Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов pH в катионообменных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Вакштейн Максим Сергеевич

I

Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов рН в катионообменных системах

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент

Иванов Александр Вадимович Официальные оппоненты: доктор химических наук, вед.научн сотр

Сердан Анхель Анхелевич кандидат химических наук, ст. научн. сотр. Яшин Александр Яковлевич

Ведущая организация: Воронежский государственный университет

Защита диссертации состоится «20» сентября 2006 г. в 16.15 в ауд. 344 на заседании диссертационного совета Д501 001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В Ломоносова по адресу: 119922, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ, а также в Интернете по адресу http //vakstein narod ru

Автореферат разослан « » июля 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

У

Торочешникова И И.

Общая характеристика работы1

Актуальность работы. Ионообменная и комплексообразовательная хроматография находят все большее применение в аналитической химии за счет расширения круга определяемых соединений и появления все новых модификаций данных вариантов жидкостной хроматографии. Одним из важнейших параметров, позволяющих повышать селективность разделения, является рН подвижной фазы Часто в хроматографии используют градиентное элюирование, т.е. изменяют состав элюента по определенному правилу. Так, в 1979 г. Слайтерман разработал хроматофокусирование (ХФ) - метод ионообменной хроматографии, основанный на элюировании с внутренним (создаваемым внутри колонки) градиентом рН. В настоящее время используют две техники формирования градиентов рН -«классическое» хроматофокусирование и индуцирование. ХФ обычно применяют для разделения биологических объектов - белков, пептидов, аминокислот, реже азокрасителей и других цвиттер-ионных соединений. В начале 1990-х Нестеренко и Ивановым был предложен метод концентрирования и разделения переходных металлов на одной колонке с использованием техники ХФ. Традиционно для этих целей формируют нисходящие градиенты рН на анионообменных сорбентах. Однако комплексообразование ионов металлов с аминогруппами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой, в связи с чем целесообразен переход к катионообменным сорбентам.

ХФ на катионообменных сорбентах является малоизученным, развивающимся методом разделения и концентрирования цвиттер-ионных соединений Метод применяют для разделения цвиттер-ионов с положительным зарядом в кислой среде, становящихся незаряженными в целом в нейтральной или щелочной средах, что характерно для белков и пептидов Традиционно в данном методе используют подходы, характерные для ХФ на анионообменных сорбентах. В частности, применяют полиамфолитные элюенты, обладающие рядом недостатков - высокой ценой, склонностью к биодеградации, взаимодействием с разделяемыми компонентами и значительным поглощением в используемой для детектирования области спектра Актуальна замена подобных подвижных фаз на более простые, не имеющие таких ограничений.

Перспективно изучение нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок из-за возможности применения их для разделения и концентрирования переходных металлов. Несмотря на высокий уровень развития метода ХФ в целом, в литературе отсутствуют данные по нисходящим внутренним градиентам на катионообменных колонках. Также не изучен другой вариант Х<}> - индуцирование градиентов рН в слое катионообменного сорбента.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 200 6л кт

' Научный консультант: доктор химических наук, профессор Нестеренко П Н

3

При ХФ пептидов не удается проводить УФ детектирование при оптимальных длинах волн из-за высокого фонового поглощения компонентов подвижных фаз. Поиск простых элюентов, позволяющих регистрировать сигнал пептидов при низких длинах волн в УФ диапазоне спектра, является очень важной задачей при анализе гидролизатов белков.

Цель и задачи исследования.

• Изучение кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. Определение селективности данных сорбентов по отношению к ионам переходных металлов в зависимости от рН раствора.

• Формирование внутренних, нисходящих и восходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок при использовании техники «классического» ХФ и техники индуцирования.

• Изучение влияния на профиль градиентов рН состава, концентрации и ионной силы подвижных фаз с целью получения линейных градиентов в широком диапазоне рН

• Изучение возможности разделения ионов переходных металлов на катионообменниках при использовании вышеупомянутых техник формирования градиентов рН внутри хроматографических колонок.

• Разделение смесей белков и пептидов методом ХФ с использованием простых низкомолекулярных элюентов.

Научная новизна. Получены нисходящие градиенты рН внутри катионообменных карбоксильных колонок при использовании техники ХФ. Изучены основные закономерности формирования подобных градиентов и разработаны подходы, позволяющие варьировать профиль градиента в широких пределах в зависимости от целей анализа. Показано, что ионная сила подвижных фаз существенно влияет на процессы, протекающие внутри колонки, что позволяет управлять формой градиента. Предложены простейшие одно-двухкомпонентные элюенты, которые в сочетании с варьированием ионной силы могут успешно заменить дорогостоящие полиамфолитные буферные растворы. Показана возможность разделения ионов переходных металлов методом ХФ на катионообменных карбоксильных сорбентах.

Предложено использование техники индуцирования для формирования нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок. Исследовано влияние природы и состава подвижный фазы и индуцирующего раствора на профиль градиентов рН Подобраны новые индуцирующие растворы и простые элюенты, ранее не использовавшиеся в данном методе Возможности простых элюентов показаны на примере разделения модельных смесей металлов на катионообменных колонках в условиях нисходящего градиента рН.

Найдены условия для формирования линейных восходящих градиентов рН методом ХФ на катионообменных колонках при использовании простых элюентов.

Модельные смеси белков разделены методом ХФ при использовании двухкомпонентного злюента в сочетании с высокой ионной силой.

Новым направлением развития ХФ для разделения пептидов является использование сильных катионообменников. При ХФ смесей пептидов значительно улучшены условия УФ-детектирования за счет замены традиционно используемых полиамфолитных буферных элюентов простыми смесями низкомолекулярных протолитов.

Практическая значимость работы. Разработаны принципы формирования нисходящих градиентов рН на новых для ХФ ионообменниках - карбоксильных катионообменных сорбентах Показана принципиальная возможность использования техники индуцирования и техники «классического» ХФ для разделения и концентрирования переходных металлов на катионообменниках.

Подобраны условия, в которых простые одно-двухкомпонентные элюенты могут заменить дорогостоящие и обладающие целым рядом недостатков коммерческие полиамфолитные буферные растворы для формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок. В данных условиях разделены смеси белков и пептидов. При ХФ трипсиновых пептидов предложен подход, позволяющий проводить детектирование при низких длинах волн, что значительно расширяет количество регистрируемых соединений в гидролизате белка. Положения, выносимые на защиту.

1 Данные по кислотно-основным и сорбционным свойствам различных карбоксильных сорбентов.

2 Рекомендации по применению катионообменных сорбентов для формирования нисходящих и восходящих градиентов рН

3. Результаты по изучению влияния ионной силы подвижных фаз на профиль внутренних градиентов рН, формируемых на катионообменниках

4. Способы получения линейных градиентов рН с простыми низкомолекулярными одно-двухкомпонентными элюентами вместо полиамфолитных.

5. Результаты по применению техники индуцирования и техники «классического» ХФ для разделения модельных смесей переходных металлов.

6 Данные по разделению смесей белков на слабых катионообменниках методом ХФ при создании градиента рН простыми элюентами.

7 Метод разделения смесей пептидов при одновременном формировании градиентов рН и ионной силы внутри колонки, позволяющий проводить детектирование при низких длинах волн в УФ области спектра

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов-2000, 2003, 2005". (Москва, МГУ); Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, РАН, 2000); Международных симпозиумах по ионной хроматографии (НСЗ-2000, 2004) (Франция, Ницца, 2000; Германия, Трир, 2004),

Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, РАН, 2001); Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К. В Чмутова (Москва, РАН, 2002); 3-м международном симпозиуме по разделению в бионауках (SBS-03) "100 лет хроматографии" (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". (Саратов, СГУ, 2003); 10-й Международной конференции "Разделение ионных соединений" (SIS'03) (Словакия, Высокие Татры, Подбаньске, 2003); XVII Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, КазНЦ РАН, 2003); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" (Москва, РАН, 2004); Международном симпозиуме по компьютерным приложениям и хемометрике в аналитической химии (SCAC-2004) (Венгрия, Вешпрем, оз. Балатон, 2004); VII Всероссийской конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2004); "Ломоносовских чтениях-2005" (Москва, МГУ); Международной конференции "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (Украина, Киев, 2005); II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 2005); X Международной конференции 'Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии" (Москва, РАН, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 19 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, включает 74 рисунка, 10 схем и 21 таблицу Список литературы содержит 141 работу зарубежных и отечественных авторов.

Основное содержание работы

В первой главе диссертации изложены принципы разделения цвиттер-ионных макромолекул методом хроматофокусирования (ХФ), в частности белков. Рассмотрены особенности нового метода - ХФ переходных металлов на комплексообразующих анионообменных сорбентах. Описаны анионообменные и катионообменные сорбенты, применяемые в ХФ. Подробно разобраны характерные матрицы и функциональные группы для подобных сорбентов. Приведены примеры разделения белков и пептидов методом ХФ с восходящим градиентом рН или градиентом ионной силы в катионообменных системах. Рассмотрены подвижные фазы, используемые для формирования градиентов рН, их преимущества и недостатки. Во второй главе приведены основные физико-химические модели, созданные для прогнозирования формы внутренних градиентов рН. Описаны наиболее сложные моменты, возникающие при изучении процессов формирования градиентов рН В третьей главе рассмотрены принципы техники индуцирования

внутренних градиентов рН. Во четвертой главе описаны растворы, реагенты, аппаратура и методики экспериментов. В пятой главе приведены данные по изучению кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. В шестой и седьмой главах показано влияние основных параметров подвижных фаз- природы, концентрации и ионной силы, - на форму нисходящих градиентов рН в ХФ и технике индуцирования Описано применение простых элюентов для получения квази-линейных градиентов рН. Приведены данные по градиентам ионной силы, возникающим при формировании градиентов рН в случае добавок сильного электролита в подвижные фазы. Продемонстрирована возможность разделения ионов переходных металлов в вариантах «классического» ХФ и индуцирования градиентов рН. Восьмая глава посвящена восходящим градиентам рН, в которой рассмотрены основные факторы, влияющие на профиль градиента Приведены данные по разделению модельной смеси белков и изоформ ферментов на карбоксильных катионообменных сорбентах. В девятой главе описаны особенности разделения трипсиновых пептидов на сильном катионообменнике при использовании простых элюентов. Показана возможность улучшения детектирования пептидов в случае применения подвижных фаз простого состава.

Экспериментальная часть

Сорбенты. В работе использовали слабые катионообменные сорбенты на основе полимерных матриц с привитыми карбоксильными, карбоксиметильными группами - СМ-52, Ольвагель-СООН, MN, МасгоРгер 50 СМ (табл. 1) и коммерческую колонку Hamilton PRP-X200, заполненную сильным катионообменником с сульфогруппами.

Таблица 1. Характеристики изученных карбоксильных сорбентов.

Сорбент СМ-52 Ольвагель-СООН MN МасгоРгер 50 СМ

Производитель Whatman (Великобритания) НИИ химии (Ленинград, СССР) Purolite (Великобритания) Biorad (США)

Матрица Целлюлоза ПММА ССПС ПММА

Функциональные группы -СН2СООН -СООН -СООН -CHjCOOH

Размер частиц (мкм) 100-200 >30 5 50

рН-диапазон * 3-10 3-13 1-14 3-13

Ионообменная емкость 0,95-1,15 ммоль/г 0,30 ммоль/мл геля <01 ммоль/г 0,21±0,04 ммоль/мл

Примечания- * - рН-диапазон гидролитической стабильности

Подвижные фазы и растворы. Растворы солей переходных металлов, реагентов и вспомогательных веществ, компоненты стартовых буферных растворов и элюентов готовили из препаратов квалификации не ниже ч.д.а. Использовали растворы Полибуфера-96 (Polybuffer-96) фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Аппаратура. Хроматографическая система низкого давления: насос ХПЖ-1 (г. Дзержинск, Россия); стеклянная хроматографическая колонка К9/30 (300x9 мм),

7

заполненная карбоксильным катионообменным сорбентом; система для регистрации рН, включающая самодельную проточную ячейку, цифровой рН-метр 'TOA Electronics HM-20S" (Япония) и комбинированный электрод GST-5211C; перистальтический насос низкого давления "Varioperpex-2120" ("LKB-Bromma", Швеция) для удаления эффлюента из ячейки, одноканальный самописец ("LKB-Bromma", Швеция). Система для ВЭЖХ: изократический насос высокого давления "А-802 Milton Roy" (Франция); "Beckman-114M" (США) или "Shimadzu LC-10ATVP" (Япония); шестиходовой инжектор для ввода пробы "Rheodyne 7125" (США); пластмассовая (50x4 6 мм или 150x4.6) или металлическая (250x4.6) хроматографическая колонка, заполненная катионообменным сорбентом; система для регистрации рН, включающая самодельную проточную ячейку, цифровой рН-метр "TOA Electronics HM-20S" (Япония) и комбинированный электрод GST-5211C; двухканальный самописец "LKB-Bromma 2210" (Швеция). При разделении модельных смесей в схему включали УФ-детектор "Uvicord-2238" ("LKB-Bromma", Швеция) или "MicroUvis 20" ("Carlo Erba Instruments", США). Использовали фотоколориметр КФК-2, цифровой рН-метр "Orion Research 501" (США) со стеклянным комбинированным электродом "Orion АТС 917002" и температурным компенсатором и универсальный иономер ЭВ-74.

Свойства карбоксильных сорбентов.

Чтобы выяснить возможность использования карбоксильных сорбентов в ХФ переходных металлов, нами были изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства сорбентов СМ-52, Ольвагель-СООН, МасгоРгер 50 СМ и сверхсшитого полистирола MN с привитыми карбоксильными группами по отношению к ионам Си2*, Со2+, Ni2*, Cd2+, Zn2+, Мп2+ и Pb2+.

Кислотно-основные свойства. При оценке буферных свойств ионообменников для хроматофокусирования было проведено кислотно-основное титрование навесок сорбентов, предварительно уравновешенных кислотой или щелочью, построены дифференциальные кривые в координатах "ДрН/М/ - рН" и найдены интервалы рН с практически постоянной буферной емкостью. Приведем для примера кривую потенциометрического кислотно-основного титрования сорбента МасгоРгер 50 СМ, при создании высокой ионной силы в титруемом растворе, находящемся в равновесии с сорбентом, и титранте (рис 1).

РН

10 -

Рис. 1. Кривая потенцио-метрического кислотно-

основного титрования навески сорбента Масгоргер 50 СМ (0.2 г) 10 мМ раствором ЫаОН при ионной силе 0.1 (К1МОз).

0.5

1

1.5

2 2.5 3 V(NaOH), мл

На кривой титрования не наблюдается явных скачков рН. Это говорит о том, что, хотя на поверхности сорбента закреплены группы только одного вида (-СН2СООН), сорбент, тем не менее, проявляет полиэлектролитные свойства (рис. 1). Данные свойства свидетельствуют о буферирующей способности сорбента Масгоргер 50 СМ в широком диапазоне рН, что позволяет использовать его в качестве сорбента при формировании нисходящих и восходящих градиентов рН с применением техники хроматофокусирования или индуцирования

Комплексообразующие свойства. При изучении сорбции с увеличением рН раствора наблюдали окрашивание сорбента, причем окраска становилась более интенсивной по мере увеличения рН. Это служит косвенным подтверждением сорбции металлов по механизму комплексообразования с функциональными карбоксильными группами на поверхности сорбента. Для всех сорбентов наблюдается увеличение сорбции ионов при повышении рН среды, извлечение максимально при рН 6 - 8 (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость относительной сорбции ионов Cu2+, Со2+, Ni2+, Cd2+ на сорбентах СМ-52 (слева) и Ольвагель-СООН (справа) от рН в статических условиях.

Извлечение ионов Си2* в зависимости от рН. Сравнение катионообменников СМ-52, Ольвагель-СООН, MN и Macro-Prep 50 проводили по

9

извлечению ионов Cu2+ в зависимости от рН раствора. Для сорбентов Ольвагель-СООН, MN и Macro-Prep 50 СМ графики похожи: при рН 4 5 - 5.0 наступает десорбция ионов Си2+, тогда как на сорбенте СМ-52 ионы меди продолжают сорбироваться и при рН 2 (рис. 3).

Сорбция,%

100

80

60Рис. 3. Сравнение сорбции ионов

Си2+ на карбоксильных катионо-

40обменниках -СМ-52, Ольвагель-

СООН, MN и Macro-Prep 50.

20

0

2 3 4 5 6 7 8

рн

Близкие значения рН50 (50%-й сорбции) характеризуют примерно одинаковую комплексообразующую способность Ольвагель-СООН, MN и Macro-Prep 50 СМ. Максимальной емкостью по меди обладает Ольвагель-СООН, тогда как емкость MN в 2 раза ниже, что, вероятно, связано с более низкой плотностью прививки карбоксильных групп на поверхности MN.

По совокупности комплексообразующих свойств, высокой сорбционной емкости и селективности наиболее целесообразно применять сорбенты Ольвагель-СООН и Macro-Prep 50 СМ для концентрирования и препаративного разделения ионов металлов, в том числе и в сочетании с рН-градиентным элюированием. Сорбент MN, вероятно, более пригоден для аналитического разделения ионов металлов.

Нисходящие градиенты рН.

Влияние ионной силы подвижных фаз. С помощью варьирования ионной силы подвижных фаз (с полиамфолитным элюентом) можно управлять формой градиента рН. Так, для получения квази-линейного градиента в широком диапазоне рН следует создавать высокую ионную силу (0.1) и в стартовом растворе и в элюенте (рис. 4, кривая 4). Под квази-линейными принято понимать градиенты, имеющие на профиле два или более линейных участка с разным углом наклона, но при этом должны отсутствовать явно выраженные ступени (участки с минимальным изменением рН) [1]. Появление «аномального» подъема (до 8 ед. рН) на начальном участке градиента можно объяснить тем, что при уменьшении ионной силы раствора условные константы диссоциации карбоксильных групп сорбента уменьшаются, вследствие чего часть групп дополнительно протонируется (рис. 4, кривые 1, 2).

1 Bates R С , Frey D D Quasi-linear рН gradients for chromatofocusing using simple buffer mixtures local equibrium theory and experimental verification //J Chromatogr 1998 V814 P 43-54.

200

300

Рис. 4. Влияние ионной силы стартового раствора и элюента на профиль нисходящего градиента рН в катионообменной системе. Колонка: 300x9мм, СМ-52; СР: 10 мМ Трис-НС1, рН 7.5, I = 0.1 М (1, 4), 0.01 М (2), 0.025 М (3); Элюент: 1:20 Полибуфер-96, рН 3.0,1=0(1, 2), 0.025 М (3), 0.1 (4), Скорость: 0.85 мл/мин.

400v, мл

Несмотря на многие преимущества полиамфолитных элюентов, они имеют ряд серьезных недостатков' склонность к биодеградации; высокая цена; взаимодействие с разделяемыми компонентами (белками, пептидами), что требует дополнительной очистки продукта от полибуфера; высокое поглощение при длинах волн < 254 нм, что затрудняет детектирование, в частности пептидов. Поэтому актуален поиск простых низкомолекулярных подвижных фаз.

Влияние природы и концентрации элюента на профиль градиента рН показано на рисунке 5 При разбавлении элюента можно получать более плавные градиенты рН, но при этом появляются «аномальные» участки с подъемом рН выше рН стартового раствора (рис. 5, кривая 3). Природа элюента также существенно сказывается на форме градиента (рис 6). Наиболее протяженные квази-линейные градиенты рН формируются при использовании более слабых кислот (уксусная) или аминокислот.

Рн

рН_

V, мл

V, мп

Рис 5 Влияние концентрации винной кислоты в составе элюента на профиль градиента рН Элюент, мМ 5 (1), 1 (2), 0 2 (3) СР: 10 мМ Трис- НС1, рН 7.5 Колонка: 50x4.6 мм, ММ.

Рис 6. Градиенты рН, полученные с различными элюентами: 1 - щавелевой, 2 -винной, 3 - лимонной, 4 - глутаминовой, 5 -уксусной 1 мМ к-тами. СР: 10 мМ Трис - НС1, рН 7.5. Колонка: 50x4.6 мм, ММ.

Влияние ионной силы простых подвижных фаз. Как отмечалось выше, в случае, если ионная сила стартового раствора выше, чем элюента, то на начальном

участке градиента рН наблюдали подъем выше значения рН стартового раствора. От этого эффекта можно избавиться повышением ионной силы элюента. Так, при относительно высокой ионной силе в элюенте и стартовом растворе удается получить достаточно плавный градиент рН без подъема на начальном участке, зато с более протяженным квази-линейным участком (рис. 7, кривая 3).

РН

Рис. 7. Влияние ионной силы подвижных фаз на профиль нисходящего внутреннего градиента рН. Колонка: 50x4.6 мм, МЫ. СР: 10 мМ Трис - НС1, рН 7.5. Элюент: 0.2 мМ лимонная кислота Ионная сила: 1-0,2- 0.01,3-01. Скорость: 1 мл/мин.

V, мл

Разделение переходных металлов. В препаративном варианте хроматографии на катионообменной колонке Масгоргер 50 СМ показали возможность разделения катионов переходных металлов в условиях нисходящего градиента рН (рис. 8), полученного с использованием однокомпонентного элюента.

V, мл

Для ионов металлов получили симметричные пики, примерно одинаковой ширины независимо от времени выхода, что свидетельствует о наличии фокусирующего эффекта.

Порядок выхода металлов согласуется с известным из литературы. Таким образом, впервые было достигнуто разделение переходных металлов на карбоксильной катионообменной колонке с использо-

Рис 8 Разделение ионов переходных металлов методом ХФ. Колонка: 50x4 6 мм, МасгоРгер 50 СМ; СР: 10 мМ Трис-НС1, рН 7 5; Элюент: 0.5 мМ лимонная к-та, 0.85 мл/мин. Ионная сила: 0.2 в ванием метода ХФ. обеих подвижных фазах

Градиент ионной силы. Чтобы проверить существование солевого градиента (градиента ионной силы) при формировании градиента рН, в потоке измеряли концентрацию компонентов сильного электролита на выходе из колонки в процессе формирования градиента рН при одинаковых стартовом растворе и элюенте, но с

разной ионной силой. В качестве регистрируемого выбрали нитрат-ион. Как видно из рисунка 9, градиент ионной силы имеет достаточно плавную форму, без ступеней и перегибов Основное уменьшение концентрации нитрат-иона происходит как раз во время слабого изменения рН в эффлюенте - при выходе «аномального» участка с подъемом рН выше стартового раствора. Данное поведение градиента ионной силы подтверждает то, что природа «аномального» участка обусловлена изменением ионной силы подвижных фаз, как и было предложено нами ранее на основе теоретического рассмотрения системы Во втором случае, при !ср < 1э градиент ионной силы выходит за значительно меньший промежуток времени, чем для первой системы (рис. 10).

]оаС(кол

1одС(ИОз")

Рис 9 Сравнение градиента рН и нисходящего градиента ионной силы в ХФ 1 - градиент С(1М03'), 2 - градиент рН. Колонка: 50x4 6 мм, МасгоРгер 50 СМ СР: 10 мМ Трис-НС1 (рН = 7 5), Элюент: 120 Полибуфер 96 (рН = 3 0) 1СР=0.1,1Э=0. Скорость 1 мл/мин

V, мл

Рис 10 Сравнение градиента рН и восходящего градиента ионной силы в ХФ 1 - градиент С(1Ч03'), 2 - градиент рН Колонка: 50x4 6 мм, МасгоРгер 50 СМ СР: 10 мМ Трис-НС1 (рН = 7 5); Элюент: 1 20 Полибуфер 96 (рН = 3 0). 1ср=0, (,=0.1. Скорость' 1 мл/мин.

Таким образом, экспериментально подтверждено, что при ионной силе стартового раствора большей, чем в элюенте, наблюдается плавный, достаточно протяженный градиент ионной силы (концентрации нитрат-иона) симбатно градиенту рН Показано, что причиной «аномального» подъема на начальном участке градиента рН является уменьшение ионной силы в подвижной фазе (рис. 9). Некоторые другие эффекты, проявляющиеся на профиле градиента рН, например, ступени, изменение угла наклона градиента, могут быть связаны с резким увеличением концентрации сильного электролита в элюенте (рис. 10).

Индуцированные нисходящие градиенты рН.

При получении градиентов рН с использованием техники индуцирования существует принципиальное отличие от «классического» ХФ. Одна из подвижных фаз (ИР) пребывает в колонке очень короткое время, хотя и успевает за счет своей высокой концентрации переуравновесить систему, но, возможно, эти особенности

могут изменить закономерности, которые были справедливы для «классического» варианта.

Влияние концентрации ИР. При уменьшении концентрации ИР уменьшается максимальное значение рН, достигаемое градиентом на начальном участке (рис. 11) Это приводит к сокращению диапазона рН, охватываемого градиентом, а также уменьшению общего времени выхода градиента рН на 10-15 минут при разбавлении ИР в 2 раза.

Рис. 11. Влияние концентрации аммиачного индуцирующего

раствора на профиль градиента рН.

Колонка: 50x4.6 мм, МасгоРгер 50 СМ. Элюент: 2 мМ лимонная к-та + Трис (рН 4.0).

ИР: N431 - 3.25 М; 2 - 6.5 М; 3 -13 М. Скорость: 1 мл/мин.

Таким образом, более концентрированные ИР (6.5 - 13 М) стоит использовать только в сочетании с концентрированными элюентами, иначе это приводит к неоправданному увеличению времени выхода градиента рН.

Как уже говорилось выше, ионная сила подвижных фаз существенно влияет на профиль градиента рН. Но данный эффект был исследован только для «классического» варианта ХФ, в технике индуцирования подобные эксперименты не проводились.

Влияние ионной силы. На рис. 12 показано влияние концентрации сильного электролита (ЫаС!) в элюенте и индуцирующем растворе на профиль нисходящего градиента рН При создании высокой ионной силы в обеих подвижных фазах удается получить плавный, квази-линейный градиент рН, значительно увеличив его рабочий участок и вместе с тем сократить время формирования градиента до 30 мин (рис 12, кривая 1). У остальных градиентов наблюдается протяженное плато на начальном участке (выше рН 7.5 - 8), которое нельзя использовать для разделения металлов (кривые 2, 3).

50 t мин

Рис. 12. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на профиль градиента РН.

Колонка: 50x4.6 мм, МасгоРгер 50 СМ. Элюент: - 8 мМ СН3СООН; с(№С1), М: 1,3-0.1; 2-0. ИР: - 3.25 М N1-13, с (№С1), М; 1 -1;2, 3-0. Скорость: 1 мл/мин.

Ацетатная система. Чтобы упростить понимание процессов, протекающих в колонке, уменьшили число компонентов различной природы в системе, поэтому перешли к индуцирующим растворам на основе CH3COONa, т.е. к ацетатной системе в целом (рис. 13). В целом, при добавлении сильного электролита в состав подвижных фаз уменьшается подъем рН после введения ИР и, следовательно, весь градиент смещается в более низкую область рН. Причем высокая ионная сила в обеих подвижных фазах (рис. 13, кривая 3) делает это смещение наиболее сильным, изменяя в том числе и угол наклона некоторых участков градиента.

Рис. 13. Профиль нисходящего градиента рН при индуцировании в ацетатной системе. Колонка: 50x4.6 мм, МасгоРгер 50 СМ.

Элюент: - 5 мМ СН3СООН; c(NaCI), М: 1, 2-0; 3-0.1. ИР: - 4 М CH3COONa; c(NaCI), М: 1 -0, 2, 3-1. Скорость: 1 мл/мин.

t, WIH

Исследование различных систем при использовании техники индуцирования показало, что наиболее удачными для разделения ионов металлов могут быть следующие системы:

Э: 3-5 мМ уксусная кислота + 0.1 М NaCI; ИР: 4 М CH3COONa + 1 М NaCI Э: 2-3 мМ лимонная кислота + 0.1 М NaCI; ИР: 3,25 М NH3 + 1 М NaCI. Разделение ионов металлов. Изучив влияние различных компонентов системы на профиль нисходящего градиента рН при применении техники индуцирования, мы выбрали условия для разделения модельной смеси ионов металлов.

Рис. 14. Хроматограмма модельной смеси РЬ2+ и Со2+ в условиях нисходящего индуцированного градиента рН.

Колонка: 50x4.6 мм, МасгоРгер 50 СМ.

Элюент: 5 мМ СН3СООН + 0.1 М ЫаС1.

ИР: - 4 М СН3СОО№ + 1 М ЫаС1. Скорость: 1 мл/мин.

ъ мим

На хроматограмме (рис 14) наблюдали два системных пика, первый из которых вызван вводом индуцирующего раствора, а второй - вводом пробы. Пики металлов хорошо видны на фоне базовой линии. В данных условиях не удалось полностью разделить ионы металлов и получить более узкие пики. Видимо, крупный размер частиц сорбента - 50 мкм - не позволяет достичь большей эффективности. Тем не менее, показана возможность индуцирования квази-линейных градиентов рН на примере простой ацетатной системы за счет создания ионной силы в подвижных фазах. Предложенный подход может оказаться перспективным для концентрирования и разделения металлов на одной катионообменной колонке.

Восходящие градиенты рН в хроматофокусировании.

Нисходящие градиенты рН, формируемые внутри катионообменных колонок, можно использовать только для разделения металлов Это связано с тем, что при высоких значениях рН (~ 7-8) катионообменник заряжен отрицательно и катионы металлов сорбируются на нем, а при снижении рН происходит десорбция катионов с колонки за счет протонирования сорбента и вытеснения ионов металлов протонами. Для разделения цвиттер-ионных соединений на катионообменных сорбентах, напротив, необходимо использовать восходящие градиенты рН, т.к. биполярные соединения заряжены положительно (и, соответственно, могут сорбироваться на катионообменнике) только при рН ниже значений их изоэлектрических точек, т.е в кислой области.

Влияние природы элюента. Элюенты на основе Трис не обеспечивают получение квази-линейных градиентов рН, т.к их рК не попадают в интервал формируемого градиента рН, и, следовательно, элюент почти не проявляет буферных свойств в этом диапазоне рН Решением данной проблемы будет добавление в элюент компонентов с рК, попадающими в область рН от 3 до 7 Для этих целей хорошо подходит лимонная кислота (рКа 3.1, 4 76,6.4).

100 V, мл

Рис. 15. Влияние добавок лимонной к-ты в элюент на профиль градиента pH. Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4.6).

СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3.0); Элюент: 1 - 25 мМ Трис + 6 мМ лимонная к-та, 2 - 12.5 мМ Трис + 1 мМ лимонная к-та + HCl, 3 -12.5 мМ Трис + HCl (pH 7.5 во всех случаях). Скорость: 1 мл/мин

Добавление лимонной кислоты в элюент заметно улучшает форму

восходящего градиента рН (рис 15) Важно, что изменяется участок градиента с

продолжительным плато (- до 100 мин) - градиент становится более плавным, т.е.

без участков со значительно отличающимся углом наклона. Градиент №2 получился

достаточно плавным, без резких изменений рН, но время его выхода слишком

велико даже для препаративного варианта хроматографии.

Если сравнить градиенты, полученные при добавлении лимонной кислоты в

элюент, со сформированными при использовании полибуферных элюентов, то

видно, что профили градиентов близки (рис. 16, кривые 1 и 2)

Рис. 16. Сравнение элюентов на основе Трис-лимонная к-та с полиамфолитным элюентом. Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4.6).

СР: 1,3- 2 мМ лимонная к-та (рН 2.95), 2-12.5 мМ уксусная к-та + НС1 (рН 3.0);

Элюент: 1 - 25 мМ Трис + 6 мМ лимонная к-та (рН 7.6), 2 -Полибуфер 96 (рН 7.0), 3-12.5 мМ Трис + 1 мМ лимонная к-та + НС1 (РН 7.6)

Скорость: 1 мл/мин. С учетом простого состава элюента система Трис - лимонная кислота является удачной заменой «Полибуфера»

Влияние ионной силы элюента. Слабые катионообменные сорбенты на своей поверхности имеют примерно одинаковый набор функциональных групп (карбоксильные или карбоксиметильные) и для них полиэлектролитные свойства менее выражены Но тем не менее, только для сильных ионообменников изменение ионной силы подвижных фаз мало сказывается на форме градиента рН На рисунке 17 представлены градиенты, полученные при последовательном уменьшении концентрации сильного электролита (ЫаС1) в элюенте на основе буферного раствора Трис-лимонная кислота.

V, мл

рН_

V, мп

Рис. 17. Влияние ионной силы элюента на профиль восходящего градиента рН.

Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4.6)

СР: 2 мМ лимонная к-та + 1.5 мМ Трис (рН 3 3);

Элюент: 20 мМ Трис + 5 мМ лимонная к-та (рН 7.6). Ионная сила элюента (№С1): 1 -0.5, 2-0.01, 3-0. Скорость: 1 мл/мин.

Создание высокой ионной силы в элюенте позволяет получить практически линейный градиент в диапазоне 4 ед рН Подобный градиент (рис 17, кривая 1) ни в чем не уступает градиентам, формируемым с помощью полиамфолитных элюентов и может применяться для разделения и очистки биологических макромолекул (например, белков и ферментов).

Для подтверждения данного тезиса разделили модельную смесь 2-х белков (рис 18) с близкими значениями изоэлектрических точек' овальбумин (р1 4 7) и бычий сывороточный альбумин (р14.9)

рН_______А, 280 нм

7.5 [ ~ 1

6.5 5.5 4.5 3.5 2.5

Oval.

Рис. 18.

модельной

содержащей

овальбумина

бычьего

Разделение смеси, по 0.02 мг (Oval.) и сывороточного

0

альбумина (BSA). Колонка: МасгоРгер 50 СМ (50x4.6).

СР: 2 мМ лимонная к-та + 1.5 мМ Трис (рН 3,3); Элюент: 20 мМ Трис + 5 мМ лимонная к-та + 0.5 M NaCI (рН 7.6). Скорость: 1 мл/мин.

10 20 30 40 50 У.МЛ

Присутствие сильного электролита в элюенте способствует элюированию белков при рН ниже их ИТ (при рН 3.8 и 3.9, соответственно). На приведенной хроматограмме (рис. 18) пики узкие, симметричные и разделены до базовой линии, хотя и отстоят не слишком далеко друг от друга. Разница в рН, при которых элюируются белки, составляет 0 1 ед , в то время как при ХФ белков с полибуфером минимально достигнутая разница - 0.05 ед. рН. Полученные пики занимают лишь малую часть градиента рН, что говорит о потенциале данного метода и возможности разделения многокомпонентных смесей биполярных соединений

Восходящие градиенты рН на сорбенте для ВЭЖХ.

Все вышеописанные результаты по формированию восходящих градиентов

рН были получены на сорбенте с размером частиц 50 мкм для препаративного

варианта хроматографии. Было интересно исследовать поведение градиентов рН и на сорбенте для ВЭЖХ - ММ на основе ССПС с привитыми карбоксильными группами (5 мкм).

Влияние ионной силы подвижных фаз. Высокая ионная сила в элюенте способствует сглаживанию градиента рН - уменьшаются углы наклона линейных участков (ДрН/Д\/, таблица 2), увеличивается общее время выхода градиента (рис. 19, кривая 2). Добавление сильного электролита в стартовый раствор также увеличивает время выхода градиента рН, но при этом градиент становится практически линейным в диапазоне рН от 3 до 7, без перегибов и участков с

Рис. 19. Влияние ионной силы подвижных фаз на профиль восходящего градиента рН. Колонка: ММ (50x4.6). СР: 2 мМ лимонная к-та (рН 3.0); Элюент: 10 мМ Трис + лимонная к-та (рН 7.5) Ионная сила:

СР: 1-0,2- 0.05 М, 3 - 0, 4 -0 05 М (N80!), 3:1-0,2-0,30.05 М, 4-0.05М(№С1). Скорость: 1 мл/мин.

Таблица 2. Параметры градиентов, приведенных на рис 19

№ градиента Наклон градиента ДрН/ДУ Начальное рН, Конечное рН2 Диапазон ДрН

1а 0.45 3 5 2

16 0.12 5 7 2

2 0.15 3 7 4

3(4)а , 0.26 3 4.5 1.5

3(4)6 0 08 4.5 7 2.5

Разделение изоформ ферментов. Провели ХФ образца формиатдегидрогеназы (ФДГ). используя градиент рН, полученный при создании высокой ионной силы в стартовом растворе (рис. 19, кривая 2) Полученные пики соответствуют скорее всего двум изоформам данного фермента (рис. 20) Структура ФДГ содержит несколько сульфидных мостиков, которые при стоянии белка окисляются до сульфо-групп, образуя тем самым формы фермента с различным количеством заряженных групп на поверхности.

Таким образом, показана возможность разделения белков на карбоксильных катионообменниках МасгоРгер 50 СМ и ММ при использовании простых двухкомпонентных элюентов.

разными углами наклона (рис. 19, кривая 2).

5.5

45

35

2.5

Рис. 20. ХФ образца ФДГ с 0.2 восходящим градиентом рН. Колонка: МЫ (50x4.6). СР: 2 мМ лимонная к-та + 0.05 М №С! (рН 3.0); Элюент: 10 мМ Трис + лимонная к-та (рН 7.5). Скорость: 1 мл/мин.

0.1

О 5 10 15 20 25 V, мл

Восходящие градиенты рН на сильных катионообменниках.

Разделение пептидов. Восходящие градиенты рН, формируемые простыми элюентами внутри сильной катионообменной колонки Hamilton PRP-X200, мы решили использовать для разделения многокомпонентных смесей пептидов Важным отличием от уже известных вариантов разделения пептидов методом ХФ является возможность УФ-детектирования при длинах волн, близких к 200 нм, где поглощает пептидная связь Такой подход позволяет детектировать все пептиды, а не только, например, ароматические при 280 нм. Как указывалось в обзоре литературы, детектирование пептидов при 206 - 214 нм затруднено из-за использования полиамфолитных буферных элюентов, интенсивно поглощающих в этой области спектра.

Влияние ионной силы. Сильные катионообменники практически не обладают буферной емкостью и поэтому сформировать на них протяженный градиент рН весьма затруднительно. Сочетание высокой ионной силы стартового раствора (для создания более протяженного градиента рН) и введения пробы во время формирования градиента позволяет детектировать до 8 пиков (рис 21).

А, 214 нм

1 03

011

А, 214 нм

02 01

; 0 1 О 09

008

V, мл

35 V, МП

Рис 21 ХФ трипсинового гидролизата 01 мг ЧСА при введении пробы во время формирования градиента рН Колонка: Hamilton PRP-X200 CP: 5 мМ NaH2P04 + 0 5 М KCI (рН = 3 0); Элюент: 10 мМ NaH2PO„ + Трис (рН 7 0)

а - хроматограмма в целом, б - участок хроматограммы от 15 до 40 мин с увеличенным масштабом по оси ординат Скорость: 1 мл/мин

Влияние добавок ацетонитрила. Помимо ионной сипы подвижных фаз на разделение пептидов может оказывать влияние добавление органического растворителя, например, ацетонитрила Ацетонитрил в составе элюента уменьшает вклад гидрофобных взаимодействий ароматических пептидов с матрицей сорбента, если таковые имеют место Поэтому далее проводили ХФ того же образца, но пробу вводили во время пропускания стартового раствора, а чтобы пептиды удерживались на колонке, в стартовый раствор сильный электролит не добавляли (рис. 22) Третий участок хроматограммы (после 14 мин) здесь не приводится. На этом участке выходят еще 3 разрешенных пика. Таким образом, удается зарегистрировать более 10 пиков, но недостаточно разделенных друг относительно друга.

Рис 22. ХФ трипсинового гидролизата 0 1 мг ЧСА. СР: 5 мМ №Н2Р04 + 20% СН3СЫ (рН = 3 0), Элюент: 10 мМ ЫаН2Р04 + Трис + 20% СН3СЫ (рН 7.0). а - хроматограмма в целом, б -участок хроматограммы до 5 мин с увеличенным масштабом по оси ординат Остальные условия такие же, как на рис. 21.

Одновременное влияние ионной силы и добавок ацетонитрила. Использование более разбавленных стартовых растворов в сочетании с высокой ионной силой в обеих подвижных фазах и небольшими добавками ацетонитрила (10%) позволяет увеличить селективность разделения пептидов (рис. 23).

Как видно из рисунка 23, создание умеренной ионной силы (0.1) в стартовом растворе и в несколько раз большей (0.3) в элюенте делает возможным частично разделять слабоудерживающиеся пептиды и при этом регистрировать сигнал сильнозаряженных пептидов (рис. 23 б). Добавление ацетонитрила, видимо, также улучшает разрешение, препятствуя размыванию пиков за счет уменьшения гидрофобных взаимодействий с матрицей сорбента. Таким образом, удается детектировать до 15 пиков.

А 214 нм 017 А 214 нм

б

6.5

5.5

4.5

35

2.5

О

10

--о 009 --1-'-'-1-1

20 V, мл Ю 20 30 40 50 У,мп

Рис 23 ХФ трипсинового гидролизата 0.1 мг ЧСА при создании высокой ионной силы в обеих подвижных фазах СР: 3 мМ №Н2Р04 + 0 1 М КС! + 10% CHзCN (рН = 3 0), Элюент: 10 мМ №Н2Р04 + Трис +0 3 М КС1+ 10% CHэCN (рН 7 0) а - хроматограмма в целом, б -участок хроматограммы от 10 до 60 мин с увеличенным масштабом по оси ординат. Остальные условия такие же, как на рис. 21.

ХФ сложных смесей цвиттер-ионных молекул на сильных катионообменниках является новым подходом, способным конкурировать с ионообменной хроматографией с солевым градиентом. Но при этом ХФ не требует наличия градиентного насоса за счет формирования градиента рН или ионной силы внутри колонки путем использования буферных свойств подвижных фаз и ионообменных свойств сорбента. Предложенный подход позволяет расширить границы применения ХФ из-за возможности детектирования при низких длинах волн в УФ области спектра (214 нм).

Выводы:

1 Изучены кислотно-основные и комплексообразующие свойства сорбентов на основе органополимерных матриц с карбоксильными и карбоксиметильными группами в статических условиях. Исследована селективность сорбции на данных сорбентах по отношению к ионам переходных металлов и свинца в зависимости от рН среды.

2 Показана возможность формирования нисходящих градиентов рН внутри карбоксильных катионообменных колонок с использованием коммерческих полибуферных элюентов в варианте классического ХФ Изучены особенности формирования таких градиентов при использовании простых злюентов на основе карбоновых и аминокислот, позволяющих заменить дорогостоящие, обладающие рядом недостатков коммерческие полиамфолитные буферные элюенты. Выбраны условия формирования квази-линейных градиентов рН.

3 Показано существенное влияние ионной силы подвижных фаз в ХФ на профиль внутренних градиентов рН Предложены физико-химические представления, объясняющие причины изменения характерных участков на градиентах рН при добавлении сильных электролитов Выявлено, что для получения внутри карбоксильных катионообменников плавных квази-линейных нисходящих градиентов рН нужно создавать высокую ионную силу в обеих подвижных фазах, а для восходящих только в элюенте.

4 Техника индуцирования впервые применена для формирования градиентов рН в катионообменных системах Подобраны новые индуцирующие растворы и элюенты, состоящие из одного-двух компонентов, позволяющие получить квазилинейные градиенты в широком диапазоне рН. Изучено влияние ионной силы индуцирующих растворов и элюентов на профиль индуцированных градиентов рН.

5 Возможности использования простых элюентов в вариантах индуцирования и ХФ на катионообменных сорбентах продемонстрированы на примере разделения ионов переходных металлов и свинца.

6 Предложены простые одно-, двухкомпонентные элюенты для формирования восходящих квази-линейных градиентов рН на слабо- и сильнокислотных катионообменных колонках.

7 Полученные градиенты применили для разделения смеси белков методом ХФ на катионообменной колонке при использовании простых элюентов.

8 Предложены элюенты на основе дигидрофосфата натрия в сочетании с внутренним градиентом ионной силы для ХФ пептидов с восходящим градиентом рН на сильном катионообменнике Hamilton PRP-X200, что позволяет проводить детектирование при низких длинах волн в УФ области. Данный подход значительно расширяет число регистрируемых пептидов.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях'

1 Тессман А Б , Иванов А В , Бакштейн М С , Нестеренко П Н Влияние ионной силы и присутствия слабого основания на профиль градиента рН в хроматофокусировании // Журн физич химии. 2001 Т 75 №2 С 342-347

2 Иванов А В , Тессман А Б., Нестеренко П Н , Бакштейн М С , Матвеев А В. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании //Вестн Моек ун-та Серия 2 Химия. 2001. Т 42 №2. С. 109-111.

3 Иванов А. В , Вакштейн М С , Нестеренко П Н Формирование нисходящего градиента рН внутри колонки с карбоксильным катионообменником // Журн. физич химии 2003 Т 77 №1 С. 137-139.

4 Вакштейн М С , Иванов А В , Нестеренко П Н , Хасанова Е М Использование карбоновых кислот для формирования нисходящих градиентов рН внутри колонки, заполненной сверхсшитым полистиролом с карбоксильными группами // Вестн Моек ун-та. Серия 2 Химия 2003. Т 44 №4 С 258-263

5 Иванов А В , Вакштейн М С , Хасанова Е М Оптимизация профиля градиента рН внутри карбоксильных колонок за счет ионной силы подвижных фаз // Вестн Моек ун-та. Серия 2 Химия 2003. Т 44. №5. С 318-323.

6 Иванов А В , Вакштейн М С , Хасанова Е.М , Чернышев И.А., Януль Н Ю Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52 Н Вестн Моек ун-та. Серия 2 Химия. 2003 Т 44. N86. С 412-416

7 Иванов А В., Вакштейн М С , Нестеренко П Н , Хасанова Е М. Способ формирования внутренних градиентов рН в хроматографической колонке с карбоксильным катионообменником. // Журн физич. химии. 2003 Т 77 №12 С.2241-2245

8 Иванов А В, Вакштейн М.С, Хасанова Е М, Нестеренко П Н Влияние сильного электролита в подвижных фазах на индуцирование градиента рН внутри карбоксильной колонки. //Журн. физич. химии 2005. Т.79. №5. С 814-817

9 Vakstein М S , Nesterenko Р N , Ivanov А V , Tessman А В Single-Component Eluents for Quasi-Linear рН Gradients in Weak Cation Exchange Columns. // J of Liquid Chromatogr. & Related Techn. 2006. V 29. №4. P.485-496.

10 Иванов AB, Тессман А Б., Вакштейн M С. Формирование линейных градиентов рН в хроматофокусировании при использовании элюентов простого состава / Тез докл Всеросс конф "Химический анализ веществ и материалов" Москва, РАН, 16- 21 апреля 2000. С. 119

11 Tessman А.В., Ivanov А V , Vakshtein М S Quasi-Linear рН Gradients for Chromatofocusing Using Simple Eluents Computer Modeling and Experimental Verification / Proc International Ion Chromatogr Symposium (IICS-2000) France, Nice, 11-14 September 2000. Ns 143

12 Иванов AB, Вакштейн MC, Нестеренко П.Н Формирование нисходящих градиентов рН в колонках, заполненных карбоксильными катионообменниками / Тез докл Всеросс симпозиума "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К.ВЧмутова Москва, РАН, 18-22 марта 2002 №40

13 Хасанова ЕМ, Вакштейн М.С Простые элюенты для формирования градиентов рН внутри колонок с карбоксильными сорбентами / Тез докл Международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2003". М МГУ, 15-18 апреля 2003. С 46.

14 Vakstein M.S., Ivanov A.V, Nesterenko P N, Tessman А В Linear pH gradient for chromatofocusing using single-component eluents within carboxylic column / "100 Years of Chromatography". Abstr. of 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies (SBS-03) Moscow, 13-18 May 2003. № 211. P 321

15 Бакштейн M.C , Иванов A.B , Хасанова E M., Чернышев И A, Януль Н.Ю Сорбция ионов переходных металлов на карбоксильном катионообменнике СМ-52 / Тез докл. IV Всеросс. конф молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" Саратов, СГУ, 23-25 июня 2003 г С.141

16 Vakstein М S , Ivanov А V , Nesterenko Р N , Dubovik DBA single-component eluent for generation of pH gradients within column packed with hyper-crossiinked polystyrene having attached carboxylic groups / Abstr. of 10-th International Conf "Separation of Ionic Solutes" (SIS'03) Slovakia, High Tatras, Podbanske, 6-11 September 2003 P 138-139

17 Нестеренко П H., Иванов А В , Вакштейн M С , Тессман А.Б. Нисходящие градиенты рН внутри слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонок / Тез. докл. XVII Международного Менделевского съезда по общей и прикладной химии. Казань, КазНЦ РАН, 21-26 сентября 2003. Т 2. С.123. (№ А-556).

18 Нестеренко ПН., Вакштейн М.С., Иванов АВ, Хасанова Е.М., Кубышев С С. Индуцирование градиентов рН в какрбоксильных колонках и в тонких капиллярах со свободной неподвижной фазой / Тез докл Всеросс симп "Хроматография и хроматографические приборы" М. РАН 15-19 марта 2004 №131. С.161

19 Ivanov A.V, Chirkov VV, Tessman AB, Garmash AV, Vakstein MS. The Computer Database on Internal pH-Gradients in Ion-Exchange Chromatography / Abstr of Symposium on Computer Application and Chemometncs in Analytical Chemistry (SCAC-2004) Hungary, Veszprem, Lake Balaton, 31 August - 3 September 2004. № P-05

20 Vakstein M S , Ivanov A V , Khasanova E.M., Nesterenko P N Induced Quasi-Linear pH Gradients within Cation-Exchange Carboxylic Column / Abstr of 17th International Ion Chromatography Symposium (IICS-2004) Germany, Trier, 20-23 September 2004. P-05-T P 53-54.

21 Вакштейн MC Физико-химические аспекты формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок / Тез докл Международ конф студентов и аспирантов "Ломоносов-2005" М • МГУ, 12-15 апреля 2005. С 11

22 Иванов А В, Вакштейн М С, Нестеренко П Н Поиск простых элюентов для формирования градиентов рН в слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонках / Тез докл конф. "Ломоносовские чтения-2005" М ■ МГУ, 18-23 апреля 2005. С 19.

23 Вакштейн М С, Иванов А В, Нестеренко П.Н., Кубышев С С Индуцированные градиенты рН в колонках с комплексообразующими сорбентами / Тез докл II Межд симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии (к юбилею акад. Б Ф Мясоедова) Краснодар, 25-30 сентября 2005 г. С.140.

Принято к исполнению 10/07/2006 Заказ №511

Исполнено 12/07/2006 Тираж- 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш,, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

P1 6 6 3 5

i

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ НА АНИОНООБМЕННЫХ И КАТИОНООБМЕННЫХ КОЛОНКАХ.

1.1. Принципы разделения цвиттер-ионных макромолекул методом ХФ.

1.2. Разделение переходных металлов методом ХФ.

1.3. Ионообменные сорбенты для хроматофокусирования.

1.3.1. Матрица.

1.3.2. Функциональные группы.

1.4. Катионообменные сорбенты.

1.4.1. Разделение белков.

1.4.2. Разделение пептидов.

1.5. Подвижные буферные фазы в градиентном элюировании.

1.5.1. Стартовые (уравновешивающие) растворы.

1.5.2. Элюенты, используемые в хроматофокусировании.

1.5.2.1. Полибуферные элюенты (полиамфолиты, полибуферы).

1.5.2.2. Многокомпонентные буферные смеси.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ ГРАДИЕНТОВ РН.

2.1. Моделирование градиентов рН.

2.1.1. Модель Слайтермана.

2.1.2. Модель Мурела.

2.1.3. Модель Фрея.

2.1.4. Модель Тессмана.

2.2. Изучение процессов формирования градиентов рН.

2.2.1. Влияние ионной силы.

2.2.2. «Аномальный» подъем.

2.2.3. Совместное влияние ионной силы и слабого основания в подвижных фазах.

2.2.4. Примеры разделения.

ГЛАВА 3. ИНДУЦИРОВАННЫЕ ГРАДИЕНТЫ РН.

ГЛАВА 4. АППАРАТУРА, РЕАГЕНТЫ, МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

4.1. Аппаратура.

4.2. Сорбенты, реагенты, растворы.

4.3. Методики экспериментов.

ГЛАВА 5. СВОЙСТВА КАРБОКСИЛЬНЫХ СОРБЕНТОВ.

5.1. Выбор сорбента для ХФ металлов.

5.2. Кислотно-основные свойства карбоксильных сорбентов.

5.3. Комплексообразующие свойства СМ-52.

5.4. Сравнение свойств карбоксильных сорбентов.

5.4.1. Кинетика сорбции.

5.4.2. Комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов.

5.4.3. Сорбционная емкость.

5.4.4. Селективность сорбции.

5.4.5. Извлечение ионов Си2+ в зависимости от рН.

ГЛАВА 6. НИСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ.

6.1. Выбор подвижных фаз.

6.1.1. Полиамфолитные элюенты.

6.1.2. Влияние природы стартового раствора.

6.1.3. Простые элюенты.

6.2. Влияние ионной силы элюента.

6.3. Разделение переходных металлов.

6.4. Градиент ионной силы.

ГЛАВА 7. ИНДУЦИРОВАННЫЕ НИСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН.

7.1. Выбор подвижных фаз.

7.1.1. Влияние концентрации ИР.

7.1.2. Влияние концентрации элюента.

7.1.3. Влияние слабого основания в составе элюента.

7.1.4. Влияние природы элюента.

7.1.5. Влияние ионной силы подвижных фаз.

7.1.6. Влияние природы электролита в составе элюента.

7.1.7. Ацетатная система.

7.2. Разделение ионов металлов.

ГЛАВА 8. ВОСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ.

8.1. Выбор подвижных фаз.

8.1.1. Влияние природы и концентрации стартового раствора.

8.1.2. Влияние природы элюента.

8.1.3. Влияние слабого основания в составе стартового раствора.

8.2. Влияние ионной силы элюента.

8.3. Разделение модельной смеси белков.

8.4. Влияние ионной силы стартового раствора.

8.5. Восходящие градиенты рН на сорбенте для ВЭЖХ.

8.5.1. Влияние ионной силы подвижных фаз.

8.5.2. Разделение изоформ ферментов.

8.6. Восходящие градиенты рН на сильных катионообменниках.

8.6.1. Влияние ионной силы элюента.

8.6.2. Разделение пептидов.

8.6.2.1. Выбор подвижных фаз.

8.6.2.2. Влияние ионной силы стартового раствора.

8.6.2.3. Влияние добавок ацетонитрила.

8.6.2.4. Влияние ионной силы элюента.

8.6.2.5. Одновременное влияние ионной силы и добавок ацетонитрила.

ВЫВОДЫ:.

Актуальность работы. Ионообменная и комплексообразовательная хроматография находят все большее применение в аналитической химии за счет расширения круга определяемых соединений и появления все новых модификаций данных вариантов жидкостной хроматографии. Одним из важнейших параметров, позволяющих повышать селективность разделения, является рН подвижной фазы. Часто в хроматографии используют градиентное элюирование, т.е. изменяют состав элюента по определенному правилу. Так, в 1979 г. Слайтерман разработал хроматофокусирование (ХФ) - метод ионообменной хроматографии, основанный на элюировании с внутренним (создаваемым внутри колонки) градиентом рН. В настоящее время используют две техники формирования градиентов рН - «классическое» хроматофокусирование и индуцирование. ХФ обычно применяют для разделения биологических объектов - белков, пептидов, аминокислот, реже азокрасителей и других цвиттер-ионных соединений. В начале 1990-х П.Н. Нестеренко и А.В. Ивановым был предложен метод концентрирования и разделения переходных металлов на одной колонке с использованием техники хроматофокусирования. Традиционно для этих целей формируют нисходящие градиенты рН на анионообменных сорбентах. Однако комплексообразование ионов металлов с аминогруппами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой, в связи с чем целесообразен переход к катионообменным карбоксильным сорбентам.

Хроматофокусирование на катионообменных сорбентах является малоизученным, развивающимся методом разделения и концентрирования цвиттер-ионных соединений. Метод применим для разделения цвиттер-ионов с положительным зарядом в кислой среде, становящихся незаряженными в целом в нейтральной или щелочной средах, что характерно для белков и пептидов. Традиционно в данном методе используют подходы, характерные для ХФ на анионообменных сорбентах. В частности, применяют полиамфолитные элюенты, обладающие рядом недостатков - высокой ценой, склонностью к биодеградации, взаимодействием с разделяемыми компонентами и значительным светопоглощением в используемой для детектирования области спектра. Актуальна замена подобных подвижных фаз на более простые, не имеющие таких ограничений.

Перспективно изучение нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок из-за возможности применения их для разделения и концентрирования переходных металлов. Несмотря на высокий уровень развития метода ХФ в целом, в литературе отсутствуют данные по нисходящим внутренним градиентам на катионообменных колонках. Также не изучен другой вариант хроматофокусирования - индуцирование градиентов рН в слое катионообменного сорбента.

При хроматофокусировании пептидов не удается проводить УФ детектирование при оптимальных длинах волн (ниже 254 нм) из-за высокого фонового поглощения компонентов подвижных фаз. Поиск простых элюентов, позволяющих регистрировать сигнал пептидов при 214 нм, является очень важной задачей при анализе гидролизатов белков.

Цель и задачи исследования.

• Изучение кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. Определение селективности данных сорбентов по отношению к ионам переходных металлов в зависимости от рН в статических условиях.

• Формирование внутренних, нисходящих и восходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок при использовании техники «классического» хроматофокусирования и техники индуцирования.

• Изучение влияния на профиль градиентов рН состава, концентрации и ионной силы подвижных фаз (стартовых и индуцирующих растворов, элюентов) с целью получения линейных градиентов в широком диапазоне рН.

• Демонстрация принципиальной возможности разделения ионов переходных металлов на катионообменниках при использовании вышеупомянутых техник формирования градиентов рН внутри хроматографических колонок.

• Разделение смесей белков и пептидов методом хроматофокусирования с использованием простых низкомолекулярных элюентов.

Научная новизна. Получены нисходящие градиенты рН внутри катионообменных карбоксильных колонок при использовании техники хроматофокусирования. Изучены основные закономерности формирования подобных градиентов и разработаны подходы, позволяющие варьировать профиль градиента в широких пределах в зависимости от целей анализа. Ионная сила подвижных фаз существенно влияет на процессы, протекающие внутри колонки, что позволяет управлять формой градиента. Предложены простейшие одно-двухкомпонентные элюенты, которые в сочетании с варьированием ионной силы могут успешно заменить дорогостоящие коммерческие полиамфолитные буферные растворы. Показана возможность разделения ионов переходных металлов методом хроматофокусирования на катионообменных карбоксильных сорбентах.

Предложено использование техники индуцирования для формирования нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок. Исследовано влияние природы и состава подвижный фазы и индуцирующего раствора на профиль градиентов рН. Подобраны новые индуцирующие растворы и простые элюенты, ранее не использовавшиеся в данном методе. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения модельных смесей металлов на карбоксильной колонке в условиях нисходящего градиента рН.

Найдены условия для формирования линейных восходящих градиентов рН методом хроматофокусирования на катионообменных колонках при использовании простых элюентов. Модельные смеси белков разделены методом ХФ при использовании двухкомпонентного элюента в сочетании с высокой ионной силой.

Новым направлением развития хроматофокусирования для разделения пептидов является использование сильных катионообменников. При хроматофокусировании смесей пептидов значительно улучшены условия детектирования за счет замены традиционно используемых полиамфолитных буферных элюентов простыми смесями низкомолекулярных протолитов.

Практическая значимость работы. Предложены рекомендации по формированию нисходящих градиентов рН на новом для хроматофокусирования типе сорбентов - карбоксильных катионообменных сорбентах. Показана принципиальная возможность использования техники индуцирования и техники «классического» хроматофокусирования для разделения переходных металлов на катионообменниках с УФ-детектированием.

Подобраны условия, в которых простые одно-двухкомпонентные элюенты могут заменить дорогостоящие и обладающие целым рядом недостатков коммерческие полиамфолитные буферные растворы для формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок. В данных условиях разделены смеси белков и пептидов. При хроматофокусировании трипсиновых пептидов предложен подход, позволяющий проводить детектирование при низких длинах волн (214 нм), что значительно расширяет количество регистрируемых соединений в гидролизате белка.

Положения, выносимые на защиту.

1. Данные по кислотно-основным и сорбционным свойствам карбоксильных сорбентов СМ-52, Ольвагель-СООН, МасгоРгер 50 CM, MN.

2. Применение катионообменных сорбентов для формирования нисходящих и восходящих градиентов рН.

3. Результаты по изучению влияния ионной силы подвижных фаз на профиль внутренних градиентов рН, формируемых на катионообменниках.

4. Применение техники индуцирования и техники «классического» хроматофокусирования для разделения модельных смесей переходных металлов.

5. Способы получения линейных градиентов рН с простыми низкомолекулярными одно-двухкомпонентными элюентами вместо полиамфолитных.

6. Данные по разделению смесей белков на слабых катионообменниках методом хроматофокусирования при создании градиента рН простыми элюентами.

7. Метод разделения смесей пептидов при одновременном формировании градиентов рН и ионной силы внутри колонки, позволяющий проводить детектирование при 214 нм.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов-2000, 2003, 2005". (Москва, МГУ); Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, РАН, 2000); Международных симпозиумах по ионной хроматографии (IICS-2000, 2004) (Франция, Ницца, 2000; Германия, Трир, 2004); Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, РАН, 2001); Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К.В.Чмутова (Москва, РАН, 2002); 3-м международном симпозиуме по разделению в бионауках (SBS-03) "100 лет хроматографии" (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". (Саратов, СГУ, 2003); 10-й Международной конференции "Разделение ионных соединений" (SIS'03) (Словакия, Высокие Татры, Подбаньске, 2003); XVI! Международном Менделевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, КазНЦ РАН, 2003); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" (Москва, РАН, 2004); Международном симпозиуме по компьютерным приложениям и хемометрике в аналитической химии (SCAC-2004) (Венгрия, Вешпрем, оз. Балатон, 2004); VII Всероссийской конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2004); "Ломоносовских чтениях-2005" (Москва, МГУ); Международной конференции "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (Украина, Киев, 2005); II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 2005); X Международной конференции "Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии". (Москва, РАН, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 19 тезисов докладов:

1. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн М.С. Влияние состава подвижных фаз на профиль начального участка градиента pH в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т. 41. №4. С.251-255.

2. Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и присутствия слабого основания на профиль градиента pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2001. Т. 75. №2. С.342-347.

3. Иванов A.B., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев A.B. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №2. С.109-111.

4. Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминогруппами для моделирования внутренних градиентов pH. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №1. С.13-16.

5. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящего градиента pH внутри колонки с карбоксильным катионообменником. // Журн. физич. химии. 2003. Т. 77. №1. С.137-139.

6. Вакштейн М.С., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Использование карбоновых кислот для формирования нисходящих градиентов pH внутри колонки, заполненной сверхсшитым полистиролом с карбоксильными группами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №4. С.258-263.

7. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М. Оптимизация профиля градиента pH внутри карбоксильных колонок за счет ионной силы подвижных фаз. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №5. С.318-323.

8. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М., Чернышев И.А., Януль Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №6. С.412-416.

9. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Способ формирования внутренних градиентов pH в хроматографической колонке с карбоксильным катионообменником. //Журн. физич. химии. 2003. Т. 77. №12. С.2241-2245.

10. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М, Нестеренко П.Н. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на индуцирование градиента pH внутри карбоксильной колонки. //Журн. физич. химии. 2005. Т.79. №5. С.814-817.

11. Vakstein M.S., Nesterenko P.N., Ivanov A.V., Tessman A.B. Single-Component Eluents for Quasi-Linear pH Gradients in Weak Cation Exchange Columns. // J. of Liquid Chromatogr. & Related Techn. 2006. V.29. №4. P.485-496.

12. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн M.C. Формирование линейных градиентов pH в хроматофокусировании при использовании элюентов простого состава. / Тез. докл. Всеросс. конф. "Химический анализ веществ и материалов". Москва, РАН, 16-21 апреля 2000. С.119.

13. Tessman A.B., Ivanov A.V., Vakshtein M.S. Quasi-Linear pH Gradients for Chromatofocusing Using Simple Eluents: Computer Modeling and Experimental Verification. I Proc. International Ion Chromatogr. Symposium (IICS-2000). France, Nice, 11-14 September 2000. № 143.

14. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн M.C., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминогруппами для моделирования в хроматофокусировании. / Тез. докл. VIII Всеросс. симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва, РАН, 15-19 октября 2001 г. С.66.

15. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящих градиентов pH в колонках, заполненных карбоксильными > катионообменниками. / Тез. докл. Всеросс. симпозиума "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К.В.Чмутова. Москва, РАН, 18-22 марта 2002. №40.

16. Хасанова Е.М., Вакштейн М.С. Простые элюенты для формирования градиентов pH внутри колонок с карбоксильными сорбентами. / Тез. докл. Международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2003". М.: МГУ, 15-18 апреля 2003. С.46.

17. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Tessman A.B. Linear pH gradient for chromatofocusing using single-component eluents within carboxylic column. I "100

Years of Chromatography". Abstr. of 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies (SBS-03). Moscow, 13-18 May 2003. №211. P.321.

18. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Хасанова E.M., Чернышев И.А., Януль Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов на карбоксильном катионообменнике СМ-52. / Тез. докл. IV Всеросс. конф. молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". Саратов, СГУ, 23-25 июня 2003 г. С.141. (доклад получил диплом III степени от Оргкомитета конференции).

19. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Dubovik D.B. A single-component eluent for generation of pH gradients within column packed with hyper-crosslinked polystyrene having attached carboxylic groups. / Abstr. of 10-th International Conf. "Separation of Ionic Solutes" (SIS'03). Slovakia, High Tatras, Podbanske, 6-11 September 2003. P.138-139.

20. Нестеренко П.Н., Иванов А.В., Вакштейн M.C., Тессман А.Б. Нисходящие градиенты рН внутри слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонок. / Тез. докл. XVII Международного Менделевского съезда по общей и прикладной химии. Казань, КазНЦ РАН, 21-26 сентября 2003. Т.2. С.123. (№ А-556).

21. Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Иванов А.В., Хасанова Е.М., Кубышев С.С. Индуцирование градиентов рН в какрбоксильных колонках и в тонких капиллярах со свободной неподвижной фазой. / Тез. докл. Всеросс. симп. "Хроматография и хроматографические приборы". М.: РАН, 15-19 марта 2004. №131. С.161.

22. Ivanov А.V., Chirkov V.V., Tessman А.В., Garmash A.V., Vakstein M.S. The Computer Database on Internal pH-Gradients in ion-Exchange Chromatography. / Abstr. of Symposium on Computer Application and Chemometrics in Analytical Chemistry (SCAC-2004). Hungary, Veszprem, Lake Balaton, 31 August - 3 September 2004. № P-05.

23. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Khasanova E.M., Nesterenko P.N. Induced QuasiLinear pH Gradients within Cation-Exchange Carboxylic Column. / Abstr. of 17th International ion Chromatography Symposium (IICS-2004). Germany, Trier, 20-23 September 2004. P-05-T. P.53-54.

24. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Смирнова Н.Ю., Хасанова Е.М., Чернышев И.А. Комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов для хроматофокусирования. / Тез. докл. VII конф. "Аналитика Сибири и Дальнего Востока". Новосибирск, 11-16 октября 2004 г. Секция III. № СД-Ш-7.

25. Вакштейн М.С. Физико-химические аспекты формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок. / Тез. докл. Международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2005". М.: МГУ, 12-15 апреля 2005. С.11.

26. Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Поиск простых элюентов для формирования градиентов рН в слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонках. / Тез. докл. конф. "Ломоносовские чтения-2005". М.: МГУ, 18-23 апреля 2005. С.19.

27. Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Vakstein M.S., Kubyshev S.S. Induced decreasing pH gradients in chelating chromatography. I Abstr. International Conf. "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (to the 100-th anniversary of A.Babko). Ukraine, Kiev, 12-18 September 2005. № P1-29.

28. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Кубышев С.С. Индуцированные градиенты рН в колонках с комплексообразующими сорбентами. / Тез. докл. II Межд. симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии (к юбилею акад. Б.Ф.Мясоедова). Краснодар, 25-30 сентября 2005 г. С. 140.

66 Kang X., Frey D.D. Chromatofocusing using micropellicular column packings with computer-aided design of the elution buffer composition. // Anal. Chem. 2002. V.74. N5. P.1038-1045.

67 Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. I. General principles. // J. Chromatogr. 1985. V.347. P.325-334.

68 Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. II. Experimental verification. // J. Chromatogr. 1986. V.362. P.101-112.

69 Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies of multicomponent chromatography using pH-gradient. //AlChE J. 1995. V.41. N5. P.1171-1183.

70 Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ. (russian translation).Stockholm-Uppsala: LKB, 1981. 44 с.

71 R. Mhatre, W. Nashabeh, D. Schmalzing, X. Yao, M. Fuchs, D. Whitney and F. Regnier. Purification of antibody Fab fragments by cation-exchange chromatography and pH gradient elution // J. Chromatogr. A. 1995. V.707, P.225-231.

72 Yang Y-B., Harrison K. and Kindsvater J. Characterization of a novel stationary phase derived from a hydrophilic polystyrene-based resin for protein cation-exchange high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A, 1996. V.723. P.1 -10.

73 Malmquist G. and Lundell N. Characterization of the influence of displacing salts on retention in gradient elution ion-exchange chromatography of proteins and peptides // J. Chromatogr. A. 1992. V.627. P.107-124.

74 Barnidge D.R., Tschumper R.C., Jelinek D.F., Muddiman D.C. and Kay N.E. Protein expression profiling of CLL В cells using replicate off-line strong cation exchange chromatography and LC-MS/MS // J. Chromatogr. B. 2005. V.819. P.33-39.

75 Bihan T.L., Duewel H.S. and Figeys D. On-line strong cation exchange |j-HPLC-ESI-MS/MS for protein identification and process optimization // J. Am. Soc. Mass Spectr. 2003. V.14. P.719-727.

76 Granger M., Todorov S.D., Matthew M.K., Dicks L.M. Growth of Enterococcus mundtii ST15 in medium filtrate and purification of bacteriocin ST15 by cation-exchange chromatography. // J Basic Microbiol. 2005. V.45. P.419-25.

77 Mirzaei H., Regnier F. Enrichment of carbonylated peptides using Girard P reagent and strong cation exchange chromatography. //Anal. Chem. 2006. V.78. P.770-778.

78 Francina A., Dorleac E., Cloppet H., Delaunay J. Chromatofocusing of human hemoglobins: application to the quantitation of hemoglobin A2. // J. Chromatogr. 1982. V.228. P.177-185.

79 Slais К. Simultaneous conductivity and potentiometric detector for miniaturized liquid chromatography and flow analysis.//J. Chromatogr. 1991. V.540. P.41-51.

80 Muller W. New ion exchangers for the chromatography of biopolymers // J. Chromatogr. 1990. V.510. P.133-140.

81 Weitzhandler M., Farnan D., Horvath J., Rohrer J.S., Slingsby R.W., Avdalovic N., Pohl C. Protein variant separations by cation-exchange chromatography on tentacle-type polymeric stationary phases // J. Chromatogr. A 1998. V.828. P.365-372.

82 Alpert A.J. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of proteins on poly(aspartic acid)—silica II J. Chromatogr. 1983. V.266. P.23-37.

83 Ofman R., Wanders R.J.A. Purification of peroxisomal acyl-CoA: dihydroxyacetonephosphate acyltransferase from human placenta. // Biochim. Biophys. Acta 1994. V.1206. N1. P.27-34.

84 Jacob L., Beecken V., Bartunik L.J., Rose M., Bartunik H.D. Purification and crystallization of yeast hexokinase isoenzymes: Characterization of different forms by chromatofocusing. //J. Chromatogr. 1991. V.587. P.85-92.

85 Wall R.A. Separation of peptides on macroreticular ion exchangers. // Anal. Biochem. 1970. V.35. N1. P.203-208.

86 Alpert A.J, Andrews P.C. Cation-exchange chromatography of peptides on poly(2-sulfoethyl aspartamide)-silica. // J. Chromatogr. 1988. V.443. P.85-96.

87 Croft L.R. Handbook of protein sequence analysis: a compilation of amino acid sequences of proteins with an introduction to the methodology. New York: Wiley, 1980. 628 p.

88 Fermo I, De Vecchi E., Diomede L., Paroni R. Serum amino acid analysis with pre-column derivatization: comparison of the o-phthaldialdehyde and N,N-diethyl-2,4-dinitro-5-fiuoroaniline methods. II J. Chromatogr. 1990. V.534. P.23-35.

89 Gulati D., Bongers J., Burman S. RP-HPLC tryptic mapping of lgG1 proteins with post-column fluorescence derivatization. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. V.21. N5. P.887-893.

90 Liu H., Cho B.-Y., Strong R., Krull I.S., Cohen S., Chan K.C., Issaq H.J. Derivatization of peptides and small proteins for improved identification and detection in capillary zone electrophoresis (CZE)// Anal. Chim. Acta1999. V.400. P.181-209.

91 Mantabe T. Capillary electrophoresis of proteins for proteomic studies. // Electrophoresis 1999. V.20. P.3116-3121.

92 Mazzeo J.R., Martineau J.A., Krull I.S. Peptide mapping using EOFDriven capillary isoelectric focusing. // Anal. Biochem. 1993. V.208 P.323- 329.

93 Mohan D., Lee C.S. Extension of separation range in capillary isoelectric focusing for resolving highly basic biomolecules. //J. Chromatogr. A. 2002. V.979 P.271-276.

94 Shen Y., Berger S.J., Anderson G.A., Smith R.D. High-efficiency capillary isoelectric focusing of peptides. II Anal. Chem. 2000. V.72 P.2154- 2159.

95 Bates R.C., Frey D.D. Quasi-linear pH gradients for chromatofocusing using simple buffer mixtures: local equibrium theory and experimental verification. // J. Chromatogr. 1998. V.814. P.43-54.

96 Righetti P.G., Gianazza E., Bjellqvist B. Modern aspects of isoelectric focusing: two-dimensional maps and immobilized gradients. // J. Biochem.Biophys.Methods. 1983. V.8 N 2. P.89-108.

97 Righetti P.G., Pagani M., Gianazza E. Characterization of synthetic carrier ampholytes for isoelectrofocusing.//J. Chromatogr. 1975. V.109. P.341-356.

98 Charlionet R., Martin J.P., Sesboue R., Madec P.J., Lefebvre F. Synthesis of highly diversified carrier ampholytes. Evaluation of the resolving power of isoelectric focusing in the Pi-system.//J. Chromatogr. 1979. V.176. P.89-101.

99 Charlionet R., Morcamp C., Sesboue R., Martin J.P. Limiting factors for the resolving power of isoelectric focusing in natural pH-gradient. // J. Chromatogr. 1981. V.205. P.355-366.

100 Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusung high-performance liquid chromatography I. Practical aspects. // J. Chromatogr. 1997. V.762. P.207-217.

101 Strong J.C., Frey D.D. Experimental and numerical studies of the chromatofocusing of dilute proteins using retained pH gradients formed on a strong-base anion-exchange column.//J. Chromatogr. A 1997. V.769. P.129-143.

102 Иванов A.B., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев А.В. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №2. С.109.

103 Frey D.D. Local-Equilibrium Behavior of Retained pH and Ionic Strength Gradients in Preparative Chromatography. // Biotechnol. Prog. 1996. V12. N1. P.65-72.

104 Farnan D., Frey D.D., Horvath C. Intraparticle Mass Transfer in High-Speed Chromatography of Proteins. // Biotechnol. Prog. 1997. V.13. N4. P.429-439.

105 Narahari C.R, Strong J.C., Frey D.D. Displacement chromatography of proteins using a self-sharpening pH front formed by adsorbed buffering species as the displacer. II J. Chromatogr. 1998. V.825. P.115-126.

106 Bates R.C., Kang X., Frey D.D. High-performance chromatofocusing using linear and concave pH gradients formed with simple buffer mixtures: I. Effect of buffer composition on the gradient shape. // J. Chromatogr. 2000. V.890. P.25-36.

107 Narahari C.R., Randers-Eichhorn L., Strong J.C., Ramasubramanyan N., Rao G., Frey D. D. Purification of Recombinant Green Fluorescent Protein Using Chromatofocusing with a pH Gradient Composed of Multiple Stepwise Fronts II Biotechnol. Prog. 2001. 17. P.150.

108 Frey D.D., Narahari C.R., Butler C.D. General Local-Equilibrium Chromatographic Theory for Eluents Containing Adsorbing Buffers // AlChE J. 2002. V.48. N3. P.561-571.

109 Farnan D., Frey D.D., Horvath Cs. Surface and pore diffusion in macroporous and gel-filled gigaporous stationary phases for protein chromatography. // J. Chromatogr. 2002. V.959. P.65-73.

110 Shen H., Frey D.D. Charge regulation in protein ion-exchange chromatography: Development and experimental evaluation of a theory based on hydrogen ion Donnan equilibrium. II J. Chromatogr. 2004. V.1034. P.55-68.

111 Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн M.C., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента рН в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2001.Т.75. №2. С.342.

112 Тессман А.Б. Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000. 158 с.

113 Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1999. Т. 73. N 8. С. 1476-1479.

114 Тессман А.Б., Иванов А.В., Гармаш А.В., Нестеренко П.Н. Образование аномальных участков внутреннего градиента рН в хроматофокусировании // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т. 23. С.20-23.

115 Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В., Рунов В.К. Аномальные участки на профиле внутреннего градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. N6. С.1069-1072.

116 Иванов А.В., Тессман А.Б., Вакштейн М.С. Влияние состава подвижных фаз на профиль начального участка градиента рН в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т. 41. №4. С.251-255.

117 Slais К. Microcolumn liquid chromatography with sample-induced internal pH-gradient. //J. Microcol. Sep. 1991. V.3. P.191-197.

118 Janecek M., Salamoun J., Slais K. Sample-induced internal pH-gradients in microcolumn liquid chromatography of proteins. // Chromatographia 1991. V.32. N 1-2. P.61-64.

119 Slais K., Friedl Z. Control of column influence on the wide range pH-gradient in ion-exchange chromatography. // Chromatographia. 1992. V.33. N 5-6. P. 231-236.

120 Slais K., Friedl Z. Ampholyte dyes for spectroscopic determination of pH in electrofocusing. //J. Chromatogr. 1995. V.695. P.113-122.

121 Иванов А.В. Хроматофокусирование переходных металлов. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 1997. 204 с.

122 Иванов А.В., Фигуровская В.Н., Иванов В.М. Молекулярная абсорбционная спектроскопия комплексов 4-(2-пиридилазо)резорцина как альтернатива атомно-абсорбционной спектроскопии. // Вестн. Моск. ун-та. Сер.2: Химия. 1992. Т.ЗЗ. N 6. С.570-574.

123 Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Иванов В.М. Сорбция цветных металлов кремнеземами с привитыми органическими соединениями. //Журн. аналит. химии. 1983. Т.38. N 1. С.22-32.

124 Sillen L.G., Martell А.Е. Stability constants of metal-ion complexes. Special publication N 17. London: The Chemical Society. 1964. 754 pp.

125 Салдадзе K.M., Копылова-Валова В.Д. Комплексообразующие иониты (комплекситы). М.: Химия. 1980. 336 с.

126 Иванов А.В., Тессман А.Б. Непрерывный контроль рН эффлюента в хроматографии с градиентом рН. // Вестн.Моск.Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241-244.

127 Тессман А.Б., Иванов А.В. Компьютерный расчет кислотно-основных равновесий в водных растворах с помощью программы "Acid-Base Calculator". // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57. №1. С.6-11.

128 Kolla P., Kohler J., Schomburg G. Polymer-coated cation-exchange stationary phases on the basis of silica // Chromatographia. 1987. 23. P.465-472.

129 Morris J., Fritz J.S. Ion chromatography of metal cations on carboxylic acid resins. // J. Chromatogr. 1992. V.602. P.111-117.

130 Макроциклические соединения в аналитической химии. П/ред. Ю.А.Золотова и Н.М.Кузьмина. М.: Наука, 1993. 320 с.

131 Паршина И.Н., Стряпков А.В. Сорбция ионов металлов органическими катионитами из карьерных растворов. // Вестник ОГУ. Химия 2003. №5. С. 107-109.

132 Нестеренко П.Н., Шпигун О.А. Высокоэффективная комплексообразовательная хроматография ионов металлов на сорбентах с привитой иминодиуксусной кислотой. // Координац. химия 2002. Т.28. №10 С.772-782.

133 Кебец П.А., Кузьмина К.А., Нестеренко П.Н. Теплоты адсорбции катионов металлов на силикагеле с ковалентно закрепленной полиаспарагиновой кислотой. //Журн. физич. химии 2002 Т.76. №9. С.1639.

134 Цизин Г.И., Седых Э.М., Банных Л.Н., Сорокина Н.М., Золотое Ю.А. Проточное сорбционно-атомно-абсорбционное определение металлов в природных водах и растворах. // ЖАХ 1995. Т.50. №1. С.76-83.

135 Nesterenko P.N., Jones P. Isocratic separation of lanthanides and yttrium by high-performance chelation ion chromatography on iminodiacetic acid bonded to silica. // J. Chromatogr. A. 1998. V.804. P.223-231.

136 Tanford C. Physical chemistry of macromolecules. N.Y.: Wiley, 1961. 457 p:

137 Пеннер H.A. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000.

138 Нестеренко П.Н., Кебец П.А., Волгин Ю.В. Применение сульфокатионообменника на основе сверхсшитого полистирола для разделения органических кислот. //ЖАХ. 2001. Т.56. №8. С.801.

139 Snow J.T. Peptides: The Drugs of the Future and Derivatized Amino Acids for Synthesis. New York: Calbiochem, 1988.

140 http://www.hamiltoncompany.com/product/hplc/prpx800.html

141 http://www.alltechweb.com/productinfo/technical/app/A0009.pdf