0.4 3.3 0.3

/18:0 17.49 0.5 1.5 1.0 0.7 0.8 0.6

18:0 17.99 0.6 0.5 1.4 1.2 1.5 0.6

3-ОН /16:0 20.32 0.6 - - - - -

2-ОН /17:0 20.56 2.6 - - - - -

3-ОН /17:0 21.33 1.2 - - - - -

Для установления строения неизвестных минорных фосфолипидов мы выделили зону на препаративной ТСХ, содержащую данные фосфолипиды, и проанализировали эту фракцию с использованием QTOF MS. МС/МС-спектры позволили идентифицировать два из трех неизвестных минорных фосфолипидов - ими оказались гексозаминил фосфоатидилглицсрин и гликозилированный дифосфатидилглицсрин. Аналогичный гексозаминил фосфоатидилглицсрин был обнаружен ранее в бактерии вида Bacillus megaterium. Насколько нам известно, это первый случай обнаружения гексозаминил ФГ в бактерии вида G. stearothermophilus.

Таким образом, нам удалось обнаружить присутствие бактериального загрязнения, используя 31Р-ЯМР, идентифицировать источник загрязнения как бактерия вида О. $1еаШЬегторЫ1иа и подтвердить идентификацию. Также нам удалось установить строение двух минорных липидов из бактерии вида С. 51еаго1ЬегторЫ1т как гексозаминил фосфатидилглицерина и гликозил дифосфатидилглицерина. Причем гексозаминил фосфатидилглицерин был обнаружен в бактерии вида С. ¡(еагшИегторЬИих впервые.

Липиды бактерии вида Thermogemmat¡spora ер. (штамм Т81)

МЭЖК были проанализированы на ГЖХ и ГЖХ-МС на колонках с неполярной фазой (ВР1) и фазой средней полярности (ГСлуах). После сравнения результатов с лабораторными стандартами и опубликованными ЭДЦ удалось идентифицировать одиннадцать из двадцати жирных кислот с содержанием более 0,2% (см. таблицу б). Были идентифицированы насыщенные жирные кислоты с неразветвленным углеродным скелетом, составившие в сумме 7,6%, и насыщенные жирные кислоты с изо- и антеизо-разветвлением, составившие в сумме 67,3%. При этом стоит отметить, что содержание /18:0 оказалось неожиданно высоким - 42,8%. Девять неидентифицированных жирных кислот с содержанием отдельных компонентов от 0,2% до 16,3% составили 25,1% от общих жирных кислот (см. таблицу 6). Неидентифицированные жирные кислоты были предварительно идентифицированы как разветвленные насыщенные жирные кислоты с общим количеством углеродных атомов в цепи от 17 до 21.

Отсутствие ненасыщенных жирных кислот было подтверждено отсутствием изменений с составе и количестве жирных кислот до и после гидрирования. Также следует отметить отсутствие изменений после силилирования МЭЖК, что говорит об отсутствии гидрокси-тспоп.

Для дальнейшей идентификации жирных кислот мы приготовили и проанализировали на ГЖХ-МС пирролидиды жирных кислот, используя имеющиеся в наличии метиловые эфиры. Масс-спектры пирролидидов ЖК подтвердил верную идентификацию жирных кислот, а также позволил уточнить строение одной из не идентифицированных жирных кислот с ЭДЦ(ВР1)=18,44 (Рис. 10).

Масс-спекгры пирролидидов других не идентифицированных кислот не позволяли полностью установить их строение. С одной стороны, спектры однозначно показывали присутствие шо-разветвления, а также монометильного разветвления в середине цепи. С другой стороны, имели некоторое снижение интенсивности между сигналом омега-Ъ атома и сигналом атома, предшествующего разветвлению в середине цепи, что оставляло возможность трактовать это как присутствие разветвления в этой части молекулы (см. Рис. 11).

Для окончательного разрешения вопроса о строении остальных жирных кислот мы выделили одну из неидентифицированных С20 жирных кислот ("X") при помощи ВЭЖХ с чистотой более 98%. ГЖХ-МС метилового эфира показал, что это насыщенная жирная кислота с двадцатью атомами углерода в цепи. Дробное значение ЭДЦ, 19,04 на колонке с

126

4( 5*3 511

Рис. 10. Масс-спектр пирролидида 12-метилоктадекановой кислоты (12-Ме 18:0).

м зш

неполярной фазой (ВР1) и 18,76 на колонке фазой средней полярности (TG-wax), указывало на присутствие разветвления в жирной кислоте.

Для окончательного установления строения данная жирная кислота была изучена с помощью 'Н-ЯМР, |3С-ЯМР, 'H-'H-COSY, 'H-^C-HSQC. Для отнесения сигналов С14, С15, а также С4 по СЮ, мы использовали данные, полученные при помощи HSQC-TOCSY. Па основании этих данных структура кислоты была определена как 12,17-диметилоктадекановая кислота (3).

Таблица 5. Данные 'Н- и 13С-ЯМР для метилового эфира 12,17-диметилоктадекановой кислоты, выделенной из бактерии вида Thermogemmatispora sp. (Т81) (CDCh, ТМС).

Atom углерода 'H 13C

<5 (ppm) 1 m 1 J (Hz) S (ppm)

1 174,32

2 2,30 t 7,5 34,13

3 1,61 m 7,3 24,97

4 1,25a m 29,16

5 1,25" m 29,25

6 1,25a m 29,45

7 1,25' m 29,59

8 1,25a m 29,67

9 1,25a m 30,00

10 1,25a m 27,07

11 1,08 m 37,10

12 1,35 m 32,76

13 1,27 m 37,14

14 1,25a m 27,34

15 1,25" m 27,76

16 1,15 m 39,11

17 1,52 n 6.6 27,98

18 0,86 d 6.6 22,65

19 0,83 d 6.6 19,72

20 0,86 d 6.6 22,65

-ОСНз 3,66 s 51,40

а Перекрывающиеся сигналы не отнесены

Химические сдвиги в спектре 13С-ЯМР 12,17-диметилоктадекановой кислоты очень близки к опубликованным в литературе для других разветвленных кислот.

Масс-спектр пирролидида данной кислоты (Рис. 11) соответствовал установленной структуре. На основании масс-спектров пирролидидов были установлены структуры оставшихся не идентифицированных жирных кислот бактерии вида Thermogemmatispora sp. (штамм Т81). Ими оказались 8,14-diMe 15:0, 10,15-diMe 16:0, 12,15-diMe 16:0, 10,16-diMe 17:0, 12,16-diMe 17:0, 12,17-diMe 18:0, 12,18-diMe 19:0 и 14,19-diMe 20:0.

350

266 Г

238

пз ^

Рис. 11. Масс-спектр пирролидида 12,17-диметилоктадекановой кислоты (12,17-diMe 18:0).

Мы использовали два сервиса, Reaxys® (сервис Elsevier Properties SA) и SciFinder® (сервис Chemical Abstracts), для поиска информации по диметил-разветвленным жирным кислотам. Ни одного упоминания об обнаружении в природе 12,17-диметилоктадекановой кислоты, а также большей части других описанных нами диметил-разветвленных жирных кислот найти не удалось. Исключение составила 10,15-диметилогексадекановая кислота, обнаруженная в полярных липидах поверхностных отложений, собранных на территории фабрики по обогащению урана. Другим исключением стала 8,14-диметилопентадекановая кислота, обнаруженная в неуказанном количестве в жировой ткани лани. К сожалению, точность идентификации в последней работе находится под вопросом, поскольку структура была установлена лишь на основании данных ГЖХ-МС для пика, содержащего по крайней мере три диметил-разветвленных жирных кислоты. Для остальных шести идентифицированных нами диметил-разветвленных жирных кислот это был первый случай обнаружения в природе.

Таблица 6. Состав жирных кислот бактерии вида Thermogemmatispora sp. (Т81).

ЖК 3flU(TG-wax) ЭДЦ(ВР1) % от суммы ЖК*

14:0 13.98 13.98 0.5

Неустановлено 15.34 15.77 0.3

/16:0 15.51 15.64 2.0

8,14-diMe-15:0 15.76 16.06 след.

16:0 16.00 16.00 2.9

/17:0 16.52 16.65 5.9

oil 7:0 16.68 16.74 0.9

10,15-diMe-16:0 16.78 17.06 0.6

12,15-diMe-16:0 16.88 17.11 0.2

17:0 17.00 17.00 0.2

/18:0 17.52 17.65 42.8

10,16-diMe-17:0 17.76 18.04 2.1

12,16-diMe-17:0 17.76 18.06 3.0

18:0 18.00 18.00 4.0

12-Me 18:0 18.29 18.44 1.6

/19:0 18.51 18.64 9.7

o/19:0 18.68 18.72 4.8

12,17-diMe 18:0, "X" 18.76 19.04 16.3

/20:0 19.50 19.63 1.2

12,18-diMe-19:0 19.72 20.01 0.6

14,19-diMe-20:0a - - -

* - приведены ЖК с содержанием более 0,2%

а - минорный компонент, который был обнаружен с использованием ГЖХ-МС в виде пирролидида в одной из фракций ВЭЖХ.

Разветвленная насыщенная жирная кислота, содержащая 20 атомов углерода в цепи, была обнаружена у двух других видов бактерий, также относящихся к роду Thermogemmatispora (класс Ktedonobacieria) — Т. onikobensis и Т. foliorum. Хотя структура данной кислоты не была установлена, приведенная в статье ЭДЦ на колонке с неполярной фазой, 19,032, практически полностью совпадала с ЭДЦ наблюдаемой нами на такой-же фазе для 12,17-diMe 18:0. Более того, основные фрагменты, наблюдаемые в масс-спектре метилового эфира неизвестной кислоты, совпадали с теми, которые мы наблюдали для 12,17-diMe 18:0. При этом другие представители класса Ktedonobacieria, относящиеся к родам Thermosporothrix и Ktedonobacter, не содержат диметил-разветвленных жирных кислот. Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что 12,17-diMe 18:0 является хемотаксономичсским маркером для бактерий рода Thermogemmatispora.

ТСХ анализ показал отсутствие свободных жирных кислот, восков, стеринов и ацилглицеринов в липидном экстракте бактерии вида Thermogemmatispora sp. (Т81). Анализ неочищенных жирных кислот, полученных путем трансметилирования биомассы на ГЖХ-МС показал присутствие, помимо МЭЖК, углеводородов. Фракция нейтральных липидов, полученная с использованием колоночной хроматографии, была охарактеризована на ГЖХ-МС (Рис. 12).

ГЖХ-МС фракции нейтральных липидов показала присутствие углеводородов с длинной цепи от 16 до 31 атомов углерода в цепи. Углеводороды с четным числом атомов углерода в цепи от С16 до С24 состояли из алканов и алкенов. На основании масс-спектров диметилдисульфидных (ДМДС) аддуктов был идентифицирован ряд изомеров с положением двойной связи от Д1 до Д5, причем последний изомер был обнаружен в наибольшем количестве.

eis

С20

Г2, i С" С\" Cf "б

Рис. 12. Хроматограмма фракции нейтральных липидов бактерии вида Thermogemmatispora sp. (Т81), полученная на ГЖХ-МС.

Двумерная ТСХ с использованием молибдатного реагента показала присутствие двух главных и четырех минорных фосфолипидов. Подвижность на ТСХ, реакции со специфичными реагентами, а также данные 31Р-ЯМР спектров позволили идентифицировать фосфолипиды и оценить их количественное содержание: ФГ и ФИ в сумме составляли более 85% от суммы фосфолипидов — 45,8 и 39,7% соответственно; ФИМ, ДФГ и ФЭ составляли 5,4, 4,4 и 3,3% соответственно. Содержание ФК количественно оценить не удалось, поскольку его было слишком мало. Содержание фосфолипидов в экстракте составило 24,1% от общей массы липидов.

Судя по подвижности на ТСХ, мы имели дело с фосфатидилинозитол маннозидом, содержащим один остаток маннозы. Для уточнения структуры ФИМ при помощи колоночной хроматографии и препаративной ТСХ была выделена фракция, содержащая искомый компонент. Для этой фракции был снят ряд масс-спектров с использованием QTOF MS в режиме регистрации отрицательных ионов. Масс-спектр показал ряд ионов m/z 999,5, m/z 1013.5, mk 1027.5, m/z 1041.5 и m/z 1055.5, что соответствовало ожидаемым

молекулярным массам депротонированных молекул для молекулярных видов ФИМ1 с С34:0 по С38:0. МС/МС спектр иона m/z 1027.5 соответствовал приведенным в литературе ФИМ1 спектрам.

Качественный состав фосфолипидов соответствовал опубликованным ранее данным по составу фосфолипидов других бактерий рода Thermogemmatispora. У обоих описанных на сегодняшний день видов, T. onicobensis и T. foliorum, главными фосфолипидами являются фосфатидилинозитол и фосфатидилглицерин. У бактерий видов Thermosporothrix hazakensis и Ktedonobacter racemifer, как и Thermogemmatispora spp., относящихся к классу Ktedonobacteria, помимо ФИ и ФГ, были также обнаружены ДФГ и ФИМ.

Выводы

1. Определен состав жирных кислот термофильных бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (Т81). Установлены структуры девяти неизвестных ранее жирных кислот. Показано, что 12,17-диметилоктадекановая кислота является хемотаксономическим маркером для бактерий рода Thermogemmatispora. Определен состав простых липидов термофильных бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (Т81). Показано, что простые липиды бактерии вида С. calidirosea содержат производные сквалена, включая частично и полностью циклизованные производные. Также показано, что простые липиды бактерии вида Thermogemmatispora sp. (Т81) содержат насыщенные и мононенасыщенные углеводороды.

2. Впервые определен состав фосфолипидов термофильных бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (Т81). Показано, что бактерия вида С. calidirosea содержит уникальные фосфогликолипиды, построенные на основе фосфатидил-Л-глицероилалкиламина и фосфатидил-Я-глицероил-З-гидроксиалкиламина. ФГАА в бактерии вида С. calidirosea были обнаружены в свободном виде, а также модифицированными следующими гликозильными остатками — ксилоза, глюкоза, N-ацетилглюкозамин и TV-аланилглюкозамин. Из 10 обнаруженных в бактерии вида С. calidirosea липидов лишь 2 быле описаны ранее.

3. Структура главного фосфолипида (PL2) бактерий видов М. ruber и Thermus spp. установлена как 2'-0-(1,2-диацил-^п-глицеро-3-фосфо)-3'-0-(а-Лг-ацетил-глюкозаминилЭ-Л^глицероил алкиламин и его аналог, построенный на базе 1,2-алкилдиола - 2'-0-(2-ацилалкилдиол-1-фосфо)-3'-0-(а-Лг-ацетил-глюкозаминил)-Лг-глицероил алкиламин.

4. На примере бактерий Geobacillus stearothermophilus, M. ruber и Thermus spp. показано, что фосфолипиды бактерий могут являться более эффективными маркерами таксономического положения, чем жирные кислоты.

5. Показана возможность использования 3,Р-ЯМР для установления особенностей строения фосфолипидов, что может быть использовано при исследовании строения неизвестных фосфолипидов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Vyssotski M., Ryan J., La gutin К.. Wong H., Morgan X.C., Stott M.B. A novel fatty acid, 12,17-dimethyloctadecanoic acid, from the extremophile Thermogemmatispora sp. (strain T81) // Lipids. 2012. Vol. 47, № 6, P. 601-611.

2. Vyssotski M., Lee K., Lagutin K.. Ryan J., Morgan X.C., Stott M.B. Fatty acids of Chthonomonas calidirosea, of a novel class Chthonomonadetes from a recently described phylum Armatimonadetes // Lipids. 2011. Vol. 46, № 12, P. 1155-1161.

3. Lee K.C.-Y., Dunfield P.F., Morgan X.C.,. Crowe M.A, Houghton K.M., Vyssotski M., Ryan J., Lagutin K.. McDonald I.R., Stott M.B. 2010. Chthonomonas calidirosea gen. nov., sp. nov., an aerobic, pigmented, thermophilic microorganism of a novel bacterial class, Chthonomonadetes classis. nov., of the newly described phylum Armatimonadetes

originally designated candidate division OP 10 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. Vol. 61, № 10, P. 2482-2490.

4. MacKenzie A., Vyssotski M., Lagutin K.. Ryan J., Lcc K.., Morgan X.C., Stott M. Phospholipids of New Zealand extremophiles // World Congress on Oleo Science & 29th ISF Congress. Sasebo.-2012.

5. Lagutin K.. Vyssotski M., Ryan J., Stott M. Simple lipids of New Zealand thermophiles // 10th Euro Fed Lipid Congress. Cracow. - 2012.

6. MacKenzie A., Vyssotski M., Lagutin K.. Ryan J., Lee K., Morgan X.C., Stott M. Lipids of NZ extremophiles // Australasian Section of the American Oil Chemists' Society (AAOCS) Biennial Conference. Adelaide. - 2011.

7. Vyssotski M., Lee K., Lagutin K.. Nekrasov E., MacKenzie A., Ryan J., Stott M. Phospholipids of extremophile Chthonomonas calidirosea from a recently described phylum Armatimonadetes // 9th Euro Fed Lipid Congress. Rotterdam. - 2011.

8. Vyssotski M., Ryan R., Lagutin K„ Wong H., Morgan X., Stott M. Novel fatty acid, 12,17-dimethyloctadecanoic acid, from Thermogemmatispora strain T81 // 102nd AOCS Annual Meeting & Expo. Cincinnati. - 2011.

9. Vyssotski M., Lec K., Lagutin K.. Ryan J., Stott M. Fatty acid composition of extremophile T49 // 8th Euro Fed Lipid Congress. Munich. -2010.

10. Lee K.C., Morgan X.C., Ryan J., Lagutin K.. Vyssotski M., McDonald I.R., Stott M.B. Physiological characterization and genome sequence of the first cultured representative of candidate division OPIO, 'Khthonomonas calidirosea' II 13th International Symposium on Microbial Ecology. Seattle. -2010.

11. Lee K.C., Morgan X.C., Ryan J., Lagutin K„ Vyssotskii M., McDonald I.R., Stott, M.B. The physiological and ecological characterisation of the first cultivated species of candidate division OPIO // COMBIOL conference. Christchurch. - 2009.

Лагутин Кирилл Александрович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ЛИПИДЫ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ НОВОЙ ЗЕЛАНДИИ

Подписано в печать 22.05.2013 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,39 Уч-изд. 1,29 Тираж 100 экз. Заказ 344 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Лагутин, Кирилл Александрович, Владивосток

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Школа естественных наук Кафедра биоорганической химии и биотехнологии

04 201360282

На правах рукописи

Лагутин Кирилл Александрович ЛИПИДЫ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ НОВОЙ ЗЕЛАНДИИ

02.00.10 — Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН В. Е. Васьковский

Владивосток — 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.............................................................................................................................3

1. Литературный обзор...................................................................................................8

1.1. Термофильные бактерии........................................................................................8

1.1.1. Открытие термофильных бактерий...............................................................9

1.1.2. Термофильные бактерии Новой Зеландии..................................................12

1.2. Липиды бактерий..................................................................................................13

1.2.1. Жирные кислоты бактерий...........................................................................13

1.2.2. Полярные липиды бактерий.........................................................................17

1.3. Липиды термофильных бактерий.......................................................................19

1.3.1. Липиды бактерий родов Thermus и Meiothermus........................................20

1.3.2. Липиды бактерий класса Bacilli...................................................................22

1.3.3. Липиды бактерий класса Clostridia..............................................................25

1.3.4. Липиды бактерий типа Cyanobacteria.........................................................27

1.3.5. Уникальные фосфогликолипиды, построенные на основе фосфатидилглицероилалкиламина....................................................................................28

2. Обсуждение результатов.............................................................................................32

2.1. Липиды бактерии вида Chthonomonas calidirosea.............................................32

2.1.1. Содержание общих липидов.........................................................................32

2.1.2. Состав жирных кислот..................................................................................32

2.1.2. Состав простых липидов...............................................................................39

2.1.2.1. Состав нейтральных липидов................................................................39

2.1.2.2. Состав бактериогопанполиолов............................................................43

2.1.3. Состав фосфолипидов...................................................................................51

2.1.3.1. Липиды Е и el.........................................................................................55

2.1.3.2. Липиды L и 11..........................................................................................57

2.1.3.3. Липиды М и N.........................................................................................59

2.1.3.4. Липиды Q и S..........................................................................................61

2.1.3.5. ЛипидыОиР..........................................................................................62

2.1.3.6. Определение структур гликозилированных фосфатидилглицероилалкиламинов методами ЯМР...................................................64

2.1.3.7. Сравнение фосфолипидов бактерии вида С. calidirosea с

фосфолипидами бактерий видов ThermuslMeiothermus spp. и Deinococcus spp........72

2.2. Липиды бактерий видов Meiothermus ruber и Thermus spp..................................73

2.2.1. Содержание общих липидов.............................................................................74

2.2.2. Состав жирных кислот......................................................................................74

2.2.3. Состав фосфолипидов.......................................................................................75

2.2.4. Обнаружение биологического загрязнения методом 31Р-ЯМР.....................83

2.3. Липиды бактерии вида Thermogemmatispora sp. (штамм Т81)........................88

2.3.1. Содержание общих липидов.........................................................................88

2.3.2. Состав жирных кислот..................................................................................88

2.3.3. Состав нейтральных липидов.......................................................................94

2.3.4. Состав фосфолипидов...................................................................................95

3. Экспериментальная часть...........................................................................................99

3.1. Биологические объекты.......................................................................................99

3.2. Реактивы и материалы........................................................................................100

3.3. Приборы и оборудование...................................................................................100

3.4. Экстракция общих липидов...............................................................................101

3.5. Приготовление производных липидов.............................................................101

3.5.1. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК)................................................................101

3.5.2. Пиррол ид иды ЖК........................................................................................101

3.5.3. Гидрирование ЖК (липидов)......................................................................102

3.5.4. Раскрытие циклопропанового кольца........................................................102

3.5.5. Диметилдисульфидные аддукты моноеновых МЭЖК............................102

3.5.6. Диметилдисульфидные аддукты алкенов.................................................102

3.5.7. Триметилсилильные прозводные гидрокси жирных кислот...................102

3.5.8. Перацетилирование полярных липидов....................................................103

3.5.9. Де-О-ацилирование полярных липидов....................................................103

3.6. Анализ гликозильных групп гликолипидов.....................................................103

3.7. Колоночная хроматография...............................................................................104

3.7.1. Разделение МЭЖК по степение ненасыщенности...................................104

3.7.2. Фракционирование липидов С. calidirosea...............................................104

3.8. Препаративная ВЭЖХ........................................................................................104

3.8.1. Выделение свободных жирных кислот.....................................................104

3.8.2. Выделение индивидуальных МЭЖК.........................................................105

3.8.2. Выделение индивидуальных фосфолипидов............................................105

3.9. Тонкослойная хроматография (ТСХ)...............................................................105

3.9.1. Системы растворителей для ТСХ..............................................................105

3.9.2. Обнаружение веществ на ТСХ-пластинках..............................................106

3.10. Количественное определение содержания фосфолипидов с использованием ядерного магнитного резонанса на ядрах 31Р (3,Р-ЯМР)...................................................107

3.11. Газожидкостная хроматография.....................................................................107

3.12. Газожидкостная хроматография — масс-спектрометрия...............................107

3.13. Анализ аминокислот.........................................................................................108

4. Выводы.......................................................................................................................109

5. Список цитируемой литературы..............................................................................110

6. Приложения................................................................................................................139

Введение

Актуальность проблемы. Важность исследования липидов термофильных бактерий определяется как интересами фундаментальной науки, так и прикладными задачами. На сегодняшний день информация о составе жирных кислот и полярных липидов широко используется для таксономических целей на всех уровнях, от вида до типа. Некоторые липиды, обнаруженные у термофильных бактерий, обладают биологической активностью. Новые, необычные полярные липиды указывают на наличие еще неизвестных биосинтетических путей. Присутствие известных ранее липидов свидетельствует о наличии ферментов, функционирующих при высоких температурах, аналогичных найденным ранее у мезофильных организмов.

К сожалению, о составе липидов большей части описанных термофильных бактерий либо ничего неизвестно, либо эти сведения носят фрагментарный характер. Большая часть известной информации опубликована микробиологами в связи с требованиями к описанию новых видов. Благодаря этому информация о жирных кислотах недавно описанных бактерий доступна, хотя и не всегда достоверна, поскольку обычно используемые в таких случаях автоматизированные системы позволяют обнаружить лишь уже известные соединения, но не могут помочь в случае обнаружения новых, ранее неизвестных соединений.

Новая Зеландия, наряду с Йеллоустонским национальным парком (США), Камчаткой (Россия) и Исландией является районом мира, богатым геотермальными зонами - местообитанием термофилов, что открывает широкие возможности для исследований в области биохимии липидов термофильных бактерий.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся анализ и установление строения неизвестных ранее липидов, обнаруженных нами в некоторых недавно культивированных термофильных бактериях, выделенных из геотермальных зон Новой Зеландии. Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить состав жирных кислот и фосфолипидов впервые культивированных термофильных бактерий видов СЫЪопотопа$ саИЖго&еа и Thermogemmaíispora эр. (штамм Т81)

2. Установить структуры неизвестных ранее жирных кислот и фосфолипидов бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (штамм Т81).

4. Оценить возможность использования обнаруженных жирных кислот и фосфолипидов для хемосистематики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ненасыщенные ЖК бактерии вида С. calidirosea представлены только Д5-моноенами. Бактерия также содержит новую циклопропановую кислоту - 5,6-метилен гексадекановую кислоту.

3. Бактерия вида С. calidirosea содержит уникальные фосфогликолипиды, построенные на основе фосфатидил-Ы-глицероилалкиламина, сходные по строению с фосфогликолипидами бактерии вида Deinococcus radiodurans.

4. Впервые установлены структуры фосфолипидов бактерий видов М. ruber и Т. filiformis. Структура главного фосфолипида (PL2) установлена как N-ацетилглюкозаменил фосфатидилглицероилалкиламин и его аналог, построенный на 1,2-диоле.

5. На примере бактерий видов Geobacillus stearothermophilus, М. ruber и Thermus spp. было показано, что фосфолипиды бактерий могут являтся более эффективными маркерами таксономического положения, чем жирные кислоты.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые был определен состав жирных кислот бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (штамм Т81). Методами масс-спектрометрии и ЯМР были установлены структуры девяти неизвестных ранее жирных кислот. Был определен состав простых липидов бактерий видов С. calidirosea и Thermogemmatispora sp. (штамм Т81). Было показано, что простые липиды бактерии вида С. calidirosea содержат набор терпеноидов - производных сквалена. включая частично и полностью циклизованные производные. Впервые был

определен состав фосфолипидов бактерий видов С. calidirosea, Thermogemmatispora sp. (штамм Т81), и установлено строение главного фосфолипида бактерий видов М. ruber и Thermus spp. Фосфолипиды бактерии вида С. calidirosea были идентифицированы с использованием методов химической модификации, масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии как фосфатидил-К-глицероилал кил амины с различным гликозилированием. Это первое обнаружение подобных липидов за пределами типа Deinococcus-Thermus. Для каждого фосфолипида был впервые обнаружен аналог, содержащий гидроксилированный алкиламин. Из 10 описанных липидов лишь 2 были описаны ранее у бактерии вида D. radiodurans. /^-конфигурация глицериновой кислоты была установлена с использованием 31Р-ЯМР и синтетических аналогов. Установлена структура главного фосфолипида бактерий видов М. ruber и T. filiformis, последние 30 лет традиционно обозначавшегося как PL2 - 2'-0-(1,2-диацил-лт7-глицеро-3-фосфо)-3'-С-(а-Л/-ацетил-глюкозаминил)-/У-глицероил алкиламин. Впервые

фосфатидилглицероилалкиламин и глюкозаминил фосфатидилглицероилалкиламин были обнаружены в бактериях родов Thermus и Meiothermus.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим руководителям чл.-корр. РАН В.Е. Васьковскому и к.х.н. М.В. Высоцкому за поддержку на всех этапах выполнения диссертационной работы; Dr. A. MacKenzie за помощь в интерпретации ЯМР спектров; Dr. J. Ryan за выращивание микробиальной биомассы для исследований; Dr. G. Painter, Dr. В. Dyer и Dr. В. Compton за предоставление синтетических образцов; Dr. Y. Lu за получение масс-спектров (ESI-MS); Dr. Н. Wong за запись ЯМР спектров; Dr. I. Sims за помощь в ГЖХ-МС анализе моносахаридов; Dr. К. Johnson за аминокислотный анализ; Dr. М. Stott, Dr. X. Morgan и Karen Houghton за предоставление образцов термофильных бактерий.

Список сокращений:

COSY -корреляционная спектроскопия

ESI-MS -электроспрей-ионизационная масс-спектрометрия

НМВС -гетероядерная многополосная корреляция

HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция

TOCSY -тотальная корреляционная спектроскопия

БГП — бактериогопанпентол

БГТ — бактериогопантетрол

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ — газожидкостная хроматография

ГЖХ-МС — газовая хроматография-масс-спектрометрия

ДГК — докозагексаеновая кислота

ДФГ — дифосфатидилглицерин

ДМДС — диметилдисульфидные аддукты

МЭЖК — метиловые эфиры жирных кислот

ТСХ — тонкослойная хроматография

ФГ — фосфатидилглицерин

ФГАА — фосфатидилглицероилалкиламин

ФИ — фосфатидилинозитол

ФИМ — фосфатидилинозитол маннозид

ФС — фосфатидилсерин ФХ — фосфатидилхолин ФЭ — фосфатидилэтаноламин ЭДЦ — эквивалентная длина цепи ЭПК — эйкозапентаеновая кислота ЯМР — ядерный магнитный резонананс

1. Литературный обзор

Изучение жирных кислот термофильных бактерий началось практически сразу после обнаружения термофилов [1], тем не менее, эти исследования проводило лишь небольшое число исследовательских групп. Еще меньшее число групп занималось изучением полярных липидов новых организмов. До сих пор для некоторых видов доступная информация ограничивается составом жирных кислот, а для многих видов нет и этой информации.

На сегодняшний день существует несколько литературных обзоров, полностью или частично посвященных жирным кислотам термофильных бактерий, среди них обзор японского исследователя Тоши Канеда (Toshi Kaneda) по бактериальным жирным кислотам изо- и антеизо-строения [2], а также несколько обзоров, посвященных связи состава и строения жирных кислот и температурной адаптации, последний из которых был опубликован в 1994 году [3-5]. Информация по полярным липидам термофильных бактерий очень разрознена, однако некоторые сведения о предмете можно подчерпнуть в нескольких обзорах [6-9].

Целью данного литературного обзора является введение читателя в область исследований термофильных бактерий, краткое обобщение информации по липидам бактерий и более подробный обзор липидов термофильных бактерий, относящихся к следующим типам: Cyanobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicules (класс Bacilli и класс Clostridia). Акцент сделан на жирные кислоты и полярные липиды, преимущественно фосфолипиды, как обязательные и зачастую главные компоненты мембран бактерий. Кроме того, особое внимание в обзоре обращено на термофильные бактерии, обнаруженные в Новой Зеландии.

1.1. Термофильные бактерии

Прежде чем перейти к рассмотрению термофильных бактерий, следует отметить, что температура является лишь одним из факторов, которые формируют условия обитания, а также экстремальность этих условий. Как правило, соленость, рН, а также высокую концентрацию других соединений рассматривают как геохимические экстремальные условия; радиацию, высокие давление и температуру относят к физическим экстремальным условиям [10]. Организмы, живущие в условиях экстремальности нескольких типов, называют полиэкстремофилами. В качестве примера

можно привести бактерию вида Ме1ку1ас'кИрЫ1ит т/егпогит, метанотрофную бактерию, растущую при рН 2.0 и 60°С [11]. Отдельно следует отметить гипертермофилы, обнаруженные рядом с "черными курильщиками" — подводными геотермальными источниками на глубинах 1-3 км, живущие в условиях сверхвысоких те�