Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении ионов металлов и биологически важных макромолекул тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Иванов Александр Вадимович

ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ: НОВЫЕ ПОДХОДЫ

В КОНЦЕНТРИРОВАНИИ И РАЗДЕЛЕНИИ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2011 г.

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Нестеренко Павел Николаевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Сердан Анхель Анхелевич

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник

Хамизов Руслан Хажсетович

доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович

Ведущая организация: химический факультет Воронежского государственного университета

Защита состоится " марта 2011 г. в 15 час. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

С авторефератом можно ознакомиться на сайте ВАК России: http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан "2.0 " января 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ьпёлйогека"" 3

2011

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Применение градиентов рН в жидкостной хроматографии давно вызывает интерес, так как позволяет существенно увеличить нагрузочную емкость хроматографической колонки и варьировать селективность и разрешающую способность хроматографической системы в целом. Для создания градиентов рН используют два подхода. Первый, доколоночный или внешний, способ - смешивание двух или нескольких буферных растворов на входе в хроматографическую колонку за счет применения градиентного насоса, системы смесителей или последовательно соединенных камер. Внешние градиенты рН обычно линейны в интервале не более 2-2,5 ед., а оборудование для их формирования отличается усложненным устройством. Второй способ -формирование градиента непосредственно внутри хроматографической колонки за счет кислотно-основных свойств сорбента и полибуферных подвижных фаз. В хроматофокусировании (ХФ) сочетают принципы ионообменной хроматографии, электрофореза и изоэлектрофокусирования и используют линейный внутренний градиент рН для разделения. Метод ХФ, предложенный в 1979-81 гг. Л.Слайтерманом, широко применяют для разделения, препаративного выделения и очистки биологически важных биполярных макромолекул в соответствии с их изоэлектрическими точками (рГ). ХФ - это и техника получения линейного градиента рН внутри предварительно уравновешенной стартовым раствором колонки при последующем пропускании буферного элюента. В качестве "буферирующих" неподвижных фаз используют либо слабоосновные анионообменники с аминогруппами (нисходящие градиенты рН), либо слабокислотные карбоксильные катионообменники (как правило - восходящие градиенты). ХФ обладает рядом достоинств: 1) для формирования внутреннего градиента рН не требуется дополнительное оборудование; 2) можно перевести все функциональные группы сорбента в активную форму при определенном рН и достичь высокой нагрузочной емкости, тем самым- концентрировать и разделять компоненты на одной колонке, что редко достижимо в других вариантах хроматографии; 3) внутренние градиенты линейны в широком интервале до 4-5 и более ед. рН, они хорошо воспроизводимостью (^ < 0,02); 4) для метода характерен фокусирующий эффект.

Однако, у ХФ есть недостатки и ограничения, не позволяющие полностью реализовать высокий потенциал, заложенный в методе. Основное ограничение -необходимость применения синтетических полиамфолитов (полибуферов), в качестве компонентов элюента. Для полибуферов характерны быстрая биодеградация, взаимодействие с разделяемыми компонентами, значительное светопоглощение в используемой для детектирования УФ-области спектра и высокая цена, поэтому актуален поиск более простых подвижных фаз. Применение ХФ ограничено и с позиций сорбентов, и разделяемых компонентов - это разделение только биполярных макромолекул на слабоосновных и слабокислотных ионообменных сорбентах.

В связи с этим ХФ следует развивать и совершенствовать для значительного расширения области применения. Так, традиционно применяемые в ХФ ионообменные сорбенты должны проявлять комплексообразующие свойства по отношению к ионам переходных металлов, что позволяет разработать новый метод сорбционного концентрирования и разделения ионов металлов на одной хроматографической колонке. Внутренние градиенты рН для концентрирования и разделения ионов металлов на комплексообразующих анионо- и катионообменных сорбентах ранее не применяли. Основным и наиболее актуальным направлением исследований представляется поиск простых элюентов, содержащих не более одного-двух компонентов, способных заменить полибуферы. Особенно важен поиск простых элюентов для хроматофокусирования на катионообменных сорбентах с восходящими градиентами рН с целью разделения и концентрирования биполярных биологически важных соединений. Отдельный интерес представляет применение техники ХФ для разделения биполярных молекул, например, пептидов, на сульфокатионитах, не проявляющих буферной емкости. В изократическом варианте ионообменной хроматографии возможно только групповое разделение пептидов - на сильно- и слабоудерживаемые, поэтому внутренние градиенты рН представляются перспективными для решения таких задач. Поиск простых элюентов, формирующих линейный градиент рН и позволяющих регистрировать сигнал пептидов при 214 нм, является важной задачей и при анализе гидролизатов белков.

Работы по применения техники ХФ для концентрирования и разделения ионов металлов на слабоосновных аниониообменных кремнеземах начаты соискателем в 1990 г. под руководством П.Н.Нестеренко1, далее развивались самостоятельно соискателем во всех перечисленных выше аспектах.

Цель н задачи исследования. Цель - развитие и совершенствование метода ХФ: разработка основ нового метода концентрирования и разделения ионов переходных металлов на одной хроматографической комплексообразующей колонке с применением техники хроматофокусирования; поиск закономерностей, связывающих форму градиента рН с параметрами хроматографической системы; выбор простых подвижных фаз вместо полибуферных элюентов для хроматофокусирования биполярных биологически важных соединений; возможность применения техники хроматофокусирования с простыми элюентами для рН-градиентного разделения пептидов, полученных из гидролизата белков. Достижение поставленных целей предусматривало решение следующих задач:

1. Анализ литературных данных по хроматофокусированию биполярных молекул и формулирование основных принципов формирования внутренних градиентов рН и требований к сорбентам, подвижным фазам (стартовым буферным растворам и буферным элюентам), способам детектирования.

2. Изучение протолитических и комплексообразующих свойств: слабоосновных анионообменников - РВЕ-94 (ПБИ-94) на полисахаридной основе с привитыми

1 Отдельные результаты вошли в докторскую диссертацию П.Н.Нестеренко "Высокоэффективная комплексообразовательная хроматография ионов металлов" (М.: МГУ, 1999).

олигоэтиленаминами и синтезированных на основе кремнеземов с привитыми группами пропиламина (АР-ЗЮг), этилендиамина (Еп-БЮг), диэтилентриамина (01еп-5Ю2), тетраэтиленпентамина (ТеЦ-еп-ЯЮг); слабокислотных катионообменников - СМ-52 (целлюлозаы с карбоксиметильными группами), МасгоРгер 50 СМ и Ольвагель-СООН (полиметилметакрилат с карбоксиметильными и карбоксильными группами), сверхсшитого полистирола МЫ с карбоксильными группами. Выбор условий селективного и максимального извлечения ионов металлов в фазу сорбента в статических условиях.

3. Разработка способов формирования внутренних нисходящих градиентов рН внутри анионо- и катионообменных колонок при использовании техники "классического" хроматофокусирования и техники индуцирования. Возможность концентрирования и разделения ионов переходных металлов при использовании внутренних градиентов рН.

4. Изучение влияния на профиль внутренних градиентов рН состава, концентрации и ионной силы подвижных фаз с целью получения линейных или квазилинейных градиентов в широком диапазоне рН. Изучение буферных и комплексообразующих свойств и электропроводности стартовых буферных растворов и полиамфолитного элюента "Ро1уЬиЯег-74" ("Полибуфер-74"); смесей протолитов и амфолитов как возможных буферных элюентов для формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании.

5. Физико-химическое моделирование формирования внутренних градиентов рН в динамических ионообменных системах; построение модели, учитывающей гомогенные и гетерогенные химические равновесия в хроматографической системе и описывающей все основные особенности профиля градиента рН; проверка адекватности разработанной модели. Выбор оптимальных сорбентов и подвижных фаз на основе предложенной модели.

6. Поиск и применение простых подвижных фаз, содержащих сильные электролиты (ИаС1), для разделения биполярных соединений в условиях линейного или квазилинейного градиента рН в анионообменных и катионообменных системах.

7. Применение техники хроматофокусирования для формирования линейных градиентов рН на сульфокатионитах - сорбентах, не обладающих буферными свойствами. Хроматофокусирование смесей пептидов на сульфокатионитах с использованием простых низкомолекулярных элюентов.

Научная новизна. Предложен новый метод концентрирования и разделения переходных металлов на одной хроматографической колонке с формированием внутреннего градиента рН - хроматофокусирование переходных металлов. Сформулированы основные принципы метода и требования к сорбентам, подвижным фазам и способам детектирования. Предложены кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами Еп-БЮг, 01еп-8Юг и Тей-еп-ЗЮг в качестве новых сорбентов для хроматофокусирования. Разделены ионы переходных металлов на анионо- и

катионообменных сорбентах полиамфолитным элюентом "Полибуфер-74" с применением техники ХФ.

Предложено использовать технику индуцирования для формирования нисходящих градиентов рН внутри анионо- и катионообменных колонок. Исследовано влияние природы и состава подвижный фазы и индуцирующего раствора на профиль градиентов рН. Выбраны новые индуцирующие растворы и простые элюенты. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения модельных смесей переходных металлов в условиях индуцированного нисходящего градиента рН.

Найдены основные закономерности формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании и требования к сорбентам и составу подвижных фаз стартового раствора и элюента. Создана физико-химическая модель формирования нисходящих внутренних градиентов рН, учитывающая ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе при использовании смеси простых протолитов в качестве элюента, а также полиэлектролитные и полифункциональные свойства сорбента. Модель описывает все известные из экспериментальных данных особенности профиля градиента рН.

Разработаны подходы, позволяющие варьировать профиль градиента рН в широких пределах в зависимости от целей анализа. Ионная сила подвижных фаз существенно влияет на процессы внутри ионообменной колонки, особенно - на протолитические равновесия, что позволяет управлять формой градиента. Получены нисходящие градиенты рН внутри катионообменных карбоксильных колонок при использовании техники хроматофокусирования. Предложены простые одно-двухкомпонентные элюенты, которые в сочетании с варьированием ионной силы могут успешно заменить дорогостоящие коммерческие полиамфолитные буферные растворы в методе ХФ. Модельные смеси белков разделены методом хроматофокусирования при использовании двухкомпонентного элюента в сочетании с градиентом ионной силы.

Сформулировано новое направление в хроматофокусировании - для разделения пептидов на сильных катионообменниках (сульфокатионитах). Достигнуто разделение гидролизата белков (9-15 пептидов) в условиях восходящего градиента рН, сформированного простым двухкомпонентным элюентом. При хроматофокусировании пептидов значительно улучшены условия детектирования за счет замены традиционно используемых полиамфолитных буферных элюентов простыми смесями низкомолекулярных протолитов.

Практическая значимость работы. Найдены условия количественной сорбции переходных металлов на комплексообразующих анионитах РВЕ-94, Еп-БЮг, 01еп-5Ю2 и Те1геп-5Ю2 и катионитах СМ-52, МасгоРгер 50 СМ, Ольвагель-СООН и М1Ч. Коэффициенты концентрирования переходных металлов составляют от 70-120 до 400-600 и выше. Сорбенты на основе кремнеземов с привитыми олигоэтиленаминами и на основе карбоксилированных полиметилметакрилата и сверхсшитого полистирола пригодны в высокоэффективном варианте хроматофокусирования. Как оптимальные сорбенты для ХФ выбраны ТеЦ-еп-БЮг, МасгоРгер 50 СМ и ММ. Показана возможность

концентрирования и разделения переходных металлов с использованием техники хроматофокусирования. Разработана методика фотометрического послеколоночного детектирования переходных металлов по реакции с 4-(2-пиридилазо)резорцином в условиях градиентного элюирования.

Предложены рекомендации по формированию линейных и квазилинейных нисходящих градиентов рН на новом для ХФ типе сорбентов - карбоксильных катионообменниках. Подобраны условия замены дорогостоящих, обладающих рядом недостатков, коммерческих полиамфолитных "Полибуферов", простыми одно-двухкомпонентными элюентами для формирования градиентов рН внутри анионо- и катионообменных колонок. Сформулированы практические рекомендации по управлению формой градиента рН изменением ионной силы подвижных фаз в анионо- и катионообменных системах. В качестве компонентов для простых буферных элюентов рекомендованы щавелевая, лимонная кислоты и низшие аминокислоты - гистидин, 6-аминогексановая и глутаминовая кислоты, в сочетании с добавками №С1 в качестве сильного электролита. Подобные элюенты просты в приготовлении, значительно дешевле коммерческих полиамфолитных буферов и позволяют детектировать разделяемые компоненты в УФ-области. Показано применение простых элюентов для ХФ на примере разделения изоформ плазминогена, формиатдегидрогеназы и модельных смесей аминокислот и альбуминов. Разрешение пиков сравнимо с достигнутым при использовании коммерческого "Полибуфера" (0,05 -0,10 ед. рН).

Показана принципиальная возможность использования техники индуцирования и техники "классического" хроматофокусирования для разделения переходных металлов на анионообменных сорбентах с привитыми олигоэтиленаминами и катионообменных карбоксильных сорбентах с детектированием в УФ-области.

При хроматофокусировании смесей пептидов предложен подход, позволяющий проводить детектирование при коротких длинах волн (214 нм), что значительно расширяет число регистрируемых соединений в трипсиновом гидролизате белков.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения кислотно-основных и комплексообразующих свойств анионообменных сорбентов РВЕ-94, АР-БЮг, Еп-8Юг, 01еп-8Юг и Те^еп-БЮг и катионообменных сорбентов СМ-52, Ольвагель-СООН, МасгоРгер 50 СМ и М>}.

2. Применение техники индуцирования и техники "классического" хроматофокусирования для разделения модельных смесей переходных металлов на комплексообразующих слабоосновных анионообменных и слабокислотных катионообменных сорбентах. Применение карбоксильных катионообменных сорбентов в хроматофокусировании для формирования нисходящих и восходящих градиентов рН.

3. Формирование внутренних градиентов рН при использовании смесей протолитов и амфолитов в качестве буферных элюентов. Результаты изучения влияния природы, концентрации и числа рН-определяющих компонентов подвижных фаз на профиль внутренних градиентов рН. Результаты изучения влияния ионной силы

подвижных фаз на профиль внутренних градиентов рН, формируемых в анионо- и катионообменных системах с использованием техники "классического" хроматофокусирования и индуцирования.

4. Физико-химическая модель формирования нисходящих внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси простых протолитов в качестве элюента, учитывающая кислотно-основные и ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитную и полифункциональную природу анионообменного сорбента. Результаты моделирования внутренних градиентов рН и их сравнение с экспериментальными данными. Найденные закономерности, связывающие форму градиента с параметрами хроматографической системы.

5. Способы получения линейных и квазилинейных градиентов рН с простыми низкомолекулярными одно-двухкомпонентными элюентами вместо полиамфолитных "Пол »буферов". Практические аспекты использования простых элюентов внутри слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонок. Данные по разделению переходных металлов, белков, ферментов, аминокислот, плазминогенов методом хроматофокусирования при создании градиента рН простыми подвижными фазами.

6. Данные по формированию плавных линейных градиентов простыми подвижными фазами на сорбентах, не обладающих буферными свойствами -сульфокатионообменных. Способ разделения трипсинового гидролизата альбуминов при одновременном формировании градиентов рН и ионной силы внутри колонки, позволяющий проводить детектирование при 214 нм.

Апробация работы. Работа частично выполнена в рамках научных проектов: программы Международного фонда Д. Сороса и Правительства России (проекты № MHR300 и MHR000, "Chromatofocusing of transition metals", 1994-1996 гг.); программы университета им. Т.-Г. Масарика (Брно, Чехия) и АН Чехии (1994-1995 гг.; индивидуальный грант № 94/06-36 для иностранных специалистов); ИНТАС (проект № 00-00782, "Fundamental research into the hydrodynamics and efficiency of counter-current chromatography", 2001-2003 гг.); Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 02-03-33007 - "Природа взаимодействий катионов щелочных и щелочноземельных металлов с карбоксильными катионообменниками" (2002 - 2003 гг.), 02-03-33171 -"Развитие теоретических основ цветометрии растворов и сорбатов хелатов как нового метода аналитической химии" (2002 - 2004 гг.), 04-03-32866 - "Новые псевдостационарные фазы на основе водорастворимых полиэлектролитных комплексов для капиллярного электрофореза" (2004 — 2006 гг.), 04-03-33000 — "Монолитные пористые стержни и диски как высокопроизводительные и эффективные сорбционные среды в жидкостной хроматографии" (2004—2006 гг.), 05-03-33096 - "Новые возможности хроматографического разделения ионов металлов и аминокислот при формировании градиентов рН внутри карбоксильных колонок" (2005 — 2007 гг.).

Основные результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на VII Всесоюзной конференции "Применение ионообменных материалов в

промышленности и аналитической химии" (Воронеж, 1991); Международных симпозиумах по ионной хроматографии IICS-92, -93, -94, -2000, -2004 (Австрия, Линц, 1992; США, Балтимор, 1993; Италия, Турин, 1994; Франция, Ницца, 2000; Германия, Трир, 2004); VIII Всероссийской конференции "Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов" ("Иониты-96", Воронеж, 1996); Международной конференции молодых ученых "Ломоносов-96" (Москва, 1996); Международном конгрессе по аналитической химии ICAC-97 (Москва, 1997); XVI, XVII и XVni Международных Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998; Казань, 2003; Москва, 2007); Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998); Всеукраинской конференции по аналитической химии (Ужгород, 1998); II Всероссийской конференции по истории и методологии аналитической химии ИМАХ-2 (Москва, 1999); Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии SCAC-99 (Москва, 1999); ХЗХ Всероссийском Чугаевском совещании по химии комплексных соединений (Иваново, 1999); VII Всероссийской конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999); Поволжской региональной конференции "Физико-химические методы в координационной и аналитической химии" (Казань, 1999); Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000); VI, VII и VIII конференциях "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2000 и 2004; Томск, 2008); VIII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001), Международной научной конференции "Концентрирование в аналитической химии" (Астрахань, 2001); Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии", посвященном 100-летию К.В.Чмутова (Москва, 2002); Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии", посвященном юбилею Ю.А.Золотова (Краснодар, 2002); 3-м Международном симпозиуме по разделению в бионауках (SBS-03) "100 лет хроматографии" (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". (Саратов, 2003); X Международной конференции "Разделение ионных соединений" (SIS'03) (Словакия, Высокие Татры, Подбаньске, 2003); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" (Москва, 2004); Международном симпозиуме по компьютерным приложениям и хемометрике в аналитической химии (SCAC-2004) (Венгрия, Вешпрем, оз. Балатон, 2004); конференции "Ломоносовские чтения-2005" (Москва, МГУ, 2005); Международной конференции "Analytical Chemisüy and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (Украина, Киев, 2005); II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 2005); X Международной конференции "Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии" (Москва, 2006); Международном конгрессе по аналитическим наукам (ICAS'06) (Москва, РАН, 2006); Всероссийском симпозиуме "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" (Москва,

2007); II Всероссийской конференции "Аналитика России-2007" (Краснодар, 2007); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия" (Москва,

2008); Юбилейной конференции к 80-летию Химического факультета МГУ "Химия и общество. Грани взаимодействия: вчера, сегодня, завтра" (Москва, 2009); Съезде аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, 2010); Московском семинаре по аналитической химии (Москва, ГЕОХИ РАН, 1994); научных семинарах по аналитической химии университета им. Т.Г.Масарика и Института аналитической и прикладной химии Чешской АН (Чехия, Брно, 1994-1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 обзора, 55 статей и более 60 тезисов докладов.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоит в формировании основных направлений, общей постановке проблем, экспериментальном решении конкретных задач, творческом участии на всех этапах выполнения работы, в обсуждении, интерпретации и оформлении полученных результатов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и девяти глав с обсуждением результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 335 страницах машинописного текста, включает 136 рисунков, 9 схем и 49 таблиц. Список литературы содержит 388 работ зарубежных и отечественных авторов.

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность направлений развития хроматофокусирования, особенно - поиска новых простых элюентов для замены полибуферов. Сформулированы основные цели и задачи исследования, положения, выносимые на защиту; кратко охарактеризованы новые научные результаты, полученные диссертантом. Первая глава содержит критический анализ подходов к формированию градиентов рН. Рассмотрены области применения градиентов рН в различных вариантах жидкостной хроматографии Особое внимание уделено хроматофокусированию как технике создания внутренних градиентов и хроматографическому методу, основанному на использовании рН-градиентного элюирования. Критически рассмотрены существующие модельные представления о формировании градиентов в ионообменных системах; проведен обзор сорбентов, стартовых растворов и буферных элюентов для ХФ. На основании обзора сформулированы дальнейшие перспективы метода ХФ. Вторая глава содержит описание использованных в работе методик, реагентов, растворов, характеристики сорбентов. Третья глава посвящена изучению свойств слабоосновных анионитов с привитыми олигоэтиленаминами и оценке их применимости в качестве комплексообразующих сорбентов для разделения ионов металлов с помощью техники ХФ. В четвертой главе рассмотрено применение комплексообразующих карбоксильных сорбентов в хроматофокусировании ионов металлов. В пятой главе рассмотрена техника индуцирования нисходящих градиентов рН внутри анионо- и катионообменных колонок,

влияние параметров подвижных фаз и сорбентов на профиль градиента рН и применение индуцированных градиентов для разделения ионов металлов. Шестая глава содержит описание разработанной физико-химической модели формирования градиентов рН внутри слабоосновных анионообменных колонок и анализ влияния параметров модели на профиль нисходящих градиентов рН. Проведено сравнение предложенной модели с уже существующими, рассмотрены преимущества и ограничения подхода. Седьмая глава посвящена поиску простых элюентов для формирования нисходящих градиентов рН внутри анионообменных колонок; особое внимание уделено влиянию ионной силы стартового раствора и элюента как параметрам, позволяющим оптимизировать профиль градиента рН. В восьмой главе приведены примеры практического применения простых элюентов в хроматофокусировании биполярных веществ (аминокислот и ферментов) и ионов металлов. В девятой главе рассмотрено формирование нисходящих градиентов рН полибуферами и простыми элюентами в слабокислотных катионообменных системах; возможности простых элюентов показаны на примере разделения ионов переходных металлов с помощью техники ХФ. Десятая глава посвящена поиску простых подвижных фаз для формирования восходящих градиентов в колонках с карбоксильными сорбентами. Показаны преимущества элюентов, содержащих 1-2 компонента, по сравнению с полибуферами, в хроматофокусировании биполярных макромолекул - белков и ферментов в условиях восходящих градиентов рН. В одиннадцатой главе впервые предложено использовать технику ХФ для формирования восходящих градиентов рН простыми подвижными фазами на сильнокислотных катионообменных сорбентах. Подход применен для хроматофокусирования пептидов на сульфокатионитах.

Предпосылки к созданию нового метода концентрирования и разделения -хроматофокусирования на комплексообразующих сорбентах

Сорбенты, модифицированные группами первичных и вторичных аминов, нашли применение в аналитической практике к началу 1980-ых гг., и с тех пор область их использования продолжает расширяться, главным образом - для предварительного концентрирования. Они проявляют как комплексообразующие свойства по отношению к ионам переходных металлов, так и ионообменные свойства по отношению к анионным комплексам металлов. Полибуфер-ионообменники РВЕ-94 или РВЕ-118, широко применяемые в качестве анионитов в хроматофокусировании для разделения белков и других биполярных макромолекул, содержат на поверхности Сефарозы-бВ первичные, вторичные и, вероятно, третичные аминогруппы (предположительно - триэтилентетрамин, тетраэтиленпентамин и пентаэтиленгексамин), и тем самым можно уверенно отнести эти сорбенты к комплексообразующим. Привитые аминогруппы с различными значениями равномерно распределенными в широком интервале рН (4 - 9), позволяют создать линейный плавный градиент в указанном диапазоне рН при пропускании через хроматографическую колонку буферного элюента с рН в слабокислой области. Это создает предпосылки для разработки нового направления - хроматофокусирования ионов

металлов, или комплексообразовательной хроматографии с внутренним градиентом рН. Ранее комплексообразующие свойства ионообменных полибуферных сорбентов для хроматофокусирования не изучали. Предложенные на химическом факультете МГУ комплексообразующие сорбенты Еп-БЮг, 01еп-8Ю2 и Те1геп-8Ю2 на основе кремнезема Силохром С-120 с привитыми группами этилендиамина, диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина во многом схожи с РВЕ-94, обладают буферной емкостью в широком интервале рН, т.е. их можно использовать в качестве неподвижной фазы при создании линейного градиента рН в хроматофокусировании. Использование сорбентов Еп-ЯЮг, 01еп-8Ю2 или Тйгеп-ЗЮг может оказаться более предпочтительным по сравнению с РВЕ-94 благодаря свойствам кремнеземной матрицы. Свойства анионитов приведены в табл. 1.

Таблица 1. Анионообменные сорбенты, применявшиеся в эксперименте.

Сорбент РВЕ-94 En-Si02 Dien-Si02 Tetren-Si02 AP-Si02

Матрица полисахарвд (Сефароза) Силохром С-120 Силохром С-120 Силохром С-120 Silasorb Si-600 Lichro-sorb

Функцио- "N112 (?) этилен- диэтилен- тетраэтилен- тетраэтилен пропил-

нальные (не указаны) диамин триамин пентамин -пентамин амин

группы (En-, EDA-) (Dien-, DETA-) (Tetren-, ТЕРА-) (Tetren-, ТЕРА-) (АР-)

Размер 45-165 100-160 100-160 100-160 7,5 100-120

частиц

(мкм)

рН- 2- 12 1 - 8 1-8 1-8 1 -8 1-8

диапазон*

Ионообм. 0,32 ммоль/мл 0,10 0,12 0,35 -1,0 0,16

емкость геля ** ммоль/г *'1'* ммоль/г ммоль/г ммоль/г ммоль/г

Примечания: * - рН-диапазон гидролитической стабильности матрицы; ** - по данным производителя

*** - емкость по ионам Си2+, найденная экспериментально.

При кислотно-основном потенциометрическом титровании кремнеземов с привитыми олигоэтиленаминами наиболее плавное изменение рН наблюдали на кривой титрования ТеЬ-еп-БЮг, что объясняется равномерным распределением констант ионизации аминогрупп в составе тетраэтиленпентамина в широком интервале рН (табл. 2). При закреплении аминосодержащих групп на поверхности кремнезема их константы протоннрования уменьшаются за счет взаимодействия с силанольными группами, причем этот эффект усиливается в случае закрепления олигоэтиленаминов за две концевые аминогруппы, что также делает более плавным изменение рН при титровании таких сорбентов за счет расширения диапазона констант протоннрования аминогрупп. Плавному изменению рН в интервале 4-9 способствуют также неоднородность поверхности и кислотно-основные взаимодействия привитых аминогрупп и остаточных силанольных групп. Изменение ионной силы от 0,01 до 1 практически не меняет вид кривой кислотно-основного титрования Те1геп-8Ю2 и Э^п-БЮг, а, следовательно, буферная емкость остается постоянной в том же интервале рН, однако при ионной силе 1 изменение рН в слое сорбента более плавно. Согласно проявляемым кислотно-основным

свойствам и буферирующей способности Тей-еп-8Ю2 и 01еп-ЗЮ2 наиболее подходят из изученных сорбентов для создания внутриколоночного градиента рН в интервале от 7,0 -7,5 до 3,0 с применением техники хроматофокусированш.

Сорбционную емкость комплексообразующих сорбентов по ионам металлов определяли в статическом варианте, как более простом в выполнении и не требующем специального лабораторного оборудования. В качестве объекта исследования выбрали медь(И), поскольку ее ионы лабильны по отношению к аминосодержащим группам сорбентов, причем атомы кислорода в составе остаточных силанольных групп на поверхности сорбента не должны вносить вклад в комплексообразование, поскольку медь предпочтительно координирует по азоту, а не по кислороду. Для установления равновесия между раствором и фазой сорбента время встряхивания ггробирки составляло 30 - 40 мин, после чего определяли равновесную концентрацию меди(П) в растворе по реакции с ПАР. Сорбционная емкость по ионам меди(Н), определенная в статическом режиме, составляет 0,10 ммоль/г, 0,12 ммоль/г и 0,35 ммоль/г сорбента при рН 7,0 - 7,5 для Еп-БЮг, 01еп-5Ю2 и Те^еп-ЗЮг соответственно. Для кремнезема с иммобилизованным пропиламином (где содержатся только первичные аминогруппы) наблюдается увеличение сорбционной емкости по меди(И) до 0,16 ммоль/г. В случае ТеЦеп-ЗЮо, даже если молекулы тетраэтиленпентамина закрепляются на поверхности модифицированного кремнезема за две концевые группы, сорбционная емкость по меди(П) все равно достаточно высока благодаря присутствию пяги аминогрупп в составе одной иммобилизованной группы ТеЬ"еп. РВЕ-94 также обладает высокой сорбционной емкостью 0,45 ммоль/г при рН 7,0 -8,0. При сорбции меди(Ц) наблюдали окрашивание всех изученных сорбентов в ярко-синий цвет, наиболее интенсивный для ТеЬгеп-5Ю2 и РВЕ-94, что служит косвенным подтверждением сорбции ионов меди(Ц) по механизму комплексообразования с аминогруппами на поверхности изученных полибуфер-ионообменных сорбентов.

Таблица 2. Протолитические характеристики (^ Кр) свободных и привитых

Амины «8 ^ А'р5

Пропил амин 10,7 - - - -

Этилендиамин 10,1 7,0 - - -

И-метилзти ленд нам и н 10,0 6,8 - - -

Ы-пропил этилендиамин 10,3 7,5 - - -

Ы.Ы'-диметилэтилендиамин 9,8 7,0 - - -

Д иэтилентриам и н 9,9 9,1 4,3 - -

Ы-метилдиэтилентриамин 9,9 9,1 3,3 - -

Триэтилентетрамин 9,9 9,2 6,7 3,3 -

Тетраэтиленпентамин 9,9 9,1 7,9 4,3 2,7

Пропиламин* 7,60 - - - -

Этиленд нами н * 7,7 6,2 - - -

Примечание: * - лиганды ковалентно закреплены на поверхности кремнезёма. Другой важной характеристикой сорбентов является время установления сорбционного равновесия ("кинетика" сорбции ионов металлов). В качестве модельного металла выбрали медь(П), как кинетически лабильный ион. Кинетика сорбции меди(Л) на

РВЕ-94 зависит от рН среды; даже незначительное увеличение рН до 7,9 - 8,0 снижает время количественной сорбции меди(П) до 7 - 8 мин по сравнению с 13 - 15 мин при рН 7,5, по-видимому, вследствие более полного перехода комплексообразующих групп сорбента РВЕ-94 в координационно-активную форму. Для химически модифицированных кремнеземов увеличение рН среды практически не влияет на кинетику сорбции, поскольку при рН 7,5 количественная сорбция меди(Н) для сорбентов с привитыми олигоэтиленаминами достигается в течение 5-7 мин при комнатной температуре. Изучили кинетику сорбции меди(П) на Те^еп-ЗЮг на основе кремнезема Силасорб 81-600 (диаметр частиц 7,5 мкм, удельная поверхность 600 м2/г) при рН 7,5, поскольку этот сорбент в дальнейшем предполагалось использовать в качестве неподвижной фазы при разделении ионов переходных металлов в хроматографическнх системах с высоким рабочим давлением. Время количественной сорбции снижается при этом до 2 - 2,5 мин по сравнению с 5 - 7 мин на сорбенте на основе Силохрома С-120. Такая кинетика комплексообразования на поверхности аминосодержащих сорбентов удовлетворительна для их использования в жидкостной хроматографии.

Сорбцию меди(Н), кобальта(П), никеля(Н), кадмия(П), цинка(И) и железа(Ш) изучали в статическом режиме при рН раствора 7,5 - 8,0, а марганца(11) на Те1геп-8Ю2 при рН 8,0 - 8,5 (18 - 20° С, время контакта фаз 30 мин). Для контроля распределения металла между сорбентом и раствором использовали ПАР - высокочувствительный, водорастворимый и доступный реагент. Реакции ПАР с ионами металлов контрастны, а комплексы настолько устойчивы, что для количественного образования комплексов достаточно небольшого избытка ПАР. Оптимальное значение рН 9,18 (0,05 М боратный буферный раствор) для проведения реакции и положение максимума светопоглощения для комплексов всех изученных металлов примерно совпали.

Для всех изученных сорбентов наблюдали увеличение сорбции переходных металлов с увеличением рН среды. Сорбция максимальна в нейтральной среде, а для марганца на сорбенте Те1:геп-5Ю2 - при рН > 8; при этом возможно частичное растворение матрицы сорбента. Для железа(Ш) на сорбентах РВЕ-94, Б1еп-8Ю2 и Те^еп-ЗЮг наблюдали снижение сорбции при рН > 6 (рис. 1), что, вероятно, можно объяснить образованием гидроксокомплексов железа(Ш) уже при рН > 1,5 - 2,5. Исследование показало недостаточную избирательность РВЕ-94 по отношению к изученным металлам -значения рН, соответствующие 50%-ной сорбции, лежат в узком интервале рН от 4,0 до 4,9 (табл. 3). Порядок десорбции переходных металлов на сорбентах Еп-8Юг, В1еп-8Юг, Те1геп-8Ю2 в целом согласуется с константами устойчивости комплексов переходных металлов со свободными олигоэтиленаминами. Полученные результаты позволяют сделать предположение о роли полисахаридной матрицы в сорбции ионов металлов на РВЕ-94. Значение рН, соответствующее 50%-ной сорбции меди(Н), выше, чем для остальных изученных металлов, особенно цинка(Н) и кадмия(П), и свидетельствует об относительно невысокой устойчивости адсорбционных комплексов меди(П) с привитыми группами РВЕ-94. Наиболее устойчивые адсорбционные комплексы образуют цинк(П) и

кадмий(Н), которые, вероятно, предпочтительнее координируются по кислородсодержащим группам полисахаридной матрицы, чем по привитым аминогруппам.

Сорбция, %

а 100 во

60

N1 <0

са /^у 20

0

Сорбция, %

/ в

Си /

Со//

рн

рн

Сорбция, %

си / у

/ Со У /У

/ гмг

У N1

Сорбция, %

Ув г

'З-З» /

Си/ /

/

/мп

7 РН

Сорбция, %

д

Си/ Ч / 29У /

/ //СО /

/ / Сё Мп/

{^г Ч

7 РН

Рис. 1. Зависимость сорбции переходных металлов на сорбентах: РВЕ-94 (а), АР-БЮг (б), Еп-БЮг (в), 01еп-5Ю2 (г), Те1геп-ЗЮ2 (<)) от рН. Объем водной фазы 10 мл; масса сорбента 0,20 г; сме - 10"4 М; время контакта фаз 20-30 мин.

2 3 < 5 в 7 в рН

Те1геп-8Ю2 обладает большей избирательностью по отношению к переходным

металлам, чем другие сорбенты на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами и пропиламином: значения рН 50%-ной сорбции металлов лежат в более широком интервале (табл. 3). Комплексообразующие свойства сорбентов Еп-БЮг и ТеЬгеп-БЮг, полученных закреплением по эпоксигруппе, по отношению к некоторым переходным металлам отличаются от свойств подобных сорбентов, полученных ранее замещением по С1-группе (литературные данные). Существенное снижение значений рН 50%-ной сорбции кобальта(П) и никеля(И) свидетельствует о большей устойчивости их комплексов, образующихся на поверхности Еп-БЮг и Те1геп-8Ю2, полученных закреплением по эпоксигруппе. На поверхности 05еп-8Ю2 никель(Н) образует наиболее устойчивые комплексы по сравнению с другими металлами. При модифицировании

кремнезема по эпоксигруппе на поверхности сорбента есть и атомы кислорода, что при их определенном расположении, вероятно, повлияет на увеличение сорбционной емкости и селективности по отношению к никелю и кобальту, поскольку в этом случае данные переходные металлы будут удерживаться не только за счет комплексообразования с вторичными аминогруппами, но и за счет взаимодействия с атомами кислорода гидроксильных групп в составе привитых молекул З-глицидоксипропилтриэтоксисилана.

Таблица 3. Значения рН 50%-ной сорбции переходных металлов на РВЕ-94 и на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами и пропиламином._

Ион металла РВЕ-94 АР-5Ю2 Еп-БЮг 0|еп-8!02 Те^еп-БЮ*

- 1 1 2 2 1 2

Си(П) 4,9 6,2 4,6 4,5 6,6 3,3 3,5

Со(И) 4,6 7,0 6,2 5,1 5,4 5,7 5,0

гп(Л) 4,0 7,3 5,9 5,4 4,9 4,9 4,7

N¡(11) 4,3 - 6,4 5,6 4,7 6,4 4,4

Мп(11) - - 9,4 - 7,5 7,4 7,5

Ре(Ш) 4,7 - 4,0 4,2 4,5 - 4,3

Сс1(И) 4,2 - 6,7 5,6 5,5 - 5,7

Примечание: I - привитые олигоэтиленамины закреплены по С1-группе

2 - привитые олигоэтиленамины закреплены по эпоксигруппе.

Таким образом, сравнение кислотно-основных, комплексообразующих свойств сорбентов на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами и полибуфер-ионообменника РВЕ-94 показывает, что для концентрирования и последующего разделения переходных металлов с применением техники хроматофокусирования наиболее подходящими являются ТеЦ-еп-БЮг и, возможно, 01еп-5Ю2. В хроматографических системах с низким рабочим давлением можно использовать и выпускаемый промышленностью РВЕ-94.

Разделение переходных металлов с использованием техники хроматофокусирования. При использовании техники хроматофокусирования на РВЕ-94 возможно создание линейного градиента в интервале рН от 9 до 4, однако рекомендуемый для создания градиента коммерческий полиамфолитный элюент Полибуфер-74 ограничивает диапазон градиента рН до 3 - 4 единиц. С учетом зависимости сорбции переходных металлов от кислотности среды (рис. 1; табл. 3) в качестве стартового буферного раствора (СР) выбрали 0,025 М раствор Трис-НС1 (рН 7,5), а в качестве элюента (Э) - 1:8 Полибуфер-74 (рН 3,3 - 3,5), что позволяет обеспечить количественную сорбцию металлов на РВЕ-94 (при рН > 7) и сформировать градиент рН, линейный от 7,5 до 3,3. В системе низкого давления эффлюент собирали в коллекторе фракций, измеряли рН в каждой фракции и строили выходную кривую рН; оптическую плотность фракций измеряли после реакции с ПАР, при этом Полибуфер-74 не мешает количественному протеканию реакции. Сорбент РВЕ-94 обладает невысокой селективностью по отношению к изученным переходным металлам: значения рН, соответствующие 50%-ной сорбции, находятся в узком интервале от 4 до 4,9; тем не менее, в выбранных условиях удалось разделить модельную смесь ионов металлов. Для идентификации хроматографических

пиков в соответствующих фракциях проводили качественные реакции на Си(П), Со(Н), Сг(Ш) и №(11). На хроматограмме (рис. 2, а), пики Си(Н), Со(Н) и N¡(11) имеют примерно одинаковую ширину и достаточно симметричны, что говорит об обратимости и удовлетворительной кинетике сорбции переходных металлов в выбранных условиях разделения, а также подтверждает для комплексообразующих систем наличие фокусирующего эффекта, характерного для "классического" хроматофокусирования. Пик хрома(Ш) размыт, вероятно, вследствие кинетической инертности комплексов хрома. Разрешение хроматографических пиков составило: для пары Со27Си2+ 0,80, для пары №2+/Сг(Ш) - 0,65. Пики Со2+ и Сг(Ш) разделены продолжительным участком базовой линии. Порядок элюирования металлов согласуется с рядом устойчивости поверхностных комплексов на РВЕ-94, вместе с тем заметно различие между значениями рН 50%-ной сорбции и рН элюирования переходных металлов из колонки - практически во всех случаях ионы металлов элюируются раньше, чем достигается рН 50%-ной сорбции; это может объясняться конкурирующим комплексообразованием с Полибуфером-74. Другой пример - разделение модельной смеси Си(Н), Со(Н), Сс1(Н) и N¡(11) в тех же условиях (рис. 2, б). Все хроматографические пики имели примерно одинаковую форму и ширину; пики Со2+, Сс12+ и №2+ разделены до базовой линии; разрешение пары Со2+/Си2+, как и в предыдущем случае, равно 0,80. Значения рН, соответствующие максимумам пиков, при повторных экспериментах варьировались в пределах не более 0,05 ед. рН.

Рис. 2. Применение техники "классического" хроматофокусирования для разделения модельных смесей ионов металлов. Колонка 300x9 мм, РВЕ-94. СР: 0,025 М Трис-НС1 (рН 7,50), Э: 1:8 Полибуфер-74 (рН 3,45), 1 мл/мин. 1 - градиент рН, 2 - хроматограмма смеси.

Те1хеп-8Ю2 обладает более высокой селективностью по отношению к изученным переходным металлам, что позволяет разделять на этом сорбенте более сложные по составу смеси, чем на РВЕ-94. В аналогичных условиях формирования линейного градиента рН разделена модельная смесь Мп(П), С<1(П), 2п(П), N¡(11) и Си(Н), содержащая по 1,5-10'3 М каждого из компонентов (рис. 3). Порядок элюирования переходных металлов из колонки соответствует устойчивости комплексов. Как и в случае РВЕ-94, пики металлов на хроматограмме имели симметричную форму и примерно одинаковую ширину, что также подтверждает удовлетворительную кинетику, обратимость сорбции и наличие фокусирующего эффекта. Хроматографические пики попарно разделяются до

базовой линии: Л, для пар Сс127Мп2+ равно 1,3, Ъп1+1С&2+ - 1,75, №2+^п2+ - 1,9, Си2+М2+ -2,2. Проверена возможность концентрирования переходных металлов на сорбенте Те(геп-5102 при пропускании через колонку модельных смесей ионов металлов, содержащих 10*4 - 10"5 М каждого из ионов, при рН 7,0 - 7,5. В нейтральной и слабокислой средах хроматографическая колонка может быть практически полностью насыщена переходными металлами. При последующем пропускании 1:8 раствора Полибуфера-74 через такую колонку получили хроматограмму, аналогичную приведенной на рис. 3. При рН, соответствующем максимальной сорбции данного металла из раствора, найдены коэффициенты концентрирования Л"конц (табл. 4).

Таблица 4. Коэффициенты концентрирования ионов переходных металлов с применением техники хромагофокусирования (в статических условиях)._

Сорбент Лияц'Ю

Со Си Ni1+ Zn Fe^ Mn2+ Cd2+

РВЕ-94 7,8 4,5 6,3 1,8 1,1 - 0,7

En-Si02 0,8 0,3 4,1 0,5 0,4 - 0,2

Dien-Si02 0,6 0,4 4,1 0,4 0,5 0,3 0,3

Tetren-Si02 (Силохром С-120) 2,3 1,2 11,8 0,9 0,8 0,5 0,6

Tetren-Si02 (Силасорб Si-600) - 4,9 - - - - -

.рн

4 Cd Zn Ni Си T A 0,10 овд| /1 (540 нм)

■ МП.

. 2

О 50 100 150 V, МЛ

Рис. 3. Разделение модельной смеси ионов Рис. 4. Хроматограмма смеси металлов при

металлов на сорбенте Тйгеп-ЗЮ^ с применением техники ХФ. Колонка 300x9 мм. СР: 0,025 М Трис-НС1 (рН 7,5), Э: 1:8 Полибуфер-74 (рН 3,35)т 1 мл/мин. 1 - градиент рН, 2 - хроматограмма смеси.

кондуктометрическом детектировании.

Стальная колонка 250x4,6 мм, Tetren-Si02. (7,5 мкм). CP: 0,004 М гистидин (рН 7,6), Э: 1:50 Полибуфер-74 (рН 3,4), 1 мл/мин. У - градиент рН, 2 - хроматограмма смеси.

Пример хроматограммы ионов металлов на сорбенте ТеЦ-еп-БЮг в системе ВЭЖХ с кондуктометрическим детектированием приведен на рис. 4. В качестве стартового раствора выбран гистидин как обладающий более низкой электропроводностью, чем Трис. Разбавленные стартовый раствор и элюент создают благоприятные условия для детектирования металлов; вместе с тем разбавление подвижной фазы приводит к уширению хроматографических пиков и существенно увеличивает время анализа.

Следовательно, для применения техники хроматофокусирования для разделения ионов металлов в системах ВЭЖХ необходима дальнейшая оптимизация состава и концентрации подвижных фаз, чтобы позволить детектировать металлы в потоке.

Техника хроматофокусирования для концентрирования и разделения ионов металлов на карбоксильных сорбентах.

По совокупности характеристик карбоксильные катионообменники можно применить в качестве комплексообразующих сорбентов для одновременного концентрирования и разделения переходных металлов в варианте хроматофокусирования. Благодаря более удовлетворительной кинетике комплексообразования (по сравнению с привитыми олигоэтиленаминами) и менее сложному механизму комплексообразования, карбоксильные сорбенты представляются более перспективными для применения в технике хроматофокусирования. Исследовали кислотно-основные и комплексообразующие свойства слабокислотных катионообменных сорбентов СМ-52, Ольвагель-СООН, MN KS/R 527 и МасгоРгер 50 СМ на основе полимерных матриц с закрепленными карбоксильными или карбоксиметильными группами (табл. 5).

Таблица 5. Карбоксильные сорбенты,применявшиеся в эксперименте

Сорбент СМ-52 Ольвагель-СООН MN KS/R 527 МасгоРгер 50 СМ

Производитель Whatman (Великобритания) НИИ химии (Ленинград, СССР) Purolite (Великобритания) Biorad (США)

Матрица Целлюлоза ПММА сспс ПММА

Функциональные группы -СН2СООН -соон -СООН -СН2СООН

Размер частиц (мкм) 100-200 >30 5 50

рН-диалазон * 3-10 3-13 1-14 3-13

Ионообменная емкость 0,95- 1,15 ммоль/г ** 0,30 ммоль/мл геля <0,10 ммоль/г 0,21 ±0,04 ммоль/мл

Примечания: * - pH-диапазон гидролитической стабильности матрицы,

** - сухого сорбента.

Интервалы рН с постоянной буферной емкостью у данных карбоксильных сорбентов практически совпадают, но для СМ-52 этот интервал несколько шире, поскольку целлюлозная матрица сорбента также может обладать буферной емкостью. На профиле градиентов рН, полученных при использовании и полиамфолитного элюента, и 0,5 мМ лимонной кислоты в условиях высокой ионной силы, снижение рН во всем рабочем интервале было плавным, практически линейным. Известно, что в случае аминосодержаших анионообменников сорбция достигает максимума для ионов Си2+ в среднем через 10 мин и меньше, а для кинетически инертных ионов и Со2+ - через 20 -30 мин. Вероятно, такое продолжительное время установления равновесия связано и с многоступенчатым образованием олигоэтиленаминных комплексов, поэтому можно ожидать, что одностадийное комплексообразование с карбоксильными группами будет происходить быстрее. Сорбцию меди, кобальта, никеля, цинка, кадмия, марганца и свинца

изучали в статическом режиме при температуре 18-20°С. По времени количественной сорбции Ni2' и Со2\ как наиболее кинетически инертных акваионов, находили оптимальные условия и время контакта фаз для всех изученных ионов. Уже через 12-14 мин контакта сорбента и раствора достигается количественное извлечение ионов Ni2+" на сорбенте СМ-52. Для сорбента MN KS/R 527 время достижения максимальной сорбции Ni2+ составило 7-10 мин, чему, вероятно, способствует достаточно высокая удельная поверхность сорбента.

Сорбция, %

Сорбция, %

100

N1X * / "^s^r"- а

во

/ Со -

/ во

■ \ / ff 70

1/ J CD

■ /ы/f 50

if 40

■ 1 //Cu 30

/ / 20

СУ 10

РН

Рис. 5. Зависимость относительной сорбции ионов Си2+, Со2+, №2+, Сс12+ (а), Zn2+, Мп2+ и РЬ2+ (б) на сорбенте СМ-52 от рН в статических условиях.

Сорбция,%

Сорбция, %

6

РЬ/

J^^ Мп У f Zn

* рН

Рис. 6. Зависимость относительной сорбции ионов Си2+, Со2+, №2+, С<12+ (о), Zn2+, Мп2+ и РЬ2+ (б) на сорбенте Ольвагель-СООН от рН в статических условиях.

Исследовали сорбцию ионов металлов из ацетатных буферных растворов в интервале рН от 1,5 до 8,0. В более кислой области начинается частичное разрушение целлюлозной матрицы сорбента СМ-52, а при рН выше 8 начинается образование гидроксидов или основных солей металлов, вплоть до частичного выпадения осадков, что может привести к снижению сорбции ионов металлов. На сорбенте СМ-52 максимальное изшгечение ионов Zn2+, Mn2+, Со2+, Ni2+ достигается уже при рН 4-5, для Cd2+ - при рН выше 5, а ионы Си2+ и РЬ2+ максимально извлекаются при рН 7-8 (рис. 5, табл. 6). Наибольшая сорбционная емкость (выше 0,18 ммоль/г) достигается для ионов Ni2+ и РЬ2+. При рН 1,5 наблюдается практически полная десорбция всеЧ изученных ионов за исключением более прочно удерживаемых ионов Со2+ и Ni2+. Для всех изученных ионов

наблюдали аналогичное увеличение сорбции на сорбенте Ольвагель-СООН при повышении рН среды; извлечение максимально при рН 6-8 (рис. 6).

Таблица 6. Значения рНзо, рНщах сорбции металлов и коэффициенты

Ион СМ-52 Ольвагель-СООН

pHw Лмши'Ю рН» #,«,„„• 101

Ni2+ 1,7 6,6 ниже 2,0 8,3

Pb2+ 1,8 8,6 4,2 13,8

Со2+ 1,9 1,6 3,7 4,8

Zni+ 2,1 0,7 5,2 4,1

Cd2+ 2,5 0,7 5,5 3,8

Cu2+ 2,7 0,8 6,0 6,2

Mn2+ 2,9 0,7 5,1 2,9

Сравнение катионообменников СМ-52, Ольвагель-СООН, MN KS/R 527 и Macro-Prep 50 проводили по извлечению ионов Си2+ в зависимости от рН раствора. Для сорбентов Ольвагель-СООН, MN KS/R 527 и Macro-Prep 50 СМ при рН 4,5 - 5,0 ионы Си2+ десорбируются, тогда как на сорбенте СМ-52 ионы Си2+ сорбируются и при рН 2. Близкие значения pHso характеризуют примерно одинаковую комплексообразующую способность Ольвагель-СООН, MN KS/R 527 и Macro-Prep 50 СМ. Количественное извлечение достигается при рН выше 6, и только в случае сорбента MN KS/R 527 - при рН выше 7,5. При предварительном концентрировании ионов Си2+ на сорбенте MN KS/R 527 из более щелочной среды возможно конкурентное образование гидроксокомплексов меди, с другой стороны, если для количественной десорбции ионов Си2+ с сорбента СМ-52 требуется использование сильнокислых элюентов (рН ниже 2), то это может вызвать коррозию металлических деталей и соединений хроматографического насоса. Поэтому сорбенты Ольвагель-СООН и Macro-Prep 50 СМ с этой точки зрения представляют больший практический интерес. Тем не менее, по совокупности свойств сорбенты СМ-52 и MN KS/R 527 также подходят для использования в хроматофокусировании.

Хроматофокуснрование ионов металлов на карбоксильных сорбентах. Модельную смесь РЬ2+ и Ni2+ разделили на колонке, заполненной СМ-52 в условиях нисходящего градиента рН, сформированного полиамфолитным элюентом "Полибуфер-96" (рис. 7). Аналогичные хроматограммы при формировании градиента рН полибуферным элюентом получили и для других модельных смесей - Си2+ и Zn2+, Pb2+ и Cd2+, Pb2+ и Со2+. Пики РЬ2+ и Ni2+ разделены до продолжительного участка базовой линии (Rs более 2,2). Пик РЬ2+ практически симметричен; у пика Ni2+ размыт задний фронт, что, вероятно, вызвано дополнительным взаимодействием иона металла с донорными атомами матрицы СМ-52. Ионы металлов элюируются при более высоких рН. чем можно было ожидать из данных, полученных для сорбции в статических условиях - видимо, одновременно с разрушением карбоксильных комплексов за счет нисходящего градиента рН имеет место конкурирующее комплексообразование с макромолекулами "Полибуфера". При использовании однокомпонентного элюента на основе 0,5 - 1 мМ лимонной кислоты получили схожие результаты, что говорит о перспективности

использования простых элюентов для хроматофокусирования в катионообменных системах. Так, разделить смеси трех металлов при использовании "Полибуфера" не удалось, но при использовании лимонной кислоты такие смеси были разделены.

Ольвагель-СООН проявил в статических условиях более высокую селективность к ионам металлов, чем СМ-52. При пропускании полиамфолитного элюента "Полибуфер-96" на профиле градиента рН наблюдали уменьшение наклона градиента в области рН 5,7 -5,1, что, возможно, связано с тем, что константы кислотности привитых карбоксильных групп варьируются в более узком диапазоне по сравнению с константами карбоксиметильных групп, и следовательно, сорбент Ольвагель-СООН в меньшей степени проявляет полиэлектролитные свойства на всем интервале формирования градиента. В условиях нисходящего градиента рН на колонке, заполненной кагионообменником Ольвагель-СООН, удалось разделить смесь Мп2+, РЬ2+ и №2+ (рис. 8). Как в случае сорбента СМ-52, ионы металлов элюируются при более высоких рН, чем значения рНзо, полученные в статических условиях: так, Мп2+ элюируется при рН около 7, тогда как для него значение рН5о равно 5,1. Все хроматографические пики разделены до участков базовой линии; коэффициенты селективности а составляют: для пары РЬ2+/Мп2+ - 2,4, №2+/РЬ2+ - 1,8. Форма пиков практически симметрична. При работе с сорбентом Ольвагель-СООН давление в хроматографической системе постепенно повышалось в 2,5 -3 раза по сравнению с исходным, а слой сорбента уплотнялся. По-видимому, наряду с частицами заявленного размера (30 мкм), в сорбенте присутствует значительное количество очень малых частиц (менее 2-5 мкм), либо отдельные частицы разрушаются под механическим воздействием, что и способствует постепенному повышению давления в системе для ВЭЖХ. Поэтому от дальнейших экспериментов с Ольвагелем-СООН в системах ВЭЖХ отказались.

Рис. 7. Хроматофокусирование модельной Рис. 8. Хроматофокусирование модельной смеси РЬ2+ и №2+ (по 20 мМ) на СМ-52 смеси Мп2+, РЬ2+ и №2+ (по 20 мМ) на (колонка: 100x4,6 мм). Ольвагель-СООН (колонка: 100x4,6 мм).

СР: 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,1); Э: 1:20 Полибуфер-96 (рН 3,0), 0,8 мл/мин; ионная сила подвижных фаз: 0,05 (ЫаС1). Детектирование при 254 нм. Объем пробы 50 мкл. 1 - градиент рН, 2 -хроматограмма смеси.

Таким образом, техника хроматофокусирования впервые применена для разделения ионов металлов на карбоксильных катионитах (на примере СМ-52 и Ольвагель-СООН) в условиях нисходящего градиента рН.

Индуцированные градиенты для разделения ионов металлов

К.Шлайсом предложена видоизмененная схема получения градиентов внутри ионообменных колонок1: в хроматографическую систему помимо инжектора для ввода пробы включали второй инжектор с петлей большого объема (до 1 - 2 мл) - для ввода в колонку порции буферного раствора, имеющего рН, отличное от рН подвижной фазы и индуцирующего формирование градиента в слое сорбента. Концентрация индуцирующего раствора на 1-2 порядка выше концентрации элюента, за счет чего после переключения второго инжектора и поступления порции индуцирующего раствора в колонку рН в слое сорбента сначала резко изменяется, а потом медленно возвращается к рН элюента, при этом изократический насос подает элюент неизменного состава (схема). Внутренние градиенты рН, полученные по этой схеме, называют индуцированными, а методику их получения - техникой индуцирования. Применение техники индуцирования позволяет уменьшить время получения градиента в 3-4 раза и использовать более простые элюенты для формирования градиента рН. Техника индуцирования также удобна для более быстрой экспериментальной проверки модельных градиентов или при накоплении большого объема информации для занесения в компьютерную базу данных (БД) по градиентам рН. До цикла наших работ на сорбентах с привитыми олигоэтиленаминами индуцированные градиенты не получали.

Введение индуцирующего раствора

ШшоЬттт

Объем эффлюенте, ми. (время, пин)

БД градиентов, Компьютерное моделирование

Схема.

Формирование градиента рН с использованием техники индуцирования

Индуцирование градиентов рН на анионообменных сорбентах. В качестве компонентов элюента изучали ряд низших аминокислот. Оптимальными оказались 6-аминогексановая кислота и гистидин, имеющие низкую комплексообразующую способность по сравнению с аминогруппами сорбентов; смесь этих кислот обладает буферной емкостью в рабочем интервале рН 7,5 - 3,5. Для индуцирования градиента рН в колонку вводили 1 мл 0,1 М раствора N328407. При этом наблюдали резкое повышение рН до 9,8 через 3 мин после введения индуцирующего раствора (ИР) для всех изученных сорбентов. Во всех случаях продолжительность градиента рН составила 40 - 45 мин при объемной скорости подвижной фазы 0,2 мл/мин, что вполне приемлемо для задач разделения. Наиболее планвый нисходящий градиент получен для сорбента ТеЬ-еп-БЮг. При переходе от Еп-БЮг к В1еп-5Ю2 и к Тей-еп-БЮг концентрацию гистидина и 6-

' Slais K. Microcolumn liquid chromatography with sample-induced internal pH-gradient. //J.Microcol. Sep. 1991. V.3. P.191-197.

аминогексановой кислоты в элюенте увеличивали пропорционально общему содержанию

Рис. 9. Разделение ионов металлов на 01еп-5Ю2 Рис. 10. Разделение ионов металлов на Те1геп-в условиях индуцированного градиента рН. Э: БЮ2 в условиях индуцированного градиента рН. 0,01 М (6-аминогексановая кислота и Э: 0,02 М (6-аминогексановая кислота и гистндин); 0,2 мл/мин. гистидин); 0,2 мл/мин.

Колонки: 150x2 мм; ИР: 0,1 М Ыа2В407. 1 - градиент рН, 2 - хроматограмма смеси.

Проверили возможность разделения переходных металлов в условиях индуцированного градиента рН. Содержание ионов металлов в собранных фракциях эффлюента контролировали спектрофотометрически по реакции с ПАР при 540 нм. Продолжительность разделения модельных смесей в условиях градиента рН составила 20 - 30 мин при расходе подвижной фазы 0,2 мл/мин. Значения рН, соответствующие максимумам хроматографических пиков Со, № и Си, на 0,5 - 2 ед. выше значений рН 50%-ной сорбции, полученных для этих ионов в статическом режиме, что, вероятно, вызвано тем, что из-за присутствия гистидина в элюенте может идти конкурирующая реакция комплексообразования, несмотря на то, что в слабощелочной и нейтральной областях рН константы устойчивости комплексов переходных металлов с привитыми олигоэтиленаминами выше, чем с гистидином. В отдельных случаях наблюдали обратную зависимость: так, для меди на 01еп-5Юг в статических условиях рН 50%-ной сорбции выше на 2 единицы, чем рН десорбции при элюировании смесью гистидина и 6-аминогексановой кислоты, что можно объяснить образованием и удерживанием отрицательно заряженных комплексов переходных металлов за счет анионного обмена на аминогруппах сорбента (рис. 9). Отметим, что при разделении модельной смеси из 2 - 3 металлов градиент рН становится более плавным в интервале рН от 9 до 3, то есть происходит сглаживание двух участков градиента в один. Хроматографические пики, построенные по точкам по светопоглощению комплексов металлов с ПАР в собранных фракциях, симметричны и приблизительно равны по полуширине, что подтверждает наличие фокусирующего эффекта при разделении в выбранных условиях. Наилучшие результаты получены на сорбенте Те^еп-БЮг - разделены модельные смеси: Со2+, №2+, Си2+ и Со2+, и022+, №2+. Пример разделения смеси Со2+, И022+, №2+ представлен на рис. 10. Разрешение пар пиков и022+/Со2+ и №2+/и022+ практически одинаково (1,6). Значения

рН, соответствующие максимумам пиков металлов, варьируются в пределах не более 0,05 ед. рН.

Индуцирование градиентов рН на катионообменных сорбентах. Нисходящие градиенты рН, полученные с применением "классической" техники ХФ, применимы для разделения ионов металлов на карбоксильных сорбентах; с помощью техники индуцирования такие градиенты в данных системах не получали. В качестве объекта изучения выбрали катионообменник МасгоРгер 50 СМ, проявляющий высокую сорбционную емкость по ионам металлов. Индуцирующие растворы слабых оснований -аммиака, ацетата натрия, Трис - выбирали, исходя из результатов, полученных для анионообменных систем, описанных выше. Использование растворов тетрабората натрия в качестве индуцирующих в данном случае нежелательно, поскольку константы устойчивости боратных и карбоксильных комплексов переходных металлов близки, т.е. возможно конкурирующее образование малорастворимых тетраборатов металлов.

Впервые для индуцированных нисходящих градиентов рН показано, что ионная сила подвижных фаз (ИР и элюента) существенно влияет на профиль градиента. Наиболее плавные индуцированные градиенты получены при создании высокой ионной силы в элюенте и индуцирующем растворе (рис. 11). Удачными системами для разделения ионов металлов на сорбенте МасгоРгер 50 СМ (колонка 50x4,6 мм) в условиях нисходящего индуцированного градиента рН представляются следующие:

а) элюент: 2-3 мМ лимонная кислота + 0,1 М ЫаС1; ИР: 3,25 М >Щ3 + 1 М ИаС);

б) элюент: 3-5 мМ уксусная кислота + 0,1 М ЫаС1; ИР: 4 М СН3СО(Жа + 1 М ЫаС1.

Рис. 11. Индуцированные градиенты рН на Рис. 12. Разделение модельной смеси ионов

сорбенте МасгоРгер 50 СМ. Э: 5 мМ СН3СООН; РЬ2+ (1) и Со2* (2) при нисходящем

с(МаС1), М: 1, 2- 0; 3 - 0,1. ИР: 4 М СН3СОО№; индуцированном градиенте рН. Условия - рис.

с(ЫаС1), М: / - 0; 2, 3 - 1. 11, кривая 3. Скорость Э: 0,8 мл/мин.

На хроматограмме модельной смеси (рис. 12) пики металлов хорошо видны на фоне базовой линии. Оба пика имеют симметричную форму, однако пик Со2+ несколько шире, что, вероятно, связано с его кинетической инертностью при разрушении комплексов на поверхности сорбента. В данных условиях не удалось добиться полного разделения хроматографических пиков 0,80), вероятно, вследствие достаточно крупного размера частиц сорбента (50 мкм). Итак, показана возможность индуцирования

квази-линейных градиентов на анионо- и катионообменных сорбентах в широком диапазоне рН (от 10 и выше до 3-4) при использовании простых одно-двухкомпонентных элюентов, в том числе - при создании ионной силы в обеих подвижных фазах.

Моделирование внутренних градиентов рН, создаваемых смесью протолитов с использованием техники хроматофокусирования

Теория формирования внутренних градиентов рН с использованием смесей протолитов, несмотря на кажущуюся простоту метода, еще находится в стадии развития -так, до недавнего времени не существовало единого мнения о механизме формирования градиента рН внутри колонки. Из-за сложного математического описания гетерогенных равновесий в подобных динамических системах при выборе сорбентов и особенно - при оптимизации состава подвижных фаз в ХФ - преобладал эмпирический подход, состоящий в практическом подборе компонентов для подвижных фаз из большого ряда слабых кислот, оснований и амфолитов, у которых значения констант ионизации (р/<0 или изоэлектрические точки (р/) попадают в требуемый диапазон градиента рН. Имеющиеся в литературе теоретические подходы к описанию формы получаемого градиента рН в зависимости от состава системы (модель "буферных взаимодействий" Л.Слайтермана, модель "фронтального разделения" А.Мурела) базируются, в основном, на аналогиях с гомогенными протолитическими равновесиями, поэтому не могут удовлетворительно объяснить ряд экспериментальных эффектов, а кроме того, зачастую с трудом поддаются количественной проверке. Закономерности, связывающие форму градиента рН с составом и свойствами подвижной и неподвижной фаз, до цикла наших работ и работ Д.Фрея надежно не были установлены. Модели Д.Фрея (модель "локальных равновесий" и "точного численного решения") во многих случаях используют параметры, которые лрудно оценить из экспериментальных данных. Более строгий подход к описанию формирования внутреннего градиента рН может быть основан на модели, учитывающей в явном виде гомогенные и гетерогенные химические равновесия в динамической системе. Найденные закономерности помогут логически подойти к выбору подвижной фазы, представляющей собой смесь протолитов и - в дальнейшем - амфолитов, а также составить более строгий план эксперимента, направленного на подтверждение закономерностей и проверку адекватности построенной модели.

Параметры физико-химической модели. При моделировании внутренних градиентов рН задавали параметры хроматографической колонки (число зон фокусирования N и фазовое отношение т/У массы сорбента к объему подвижной фазы), состав и свойства анионообменного сорбента (ионообменная емкость <2, константы протонирования Кр аминогрупп, коэффициенты анионного обмена хлорид-ионов на анионы слабых кислот и при наличии в системе многоосновных кислот — коэффициенты катионного обмена Н* на на сорбированных полианионах), стартового раствора и буферного элюента; исходя из выбранной системы, определяли основные равновесия в ионообменной колонке. Химическую неоднородность анионообменника, а также его

термодинамическую неидеальность учитывали с помощью эмпирической зависимости константы протонирования Кр аминогрупп от степени протонирования а и ионной силы раствора 1. Коэффициенты остальных равновесий (например, для анионного обмена) считали постоянными. Рассматривали равновесия в системе, содержащей слабоосновный анионообменник ЯЫН2, набор кислот Н„;А/ (где п - основностьу-той кислоты) и ионы Ыа+ и СГ в подвижных фазах, поскольку такие системы в общем виде наиболее типичны для формирования градиента рН при использовании неамфолитного элюента. Полидентатное связывание многозарядных анионов, сверхэквивалентную сорбцию и образование ионных пар в рамках предлагаемой модели не рассматривали. Во избежание усложнения системы не рассматривали равновесия, включающие взаимодействия с остаточными силанольными группами на поверхности сорбента. Константы протонирования Кр аминогрупп, коэффициенты анионного и катионного обмена оценивали из результатов специально проведенных экспериментов. В предложенной модели впервые уделено внимание ионной силе подвижных фаз. Для расчета градиентов рН, соответствующих предложенной физико-математической модели, использовали программу "СР" на языке С++ для персональных компьютеров (авторы - канд. хим. наук А.В.Гармаш и А.Б.Тессман). Компьютерный расчет включал две основные чередующиеся операции: перенос порции подвижной фазы из (/ - 1)-й в /-ю зону и вычисление равновесных составов подвижной фазы и ионообменных групп сорбента /-ой зоны. Исходно рассчитывали состав ионообменных групп сорбента, равновесного со стартовым раствором.

. Рн

\

1 2

\\

< Э

Рис. 13. Градиенты рН для смесей трех (I) и девяти кислот (2): Э: активные компоненты:

НА/с К(СГ,Л~) =0,1; 1 -сна=7-10и М;рА-.= 3,0; 5,0; 7,0; 2 - снА= 2-Ю"1 М; рКа = 3,0, 3,5; ...; 6,5; 7,0; инертный компонент: NaCl (МО"4 М); сорбент - анионообменный при lgАГР = 8,0.

О 20 40 60 80 100У

Рис 14. Градиенты рН для систем с различной концентрацией №С1: элюент - активный компонент: НА, Сна = 2-10"3 М; рА.'„ = 5,0; К(СГ,А~) =0,1; инертный компонент: ЫаС1;

смаа, М: 1 - 1 • 10"2; 2 - 1 ■ 10°; 3 - I ■ 1 О*4; сорбент -анионообменный при Кр = 8.0.

Параметры подвижных фаз. В качестве многокомпонентных элюентов рассмотрены смеси одноосновных кислот. Для получения плавных градиентов рН. исходя из принципа увеличения диапазона постоянства буферной емкости и числа конкурирующих анионов, моделировали внутренний градиент рН для элюента с увеличенным числом активных компонентов. На рис. 13 приведены рН-градиенты для

систем, содержащих три и девять одноосновных кислот, величины рА*а которых равномерно распределены в интервале 3,0 - 7,0. Градиенты рН в этих случаях получаются существенно более плавными, чем для однокомпонентных систем, что согласуется с экспериментом. Применение многоосновных кислот в составе элюента позволяет получать более плавные градиенты рН по сравнению с одноосновными кислотами (рис. 14), что подтверждается экспериментальными данными. По сравнению с многокомпонентными смесями одноосновных кислот НА применение многоосновных кислот позволяет избежать нежелательных эффектов - например, фронтального разделения компонентов элюента.

На профиль градиента существенно влияют инертные компоненты элюента - ионы сильных электролитов, явным образом не определяющие рН (рис. 14). Для обеспечения наиболее плавного градиента рН при выбранных параметрах модели в случае многоосновных кислот концентрации инертного и активного компонента должны быть соизмеримы: при слишком малых или слишком больших концентрациях ЫаС1 на профиле градиента наблюдается ярко выраженная ступень, т.е. резкое понижение рН. Этот эффект наблюдали и для многокомпонентных смесей одноосновных кислот.

Рнс. 15. Градиенты рН для различных моделей зависимости от а и / при использовании девятикомпонентного элюента( сна = 2-Ю'4 М). Э: активные компоненты НА/ с К(С1~,А~) = 0,1; рАГ„ = ЗД 3,5; ...; 6,5; 7,0; инертный компонент - ЫаС1, скао = 1-Ю"3 М; сорбент: I -^ Кр = 8,0; 2- АР-ЯЮг; 3 - ТеЦеп-ЭЮ;.

5CD V, мл

Рнс. 16. Сравнение профилей экспериментального (У) и расчетного (2) внутренних градиентов рН. СР: 0,025 М Трис-НС1 (рН 7,5, /КаС1 = 0,002); элюент: 0,005 М уксусная кислота (рН 3,5, I = 0,005), 1 мл/мин; сорбент: В1еп-5Ю2, 300x9 мм. (У); модель сорбента Те^еп-БЮг, К(С\\ СН3СОО ) = 0,1 (2).

Иротолитическне свойства сорбента. Результаты моделирования градиентов рН с учетом переменной функции IgATp для элюента, содержащего одну одноосновную кислоту, показали, что в случае пол и функционального анионообменного сорбента (модель Tetren-SÍO2) ступени на профиле градиента рН существенно сближаются и становятся более плавными. Это подтверждает экспериментальные результаты и позволяет считать полифункциональные полиэлектролитные сорбенты более перспективными для использования в ХФ. Более отчетливо различие моно- и полифункциональных анионообменников проявляется для градиентов рН, полученных при пропускании

девятикомпонентного элюента (смесь одноосновных кислот) (рис. 15). Близкий к линейному градиент в области рН 6,5 - 4,5 получается при использовании полифункционального Те1геп-8Ю2 (кривая 3), при этом наклон градиента рН несколько выше, чем при использовании монофункционального АР-8Ю2 (кривая 2).

На профиле градиента рН, полученного при пропускании 5 мМ СНзСООН через колонку с сорбентом 01еп-5Ю2, уравновешенную 0,025 М раствором Трис до рН 7,5, наблюдается начальное увеличение рН на 0,1-0,2 ед. рН. (рис. 16), после чего рН эффлюента плавно снижается за счет ионного обмена хлорид-ионов на ацетат. Вторая ступень на профиле градиента в области рН 4,6-4,7 несколько размыта, размыванию второй ступени способствуют полиэлектролитныё свойства аминогрупп сорбента. На профиле расчетного градиента рН можно выделить те же участки, что и для экспериментального градиента - начальное повышение рН, плавное снижение рН до 6,9, резкий спад до второй ступени (рН 5,3) и далее - плавное уменьшение до кислотности элюента (рис. 16). Несмотря на некоторые различия между экспериментальным и расчетным градиентами рН, но учитывая большую сложность процессов в динамической системе, подобное совпадение можно считать достаточным. Модель воспроизводит характерные участки на профиле градиента рН ("аномальное" повышение рН на начальном участке и наличие двух фронтов для однокомпонентной системы), что позволяет успешно использовать ее для предсказания формы градиента при выборе системы. Модель содержит ряд допущений: реальные константы гетерогенных равновесий, кроме константы протонирования аминогрупп сорбента, принимаются постоянными величинами; константа протонирования зависит только от степени протонирования и ионной силы подвижной фазы; не рассматриваются элюенты, содержащие амфолиты, поскольку это осложнило бы и модель, и расчеты по ней.

Среди существующих моделей формирования внутренних градиентов рН данная модель, в явном виде рассматривающая ионообменные равновесия, описывает известные экспериментальные эффекты наиболее адекватно. С помощью модели предсказан не известный ранее эффект влияния инертных (небуферных) компонентов на форму градиента рН.

Поиск простых подвижных фаз для формирования нисходящих градиентов рН внутри слабоосновных анионообменных колонок Экспериментальная проверка включала подтверждение теоретических положений об учете влияния ионной силы подвижных фаз на состояние аминогрупп сорбента и, соответственно, на профиль нисходящего градиента рН; подтверждение влияния слабого основания на профиль градиента рН (см. выше). Также экспериментально изучили совместное влияние ионной силы и присутствия слабого основания в подвижных фазах. Для расширения диапазона буферной емкости в элюенты, содержащие слабую кислоту, добавляли второй активный компонент - слабое основание (Трис или гистидин). Градиенты рН, полученные такими двухкомпонентными элюентами,

в большинстве случаев имели участок с "аномальным" подъемом рН и ступень в области рН 4.5 - 5,5; после ступени кислотность снижалась достаточно плавно. Повышение рН после замены стартового раствора на элюент вызвано не только постепенным вымыванием слабого основания из пор сорбента и межчастичного пространства, но и в результате ионного обмена на сорбированных многоосновных кислотах (например, на сорбированной щавелевой кислоте). С другой стороны, "аномальное" повышение рН в первых порциях эффлюента может быть вызвано различием в ионной силе подвижных фаз, если /Ср < А- При создании в стартовом растворе ионной силы выше, чем в элюенте, удается не только сгладить ступени на профиле градиента рН, вызванные присутствием слабого основания, но даже в случае лишь одного активного компонента в элюенте (например, щавелевой кислоты) можно получить градиенты, содержащие плавный, практически линейный, или квази-линейный, участок протяженностью до 2,5 ед. рН и выше (рис. 17). В хроматофокусировании под квази-линейными принято понимать градиенты, имеющие на профиле два или более линейных участка с разным углом наклона, плавно соединенные между собой (т.е. должны отсутствовать явно выраженные ступени). Градиент, представленный на кривой 2, типичный квази-линейный, получен при

/ср > Л-РН

Рис. 17. Оптимизация профиля \ градиента рН при варьировании

\ ионной силы стартового раствора и

\ элюента. Колонка: 250x4,6 мм,

\ Те^еп-ЗЮ}, 7,5 мкм; стартовый

раствор: 25 мМ Трис-НС1, рН 7,5,

\^аС1=0,03 М; элюент: 2 мМ Н2С2О4, рН 2,95, /мва=0,2 М (Д 0,002 М (2), 1 мл/мин.

V, мл

Таким образом, для формирования нисходящих квази-линейных градиентов рН в анионообменных системах предпочтительно использовать:

- полифункциональные сорбенты,

- элюенты с минимальным содержанием слабоосновных компонентов при

невысокой ионной силе (не выше -0,01),

- стартовые растворы с ионной силой в 5-10 раз выше, чем у элюента.

Применение одиокомпонеитных элюентов в ХФ биполярных соединений.

Квази-линенные градиенты рН, сформированные при использовании однокомпонентного элюента на основе растворов Н2С2О4 переменной концентрации, применили для разделения модельной смеси аминокислот, чтобы показать возможности подобных элюентов в сочетании с правильным выбором ионной силы подвижных фаз в аналитическом и препаративном хроматофокусировании., Состав эффлюента контролировали фотометрически при 280 нм; рН эффлюента непрерывно измеряли в проточной ячейке. При использовании 2 мМ раствора Н2С2О4 в качестве элюента

оптическая плотность эффлюента меняется незначительно; базовая линия при фотометрическом детектировании достаточно ровная и линейная. Достигнуто разделение модельной смеси аминокислот - пролина (Pro), тирозина (Туг) и фенилаланина (Phe), изоэлектрические точки которых равны 6,30; 5,66 и 5,48 соответственно. Пики аминокислот достаточно узкие и симметричные по форме, т.о., фокусирующий эффект есть и при использовании простых подвижных фаз (рис. 18). Порядок элюирования и положение пиков на хроматограмме относительно градиента рН согласуются со значениями изоэлектрических точек. Разрешение пиков составило: для пары "пролин-тирозин" 3,9; для пары "тирозин-фенилаланин" с близкими значениями изоэлектрических

Рис. 18. Хроматофокусирование аминокислот: Рис. 19. Хроматофокусирование изоформ I- градиент рН, 2 - хроматограмма смеси, плазминогена: У - градиент рН, 2 Колонка: 50x4,6 мм, Tetren-SiO;, 7,5 мкм; СР: хроматограмма. Колонка: 50x4,6 мм, Telren-25 мМ Трис-Н2С204 или Трис-HCI, рН 7,5, Si02, 7,5 мкм; СР: 25 мМ Трнс-Н2С204, рН 7,5, Aiaci=0,02 М, Э: 2мМ Н2С204, 1 мл/мин. Объем /NaCi=0,02 M, Э: 2мМ Н2С204, 1 мл/мин., пробы 20 мкл.

Другой пример - хроматофокусирование изоформ плазминогена. Плазмин (фибринолизин) — гликопротеин, фермент класса гидролаз, катализирующий разрушение фибринов и тем самым препятствующий образованию тромбов в кровеносных сосудах. В НИИ медицинской экологии (МНИИМЭ) на основе плазмина разрабатывали лекарственный препарат для лечения заболеваний, сопровождающихся внутрисосудистым выпадением сгустков фибрина и образованием тромбов. В плазме крови плазмин содержится в виде профермента - плазминогена, имеющего две изоформы - менее плотную, активную изоформу с лизином в концевой цепи (Lys- , профнбринолизин) и неактивную изоформу с глутамином на конце (Glu-). Изоформы отличаются молекулярной массой, а их изоэлектрические точки лежат в узком интервале рН (5,82 и 5,66, соответственно), что делает невозможным разделение в изокрэтических условиях. Элюирование с градиентом ионной силы приводит к денатурированию плазминогенов, что неприемлемо при выделении активного Lys-плазминогена (профибринолизина) для лекарственных препаратов, поэтому задача разделения активной и неактивной форм плазминогена актуальна для биохимиков и медиков. Проведено хроматофокусирование лиофилизованного образца плазминогена при использовании простого

однокомпонентного элюента (рис. 19). Несмотря на относительно резкое снижение рН от 7,5 до 5,4, Glu- и Lys-изоформы плазминогена удалось разделить в соответствии с их изоэлектрическими точками. Пики разделены до участка базовой линии, их разрешение при этом составляет 1,65. Вследствие фокусирующего эффекта пики изоформ симметричны и практически одинаковы по ширине. Третий пик связан с присутствием в образце остатков плазмина после лиофилизации плазмы крови, а также частичным переходом активного Lys-плазминогена в плазмин (обозначен на рисунке "Plas"). Значения рН, соответствующие максимумам пиков ппазминогенов, варьировались в пределах не более 0,03 ед. рН, для плазмина - не более 0,05 ед. Непродолжительная ступень на профиле градиента в области рН 5,2-5,1, вероятно, объясняется некоторым буферным действием разделяемых белков как полиамфолитов.

Разделение переходных металлов. Исследовали применение однокомпонентных элюентов на основе аминокислот для формирования внутреннего градиента рН и в перспективе - для градиентного элюирования переходных металлов. В литературе описано использование аминокислот в составе многокомпонентных элюентов (содержащих более 20 компонентов) для разделения биологических макромолекул методом ХФ, однако элюенты, содержащие только одну аминокислоту, в ХФ ранее не применяли. Аминокислоты - глутамин, глутаминовая, аспарагиновая, 6-аминогексановая кислоты — формируют в колонке, заполненной Tetren-Si02, типичные квази-линейные градиенты рН в широком диапазоне (рис. 20). При использовании 25 мМ аспарагиновой кислоты в качестве элюента разделили смесь переходных металлов (по 20 мМ каждого): Мп , СЛ Со2+ и Ni2+; первые три пика разделяются до базовой линии, а пики Со2+ и Ni2+ разделены частично (Rs 0,68), поскольку они элюируются в области более резкого изменения рН от 5 до 3,7 (рис. 21). Аналогичные результаты получены при использовании глутаминовой кислоты. Таким образом, низшие аминокислоты можно использовать в качестве буферных элюентов или их компонентов для формирования внутренних градиентов рН.

Рис. 20. Градиенты рН при использовании 25 Рис. 21. Хроматофокусирование смеси ионов

мМ растворов аминокислот - аспарагиновой (У) металлов с использованием однокомпонентного

и глутаминовой (2) (рН 3,0-3,3) в качестве элюента. Э: 25 мМ аспарагиновая кислота (рН

элюентов. Колонка: 300x9 мм, Те^еп-ЭЮг, 100- 2,8). Колонка: 300x9 мм, Тей-еп-ЗЮ2, 100-120

120 мкм; СР: 25 мМ Трис-Н2С204, рН 7,5, 1 мкм; СР: 25 мМ Трис-Н2С204, рН 7,5, 1 мл/мин.

мл/мин. 1 - градиент рН, 2 - хроматограмма смеси.

Нисходящие градиенты рН в слабокислотных катнонообменных системах

Для создания нисходящего градиента на сорбенте СМ-52 выбрали "Полибуфер-96", исходя из литературных данных о формировании восходящих градиентов рН полиамфолитными элюентами. В качестве стартового выбрали раствор Трис с добавками ЫаС1. На начальном участке градиента рН, сформированного полиамфолитным элюентом, наблюдали аномальное повышение рН (выше значения стартового раствора), которое может быть вызвано тем, что при уменьшении ионной силы подвижной фазы условные константы диссоциации карбоксильных групп сорбента уменьшаются, вследствие чего часть групп дополнительно протонируется. Для получения в катионообменной системе линейного нисходящего градиента в широком диапазоне рН следует создавать высокую ионную силу (до 0,1) и в стартовом растворе, и в полиамфолитном элюенте. Замена стартового раствора (Трис) на раствор иной природы практически не сказывается на профиле градиента рН, а влияние ионной силы при этом существенно проявляется. При использовании 10 мМ фосфатного буферного раствора в качестве стартового и при сохранении остальных условий эксперимента - кислотности и ионной силы подвижных фаз, концентрации элюента - получили градиенты, полностью идентичные полученным

Рис. 22. Формирование градиента рН полиамфолитным элюентом при варьировании ионной силы. Колонка: 300x9мм, СМ-52; СР: 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, I = 0,1; элюент: 1:20 Полибуфер-96, рН 3,0, / = 0 (/), 0,1 (2). Скорость элюента 0,85 мл/мин.

Таблица 7. Влияние состава и концентрации элюента на характерные участки градиента рН в катионообменной системе.____

Элюент Подъем, ед. рН Протяженность подъема, мл Наклон линейного участка, рН/АУ

Кислота с, мМ рН Собственная и

Уксусная 5 3,55 <0,001 0,10 4 0,33

1 3,92 -0 0,50 17 0.15

ол 4,30 Ч) 0,85 60 0,05

Лимонная 5 2,80 0,002 0,10 2 0,58

1 3,23 <0,001 0,30 9 0,23

0,2 3,75 ~0 0,80 38 0,17

0,05 4,25 ~0 1,00 65 0,03

Глутамино-вая 5 3,42 0,005 0,10 5 0,54

1 3,70 0,001 0,35 13 0,17

0,2 4,10 <0,001 0,70 43 0,04

при использовании 10 мМ раствора Трис.

Простые элюенты. В качестве элюентов, формирующих градиент рН внутри колонки, выбрали растворы карбоновых кислот с увеличивающимся числом карбоксильных групп - уксусной (рА"а = 4,76), щавелевой (р/С0 = 1,25; 4,27), винной (рА'а = 2,98; 4,34) и лимонной (рА"п = 3,10; 4,76; 6,40). Подобные элюенты мы ранее применили для формирования нисходящих градиентов рН в анионообменных системах на сорбентах высокой и низкой емкости. Концентрации кислот варьировали в интервале от 5 до 0,2 (в отдельных случаях - до 0,05) мМ. Для всех изученных кислот профиль нисходящего градиента был аналогичен представленному на рис. 22 (кривая 1), т.е. рН на начальном участке повышался выше значения рН стартового раствора, а затем практически линейно снижался до рН элюента. При разбавлении элюента наклон градиента уменьшается (табл.

7), но "аноматьный" подъем рН становится выше. Природа элюента также существенно сказывается на форме градиента - наиболее протяженные градиенты рН формируются при использовании более слабых кислот (уксусная) или аминокислот, однако желаемое конечное значение рН (3,5 - 3,0) в этом случае не достигается. Элюент на основе 0,2 - 1 мМ лимонной кислоты представляется оптимальным. Увеличения рН на начальном участке градиента можно избежать, повышая ионную силу элюента. При достаточно высокой ионной силе в элюенте и стартовом растворе получили плавный градиент рН без подъема на начальном участке, зато с более протяженным квази-линейным участком (рис. 23, кривая 3). Вывод является общим для всех изученных катионообменных систем (табл.

8) - при создании высокой ионной силы, одинаковой в обеих подвижных фазах, получали более линейные или квази-линейные нисходящие градиенты.

Разделение переходных металлов. Условия, в которых формируются наиболее плавные, практически линейные градиенты рН, применили для хроматофокусирования ионов металлов. На колонках, заполненных карбоксильными сорбентами МасгоРгер 50 СМ и МЫ, достигнуто разделение 2-3 переходных металлов при нисходящем градиенте рН созданным однокомпонентным элюентом (0,5 - 1 мМ лимонная кислота). Для ионов металлов получили симметричные пики, примерно одинаковой ширины, независимо от времени выхода, что говорит о наличии фокусирующего эффекта (рис. 24). Порядок выхода металлов согласуется с рядом констант устойчивости карбоксильных комплексов. Разрешение пиков составляет: для пары Мп2+-2п2+ - 1,6, для 2пг+-£о2+ - 2,7; коэффициенты селективности составляют 1,3 и 1,5 соответственно, чего вполне достаточно для

РН

Рис. 23. Влияние ионной силы подвижных фаз на профиль градиента: 1-0,2- 0,01, 3 - 0,1. Колонка: 50x4,6 мм, MN KS/R 527, 5 мкм; СР: 10 мМ Трис - HCl, pH 7,5; Э: 0,2 мМ раствор лимонной кислоты, 1 мл/мин.

О 30 40 60 80 100 120 НО 160 у мл

проведения аналитических измерений. Высокая емкость сорбента МасгоРгер 50 СМ позволяет использовать его и для препаративного разделения ионов металлов или для предварительного концентрирования с последующим определением спектроскопическими методами. На сорбенте МЫ пики ионов металлов также разделяются до продолжительного участка базовой линии; коэффициент селективности равен 4.1 (рис. 25). Проверили возможность динамического концентрирования ионов Си2+ на МЫ при пропускании 30 мл раствора, содержащего 610"7 моль ионов. После концентрирования в условиях градиента при рН 4,6 - 4,8 наблюдали более узкий пик Си2+ (общее время элюирования пика около 3 мин), чем полученный при разделении смеси (~ 7 мин).

Таблица 8. Влияние ионной силы элюента на характерные участки градиента рН.

Сорбент, колонка Стартовый раствор (РН,Л Элюент (рН,/) Подъем, ед. pH Протяженность подъема, мл Наклон* ÄpH/AV

СМ-52, 300x9 мм 10 мМ Трис-НС1 (pH 7,50,/0,1) 1:20 Полибуфер (3,00,7-0) 0,70 -150 0Л2

тот же тот же (7 0,1) 0 - -0,01

MN KS/R 527, 50x4,6 мм 10 мМ Трис-НС1 (pH 7,50,7-0) 0,2 мМ лимонная кислота (рН 3,75,7-0) 0,80 38 0,17

тот же (7 0,01) тот же ( рН 3,92, 7 0,01) 0,05 13 0,11

-//-(/ 0,1) тот же (рН 3,97, 7 0,1) 0,02 7 0,08

Macro-Prep 50 СМ, 50x4,6 мм -II-{I 0,01) 1 мМ лимонная кислота (рН 3,25,7 0,01) 0,03 10 0,23

-//-(7 0,1) 0,5 мМ лимонная кислота (рН 3,47,7 0,1) 0 0,11 0,28**

Примечание: * - наклон линейного участка рН

** - участки в области рН 6,5 - 5,1 и 5,0 - 5,1, соответственно.

а 20 чо во во V, МЛ

Рис. 24. Разделение ионов Мп2+, гп2+ и Со2+ (по 20 мМ) на сорбенте МасгоРгер 50 СМ (50x4,6 мм). СР: 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,1); Э: 0,5 мМ лимонная кислота (рН 3,4), 1,0 мл/мин; нонная сила: 0,2 (ЫаС1). Объем пробы 50 мкл.

о 10 20 м V, мл

Рис. 25. Разделение смеси 10 мМ РЬ2+ и 20 мМ Си2+ на сорбенте MN KS/R 527 (50x4,6 мм). СР: 10 мМ Трис-HCI (pH 7,1); Э: 1 мМ лимонная кислота (pH 3,3), 1 мл/мин; ионная сила: 0,05 (NaCl). Объем пробы 30 мкл.

Простые элюенты для формирования восходящих градиентов рН в хроматофокуснрованни биполярных соединений

Нисходящие градиенты рН, формируемые внутри катионообменных колонок, можно использовать только для разделения ионов металлов. Это связано с тем, что при высоких значениях рН (-7-8) функциональные группы катионообменника заряжены отрицательно, и ионы металлов могут сорбироваться, а при последующем снижении рН десорбироваться за счет протонирования сорбента и вытеснения ионов металлов протонами (или разрушения комплексов). Для разделения биполярных соединений, например, белков, на катионообменных сорбентах, напротив, необходимо использовать восходящие градиенты рН, т.к. биполярные соединения заряжены положительно и, соответственно, сорбируются на катионообменнике только при рН ниже значений их изоэлектрических точек, т.е. в кислой области. Несмотря на перспективность применения восходящих внутренних градиентов рН, их изучению до сих пор уделялось мало внимания, а для формирования восходящих градиентов рН используют те же полиамфолитные элюенты (т.н. "полибуферы"), уравновешенные до рН 7-8; в качестве стартовых используют растворы слабых кислот (рис. 26, кривая 1). Для катионообменных систем практически не предпринималось попыток найти более простые подвижные фазы, тогда как для нисходящих градиентов в анионообменных системах такой поиск проводится давно. Эффект ионной силы подвижных фаз при формировании восходящих градиентов рН ранее никогда не рассматривали.

Рнс. 26. Влияние состава элюента на профиль восходящих градиентов рН. Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4,6 мм). CP: 2 мМ лимонная кислота (рН 3,0). Э: 1:25 "Полибуфер-96" (рН 7,0) (7), 12,5 мМ Трис - НС1 (рН 7,5) (2), 12,5 мМ Трис - НС1 + 1 мМ лимонная кислота (рН 7,5) (i), 25 мМ Трис - НС1 + 6 мМ лимонная кислота (рН 7,5) (4). Скорость элюента 1 мл/мин.

О 20 40 80 »0 <00 <20 V, МЛ

Элюенты на основе Трис не позволяют получить квази-линейные восходящие градиенты рН, поскольку практически не проявляют буферных свойств при рН ниже 7. В результате на профиле градиента образуется продолжительное плато в области рН 3 -4, где проявляет буферные свойства стартовый раствор, а затем рН в течение нескольких минут повышается до 7 и выше (рис. 26, кривая 2). Добавление в элюент активных компонентов с рК, попадающими в область рН от 3 до 7 - например, лимонной кислоты (pA"a 3,10; 4,76; 6,40) - заметно улучшает форму восходящего градиента рН. Изменяется участок градиента с продолжительным плато (~ до 100 мин) - градиент становится более плавным, т.е. без участков со значительно отличающимся углом наклона (кривая 5), однако время его выхода достаточно велико. Повышение концентрации лимонной кислоты в элюенте до 6 мМ и одновременно - концентрации Трис до 25 мМ - позволяет

РН

получить плавный градиент (кривая 4), практически совпадающий с полученным для "Полибуфера" в области рН 4,5 - 6,3; вместе с тем сокращается и время выхода градиента (до 80 мин). Начальный участок с резким повышением рН можно сделать более плавным за счет добавления Трис в стартовый раствор, либо за счет выбора ионной силы подвижных фаз. С учетом простого состава элюента система Трис - лимонная кислота является удачной заменой "Полибуфера".

Влияние ионной силы элюента. При изменении ионной силы подвижной фазы варьируются и условные константы протонирования (или диссоциации) функциональных групп сорбента; в результате сорбент проявляет буферные свойства в более широком диапазоне рН, чем в отсутствие сильного электролита. Такие сорбенты, как показано выше на примере анионообменников, можно назвать полиэлектролитными. Слабые катионообменные сорбенты на своей поверхности имеют примерно одинаковый набор функциональных групп (карбоксильные или карбоксиметильные) и для них полиэлектролитные свойства менее выражены.

МасгоРгер 50 СМ (сорбент с высокой емкостью). Создание высокой ионной силы в элюенте (Трис-лимонная кислота) позволяет получить практически линейный градиент в диапазоне 4 ед. рН, при этом время выхода градиента сокращается до 65 мин. Подобный градиент (рис. 27, кривая 3) не уступает градиентам, формируемым с помощью полиамфодитных элюентов и может применяться для разделения и очистки биологических макромолекул (например, белков и ферментов), рн

Рис. 27. Влияние ионной силы

7 элюента на профиль градиента рН.

Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4,6

• мм). СР: 2 мМ лимонная кислота + 1,5

мМ Трис (рН 3,3); Э: 20 мМ Трис + 5

5 мМ лимонная кислота (рН 7,6), ионная

сила (№С1): 0 (/), 0,01 (2), 0,5 (5).

* Скорость элюента 1 мл/мин.

О 20 40 во 60 V, МЛ

MN KS/R 527 (сорбент с низкой емкостью). Также проверили влияние ионной силы подвижных фаз на профиль градиентов pH, полученных на карбоксильном сорбенте с малым (5 мкм) размером частиц и невысокой ионообменной емкостью - где вклад функциональных групп сорбента в процесс формирования градиента снижается. В качестве такого сорбента выбрали MN KS/R 527 на основе сверхсшитого полистирола с карбоксильными группами. По нашим оценкам, ионообменная емкость MN KS/R 527 в 3 -4 раза ниже, чем емкость сорбента МасгоРгер 50 СМ. Следует ожидать сокращения времени формирования градиента, что важно при решении аналитических задач. Компоненты для стартового раствора и элюента выбрали на основе экспериментальных данных по формированию восходящих градиентов pH на сорбенте МасгоРгер 50 СМ.

рн

При отсутствии сильного электролита в подвижных фазах профиль градиента аналогичен полученному на сорбенте МасгоРгер 50 СМ, однако время выхода градиента рН сокращается до 35 - 40 мин (рис. 28, кривая 1). Создание ионной силы (до 0,05 - 0,1) в элюенте способствует сглаживанию отдельных участков градиента (АрН/ДУ в табл. 9), диапазон линейного участка увеличивается до 2,5 ед. рН, но вместе с тем увеличивается до 50 - 60 мин общее время выхода градиента (рис. 28, кривая 3). Добавление сильного электролита в стартовый раствор незначительно увеличивает время выхода градиента рН, но при этом градиент становится практически линейным в диапазоне рН 3-7, без перегибов и участков с различными углами наклона (кривая 2). Добавление одинакового количества ЫаС1 как в стартовый раствор, так и в элюент не приводит к заметному изменению формы градиента по сравнению с добавлением сильного электролита только в элюент (кривые 3 и 4). В данном случае градиент ионной силы отсутствует, и через 7-8 мин после начата пропускания' элюента обе системы становятся одинаковыми - из-за быстрого переуравновешивания колонки до значения ионной силы элюента (0,05). Таким образом, градиент рН. полученный при создании ионной силы в стартовом растворе (кривая 2), представляется оптимальным для использования в ХФ для разделения

биполярных макромолекул.

рН

Рис. 28. Оптимизация ионной 7силы подвижных фаз для формирования

линейного градиента рН. Колонка: MN аКБ/Т* 527 (50x4,6 мм), 5 мкм. СР: 2 мМ

лимонная кислота (рН 3,0), ионная сила: 0 (У, 3), 0,05 (2, 4). Э: 10 мМ Трис + лимонная кислота (рН 7,3), ионная сила (ЫаС1): 0 (У, 2), 0,05 (3, 4). Скорость элюента 1 мл/мин.

з

О 70 40 60 V, МЛ

Таблица 9. Параметры линейных участков градиентов, полученных на сорбенте

ГМ КЯ/Я 527 (рис. 28).

Стартовый Элюент (рН) Диапазон Протяжен ность Наклон

раствор (рН) рН лннеиного участка, мин градиента, АрН/ДУ

2 мМ лимонная 10 мМ Трис + 3,0-5,1 4,5 0,46

кислота (3,0) лимонная кислота (7,3) 5,1 -7,0 18 0,11

Такой же + 0,05 М Такой же 3,0 - 7,2 25-26 0,16

ЫаС1 (3,0)

2 мМ лимонная 10 мМ Трис + 3,0-4,6 6-7; 0,25;

кислота (3,0) лимонная кислота 0,05 М №С1 (7,3) 4,6-7,0 28 0,08

Такой же + 0,05 М Такой же 3,0-4,6; 6-7; 0,25

ЫаС1 (3,0) 4,6 - 7,0 35 0,07

рН

Применение простых элюентов в ХФ биполярных соединений. Для оценки применения полученных градиентов в хроматофокусировании разделили модельную смесь (по 0,5 мг/мл) белков (рис. 29) с близкими изоэлектрическими точками -овальбумина (р/ 4,7) и бычьего сывороточного альбумина (р/ 4,9). Присутствие сильного электролита в элюенте способствует элюированию белков при рН ниже их р/ (при рН 3,8 и 3,9, соответственно). Подобный эффект известен из литературных данных. На хроматограмме (рис. 29) пики белков (обозначены Oval, и BSA) узкие и симметричные, близкие по ширине, что в целом говорит о наличии фокусирующего эффекта; разделение происходит до базовой линии -1,5). Разница в рН, при которых элюируются белки, составляет 0,1 ед., в то время как при хроматофокусировании белков с коммерческим "Полибуфером" минимально достигнутая разница - 0,05 ед. рН. Полученные пики занимают лишь малую часть градиента рН, что говорит о потенциале данного подхода и возможности разделения многокомпонентных смесей биполярных соединений.

На сорбенте с низкой ионообменной емкостью MN KS/R 527 провели хроматофокусирование образца формиатдегидрогеназы (ФДГ) с активностью 1 мг/мл, выделенной из клеточного лизата. Структура ФДГ содержит несколько сульфидных мостиков, которые при хранении фермента окисляются до сульфогрупп, образуя тем самым изоформы ФДГ с различным количеством заряженных групп. Использовали градиент рН, полученный при создании высокой ионной силы в стартовом растворе (рис. 28, кривая 2). Полученные пики соответствуют двум изоформам формиатдегидрогеназы; они соизмеримы по площади, что косвенно свидетельствует об их происхождении за счет образования изоформ в сопоставимых количествах (рис. 30).

Рис. 29. Хроматофокусирование смеси Рис. 30. Хроматофокусирование образца ФДГ.

альбуминов. Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4,6 Колонка: MN KS/R 527 (50x4,6 мм), 5 мкм.

мм), 50 мкм. СР: 2 мМ лимонная кислота + 1,5 СР: 2 мМ лимонная кислота (pH 3,0), I = 0,05

мМ Трис (pH 3,3); Э: 20 мМ Трис + 5 мМ (NaCl); Э: 10 мМ Трис + лимонная кислота (pH

лимонная кислота (pH 7,6), I = 0,5 (NaCI), 1 7,5), 1 мл/мин. Объем пробы 20 мкл. мл/мин. Объем пробы 20 мкл.

Таким образом, показана возможность хроматофокусирования белков на карбоксильных катионообменниках МасгоРгер 50 СМ и MN при использовании простых двухкомпонентных элюентов.

Хроматофокусирование биполярных соединений (пептидов) на сульфокатионитах

Традиционно в хроматофокусировании линейные градиенты рН создают внутри ионообменных колонок, обладающих значительной буферной емкостью - в подавляющем большинстве случаев внутренние градиенты рН формируют в колонках со слабоосновными анионообменниками или слабокислотными карбоксильными катионообменниками. Сильнокислотные или сильноосновные ионообменные сорбенты практически не обладают буферной емкостью, и поэтому принято считать, что они не пригодны для использования в хроматофокусировании. С другой стороны, в ионообменной хроматографии для разделения некоторых низкомолекулярных биполярных соединений, например, смесей пептидов, на сильнокислотных катионообменных сорбентах (сульфокатионитах) традиционно используют внешние восходящие ступенчатые градиенты в широком интервале рН (от 3 до 7), либо создают восходящий градиент ионной силы. Как известно, линейные внешние градиенты рН не удается создать в таком широком диапазоне, а при формировании ступенчатого градиента на хроматограмме возникают т.н. "ложные" пики, вызванные резкой сменой параметров элюента на каждой следующей "ступени" градиента. Представляется весьма перспективным применить технику хроматофокусирования для градиентного разделения пептидов на сульфокатионитах. Наряду со снижением стоимости метода можно ожидать, что использование простых элюентов в варианте хроматофокусирования облегчит УФ детектирование при длинах волн, близких к 200 нм, где поглощает пептидная связь, тогда как полибуферные элюенты, интенсивно поглощающие в той же области, в этом случае не годятся. Таким образом, при использовании простых элюентов можно ожидать детектирования большинства пептидов, а не только ароматических.

Для разделения пептидов, полученных трипсиновым гидролизом из человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), использовали колонку PRP-X200 (Hamilton, США), заполненную катионообменным сорбентом на основе полистиролдивинилбензола с привитыми сульфогруппамн. Сформировать протяженный градиент рН на сульфокатионите, не проявляющем буферной емкости, весьма затруднительно. Применение простых подвижных фаз на основе NaH2P04 в сочетании с высокой ионной силы в стартовом растворе позволяет получить достаточно плавный градиент рН, выходящий более 10 мин (ДрН/AV = 0,38), что пригодно для задач разделения (рис. 31, кривая 4). Градиент рН, представленный на кривой 3, тоже представляет интерес, поскольку в данных условиях одновременно с ним создается восходящий градиент ионной силы (от 0,1 до 0,3). Характеристики градиентов рН представлены в табл. 10.

Создание высокой ионной силы в стартовом растворе (для получения более протяженного градиента рН) и введение пробы в начале формирования градиента позволяет детектировать до 8 пиков. Добавление ацетонитрила (до 10 об. %) в элюент уменьшает вклад гидрофобных взаимодействий ароматических пептидов с матрицей

сорбента и позволяет разделить недостаточно разрешенные пики. В этих условиях удается зарегистрировать 9-10 пептидных пиков.

Рис. 31. Влияние ионной силы подвижных фаз на профиль градиента рН внутри сульфокатионообменной колонки (Р11Р-Х200, ().

СР: 5 мМ ЫаН2Р04 (рН 3,0). ионная сила: /, 2 - 0; 3 - 0,1; 4 - 0,5.

Э: 10 мМ №Н2РО„ + 6 мМ Трис (рН 7,0), ионная сила: /, 4 - 0; 2 и 3 -0,3.

V, мл

Использование разбавленных стартовых растворов (до 3 мМ ЫаН2Р04) в сочетании с высокой ионной силой в обеих подвижных фазах (более высокой в элюенте) и небольшими добавками ацетонитрила (10 об.%) позволяет увеличить селективность разделения пептидов (рис. 32).

Таблица 10. Характеристики линейных участков градиентов рН для

Стартовый раствор (рН) Элюент (рН) Диапазон рН Протяженность линейного участка, мин АрН/АУ

5 мМ ЫаН2Р04 (3,0), 0 10 мМ №Н2Р04 + 6 мМ Трис (рН 7,0), /~0 3,4 - 6,9 2,5 1,40

Тот же, I ~0 Тот же + 0,3 М №С1 3,3-6,9 2,5 1,44

Тот же + 0,1 М №С1 Тот же + 0,3 М ИаС! 3,6 - 7,0 2,5 1,35

Тот же + 0,5 М ЫаС1 Тот же, / ~0 3,1 -6,9 -10 0,38

А. 214 Ш

Рнс. 32.

Хроматофокусирование трипсинового гидролизата ЧСА (0,1 мг) при одновременном градиенте ионной силы. СР: ЗмМ ИаН2Р04 + 0,1 М ЫаС1 + 10% СНзСЫ (рН 3,0). Э: 10 мМ ЫаН2Р04 + 6 мМ Трис + 0,3 М ЫаС1 + 10% СН3СЫ (рН 7,0).

При создании в стартовом растворе ионной силы 0,1 и в элюенте - большей ионной силы (0,3) частично разделяются слабоудерживаемые пептиды; сигнал сильноудерживаемых пептидов при этом также удается регистрировать (рис. 32). Добавление ацетонитрила препятствует размыванию пиков, в результате, в трипсиновом гидролизате при восходящем градиенте ионной силы удается детектировать до 15 пиков.

Таким образом, показана возможность применения хроматофокусирования для разделения на сульфокатионитах смесей пептидов, полученных гидролизом белка. Впервые применен новый метод одновременного формирования восходящих градиентов рН и ионной силы внутри хроматографической колонки.

Основные выводы

1. Развит и усовершенствован метод хроматофокусирования для расширения круга задач, решаемых с помощью рН-градиентного элюирования. Разработаны основы новых направлений в хроматофокусировании: а) для концентрирования и разделения ионов переходных металлов на одной хроматографической комплексообразующей колонке в условиях градиента рН; б) применение простых подвижных фаз вместо полибуферных элюентов для хроматофокусирования биполярных биологически важных соединений; в) возможность применения техники хроматофокусирования с простыми элюентами для рН-градиентного разделения пептидов на сильнокислотных катионообменных сорбентах, не обладающих буферными свойствами.

2. Предложен новый хроматографический метод разделения ионов переходных металлов с использованием внутриколоночного градиента рН, сочетающий принципы комплексообразовательной жидкостной хроматографии и хроматофокусирования. Сформулированы основы метода, требования к сорбентам, подвижным фазам - стартовым буферным растворам и буферным элюентам, способам детектирования.

3. Изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства полибуфер-ионообменника на основе полисахаридной матрицы с привитыми олигоэтиленаминами и сорбентов на основе кремнезема с ковалентно привитыми группами этилендиамина, диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина. Определены интервалы рН постоянства буферной емкости сорбентов, найдены оптимальные условия количественной сорбции металлов. Установлены зависимости, связывающие протолитические свойства сорбентов на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами с их химической природой и полиэлектролитными свойствами. Для использования в хроматофокусировании переходных металлов рекомендованы кремнеземы с привитыми группами диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина.

4. Изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов на основе органополимерных матриц (целлюлозы, полиметилметакрилата, сверхсшитого полистирола) с карбоксильными и карбоксиметильными группами в статически условиях. Исследована селективность сорбции ионов переходных металлов на данных сорбентах в зависимости от рН. Сорбенты на основе полиметилметакрилата с карбоксиметильными группами и сверхсшитого полистирола с карбоксильными группами рекомендованы для формирования градиентов рН и разделения переходных металлов.

5. Показана возможность применения комплексообразу&щих сорбентов для предварительного концентрирования переходных металлов и разделения с

использованием техники "классического" хроматофокусирования и индуцирования нисходящих градиентов рН. Коэффициенты концентрирования ионов переходных металлов в статических и динамических условиях в среднем составляют от 70-80 до 600. Достигнуто разделение модельных смесей 5 переходных металлов при использовании коммерческого полибуферного элюента и 3-4 металлов - при использовании простых элюентов в варианте хроматофокусирования.

6. Изучено влияние природы, состава и концентрации стартового раствора и элюента, включающего простые протолиты, на форму нисходящих градиентов рН в анионо- и катионообменных системах. В качестве буферных элюентов на основе протолитов для создания нисходящих градиентов рН рассмотрены одноосновные -уксусная, гликолевая; двухосновные - янтарная, винная; трех- и четырехосновные -лимонная, пиромеллитовая кислоты; низшие аминокислоты - глутамин, глугачиновая и аспарагиновая кислоты; комплексоны - НТА, ЭДТА, ЦЦТА и двухкомпонентные смеси кислот - лимонная и янтарная, лимонная и ЭДТА. Показаны преимущества использования аминокислот или двухкомпонентных смесей протолитов для формирования градиентов рН. Впервые использовано влияние ионной силы подвижных фаз на форму внутреннего градиента рН. Техника индуцирования впервые применена для формирования нисходящих градиентов рН в катионообменных системах. Выбраны новые индуцирующие растворы и элюенты, состоящие из одного-двух компонентов, позволяющие получить квази-линейные градиенты в широком диапазоне рН. Изучено влияние ионной силы индуцирующих растворов и элюентов на профиль индуцированных градиентов рН. Найдены условия формирования нисходящих квази-линейных градиентов рН в варианте хроматофокусирования и индуцирования простыми подвижными фазами, позволяющими заменить дорогостоящие, обладающие рядом недостатков коммерческие полиамфолитные полибуферные элюенты. Нисходящие градиенты рН, полученные с применением простых элюентов в варианте хроматофокусирования, использованы для разделения модельных смесей ионов металлов, аминокислот, белков (изоформ плазминогена).

7. Предложена физико-химическая модель формирования внутренних градиентов рН с применением техники хроматофокусирования, учитывающая совокупность основных гомогенных и гетерогенных равновесий в динамической ионообменной системе. Предложенная модель позволяет описывать основные особенности профилей градиентов рН, экспериментально полученных в анионообменных системах, а также учитывать влияние свойств сорбента, состава и свойств компонентов элюента и эффективности хроматографической колонки. Экспериментально оценены величины отдельных параметров модели (константы протонирования аминогрупп для кремнеземов с привитыми группами этилендиамина, диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина, коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот АГ(СГ,А") и коэффициенты обмена протона на натрий /¿(ЬГ, №+) на сорбированных дикарбоновых кислотах). На основании модели впервые объяснено образование так называемых

"аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора).

8. Изучено формирование восходящих градиентов рН в спабокислотных катионообменных системах. Ионная сила подвижных фаз также существенно влияет на профиль восходящих градиентов рН. Предложены физико-химические представления, объясняющие причины изменения характерных участков на градиентах рН при добавлении сильных электролитов. Предложены простые одно-двухкомпонентные элюенты для формирования восходящих квази-линейных градиентов рН внутри слабокислотных катионообменных колонок, не уступающие коммерческим полибуферным элюентам. Сформированные простыми элюентами восходящие градиенты рН применены для разделения смесей белков (альбуминов и изоформ формиатдегидрогеназы) методом хроматофокусирования на катионообменных колонках.

9. Показана возможность применения техники хроматофокусирования для создания линейных восходящих градиентов рН на сильнокислотных катионообменных сорбентах (сульфокатионитах), ранее считавшихся непригодными для этих целей. Предложены простые элюенты на основе дигидрофосфата натрия с добавками сильного электролита (NaCl) для сильнокислотных катионообменных систем, позволяющие детектировать пептиды в УФ области (ниже 214 нм). В выбранных условиях проведено хроматофокусирование смесей пептидов (трипсиновый гидролизат альбуминов) в сочетании с внутренним градиентом ионной силы. Данный подход значительно расширяет число регистрируемых пептидов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Иванов А.В.. Нестеренко П.Н. Формирование и применение градиентов рН в жидкостной хроматографии (обзор"). //Журн. аналит. химии. 1999. Т.54. №6. С.566-584.

2. Иванов А.В. Внутренние градиенты рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка (обзор). // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2005. Т.46. №4. С. 203-219.

3. Нестеренко П.Н, Иванов А. В. Комплексообразующие свойства полибуфер-ионообменника ПБИ-94 и их использование для разделения переходных металлов. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1992. Т.ЗЗ. №6. С.574-578.

4. Иванов А.В.. Фигуровская В.Н., Иванов В.М. Молекулярная абсорбционная спектроскопия комплексов 4-(2-пиридилазо)резорцина как альтернатива атомной абсорбционной спектроскопии. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1992. Т.ЗЗ. №6. С.570-574.

5. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. Détection of transition metals during their séparation in isoconductive pH-gradient. // J.Chromatogr. 1994. V.671. №1-2. P.95-99.

6. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. Applicability of chromatofocusing to the concentration and séparation of transition metals with tetraethylenepentamine bonded silica. // Mendeleev Communication. 1994. №5. P. 174-176.

7. Иванов A.B.. Желиговская H.H., Нестеренко П.Н. Контроль индивидуальности цис-диамминодихлороплатины методом ВЭЖХ на комплексообразуюшем сорбенте. // Журн. аналит. химии. 1995. Т.50. №2. С. 190-195.

8. Нестеренко П.Н., Иванов A.B.. Галева H.A., Сеневиратне Дж.Б.Ч. Комплексообразующие и ионообменные свойства силикагелей с привитыми олигоэтиленамииами. //Журн. аналит. химии. 1997. Т.52. №8. С.814-820.

9. Гармаш A.B., Тессман А.Б., Иванов A.B.. Нестеренко П.Н. Физико-химическая и математическая модели формирования внутреннего линейного градиента pH в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1997. Т.71. №9. С.1683-1689.

10. Гармаш A.B., Тессман А.Б., Иванов A.B.. Нестеренко П.Н. Расчет внутренних градиентов pH при хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1997. Т.71. №10. С.1872-1876.

11. Гармаш A.B., Тессман А.Б., Иванов A.B.. Нестеренко П.Н. Расчет влияния инертных компонентов элюента на градиент pH при хроматофокусировании. // Журн. физич химии. 1997. Т.71. №11. С.2054-2059.

12. Иванов A.B.. Китиашвили К.Д., Иванов В.М. Определение индивидуальности оксоплатины(1У) методом ВЭЖХ. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1998. Т.39. №2. С. 109111.

13. Тессман А.Б., Иванов A.B.. Курочкина Е.В., Гармаш A.B., Нестеренко П.Н. Моделирование внутренних градиентов pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1998. Т.23. С.347-358.

14. Иванов A.B.. Курочкина Е.В., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы элюента на формирование внутреннего градиента pH в комплексообразовательной хроматографии металлов. // Журн. физич. химии. 1998. Т.72. №6. С. 1129-1132.

15. Garmash A.V., Tessman A.B., Nesterenko P.N., Ivanov A.V. Modeling of of the internal pH-gradient in chromatofocusing. //Fresenius' J. Anal. Chem. 1998. V.361. №3. P.274-275.

16. Иванов A.B.. Нестеренко П.Н. Формирование индуцированных внутренних градиентов pH и разделение переходных металлов при использовании многокомпонентных подвижных фаз. // Известия ВУЗов. Серия "Химия и химтехнология". 1999. Т.42. №2. С. 122-128.

17. Тессман А.Б., Иванов A.B.. Нестеренко П.Н., Гармаш A.B. Образование аномальных участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т.24. С.20-22.

18. Иванов A.B.. Нестеренко П.Н. Формирование индуцированных градиентов pH и их применение в хроматографии для разделения переходных металлов. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1999. Т.40. №3. С. 155-160.

19. Иванов A.B.. Тессман А.Б. Непрерывный контроль pH эффлюента в хроматографии с градиентом pH. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1999. Т.40. №4. С.241-245.

20. Тессман А.Б., Иванов A.B.. Нестеренко П.Н., Гармаш A.B. Применение слабых органических протолитов для формирования градиентов pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1999. Т.73. №8. С. 1476-1479.

21. Иванов A.B.. Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Рунов В.К. "Аномальные" участки на профиле внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2000. Т.74. №6. С. 1103-1106.

22. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Вакштейн М.С. Влияние состава подвижных фаз на профиль начального участка фадиента рН в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т.41. №4. C.25I-255.

23. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Нестеренко П.Н. Применение кремнезема с привитыми группами окснпролина для одновременного ионохроматографического определения Na+, СГ и анионовдикарбоновых кислот. //Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т.41. №4. С.255-258.

24. Тессман А.Б., Иванов А.В.. Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и присутствия слабого основания на профиль фадиента рН в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2001. Т.75. №2. С. 342-347.

25. Тессман А.Б., Иванов А.В. Профамма "Acid-Base Calculator" для расчета рН и ионной силы в водных растворах. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №1. С. 19-22.

26. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Нестеренко П.Н. Ионохроматофафическое определение коэффициентов катионного обмена AT(H+,Na+) на сорбированных дикарбоновых кислотах для расчетов фадиентов рН в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №1. С.22-26.

27. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев А.В. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №2. С.109-111.

28. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Матвеев А.В., Ремизова Е В. Информационная база данных по внутренним фадиентам рН в хроматофокусировании. //Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. №4. С.374-380.

29. Тессман А.Б., Иванов А.В.. Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминофуппами для моделирования внутренних фадиентов рН. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №1. С. 13-16.

30. Иванов А.В.. Хасанова Е.М., Макшина Е.В., Нестеренко П.Н., Матвеев А.В., Тессман А.Б. Ионохроматофафическое определение коэффициентов анионного обмена /С(С1,А) на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №1. С.28-31.

31. Тессман А.Б., Иванов А.В. Компьютерный расчет кислотно-основных равновесий в водных растворах с помощью профаммы "Acid-Base Calculator". // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57. №1. С.6-11.

32. Иванов А.В.. Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящих фадиентов рН в катионообменных карбоксильных колонках. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №3. С. 180-182.

33. Иванов А-В. Индуцированные восходящие фадиенты рН в жидкостной хроматофафии со свободной неподвнжной фазой. // Вестн.Моск.ун-та. Серия 2. Химия, 2002. Т.43. №5. С.296-300.

34. Иванов А.В.. Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящего фадиента рН внутри колонки с карбоксильным катионообменником. // Журн. физич. химии. 2003. Т.77. №1. С.137-139.

35. Иванов А.В.. Тессман А.Б., Пирогов А.В. Формирование восходящих фадиентов рН внутри тонких капилляров со свободной неподвижной фазой. // Журн. физич. химии. 2003. Т.77. №5. С.934-938.

36. Вакштейн М.С., Иванов А.В.. Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Использование карбоновых кислот для формирования нисходящих фадиентов рН внутри колонки, заполненной

сверхсшитым полистиролом с карбоксильными группами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т.44. №4. С.258-263.

37. Иванов A.B.. Вакштейн М.С., Хасанова Е.М. Оптимизация профиля градиента pH внутри карбоксильных колонок за счет ионной силы подвижных фаз. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т.44. №5. С.318-323.

38. Иванов A.B.. Вакштейн М.С., Хасанова Е.М., Чернышев И.А., Януль Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т.44. №6. С. 412-416.

39. Иванов A.B.. Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Способ формирования внутренних градиентов pH в хроматографической колонке с карбоксильным катионообменником. //Журн. физич. химии. 2003. Т.77. №12. С.2241-2245.

40. Шпигун O.A., Пирогов A.B., Иванов A.B.. Марютина Т А., Игнатова С.Н. Системы ВЭЖХ и их использование в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. // Журн. физич. химии. 2004. Т.78. №6. С. 1124-1129.

41. Иванов A.B.. Кубышев С.С., Нестеренко Г1.Н. Нисходящие индуцированные градиенты pH в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2004. Т.45. №4. С.240-245.

42. Иванов A.B.. Тессман А.Б., Кубышев С.С. Оценка констант кислотности карбоновых кислот в водно-органических смесях для моделирования градиентов pH внутри капилляров со свободной неподвижной фазой. //Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2004. Т.45. №5. С. 339-343.

43. Тессман А.Б., Иванов A.B. Модель индуцирования восходящих градиентов pH в капиллярной жидкостной хроматографии. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2004. Т.45. №6. С.386-392.

44. Иванов A.B.. Кубышев С.С., Нестеренко П.Н., Тессман А.Б. Полиэтиленимин как компонент свободной неподвижной фазы в капиллярной жидкостной хроматографии с градиентом pH. //Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2005. Т.46. №1. С.27-32.

45. Иванов A.B.. Вакштейн М.С., Хасанова Е.М., Нестеренко П.Н. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на индуцирование градиента pH внутри карбоксильной колонки. //Журн. физич. химии. 2005. Т.79. №5. С.814-817.

46. Иванов A.B.. Кубышев С.С. Однокомпонентные элюенты для хроматофокусирования в слабоосновныханионообменных колонках. //Журн. физич. химии. 2006. Т.80. №5. С.902-907.

47. Кубышев С.С., Иванов A.B. Роль инертного компонента элюента при индуцировании градиентов pH в капиллярах со свободной неподвижной фазой. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2006. Т.47. №4. С.253-256.

48. Vakstein M.S., Nesterenko P.N., Ivanov A.V.. Tessman A.B. Single-component eluents for quasi-linear pH gradients in weak cation exchange column. // J. Liquid Chromatogr. & Related Techn.

2006. V.29. №4. P.485-496.

49. Иванов A.B.. Вакштейн M.C., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Индуцирование квазилинейных нисходящих градиентов pH в колонках с карбоксильными сорбентами. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. №5. С.675-688.

50. Иванов A.B.. Смирнова Н.Ю., Вакштейн М.С. Разделение ионов металлов на карбоксильных сорбентах с применением техники хроматофокусирования. // Журн. физич, химии

2007. Т.81. №4. С.704-709.

51. Иванов A.B.. Смирнова Н.Ю., Вакштейн М.С., Чернышев И.А. Комплексообраэующие свойства катионообменников с привитыми карбоксильными группами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2007. Т.48. №3. С. 171-177.

52. Иванов A.B.. Курек Д.В., Вакштейн М.С., Баюнов А.П. Градиент ионной силы при хроматофокусировании в карбоксильных колонках. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2007. Т.48. №4. С.250-256.

53. Иванов A.B.. Вакштейн М.С. Хроматофокусирование биполярных соединений на катионообменных колонках с помощью простых подвижных фаз. // Молекулярные технологии. 2007. Т.1. №1. С. 15-38.

54. Голубицкий Г.Б., Иванов A.B.. Басова Е.М., Иванов В.М. Анализ многокомпонентного препарата от простуды "Максиколд" методом ВЭЖХ с градиентом pH подвижной фазы. // Журн. анапит. химии. 2007. Т.62. №9. С.969-972.

55. Вакштейн М.С., Иванов A.B. Хроматофокусирование пептидов на сульфокатнонообменном сорбенте. //Журн. аналит. химии. 2007. Т.62. №10. С. 1057-1062.

56. Вакштейн М.С., Иванов A.B. Простые элюенты для формирования восходящих градиентов pH в хроматофокусировании биполярных соединений. // Журн. аналит. химии. 2007. Т.62. №11. С.1155-1161.

57. Иванов A.B.. Десяткин В.Г. Хроматофокусирование лекарственных препаратов, содержащих парацетамол, на обращенно-фазовых сорбентах. / // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2009. Т.50. №1. С.47- 54.

Благодарности.

Автор искренне признателен всем, кто принимал участие в выполнении отдельных этапов данной работы, помогал в обсуждении результатов, консультировал и поддерживал диссертанта. Приношу свою благодарность докторам химических наук Павлу Николаевичу Нестеренко, Олегу Алексеевичу Шпигуну, Карелу Шлайсу (Чехия), покойному Валентину Константиновичу Рунову; кандидату химических наук Андрею Викторовичу Гармашу; своим бывшим аспирантам, дипломникам и стажерам - Максиму Сергеевичу Вакштейну, Надежде Анатольевне Галёвой, Сергею Сергеевичу Кубышеву, Денису Вячеславовичу Куреку, Алексею Владимировичу Матвееву, Екатерине Павловне Нестеренко, Томашу Рейтару (Чехия), Надежде Юрьевне Смирновой, Алексею Борисовичу Тессману, Елене Мухамедовне Хасановой, Анне Анатольевне Цхай, Джанаки Сеневиратне Чандима (Шри-Ланка), Ивану Александровичу Чернышеву.

Формат 60 х 90 '/16 Тираж 150 экз. Объем 3 пл. Заказ 2934

Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии Издательского Дома МИСиС, 119049, Москва, Ленинский пр-т, 4 Тел. (495) 236-76-17, тел./факс (495) 236-76-35

2010183889

Стр.

Общая характеристика работы 2

Глава 1. Формирование и применение градиентов рН в жидкостной хроматографии (обзор)

1.1. Формирование градиентов рН 18

1.2. Применение градиентов рН 26

1.3. Хроматофокусирование 28

1.4. Модели формирования внутренних градиентов рН 34

1.4.1. Модели для описания гомогенной системы 35

1.4.2. Модели, учитывающие гетерогенный характер системы 42

1.5. Ионообменные сорбенты для хроматофокусирования 51

1.6. Подвижные буферные фазы в рН-градиентном элюировании . 64

Основные выводы

1. Развит и усовершенствован метод хроматофокусирования для расширения круга задач, решаемых с помощью рН-градиентного элюирования. Разработаны основы новых направлений в хроматофокусировании: а) для концентрирования и разделения ионов переходных металлов на одной хроматографической комплексообразующей колонке в условиях градиента рН; б) применение простых подвижных фаз вместо полибуферных элюентов для хроматофокусирования биполярных биологически важных соединений; в) возможность применения техники хроматофокусирования с простыми элюентами для рН-градиентного разделения пептидов на сильнокислотных катионообменных сорбентах, не обладающих буферными свойствами.

2. Предложен новый хроматографический метод разделения ионов переходных металлов с использованием внутриколоночного градиента рН, сочетающий принципы комплексообразовательной жидкостной хроматографии и хроматофокусирования. Сформулированы основы метода, требования к сорбентам, подвижным фазам - стартовым буферным растворам и буферным элюентам, способам детектирования.

3. Изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства полибуфер-ионообменника на основе полисахаридной матрицы с привитыми олигоэтиленаминами и сорбентов на основе кремнезема с ковалентно привитыми группами этилендиамина, диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина. Определены интервалы рН постоянства буферной емкости сорбентов, найдены оптимальные условия количественной сорбции металлов. Установлены зависимости, связывающие протолитические свойства сорбентов на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами с их химической природой и полиэлектролитными свойствами. Для использования в хроматофокусировании переходных металлов рекомендованы кремнеземы с привитыми группами диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина.

4. Изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов на основе органополимерных матриц (целлюлозы, полиметилметакрилата, сверхсшитого полистирола) с карбоксильными и карбоксиметильными группами в статических условиях. Исследована селективность сорбции ионов переходных металлов на данных сорбентах в зависимости от рН. Сорбенты на основе полиметилметакрилата с карбоксиметильными группами и сверхсшитого полистирола с карбоксильными группами рекомендованы для формирования градиентов рН и разделения переходных металлов.

5. Показана возможность применения комплексообразующих сорбентов для предварительного концентрирования переходных металлов и разделения с использованием техники "классического" хроматофокусирования и индуцирования нисходящих градиентов pH. Коэффициенты концентрирования ионов переходных металлов в статических и динамических условиях в среднем составляют от 70-80 до 600. Достигнуто разделение модельных смесей 5 переходных металлов при. использовании коммерческого полибуферного элюента и 3-4 металлов - при использовании простых элюентов в варианте хроматофокусирования.

6. Изучено влияние природы, состава и концентрации стартового раствора и элюента, включающего простые протолиты, на форму нисходящих градиентов pH в анионо- и катионообменных системах. В качестве буферных элюентов на основе протолитов для создания нисходящих градиентов pH рассмотрены одноосновные -уксусная, гликолевая; двухосновные - янтарная, винная; трех- и четырехосновные -лимонная, пиромеллитовая кислоты; низшие аминокислоты - глутамин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты; комплексоны - HTA, ЭДТА, ЦДТА и двухкомпонентные смеси кислот - лимонная и янтарная, лимонная и ЭДТА. Показаны преимущества использования аминокислот или двухкомпонентных смесей протолитов для формирования градиентов pH. Впервые использовано влияние ионной силы подвижных фаз на форму внутреннего градиента pH. Техника индуцирования впервые применена для формирования нисходящих градиентов pH в катионообменных системах. Выбраны новые индуцирующие растворы и элюенты, состоящие из одного-двух компонентов, позволяющие получить квазилинейные градиенты в широком диапазоне pH. Изучено влияние ионной силы индуцирующих растворов и элюентов на профиль индуцированных градиентов pH. Найдены условия формирования нисходящих квазилинейных градиентов pH в варианте хроматофокусирования и индуцирования простыми подвижными фазами, позволяющими, заменить дорогостоящие, обладающие рядом недостатков коммерческие полиамфолитные полибуферные элюенты. Нисходящие градиенты pH, полученные с применением простых элюентов в варианте хроматофокусирования, использованы для разделения модельных смесей ионов металлов, аминокислот, белков (изоформ плазминогена).

7. Предложена физико-химическая модель формирования внутренних градиентов pH с применением техники хроматофокусирования, учитывающая совокупность основных гомогенных и гетерогенных равновесий в динамической ионообменной системе. Предложенная модель позволяет описывать основные особенности профилей градиентов pH, экспериментально полученных в анионообменных системах, а также учитывать влияние свойств сорбента, состава и свойств компонентов элюента и эффективности хроматографической колонки. Экспериментально оценены величины отдельных параметров модели (константы протонирования аминогрупп для ' кремнеземов с привитыми группами этилендиамина, диэтилентриамина и тетраэтиленпентамина, коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот ЩСГ,А") и коэффициенты обмена протона на натрий Ыа+) на сорбированных дикарбоновых кислотах). На основании модели впервые объяснено образование так называемых "аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора).

8. Изучено формирование восходящих градиентов рН в слабокислотных катионообменных системах. Ионная сила подвижных фаз также существенно влияет на профиль восходящих градиентов рН. Предложены физико-химические представления, объясняющие причины изменения характерных участков на градиентах рН при добавлении сильных электролитов. Предложены простые одно-двух компонентные элюенты для формирования восходящих квазилинейных градиентов рН внутри слабокислотных катионообменных колонок, не уступающие коммерческим полибуферным элюентам. Сформированные простыми элюентами восходящие градиенты рН применены для разделения смесей белков (альбуминов и изоформ формиатдегидрогеназы) методом хроматофокусирования на катионообменных колонках.

9. Показана возможность применения техники хроматофокусирования для создания линейных восходящих градиентов рН на сильнокислотных катионообменных сорбентах (сульфокатионитах), ранее считавшихся непригодными для этих целей. Предложены простые элюенты на основе дигидрофосфата натрия с добавками сильного электролита (№С1) для сильнокислотных катионообменных систем, позволяющие детектировать пептиды в УФ области (ниже 214 нм). В выбранных условиях проведено хроматофокусирование смесей пептидов (трипсиновый гидролизат альбуминов) в сочетании с внутренним градиентом ионной силы. Данный подход значительно расширяет число регистрируемых пептидов.

302

1.7. Заключение

Обобщение литературных данных по формированию и применению градиентов рН в различных областях жидкостной хроматографии показывает, что работы будут развиваться по следующим направлениям.

Внешние градиенты рН будут применять при решении новых аналитических задач, например, при разделении ионов металлов на хелатообразующих сорбентах [31-34, 139], при анализе сложных лекарственных препаратов [18-23, 142, 143]. Вряд ли стоит ожидать поиска новых элюентов для формирования внешних градиентов рН.

Внутренние градиенты рН применяют в хроматофокусировании. Интерес исследователей к хроматофокусированию обусловлен возможностью формирования градиентов внутри ионообменных колонок в широком диапазоне рН, а также возможностью разделения веществ различных классов. Среди прочих достоинств ХФ можно назвать высокую разрешающую способность, возможность предварительного концентрирования и разделения веществ на одной колонке [4, б, 7, 63, 64, 199, 204, 205]. Представляется целесообразным развитие работ по следующим направлениям.

1). Совершенствование модели формирования внутренних градиентов рН, что позволит минимизировать эксперимент при выборе оптимальных сорбентов и элюентов. Вероятно, в модели [191-195] следует рассматривать не только протолиты, но и амфолиты в качестве компонентов буферного элюента.

2). Поиск новых сорбентов для хроматофокусирования. Например, сорбенты с привитыми биполярными группами (типа иминодиуксусной кислоты или аминокислот) в ХФ еще не применяли, хотя такие сорбенты должны проявлять буферирующую способность. Перспективным представляется также применение анионообменных хелатообразующих сорбентов для разделения переходных металлов с применением техники ХФ [28-30,35, 102].

3). Поиск новых буферных элюентов, по возможности включающих меньшее число компонентов, с целью замены дорогостоящих синтетических полиамфолитов.

4). Техника индуцирования представляется весьма перспективной, поскольку позволяет сформировать внутренние градиенты рН в течение 15-20 мин при использовании буферного элюента из 3-5 компонентов [18-23, 132, 133]. Такой подход наиболее целесообразен при работе в системах ВЭЖХ, особенно - на микроколонках. Индуцированные градиенты рН следует использовать при анализе разнообразных объектов [18-20, 176].

Глава 2. Растворы, реагенты, аппаратура, методика эксперимента, расчеты

2.1. Реагенты и растворы

Растворы солей меди(И), кобальта(И), никеля(П), кадмия(И), цинка(П), марганца(Н), свинца(И) готовили из хлоридов или нитратов, урана(У1) - из нитрата уранила, железа(Ш) - из сульфата квалификации ч.д.а. растворением точных навесок в бидистиллированной воде, подкисленной соляной или азотной кислотами. Точные концентрации растворов после приготовления проверяли с помощью комплексонометрического титрования [252]. Реагент 4-(2-пиридилазо)резорцин (ПАР), 0,025%-ный раствор, готовили из препаратов фирм "Merck" (Германия) или "Reanal" (Венгрия) растворением точной навески в 0,05 М боратном буферном растворе (рН 9,18).

Для изучения комплексообразующих свойств сорбентов в статических условиях использовали 0,20 М ацетатный буферный раствор переменного состава, приготовленный из 1 М растворов СН3СООН и' CH3COONa (рН 3 - 8) [253] и 0,025 М буферный раствор Трис-HCl (рН 7,5 - 8,5), приготовленный из сухого трис(гидроксиметил)аминометана фирмы "Serva" (Германия), квалификации ч.д.а. [254]'. В1 отдельных случаях, например", при изучении сорбции Ni2+, создавали рН 2 и ниже. Боратный 0,05 М буферный раствор готовили из фиксанала Na2B4C>7-1ОН2О фирмы "Germed" (ГДР).

Для потенциометрического кислотно-основного титрования. сорбентов использовали 0,100 М НС1 и 0,100 М NaOH, приготовленные из фиксаналов "Germed" (ГДР). Ионную силу создавали добавлением рассчитанного количества 2 М раствора NaCl, приготовленного из фиксанала.

Для кондуктометрического титрования полиамфолитных элюентов на основе "Полибуфера-74" и стартовых буферных растворов применяли 0,05 М раствор LiOH, приготовленный из препарата квалификации ч.д.а.; точную концентрацию раствора устанавливали титриметрически по 0,100 М раствору НС1 [255].

При оценке содержания первичных аминогрупп на поверхности сорбентов РВЕ-94, AP-SÍO2, En-SiC>2, Dien-SiC>2 и Tetren-Si02 использовали 1%-ный раствор нингидрина в 95%-ном этаноле, приготовленный растворением навески препарата фирмы "Merck" (Германия) квалификации ч.д.а.; 0,10 М фосфатный буферный раствор (рН 6,50) приготовленный из фиксанала. Для построения градуировочного графика готовили раствор аминогексаметилениминопропилтриэтоксисилана (АГМ-3) с концентрацией 0,96 мг/мл растворением точной аликвотной части исходного препарата в дистиллированной воде [256, 257].

Биологические препараты. Модельную смесь белков (по 0,02 мг овальбумина и бычьего сывороточного альбумина) готовили из препаратов, предоставленных проф.

A.П.Синицыным (кафедра химической энзимологии МГУ). Образец рекомбинантной формиатдегидрогеназы (ФДГ) метилотрофных бактерий, выделенных из клеток E.coli, с активностью 1 мг/мл, любезно предоставлен профессором той же кафедры

B.И.Тишковым. Лиофилизованная смесь изоформ плазминогена, полученная вытяжкой из плазмы крови, предоставлена сотрудником НИИ медицинской экологии (МНИИМЭ) к.б.н. С.М. Киселевым. Трипсиновый гидролизат получали из человеческого и бычьего сывороточного альбуминов (ЧСА, БСА). Трипсин и препараты альбуминов любезно предоставлены проф. А.П.Синицыным (кафедра химической энзимологии МГУ).

Анионообменные сорбенты. В динамических и статических условиях в качестве неподвижной фазы применяли сорбент Polybuffer-ion exchanger-94 (РВЕ-94, Полибуфер-ионообменник-94, ПБИ-94) фирмы "Pharmacia" (Швеция), на основе полисахаридной матрицы, размер частиц 45 - 165 мкм, обменная емкость 32 мкмоль/ед.рН/мл (указана производителем); а также сорбенты на основе химически модифицированных кремнеземов с привитыми группами пропиламина и олигоэтиленаминов, синтезированные д.х.н. П.Н.Нестеренко (табл. 7). Стеклянную колонку К 9/30 (300x9 мм) заполняли сорбентом РВЕ-94 или Tetren-Si02 суспензионным способом с предварительной ультразвуковой обработкой сорбента и удалением микрочастиц декантацией. Колонки для ВЭЖХ заполняли сорбентами на основе кремнезема суспензионным способом из смеси изопропанол - вода с предварительной обработкой на ультразвуковой бане.

1. Величина рН50 приведена с точностью до десятых, т.к. в статических условиях ее определяли по графикам (рис. 16), а в динамических условиях для данного элгоента она варьировалась в пределах ±0,05 ед.

2. Аналитическая хроматография. П/ред. К.И.Сакодынского. М.: Химия, 1993. 464с.

3. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. М.: Мир, 1989. 400с.

4. Жидкостная колоночная хроматография. П/ред. З.Дейла, К.Мацека и Я.Янака. В 3 тт. М.: Мир, 1978. Т.1. 556 с.

5. Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods. Uppsala: Amersham Biosciences, 2004. P. 126-165.

6. Jandera P., ChuracekJ. Gradient elution in column liquid chromatography: theory and practice. Amsterdam Oxford - New York - Tokyo: Elsevier, 1985. 510 p.

7. Amersham Biotechnology BioDirectory (Catalogue). Sweden, Uppsala, 2003. P. 500527.

8. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.536 с.

9. Moore S., Stein W.H. Chromatography of amino acids on . sulfonated polystyrene resins. // J.Biol. Chem. 1951. V.192. №2. P.663-681.

10. Moore S., Stein W.H. Procedures for the chromatographic determination of amino acids on four per cent cross-linked sulphonated polystyrene resins. // J.Biol. Chem. 1954. V.211. №2. P.893-906.

11. Boman H.G. Adsorption of prostatic phosphatase on ion-exchange resin. // Nature.1954. V.173. №4401. P.447-448.

12. Boman H.G. Chromatography of prostatic phosphatase. // Biochim.Biophys.Acta.1955. V.16.№2. P.245-253.

13. Tompkins E.R., Khym E.X., Cohn W.E. Ion-exchange as separations methods. I. The separation of fision-produced radioisotops, including individual rare earths, by compexing elution from Amberlite resin. // J. Am. Chem.Soc. 1947. V.69. №11. P.2769-2777.

14. Овчинников IO.А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение, 1987. 815 с.

15. Хроматофокусирование Полибуфером на ПБИ (russian translation). Stockholm-Uppsala: Pharmacia Fine Chemicals, 1981. 40 c.

16. Gianazza E., Righetti P.G. Immobilized pH gradients. // Electrophoresis. 2009. V.30. №1. P.112-121.

17. Иванов A.B. Внутренние градиенты pH в ионобменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка. // Вестн. Моек ун-та. Серия 2. Химия. 2005. Т.46. №4. С.203-219.

18. Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Формирование и применение градиентов рН в жидкостной хроматографии.//Журн. аналит. химии. 1999. Т.54. №6. С.566-584.

19. Slais К. Microcolumn liquid chromatography with sample-induced internal pH-gradient. //J.Microcol. Sep. 1991. V.3. P.191-197.

20. Janecek M., Salamoun J., Slais K. Sample-induced internal pH-gradients in microcolumn liquid chromatography of proteins. // Chromatographia. 1991. V.32. №1-2. P.61-64.

21. Janecek M„ Slais K. Design of mobile phase composition for liquid chromatography with an internal pH-gradient. // Chromatographia. 1993. V.36 (special issue). P.246-250.

22. Slais K., Friedl Z. Control of column influence on the wide range pH-gradient in ionexchange chromatography. // Chromatographia. 1992. V.33. №5-6. P. 231-236.

23. Slais K., Friedl Z. Low-molecular-mass pi-markers for isoelectric focusing. // J.Chromatogr.A. 1994. V.661. P.249-256.

24. Slais K. Electrophoretic focusing in a natural steady state moving pH-gradient. // J.Microcol. Sep. 1993. V.5. P.469-479.

25. Leibl H., Erber W., Eibl M.M., Mannhalter J.W. Separation of polysaccharide-specific human immunoglobulin G subclasses using a Protein A Superose column with a pH-gradient elution system. // J.Chromatogr. 1993. V.639. P.51-56.

26. Curtis MA., Witt A.F., Schram S.B, Rogers L.B. Humic acid fractionation using a nearly linear pH-gradient. // Anal.Chem. 1981. V.53. №8. P.l 195-1199.

27. McCarthy P., Peterson M.J., Malcolm R.L., Thurman-E.M. Separation of humic substances by pH-gradient desorption from hydrophobic resin. // Anal.Chem. 1979. V.51. №12. P.2041-2043.

28. Ohga K, Aritomi Y., Ohtsu H. Chromatography with pH-gradient elution of dissolved humic substances in river water. // Anal.Sci. 1989. V.5. №2. P.215-216.

29. Нестеренко П.Н., Иванов A.B. Комплексообразующие свойства полибуфер-ионообменника ПБИ-94 и их использование для разделения переходных металлов. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1992. Т.ЗЗ. №6. С.574-578.

30. Nesterenko P.N., Ivanov А. V. Detection of transition metals during their separation in an isoconductivepH-gradient. //J.Chromatogr. A. 1994. V.671. P.95-99.

31. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. The applicability of chromatofocusing to the preconcentration and separation of transition metals with tetraethylenepentamine bonded silica. // Mendeleev Commun. 1994. №5. P. 174-176.

32. Jones P., Challenger O.J., Hill S.J., Barnett N.W. Advances in chelating exchange ion chromatography for the determination of trace metals using dye-coated columns. // Analyst. 1992. V. 117. №7. P.1447-1450.

33. Challenger O.J., Hill S.J., Jones P. Separation and determination of trace metals in concentrated salt solutions used chelating-ion chromatography. // J.Chromatogr. 1993. V. 639. P.l 97-205.

34. Paull В., Foulkes M., Jones P. High-performance chelation ion chromatographic determination of trace metals in coastal sea-water using dye-impregnated resins. // Analyst. 1994. V. 119. №5. P.937-941.

35. Jones P., Challenger O.J., Hill S.J. Recent advances in high-performance metal determination. / Ion-Exchange Processes: advances and applications. Editors: A.Dyer, M. J.Hudson, P.A. Williams. Ion-Ex'93. UK, Wrexham, 1994. P.279-287.

36. Иванов A.B., Смирнова НЛО., Бакштейн М.С. Разделение ионов металлов на карбоксильных сорбентах с применением техники хроматофокусирования. // Журн. физич. химии. 2007. Т.81. №4. С.704-709.

37. Практическая и газовая жидкостная хроматография. П/ред. Б.В.Столярова, И.М.Савинова, А.Г.Витенберга. СПб: СпбГУ, 2002. 616 с.

38. Голубицкий Г.Б., Иванов А.В., Басова Е.М., Иванов В.М. Анализ многокомпонентного препарата от простуды "Максиколд" методом ВЭЖХ с градиентом подвижной фазы. //Журн. аналит. химии. 2007. Т.62. №9. С.969-972.

39. Иванов А.В., Десяткин ВТ. Хроматофокусирование лекарственных препаратов, содержащих парацетамол, на обращенно-фазовых сорбентах. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2009. Т.50. №1. С.47-54.

40. Oka Н„ Ito Y„ Kaqgami Т. Separation of lac dye components by high-speed counter-current chromatography. // J:Chromatogr. A. 1998. V.813. P.71-77.

41. Ito K, Shinomiya K, Fales H.M., Weisz A., Scher A.L. pH-zone-refining countercurrent chromatography. / In book: Modern Countercurrent Chromatography. Edited by Conway W.D., Petroski R.J. American Chemical Society, Washington. 1995. P.156-183.

42. Марютина T.A., Федотов П.С., Спиваков Б.Я. Использование методажидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой для концентрирования и1разделения неорганических веществ. // Журн. аналит. химии. 1997. Т.52. №12. С.1263-1269.

43. Counter-Current Chromatography. Editors: J.M.Menet, D.Thiebaut. New York-Basel: Marcel Dekker, 1999. 278 p.

44. Slais К., Horka M, Kleparnik K. Solute retention in open tubular liquid chromatography with flowing retentive liquid. // J. Chromatogr. 1992. V.605. P. 167-174.

45. Slais K., Horka M. Open tubular liquid chromatography with flowing retentive liquid. // J. High Resol. Chromatogr. 1993. V.16. P.195-196.

46. Slais K., Horka M. Effect of surface modification and mobile phase velocity on the performance of parallel current open tubular liquid chromatography. // J. Microcol. Sep. 1993. V.5. P.63-69.

47. Иванов А. В. Индуцированные восходящие градиенты рН в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия.2002. Т.43. №5. С.296-300.

48. Иванов А.В., Тессман А.Б., Пирогов А.В. Формирование восходящих градиентов рН внутри тонких капилляров со свободной неподвижной фазой. // Журн. физич. химии.2003. Т.77. №5. С.934-938.

49. Шпигун О.А., Пирогов А.В., Иванов А.В., Марютина Т.А., Игнатова С.Н. Системы ВЭЖХ и их использование в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. // Журн. физич. химии. 2004. Т.78. №6. С. 1124-1129.

50. Иванов А.В., Кубышев С.С., Нестеренко П.Н. Нисходящие индуцированные градиенты рН в жидкостной хроматографии со свободной неподвижной фазой. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2004. Т.45. №4. С.240-245.

51. Иванов А.В., Кубышев С.С., Нестеренко П.Н., Тессман А.Б. Полиэтиленимин как компонент свободной неподвижной фазы в капиллярной жидкостной хроматографии с градиентом рН. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2005. Т.46. №1. С.55-60.

52. Biotechnology Products Catalogue. Pharmacia Biotech. Sweden, 1994. P.59-75.

53. Perkins R. V., Nau V.J., McParthland A. Automatic pH gradient generation for protein and peptide HPLC separation. // Chromatogr.Review. 1987. V.14. №1. P.13-15.

54. Andersen Т., Pepaj M., Trones R., Lundanes E., Greibrokk T. Isoelectric point separation of proteins by capillary pH-gradient ion-exchange chromatography. // J. Chromatogr. A. 2004. V.1025. P.217-226.

55. Kim H., Lubman D.M. Micro-proteome analysis using micro-chromatofocusing in intact proteins separations. // J.Chromatogr. A. 2008. V.l 194. P.3-10.

56. Piez K.A. Some theoretical and experimental consideration of pH-gradient elution analysis. // Anal.Chem. 1956. V.28. №9. P. 1451-1454.

57. Svensson H. Isoelectric fractionation, analysis, characterization of ampholytes in natural pH-gradient. II. Buffering capacity and conductance of isoionic ampholytes. // Acta Chem.Scand. 1962. V.16. №2. P.456-466.

58. Anderson D.J., Liu Y. Protein separation using a combined internal and extrenal pH gradient on a high-performance DEAE-polymetacrylate column. // Clinical Chemistry. 1996. V.42. №6. P.194-195.

59. Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusing high-performance liquid chromatography. II. Theoretical aspects. // J.Chromatogr.A. 1997. V.762. P.47-56.

60. Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusing high-performance liquid chromatography. I. Practical aspects. // J.Chromatogr.A. 1997. V.762: P.207-217.

61. Sluyterman L.A.A., Elgersma O. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ionexchange columns. General principles. // J. Chromatogr. 1978. V.150. P. 17-30.

62. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ion exchange columns. II. Experimental verification. // J.Chromatogr. 1978. V.150. P.31-44.

63. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing. III. The properties of DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations. // J.Chromatogr. 1981. V.206. P.429-440.

64. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing. IV. Properties of an agarose polyethyleneimine ion exchanger and its suitability for protein separations. // J.Chromatogr. 1981. V.206. P.441-447.

65. Sluyterman L.A.A., Kooistra C. Ten years of chromatofocusing: a discussion. // J. Chromatogr. 1989. V.470. P.317-326.

66. Sluyterman L.A.AE., Kooistra C. Change of counter ion concentration, and of resolving power in a chromatofocusing run. // J.Chromatogr. 1990. V.519. P.217-220.

67. Righetti P.G. Isoelectric focusing: theory, methodology and applications. Amsterdam-New York-Oxford: Elsevier Biomed. Press, 1983. 386 p.

68. Chromatofocusing a fifth dimension? // Separ. News (Pharmacia bull.) 1984. (special issue). V. 12. № 1. P. 1-8.

69. All you ever wanted to know about chromatofocusing. // Separ. News (Pharmacia bull.) 1983. (special issue). V.ll. № 2. P.l-5.

70. Hutchens T.W., Gibbons W.E., Besch P.K. High-performance chromatofocusing and size-exclusion chromatography: separation of human uterine estrogenbinding proteins. // J.Chromatogr. 1984. V.297. P.283-299.

71. Hutchens T.W., Li C.M., Besch P.K. Development of focusing buffer systems for generation of wide range pH-gradients during high-performance chromatofocusing. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.157-168.

72. Hutchens T.W., Li CM., Besch P.K Performance evaluation of a focusing buffer developed for chromatofocusing on high-performance anion-exchange columns. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.169-179.

73. KangX, Frey D.D. High-performance cation-exchange chromatofocusing of proteins //J. Chromatogr. A. 2003. V.991. P. 117-128.

74. Shen IL, Frey D.D. Charge regulation in protein ion-exchange chromatography: development and experimental evaluation of a theory based on hydrogen ion Donnan equilibrium //J. Chromatogr. A. 2004. V.1034. P.55-68.

75. Quirin K. Duennschicht-Chromatographie auf pH-Gradientschichten eine Leistungsfähige Methode zur Trennung Komplexer Phosphatidmischungen. // J.Chromatogr. 1983. V.281. P.179-197.

76. Righetti P.G., Morelli A., Geiß C. pH-Measurements after isoelectric focusing in immobilized gradients. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.339-349.

77. Wenish E., Jungbauer A., Tauer Ch., Reiter M., Gruber G., Steindl F., Katinger H. Isolation of human monoclonal antibody isoproteins by preparative isoelectric focusing in immobilized pH-gradients. //J.Biochem.Biophys.Methods. 1989. V.18. P.309-322.

78. EkK, Bjellqvist B., Righetti P. G. Preparative isoelectric focusing in immobilized pH-gradients. I. General principles and methodology. // J.Biochem.Biophys.Methods. 1983. V.8. P.135-155.

79. Geiß C., Righetti P.G. Preparative isoelectric focusing in immobilized pH-gradients. II. A case report. // J.Biochem.Biophys.Methods. 1983. V.8. P.157-172.

80. Gianazza E., Dossi G„ Celentano F, Righetti P.G. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Generation and optimization of wide pH intervals with two-chamber mixers. //J.Biochem .Biophys. Methods. 1983. V.8. P.109-133.

81. Righetti P.G., Gianazza E., Bjellqvist B. Modern aspects of isoelectric focusing: two-dimensional maps and immobilized gradients. // J.Biochem.Biophys.Methods. 1983. V.8. P.89-108.

82. Righetti P.G., Gelfi C. Immobilized pH-gradients for isoelectric focusing. III. Preparative separations in highly diluted gels. // J.Biochem.Biophys.Methods. 1984. V.9. P. 103119.

83. Righetti P.G. Isoelectric focusing in immobilized pH-gradient. // J.Chromatogr. 1984. V.300. P. 165-223.

84. Giaffreda E., Tonani C., Righetti P.G. pH-Gradient simulator for electrophoretic techniques in a Window environment. // J.Chromatogr. 1993. Y.630. P.313-372.

85. Immobilized pH-gradients. Fluka-Biochemika Catalogue. Switzerland, 1994. P.l-8.

86. Righetti P.G. Immobilized pH-gradients: theory and methodology; laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Amsterdam: Elsevier, 1990. 397 p.

87. Hujsman T.H.J., Dozy A.M. Studies of the heterogeneity of hemoglobin. IX. The use of tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCL buffers in the anion-exchange chromatography of hemoglobins. //J.Chromatogr. 1965. V.19. P.160-169.

88. Vanecek G., Regnier F.E. Variables in the high-performance anion-exchanger chromatography of proteins. // Anal.Biochem. 1980. V.109. №2. P.345-353.

89. Mikes O., Strop' P., Coupek J. Ion-exchange derivatives of Spheron. I. Characterization of polymeric supports. // J.Chromatogr. 1978. V.153. P.23-36.

90. Chytilova Z., Mikes O., Farkas J., Strop P., Vratny P. Chromatography of sugars on DEAE-Spheron. // J.Chromatogr. 1978. V.153. P.36-52.

91. Mikes O., Strop P., Hostomska Z, Smrn M., Slovakova S., Coupek J. Ion-exchange derivatives of Spheron. V. Sulphate and sulpho derivatives. // J.Chromatogr. 1984. V.301. P.93-105.

92. Mikes O., Strop P., Smrn M., Coupek J. Ion-exchange derivatives of Spheron. III. Carboxylic cation exchangers. //J.Chromatogr. 1980. V.192. P. 159-172.

93. Mikes O., Strop P., Hostomska Z, Smrn M., Coupek J., Frydrychova A., Bares M. Ion-exchange derivatives of Spheron. IV. Phosphate derivatives. 7/ J.Chromatogr. 1983. V.261. P.363-379.

94. Mikes O., Strop P., ZbronekJ., Coupek J. Chromatography of biopolymers and their fragments on ion-exchange derivatives of the hydrophylic macroporous synthetic gel Spheron. // J.Chromatogr. 1976. V.119. P.339-353.

95. Mikes O., Strop P., Zbronek J., Coupek J. Ion-exchange derivatives of Spheron. II. Diethylaminoethyl Spheron. //J.Chromatogr. 1979. V.180. P. 17-30.

96. Chang Н.Т., Yeung E.S. Optimization of selectivity in capillary zone electrophoresis via dynamic pH-gradient and dynamic flow gradient. // J.Chromatogr. 1992. V.608. P.65-72.

97. Lu Т., Gray H.B. Combined pH-gradient and anion-exchange high-performance liquid chromatographic separation of oligodeoxyribonucleotides. // J.Chromatogr.A. 1994. V.686. P.339-343.

98. Островидов E.A. Электрохимический генератор градиента рН. / 5 Всес. семинар по молек. жидкост. хроматографии: Тез. докл. Рига: Зинатне, 1990. С.270.

99. Samczynski Z, Dybczynski R. Some examples of the use of amphoteric ion-exchange resins for inorganic separations. // J.Chromatogr.A. 1997. V.789. P.157-163.

100. Jones P., Nesterenko P.N. High-performance chelation ion chromatography: A new dimension in the separation and determination of trace metals. // J.Chromatogr. A. 1997. V.789. P.413-435.

101. Weiss J. Ion chromatographic system with eluent generator. / Abstr. of Internat. Seminar on Ion Chromatography. Moscow, 1998. P.40-41.

102. Young J.L., Webb B.A. Two methods for the separation of human a-fetoprotein and albumin: A affinity chromatography using blue Sepharose CL-6B and В - ampholyte displacement chromatography. //Anal. Biochem. 1978. V.88. №2. P.619-623.

103. Bloj В., Zilversmit D.B. Rat liver proteins capable of transferring phosphatidylethanolamine. //J.Biol.Chem. 1977. V.252. №5. P.1613-1619.

104. Young J. L., Webb B.A. The separation of serum proteins by ampholyte displacement chromatography. // Sci. Tools. 1978. V.25. №4. P.54-56.

105. Schmuck M.N., Gooding D.L., Gooding K.M. Comparison of porous silica packing materials for preparative ion-exchange chromatography. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.323-330.

106. Gooding D.L., Schmuck M.N., Nowlan M.P., Gooding K.M. Optimization of preparative hydrophobic interaction chromatographic purification methods. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.331-337.

107. Kato Y., Kitamura Т., Hashimoto T. Operational variables in high-performance hydrophobic interaction chromatography of proteins on TSK-gel phenyl-5PW // J.Chromatogr. 1984. V.298. P.407-418.

108. Gooding K.M., Schmuck M.N. Comparison of weak and strong high-performance anion exchange chromatography. // J.Chromatogr. 1985. V.327. P.139-146.

109. Regnier F.E. High-performance ion-exchange chromatography of proteins. // Anal.Biochem. 1982. V.126. №1. P.l-7.

110. Gooding K.M., Schmuck M.N. Ion-selectivity in the high-performance cation-exchange chromatography of proteins. // J.Chromatogr. 1984. V.296. P.321-328.

111. Kopaciewicz W„ Rounds M.A., Fausnaugh J., Regnier F.E. Retention model for high-performance ion-exchange chromatography. // J.Chromatogr. 1983. V.266. P.3-21.

112. Kopaciewicz W., Regnier F.E. Mobile phase selection for the high-performance ionexchange chromatography of proteins. // Anal.Biochem. 1983. V.133. №1. P.251-259. .

113. Roy A.K., Burgum A., Roy S. Preparation of ion-exchange silica and effect of pH on protein binding of ion-exchange silica. // J.Chromatogr.Sci. 1984. V.22. №2. P.84-86.

114. Salamoun J., Slais K. On-line precolumn photochemical generation of pH-gradient: micro-high-performance liquid chromatography of methotrexate and its impurities. // J.Chromatogr. 1990. Y.522. P.205-211.

115. Kaltenbrunner O., Tauer Ch., Brunner J., Jungbauer A. Isoprotein analysis by ionexchange chromatography using a linear pH gradient combined with a salt gradient. // J.Chromatogr. 1993. V.639. P.41-49.

116. Pharmacia LKB Biotechnology Catalogue 90-91. Pharmacia LKB. 1990. P.T23-127.

117. Hearn M.T.W., Lyttle D.J. Buffer-focusing chromatography using multi-component electrolyte elution systems. // J.Chromatogr. 1981 V. 218. P.483-495.

118. Hutchens T.W. Requirements of the mobile and stationary phases during development chromatographic focusing techniques. // Protides Biol. Fluids. 1986. V.34. P.749-752.

119. Hutchens T. W, Wiehle R.D., Shahabi N.A., Wittliff J.L. Rapid analysis of estrogen receptor heterogeneity by chromatofocusing with high-performance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1983. V.266. P.l 15-128.

120. Frey D.D., Narahari C.R., Bates R.C. Chromatofocusing. / In book: "Encyclopedia of Life Sciences". McMillan Publisher, 2001. P. 120-126.

121. Wagner G., Regnier F.E. Rapid chromatofocusing of proteins. // Anal.Biochem. 1982. V.126. №l.p.37-43.

122. Hirose A., Ishii D. Microcolumn chromatofocusing. I. Use of a 10 jam-diethylaminoethyl anion exchanger. //J.Chromatogr. 1987. V.387. P.416-419.

123. Hirose A., Ishii D. Microcolumn chromatofocusing. 1Г. High resolution chromatofocusing using a slurry packed capillary column loaded with a 10 pm DEAE anion-exchanger. //J. High.Resolut.Chromatogr.Comm. 1987. V.10. №6. P.360-361.

124. Hirose A., Ishii D. Microcolumn chromatofocusing. III. Effect of the analysis time on the resolution and the use of a semi-disposable microcolumn. // J.Chromatogr. 1988. V. 438. P. 15-22.

125. Li C.M., Hutchens T.W. Practical protein chromatography: chromatofocusing. // Methods in Molecular Biology. 1992. V.l 1. P.237-248.

126. Barre O., Solioz M. Improved protocol for chromatofocusing on the ProteomeLab PF2D. // Proteomics. 2006. V.19. № 6. P.5096-5098.

127. Slais K. Simultaneous conductivity and potentiometric detector for miniaturized liquid chromatography and flow analysis.// J.Chromatogr. 1991. V.540. P.41-51.

128. Иванов A.B., Нестеренко П.Н. Формирование индуцированных внутренних градиентов рН и разделение переходных металлов при использовании многокомпонентных подвижных фаз. // Известия ВУЗов. Сер. Химия и химтехнология. 1999. Т.42. №2. С.122-128.

129. Иванов А.В., Бакштейн М.С., Хасанова Е.М., Нестеренко П.Н. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на индуцирование градиента рН внутри карбоксильной колонки. //Журн. физич. химии. 2005. Т.79. №5. С.940-942.

130. Emond J.P., Page М. An approach to ampholyte-displacement chromatography. // J.Chromatogr. 1980. V.200. P.57-63.

131. Caslavska J., Molteni S., ChmelikJ., Slais K, MatulikF., Thormann W. Behavior of substituted aminomethylphenol dyes in capillary isoelectric focusing with electroosmotic zone displacement. // J.Chromatogr.A. 1994. V.680. P.549-559.

132. Slais K., Friedl Z. Ampholyte dyes for spectroscopic determination of pH in electrofocusing. //J.Chromatogr.A. 1995. V.695. P.l 13-122.

133. Lubman D.M., Kachman M., WangHX., GongS., YanF., Hamler R.L., O'Neil K.A., Zhu K., Buchanan N.S., Border T.J. Two-dimensional liquid separations-mass mapping of proteins from human cancer cell lysates. // J. Chromatogr. B. 2002. V.782. P.183-196.

134. Slais K. Model of electrophoretic focusing in a natural pH-gradient moving in a tapered capillary. // J.Chromatogr. 1994. V.684. P.149-161.

135. Frey D.D., Narahari C.R., Butler C.D. General local-equilibrium chromatbgraphic theory for eluents containing adsorbing buffers // AIChE Journal. 2002. V.48. P.561-571.

136. Paull В., Jones P. A comparative study of the metal selective properties of chelating dye impregnated resins for the ion chromatographic separation of trace metals. // Chromatographia. 1996. V.42. №9-10. P.528-538.

137. Химия привитых поверхностных соединений. П/ред. Г.В.Лисичкина. М.: Физматлит, 2003. 592 с.

138. Голубицкий Г.Б., Будко Е.В., Иванов В.М., Басова Е.М. Количественный анализ таблеток "Пенталгин" методами градиентной и изократической высокоэффективной жидкостной хроматографии. //Журн. аналит. химии. 2006. Т.61. №4. С.383-387.

139. Голубицкий Г.Б., Басова Е.М., Иванов В.М. Возможности градиентной ВЭЖХ при анализе некоторых многокомпонентных лекарственных форм. // Журн. аналит. химии. 2008. Т.63. №9. С.962-968.

140. Kaliszan R, Wiczling P., Markuszewski M.J. рН Gradient reversed-phase HPLC. // Anal.Chem. 2004. V.76. №3. P. 749-760.

141. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.:Мир, 1991.544 с.

142. Mhatre R., Nashaben W., Schmalzing D., Yao X, Fuchs M., Whitney D., Regnier F. Purification of antibody Fab fragments by cation-exchange chromatography and pH gradient elution. //J.Chromatogr.A. 1995. V.707. P.225-231.

143. Mant C.T., Hodges R.S. Separation of peptides by strong cation-exchange highperformance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1985. V.327. P.147-155.

144. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. П/ped. АХеншеи, К.-П.Хупе, Ф.Лотитайха, В.Вельтера. М.: Мир, 1988. 688 с.

145. Kang X, Frey D.D. Chromatofocusing of peptides and proteins using linear pH gradients formed on strong ion-exchange adsorbents. // Biotechnol. Bioeng. 2004. V.87. P.376-387.

146. Shen H., Li X, Bieberich C.J., Frey D.D. Reducing sample complexity in proteomics by chromatofocusing with simple buffer mixtures. // Methods Molecular. Biol. 2007. V.424. P. 187-203.

147. Mürel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to the theory and practice of chromatofocusing. II. Experimental verification. // J.Chromatogr. 1986. V.362. P.101-112.

148. Shamoon J.M., Davies I.A.I. Separation of the enkephalins from proteins in an aqueous medium by chromatofocusing. // J.Chromatogr. 1984. V.314. P.499-505.

149. Jungbauer A„ Tauer Ch., Wenish E., Uhl K, Brunner J., Purtscher M., Steindl F., Buchacher A. Isolation of isoproteins from monoclonal antibodies and recombinant proteins by chromatofocusing. //J.Chromatogr. 1990. V.512. P. 157-163.

150. Hjerten S., Li J.-P. High-performance chromatofocusing of proteins on agarose column. I. Macroporous 15-20 (im BEADS. // J.Chromatogr. 1989. V.475. P.167-175.

151. Hjerten S., Li J.-P., Liao J.L. High-performance chromatofocusing of proteins on agarose columns. II. Deformed non-porous 12-15 pm BEADS. // J. Chromatogr. 1989. V.475. P.177-185.

152. Campeau J.D., Marrs R.P., Di-Zerega G.S. Comparison of chromatofocusing and isoelectric focusing in recovery of specific activity from biological fluids. // J.Chromatogr. 1983. V.262. P.334-339.

153. Gysin R„ Yost B., Flanagan S.D. Immunochemical and molecular differentiation-of 43000 molecular weight proteins associated with Torpedo rieuroelectrolyte synapses. // Biochemistry. 1983. V.22. №25. P:5781-5789.

154. Gallo P., Olsson O., Siden-Ae. Small-column chromatofocusing of cerebrospinal fluid and serum immunoglobulin G. // J.Chromatogr. Biomed. Appl. 1986. V. 375. P.277-283.

155. Alexander N.M., Neeley W.E. Chromatofocusing of human hemoglobins. // J.Chromatogr. Biomed. Appl. 1982. V. 230. P.137-141.

156. Bates R., Frey D.D. Quasi-linear pH gradients for chromatofocusing using simple buffer mixtures: local equilibrium theory and experimental verification. // J. Chromatogr.A. 1998. V.814.P.43-54.

157. Narahari C.R., Strong J.C., Frey D.D. Displacement chromatography of proteins using a self-sharpening pH front formed by adsorbed buffering species as the displacer. // J.Chromatogr. A. 1998. V.825. P.l 15-126.

158. Bates R., KangX., Frey D.D. High performance chromatofocusing using linear and concave pH gradients formed with simple buffer mixtures. I. Effect of buffer composition on the gradient shape. // J. Chromatogr. A. 2000. V.890. P.25-36.

159. Kang X., Bates R.C., Frey D.D. High performance chromatofocusing using linear and concave pH gradients formed with simple buffer mixtures. II. Separation of Proteins. // J.Chromatogr. A. 2000.V. 890. P.37-43.

160. Бакштейн M.C. Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов рН в катионообменных системах. Дисс. . канд. хим. наук. М.: МГУ. 2006. 156 с.

161. Бакштейн М.С., Иванов А.В. Простые элюенты для формирования восходящих градиентов рН в хроматофокусировании биполярных соединений. // Журн. аналит. химии. 2007. Т.62. №11. С.1155-1162.

162. Иванов А.В., Бакштейн М.С. Хроматофокусирование биполярных соединений на катионообменных колонках с помощью простых подвижных фаз. // Молекулярные технологии. 2007. Т.1. №1. С.15-38.

163. Porath J. High-performance immobilized metal-ion-affinity chromatography of peptides and proteins. // J.Chromatogr. 1988. V.443. P.3-11.

164. Belew M., Yip T.T., Andersson L., Ehrnststromt R. High-performance analytical applications of immobilized metal-ion affinity chromatography. // Anal.Biochem. 1987. V.164. №2. P.457-465.

165. Kato Y., Nakamura K., Hashimoto T. High-performance metal chelate affinity chromatography of proteins. // J.Chromatogr. 1986. Y.354. P.511-517.

166. Michalski W.P. Resolution of three forms of superoxide dismutase by immobilised metal affinity chromatography. // J.Chromatogr. Biomed. Appl. 1992. V. 576. P.340-345.

167. Metal chelate affinity chromatography. // Separ.News (Pharmacia bull.) 1983. V.ll. №2. P.7-9.

168. Иванов А.В., Курочкина E.B., Нестеренко П.H. Влияние ионной силы элюента на формирование внутреннего градиента рН в комплексообразовательной хроматографии переходных металлов. //Журн. физич. химии. 1998. Т.72. №6. С.1129-1132.

169. Иванов А.В., Бакштейн М.С., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Индуцирование квазилинейных нисходящих градиентов рН в колонках с карбоксильными сорбентами. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. №5. С.675-688.

170. Vakstein M.S., Nesterenko P.N., Ivanov A.V., Tessman А.В. Single-component eluents for quasi-linear pH gradients in weak cation exchange columns. // J. Liq. Chrom. & Related Techn. 2006. V.29. №4. P.485-489.

171. Иванов А.В., Кубышев С. С. Однокомпонентные элюенты для хроматофокусирования в слабоосновных анионообменных колонках. // Журн. физич. химии. 2006. Т.80. №5. С.902-907.

172. Murel A., Vilde S., Pank М., Shevchuk I., Kirret О. Chromatophoresis: a new approach to the theory and practice of chromatofocusing. I. General principles. // J.Chromatogr. 1985. V.347. P.325-334.

173. Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies of multicomponent chromatography using pH-gradient. // AIChE Journal. 1995. V.41. №5. P.l 171-1183.

174. Strong J. C., Frey D.D. Experimental and numerical studies of the chromatofocusing of dilute proteins using retained pH gradients formed on a strong-base anion-exchange column. // J.Chromatogr. 1996. V.769. P.129-143.

175. Pabst T.M., Carta G. pH Transitions in cation exchange chromatographic columns containing weak acid groups. // J.Chromatogr. A. 2007. V.l 142. P. 19-31.

176. Slais K. Sample-induced internal gradient and ionic strength in ion-exclusion microcolumn liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1989. V.469. P.223-229.

177. Rejtar Т., Slais K. Isotachophoretic focusing of strong and weak electrolytes in combined pH and conductivity gradients. // J.Chromatogr. A. 1999. V.838. P.71.

178. Тессман А.Б., Иванов A.B. Модель индуцирования восходящих градиентов pH в капиллярной жидкостной хроматографии. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2004. 45. № 6. С.386-392.

179. Frey D.D. Local-Equilibrium Behavior of Retained pH and Ionic Strength Gradients in Preparative Chromatography. // Biotechnol. Prog. 1996. V.12. P.65-72.

180. Farnan D., Frey D.D., Horvath C. Intraparticle Mass Transfer in High-Speed Chromatography of Proteins. // Biotechnol. Progr. 1997. V.13. №4. P.429-439.

181. Farnan D„ Frey D.D., Horvath C. Surface and pore diffusion in macroporous and gel-filled gigaporous stationary phases for protein chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. V.959. P.65-73.

182. KangX., Frey D.D. Chromatofocusing using micropellicular column packings with computer-aided design of the elution buffer composition. // Anal. Chem. 2002. V.74. №5. P. 1038-1045.

183. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Расчет внутренних градиентов рН при хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1997. Т.71. №10. С. 1872-1876.

184. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Расчет влияния инертных компонентов элюента на градиент рН при хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1997. Т.71. №11. С. 2054-2059.

185. Garmash А. V., Tessman А.В., Nesterenko P.N., Ivanov А. V. Modeling of the internal рН gradient in chromatofocusing. // Fres. J. .Anal. Chem. 1998. V.361. №3. P.274-275.

186. Иванов A.B., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Рунов В.К. "Аномальные" участки на профиле внутреннего градиента рН. // Журн. физич. химии. 2000. Т.74. № 6. С. 11031106.

187. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н Физико-химическая и математическая модель формирования внутреннего линейного градиента рН в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1997. Т.71. №9. С. 1683-1689.

188. Тессман А.Б., Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и присутствия слабого основания на профиль градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2001. Т.75. №2. С.342-347.

189. Тессман А.Б. Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка. Дисс. . канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000. 158 с.

190. Brorson К., Shen Н, Lute S., Soto Pérez J., Frey D.D. Characterization and purification of bacteriophages using chromatofocusing. // J. Chromatogr. A. 2008. V.1207. P.l10-121.

191. Shen H., Frey D.D. Serial displacement chromatofocusing and its applications in multidimensional chromatography and gel electrophoresis: I. Theory and general considerations. // J. Chromatogr. A. 2009. V.1216. P.967-976.

192. Shen H, Li X, Bieberich C.J., Frey D.D. Serial displacement chromatofocusing and its applications in multidimensional chromatography and gel electrophoresis: II. Experimental results. // J. Chromatogr. A. 2009 V.1216. P.977-986.

193. Тессман А.Б., Иванов A.B., Нестеренко П.H, Гармаш А.В. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента рН в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1999. Т.73. № 8. С.1476-1479.

194. Chun S.W., Bae J.Y., Kim J.D. Protein separation and focusing in a transient pH-gradient column. // Separ. Science Techn. 1995. V.30. №10. P.2101-2125.

195. Ledesma M.D., Avila J., Correas I. Isolation of a phosphorylated soluble tau-fraction from alzheimers-disease brain. //Neurobiol. Agins. 1995. V.16. №4. P.515-522.

196. Frey D.D., KangX. New concepts in the chromatography of peptides and proteins. // Curr. Opin. Biotechnol. 2005. V.16. P. 552-560.

197. Soto-Pérez J., Frey D.D. Behavior of the inadvertant pH transient formed by a salt gradient in the ion-exchange chromatography of proteins. // Biotechnol. Progr. 2005. V.21. P.902-910.

198. Majors R.E. High performance liquid chromatography columns and column technology: a state-of-the-art reviews (Parts I and II). // J Chromatogr Sci. 1980 V.18. №9. P.393-486.

199. Лисичкин Г.В., Староверов C.M. Высокоэффективные химически модифицированные кремнеземные сорбенты для жидкостной хроматографии. // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1983. Т.28. №1. С.47-53.

200. Шпигун О.А., Золотое Ю.А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М.: Изд-во МГУ, 1990. 199 с.

201. Нестеренко П.Н., Иванов А. В., Галева Н.А., Сеневиратне Дж. Комплексообразующие и ионообменные свойства силикагелей с привитыми олигоэтиленаминами. //Журн. аналит. химии. 1997. Т.52. №8. С.814-820.

202. Херинг Р. Хелатообразующие ионообменники. М.: Мир, 1971. 279 с.

203. Мархол М. Ионообменники в аналитической химии. Свойства и применение в неорганической химии. В 2-х тт. М.: Мир, 1985. Т.1. 264 е.; Т.2. 280 с.

204. Ley den D.E., Luttrell G.H., Patterson Т. A. Silica gel with immobilized chelating groups as an analytical sampling tool. // Anal.Lett. 1975. V.8. №1. P.51-56.

205. Кудрявцев Г.В., Иванов B.M., Лисичкин Г.В. Закономерности сорбции переходных металлов химически модифицированным силикагелем. // Докл. АН СССР. 1980. Т. 250. №3. С.635-638.

206. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Иванов В.М. Сорбция цветных металлов кремнеземами с привитыми органическими соединениями. // Журн. аналит. химии. 1983. Т.38. № 1. С.22-32.

207. Скопенко В.В., Лишко Т.П., Трофгмчук А.К., Сухан Т.А. Сорбция металлов аэросилом, содержащим привитые диэтилентриаминные группы. // Укр. хим. журн. 1986. Т.52. № 8. С.814-818.

208. Okada.T. Multifunctional separation with polyamine-bonded resin. // Anal. Chim. Acta. 1995. V.303. P. 193-197.

209. Soliman E.M. Synthesis and metal collecting properties of mono-, di-, tri- and tetramine based on silica gel matrix. // Anal. Lett. 1997. V.30. №9. P.1739-1751.

210. El-Nahhal I.M., Zaggout F.R., El-Ashar N.M. Uptake of divalent metal ions by polysiloxane immobilized monoamine ligand system. // Anal. Lett. 2000. V.33. №10. P.2031-2053.

211. Zaggout F.R., El-Nahhal I.M., El-Ashgar N.M. Uptake a divalent metal ions

212. Zn2+ and Cd2+) by polysiloxane immobilized diamine ligand system. // Anal. Lett. 2001. V.34. № 2. P. 247-266.

213. Bakircioglu Y., Seren G., Akman C. Determination of cadmium, copper and zinc by flame atomic abrorption spectrometry after preconcentration using a DETA (diethylenetriamine) polymer.// Anal. Lett. 2001. V.34. № 3. P:439-447.

214. Ofman R., Wanders R.J.A. Purification of peroxisomal acyl-CoA: dihydroxyacetonephosphate acyltransferase from human placenta. // Biochim. Biophys. Acta 1994. V.1206. №1. P.27-34.

215. Jacob L., Beecken V., Bartunik L.J., Rose M., Bartunik H.D. Purification and crystallization of yeast hexokinase isoenzymes: Characterization of different, forms by chromatofocusing. //J. Chromatogr. 1991. V.587. P.85-92.

216. Alpert A ,J. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of proteins on poly(aspartic acid)-silica // J. Chromatogr. 1983. V.266. P.23-37.

217. Alpert A. J, Andrews P.C. Cation-exchange chromatography of peptides on poly(2~ sulfoethyl aspartamide)-silica. // J. Chromatogr. 1988. V.443. P.85-96.

218. Hunter A.K., Carta G. Protein adsorption on novel acrylamido-based polymeric ion-exchangers: I. Morphology and equilibrium adsorption. // J.Chromatogr. A. 2000. V.897. P.65-80.

219. Shen H., Frey D. D. Effect of charge regulation on steric mass-action equilibrium for the ion-exchange adsorption of proteins. // J. Chromatogr. A. 2005. V.1079. P.92-104.

220. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. 304 с.

221. Mazzeo J.R., Martineau J.A., Krull I.S. Peptide mapping using EOFDriven capillary isoelectric focusing. // Anal. Biochem. 1993. V.208. P.323- 329.

222. Mantabe T. Capillary electrophoresis of proteins for proteomic studies. // Electrophoresis 1999. V.20. P.3116-3121.

223. Shen Y., Berger S.J., Anderson G.A., Smith R.D. High-efficiency capillary isoelectric focusing of peptides. // Anal. Chem. 2000. V.72. P.2154- 2159.

224. Mohan D., Lee C.S. Extension of separation range in capillary isoelectric focusing for resolving highly basic biomolecules. // J. Chromatogr. A. 2002. V.979. P.271- 276.

225. Модифицированные кремнезёмы в сорбции, катализе и хроматографии. П/ред Г.В.Лисичкина. М.: Химия, 1986. 248 с.

226. Sillen L.G., Martell А.Е. Stability constants of metal-ion complexes. Special publication № 17. London: The Chemical Society. 1964. 754 p.

227. Sillen L.G., Martell A.E. Stability, constants of metal-ion complexes. Special publication № 25. London: The Chemical Society. 1971. 866 p.

228. Салдадзе KM., Копылова-Валова В.Д. Комплексообразующие иониты (комплекситы). М.: Химия, 1980. 336 с.

229. Паршина КН., Стряпков А.В. Сорбция ионов металлов органическими катеонитами из карьерных растворов. // Вестник ОГУ. Химия. 2003. №5. С.107-109.

230. Gelsema W.J., de Ligny C.L. Are shew concentration distribution of ampholytes in isoelectric focusing due to specific conductivity changes with pH? // J.Chromatogr. 1979. V.178. P.550-554.

231. Baldesten A. Theoretical and practical aspects of isotachophoretic separations of weak electrolytes. // Sci. Tools. 1980. V.27. №1. P.2-7.

232. Righetti P.G., Pagani M., Gianazza E. Characterization of synthetic carrier ampholytes for isoelectrofocusing. // J.Chromatogr. 1975. V.109. P.341-356.

233. Charlionet R., Martin J.P., Sesboue R., Madec P. J., Lefebvre F. Synthesis of highly diversified carrier ampholytes. Evaluation of the resolving power of isoelectric focusing in the Pi-system. // J.Chromatogr. 1979. V.176. P.89-101.

234. Charlionet R., Morcamp C., Sesboue R., Martin J.P. Limiting factors for the resolving power of isoelectric focusing in natural pH-gradient. // J.Chromatogr. 1981. V.205. P.355-366.

235. Nguen N.Y., Salokangas A., Chrambach A. Electrofocusing in natural pH-gradients formed by buffers: gradient modifications. // Anal. Biochem. 1977. V.78. № 1. P.287-294.

236. Prestige R.L., Hearn M.T.W-. The application of buffer electrofocusing to granulated flat bed media. // Sep. Purif. Methods. 1981. V.10. № 1. P.l-28.

237. Leebach D.H., Robinson H.K. Carrier ampholyte displacement, chromatography. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1975. V.67. P.248-254. (цит. no: Serva Catalogue. Fine Biochemicals Separation Technology. 1989. P.400-401.

238. Righetti P.G., Hjerten S. High-molecular-weight carrier ampholytes for isoelectric focusing of peptides. //J.Biochem. Biophys. Methods. 1981. V.5. № 5. P.259-272.

239. Шварценбах Г., Флашка Г. Комилексонометрическое титрование. М.: Химия, 1970.360 с.

240. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. 456 с.

241. Ramette R.W. Buffers Plus. //J.Chem.Educ.Software 1989. V.2B. №2. P.220-228.

242. Худякова T.A., Крешков А.П. Теория и практика кондуктометрического и хронокондуктометрического анализа. М.: Химия, 1976. 304 с.

243. Шапилов О.Д., Каюмов В.Г., Крашеток А.Г. Спектрофотометрическое определение аминогрупп в пористых силикатных сорбентах с помощью нингидрина. // Журн. аналит. химии. 1983. Т.38. №3. С.564-566.

244. Taylor /., Howard A.G. Measurement of primary amine groups on surface-modified silica and their role in metal binding. // Anal. Chim. Acta. 1993. V.271. P.77-82.

245. Сайт компании "Hamilton" (США):http://www.hamiltoncompanv.com/product/hplc/prpx8Q0.htmUhttp://www.hamiltoncoinpanv.com/newdev/HPLC/cation.asp .

246. Тессман А.Б., Иванов А.В. Компьютерный расчет кислотно-основных равновесий в водных растворах с помощью программы "Acid-Base Calculator". // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57. №1. С.6-11.

247. Иванов А.В., Тессман А.Б. Непрерывный контроль рН эффлюента в хроматографии с градиентом рН. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1999. Т.40. №4. С.241-244.

248. Иванов А.В., Фигуровская В.К, Иванов В.М. Молекулярная абсорбционная спектроскопия 4-(2-пиридилазо)резорцина как альтернатива атомно-абсорбционной спектроскопии. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1992. Т.ЗЗ. №6. С.570-574.

249. Dasgupta Р.К. Post-column techniques: a critical perspective for ion chromatography. II. Determination of metals, various ionic and ionizable species. // J.Chromatogr. Sci. 1993. V.27. P.431-443.

250. Elchuk S., Cassidy R.M. Separation of the lantanides on high efficienty bonded phases and conventional ion exchange resins. // Anal. Chem. 1979. V.51'. №9. P.1434-1438.

251. Lucy Ch.A., Ye L. Displacement post-column detection reagents based on the fluorescent magnesium 8-hydroxyquinoline-5-sulfonic acid complexes. // J.Chromatogr. 1994. V.671. P.121-129.

252. Нестеренко П.Н. Высокоэффективная' комплексообразовательная хроматография ионов металлов. Дисс. . докт. хим. наук. М.: МГУ, 1999. 465 с.

253. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В. Методы гетерогенизации функциональных . органических соединений на минеральных носителях. // Доклады АН СССР. 1979. Т.247. №1.С.117-121.

254. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Сопоставление свойств привитых к поверхности кремнезема лигандов и их комплексов с гомогенными аналогами. // Адсорбция и адсорбенты. 1984. №12. С.33-39.

255. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Кислотно-основные свойства кремнезема, химически модифицированного у-аминопропилтриэтоксисиланом. // Журн. физич. химии. 1981. Т.55. №5. С.1352-1354.

256. Mant С.Т., Hodges R.S. Separation of peptides by strong cation-exchange highperformance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1985. Y.327. P.147-155.

257. Dizdaroglu M. Weak anion-exchange high-performance liquid chromatography of peptides. //J.Chromatogr. 1985. V.334. P.49-69.

258. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Иванов B.M., Фигуровская В.Н. Комплексообразующие минеральные сорбенты для хроматографии. // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1979. Т.24. № 3. С.294-296.

259. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Нестеренко П.Н. Химически модифицированные кремнеземы и их применение в химическом анализе. // Журн. аналит. химии. 1983. Т.38. № 9. С. 1684-1705.

260. Tascioglu S., Koklu U. Iron (III), cobalt (II) and nickel (II) adsorptions on the surface-modified silica. // Chim. Acta Turcica. 1986. V.14. P.387-394. (цит. no: Chem. Abstr. 1986. V.104. № 136645).

261. Иванов B.M., Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Нестеренко П.Н. Сорбционное концентрирование и разделение микроэлементов на химически модифицированных кремнеземах. / Определение малых концентраций элементов. М.: Наука, 1986. С.107-118.

262. Tikhomirova T.I., Fadeeva V.I., Kudryavtsev G.V., Nesterenko P.N., Ivanov KM., Savitchev A.T., Smirnova N.S. Sorption of noble metal ions on silica with chemically bonded nitrogen-containing ligands. //Talanta. 1991. V.38. №3. P.267-274.

263. Den-Bleyker K.T., Sweet Т.К. Thin-layer chromatography of metal ions*on bonded stationary phases. // Chromatographia. 1980. Y.13. №2. P.l 14-118.

264. Leyden D.E., Luttrell G.H., Nonidez W.K, Werho D.B. Preconcentration of certain . -anions using reagents immobilized via silylation. // Anal. Chem. 1976. V.48. №1. P.67-70.

265. Leyden D.E., Luttrell G.H. Preconcentration of trace metals using chelating groups immobilized via silylation. // Anal. Chem. 1975. V.47. №9. P. 1612-1617.

266. Leyden D.E., Luttrell G.H., Sloan A.E., De Angelis N.J. Characterization and application of silylated substrates for the preconcentration of cations. // Anal. Chim. Acta. 1976. V.84. P.97-108.

267. Burggraf L.W., Kendall D.S., Leyden D.E., Pern F.J. Photoacoustic studies of complexation of copper (II) with an ethylenediamine analogue immobilized on silica gel. // Anal. Chim. Acta. 1981. Y.129. P. 19-27.

268. Kvitek R.J., Evans J.F., Carr P. W. Diamine/silane modified controlled pore glass. The covalent attachment reaction from aqueous solution and the mechanism of reactions of bound diamine with copper(II). // Anal. Chim. Acta. 1982. V.144. P.93-106.

269. Northscot S.E., Leyden D.E. Separation of uranium from molybdenum using diamine functional group bonded to controlled pore glass. // Anal. Chim. Acta. 1981. V.126. P.l 17-124.

270. Leyden D.E., Steele M.L., Jablonski B.B., Somoano R.B. Structural studies of immobilized ethylenediamine as a preconcentrating agent for molybdate and tungstate.// Anal. Chim. Acta. 1978. V.100. P.545-554.

271. Лишко Т.П., Сухап T.A., Трофимчук A.K., Трачевский В.В., Скопенко В.В. Комплексы меди (II) и кобальта (II) с закрепленным на поверхности SiC>2 диэтилентриамином. //Коорд. химия. 1983. Т.9. № 10. С.1342-1348.

272. Kudryavtsev G.V., Miltchenko D.V., Yagov V.V., Lopatkin A.A. Ion sorption on modified silica surface. //J.Colloid. Interface. Science. 1990. V.140. P.l 14-122.

273. Алимарин И.П., Нестеренко П.Н., Иванов B.M. Закономерности сорбции золота (III) азотсодержащими химически модифицированными кремнеземами. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 271. № 3. С.627-629.

274. Кузьмин H.M., Гребнева O.H., Пуховская B.M., Цизин Г.И., Золотое Ю.А. Online сорбционно-атомно-эмиссионное (с индуктивно связанной плазмой) определение редкоземельных элементов в растворах. // Журн. аналит. химии. 1994. Т.49. №2. С. 184189.

275. Цизин Г.И., Серегина И.Ф., Сорокина Н.М., Формановский А.А., Золотое Ю.А. Рентгенофлуоресцентное определение токсичных элементов в водах с использованием сорбционных фильтров. // Заводск. лаб. 1993. Т.59. №10. С.1-5.

276. Серегина И.Ф., Цизин Г.И., Шилъников A.M., Формановский А.А., Золотое Ю.А. Сорбционно-рентгенофлуоресцентное определение металлов в водах. // Журн. аналит. химии. 1993. Т.48. №1. С. 166-175.

277. Cortes H.J. High-performance liquid chromatography of inorganic and organic anions using ultraviolet detection and an amino column. // J.Chromatogr. 1982. V 234. №3. P. 517-520.

278. Vialle J., BertrandM.C., Kolosky M., Paisse O., Raffin G. Interet des complexations dans l'analyse des metaux par chromatographie ionique. // Analusis. 1989. V.l7. №7. P.376-388.

279. Иванов А. В., Желиговская H.H., Нестеренко П.Н. Контроль индивидуальности цис-диамминодихлороплатины(П) методом ВЭЖХ на комплексообразующем сорбенте. // Журн. аналит. химии. 1995. Т.50. №2. С.190-195.

280. Leuenberger U„ Gauch R., Rieder К, Baumgartner E. Determination of nitrate and bromide in foodstuffs by high-perfomance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1980. V 202. P.461-468.

281. Domazetis G. Determination of anions by non-supressed ion chromatography using an amine column. // Chromatographia. 1984. V.18. №7. P.383-386.

282. Faltynski K.H., Jezorek J.R. Liquid chromatographic separation of metal ions on several silica-bound chelating-agent stationary phases. // Chromatographia. 1986. V.22. №1-6. P.5-12.

283. McNeff C., Zhao O., Carr P.W. High-performance anion exchange of small anions with polyethylenimine-coated porous zirconia. // J.Chromatogr. 1994. V.684. P.201-211.

284. Haddad P.R., Heckenberg A.L. Determination of inorganic anions by highperformance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1984. V.300. P.357-394.

285. Иванов A.B., Китиашвили К.Д., Иванов B.M. Определение индивидуальности оксоплатины(Г/) методом ВЭЖХ. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1998. Т.39. №2. С. 109-111.

286. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Влияние ионной силы на сорбцию переходных металлов химически модифицированными кремнеземами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1983. Т.24. № 1. С.85-87.

287. Макроциклические соединения в аналитической химии. П/ред Ю.А.Золотова и Е.М.Кузьмина. М.: Наука, 1993. 320 с.

288. Скопенко В.В., Трофимчук А.К, Глущенко Л.В., Каминский В.П. Образование комплексов серебра на поверхности у-аминопропилаэросила. // Журн. неорг. химии. 1983. Т.28. №10. С.2568-2571.

289. Перрин Д. Органические аналитические реагенты. М.: Мир, 1967. 407 с.

290. Холъцбехер 3., Дивиьи Л., Крал М., Шуха Л., Влачил Ф. Органические реагенты в неорганическом анализе. М.: Мир, 1979. 752 с.

291. Alpert A. J., Regnier F.E. Preparation of a porous micro particulate anion exchanger chromatography support for proteins. // J.Chromatogr. 1979. V.185. P.375-392.

292. Matsushita S. Simultaneous determination of anions and metal-cations by single-column ion chromatography with'ethylenediaminetetraacetate as eluent and conductivity and ultra-violet detection. // J.Chromatogr. 1984. V.312. P.327-336.

293. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Иванов B.M. Кислотно-основные свойства кремнезема с химически привитым к его поверхности этилёндиамином. // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1981. Т.26. №3. С.345-347.

294. Тессман А.Б., Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминогруппами для моделирования внутренних градиентов рН. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №1. С.13-16.

295. Каменцев М.Я. Новые возможности on-line концентрирования ионов металлов при их капиллярно-электрофоретическом определении. Дисс. канд. хим. наук. СПб: СПбГУ, 2010. 117 с.

296. Voloschik I.N., Litvina M.L., Rudenko В.А. Separation of transition and heavy metals on amidoxime complexing sorbent. // J.Chromatogr. 1994. V.671. P.51-54.

297. Voloschik I.N., Litvina M.L., Rudenko B.A. Application of multi-dimentional liquid chromatography to the separation of some transition and heavy metals. // J.Chromatogr. 1994. V.671. P.205-209.

298. Lucy Ch.A., Dinh H.M. Kinetics and equilibria of the zinc-EDTA-PAR post-column reaction detection system for the determination of alkaline-earth metals. // Anal.Chem. 1994. V.66. №6. P.793-797.

299. Gelsema W.J., de Ligny C.L., van der Veen N.G. Isoelectric focusing of proteins, determined by isoelectric focusing in the presence of urea and methanol. // J.Chromatogr. 1979. V.171. P.171-181.

300. Kolla P., Schomburg G., Laubli M. W. Polymer-coated cation-exchange stationary phases on the basis of silica. // Chromatographia. 1987. V.23. P.465-472.

301. Morris J., Fritz J.S. Ion chromatography of metal cations on carboxylic acid resins. // J.Chromatogr. 1992. V.602. P.lll-117.

302. Иванов A.B., Бакштейн M.C., Хасанова E.M., Чернышев И.А., Янулъ (Смирнова) Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т.44. №6. С.412-416.

303. Нестеренко П.Н., Шпигун О. А. Высокоэффективная комплексообразовательная хроматография ионов металлов на сорбентах с привитой иминодиуксусной кислотой. // Координац. химия. 2002. Т.28. №10. С.772-782.

304. Кебец П.А., Кузьмина К.А., Нестеренко П.Н. Теплоты адсорбции катионов металлов на силикагеле с ковалентно закрепленной полиаспарагиновой кислотой. // Журн. физич. химии. 2002. Т.76. №9. С. 1639.

305. Nesterenko P.N., Jones P. Isocratic separation of lanthanides and yttrium by highperformance chelation ion chromatography on iminodiacetic acid bonded to silica. // J. Chromatogr. A. 1998. V.804. P.223-231.

306. Bashir W., Paull B. Determination of trace alkaline earth metals in brines using chelation ion chromatography with an iminodiacetic acid bonded silica column. // J.Chromatogr.A. 2001. V.907. P. 191-200.

307. Иванов A.B., Бакштейн M.C., Хасанова E.M. Оптимизация профиля градиента рН внутри карбоксильных колонок за счет ионной силы подвижных фаз. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т.44. №5. С.318-323.

308. Паршина И.Н., Стряпков А.В. Исследование процесса десорбции меди и цинка из катионита КУ-2Х8. // Вестник ОГУ. 2004. №1. С.98-101.

309. Laubli М. W., Kampus В. Cation analysis on a new poly(butadiene-maleic acid)-based column. //J.Chromatogr.A. 1995. V.706. P.99-102.

310. Yang R., Jiang Sh„ Chen L. Maleic acid-styrene encapsulated silica cation exchanger in high performance liquid chromatography. // Talanta. 2001. V.55. P.1091-1096.

311. Басаргин H.H., Розовский Ю.Г., Голосницкая В.А., Жарова В.М. и др. Органические реагенты и хелатные сорбенты в анализе минеральных объектов. М.: Наука, 1980. 190 с.

312. Басаргин H.H., Розовский Ю.Г., Голосницкая В.А. Корреляции и прогнозирование аналитических свойств полимерных хелатных сорбентов и их комплексов с элементами. М.: Наука, 1986. 200 с.

313. Тессман А.Б., Иванов A.B., Курочкина Е.В., Гармаш A.B., Нестеренко П.Н. Моделирование градиентов pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. 1998. Т.23. С.347-358.

314. Nguen N.Y., Chrambach A. Non-isoelectric focusing in buffers. // Anal. Biochem. 1976. V.74.№ 1. P.145-153.

315. Иванов A.B., Нестеренко П.Н. Формирование индуцированных градиентов pH и их применение в хроматографии для разделения переходных металлов. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 1999. Т.40. №3. С.155-160.

316. Кубышев С.С., Иванов A.B. Роль инертного компонента элюента при индуцировании градиентов pH в капиллярах со свободной неподвижной фазой. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2006. Т.47. №4. С.253-256.

317. Иванов A.B., Тессман А.Б., Матвеев A.B., Ремизова Е.В. Информационная база данных по внутренним градиентам в хроматофокусировании. // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. №4. С.374-380.

318. Snow J.T. Peptides: the drugs of the future and derivatized amino acids for synthesis. California: Calbiochem. 1988. 72 p.

319. Иванов A.B., Смирнова Н.Ю., Бакштейн M.C., Чернышев И. А. Комплексообразующие свойства катионообменников с привитыми карбоксильными группами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2007. Т.48. №3. С.171-177.

320. Химмелъблау Д. Прикладное нелинейное программирование. М.: Мир, 1975.534 с.

321. Банди Б. Методы оптимизации. Вводный курс. М.: Радио и связь,. 1988, 128 с.

322. Харъюла P., Jleemo Ю. Меморандум Международного симпозиума по унификации номенклатуры формулировок и экспериментальных методов при изучении процессов ионного обмена. //Журн. физич. химии. 1996. Т.70. №9. С.1723-1725.

323. Либинсон Г.С. Сорбция органических соединений ионитами. М.: Медицина, 1979. 182 с.

324. Тремийон Б. Разделение на ионообменных смолах. М.: Мир, 1967. 431 с.

325. Самуэлъсон О. Ионообменное разделение в аналитической химии. M.-JL: Химия, 1966. 416 с.

326. Ионный обмен. П/ред. Я.Маринского. М.: Мир, 1968. 568 с.

327. Долгоносое A.M., Сенявин М.М., Волощик ИИ. Ионный обмен и ионная хроматография. М.: Наука, 1993. 220 с.

328. Солдатов В. С. Простые ионообменные равновесия. Минск: Наука и техника, 1972. 224 с.

329. Кокотов Ю.А., Золотарев 77.77., Елъкин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена: Сложные ионообменные системы. JL: Химия, 1986. 280 с.

330. Шемякин Ф.М., Степин В.В. Ионообменный хроматографический- анализ металлов. М:: Металлургия, 1970. 392 с.

331. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных катионитов. М.: Наука, 1969. 110 с.

332. Милъченко Д.В. Физико-химические закономерности связывания ионов с лигандами, закрепленными на кремнеземе. Дисс. . канд хим.наук. М.: МГУ, 1987. 205 с.

333. Мамченко A.B., Валуйская Е.А. Теоретический анализ обмена ионов Н* Na+ на карбоксильных катионитах. // Журн. физич. химии. 1999. Т.73. №8. С.1443-1452.

334. Soldatov KS. A simple method dor the determination of the acidity parameters of ion exchangers. // Reactive and Functional Polymers. 2000. V.46. P.55-58.

335. Tanford C. Physical chemistry of macromolecules. New York: Wiley, 1961. 457 p.

336. Subramonian S., Clifford D. Monovalent/divalent selectivity and the charge separation concept. //Reactive Polymers. 1988. V.9. P. 195-209.

337. Мудрое A.E. Численные методы для ПЭВМ на языках Бейсик, Фортран и Паскаль. Томск: Раско, 1991.270 с.

338. Shen Н., Li X., Biebrich С. J., Frey D.D. Reducing sample compexity in proteomics by chromatofocusing with simple buffer mixtures. // Methods Mol. Biol. 2007. V.424. P. 187203.

339. Интернет-ресурс "Гемостаз и реология". Методы исследования фибринолитической системы (определение активности плйзмина). http://www.med.ru/MEDCENT/Tl-irombosis/Hrh/plasminogen.htm .

340. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 2003. 480с.

341. Righetti P.G., Caravaggio Т. Isoelectric points and molecular weight of proteins. // J.Chromatogr. 1976. V.127. P.l-28.

342. Гелъферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена. М.: Изд-во иностранной литературы, 1962. 490 с.

343. Иванов А.В., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев А.В. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42 . №2. С. 109-111.

344. Penner N.A., Nesterenko P.N., Ilyin М.М., Tsyurupa М.Р., Davankov V.A. Investigation of properties of hypercrosslinked polysterene as stationary phase for high performance liquid chromatography. // Chromatographia. 1999. V.50. P.611-620.

345. Пеннер H.A. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000. 178 с.

346. Kebets Р.А., Nesterenko P.N. Zwitter ion-exchange properties of sulphonated hypercrosslinked polystyrene. // Mendeleev Commun. 2002. V.12. №4. P.155-156.

347. Нестеренко П.Н., Кебец П.А., Волгин Ю.В. Применение сульфокатионообменника на основе сверхсшитого полистирола для разделения органических кислот. // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. №8. С.801-807.

348. Иванов А.В., Курек Д.В., Вакштейн М.С., Баюнов А.П. Градиент ионной силы при хроматофокусировании в карбоксильных колонках. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2007. Т.48. №4. С.250-256.

349. Электроаналитические методы. П/ped. Ф.Шолъца. М.: БИНОМ, 2006. С.241

350. Sommer L. Analytical absorption spectrophotometry in the visible and ultraviolet. The principles. Budapest: Akademiai Kiado, 1989. 311 p.

351. Марченко 3., Бальцежак M. Методы спектрофотометрии в УФ и видимой областях в неорганическом анализе. М.: БИНОМ, 2007. 712 с.

352. Интернет-ресурс компании "Purolite": Strong and weak acid cation-exchangers (WEB-catalogue). http://www.puroliteusa.com/fr products.htm .

353. Интернет-ресурс компании "Grace Davison Dicovery Science": HPLC columns (WEB-catalogue). http://www.discoverysciences.com/uploadedFiles/Home/HPLC columns.pdf.

354. Jones P., Nesterenko P.N. Single-column method of chelation ion chromatography for the analysis of trace metals in complex samples. // J.Chromatogr. 1997. V. 770. P.129-135.

355. Croft L.R. Handbook of protein sequence analysis: a compilation of amino acid sequences of proteins with an introduction to the methodology. New York: Wiley, 1980. 628 p.

356. Malmqvist G., Lundell N. Characterization of the influence of displacing salts on retention in gradient elution ion-exchange chromatography of proteins and peptides // J. Chromatogr. A. 1992. V.627. P.107-124.

357. Yang Y-B., Harrison K, Kindsvater J. Characterization of a novel stationary phase derived from a hydrophilic polystyrene-based resin for protein cation-exchange highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 1996. V.723. P. 1-10.

358. Barnidge D.R., Tschumper R.C., Jelinek D.F., Muddiman D.C., Kay N.E. Protein expression profiling of CLL В cells using replicate off-line strong cation exchange chromatography and LC-MS/MS. //J. Chromatogr. B. 2005. V.819. P.33-39.'

359. Bihan T.L., Duewel H.S., Figeys D. On-line strong cation exchange ц-HPLC-ESI-MS/MS for protein identification and process optimization // J. Am. Soc. Mass Spectr. 2003. V.14. P.719-727.

360. Granger M., Todorov S.D., Matthew M.K., Dicfo L.M. Growth of Enterococcus mundtii ST15 in medium filtrate and purification of bacteriocin ST15 by cation-exchange chromatography. // J Basic Microbiol. 2005. V.45. P.419-25.

361. Mirzaei H., Regnier F. Enrichment of carbonylated peptides using Girard P reagent and strong cation exchange chromatography. // Anal. Chem. 2006. V.78. P.770-778.

362. Markus G., McClintock D.K., Castellani B.A. Tryptic hydrolysis of human serum albumin. //J. of Biol. Chemistry. 1967. V. 242. №19. P.4395-4401.

363. Imoto Т., Yamada H. Peptide separation by reversed-phase high-performance liquid-chromatography. // Molecular and Cellular Biochem. 1983. V.51. P. 111-121.

364. Якубке Х.Д., ЕшкайтХ. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М.: Мир, 1985. 455 с.

365. Некоторые аббревиатуры, встречающиеся в тексте диссертации:

366. БСА бычий сывороточный альбумин1. ИР индуцирующий раствор

367. ИЭТ — изоэлектрическая точка

368. ИЭФ изоэлектрофокусирование1. CP стартовый раствор

369. ПСДВБ полистиролдивинилбензол1. ПММА полиметилметакрилат

370. ССПС сверхсшитый полистирол1. ФДГ формиатдегидрогеназа1. ХФ хроматофокусирование

371. ЧСА человеческий сывороточный альбумин1. Э элюент

372. DNS модель "точного численного решения" (Detailed Numerical Solution) LEQ Th - модель "локальных равновесий (Local Equilibrium Theory) РВЕ (ПБИ) - полибуфер-ионообменник (Polybuffer ion-exchanger)332