Химическая адсорбция поли-п-нитрофенилакрилата как метод формирования привитых фаз композиционных сорбентов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

РГВ 0/1

БЕЛОВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ХИМИЧЕСКАЯ АДСОРБЦИЯ ПОЛИ-П-НИТРОФЕНИЛАКРИЛАТА КАК МЕТОД ФОРМИРОВАНИЯ ПРИВИТЫХ ФАЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканхе ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2000г.

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю. А.Овчинникова РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Виталий Павлович Зубов, кандидат химических наук Александр Евгеньевич Иванов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ярославов Александр Анатольевич доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я.Карпова

Защита диссертации состоится «25» мая 2000г. в V — на заседании диссертационного Совета Д 063.4] .05 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу. Москва, ул. М.Пироговская, д. 1. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке академии по адресу:

Москва, ул. М.Пироговская, д. 1. Отзывы на автореферат можно направлять по адресу:

117571, Москва, пр. Вернадского, 86, МИТХТ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » апреля 2000г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор химических наук, профессор

/Грицкова И. А./

„о

БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

дуальность работы определяется необходимостью создания научного подхода к выбору подов синтеза композиционных сорбентов, построенных по принципу неорганический ркас - полимерная оболочка. Одной из ключевых проблем в этой области является учение новой макромолекулярной реакции: химической адсорбции гибкоцепного лимера на твердых поверхностях, а также изучение особенностей синтезированных таким особом сорбентов по сравнению с традиционными сорбентами, т.е. сшитыми лимерными гелями. Изученная в работе реакция химической адсорбции поли-п-трофенилакрилата (ПНФА) является удобной моделью для изучения процессов мосорбции полимеров, т.к. дает уникальную возможность регистрировать количество упп полимера, вступивших в реакцию с поверхностью.

:ль работы состоит в изучении фундаментальных аспектов хемосорбции ПНФА, создании лимерномодифицированных кремнеземных сорбентов для биохроматографии и в шгательном анализе механизмов сорбции белков на традиционных и новых «позиционных сорбентах. ;тор защищает:

• Концентрационные зависимости и кинетические закономерности химической адсорбции поли-п-нитрофенилакрилата из раствора на поверхности модифицированных силикагелей.

• Данные по структуре хемосорбированного слоя поли-п-нитрофенилакрилата.

• Полимер-аналогичное амидирование хемосорбированного ПНФА как метод синтеза аниоясюбменныхаффинных боратных сорбентов.

• Количественные параметры и особенности хроматографии альбумина на сорбентах с хемосорбированной полимерной фазой.

• Влияние особенностей структуры анионообменных сорбентов на механизм сорбции бычьего сывороточного альбумина.

• Влияние условий синтеза аффинных сорбентов с групповой специфичностью к цис-диояам на их емкость и эффективность фракционирования белков.

• Метод определения специфической сорбции цис-диолов на аффинных сорбентах с борильной функциональностью.

уяная новизна:

• Установлен механизм адсорбции ПНФА на поверхности аминопропилсилшшроваяных силикагелей: ацилирование иммобилизованных аминогрупп сложноэфирными группами полимера.

• Выявлены основные кинетические закономерности и концентрационные зависимости химической адсорбции ПНФА.

• Изучена структура хемосорбированного ПНФА и показано влияние ряда факто] (молекулярной массы полимера, концентрации раствора, структуры адсорбируюи поверхности) на структуру адсорбированного слоя.

• На примере сорбции бычьего сывороточного альбумина (БСА) показаны различи механизмах связывания белков с сорбентом, содержащим хемосорбировани полимерную фазу, и рядом традиционных сорбентов; на примере анионообмеш хроматографии выявлены основные особенности влияния структуры сорбента механизм связывания белка.

• Предложен метод определения специфической сорбции цис-диолов на аффиш сорбентах с борильной функциональностью для контроля емкости синтезированн сорбента.

Практическая значимость

Химическая адсорбция гибкоцепных полимеров является перспективным методом синтеза широкого спектра сорбентов для биохроматографии, а также и дру биосовмесгимых материалов, таких, как микроносители для иммуноанализа, сорбенты перфузии крови и т.д.. Характерно, что синтезированные таким образом композициот анионобменные сорбенты с ДЕАЕ-функциональностью по параметрам хроматографичес разделений белков оказываются сопоставимы с лучшими коммерческими аналогам! частности, позволяют фракционировать белки с высокими емкостями пиков. При э' механическая прочность новых сорбентов намного выше прочности сшитых полимер! частиц. Синтезированные аффинные сорбенты с борильной функциональное использованы для анализа гликозилированных белков в гемолизатах эритроцитов кр человека, а также дам очистки сериновых протеаз. Композиционные сорбек синтезированные на основе химической адсорбции ПНФА применяются в лаборатор ИБХ РАН, аффинные сорбенты с борильной функциональностью прошли апробацш поликлинике СО РАН. Апробация работы и публикации:

Результаты работы докладывались на 17-м Международном симпозиуме колоночной жидкостной хроматографии (Гамбург, Германия, май 1993г.), на Всеросийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, октя 1993г.), на международной конференции к 90-летию академика В.А.Карг «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Москва, январь 1997г.), на ! Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, май 1998г.). По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 5 - статьи в рецензируем журналах.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, ¡сспериментальной части, выводов и списка литературы наименований). Работа

зложена на '/ф) страницах, содержит рисунков, таблиц.

Ю ВВЕДКНИИ дано обоснование актуальности диссертационной работы и формулирована ее цель.

часть является обзором литературы, в котором рассмотрены методы синтеза омпозидионных сорбентов, механизмы равновесной и неравновесной адсорбции олимеров, механизмы адсорбции белков на ионообменниках. [ часть. Объекты и методы исследования.

>писаны используемые вещества и материалы, способы их синтеза и очистки. 1етоды исследования:

• Молекулярно-массовые характеристики фракций полимера определяли методом гель-проникающей хроматографии.

• Химическую структуру поверхности силикагелей с адсорбированным полимером определяли методами элементного анализа, инфракрасной спектроскопии, электронной спектроскопии для химического анализа.

• Количество выделившегося п-нитрофенола определяли спектрометрическим методом.

• Диаметр пор сорбента определяли методом ртутной порометрии.

• Хроматографические характеристики сорбентов определяли методами градиентной, изократической и фронтальной хроматографии.

• Состав хроматографических фракций бычьего сывороточного альбумина определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле.

I часть. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Химическая адсорбция поли-п-нитрофенилакрилата на аминопропилсилилированных кремнеземах.

Адсорбция полимеров на твердых поверхностях может происходить двумя [ринципиально различными путями: в результате обратимого взаимодействия достаточно ¡ольшого числа сегментов макромолекулы и в результате необратимого связывания хотя бы |дного сегмента с активным центром поверхности, например, с образованием ковалентной вязи. Химическая адсорбция полимеров (второй путь) изучена слабо, хотя имеет важное фактическое значение и находит широкое применение для создания различных ¡иосорместимых материалов и для синтеза хроматографических сорбентов. В данной работе

Рис. 1. ИК-спсктры амнпопропилсилнлировапвого аэросала до (а) в после реакции хемосорбции ПНФА (б).

изучена реакция между поли-п-нитрофенилакрилатом (ПНФА), полимером, содержащим активированные карбоксильные группы, и аминопропилсилилированными пористыми силикагелями и стеклами. Эта реакция лежит в основе синтеза реакционно-способных композиционных носителей, дальнейшая модификация которых позволяет синтезировать сорбенты с необходимой ионной, гидрофобной (А Е.Иванов, В.П.Зубов, 1992) или аффинной функциональностью.

Методом ИК спектроскопии (рис. 1) показано, что химическая фиксация макромолекул ПНФА на поверхности аминопропил-силикагелей протекает путем образования амидных связей (полоса поглощения при 1630 см"1) и сопровождается накоплением на поверхности

о

кремнеземах.

юсителя сложноэфирных групп (1740 см'1). Последнее означает, что часть сегментов макромолекулы не взаимодействует с поверхностью, а образует петли и хвосты (рис. 2).

Эти данные полностью согласуются с данными рентгеновской электронной ;пектроскопии для химического анализа (ЭСХА). Метод дает информацию об элементном ;оставе поверхности и типе функциональных групп полимера и носителя, расположенных в юверхностном слое толщиной 50А. Спектры ЭСХА, полученные для ПНФА, химчески ^сорбированного на стеклянных пластинках, содержат линии поглощения при 102,6 эВ &Ир), 285,0 эВ (С 1л),400,0 эВ (N11), 532,2 эВ (ОЬ) (таб. 1). В таблице приведены энергии :вязывания, соответствующие указанным химическим элементам и их атомная концентрация ! поверхностных слоях анализируемых образцов.

Из данных, приведенных в таб. 1. следует, что атомная концентрация углерода возрастает 1ри переходе от аминопропилсилилированных пластинок (1МН2-стекло) к пластинкам, )бработанным раствором ПНФА (ПНФА-стекло). Кроме того, профиль линии СЬ- содержит наряду с основным поглощением при 285 эВ) слабое поглощение при 289 эВ, которое может )ыть отнесено к углероду карбонильных групп сложных эфиров. И то и другое :видетельствует о необратимом закреплении ПНФА на поверхности МНг-стекла. Вместе с

Таблица 1.

Энергии связывания и атомные концентрации элементов в поверхностных слоях модифицированных

стекол по данным ЭСХА

С 1Б О и Б! 2р N18

Образец Есв,эВ С,% Есв,эВ С,% Есв.эВ С, % Есв,эВ С,%

Стекло 285,0 29,9 532,7 50,1 103,3 19,1 400,0 0,9

1ЧН2-стекло 285,5 46,6 532,0 34,5 102,5 10,9 400,0 7,9

о ч и 0,1 % Р-Р ПНФА 285,0 56,2 532,2 29,2 102,6 8,4 400,0 6,2

н « 1 В В 2% Р-Р ПНФА 285,0 57,6 532,2 28,2 102,6 8,1 400,0 6,1

Радиус пор, А

Рис. 3. Интегральные кривые вдавливания ртути в поры МПС-РШ2-(1) и МПС-ПА-(2).

тем наряду с адсорбированным полимером в спектры ПНФА-стекол вносит вклад » аминопропилсилильный подслой. Сохранение, хотя и ослабленное, сигналов кремния I спектрах ЭСХА при нанесении хемосорбционного слоя указывает на то, что толщина это« слоя не превышает 50А.

Указанный порядок толщины хемосорбционного слоя полимера подтверждаю: результаты ртутно-порометрических исследований пористых стекол, последовательш модифицированных у-аминопропилтриэтоксисиланом (МПС->ГН2) и ПНФА (МПС-ПА) Интегральные кривые вдавливания ртути в поры носителей, показанные на рис. 3, дану возможность выявить разницу -80-100 А между диаметрами пор МПС-ЖЬ и МПС-ПА, чт( соответствует толщине хемосорбционного слоя в 40-50 А (4-5 нм).

Сопоставим вышеприведенные данные с плотностью заполнения клубками ПНФ/ (М«=46200, см. таб. 2) поверхности непористого микросферического силикагеля (диаметр частиц 1,4 мкм). Изотерма химической адсорбции ПНФА на аминопропилсилилык» производном силикагеля (МБ-МИг) приведена на рис. 4. При концентрацш контактирующего с носителем раствора ПНФА, составляющей более 2%, достигаете: насыщение адсорбционного слоя, удельное содержание п-нигрофенильных сложноэфирньп групп в котором составляет 3 мкмоль/м2. Расчет дает удельную величину адсорбцш полимера, равную б мономерным звеньям на 1 нм2. Принимая среднюю степей полимеризации ПНФА за 200, можно рассчитать, что одна макромолекула занимает площад: около 30 нм2. При среднем гидродинамическом радиусе макромолекулы ПНФА 8 нм (см ниже) и монослойном распределении адсорбированных клубков можно ожидать величин;

Сдо МХМОЛЬ/г

90

1 2 3 с,%

р икмоль/мкмоль ШГП>У*>П

Рис. 4. Изотермы химической адсорбции ПНФА па МПС-1УНг (1) и М8-ГШг (2) в разлитых координатах. По оси абсцисс:

а — мкмоль сложноэфирных групп/г носителя, б - мкмоль сложноэфириых грунп/м2 поверхности носителя,

в - мкмоль сложноэфириых групп/мкмоль N Н; групп носителя.

1 2 3 с,%

площади, занятой одним клубком, яг1/4, равную 50 нм2. Реальное расположение химически фиксированных клубков, следовательно, почти вдвое плотнее расчетного. По-видимому, в процессе химической адсорбции ПНФА происходит частичное наложение и взаимное проникновение полимерных клубков. Наличие четко выраженного начального участка на изотермах (отмечаемое обычно при обратимой адсорбции полимеров, слабо взаимодействующих с поверхностью) так же позволяет сделать предположение о частичной проницаемости образующегося на поверхности адсорбированного слоя полимера. Эти данные хорошо согласуются и с данными по кинетике процесса (см. ниже).

Сравнение изотерм для макропористого (МПС-МНг) и непористого (М8-МН2) сшшкагелей (рис. 4) показывает, что величина химической адсорбции пропорциональна удельной площади поверхности носителя и удельному содержанию аминогрупп на его поверхности. Тот факт, что изотермы адсорбции ПНФА наиболее близки в координатах рис. 4в, позволяет сделать вывод об отсутствии принципиальных различий между механизмами адсорбции на макропористом стекле и непорисгом силикагеле. Вместе с тем для высоких концентраций

Таблица 2.

Молекулярно-массовыс и адсорбционные характеристики фракций полимера (значения Сис и Ср даны для времени реакции 24 час)

Фракция N° М„ м*/м„ [Г|], дл/г Саде, мкмоль/г Ср, мхмоль/г Сцде/Ср

1 63000 2,34 0,64 77 25 3

2 46200 3,40 0,5 63 31 2

3 3000 1,32 0,07 38 7 5

(свыше 10 мг/мл) раствора полимера некоторое влияние пористой структуры МПС-ЫНа проявляется в отсутствии выраженного плато на изотерме. В случае более низких концентраций изотермы располагаются ближе друг к другу (рис. 46), что может свидетельствовать о незначительном влиянии диффузии полимера в поры стекла на свойства хемосорбированных слоев.

Изучение кинетических данных выделения п-нитрофенола (НФ) в раствор и накопления сложноэфирных групп (СЭГ) на поверхности носителя в процессе хемосорбции позволяет выяснить особенности механизма этой реакции и оценить конформационное состояние хемосорбированных макромолекул. Контрольные эксперименты по аминолизу ПНФА в гомогенном растворе под действием бутиламина свидетельствуют о том, что реакция протекает очень быстро и позволяют оценить наблюдаемую константу скорости реакции второго порядка как величину не менее 103 М"'с"1. Поэтому можно предположить, что химическое связывание сегментов ПНФА происходит быстро, наблюдаемую же относительно низкую общую скорость процесса хемосорбции (см. рис. 5) можно объяснить тем, что реакция является диффузионно-контролируемой, причем диффузия может происходить как в порах носителя так и сквозь слой адсорбированного полимера. Для определения, какая из двух фаз диффузии полимера является лимитирующей, было рассчитано среднее время сорбции полимера при диффузии в сферическую частицу.

При адсорбции полимеров на поверхности частиц стекла с открытыми порами важным является отношение гидродинамического радиуса полимерного клубка к среднему эффективному радиусу пор носителя Яь/Яр, которое позволяет оценить возможный вклад диффузии полимера в поры носителя в общую кинетику химической адсорбции. Для макромолекулы с А</=63000 и [г(]=0,64 дл/г (таб. 2, фракция 1) коэффициент поступательной

Саде» МКМОЛЬ/Г

ср, мкмоль/г

2 3 Время, ч

1 2 Время, сут

Рве. 5. Кипетика накопления сложноэфирпых групп (1-3) в адсорбционном С. ) (10 (Сцдс) и выделенияп-нитрофенола (Ср) (4-6) при химической адсорбции ПНФА:

(1.4) фракция 1 (Мч^бЗООО)

(2.5) фракция 2 (М»у=46200)

(3.6) фракция 3 (Мте=3000)

диффузии составит по уравнению Цветкова и Кленина

А,

47

- = 2,9-10 смЧс

%(Щп]У

гидродинамический радиус по формуле Стокса-Эйнштейна ;; -

кТ 6ят/£>0

•10"

см или 8 /ш •

Поправка на диффузию в порах для линейных цепей для /?ь/Др=0,08 составляет 1,35 (УШогщ & и др., 1990) и, следовательно Д,=2,15'10"7 см2/с. При диффузии в сферическую

частицу радиусом 0,01 см среднее время сорбции 1\ составит и =

Я2

15Д

- = 31 с, т. е. величину в

несколько раз меньшую, чем самое короткое время контакта раствора ПНФА с МПС-№Ь (2 мин), заданное в настоящей работе. Для макромолекул с меньшим/^(фракции 2, 3) среднее время сорбции будет еще меньше. Можно ожидать, таким образом, что лимитирующей стадией адсорбции ПНФА из разбавленных растворов на поверхности МПС-ЖЬ является формирование хемосорбционного слоя (т.е., учитывая высокую скорость химической реакции, диффузия полимера сквозь слой адсорбированных макромолекул), а не диффузия полимера в поры.

Вышеприведенные данные дают основание предположить следующий механизм процесса хемосорбции - в первый момент времени реакции макромолекулы присоединяются к поверхности носителя лишь в нескольких своих звеньях, а затем происходит вступление в

реакцию сложноэфирных групп, расположенных в петлях и хвостах, обусловленное конформационной подвижностью этих сегментов. При этом, конформационная перестройка адсорбированных молекул происходит, в основном, под воздействием транспорта новых макромолекул из раствора (контрольные эксперименты показали, что выделение п-нитрофенола в раствор происходит только если образцы носителя с хемосорбированным ПНФА находятся в окружении раствора полимера; если же их поместить в среду чистого растворителя, то выделения п-нитрофенола не наблюдается). Отсутствие самопроизвольного перераспределения сегментов можно объяснить отсутствием сильного дальнодействующего взаимодействия между сегментами молекулы и поверхностью носителя, а также относительной жесткостью самой макромолекулы.

Сравнение кинетических данных для фракций полимера с различными молекулярно-массовыми распределениями (таб. 2, рис. 5) показывает, что с увеличением молекулярной массы полимера возрастает общее количество адсорбированного полимера, а также возрастает содержание сложноэфирных групп. Относительное содержание групп, образующих «петли» и «хвосты» (Садс/Ср), является наибольшим для фракций 1 и 3. Эти данные можно объяснить тем, что малая подвижность мономерных звеньев полимера фракции 3, обусловленная малым значением степени полимеризации, дает меньшую возможность для конформационных перестроек адсорбированного полимера по сравнению с полимером фракции 2. Рост же величины Садс/Ср для полимера фракции 1 можно объяснить общим увеличением количества функциональных звеньев макромолекулы. В целом можно заключить, что значительная мольная доля петель и хвостов присутствует в адсорбционных слоях всех изученных фракций полимера.

2. Композиционные сорбенты с привитым поли-п-нитрофенилакрилатом.

Описанная в предыдущем разделе структура хемосорбированного слоя ПНФА позволяет использовать его в качестве "диффузной" (т.е. не имеющей четкой границы с раствором) привитой фазы кремнеземных сорбентов. Экранирование поверхности твердого носителя за счет исключенного объема петель и хвостов ПНФА позволяет получать сорбенты с очень низкой неспецифической сорбционной емкостью по белкам (АЕ.Иванов, 1986). В то же время наличие значительного количества экспонированных функциональных групп дает возможность для их использования в качестве спейсеров при иммобилизации лигандов для синтеза сорбентов с различной функциональностью (ионообменные, аффинные и т.д. сорбенты) путем полимеранологичных реакций.

2.1. Особенности взаимодействия полимерных и композиционных сорбентов с сывороточным альбумином

Основной целыо данной части работы является изучение влияния структуры адсорбирующей поверхности на механизм ионообменной хроматографии белков. С этой целыо в настоящей работе было исследовано взаимодействие модельного белка - бычьего сывороточного альбумина (БСА) с полимерными и композиционными сорбентами, имеющими различную структуру, но при этом сходную химическую функциональность (все сорбенты со слабыми анионообменными группами):

1. DEAE-Toyopearl 650М - коммерческий сорбент фирмы "TOSOH", размер гранул 40-80 мкм, с диаметром пор в несколько тысяч ангстрем, обладает повышенной жесткостью.

2. DEAE-Sepharose CL-6B - коммерческий сорбент фирмы "Pharmacia" на основе химически сшитой агарозы. Представляет собой крупнопористые сферические гранулы агарозного геля диаметром 45-165 мкм.

3. PEI-силикагель - макропористый силикагель с полиэтилениминовым слоем, химически сшитым триглицидиловым эфиром глицерина.

4 DEAE-HA-силикагель - макропористый силикагель с хемосорбированным полиакриламидным слоем с DEAE-функциональностью, полученный путем полимераналогичного амидирования ПНФА диэтиламиноэтиламином. В настоящей работе был проведен анализ полученных данных в рамках стехиомегрической модели для анионообменного взаимодействия белков и ионообменников, разработанной в работе (W.Kopaciewicz и др., 1983). Согласно указанной модели процесс ионного обмена полиэлектролитов и слабых ионообменников может быть представлен в виде равновесного процесса: /'«С, + 7,Юь ЭРь + Z<aD0 + Z<bC,,

где Db - концентрация замещаемых с поверхности ионов, Р' С, - концентрация белка в поверхностном слое раствора с соответствующей концентрацией противоионов С„ Pi, -концентрация адсорбированного на ионообменной колонке белка, Do - концентрация замещаемых ионов в подвижной фазе, коэффициенты а и Ъ введены для учета валентности, коэффициента активности и относительных различий энергии замещения между ионами, 2 - усредненное количество зарядов, посредством которых молекула белка взаимодействует с сорбентом.

Тогда константа связывания определяется следующим уравнением:

К _<PJW'flC./ f ь (P-CJ(DJZ 1 -/

где Рт максимальная емкость сорбента; доля поверхности, занятой белком определяется как/~(Рь)/(Ргп)- £>ы~ начальная концентрация лиганда (замещаемых ионов).

Фактор удерживания к'=КА/Ут (К,- коэффициент хроматографического распределения, А, - удельная площадь поверхности сорбента, Ут - объем мобильной фазы) определяете* выражением

К.

Фо ■ С,/

(1)

(3)

где (2)

Если в качестве замещающего агента используется хлорид натрия, то уравнение (Г можно записать в виде:

А.

[А'аС/]2

Данное выражение можно линеаризовать, представив его в логарифмической форме:

Ё [ШС1] ° '

Графическое решение данного уравнения позволяет определить значения К2 I усредненного количества зарядов X.

Величина Кг пропорциональна константе связывания, площади поверхности сорбента I концентрации заряженных групп в степени 2 (уравнение 2). В связи с тем, что в уравнение : входит ряд неизвестных величин, определить значение константы связывания исходя и: значения Кг затруднительно. Физический смысл Кг связан с энергией взаимодействю белка и ионообменника в условиях бесконечно большой ионной силы раствора.

Для каждого из изученных сорбентов были определены ион-парные емкости пс пикриновой кислоте (таб. 3). Как видно из приведенных данных, ион-парные емкости дл; изучаемых сорбентов (т.е. удельное количество зарядов на поверхности) сильно различаются - от 1,6 ммоль/г для БЕАБ-БерИагове до 0,064 ммоль/г для БЕАЕ-ПА-силикагеля. Наиболее

Таблица 3.

Параметры ионообменного взаимодействия бычьего сывороточного альбумина с различными

сорбентами.

Наименование сорбента Емкость по ВСА, мг/мл Ион-парная емкость по пикриновой кислоте, ммоль/г 7.

ПЭИ-сил икагель 3,3 1,2 1,8 -1,2

БЕДЕ -ПА-силикагель 3,4 0,064 1,2 -1,6

ОЕАЕ - БерЬагозе СЬ 6В 11,6 1,6 1,8 -2,1

ОЕАЕ -Тоуореаг! 650М 24,7 0,69 1,1 -1.5

1ПШ

19 &

и

га

7.

в О

I II ш

80 Объем элюции, мл Рас. 6. Хроматография бычьего сывороточного альбумина на различных сорбентах (элюция в градиенте концентрации хлорида натрия): 1 - ВЕАЕ-Тоуореаг! 650М; 2 - ЮЕАЕ-ЗерЬагозс СЬ-6В; 3 - РЕЬсиликагель; 4 - НЕАЕ-ПА-силикагель. Колонка 1x3 см, элюеит - 0,02 М трис-НС1, рН 7,8. Градиент 0 - 0,8 М КаС1. Скорость элюции 1 мл/мин. I, П, Ш - фракции, состав которых был определен методом электрофореза в ПААГ.

близкие показатели имеют ОЕЛЕ-ЗерЬаттое и РЕ1-силикагель. Сравнение эффективных емкостей сорбентов по БСА (таб. 3), полученных путем анализа фронтальных хроматограмм белка (из растворов с низкой ионной силой), позволяет выделить сорбенты с относительно низкой емкостью - РЕ1-силикагель и ВЕАЕ-ПА-сшшкагель (3,3 и 3,4 мг/мл соответственно). Следует отметить отсутствие прямой корреляции между количеством поверхностных зарядов сорбента и его белковой емкостью (сорбент с высокой ион-парной емкостью РЕ1-силикагель имеет низкую эффективную емкость по белку, а сорбент с самой высокой белковой емкостью - ОЕАЕ-Тоуореаг1 - имеет относительно низкую ион-парную емкость).

С целью изучения влияния структуры сорбента на его разделяющую способность и выяснения условий элюции белка были получены хроматограммы БСА в условиях элюции в градиенте концентрации хлорида натрия (рис. 6). Из приведенных хроматограмм видно, что используемый БСА не является чистым гомогенным веществом и разделяется на несколько фракций. Наличие нескольких фракций можно объяснить тем, что БН-группы нативного альбумина могут быть модифицированы цистином или глютатиоком. Данные электрофореза в полракриламидном геле, полученные для хроматографических фракций элюатов (рис. 7), показывают, что сорбенты ОЕАЕ-ПА-силикагель и ОЕАЕ-Тоуореаг1 дают аналогичное распределение компонентов стандартного образца БСА. Тот факт, что для фракций П и ПТ, а также для исходного БСА, полосы по М„ расположены одинаково, можно объяснить тем, что

С И 1. 2-4 ,$£ 16 26 36

Рис. 7. Электрофорез (в градиенте концентрации акрил амида от 4% до 30%, в нрисутсвии в востанашшвадощих условиях) фракций, полученных после хроматографии БСА на сорбенте ВЕАЕ-Тоуорсаг1650М (1а, 2а, За) и сорбенте БЕЛЕ-ПА-силикагель (16,26,36). Проявление с использованием Кумасси брилпантового голубого. С - смесь стандартных белков с молекуляппыми массами 94.67.43.20 и 14.4 кДа. И - исхолнын БСА.

химическая модификация БН-групп не приводит к настолько значительному изменению которое можно было бы зарегистрировать при электрофорезе фракций.

Далее для каждого из сорбентов были получены хроматограммы БСА в условиях изократической элюции белка для ряда концентраций №С1 (в пределах 0,2-0,5 М). Из этих данных были вычислены значения первого абсолютного момента (среднего времени удерживания) для каждого пика:

о

и, соответственно, значения для фактора удерживания: к'=———-, где и - среднее время

'о

выхода маркера свободного объема колонки.

Значения фактора удерживания, полученные для различных концентраций хлорида натрия позволяют получить графическое решение уравнения 3 (рис. 8). Полученные значения X и К/. приведены в таблице 3.

Как видно из данных таб. 3 и рис. 8, сорбционные свойства РЕ1-силикагеля значительно отличаются от свойств других сорбентов. Наиболее близкие показатели 2 имеют ОЕАЕ-Тоуореаг1 и БЕЛЕ-ПА- силикагель, в то же время ОЕАЕ-ПА-силикагель, обладая относительно небольшой емкостью по белку, показывает наиболее эффективное использование зарядов, т.е. отношение емкости по белку к ион-парной емкости по пикриновой кислоте для него максимально.

Для интерпретации полученных данных следует сопоставить особенности структуры изучаемых сорбентов. Использованные в работе сорбенты можно разбить на три группы:

• Модифицированные полимерные носители с локализованными на их поверхности слабоподвижными ионогенными группами (ОЕАЕ-ЗерЬапке и ОЕАЕ-Тоуореаг1). Сорбент БЕАЕ-Тоуореаг! построен на основе крупнопористого, почти не набухающего в водных растворах полимерного носителя, химическая структура которого не опубликована. ВЕАЕ-ЗерЬагозе представляет собой гранулированный гель на основе модифицированной полимерной (агарозной) матрицы, полимерные ниги которого химически сшиты 2,3-дибромпропанолом и склонны к образованию водородных связей (Л.А.Остерман, 1985).

• Жесткокаркасные носители с привитым слоем гибкоцепного полимера, несущим относительно подвижные ионогенные группы (ОЕАЕ-ПА-сшшкагель). Значительная доля полимерных сегментов, несущих активные группы, может быть экспонирована в раствор, образуя «петли» и «хвосты» (см. раздел 1). На такое строение сорбента указывают как полученные нами ранее экспериментальные данные, так и анализ теоретических моделей сорбции полимеров. Так, в работах \У. Вагйзгс! и Я.С.ВаП (1986,1987) на основе разработанной авторами модели сорбции полимеров был сделан вывод о том, что в условиях неравновесной сорбции нейтральные адсорбированные цепи должны иметь менее высокую плотность прививки и более протяженные «хвосты» и «петли», экспонированные в раствор, чем заряженные полимеры, адсорбированные в равновесных условиях. На основании этих данных можно предположить, что в изучаемой группе сорбентов ОЕАЕ-ПА-силикагель имеет

Рис. 8. Зависимость константы удерживания бычьего сывороточного альбумина от концентрации хлорида натрия. Данные получены на основе изократических хроматограмм. Колонка 1x3 см, злюент - 0,02 М трис-НС1, рН 7,8, буфер содержащий 0,2-0,5 М КаС1, скорость элюции 1 мл/мии. 1 - РЕАЕ-Тоуореаг1,2 - ПЕАЕ-8с|)Наго«е, 3 - РЕ1-силикагель, 4 - ИЕАЕ-ПА-силикагель.

наиболее подвижные экспонированные в раствор функциональные группы.

• Жесткокаркасные носители с поперечно-сшитым адсорбционным слоем заряженного полимера, несущего неподвижные или малоподвижные ионогенные группы (РЕ1-силикагель).

Учитывая приведенные данные о строении сорбентов, а также отмеченный выше факт о слабой зависимости сорбционной емкости от количества зарядов на поверхности сорбента, можно предположить, что сорбционная емкость в существенной степени определяется строением твердого носителя и степенью доступности функциональных групп.

Относительно невысокое значение Z=l,2 для ОЕАЕ-ПА-силикагеля можно объяснить как невысокой плотностью прививки полимерной фазы, так и взаимным отталкиванием ее цепей при их деформации в результате сорбции белка. В свете этого объяснения понятно, что поперечно-сшитые макромолекулы полиэтиленимина, образующие привитую фазу высокой плотности, неспособны к упругой деформации, следствием чего является высокое значение 2-1,8. То же относится и к сшитым гелям агарозы (2=1,8).

Сопоставление величины 2 с общим зарядом молекулы белка (равным не менее -18 при рН=7,8 для молекулы БСА, р1=4,8 (Т.Р&сге, 1985)) показывает, что во взаимодействии с поверхностью сорбента участвует лишь небольшая часть зарядов белковой глобулы. Отметим, что несмотря на асимметричное распределение зарядов в первичной структуре, распределение зарядов по поверхности молекулы БСА в третичной структуре является довольно равномерным (С.-Ь.Рпе<Ш, 1997).

Высокое значение эффективности использования зарядов (отношение величины сорбционной емкости по белку к ион-парной емкости), выявленное для ОЕАЕ-ПА-силикагеля, можно объяснить диффузным строением привитой фазы гибкоцепного полимера, играющего роль спейсера для ионогенных групп и придающего им относительную подвижность. Следует отметить, что такое строение сорбента может способствовать сохранению нативной структуры белка. Невысокое значение 2= 1,1, найденное для БЕАЕ-Тоуореаг1, а также относительно высокая эффективность использования его зарядов, позволяют предположить, что поверхностные слои этого сорбента образованы гибкими сегментами полиэлектролита, подобными структуре привитой фазы ВЕАЕ-ПА-силикагеля.

Более высокие емкости пиков альбумина и эффективное разделение фракций (рис. 6), наблюдаемые для сорбентов БЕАЕ-ПА-силикагель и ОЕАЕ-Тоуореаг1 по сравнению с РЕ1-силикргелем и ОЕАЕ-ЗерИагове, можно объяснить невысоким значением 2, а, следовательно, относительно узким распределением центров сорбции по силе взаимодействия с белком. Можно предположить, что полимерные фазы, полученные в результате «самосборки» макромолекул поли-п-нитрофенилакрилата на поверхности неорганического носителя,

бладают более высокой однородностью распределения заряженных групп по сравнению с имически-сшитыми полиэлектролитами.

!.2. Аффинные сорбенты с групповой специфичностью к цис-диолам.

Аффинные сорбенты были синтезированы путем иммобилизации п-минометилфенилборной кислотой (п-АМФБК) на полимерно-модифицированной матрице. Е>енилборная кислота обладает способностью к специфическому связыванию цис-диолов, то позволяет использовать такие сорбенты для выделения гликопротеинов, в частности -;ля выделения гликозилированного гемоглобина человека, а также т-РНК:

я н

-^ПЧ

Следует отметить, что используемые до настоящего времени сорбенты представляют обой, преимущественно, производные носителей полисахаридной природы (целлюлозы и шитые агарозы). Между тем, борильные производные полиакриламидных носителей бладают большей емкостью (по связыванию т-РНК) в сравнении с аналогичными роизводными целлюлозы, что объяснялось конкурированием полисахарвдных цепей ¡осителя за связывание с аффинным лигандом (АК.МаШап и др., 1981). Полученные в ¡астоящей работе композиционные сорбенты могут явиться перспективным материалом для факционирования гликопротеинов, т.к. сочетают в себе инертность полиакриламидного окрьггия с механической прочностью пористого стекла. Кроме того, протяженные сегменты икромолекул привитой фазы могут выполнять функцию спейсера, что улучшает связывание иганда с комплементарным биологическим сорбатом.

Целью данной части работы является изучение возможностей применения омпозиционных сорбентов с иммобилизованной п-АМФБК для анализа и выделения иологически активных белков, а также разработка методов тестирования этих сорбентов.

Таблица 4.

Влияние условий синтеза на емкость сорбента

Сорбент т, моль/моль (2, мкмоль/мл сорбента

1 1/3 0.13

2 1/2 0.15

3 1/1 0.19

Обозначения: т - исходное отношение количества п-АМФБК к количеству сложноэфирных групп сорбента, о - емкость сорбента по адснозину.

Методом фронтальной хроматографии аденозина и дезоксиаденозина была оценен специфическая емкость сорбента по аденозину. Этот нуклеозид содержит цис-диольну! группу в цикле рибозы, а сильное поглощение в УФ области делает сто удобным маргсерод Дезоксиаденозин имеет аналогичное с аденозином строение, но не содержит цис-диольно группы, что позволяет оценить специфическую емкость сорбента с помощью обработк фронтальных хроматограмм (емкость соответствует площади заштрихованной области н рис. 9).

Для выяснения зависимости емкости сорбента от количества п-АМФБК, введенной реакцию с активированным носителем, был проведен синтез сорбентов с п-АМФБК, взятой молярном недостатке к количеству сложнозфирных групп носителя. Молярное отношени количества п-АМФБК к количеству сложнозфирных групп носителя и емкости полученны сорбентов по аденозину приведены в таблице 4. Как видно из данных таблицы, увеличен« поверхностной концентрации фенилборной кислоты ведет к некоторому увеличен» специфической емкости сорбента. Вместе с тем, емкость сорбента по дезоксиаденозину (т. неспецифическая емкость) практически не изменялась и была близка нулю, поскольку выхс фронта дезоксиаденозина практически совпадал с полным объемом колонки. Предложении метод сравнения фронтальных хроматограмм аденозина и дезоксиаденозина являете удобным для тестирования борат-содержащих сорбентов.

Следует отметить, что приведенные эффективные емкости сорбента были получен при низкои равновесной концентрации аденозина (10-4 М, что связано с необходимость при спектрофотометрической детекции удерживать концентрацию вещества в ингервш калибровки прибора) и, по всей видимости, гораздо ниже максимальной емкости сорбента.

Сорбенты указанного типа представляют интерес с практической точки зрени особенно для анализа гликопротеинов, в частности для анализа гемоглобино Относительное содержание гликозилированного гемоглобина в крови человека ((1) являет« важным параметром при диагностике сахарного диабета. Поэтому синтезированный нал

^ис. 9. Фронтальные хроматограммы (лтах=250 ям) аденозина (I) и дезоксиаденозина СП), объем колонки 10 мл. Номера кривых соответствуют образцам сорбента в табл. 1.

Таблица 5.

Очистка урокиназы из культуральной среды, с использованием кремнеземных сорбентов.

Стадия

Активность, МЕ/мл

Коицентрадия белка, мг/мл

Удельная активность, МЕ/мг

Исходная хуяътуральпая среда

60

3,7

16

МПС-то ВГХ элюцш 0.5МА_

1400

0,7

2000

Композиционный сорбент_

11000

0,582

18883

сорбент был использован для анализа гемолизатов эритроцитов крови человека.

Разделение гликозилированного и негликозилированного гемоглобина из гемолизата эритроцитов крови больного сахарным диабетом человека на сорбенте 1 показано на рис. 10, причем величина с! составляет 7%, что соответствует литературным данным о содержании гликозилированного гемоглобина в крови больных сахарным диабетом. Данная методика аффинной хроматографии гемолизатов эритроцитов крови человека может быть взята за основу при разработке клинического экспресс-анализа.

Отметим, что общий выход белка после хроматографии на сорбенте 1 близок к 100% , в то время как для сорбентов 2 и 3 общий выход белка составляет 70% и 60% от нанесенного соответственно. Количественный выход белка после хроматографии на сорбенте 1 свидетельствует о высокой инертности полимерного покрытия сорбента и об отсутствии неспецифического и необратимого связывания гемоглобина. Сорбенты 2 иЗ, по-видимому, проявляют как специфическую, так и неспецифическую сорбционную активность за счет большого количества остатков иммобилизованной п-АМФБК.

Известно, что остатки борной кислоты образуют ковалентную связь с гидроксильной группой серина в активном центре протеолитических ферментов. При этом атом бора находится в четырехвалентном состоянии, которое стабилизируется присутствием глицерина (В.Х.Акпаров, В.М.Степанов, 1979).

В связи с высокой специфичностью борной кислоты и ее производных к сериновым протеазам были изучены условия выделения фермента урокиназы из культуры клеток почки

о 19 10 «в

Рис. 10. Хроматограмма (Хгоах=415 нм) гемолизата эритроцитов крови человека, больного сахарным диабетом (объем колонки 3 мл, скорость 0,72 мл/мин, сорбент Лг1).

человека RH-PA с использованием композиционного сорбента с иммобилизованной п-АМФБК.

Поскольку основным компонентом культуралыюй среды, содержащей урокиназу, является бычий сывороточный альбумин (БСА), стояла задача отделения его от фермента. С этой целью на полученном сорбенте была хроматографирована модельная смесь урокиназы с БСА. Последний не сорбировался и был элюирован с полным объемом колонки, что подтверждает сделанный выше вывод об инертности полимерного покрытия и об отсутствии неспецифической сорбции белков на сорбенте 1. Для десорбции урокиназы использовали 0,5 М аргинин, что привело к получению высокоочищенного фермента со 100% выходом (удельная активность - 83 ООО МЕ/мг).

Для повышения эффективности очистки фермента из культуральной среды с высоким содержанием белка (культивирование клеток проводилось в среде, содержащей сыворотку крупного рогатого скота) наряду с аффинной хроматографией на композиционном сорбенте использовалась первичная очистка и концентрирование фермента на немодифицированных макропористых стеклах МПС-1150 ВГХ (см. табл. 5).

Как следует из данных по содержанию белка и ферментативной активности, приведенных в таблице 5, фермент был очищен на первой стадии в 125 раз, а суммарно в сочетании с хроматографией на композиционном сорбенте степень очистки урокиназы составила 1250 раз при 100% выходе.

Можно заключить, что использование аффинного сорбента с иммобилизованной п-АМФБК перспективно при разработке схемы выделения УАП из сред с высоким содержанием сывороточных белков.

Таким образом, была разработана методика анализа борильных сорбентов и показана применимость этих сорбентов для препаративного выделения сериновых протеаз и для хроматографического анализа гликопротеинов.

Зыводы.

. Показано, что реакция химической адсорбции поли-п-нитрофенилакрилата на поверхности аминопропилсилилированных кремнеземах протекает путем образования амидных связей. При этом часть сегментов адсорбированной макромолекулы не взаимодействуют с поверхностью, а образуют "петли" и "хвосты", экспонированные в раствор, что позволяет проводить дальнейшую химическую модификацию носителей с получением сорбентов с различными функциональными группами.

1. Изучена кинетика хемосорбции поли-п-нитрофенилакрилата на поверхности модифицированных пористых стекол и силикагелей и построена качественная модель механизма хемосорбции гибкоцепного полимера.

I. Выявлено влияние молекулярной массы полимера, концентрации раствора полимера, пористости носителя на структуру образующегося адсорбированного слоя полимера.

1. Синтезированы сорбенты с анионообменной (ОЕАЕ) и аффинной (групповая специфичность к цис-диолам) функциональностью.

I. Впервые показаны различия в механизмах анионообменного связывания белков с композиционным сорбентом и рядом традиционных сорбентов на основе сшитых полимерных частиц. Установлено отсутствие прямой корреляции мезвду количеством поверхностных зарядов аниоиобменника и его белковой емкостью. Показано, что композиционный анионообменник обладает высоким значением отношения величины сорбционной белковой емкости к ион-парной емкости и невысоким значением усредненного количества зарядов, участвующих во взаимодействии с молекулой белка. Эти особенности композиционного сорбента определяют его высокие хроматографические качества (хорошее разделение белков и высокие емкости хроматографических пиков).

. Показано, что композиционный сорбент с борильной функциональностью может с успехом применяться для фракционирования гликопротеинов, использоваться в клинической практике для анализа гликозилированных белков в гемолизатах эритроцитов крови человека, а также для очистки сериновых протеаз. Показано, что сорбционные свойства борильных сорбентов сильно зависят от условий их синтеза. Разработан метод определения специфической емкости этих сорбентов, который может быть использован для контроля качества синтезированного сорбента.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах;

1. A.E.Ivanov, S.V.Belov, V.P. Zubov. Diffuse Polyacrylamide coating chemically fixed on inorganic supports: Stationary phases for chromatography of proteins. 17h International Symposium on Column Liquid Chromatography (Hamburg, Germany, May 1993), Abstrais, p. 1-268.

2. А.Е.Иванов, С.В.Белов, В.П.Зубов. Композиционный сорбент на основе модифицированного кремнезема для аффинной хроматографии. VI Всеросийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. (Москва, октябрь 1993г.). Программа с. 6 (устный доклад).

3. С.В.Белов, А.Е.Иванов, В.П.Зубов. Хемосорбция полнакрилатов и строение привитых фаз композиционных сорбентов для биохроматографии. Международная конференция «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (к 90-летию академика В.А.Каргина) (Москва, январь 1997г.). Тезисы докладов с. 3-12.

4. С.В.Белов, А.Е.Иванов, В.П.Зубов. Взаимодействие белков с полимерными и композиционными анионообменниками. XTV Меделевский съезд по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, май 1998г.). Химия живого. Рефераты докладов и сообщений № 4, с. 12-13.

5. А.Е.Иванов, М.Д.Скловский, С.В.Белов, В.П.Зубов. Формирование хемосорбционных слоев акриловых полимеров на поверхности мелкодисперсного кремнезем. Высокомолекулярные соединения, 1991, ЗЗБ, № 4, с. 289-292.

6. А.Е.Иванов, С.В.Белов, В.П.Зубов. Химическая адсорбция поли-п-нитрофенилакрилата на аминопропилсилильных производных силикагеля и пористого стекла. Высокомолекулярные соединения, 1993, 35, № 8, с. 1320-1325.

7. А.Е.Иванов, С.В.Белов, В.П.Зубов. Строение привитых полимерных фаз и особенности разделения белков на композиционных анионообменниках. Высокомолекулярные соединения, 1994, 36, № 2, с. 334-339.

8. С.В.Белов, М.А.Грин, А.Е.Иванов, В.П.Зубов. Композиционный сорбент с боратными группами на основе модифицированного кремнезема для аффинной хроматографии. Журнал физической химии, 1995,36, Кг 2, с. 334-339

9. С.В.Белов, А.Е.Иванов, В.П.Зубов. Взаимодействие сывороточного альбумина с полимерными и композиционными анионообменниками. Журнал физической химии, 2000, 74, N° 4, с. 734-739.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Композиционные сорбенты для хроматографии биополимеров и частиц

1.1. Сорбенты, модифицированные путем проведения прививочной полимеризации

1.2. Сорбенты, модифицированные адсорбированными полимерами

2. Адсорбция полимеров из растворов на поверхностях твердых тел

2.1. Адсорбция неионогенных полимеров

2.2. Адсорбция полиэлектролитов 32 РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Химическая адсорбция поли-п-нитрофенилакрилата на аминопропилсилилированных кремнеземах

2. Композиционные сорбенты с привитым поли-п-нитрофенилакрилатом

2.1. Особенности взаимодействия полимерных и композиционных сорбентов с сывороточным альбумином

2.2. Аффинные сорбенты с групповой специфичностью к цис-диолам

ВЫВОДЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Жидкостная хроматография является одним из ведущих и наиболее интенсивно развивающихся методов разделения высокомолекулярных соединений природного происхождения. В связи с развитием высокоэффективной жидкостной хроматографии и активным внедрением крупномасштабных хроматографических процессов в биотехнологию, особое значение приобретает разработка сорбентов, способных выдерживать высокие давления в колонках, обеспечивая в то же время высокие выходы разделяемых компонентов при сохранении их биологической активности. В наибольшей степени перечисленным требованиям отвечают композиционные сорбенты, синтезируемые на основе пористых кремнеземов с привитой полимерной фазой, позволяющие выделять биополимеры в неденатурирующих условиях. Создание на поверхности кремнезема тонкого сплошного полимерного покрытия дает возможность объединить в одном композиционном материале жесткость, механическую прочность, контролируемую пористость кремнеземов с адсорбционной инертностью, высокой емкостью и биосовместимостью, присущим мягким органическим гелям, традиционно используемым для хроматографии биополимеров.

Разработка композиционных сорбентов является, таким образом, комплексной проблемой возникшей на стыке химии полимеров и биоорганической химии. Одним из перспективных методов синтеза композиционных сорбентов является химическая адсорбция гибкоцепных полимеров на поверхности кремнеземов. Дальнейшая модификация полученных таким образом носителей путем полимераналогичных реакций позволяет синтезировать сорбенты с различной функциональностью. В качестве полимерного модификатора в данной работе был выбран поли-п-нитрофенилакрилат (ПНФА), полимер, обладающий значительной реакционной способностью в полимераналогичных превращениях и использованный ранее для синтеза биосовместимых сорбентов [1]. Особый интерес представляет изучение механизма химической адсорбции ПНФА, а также изучение особенностей синтезированных таким способом сорбентов по сравнению с традиционными сорбентами, т.е. сшитыми полимерными гелями.

Настоящая работа является частью структурно-функциональных исследований новых сорбентов, проводимых в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Цель работы состоит в изучении фундаментальных аспектов хемосорбции полимеров, синтеза полимерномодифицированных кремнеземных сорбентов для биохроматографии, а также включает сравнительный анализ и изучение механизмов сорбции на традиционных и новых композиционных сорбентах.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Выводы.

1. Показано, что реакция химической адсорбции поли-п-нитрофенилакрилата на поверхности аминопропилсилилированных кремнеземах протекает путем образования амидных связей. При этом часть сегментов адсорбированной макромолекулы не взаимодействуют с поверхностью, а образуют "петли" и "хвосты", экспонированные в раствор, что позволяет проводить дальнейшую химическую модификацию носителей с получением сорбентов с различными функциональными группами.

2. Изучена кинетика хемосорбции поли-п-нитрофенилакрилата на поверхности модифицированных пористых стекол и силикагелей и построена качественная модель механизма хемосорбции гибкоцепного полимера.

3. Выявлено влияние молекулярной массы полимера, концентрации раствора полимера, пористости носителя на структуру образующегося адсорбированного слоя полимера.

4. Синтезированы сорбенты с анионообменной (БЕАЕ) и аффинной (групповая специфичность к цис-диолам) функциональностью.

5. Впервые показаны различия в механизмах анионообменного связывания белков с композиционным сорбентом и рядом традиционных сорбентов на основе сшитых полимерных частиц. Установлено отсутствие прямой корреляции между количеством поверхностных зарядов анионобменника и его белковой емкостью.

6. Показано, что композиционный анионообменник обладает высоким значением отношения величины сорбционной белковой емкости к ион-парной емкости и невысоким значением усредненного количества зарядов, участвующих во взаимодействии с молекулой белка. Эти особенности композиционного сорбента определяют его высокие хроматографические качества (хорошее разделение белков и высокие емкости хроматографических пиков).

7. Показано, что композиционный сорбент с борильной функциональностью может с успехом применяться для фракционирования гликопротеинов, использоваться в клинической практике для анализа гликозилированных белков в гемолизатах эритроцитов крови человека, а также для очистки сериновых протеаз. Показано, что сорбционные свойства борильных сорбентов сильно зависят от условий их синтеза. Разработан метод определения специфической емкости этих сорбентов, который может быть использован для контроля качества синтезированного сорбента.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Исходные вещества, реагенты и материалы. у-Аминопрпилтриэтоксисилан марки АГМ-9 (СССР) перегоняли в вакууме (110°С, 1мм рт.ст.), диметилацетамид перегоняли в вакууме (60°С, 10 мм. рт. ст.) и бензол перегоняли (80°С).

Диметилсульфоксид марки х.ч., ацетон (VEB Chemische Werke Buna, Германия), диметилформамид марки х.ч., поли-К-винилкапролактам, о-фталевый альдегид (Serva, ФРГ), п-аминометилфенилборную кислоту, 2-диэтиламиноэтиламин (Fluka, Швейцария) дополнительной очистке не подвергали. В работе использовали концентрированный водный раствор аммиака марки ч.д.а., п-нитрофенол (Bio-Rad, США), бычий сывороточный альбумин ("Boehringer-Mannheim", Австрия), гемолизаты эритроцитов крови человека были любезно предоставлены Т.А.Чимитовой (НИБХ СО РАН, Новосибирск).

Пористые стекла МПС-2000 ВГХ со средним диаметром пор 2000±150 Á, зернистостью 0,1-0,2 мм и удельной площадью поверхности 30 м2/г производства Горьковского опытного завода ВНИИ нефтепереработки, мелкодисперсная аморфная двуокись кремния (аэросил-175) с удельной площадью поверхности 175 м2/г, непористый сферический силикагель "Monospher" зернистостью 1,4±0,1 мкм был любезно предоставлен профессором К.Унгером (Университет им. Гутенберга, Майнц, ФРГ). В работе использовали силикагель XWP-1500 (ФРГ) с размером частиц 16-23 мкм и диаметром пор 1500Á, коммерческие сорбенты DEAE-Toyopearl 650 М (TOSOH, Япония) и DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Швеция).

Стеклянные пластинки (покровные стекла для микроскопии) для получения спектров ЭСХА и атомно-силовой микроскопии перед химической модификацией оплавляли в пламени газовой горелки, обрабатывали концентрированной серной кислотой, затем 0,1 М соляной кислотой, промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и под вакуумом.

Синтез вспомогательных веществ. п-Нитрофенилакрилат получали по методике [113], т. пл. 53-54 °С.

Синтез РЕ1-силикагеля

1-3 г силикагеля при интенсивном перемешивании заливают десятикратным объемом 10%-го раствора полиэтиленимина в метаноле, после дегазации смеси силикагель отфильтровывают под вакуумом водоструйного насоса до удаления метанола. Затем силикагель переводят в 10-ти кратный объем 10%-го раствора триглицидилового эфира глицерина в диоксане и выдерживают в течение 2-х часов. Силикагель отфильтровывают и промывают диоксаном, метанолом и сушат. [34]

Определение ион-парной емкости сорбентов по пикриновой кислоте.

К 100 мг сорбента прибавляют при встряхивании 4 мл метиленхлорида и центрифугируют. Супернатант декантируют, после чего к сорбенту прибавляют 4 мл 0,2М раствора пикриновой кислоты в метиленхлориде. Несвязанную пикриновую кислоту отмывают 4 мл метиленхлорида (4 раза), после чего к сорбенту прибавляют 4 мл 5%-го раствора триэтиламина в метиленхлориде. Сорбент перемешивают с этим раствором в течение нескольких минут. После седиментации супернатант собирают в отдельную пробирку. Промывку раствором триэтиламинаамина повторяют несколько раз до тех пор, пока супернатант не перестанет давать желтую окраску (около 4 раз), а собранные порции супернатанта объединяют. Количество образовавшегося пикрата триэтиламина в супернатанте определяют спектрофотометрически (е=14500, Х=358 нм) [34].

Синтез поли-п-нитрофенилакрилата.

В 100 мл сухого бензола растворяют 20 г. п-нитрофенилакрилата и 1 г. азобисизобутиронитрила. Раствор перемешивают 8-10 минут слабым током аргона, после чего нагревают, после чего нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течении 4 часов при 70 °С и равномерном пропускании пузырьков аргона. Полученный осадок полимера растворяют в смеси ацетона и диметилформамида (9:1) и прибавляют по каплям при перемешивании в холодный диэтиловый эфир. Выпавший осадок ПНФА отделяют фильтрованием и сушат на воздухе и под вакуумом. Чистоту полученного полимера контролируют методом ТСХ на силуфоле в системе хлороформ:этанол = 2:1. Rf мономера в данной системе 0,5, в то время как Rf полимера 0,1-0,2. Полученный указанным способом полимер не содержит мономера. Полимер переосаждали из ацетона в метанол и характеризовали методом ГПХ.

Расчеты хроматограмм фракций ПНФА выполнялись по калибровке для стандартного полисульфона в хлороформе на колонках m-Bondagel Е-125, 500, 1000, Linear (Knauer, ФРГ). Хроматография ПНФА выполнялась в диметилацетамиде с 0,05 М LiBr.

Модификация силикагелей у-аминопропилтриэтоксисиланом.

20 г силикагеля промывают в экстракторе Сокслета 6,1 М соляной кислотой, представляющую собой азеотропную смесь, кипящую при 1100С, до полного обесцвечивания, затем промывают дистиллированной водой, ацетоном, после чего сушат на воздухе и под вакуумом (1500С, 6-8 часов). 20 г сухого силикагеля прибавляют при перемешивании к 200 мл 3%-го раствора у-аминопрпилтриэтоксисилана в сухом толуоле и перемешивают в течении 20 ч в колбе с обратным холодильником при 90-1000С. Модифицированный силикагель промывают 200 мл сухого толуола и далее ацетоном. Промытый силикагель сушат на воздухе и затем при 1000С 2 ч под вакуумом.

Химически модифицированный Аэросил-175 содержал привитые аминогруппы в количестве 700 мкмоль/г, макропористое стекло МПС-2000 -210 и мкмоль/г, силикагель Monospher - 38 мкмоль/г.

Синтез носителей, содержащих привитую фазу ПНФА.

К 200 мл 2-3% раствора ПНФА в диметилформамиде или диметилсульфоксиде при медленном встряхивании добавляют 20 г модифицированного силикагеля, после чего перемешивают еще 1 час при комнатной температуре. Полученный носитель промывают тем же растворителем до отмывки полимера (600-800 мл). После этого носитель промывают 300 мл эфира и сушат на воздухе 1 час, затем в вакууме 2 часа и хранят в сухом состоянии без доступа влаги.

Синтез аффинного сорбента с групповой специфичностью к цис-диолам.

К 30 г носителя на основе макропористого стекла МПС-2000 ВГХ с привитым ПНФА, содержащим 163 мкмоль/г сложноэфирных групп , добавляли 150 мл раствора п-аминометилфенилборной кислоты (ПАМФБК), взятой в различных молярных соотношениях к сложноэфирным группам носителя, а также триэтиламин в эквимолярном количестве к ПАМФБК. Реакцию проводили в течение двух суток при небольшом перемешивании при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляли 1 мл морфолина для блокирования непрореагировавших сложноэфирных групп носителя, выдерживали еще двое суток, после чего сорбент промывали 0,25 М аммиачным буферным раствором (рН 8) до полного удаления выделившегося в процессе реакции п-нитрофенола. Сорбент хранили в том же буферном растворе.

Определение NH2-rpynn в аминопропилсилилированных силикагелях.

Навеску 100мг) силикагеля смачивают 1-2 каплями дистиллированной воды и растворяют в 0,5-1 мл концентрированной плавиковой кислоты. Раствор разбавляют водой до 10 мл и титруют 4 М КОН до рН 7-8. После этого добавляют объем раствора до 25 мл добавлением 0,1 М раствора тетрабората натрия. В полученном растворе спектрофотометрически определяют концентрацию растворенного амина по реакции с о-фталевым диальдегидом в присутствии меркаптоэтанола. Калибровку проводили по н-бутиламину (s=7100, А/=340 нм). Относя общее количество амина в 25 мл раствора к количеству взятого силикагеля, находят содержание в нем NH2-групп.

Измерение размера частиц носителя и размеров пор.

Измерение распределения частиц силикагеля "Monospher" по размерам проводили методом автокорреляционной лазерной спектроскопии на приборе "Coulter N4" (Coulter Electronics, Франция). Средний диаметр частиц составлял 1,4 мкм, что совпадало с паспортными данными.

Размеры пор макропористых стекол определяли методом ртутной порометрии. В основе метода ртутной порометрии лежит вдавливание металической ртути в поры сорбента, осуществляемое под давлением до 2000 атм. Давление, которое требуется приложить к образцу сорбента для заполнения его пор ртутью, обратнопропорционально диаметру этих пор: в р = -4усо%— d, где d - диаметр цилиндрических пор, у - поверхностное натяжение ртути, 0 - угол смачивания сорбента ртутью (принят равным 1450). Зависимость объема пор сорбента, занятых ртутью при данном давлении от их диаметра представлена на рис. 8 в виде интегральных кривых вдавливания, или, что то же самое, интегральных кривых распределения пор сорбента по их эффективным диаметрам. Измерения проводились на ртутном порометре "Роге 9300" (МйготеШсз, США).

Определение количества п-нитрофенола в растворе.

Концентрацию п-нитрофенола в растворе определяли спектрофотометрически. Для водных растворов с рН>7 А.тах=405 нм и в=15300л/моль см, для растворов в диметилсульфоксиде ^тах=325 нм и 8=11 ОООл/моль см.

Кинетика хемосорбции ПНФА и изотермы адсорбции.

Химическую адсорбцию ПНФА проводили, выдерживая 3 мл 1%-го раствора ПНФА в диметилсульфоксиде с 0,1 г носителя при умеренном встряхивании в термостатированном реакторе (25°С). Количество полимера в растворе соотвествовало трех- пятикратнму молярному избытку сложноэфирных групп по отношению к количеству аминогрупп на поверхности носителей, что позволяло считать концентрацию полимера в растворе приблизительно постоянной.

Кинетику адсорбции изучали с помощью отбора проб носителя и супернатанта из реакционной смеси ( количество мономерных звеньев, химически связанных с поверхностью носителя, соответствует количеству п-нитрофенола, выделившегося в раствор, так как адсорбция п-нитрофенола в условиях эксперимента незначительна). Для измерения количества п-нитрофенола, выделившегося при адсорбции, отбирали 10 мкл супернатанта, разбавляли до 1 мл и определяли концентрацию п-нитрофенола спектрофотометрически.

Для определения количества сложноэфирных групп, локализованных в петлях и хвостах химически адсорбированных макромолекул, из реакционной смеси отбирали пробы носителя (~5 мг), которые после промывки 50-кратным объемом диметилсульфоксида, 20-кратным объемом ацетона, последующей сушки под вакуумом и взвешивания подвергали аминолизу концентрированным (25%) водным раствором аммиака (1 мл) в течении 2-х суток, после чего определяли концентрацию п-нитрофенола в растворе, как описано выше, и рассчитывали исходное содержание сложноэфирных групп на носителе.

Описанную методику определения сложноэфирных групп, иммобилизованных на поверхности носителя использовали при построении изотермы адсорбции. Время контакта носителя с раствором ПНФА составляло 48 часов, т.е. было близко к времени насыщения. Поэтому с некоторым приближением можно рассматривать полученные концентрационные зависимости как изотерму адсорбции.

Определение специфической емкости боратных сорбентов по аденозину.

Емкость боратных сорбентов оценивали методом фронтальной хроматографии аденозина и дезоксиаденозина, проводимой на колонке диаметром 1 см и длиной 10см при скорости потока 0,1 мл/мин. Вещества растворяли в 0,25 М водном растворе ацетата аммония с различными значениями рН (7-9) при добавлении и без добавления 1М раствора №С1. Детекцию аденозина и дезоксиаденозина проводили спектрофотометрическим методом (Атах=250 нм и 8=12800 л/моль см для аденозина и в=11900л/моль см для дезоксиаденозина, рН 9.0) на спектрофотометре Весктап П11-70 (Весктап, США). Концентрация аденозина или дезоксиаденозина в буферном растворе составляла 10-4М.

Ионообменная хроматография бычьего сывороточного альбумина.

Хроматографию белка на синтезированных и коммерческих сорбентах проводили на колонках 1x3 см в 0,02 М трис-НС1 буфере (рН 7,8) в градиенте концентрации ИаС! от 0 до 0,8 М, а так же в режиме изократической элюции при различных концентрациях NaCl (0,2 - 0,5 М). Объем пробы 0,5 мл, концентрация белка 1 мг/мл, скорость элюции 1 мл/мин. Оптическую плотность (А,тах=280 нм) хроматографических элюатов регистрировали на проточном спектрофотометре "Holochrome" ("Gilson", Франция).

Аффинная хроматография гликозилированного гемоглобина.

Аффинную хроматографию гликозилированного гемоглобина из гемолизата эритроцитов крови человека проводили на колонке диаметром 1 см и длиной 10 см при скорости потока 0,72 мл/мин. В качестве растворителя использовали 0,25М аммоний-ацетатный буферный раствор, содержащий 0,05М ацетата магния, рН 8,5. С сорбентом № 1 (см. таб. ) использовали также буфер следующего состава: 0,25 М ацетата аммония, 0.02 М ацетата магния, 0,05М HEPES, рН 9. Элюирование проводили 1М раствором сорбита в исходном буфере. Детекцию проводили спектрофотометрически (Яшах=415 нм) на проточном спектрофотометре "Holochrom" (Gilson, Франция).

Дополнительные методы.

ИК спектры носителей (Аэросил-175) с хемосорбированным полимером снимали на спектрофотметре Specord 75IR (ГДР). Образцы для исследования получали прессованием таблеток диаметром 1 см и массой 5-7 мг.

Изучение тонких поверхностных слоев полимера, адсорбированного на аминопропилсилилированных покровных стеклах для оптической микроскопии, проводили методом рентгеновской спектроскопии для химического анализа (ЭСХА). Метод дает информацию об элементном составе поверхности и типе функциональных групп полимера и носителя в поверхностном слое до 50А. Спектры ЭСХА получали на приборе "ISA RJBER ESCA" (Франция) с использованием излучения MgKa в вакууме о порядка 1(Г Па при помощи источника 300 Вт. Количественный анализ спектров осуществляли с использованием сечений ионизации.

Атомно-силовая микроскопия поверхности аминопропил-силилированных покровных стекол с адсорбированным ПНФА проводилась в лаборатории электронной микроскопии ИБХ РАН с помощью прибора для атомно-силовой и сканирующей тунельной микроскопии Nanoscop 2 (США).

Электрофорез выделенных фракций при градиентной хроматографии фракций БСА проводили в акриламидном геле (градиент концентрации акриламида от 4 до 30%), в присутствии SDS в восстанавливающих условиях. Проявление - Coumassie Brilliant Blue.

Эффективную емкость сорбентов по БСА определяли методом фронтальной хроматографии на колонках 1x1 см в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,8).

1. А.Е.Иванов. Пористые кремнеземы, модифицированные привитыми сополимерами N-замещенных акриламидов сорбенпы для хроматографии биополимеров. Канд. Диссертация, Москва, 1986, с. 5-41.

2. A.E.Ivanov, V.V.Saburov, V.P.Zubov. Polymer-coated adsorbents for the separation of biopolymers and particles. Advances in Polymer Science, 1992, V. 104, p. 135-175.

3. M.Hanson, K.K.Unger. Polymer coatings as stationary phases in high performance liquid chromatography. Trends in analyticalchemistry, 1992, V. 11, № 10, p. 368-373.

4. M.Hanson, A.Kurganov, K.K.Unger, V.A.Davankov. Polymer-coated reversed-phase packings in high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1993, V. 656, p. 369-380.

5. G.Wegner. Functional polymers. Acta mater, 2000, V. 48, p. 253-262

6. О.Н.Мервужева, В.М.Молодкин, А.В.Смирнов, Б.В.Мчедлишвили.

7. А.С СССР № 747513, опубликовано в Б.И. № 26, 1980.

8. F.E.Regnier. Bonded carbohydrate stationary phases for chromatography. Патент США№ 3.983.299. РЖ Химия 11Б1456П, 1977.

9. K.Mosbach, M.Glad, P.O.Larsson, S.Ohlson. Affinity precipitation and high perfomance liquid affinity chromatography. In: Affinity chromatography and related techniques. Ed. T.C J.Gribnau, J. Visser, R.J.F.Nivard, Elsevier, Amsterdam, 1982.

10. S.Gupta, E.Pfannkoch, F.E.Regnier. High performance cationexchange chromatography of proteins. Analitical Biochemistry, 1983, V. 128, p. 196-201.

11. S.H.Chang, F.E.Regnier. Chromatographic supports and methoda and apparatus for preparing the same. Патент США № 4.029.583. РЖ Химия 8Г40П, 1978.

12. J.P.C.Bootsma, H.W.Wolsink, G.Challa, F.Miller. Polymer-bound flavins. 2: Immobilization of linear flavin-containing polyelectrolites by adsorption onto silica. Polymer, 1984, V. 25, p. 1327-1332.

13. M.Bleha, E. Vatavova, M.Tlustakova, J.Kalal. Internal structure of porous glass coated with a polymer layer of poly(2,3-epoxypropylmethacrylate). Angew. Macromol. Chem., 1982, V. 107, p. 25-32.

14. В .В. Сабуров. Синтез композиционных перфторполимерсодержащих сорбентов и их использование в хроматографии биополимеров. Автореферат канд. дисс., Москва, 1989.

15. S.Imure, K.Fukano. Solid support for liquid chromatography. Патент США№ 4.140.653. РЖ Химия 20Б158711, 1979.

16. Y.Kosaka, M.Vemura, T.Hashimoto, K.Fukano. High-energy radiation induced polymerization on a chromatographic solid supports. Патент CIHA№ 4.045.353. Chemical Abstracts 85: 47865f.

17. В.П.Варламов, А.В.Власов, Т.Е.Банникова, Б.Л.Цетлин,

18. С.В .Рогожин. Способ получения водонерастворимых биологически-соединений. А.С. СССР № 689200, опубликовано в Б.И. № 44,1980.

19. В.И.Лозинский, В.П.Варламов, С.В.Рогожин. Способ получения тиолсодержащих сорбентов. А.С. СССР № 771106, опубликовано в Б.И. № 38, 1980.

20. K.Fukano, E.Kageyama. Study of radiatio-induced polymerization of vinyl monomers adsorbed on inorganic substances. X. Influence of H2O in the styrene-silica gel system. J.Polym. Sci. Polym. Chem Ed., 1977, V. 15, p. 65-72.

21. K.Fukano, E.Kageyama. Effect of p-benzoquinone and ammonia on radiation-induced polymerization of styrene adsorbed on silica gel. J. Polym. Sci., 1975, V. 13, p. 2103-2115.

22. С.Л.Мунд, М.А.Брук, А.Д.Абкин. Некоторые зависимости раздельной и совместной полимеризации винилацетатаи акрилонитрила в адсорбированном слое на поверхности аэросила. Высоколекулярные соединения., А, 1976, т. 18, с. 2631-2638.

23. М.Т.Брык. Полимеризация на твердой поверхности неорганических веществ. Киев, Наукова думка, 1981, с. 127.

24. Г.Флир, Я.Ликлема. Адсорбция полимеров. В кн.: Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел. Ред. Г.Парфит, К.Рочестер. М., Мир, 1986, с. 182-288.

25. T.Darling, J.Albert, P.Russel, D.M.Albert, T.W.Reid. Rapid purification of an RNA tumor virus and proteins by high performance steric exclusionchromatography on porous glass beads columns. J. Chromatogr., 1977, V. 131, p. 383-390.

26. В.Я.Мокеев, В.В .Поддужный, И.Д.Баранник. Способ получения пористого материала для хроматографии. А. С. СССР № 467883, опубликовано в Б.И. № 15, 1975.

27. Ch.Dulot, A.Peyrouset, R.Panaris, C.Hennoun, J.Vincent. Process of separation from an aqueous medium a protein or a morphologically organized unit by liquid exclusion chromatography. Патент США № 4.199.450, Chemical Abstracts 90: 134770t.

28. J.-L.Tayot, M.Tardy. Nouveau matériau capable de fixer de façon reversible des macromolecules biologiques, sa preparation et son application. Патент Франции № 2403098, Chemical Abstracts 91: 52235d.

29. Chromatography, 1979, V.185, p. 375-392.

30. G.Vanecek, F.E.Regnier. Variables in the high-performance anion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry, 1980, V.109, p. 315-353.

31. G.Vanecek, F.E.Regnier. Macropourous high-performance anion-exchange supports for proteins. Analytical Biochemistry, 1982, V.121, p. 156-169.

32. A.V.Pirogov, M.M.Platonov, O.A.Shpigun. Polyelectrolyte sorbents based on aliphatic ionenes for ion chromatography. Journal of Chromatogrphy, A, 1999, V. 850, p. 53-63.

33. M.Wilchek. Stable and high capascity Sepharose derivatives for affinity chromatography. FEBS Lett., 1973, V. 33, p. 70-74.

34. P.A.Anderson, L.Jervis. Affinity purification on malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase fromfish muscle on micro-spherical porous ceramic adsorbents. Biochem. Soc. Trans., 1977, V. 5, p. 728-731.

35. В.А.Кадушявичус, О.Ф.Суджувене, И.-Г.И.Песлякас. Способ получения сорбента для очистки белков. А.С. СССР № 1061828, опубликовано в Б.И. № 47, 1983.

36. F.Meiller, C.Bonnebat, M.Delenil. Modified porous bodies. Патент США№ 3.984.349, Chem. Abs. 78: 128813v.

37. А.В.Ильина, В.И.Лозинский, Ю.А.Давидович, С.В.Рогожин. Модифицированный полимерами макропористый кремнезем в качестве носителя для дисульфиднообменной хроматографии белков и способ его получения. А.С. СССР № 687081, опубликовано в Б.И. № 35, 1979.

38. A.Kurganov, O.Kuzmenko, V.A.Davankov, В. Eray, K.K.Unger, U.Trudinger. Effect of polystyrene coating in pore, structural and chromatographic properties of silica packings. J. Chromatogr., 1990, V. 506, p. 391.

39. V.A.Davankov, A.A.Kurganov, K.K.Unger. Reversed-phase highperformance liquid chromatography of proteins and polypeptides on polystyrene-coated silica supports. J. Chromatogr., 1990, V. 500, p. 519.47. см. 2, c. 86-98.

40. Хлорангидридсодержащне композиционные носители дляиммобилизации биоспецифических лигандов. Биоорганическаяхимия, 1985, № 11, с. 1527-1532.

41. A.E.Ivanov, N.V.Bovin, E.Yu.Korchagina, V.P.Zubov. Favourable biospecific reactivity of blood group В antigenic trisaccharide chemically attached to poly-N-(2-hydoxyethyl)acrylamide-coated porous glass. Biomedical Chromatography, 1992, V. 6, p. 39-42.

42. F.H.Arnold, H.W.Blanch, C.R.Wilke. Analysis of affinity adsorbents. I: Predicting the performance of affinity adsorbents. The Chemical Engineering Journal, 1985, V. 30, p. B9-B23.

43. F.H.Arnold, H.W.Blanch, C.R.Wilke. Analysis of affinity adsorbents. II: The characterization of affinity columns by pulse techniques. The Chemical Engineering Journal, 1985, V. 30, p. B25-B36.

44. W.Xu, F.E.Regnier. Electrokinetically-driven cation-exchange chromatography of proteins and its comparison with pressure-driven high-performanceliquid chromatography. Journal of Chromatogrphy, A, 1999, V. 853, p. 243-256.

45. I.S.Jones, P.Richmond. Effects of excluded volume on the conformation of adsorbed polymers. J. of the Chemical Society, 1977, V. 73, № 8, p. 1062-1070.

46. S.Nagaoka, Y.Mori. Interaction between blood components and hydrogels with poly(oxyethilene) chains. In: Sh.W.Shalaby (Ed.) Polymers as Biomaterials, 1983, Plenum Press, N.Y. and London, p. 361374.

47. A.S. Lea, J.D.Andrade, V.Hlady. Measurement of steric exclusion forces with the atomic force microscope. ACS Symposium Series, 1993, V. 532, p. 266-279.

48. Ю.С.Липатов, Л.М.Сергеева. Адсорбция полимеров. Наукова думка, 1972, с. 90.

49. Т.М.Бирштейн. Фазовые переходы при адсорбции макромолекул. Высокомолекулярные соединения, 1982, т. 24 А, с. 1828-1835.

50. C.AJ.Hoeve. General theory of polymer absorption at a surface. J. Polym. Sci., 1971, V. 34, p. 1

51. A.J.Silberberg. Adsorption of flexible macromolecules. IV. Effect of solvent-solute interaction, solute concentration and molecular weight. J. Chem. Phys., 1968, V. 48, p. 3835

52. R.J.Roe. Multilayer theory of adsorption from a polymer solution. J. Chem. Phys., 1974, V. 60, p. 4192

53. I.S Jones, P.Richmond. Effects of excluded volume on the conformation of adsorbed polymers. J. of the Chemical Society, 1977, V. 73, № 8, p. 1062-1070.

54. K.F.Freed. Excluded volume effects in polymers attached to surfaces: chain conformational renormalization group. J. Chem. Phys., 1983, V. 79, №6, p. 3121-3132.

55. M.Daoud, E.Leclerc. Adsorption from a mixture of a short and long chains. ACS Symposium Series, 1993, V. 532, p. 23-34.

56. A.M.Skvortsov, A.A.Gorbunov, D.Berekcan, B.Trathnigg. Liquid chromatography of macromolecules at the critical adsorption point: behaviour of a polymer chain inside pores. Polymer, 1998, V.39, № 2, p. 423-429.

57. E.Dickinson, S.R.Euston. Monte-Carlo simulation of colloidal systems. Advances in Colloid and Interface Science, 1992, V. 42, № OCT p. 89148.

58. S.M.King, T.Cosgrove. A dynamical Monte Carlo model of polymer adsorption. Macromolecules, 1993, V. 26, p. 5414-5422.

59. K.Binder, A.Milchev, J.Baschnagel. Simulation studies on the dynamics of polymers at interface. Annual Review of Materials Science, 1996, V. 26, p. 107-134.

60. P.Cifra, T.Bleha. Steric exclusion/adsorption compensation in partitioning of polymers into micropores in good solvents. Polymer, 2000, V. 41, p. 1003-1009.

61. M.Muthukumar, J.-Sh.Ho. Self-consistent field thery of surfaces with terminally attached chains. Macromolecules, 1989, V. 22, p. 965-973.

62. Ю.С.Липатов, Т.Т.Тодосийчук, В.Н.Черная. Адсорбция полимеров из разбавленных и концентрированных растворов. Успехи химии, 1995, т. 64, № 5, с. 497-504.-9079. K.Debell, T.Lookman. Surface phase-transitions in polymer systems.

63. Reviews of Modern Physics, 1993, V. 65, № 1, p. 87-113.

64. F.Rouland, F.Eirich. Flow rates of polymer solutions through porous disks as a function of solute. II. Thickness and structure of adsorbed polymer films. J. Polymer Sci., 1966, A-l, V. 4, p. 2401-2421.

65. I.Koral, R.Ullman, F.Eirich. The adsorption of a copolymer of vinyl pyrrolidoneand allylamine at the silica-solution interface. Eur. Polymer J., 1974, V.10,p. 1005-1010.

66. N.L.Filipova. Adsorption isotherms on planar surface under flow conditions by ellipsometry. Chemical Engineering Science, 1999, V. 54, p. 35-40.

67. S.Dasgupta. Adsorption behavior of macromolecules on colloidal magnetic oxide particles interfacial interaction and dispersion characteristics. Progress in Organic Coatings, 1991, V. 19, № 2, p. 123139.

68. K.S.Jeon, A.M.Lane. Polymer adsorption on magnetic particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1999, V. 193, p. 300-302.

69. M.A.C.Stuart, G.J.Fleer. Adsorbed polymers in nonequilibrium situations. Annual Review of Materials Science, 1996, V. 26, p. 463-500.

70. M.M.Santore, M.S.Kelly, E.Mubarekyan, V.A.Rebar. Influence of polymer end-group chemistry and segment-substrate interactions on polymer adsorption-kinetics case-studies with polyethylene oxide. ACS Symposium Series, 1995, V. 615, p. 183-195.

71. P.G.Tong, B.L.Carvalho, J.S.Huang, L.J.Fetters. Light-scattering of adsorption of end-fonctionalized polymers in colloidal solutions. ACS Symposium Series, 1993, V. 532, p. 96-110.

72. T.Cosgrove, R.D.C.Richards, J.A.Semlien, J.P.R.Webster. Adsorption of end-fuctionalized and cyclic polymers. ACS Symposium Series, 1993, V. 532, p. 111-120.

73. V.Koutsov, E. W. van der Vegte, G.Hadziioannou. Direct view of structural regimes of end-grafted polymer monolayers: a scaning force microscopy study. Macromolecules, 1999, V. 32, p. 1233-1236.

74. A.E.Ivanov. Covalent adsorption of poly(p-nitrophenyl acrylate): kinetics at the early stage of the reaction. Macromolecular Reports, 1994, A31(suppl.5), p. 521-524.

75. Physica A, 1998, V. 249, p. 315-320.

76. S.C.Goheen, J.L.Hilsenbeck. High performance ion-exchange chromatography and adsorption of plasma proteins. J. Chromatogr. A, 1998, V. 816, p. 89-96.

77. W.Kopaciewicz, M.A.Rounds, J.Fausnaugh, F.E.Regnier. Retention model for for high-performance ion-exchange chromatography. J. Chromatogr., 1983, V. 266, p. 3-21.

78. K.Miyabe, G.Guiochon. Kinetic study of the mass transfer of bovine serum albumin in anion-exchange chromatography. J. Chromatogr. A, 2000, V. 866,p. 147-171.

79. Q.Luo, J.D.Andrade, K.D.Caldwell. Thin-layer ion-exchange chromatography of proteins. J. Chromatogr. A, 1998, V. 816, p. 97-105.

80. A.Baszkin, M.M.Boissonnade. Competitive adsorption of albumin and solution polyethylene interfaces In-Situ measurements. ACS Symposium Series, 1995, V. 602, p. 209-227.

81. H.Quiquampoix, J.Abadie, M.H.Baron, F.Leprince, P.T.Matumotopintro, R.G.Ratcliffe, S.Staunton. Mechanisms and consequences of protein adsorption on soil mineral surfaces. ACS Symposium Series, 1995, V. 602, p. 321-333.

82. W.Barford, R.C.Ball, C.M.M.Nex. A non-equlibrium configuration theory of polyelectrolyte adsorption. J. Chem. Soc., Faradey Trans. I, 1986, V. 82, p. 3233-3244.

83. W.Barford, R.C.Ball. Towards a complete configuration theory of non-equlibrium polymer adsorption. J. Chem. Soc., Faradey Trans. 1,1987, V. 83, p. 2515-2523.

84. M.C.Cafe, I.D.Robb. The adsorption of polyelectrolytes on barium sulfate crystals. J. Colloid Interface Sci., 1982, V. 86, p. 411-421.

85. S.H.Chang, K.M.Gooding, F.E.Regnier. High-performance liquid chromatography of proteins. J. Chromatogr., 1976, V. 125, p. 103-114.

86. A.Alpert. High-performance hydrophobic-interaction chromatography. J. Chromatogr., 1983, V. 359, p. 85-97.

87. Z.E1 Rassi, Cs. Horvath. Hydrophobic interaction chromatography of t-RNA's and proteins. J. Liq. Chromatogr., 1986, V. 6, p. 3245-3268.

88. Л.А.Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот, 1985, М. "Наука", с. 53-54.

89. T.Peters. Serum albumin. Adv. in Protein Chem., 1985,V. 37, p. 161-245.

90. G.-L.Freidli. Doctoral (PhD) thesis. Электронная публикация: http//www.friedli.com/research/home.