Формирование внутренних градиентов рНв ионообменной хроматографии: моделирование иэкспериментальная проверка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

РГБ ОД

На правах рукописи

Тессман Алексей Борисович

Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2000

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук,

Ведущая организация:

Официальные оппоненты:

Научный консультант:

профессор |Рунов В.1С| кандидат химических наук, Иванов A.B.

кандидат химических наук, доцент Гармаш A.B. доктор химических наук, профессор Яшин Я.И. доктор химических наук, старший научный сотрудник Долгоносое A.M.

Воронежский государственный университет

Защита диссертации состоится 14 июня 2000 г. в 16.10 в ауд. 344 на заседании диссертационного совета Д.053.05.60 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ, а также в Интернете по адресу http://tessman.narod.ru

Отзывы и замечания просьба направлять по адресу:

119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра аналитической химии, ученому секретарю диссертационного совета

Ученый секретарь диссертационного совета,

Автореферат разослан 5 мая 2000 г.

кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

r/JCt^.P-

А О

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Среди гибридных методов в аналитической химии в последние годы широкое распространение получили ионообменная, комплексообразовательная и другие варианты жидкостной хроматографии. Развитие и совершенствование этих методов связано с расширяющимся кругом определяемых компонентов, анализируемых объектов, возможностью сочетания хроматографии с другими методами анализа. В 1979 г. Слайтерманом был создан новый метод препаративного разделения и определения белков на ионообменных колонках, основанный на элюировании с внутриколоночным (внутренним) градиентом рН, - хроматофокусирование. Выбор компонентов хроматографической системы - сорбента, стартового раствора и элюента - в методе хроматофокусирования в большинстве случаев основан на эмпирическом подходе, а существующие модели формирования внутреннего градиента рН дают лишь крайне упрощенное представление о системе. Многие характерные участки градиента рН невозможно объяснить с помощью существующих моделей. В то же время стоимость химических реактивов, используемых для получения внутренних градиентов рН, достаточно высока. Особенно это относится к буферным элюентам, составленным из синтетических полиамфолитов, свойства которых могут быть плохо воспроизводимы. Кроме того, подобные элюенты под действием бактерий быстро разрушаются. В целом это приводит к высокой стоимости метода хроматофокусирования при его рутинном использовании. В связи с этим актуально изучение процессов формирования внутренних градиентов рН и создание физико-химической и математической модели, описывающей все особенности градиента. На основании полученных закономерностей, связывающих форму внутреннего градиента рН с параметрами хроматографической системы, можно будет подбирать элюенты, составленные из небольшого числа дешевых реагентов простого состава. Кроме того, необходимо создать программу или пакет программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия, что сэкономит время, химические реактивы и снизит стоимость анализа в целом, а также поможет исследователю подобрать градиент требуемой формы.

Цель работы:

■ разработка методов расчета профилей внутренних градиентов рН;

■ поиск закономерностей, связывающих форму градиента рН с параметрами системы;

• поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов, для получения рабочих градиентов рН требуемой формы;

• создание информационной базы данных по внутренним градиентам рН.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач

1. Анализ литературных данных по формированию внутренних градиентов рН хроматофокусировании (теоретические принципы, модельные представления практическое применение);

2. Разработка физико-химической и математической модели формирован! внутреннего градиента рН, учитывающей гомогенные и гетерогенм химические равновесия, протекающие в системе, и описывающей в основные особенности профиля градиента рН;

3. Анализ модели, т.е. выявление закономерностей, связывающих фор| градиента с параметрами модели;

4. Получение экспериментальных значений отдельных параметров модел (констант протонирования аминогрупп для сорбентов Еп-БЮг, Оюп-ЗЮг Те^еп-БЮг' коэффициентов ионного обмена хлорида на анионы слабы кислот и коэффициентов обмена протона на натрий на сорбированны дикарбоновых кислотах);

5. Проверка адекватности модели литературным и собственнь экспериментальным данным;

6. Разработка аппаратурного оформления для получения экспериментальнь внутренних градиентов рН;

7. Поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа прость протолитов;

8. Разработка пакета программ, позволяющих до начала эксперимента подобра-его условия (сорбент, стартовый раствор, элюент, требуемая форма градиент рН), для экономии времени и стоимости химического анализа.

Научная новизна. Найдены основные закономерности формировав внутриколоночных градиентов рН в хроматофокусировании и требования сорбентам и составу подвижных фаз стартового раствора и элюента.

Впервые для получения квази-линейных внутренних градиентов р применены системы, включающие кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами одно- двухкомпонентные элюенты на основе слабых низкомолекулярных кисло Определены константы протонирования аминогрупп этих сорбентов, а так» коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированнь дикарбоновых кислотах.

Изучено влияние природы и состава стартового раствора и элюент: составленного из простых протолитов, на форму градиента рН. Впервые показан влияние ионной силы на форму градиента рН.

Разработана физико-химическая и математическая модель формировани внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смес протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия

гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитные и полифункциональные свойства сорбента. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные участки на профиле градиента рН.

Профили градиентов рН, рассчитанных на основе модели, хорошо согласуются с полученными экспериментально в аналогичных условиях. Модель впервые позволила объяснить образование так называемых "аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора), что в принципе невозможно было объяснить с помощью моделей, учитывающих только буферные свойства системы, и лишь частично - с помощью модели локальных равновесий Фрея".

Практическая значимость работы. Даны практические рекомендации по созданию дешевых элюентов простого состава и способы управления формой градиента рН за счет изменения ионной силы подвижных фаз. Показана возможность применения однокомпонентных элюентов для хроматофокусирования на примере разделения изоформ плазминогена и модельной смеси аминокислот. Создан пакет программ для операционной системы Windows 9x/NT - Acid Base Calculator, Cfocusing, Alpha и база данных "pH-gradients". Эти программы позволяют до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых вещестз форму градиента рН).

Положения, выносимые на защиту:

1. Физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая кислотно-основные и ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитную и полифункциональную природу сорбента.

2. Результаты моделирования внутренних градиентов рН и их сравнение с экспериментальными данными.

3. Найденные закономерности, связывающие форму градиента с параметрами хроматографической системы.

4. Способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием одно-двух компонентных элюентов на основе простых протолитов и использование таких градиентов рН для разделения белков и аминокислот.

5. Программное обеспечение - информационная база данных по модельным и экспериментальным внутренним градиентам рН с интегрированными с ней программами расчета внутренних рН-градиентов, рН и ионной силы смесей кислот и оснований в водных растворах, степени протонирования сорбента.

' Frey D.D.. Barnes A.. Strong J. //AlChE Journal 1995. V.41 N 5. P 1171-1163

5

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI Всероссийской конференции "Физико-химические основы и практическо применение ионообменных процессов" (Воронеж, 1996 г.); Международно конгрессе по аналитической химии (ICAC-97) (Москва, 1997 г.); Международно конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносое 98" (Москва, МГУ, 1998 г.); Всероссийском симпозиуме по теории и практик хроматографии и электрофореза (Москва, 1998 г.); Всеукраинской конференции п аналитической химии (Ужгород, 1998 г.); 2-й Всероссийской конференции п истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) (Москва, 1999 г. Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографи (SCAC'99) (Москва, 1999 г.); VII Всероссийской конференции "Органически реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999 г.); Всероссийской конференци "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 1 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух гла обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов и списк литературы. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, включае 70 рисунков и 14 таблиц. Список литературы содержит 110 работ зарубежных отечественных авторов.

Основное содержание работы

В первой главе диссертации изложены принципы хроматофокусировани: амфолитов. Рассмотрены основные типы ионообменных сорбентов, применяемы в хроматофокусировании, их кислотно-основные и ионообменные свойства Рассмотрены свойства подвижных фаз - стартовых (уравновешивающих растворов и буферных элюентов. Показаны тенденции поиска новых составо! элюентов для получения внутренних градиентов в требуемом диапазоне рН Рассмотрены теоретические аспекты формирования внутренних градиентов рН Обсуждены существующие модели формирования внутреннего градиента рН i дана их критическая оценка. Показано, что для понимания и объяснения сложны: физико-химических процессов, протекающих в хроматографической системе npi формировании внутреннего градиента рН, необходимо использовать модельньк представления, описывающие кислотно-основные и ионообменые равновесия i гетерогенной системе. Во второй главе рассмотрены основные подходы моделированию ионообменных равновесий, объяснены возникающие при этол математические сложности и кратко описаны применяемые для их решени! математические методы. В третьей главе описаны растворы, реагенты аппаратура и методики эксперимента. В четвертой главе приводится выбор i описание модели формирования внутреннего градиента рН смесью просты: протолитов, учитывающей кислотно-основные и ионообменые равновесия ¡

твердой и жидкой фазах, а также полифункциональную и полиэлектролитную природу сорбента. Показано влияние параметров модели на форму рассчетных выходных кривых:

• состава элюента - одно и мнококомпонентные элюенты

• влияние ионной силы элюента и стартового раствора

• влияние природы сорбента (на примере кремнеземов, модифицированных различными олигоэтиленаминами).

Приведено сравнение разработанной нами модели с моделями Слайтермана-Элгерсмы, Мурела и сотр., Фрея и сотр., а также показано соответствие рассчитанных профилей внутренних градиентов рН литературным данным. Приведены экспериментально определенные значения отдельных параметров модели. В пятой главе приводятся данные экспериментальной проверки ряда предсказанных моделью эффектов. Показаны способы получения квази-линейных внутренних градиентов рН с помощью одно- двухкомпонентных элюентов, составленных из простых протолитов, а также приводятся примеры разделения аминокислот и белков на полученных градиентах. В шестой главе описано разработанное программное обеспечение с примерами его применения.

Экспериментальная часть

Сорбенты. В работе использовали сорбенты на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами (Dien-S¡C>2, Tetren-SiC>2, матрица Силохром С-120 (100-160 мкм), Силасорб Si-600 (7.5 мкм), синтезированные д.х.н. П.Н.Нестеренко.

Подвижные фазы и растворы. Растворы реагентов и вспомогательных веществ, компоненты стартовых буферных растворов и элюентов готовили из препаратов квалификации не ниже ч.д.а. Использовали растворы Полибуфера-74 (Polybuffer-74) фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Аппаратура. Хроматографическая система низкого давления: емкость для подвижной фазы с краном ("Pharmacia", Швеция); стеклянная хроматографическая колонка, перистальтический насос низкого давления Multiperpex 2115 ("LKB-Bromma", Швеция), самодельная проточная ячейка для измерения рН, цифровой рН-метр "TOA Electronics HM-20S" (Япония) с комбинированным электродом GST-5211С; перистальтический насос низкого давления Varioperpex 2120 ("LKB-Bromma", Швеция) для откачивания эффлюента из рН-ячейки; одноканальный самописец ("LKB-Bromma", Швеция). Система для ВЭЖХ: изократический насос высокого давления "Beckman-114M" (США) или "Altex-110A" (США), стальная (250x4.5мм) или пластмассовая (50x4.6мм) хроматографическая колонка, самодельная проточная ячейка для измерения рН, цифровой рН-метр "TOA E!ectronics-HM-20S" с комбинированным электродом GST-5211C, перистальтический насос низкого давления "Varioperpex-2120" и одноканальный или двухканальный самописец "LKB-Bromma" (Швеция). При определении коэффициентов ионного обмена и при разделении модельных смесей в схему

включали инжектор 'ТО1еос1упе-7125" (США) с объемом петли 25 мкл и УФ-детект "1Мсогс)-2238" ("1_КВ-Вготта", Швеция) или кондуктометр "СошЗисЫугег-бЗОС ("иКВ-Вгогпта", Швеция). Обычная схема формирования нисходяще внутреннего градиента рН приведена на рис. 1.

Рис. 1. Схема формирования нисходящего внутреннего градиента рН в хроматофокусировании (колонка заполнена слабоосновным сорбентом).

Модельные внутренние градиенты рН

Выбор и описание модели. Для поиска закономерностей, связывающ форму внутреннего градиента рН с параметрами хроматографической систем мы использовали упрощенное модельное представление системы. Основн отличие данной модели от разработанных ранее моделей Слайтермана1, Мурег состоит в учете гетерогенности рассматриваемой системы: сорбент - стартов! раствор - элюент, а в отличие от модели Фрея3 - в более полном учете кисло™ основных и ионообменных равновесий, протекающих в системе.

Уравнения модели.

Для моделирования внутреннего градиента рН в хроматофокусирован необходимо задать состав и свойства колонки с ионообменником, стартовс раствора, элюента и определить основные равновесия в колонке. N рассматривали равновесия в системе, содержащей анионообменник ЯЫНг, наб кислот НпА] и ионы Ыа*, С/*. Именно такие системы наиболее типичны д

' 3(иу1егтап 1..А.АЕ.. Е1дегзта О, //О.СЬготаЮдг. 1978. У.150. N231. Р 17-30. 1 Миге1 А.. У'ЛЛе Б., Рапк М.. БЬеусЛик I.. Югге! О. // ЮиотаЮдг. 1985. V 347. Р.325-334

1 Ргеу О О . Ваглеэ А., 31гопд .1. ИАЮЬЕ ,1оигпа1. 1995. У.41 N 5. Р 1171-1183.

внутриколоночного получения градиента рН при использовании неамфолитного элюента.

1. Протонирование ионообменника со связыванием противоиона СГ:

нын2+н* +сгояш;+сг (1)

к [ЯЫН;Ца-]

Р [ЯМН2][Н*][СГ]

2. Ионный обмен.

Монодентатное связывание противоиона с образованием ионов в фазе ионообменника:

К(О.А)~

яын; + СГ +Н„г,А: <=> ЯЫН;+Н„Г,А: +СГ (3)

К(С1,А)= ' ' __(4)

[Н„г<А]][СГ]

При сорбции анионообменником многоосновных кислот, т.е. П) > 1, возможны процессы катионного обмена Н* на №*:

К(Н,Н ч-

ЙНН;+Н„г,А]+№* о ЯНН;+НП1_гА]- +Ыа* +Н* (5)

[Н„.2А*-][Ыа>][Н']

К(Н.Ыа) = ' ; -----(6)

[Н„г,А1][Ыа*]

В систему уравнений включены выражения констант всех гомогенных равновесий в фазе раствора, а также уравнения материальных балансов для каждого компонента, т.е. каждой кислоты, СГ, Ыа* и ионогенных групп ионообменника. Например, для А1 можно записать:

+ (7)

1.0 1-0

( заряды ионов (0.....П)) для простоты опущены).

Здесь /\/; - количество моль у-той кислоты, V - объем раствора, т - масса

ионообменника. При этом концентрации всех частиц в подвижной фазе выражены в моль/л, а в фазе ионообменника в ммоль/г. Для ионогенных групп анионообменника выражение материального баланса имеет вид:

[ЙЫН;] + [ЙМН2] = ц (8)

где ц - максимальная удельная обменная емкость.

Система содержит также уравнения электронейтральности обеих фаз. Уравнена электронейтральности для подвижной фазы:

О

к

где индекс к нумерует все частицы, находящиеся в растворе (Н„1АГ Л/а*, СГ Н30\ ОН", Н20), гк - заряд к-той частицы с учетом знака, [хк] - равновесна! концентрация /с-ой частицы.

Для неподвижной фазы при эквивалентном ионном обмене уравнение электронейтральности типа (9) имеет вид:

Полученная система уравнений, включающая выражения всех констат равновесий, выражения для всех материальных балансов и уравнения электронейтральности, всегда имеет единственное положительное решение, ^ решается с помощью численных методов (методов оптимизации). Расчет равновесных составов твердой и жидкой фаз выполняли послойно, деля колонку на определенное число секций.

Параметры модели.

Сорбент - слабоосновный анионообменник, представляющий собой химически модифицированный олигоэтиленаминами кремнезем.

В качестве характеристик ионообменника использовали величину максимальной удельной емкости с? (ммоль/г) и величины констант и коэффициентов соответствующих равновесий (2, 4, 6). Химическую неоднородность анионообменника, а также его термодинамическую неидеальность формально учитывали с помощью эмпирической зависимости константы протонирования Кр (2) от степени протонирования а и ионной силы раствора /. Для расчета Кр из кривых титрования изучаемых сорбентов использовали выражение:

(10

(11

1-а

(12)

Степень протонирования (а) в данном случае определяется как:

[мн;] + [Щ}~ я

(13)

где ц - максимальная емкость сорбента (общее количество функциональных групп на единицу массы сорбента). Для каждого сорбента зависимость Кр от а и / аппроксимировали полиномом.

При расчете внутренних градиентов мы использовали четыре модели анионообменника:

Монофункциональные Полифункциональные

Сорбент с величиной \дКр = 8.0 Еп-ЭЮг. 1дКр = /(а,VI)

АР-ЭЮг; \дКр = /■(а,VI) Те^еп-БЮг, 1д Кр = /(а,VI)

АР- пропиламин; Еп- этилендиамин; Те1геп- тетраэтиленпентамин.

Колонка. Характеристиками хроматографической колонки служили число секций (или зон фокусирования) N и отношение т/\/ массы анионообменника (г) к объему жидкой фазы (мл). В расчетах обчыно использовали N=50 или 200, а тЛ/=2.

Стартовый раствор (СР). В рамках модели рассматривали водный раствор, содержащий слабое основание Трис (рКа=8.06) и ионы Л/а* (поскольку конкретная природа катиона несущественна) и СГ в заданных концентрациях. Последние подбирают для обеспечения требуемых значений ионной силы и рН. В расчетах обычно использовали стартовой раствор с I = пхЮ"3 М, рН 7.50.

Элюент (Э). В рамках модели рассматривали водный раствор, содержащий в заданных концентрациях слабые кислоты Нп А1 (/' = 1.....т) и ионы Ыа* и С/".

Анионы слабых кислот, присутствующих в элюенте, мы в дальнейшем называли активными, а анионы сильных кислот (включая СГ) - инертными компонентами элюента. Элюенты, содержащие только один активный компонент (независимо от числа инертных компонентов), называли однокомпонентными, более одного активного компонента - многокомпонентными.

Влияние параметров модели на форму выходных кривых.

С использованием данной модели проведено большое число расчетов внутренних градиентов рН с варьированием параметров модели. Установлено, что модель на качественном уровне описывает все известные из литературы особенности градиента рН. Например:

• Формирование более плавных (наиболее протяженных в ед. рН и объемов эффлюента) градиентов рН при использовании многокомпонентных элюентов, составленных их простых протолитов, в отличие от индивидуальных протолитов (рис. 2).

• Формирование более плавных градиентов рН при использовании полифункциональных сорбентов по сравнению с монофункциональными (рис. 3).

Кроме того, модель предсказала ряд ранее неизвестных эффектов связанных с влиянием ионной силы подвижных фаз на профиль внутреннее градиента рН (рис. 4, 5). Также модель впервые позволила объяснит! образование, так называемых аномальных участков градиента, т.е. начальный подъем рН эффлюента выше значения рН стартового раствора (рис. 6).

Влияние состава элюента на форму внутреннего градиента рН

Типичный пример зависимости рН эффлюента от его объема (в дальнейшем -профиль градиента рН) приведен на рис. 2, кривая 1 (для всех зависимостей объем эффлюента приведен в относительных единицах (V0TH), соответствующие объему подвижной фазы в колонке).

Элюент: одноосновные кислоть НА,

1 - рКа = 5.0; Сил = 5.10° М;

2 - рКа = 3.0; 5.0; 7.0; сНА = 710J М;

3 - Сна = 2-Ю"' М; РК, = З.о, 3.5; ... 6.5; 7.0.

Рис. 2. Профиль внутреннего

градиента рН при использование одно- и многокомпонентных элюентоа

Как видно из рис.2, кривая 1, на выходной кривой наблюдаются два фронта. При пропускании через колонку стартового раствора аминогруппы анионообменника протонируется не полностью, поскольку значение рН стартового раствора достаточно велико (7.5), а концентрация противоиона достаточно мала (2x10"3 М). В частности, при 1дКр=8.0 рассчитанная степень протонирования а = 0,532. Согласно модели, при последующем пропускании элюента, содержащего №С! и НА, происходит одновременно несколько процессов.

• Обмен сорбированных ионов С1" на А". Этому процессу соответствует первый фронт (рис. 2, кривая 1, участок а - Ь).

• Уменьшение рН подвижной фазы и связанное с этим увеличение степени протонирования анионообменника а.

• Дополнительная сорбция противоиона СГ из элюента в связи с увеличением а. Этому процессу соответствует второй фронт (рис.2, кривая 1, участок с-сО-

Из рис.2, кривые 2, 3 видно, что увеличение числа активных компонентов в элюенте увеличивает протяженность градиента как в ед. рН, так и объемах эффлюента, т.е. увеличивает плавность внутреннего градиента рН.

v„

Влияние природы сорбента на форму внутреннего градиента pH.

pH

1 - условный сорбент с lgKp=8.0

2 - монофункц-ный AP-S¡0¡, IgКр = f(a,l);

3 - полифункц-ный Tstren-Si02, lgKp = f(a,l);

20

60

80

100

Сорбент: модель анионообменника:

1- 1дКр=8.0;

2- АР-ЭЮ2;

3- Те^еп-ЭЮг.

Рис. 3. Профили внутренних

градиентов рН при использовании 9-компонентного элюента для различных моделей сорбентов.

ОТМ

Результаты моделирования выходных кривых с учетом зависимости \дКр сорбента от а и I приведены на рис. 3 (кривые 2, 3). Для сравнения на этом же рисунке (кривая 1) приведена и рН-выходная кривая при постоянном значении 1дКр = 8.0. Особенно плавный, близкий к линейному, градиент получается при использовании полифункционального анионообменника (рис. 3, кривая 3), что позволяет считать такие анионообменники весьма перспективными для создания внутренних градиентов рН, хотя в этом случае протяженность градиента рН по оси абсцисс несколько меньше, чем при использовании монофункционального анионообменника (кривая 2).

Влияние ионной силы элюента на форму внутреннего градиента рН.

pH

1 - / = 1x10" 2-1- 1x10° 3-1- 1x10'2

2

* \\_

pH

20

1-1 =0.1 2 -1 = 0.01 3-1 = 0.001

40

60

80

100

Рис.4. Профили внутреннего градиента pH для систем с различной концентрацией Элюент: одноосновная кислота НА, сНа = 2-10 М, рК3 = 5.0.

Рис. 5. Профили внутреннего градиента рН для ЫаС1. систем с различной концентрацией №С1 Элюент: 9-ти компонентная смесь

I-4 I

одноосновных кислот НА, с Сна = 2 Ю М; рКа = 3.0, 3.5; ...; 6.5; 7.0.

Влияние ионной силы на профиль внутреннего градиента рН ранее другим исследователями, работающими в области хроматофокусирования, н рассматривался. На рис. 4 приведены три профиля градиента рН, полученные пр использовании однокомпонентного элюента. Видно, что квази-линейный участс образуется на профиле градиента только в случае, когда ионная сила, т.( концентрация инертного компонента соизмерима с концентрацией активное компонента. На рис. 5 показано влияние ионной силы элюента на профиг градиента для 9-ти компонентного элюента. Из рис.5 видно, что увеличени ионной силы в элюенте приводит к ухудшению формы градиента, котора становится более резкой (кривые 1, 2).

Образование аномального участка на профиле градиента рН (т.< увеличения рН эффлюента выше значения рН стартового раствора). На рис. приводится начальный участок градиента рН для 9-ти компонентного элюент; Модель впервые позволила объяснить причины образования подобных участкс на профиле внутреннего градиента рН. Такие эффекты неоднократн наблюдались в эксперименте, но не могли быть объяснены с моделей моделе Слайтермана, Мурела и лишь частично с помощью модели Фрея. В данном случа появление аномального участка связано с влиянием ионной силы на величину 1д/-сорбента, значения которой оказываются различными для СР и Э (/ср < /э Аномальный участок может появится только в случае, если /ср < /э.

8.8 г-------------------

Рис. Б. Начальный участок модельного градиент для системы СР: рН 7.5, сМаа=2-10"* М; Элюен смесь девяти кислот, инертный компонент: 1-10'3 №С1; Сорбент - модель анионообменника Те1ге1 ЭЮг.

Экспериментальные внутренние градиенты рН

На данном этапе работы необходимо было экспериментально проверит ряд обнаруженных при моделировании эффектов, - в первую очередь - эффекть связанные с влиянием ионной силы на профиль внутреннего градиента рН, также возникновение аномальных участков на форме градиента.

Проверка влияния ионной силы элюента. На рис. 7 приведены профил внутренних градиентов рН при различной ионной силе, полученные пр использовании в качестве элюента синтетического полиамфолита Полибуфер-7<: В модельных расчетах подобному элюенту соответствует смесь 9-т

5 К

одноосновных кислот. Из рис. 7 видно, что увеличение ионной силы элюента приводит к резкому изменению формы градиента, что хорошо согласуется с расчетами для 9-ти компонентной смеси.

V, мл V, мл

Рис. 7. Влияние ионной силы на профиль Рис. 8. Влияние ионной силы на профиль внутреннего градиента рН, полученного для внутреннего градиента рН, полученного для

элюента с Полибуфер-74. Колонка: 300x9 мм, элюента с 0.005 М щавелевой кислотой.

Еп-ЭЮ2. Колонка: 250x4.6 мм, Те^еп-ЭЮг-

Природа аномального участка. Ряд экспериментов был направлен на поиск причин появления и способов устранения аномальных участков градиента рН, препятствующих разделению веществ в методе хроматофокусирования. Установлено, что возможными причинами появления таких участков может соотношение ионной силы СР и элюента (/ср < /э). На рис. 9 приведен ряд градиентов рН, полученных при различных значениях ионной силы элюента и СР. В случае, когда /ср > /э, возможно получение градиентов, содержащих плавный (квази-линейный) участок протяженностью до 2-2.5 ед. рН даже при наличии в элюенте лишь одного активного компонента (щавелевой кислоты) (рис. 9, кривые 1-3). В случае, если /ср < /э возможно появление аномального участка на форме градиента (рис. 9, кривая 4).

Второй фактор, вызывающий появление аномального участка - наличие в элюенте "неудерживаемого" слабого основания, которое обычно используют для подведения рН элюента до определенного значения (рис. 10). Влияние слабого основания на появление аномального участка можно подавить за счет увеличения ионной силы СР (рис. 10, кривые 1-3).

Возможно и совместное влияние указанных факторов, приводящее к появлению двух максимумов на профиле внутреннего градиента рН (рис. 11).

Рис. 9. Влияние ионной силы стартового раствора на профиль внутреннего градиента рН и на появление аномального участка. СР: 25 мМ Трис-НС1 (рН 7.5) 1 - -0.03, 2 - 0.1, 3 - 1, 4 - 0.02; Элюент: 2 мМ Н2С204 (рН 2.95), /,: 1, 2, 3 - -0; 4 - 0.5, скорость подвижной фазы - 1 мл/мин; Колонка: 250x4.6 мм, Те^еп-БЮг (7.5 мкм).

рН

7.5

5.5

3.5

/СР-0

1ср~ 0.1

IСР ~ 1-0

25

50

25

50

25

50 I, мин

Рис. 10. Влияние слабого основания в подвижной фазе на профиль внутреннего градиента рН и на появление аномального участка. Элюент: 20 мМ Н2Сг04 - 22.5 мМ Трис (рН 3.5, /3-0.03); Колонка: 250x4.6 мм, Теиеп-3|02.

РН

7.5

5,5 3.5

/ср-0

/э - 0.5

Рис. 11. Совместное влияние слабого основания и сильного электролита на профиль внутреннего градиента рН и на появление аномального участка. Элюент: 20 мМ Н2С204 - 22.5 мМ Трис (рН 3.5), Колонка: 250x4.6 мм, Те^еп-ЗЮ?.

Рекомендации по формированию квази-линейных внутренних градиентов рН. Для получения квази-линейных внутренних градиентов рН предпочтительно использовать

• полифункциональные сорбенты

• элюенты с минимальным содержанием слабоосновных компонентов

• элюенты с ионной силой ниже, чем у стартового раствора.

Если требуется сформировать протяженный градиент, то ионную силу элюента следует понижать, если более резкий градиент - то повышать.

Примеры разделения аминокислот и белков на квази-линейном градиенте рН, полученном в условиях (/ср > /3). Квази-линейные градиенты рН, сформированные элюентами простого состава (например, Н2С2О4), использовали для разделения модельной смеси аминокислот и изоформ плазминогена, чтобы показать возможность применения таких простых элюентов в сочетании с правильным использованием ионной силы в аналитическом и препаративном хроматофокусировании. Состав эффлюента контролировали фотометрически при 280 нм; рН эффлюента непрерывно измеряли в проточной ячейке.

На рис. 12а показан пример разделения модельной смеси пролина (Рго), тирозина (Туг) и фенилаланина (РИе). Хроматографические пики аминокислот достаточно узкие и симметричные по форме, что говорит о наличии фокусирующего эффекта. Порядок элюирования аминокислот и их положение на хроматограмме относительно градиента рН согласуется со значениями их изоэлектрических точек (р1).

рН

1 - 5уэ1ет

2 - Рго (р| - 6.30)

3 - Туг (р! - 5 65)

4 - РИе (р| - 5 43)

А,.

:зо

0.05

РН

7.5

6 5 55 4.5 3.5 2.5

\ 1 - 01у-Р1а5гтподеп (М1/У= 90000)

\ 2 - 1_уз-Р1з5т!Подеп = 33000)

\ 3 - Р1а5пи'п (ММ= 33000)

1 А 280

2 \

1-0 05

-V. 1 1 1

20

40

V, мл

20

(а)

40

(б)

60 ■ V, мл

Рис. 12. Хроматограммы модельной смеси аминокислот (а) и плазминогена (б) и профили внутреннего градиента рН для системы СР: 25 мМ Трис-НС1, рН=7.5, /маС,=0.02 М, Элюент: 2мМ щавелевая к-та. 1 мл/мин, Колонка: 50x4.6 мм, Те1геп-5!02, 7.5 мкм.

Изоформы плазминогена - неактивный белок С1и-плазминоген и активный белок 1_уэ-плазминоген имеют очень близкие значения изоэлектрических точек

(р1=5.82 и 5.66, соответственно), и их практически невозможно разделить методом ионообменной хроматографии при изократическом элюировании. Тем не менее, задача их разделения актуальна для биохимиков и медиков. Мы проверили возможность разделения изоформ плазминогена методом хроматофокусирования при использовании простого элюента. Хроматограмма лиофилизованного образца представлена на рис. 126. Несмотря на достаточно резкое снижение рН от 7.5 до 5.4, изоформы плазминогена удалось разделить по их изоэлектрическим точкам.

Таким образом, показана применимость простых элюентов в сочетании с высокой ионной силой стартового раствора в хроматофокусировании аминокислот и белков.

Определение коэффициентов анионного и катионного обмена на модифицированных кремнеземах

Коэффициенты анионного обмена хлорид-иона на анион слабой кислоты К(С1,А) на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами. В модель заложены экспериментально определяемые параметры. Одним из варьируемых параметров, влияющим на профиль модельного градиента рН, является коэффициент анионного обмена хлорид-иона на анион слабой кислоты К(С1,А), входящей в состав элюента (ур-ние 4).

Для определения коэффициентов анионного обмена К(С1,А) использовали следующую схему: кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами переводили в протонированную форму {1?мн;СГ), достигая степени протонирования сорбента -100% при пропускании 0,1 М НС1 с высокой ионной силе (1 М №С1). Затем обрабатывали сорбент в статических условиях растворами кислот (муравьиной, уксусной, щавелевой, малоновой, янтарной, фумаровой, малеиновой, винной) (рН<2,5). Равновесные концентрации хлорид-иона и анионов кислот в жидкой фазе после ионного обмена определяли методом ионной хроматографии на колонке, заполненной Нурго-ЭЮг с привитыми группами оксипролина, при кондуктометрическом детектировании; элюент - 0,8 мМ фталевая кислота.

Для изученных кислот (муравьиной, уксусной, щавелевой, малоновой, янтарной, фумаровой, малеиновой, винной) получили близкие друг к другу значения К(С1,А), лежащие в диапазоне 0.1 - 0.3, что с учетом погрешности эксперимента говорит о том, что ионный обмен для данных кислот протекает с примерно равной силой в виду многообразия возможных способов закрепления аниона кислоты на функциональных группах сорбента. Соотношение количества хлорид-иона, выделившегося при ионном обмене, и количества сорбированной дикарбоновой кислоты нестехиометрично, что связано с возможной сорбцией кислоты за одну или за две карбокисльные группы. Различный способ закрепления дикарбоновой кислоты - за одну или за две группы - зависит от расстояния между привитыми аминогруппами на поверхности сорбента, от геометрического размера

молекулы кислоты и от возможной конформации привитых олигоэтиленаминов Таким образом, ионообменный ряд для изученных кислот не связан с рядом р/Са данных кислот.

Экспериментально определенные значения коэффициентов анионного обмена К(С1,А) на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами соответствуют величине параметра, взятого из литературных данных для сильноосновных ионитов и ранее использованного нами при моделировании внутренних градиентов рН в хроматофокусировании.

Коэффициенты катионного обмена протона на натрий К(Н,Ма) на дикарбоновых кислотах, сорбированных на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами. Для определения коэффициентов К(Н,Ма) (ур-ние 6) использовали ту же хроматографическую схему, что и для коэффициентов анионного обмена.

Полученные значения К(Н,№) уменьшаются в ряду:

щавелевая - малеиновая > фумаровая > янтарная - малоновая, что некоторым образом, хотя и слабо, коррелирует с силой этих кислот. Снижение степени протонирования аминогрупп ионообменника (рН раствора кислот=:5) приводит к уменьшению коэффициентов обмена для малоновой и янтарной кислот.

Таблица 1. Коэффициенты катионного обмена рК(Н, N3) при максимальной степени протонирования анионообменника 0|еп-ЗЮ2 (п=3-5, р=0.95)

Кислота рН после сорбции рК(Н, Иа)

щавелевая 3,11 2,2±0,1

малоновая 3,45 3,5+0,1

янтарная 4,35 3,4+0,1

малеиновая 3,22 2,3+0,3

фумаровая 3,76 | 2,7+0.1

Таблица 2. Коэффициенты катионного обмена рК(Н, при -50%-ной степени протонирования анионообменника 0)'еп-ЗЮ2 (л=3, р=0.95)

Кислота рН после сорбции рК(Н, N3)

малоновая 5,22 4,3+0,3

янтарная 5,30 5,3±0,9

малеиновая 5,20 4,5±0,1

Диапазон значений экспериментально определенных коэффициентов

анионного обмена К(Н,Ыа) соответствует диапазону параметра, ранее

использованного нами при моделировании внутренних градиентов рН в хроматофокусировании.

Сравнение экспериментальных и модельных градиентов рН

Для проверки модели на полуколичественном уровне для ряда систем был1 экспериментально оценены значения коэффициентов ионообменных равновесий входящих в модель (4, 6) и проведены соответствующие расчеты с и: использованием. На рис. 13 приводится пример сравнения экспериментальное (кривая 2) и модельного градиента рН, рассчитанного по нашей модели (кривая 1) Для сравнения приводится профиль градиента рН, рассчитанного по другиг,

1 - модельный градиент рН. СР: 0.025 М Трис-НС1 (рН 7.5, /Маа = 0.002); Элюент: 0.005 М уксусная кислота (рН 3.5, 1Ыаа = 0.005), К(СГ, СНзСОО ) = 0.1; Колонка: модель сорбента Те^еп-ЭЮг.

2 - экспериментальный градиент рН. СР: 0.025 М Трис-НС1 (рН 7.5, /„аС| = 0.002); Элюент: 0.005 М уксусная кислота (рН 3.5, /Ыаа = 0.005), 1 мл/мин; Колонка: Те1геп-ЗЮ2, 250x4.6 мм.

3 - градиент, рассчитанный для данной системы по другим моделям, не учитывающим либо гетерогенность системы (Слайтерман, Мурел), либо полиэлектролитную природу сорбента

Рис. 13. Сравнение профилей расчетного (1) и (фРей)-экспериментального (2) внутренних градиентов рН.

На профиле градиента рН, полученного при пропускании 0,005 М раствора уксусной кислоты через колонку с сорбентом Те^еп-ЗЮг, уравновешенную 0.025 М раствором Трис до рН 7.5, наблюдается увеличение рН на 0.1-0.2 ед. рН. (рис. 13, кривая 2). Затем рН эффлюента плавно снижается до 6.8 за счет ионного обмена хлорида на ацетат (рис. 13, кривая 2). Вторая ступень на профиле градиента в области рН 4.6-4.7 несколько размыта, поскольку в этой области фронты выхода хпорид-иона и ацетат-иона частично перекрываются, кроме того, размыванию второй ступени способствуют полиэлектролитные свойства аминогрупп сорбента и процессы масопереноса в системе.

На профиле расчетного градиента рН можно выделить те же участки -начальный подъем рН до 7.6, плавное уменьшение рН до 6.9, резкий спад до второй ступени (рН 5.3) и далее - плавное уменьшение до рН элюента (рис. 13, кривая 1). Вероятно, различие в форме и положении вторых ступеней связано с недостаточно точным моделированием свойств сорбента и неучетом процессов массопереноса в системе.

описанным в литературе моделям (кривая 3).

Однако, несмотря на некоторое различие между экспериментальным и расчетным градиентами рН, но учитывая большую сложность процессов, протекающих в ситеме, подобное совпадение можно считать хорошим. Кроме того, из рис. видно, что в сравнение с моделями других исследователей (Слайтемана, Мурела, Фрея) наша модель воспроизводит характерные участки на профиле градиента рН (аномальный участок и наличие двух фронтов для однокомпонентной системы), т.е. модель можно вполне успешно использовать для предсказания формы градиента при выборе системы "сорбент - элюент". Более того, точное совпадение форм расчетного и экспериментального градиентов рН в большинстве случаев и не требуется. Наличие на профиле расчетного градиента рН характерных участков и форма градиента в целом уже позволяют экспериментаторам, многие из которых имеют большой практический опыт по формированию внутренних градиентов рН, судить о пригодности или не пригодности для разделения градиента, рассчитанного в заданных хроматографических условиях.

Программное обеспечение

База данных по внутренним градиентам рН. Накопленный большой модельных и экспериментальных внутренних градиентов рН потребовал их систематизации и представления в виде базы данных, позволяющей исследователю быстро подобрать требуемый градиент рН. Учитывая широкое распространение персональных компьютеров на базе операционной системы Windows 95/98/NT с установленным пакетом программ Microsoft Office, для написания базы данных выбрали программу Access97, которая является системой управления реляционными базами данных и входит а стандартный пакет программ Microsoft Office, поддерживающий универсальный язык программирования VBA и позволяющий встраивать таблицы базы данных в Интернет-приложения для предоставления доступа через информационную компьютерную сеть.

На рис. 14 показано главное диалоговое окно базы данных, представляющее собой обычную карточку запроса. Заполнив поля, расположенные в левой части диалогового окна, разбитые на группы параметров, относящихся к условиям эксперимента (свойствам сорбента, составу подвижных фаз, геометрическим параметрам хроматографической колонки), можно провести поиск градиента, сформированного в заданных условиях. Профиль найденного в базе данных градиента рН выводится в правую часть окна. Параметры поиска можно варьировать (например, искать только экспериментальные или только модельные градиенты рН, либо проводить смешанный поиск).

Разработаны также специальные формы (диалоговые окна) для простого и удобного ввода новой информации в базу данных.

Сорбент Стерт, раствор

Элгаент Колонка

История Дополнительно

СЕ

Модельн. Экслеримен. Новые данные

Модельн.*Эксперимен. Закрыть

Скорость поаачиэлюемга (мл/ми*1

Экспериментальные градиенты

Рис. 14. Диалоговое окно "Ззпрос".

В базу данных также интегрированы программы, позволяющие рассчитывать рН и ионную силу смесей кислот, оснований и солей (программа Acid Base Calculator), а также модель формирования внутреннего градиента рН (программа CF). В целом это позволяет в отсутствии в базе данных градиента рН, сформированного в заданных условиях, провести расчет либо всего градиента, либо его отдельных участков при этих условиях.

Программа Acid-Base Calculator.

Aci(J:Basd Calculator

- ~ x

г Indicata-

N

Г Calculation

F рН l-S

X RESET </ ENTER

г Na. О • concentration -

" cNa |

cQ

rV/eak Bases-

Num | nJ>j>\ pKb I c.

rEcfl-

I „ I

»

-Weak Adds -

! N""> | | рКч I с

! - Есй — —

c<

I

r Results -

>>_I ii

--------1 |

pH- |

Ionic Stiength»

Рис. 15. Главное диалоговое окно программы Acid-Base Calculator.

Программа Acid-Base Calculator

предназначена для расчета рН и ионной силы (I) в водных растворах, содержащих смеси кислот, оснований и солей.

На практике современный исследователь, особенно в области биологического анализа, работает со смесями весьма сложного состава с широким диапазоном концентраций компонентов. Для расчета рН 8 сложных смесях часто прибегают к серьезным упрощениям (пренебрежение степенью диссоциации слабых кислот и оснований, упрощение уравнений высокой степени до квадратичных или даже до уравнений первой степени). В этом случае значения рН необходимо находить расчетным путем.

Пример расчета:

"Биологическая буферная смесь" для изоэлектрофокусирования, содержащая ЮмМ MES (рК, 6.4), ЮмМ ACES (рК, 7.3), ЮмМ TES (рК. 7.9), 10мМ Tricine (рКа 8.6), ЮмМ Bicine (рК, 8.74) и 5мМ Таи (рК, 9.7). Число компонентов в смеси = 6 Результат расчета: рН=4.17 Измеренное значение: рН = 4.33

Выводы

1. Разработана физико-химическая и математическая модель формировани внутреннего градиента рН, учитывающая гомогенные и гетерогенны химические равновесия, протекающие в хроматографической системе. Модел описывает все известные из экспериментальных данных характерные участк на профиле градиента рН.

2. Установлены зависимости, связывающие протолитические свойства сорбента на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами с их химическо! природой и полиэлектролитными свойствами.

3. Получены экспериментальные значения отдельных параметров модел! (константы протонирования аминогрупп для сорбентов En-SiC>2, Dien-SiC>2 i Tetren-SiC>2, коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы слабых кисло K(CI,A) и коэффициенты обмена протона на натрий К(Н, Na) на сорбированны: дикарбоновых кислотах).

4. Изучено влияние природы и состава стартового раствора и элюента составленного из простых протолитов, на форму градиента рН. Впервьк показано влияние ионной силы подвижных фаз на форму внутренней фадиента рН.

5. На основание модели впервые объяснено образование так называемы: "аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюент; выше значения рН стартового раствора).

6. Предложены способы получения квази-линейных градиентов рН < использованием простых. элюентов на основе нескольких дешевы) компонентов.

7. Создан пакет программ для операционной системы Windows 9x/NT позволяющий до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых веществ форму градиента рН), что значительно сокращает время и стоимость анализа.

Автор выражает глубокую благодарность д.х.н. П.Н. Нестеренко за помощь в диссертационной работе.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Физико-химическая и математическая модели формирования внутреннего линейного градиента pH в хроматографической колонке. // Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 9. С. 1683-1689.

2. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Расчет внутренних градиентов pH. //Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 10. С. 1872-1876.

3. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Расчет влияния инертных компонентов элюента на градиент pH при хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 11. С. 2054-2059.

4. A.V. Garmash, A.B. Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of internal pH-gradient in chromatofocusíng // Fresenius' J. Anal. Chem. 1998. V. 361. N3. P. 274-275.

5. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, E.B. Курочкина, A.B. Гармаш, П.Н. Нестеренко. Моделирование внутренних градиентов pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1998. Т. 22. С.347-358.

6. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, A.B. Гармаш, П.Н. Нестеренко. Образование аномальных участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т. 23. С.20-23.

7. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента pH в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1999. Т. 73. N 8. С. 1476-1279.

8. A.B. Иванов, А.Б. Тессман. Непрерывный контроль pH эффлюента в хроматографии с градиентом pH. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241-244.

9. A.B. Иванов, А.Б. Тессман, П.Н. Нестеренко. Применение кремнезема с привитыми группами оксипролина для одновременного ионохроматографического определения натрия, хлорида и анионов дикарбоновых кислот. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2000. Т.41. (в печати).

10. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш, В.К. Рунов. Аномальные участки на профиле внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. N6. С.1069-1072.

11. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, М.С. Вакштейн. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента pH в хроматофокусировании: теоретические принципы и экспериментальная проверка. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. (в печати).

12. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. VIII Всесросс. конф. "Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов". Воронеж: ВГУ, 1996. С.8-9.

13. A.V.Garmash, A.B.Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of interna pH-gradient in chromatofocusing. / International Congress on Analytical Chemistry Moscow, 1997. E-19.

14. А.Б. Тессман. Расчет кислотно-основных равновесий с применением компьютерного программирования. / Тез. докл. Международной конференци!* студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-98. М: МГУ

1998. С.6.

15. A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко, А.Б. Тессман, A.B. Гармаш. Формирование внутренних градиентов pH с использованием слабых органических протолитоЕ и аминокислот. / Тез. докл. Всеросс. симп. по теории и практике хроматографии и электрофореза. М.: Научный совет по хроматографии РАН.

1999. С.48.

16. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеукр. конф. по аналитической химии. Ужгород, 1998. С.43.

17. A.B. Иванов, А.Б. Тессман, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Определение коэффициентов катионного обмена на сорбированных дикарбоновых кислотах и их использование при расчетах градиентов pH. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С.107.

18. А.Б.Тессман, А.В.Иванов, П.Н.Нестеренко, A.B.Гармаш. Образование «аномальных» участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С. 108.

19. А.Б.Тессман, А.В.Иванов. Исторические и методологические аспекты автоматизации расчета кислотно-основных равновесий. / Тез. докл. 2-ой Всеросс. конф. по истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) М.: ИОНХРАН, 1999. С.99.

20. А.В.Иванов, П.Н.Нестеренко, А.Б.Тессман. Применение ионообменных свойств кремнезема с привитыми группами пролина и оксипролина в хроматографии. / Тез. докл. VII Всеросс. конф. "Органические реагенты в аналитической химии". Саратов: СарГУ. 1999. С.222.

21. А.В.Иванов, А.Б.Тессман, П.Н.Нестеренко. Хроматографическое определение коэффициентов обмена K(CI, А) на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами. / Тез. докл. Всеросс. конф. "Химический анализ веществ и материалов". М.: РАН, 2000. С.291.

22. А.В.Иванов, А.Б.Тессман, М.С.Вакштейн. Формирование линейных градиентов pH в хроматофокусировании при использовании элюентов простого состава. / Тез. докл. Всеросс. конф. "Химический анализ веществ и материалов". М.: РАН, 2000. С.119.