Формирование внутренних градиентов pH в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Содержание.

Введение.

Глава 1. Хроматофокусирование.

1.1. Принципы, на которых основано разделение амфолитов.,.: 1.2. Применяемые ионообменные сорбенты.

1.2.1. Протолитические и ионообменные свойства сорбентов, применяемых в хроматофокусировании.

1:2.1.1. Константа протежирования функциональных групп сорбента.

1.2.1.2. Коэффициенты анионного обмена СГ на А" К(С 1,А).

1.2.1.3. Коэффициенты катионного обмена К(Н,№).

1.3. Элюенты, используемые в хроматофокусировании.

1.4. Стартовые (уравновешивающие) растворы.

1.5. Модели формирования градиента рН в хроматофокусировании.;.

1.5.1. Модель Слайтермана - Элгерсмы.

1.5.2. Модель Мурела и сотрудников.:,.

1.5.3. Модель Фрея, Барнеса и Стронга.

1.5.3.1. Модель локальных равновесий.:.

1.5.3:2. Численное изучение формирования внутреннего градиента рН.

1.5.3.3. Расчет по модели локальных равновесий и точный численный расчет с учетом массопереноса в системе.,.

Глава 2. Математическое моделирование ионообменных равновесий.;.

2.1. Ионный обмен как химическая реакция.

2.2. Ионный обмен с позиции теории растворов электролитов.

2.3. Учет осмотического давления :.

2.4. Применяемые математические методы.

Методы .оптимизации.

Глава 3. Аппаратура, реагенты, методика эксперимента, расчеты.

3.1. Аппаратура.

3.2. Сорбенты, реагенты, растворы.

3.3. Методики эксперимента.

Глава 4. Модельные внутренние градиенты рН.

4.1. Выбор и описание модели.

4:1.1. Ионообменные гетерогенные равновесия.,.•••

4.1.2. Физико-химическая модель.,.

4.1.3. Математическая модель.

4.1.4. Параметры модели.

4.2. Влияние параметров модели на форму выходных кривых.

4.2.1. Состав элюента.

4.2.1.1. Состав активных компонентов. Одноком'понентные системы: одноосновные кислоты.

4.2.1.2. Многокомпонентные системы: одноосновные кислоты.

4.2.1.3. Однокомпонентные системы: многоосновныё кислоты.

4.2.1.4. Инертнью компоненты.-:.

4.2.2. Параметры колонки.:

4.2.3. Сорбент.:.

4.3. Соответствие рассчитанных профилей внутренних градиентов рН литературным данным.

4.4. Сравнение с моделями Слайтермана-Элгерсмы, Мурела и сотр., Фрея и сотр. и пути проверки модели.

4.5. Экспериментально определенные значения параметров модели .86 4.5.1. Константа протонирования аминогрупп сорбента.

4.5.2. Коэффициенты анионного обмена хлорид-иона-на анион слабой■ кислоты /С(С1,А) на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами .'.;.'.:.•.

4.5.3. Коэффициенты катионного обмена протона на натрий К{Н,№) на дикарбоновых кислотах, сорбированных на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами.

Глава 5. Экспериментальные внутренние градиенты рН.

5.1. Влияние состава элюента на профиль градиента рН

5.1.1. Однокомпонентные системы: одноосновные кислоты.10Ó

5.1.2. Однокомпонентные системы: двухосновные кислоты.

5.1.3. Проверка влияния ионной силы. . .:.,.

5.1.4. Влияние слабого основания.,.:.

5.2; Природа аномального участка . .:

5.3. Рекомендации по.формированию квази-линейных внутренних градиентов рН.:.

5.4. Примеры разделения аминокислот и белков на квази-линейном градиенте, полученном по нашему способу.

5.4.1. Модельная смесь аминокислот.-.

5.4.2. Разделение Изоформ плазминогена.

5.5. Сравнение экспериментальных и модельных градиентов рН

Глава 6. Программное обеспечение.

6.1. Программа расчета выходных кривых рН

6.2. База данных по внутренним градиентам рН . .:. 133 6.2.1. Причины создания специализированной базы данных по внутренним градиентам рН.

6:2.2. Структура базы данных.

6.2.3. Диалоговые окна.

6.3. Программа Acid-Base Calculator.

6.3.1. Причины создания программы Acid-Base Calculator.

6.3.2. Физико-химические положения, используемые в программе.:.

6.4. Программа Альфа для расчета степени протонированйя слабоосновных групп сорбента. 147 '

Выводы.:.

Актуальность работы. Среди гибридных методов в аналитической химии в последние годы, широкое распространение получили" ионообменная, комплексообразова+ельная и другие варианты жидкостной хроматографии. Развитие и совершенствование этих методов связано с расширяющимся кругом определяемых компонентов, анализируемых объектов, возможностью сочетания хроматографии с. другими методами анализа. В 1979 г. Слайтерманом был создан новый метод препаративного разделения и определения белков на ионообменных колонках, основанный на элюировании с внутриколоночным (внутренним) градиентом рН, -хроматофокусирование. Выбор компонентов хроматографической системы сорбента, стартового раствора и элюента - в методе хроматофокусирования в большинстве случаев основан на эмпирическом, подходе, а существующие модели формирования внутреннего градиента рН дают лишь крайне упрощенное представление, о системе. Многие характерные участки градиента рН невозможно объяснить с помощью существующих моделей. В то же время стоимость химических реактивов, используемых для получения внутренних градиентов рН, достаточно высока. Особенно это относится к буферным элюентам, составленным из синтетических полиамфолитов, . свойства которых могут быть плохо воспроизводимы. Кроме того, подобные элюенты под действием бактерий быстро разрушаются. В целом это приводит к высокой стоимости .метода хроматофокусирования при его рутинном использовании. В связи с этим актуально изучение процессов формирования внутренних градиентов рН и создание физико-химической и математической модели, описывающей все особенности градиента. На основании полученных закономерностей, связывающих форму внутреннего градиента рН с параметрами хроматографической системы, можно будет подбирать элюенты, составленные из небольшого числа простых протолитов. Кроме того, необходимо создать программу или пакет программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия, что сэкономит время, химические реактивы и снизит стоимость анализа в целом, а также поможет исследователю подобрать градиент требуемой формы. .

Цель работы: разработка методов расчета профилей внутренних градиентов рН; поиск закономерностей, связывающих форму градиента рН с параметрами системы; поиск дешёвых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов, для получения рабочих градиентов рН требуемой формы; создание информационной базы данных по внутренним градиентам рН.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

1. Анализ литературных данных по формированию внутренних градиентов рН в хроматофокусировании (теоретические принципы, модельные представления и практическое применение);

2. Разработка физико-химической и математической модели формирования'внутреннего градиента рН, учитывающей гомогенные и . гетерогенные химические равновесия, протекающие в системе, и описывающей все основные особенности профиля градиента рН;

3. Анализ модели, т.е. выявление закономерностей,, связывающих форму' градиента с параметрами модели;

4. Получение экспериментальных значений отдельных параметров модели (констант протонирования аминогрупп для сорбентов АР-БЮг, Еп-ЭЮг и Те^еп-БЮг' коэффициентов ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот и коэффициентов обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах);

5. Проверка адекватности модели литературным и собственным экспериментальным данным;

6. Разработка аппаратурного оформление для получения экспериментальных внутренних градиентов рН;

7. Поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов;

8. Разработка пакета программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия (сорбент, стартовый раствор, элюент, требуемая форма градиента рН), для экономии времени и стоимости химического анализа. Научная новизна. Найдены основные закономерности формирования внутриколоночных градиентов рН в хроматофокусировании и требования к сорбентам и составу подвижных фаз стартового раствора и элюента.

В качестве сорбентов для получения квази-линейных градиентов рН исследованы' кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами: Еп-вЮг, .□¡еп-вЮг и Те^еп-вЮг- Были определены константы протонирования аминогрупп этих сорбентов, а также коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот и коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах.

Изучено влияние природы и состав стартового раствора, и элюента,-составленного из простых протолитов, на форму градиента рН. Впервые показано влияние ионной силы на форму градиента рН.

Разработана физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитные и полифункциональные свойства сорбента. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные участки на профиле градиента рН.

Профили градиентов рН, рассчитанных на основе модели, хорошо согласуются с полученными экспериментально в аналогичных условиях. Модель впервые позволила объяснить- образование так называемых "аномальных" участков на. профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора), что в принципе невозможно было объяснить с помощью моделей, учитывающих только буферные свойства системы, и лишь частично - с помощью модели локальных равновесий Фрея*. Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies, of multicomponent chromatography using pH-gradient.//AlChE Journal. 1995. V.41 N5. P.1171-1183.

Практическая значимость работы. Даны практические рекомендации по созданию Дешевых элюентов простого состава и способы управления формой градиента рН за счет изменения ионной силы подвижных фаз. Показана возможность хроматографического разделения модельной смеси аминокислот и изоформ плазминогена. Создан пакет программ для операционной системы Windows 95, 98 - Acid Base Calculator, Cfocusing, Alpha и база данных "pH-gradients". Эти программы позволяют до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых веществ форму градиента рН).

Положения, выносимые на защиту:

1. Физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитныё и полифункциональные свойства сорбента.

2. Результаты моделирования внутренних градиентов рН и их сравнение с экспериментальными данными.

3. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента рН.

4. Коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот и коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах.

5. Способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием элюентов на основе небольшого числа дешевых реагентов простого состава.

6. Программное обеспечение для расчета внутренних рН-градиентов, рН и ионной силы смесей кислот и оснований в водных растворах, степени протонирования сорбента, а также информационная база данных по модельным и экспериментальным градиентам рН.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VIII Всероссийской конференции "Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов" (Воронеж, 1996 г.); Международном конгрессе по аналитической химии (ICAC-97) (Москва, 1997 г.); Международной конференции студентов и аспирантов по

1997 г.); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-98" (Москва, МГУ, 1998 г.); Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998 г.); Всеукраинской конференции по аналитической химии (Ужгород, 1998 г.); 2-й Всероссийской конференции по истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) (Москва, 1999 г.); Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99) (Москва, 1999 г.); VII Всероссийской конференции "Органические реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 9 тезисов докладов:

1. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Физико-химическая и математическая модели формирования внутреннего линейного градиента pH в хроматографической колонке. // Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 9. С. 1683-1689.

2. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Расчет внутренних градиентов pH. //Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 10. С. 1872-1876.

3. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Расчет влияния инертных компонентов элюента на градиент pH при хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 11. С. 2054-2059.

4. A.V. Garmash, A.B. Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of internal pH-gradient in chromatofocusing // Fresenius' J. Anal. Chem. 1998. V. 361. N3. P. 274-275.

5. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, E.B. Курочкина, A.B. Гармаш, П.Н. Нестеренко. Моделирование внутренних градиентов pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1998. Т. 22. С.347-358.

6. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, A.B. Гармаш, П.Н. Нестеренко. Образование аномальных участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т. 23. С.20-23.

7. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1999. Т. 73. N 8. С. 1476-1279.

8. A.B. Иванов, А.Б. Тессман. Непрерывный контроль pH эффлюента в хроматографии с градиентом pH. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241-244.

9. A.B. Иванов, А.Б. Тессман, П.Н. Нестеренко. Применение кремнезема с привитыми группами оксипролина для одновременного ионохроматографического определения натрия, хлорида и анионов дикарбоновых кислот. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия, (в печати).

10. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш, В.К. Рунов. Аномальные участки на профиле внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. N6. С. 10691072.

11. А.Б. Тессман, A.B. Иванов, М.С. Вакштейн. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента pH в хроматофокусировании: теоретические принципы и экспериментальная проверка. //Журн. физич. химии. 2000. (в печати).

12. A.B. Гармаш, А.Б. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. VIII Всесросс. конф. "Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов". Воронеж: ВГУ, 1996. С.8-9.

13. A.V.Garmash, A.B.Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of internal pH-gradient in chromatofocusing. / International Congress on Analytical Chemistry. Moscow, 1997. E-19.

14. А.Б. Тессман. Расчет кислотно-основных равновесий с применением компьютерного программирования. / Тез. докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-98. М: МГУ, 1998. С.6.

15. A.B. Иванов, П.H. Нестеренко, A.B. Тессман, A.B. Гармаш. Формирование внутренних градиентов pH с использованием слабых органических протолитов и аминокислот. / Тез. докл. Всеросс. симп. по теории и практике хроматографии и электрофореза. М.: Научный совет по хроматографии РАН. 1999. С.48.

16. A.B. Гармаш, A.B. Тессман, A.B. Иванов, П.Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеукр. конф. по аналитической химии. Ужгород, 1998. С.43.

17. A.B. Иванов, A.B. Тессман, П.Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Определение коэффициентов катионного обмена на сорбированных дикарбоновых кислотах и их использование при расчетах градиентов pH. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С.107.

18. А.Б.Тессман, А.В.Иванов, П.Н.Нестеренко, А.В.Гармаш. Образование «аномальных» участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С. 108.

19. А.Б.Тессман, А.В.Иванов. Исторические и методологические аспекты автоматизации расчета кислотно-основных равновесий. / Тез. докл. 2-ой Всеросс. конф. по истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) М.: ИОНХ РАН, 1999. С.99.

20. А.В.Иванов, П.Н.Нестеренко, А.Б.Тессман. Применение ионообменных свойств кремнезема с привитыми группами пролина и оксипролина в хроматографии. / Тез. докл. VII Всеросс. конф. "Органические реагенты в аналитической химии". Саратов: СарГУ. 1999. С.222.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, включает 70 рисунков и 14 таблиц. Список литературы содержит 110 работ зарубежных и отечественных авторов.

Выводы

1. Разработана физико-химическая и математическая модель формирования внутреннего градиента рН, учитывающая гомогенные и гетерогенные химические равновесия, протекающие в хроматографической системе. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные . участки на профиле градиента рН.

2. Установлены зависимости, связывающие протолитические свойства сорбентов на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами с их химической природой и полиэлектролитными свойствами.

3. Получены экспериментальные, значения отдельных параметров модели (константы, протонирования аминогрупп для.сорбентов En-Si02, Dien-Si02 и Tetren-Si02' коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот К(С1,А) и коэффициенты обмена протона, на натрий К(Н, Na) на сорбированных дикарбоновых кислотах).

4. Изучено влияние природы и состава стартового раствора и элюента, составленного из простых, протолитов, на форму градиента рН. Впервые показано влияние ионной силы подвижных фаз на форму внутреннего градиента рН. .

5. На основание модели впервые объяснено, образование так называемых "аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора),

6. Предложены способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием простых элюентов на основе нескольких дешевых компонентов.

7. Создан пакет программ для операционной системы Windows 9x/NT, позволяющий до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых веществ форму градиента рН) для экономии времени и стоимости химического анализа.

1. Sluyterman L.A.AE., Elgersma О. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ion exchange columns. I. General principles. // J.Chromatogr. 1978. V.150. N231. P. 17-30.

2. Slais K. Microcolumn liquid chromotography with sample-induced internal pH-gradient. //J.Microcol.Sep. 1991. V.3. P.191-197.

3. Slais K. Simultaneous conductivity and potentiometric detector for miniaturized liquid chromatography and flow analysis. //J.Chromatogr. 1991. V.540. P.41-51.

4. Righetti P.G. Isoelectric focusing: theory, methodology and applications. Amsterdam-New York-Oxford. Elsevier Biomed. Press. 1983. 386 p.

5. Hutchens T.W., Wiehle R.D., Shahabi N.A., Wittliff J.L. Rapid analysis of estrogen receptor heterogeneity by chromatofocusing with high-perfomance liquid chromatography. //J.Chromatogr. 1983. V.266. P.115-128.

6. Hutchens T.W., Gibbons W.E., Besch P.K. High-performance chromatophocusing and size-exclusion chromatography: separation of human uterine estrogenbinding proteins. //J.Chromatogr. 1984. V.297. P.283-299.

7. Janecek M., Salamoun J., Slais K. Sample-induced internal pH-gradient in microcolumn liquid chromotography of proteins. // Chromatographia. 1991. V.32. P.61-64

8. Narahari C.R, Strong J.C., Frey D.D. Displacement chromatography of proteins using a self-sharpening pH front formed by adsorbed buffering species as the displacer. //J.Chromatogr. 1998. V.825. P.115-126.

9. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ion exchange columns. II. Experimental verification. // J.Chromatogr. 1978. V.150. P. 31-44.

10. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. The applicability of chromatofoocusing to the concentration and separation of transition metals with tetraethylenepentamine bonded silica. // Mendeleev Comm. 1994. V.N 5. P.174-176.

11. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. Detection of transition metals during their separation in an isoconductive pH-gradient. //J.Chromatogr. 1994. V.671. P.95-99.

12. Нестеренко П.Н., Иванов А.В. Хроматофокусирование переходных металлов. / "Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии". Тез. докл. 6 Всес. конф. Воронеж, 1991. С.339-340.

13. Нестеренко П.Н., Иванов А.В. Комплексообразующие свойства полибуфер-ионообменнмка ПБИ-94 и их использование для разделения переходных металлов. // Вестн.Моск.ун-та. Сер.2: Химия. 1992. Т.ЗЗ. N6. С.574-578.

14. Sluyterman L.A.AE., Kooistra С. Ten years of chromatofocusing: a discussion. // J.Chromatogr. 1989. V.470. P.317-326.

15. Pharmacia LKB Biotechnology Catalogue 90-91. Pharmacia LKB. 1990. P. 123-124.

16. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение, 1987. 816 с.

17. Лисичкин Г.В., Староверов С.М. Высокоэффективные химически модифицированные кремнеземные сорбенты для жидкостной хроматографии. //ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1983. Т.28. N 1. С.47-53.

18. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Нестеренко П.Н. Химически модифицированные кремнеземы и их применение в химическом анализе. // Журн.аналит.химии. 1983. Т.38. N 9. С.1684-1705.

19. Chromatophocusing a fifth dimension? // Separ.News (Pharmacia bull.) 1984. V.12 N 1. P. 1-8.

20. Jandera P., Churacek J. Gradient elution in column liquid chromatography: theory and practice. Oxford-New York-Tokyo. Elsevier, 1985. 510 p.

21. Leibl H., Erber W., Eibl M.M., Mannhalter J.W. Separation of polysacharide-specific human immunpglobulin G subclasses using a Protein A Superose column with a pH-gradient elution system. //J.Chromatogr. 1993. V.639. P.51-56.

22. Slais K., Friedl Z. Control of column influence on the wide range pH-gradient in ionexchange chromatography. // Chromatographia. 1992. V.33 N 5-6. P.231-236.

23. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing. III. The properties of DEAE-agrose anion excanger and its suitability for protein separation. // J.Chromatogr. 1981. V.206. P.429-440.

24. Sluyterman L.A.AE., Wijdenes J. Chromatofocusing. IV. The properties of an agrose polyethyleneimine ion excanger and its suitability for protein separation. // J.Chromatogr. 1981. V.206. P.441-447.

25. Нестеренко П.Н., Иванов A.B., Галева H.A., Сеневиратне Дж.Б.Ч. Ионообменные и комплексообразующие свойства кремнеземов с привитыми олигоэтиленаминами. //Журн.аналит.химии. 1997. Т.52. N8. С.814-820.

26. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. 536 с.

27. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 544 с.

28. Vanecek G., Regnier F.E. Variable in the high-performance anion-excange chromatography of proteins. //Anal.Biochem. 1980. V.109 N 2. P.345-353.

29. Wagner G., Regnier F.E. Rapid chromatofocusing of proteins. // Anal.Biochem. 1982. V. 126 N 1. P.37-43.

30. Hutchens T.W., Li C.M., Besch P.K. Development of focusing buffer system for generation of wide range pH-gradients during high-performance chromatophocusing. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.157-179.

31. Hutchens T.W., Li C.M., Besch P.K. Perfomance evaluation of a focusing buffer developed for chromatophocusing on high-performance aion-exchange column. // J.Chromatogr. 1986. V.359. P.169-179.

32. Hutchens T.W. Requirements of the mobile and stationary phases during development chromatographic focusing techniques. // Protides Biol.Fluids. 1986. V.34. P.749-752.

33. Slais K. Electrophoretic focusinng in a natural steady state moving pH-gradient. // J.Microcol.Sep. 1993. V.5. P.469-479.

34. Шпигун O.A., Золотов Ю.А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М.: Изд-во МГУ, 1990. 199 с.

35. Салдадзе К.М., Копылова-Валова В.Д. Комплексообразующие иониты (комплекситы). М.: Химия, 1980. 336 с.

36. Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Формирование и применение градиентов рН в жидкостной хроматографии. //Журн.аналит.химии 1999. Т.54. N6. С.566-584.

37. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Сердан А.А., Староверов С.М., Юффа А.Я. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М.: Химия, 1986. 248 с.

38. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Кислотно-основные свойства кремнезема, химически модифицированного у-аминопропилтриэтоксисиланом. // Журн.физич.химии. 1981. Т.55 N 5. С. 1352-1354.

39. Bates R.C., Frey D.D. Quasi-linear pH gradients for chromatofocusing using simple buffer mixtures: local equibrium theory and experimental verification. // J.Chromatogr. 1998. V.814. P.43-54.

40. Шемякин Ф.М., Степин В.В. Ионообменный хроматографический анализ металлов. М.: Металлургия, 1970. 392 с.

41. Самуэльсон О. Ионообменное разделение в аналитической химии. М.-Л.: Химия, 1966. 416 с.

42. Ионный обмен. П/ред. Я.Маринского. М.: Мир, 1968. 568 с.

43. Долгоносое A.M., Сенявин М.М., Волощик И.И. Ионный обмен и ионная хроматография. М.: Наука, 1993. 220 с.

44. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных катионитов. М.: Наука, 1969. 110 с.

45. Либинсон Г.С. Сорбция органических соединений ионитами. М.: Медицина, 1979. 182 с.

46. Мильченко Д.В. Физико-химические закономерности связывания ионов с лигандами, закрепленными на кремнеземе. Дисс. . канд хим.наук. М.: МГУ, 1987. 205с.

47. Righetti P.G. Immobilized pH-gradient: theory and methodology; laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Amsterdam. Elsevier, 1990. 397p.

48. Righetti P.G., Gianazza E., Bjellqvist B. Modern aspects of isoelectric focusing: two-dimensional maps and immobilized gradients. // J.Biochem.Biophys.Methods.1983. V.8N2. P.89-108.

49. Righetti P.G. Isoelectric focusing in immobilized pH-gradients. // J.Chromatogr.1984. V.300. P. 165-223.

50. Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies of multicomponent chromatography using pH-gradient. // AlChE Journal. 1995. V.41 N 5. P. 1171-1183.

51. Strong J.C., Frey D.D. Experimental and numerical studies of the chromatofocusing of dilute proteins using retained pH gradients formed on a strong-base anion-exchange column. //J.Chromatogr. 1996. V.769. P.129-143.

52. Janecek M., Slais K. Design of mobile phase composition for liquid chromotography with an internal pH-gradient. // Chromatographia. 1993. V.36. (special issue). P.246-250.

53. Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. I. General principles. // J.Chromatogr. 1985. V.347. P.325-334.

54. Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. II. Experimental verification. //J.Chromatogr. 1986. V.362. P.101-112.

55. Sluyterman L.A.AE., Kooistra C. Change of counter ion concentration and of resolving power in chromatofocusing run. // J.Chromatogr. 1990. V.519. P.217-220.

56. All you ever wanted to know about chromatofocusing. // Separ.News (Pharmacia bull.) 1984. V.11 N2. P. 1-5.

57. Anderson D.J., Liu Y. Protein separation using a combined internal and extrenal pH gradient on a high-performance DEAE-polymetacrylate column. // Clinical Chemistry 1996. V.42. N6. P. 194.

58. Chun S.W., Bae J.Y., Kim J.D. Protein separation and focusing in a transient pH-gtadient column. // Separ.Science and Technology. 1995. V.30 N 10. P.2101-2125.

59. Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusing high-performance liquid chromatography II. Theoretical aspects. //J.Chromatogr. 1997. V.762. N762. P.47-54.

60. Lu Т., Gray H.B. Combied pH-gradient and anion-exchange high-performance liquid chromatographic separation of oligodeoxyribonucleotides. // J.Chromatogr. 1994. V.686. P.339-343.

61. Кокотов Ю.А., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена: Сложные ионообменные системы. Л.: Химия, 1986. 280 с.

62. Солдатов B.C. Простые ионообменные равновесия. Минск: Наука и техника, 1972. 224 с.

63. Гельферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена. М.: Иностр. литература, 1962. 490 с.

64. Банди Б. Методы оптимизации. Вводный курс. М. Радио и связь, 1988. 128 с.

65. Химмельблау Д. Прикладное нелинейное программирование. М.: Мир, 1975. 534 с.

66. Иванов А.В., Тессман А.Б. Непрерывный контроль рН эффлюента в хроматографии с градиентом рН. // Вестн.Моск.Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241-244.

67. Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Формирование индуцированных внутренних градиентов рН и разделение переходных металлов при использовании многокомпонентных подвижных фаз. // Известия вузов. Химия и химтехнология. 1999. Т.42. N2. С. 122-128.

68. Nesterenko P.N. Silica-bonded L-hydroxyproline and its application to the separation of inorganic anions. // J.High Resol.Chromatogr. 1991. V.14. N11. P.767-768.

69. Nesterenko P.N. Application of amino acid-bonded silicas as ion exchangers for the separation of anions by single-column ion chromatography. // J.Chromatogr. 1992. V.605. P. 199-204.

70. Nesterenko P.N., Elefterov A.I., Tarasenko D.A., Shpigun O.A. Selectivity of chemically bonded zwitterion-exchange stationary phases in ion chromatography. // J.Chromatogr. 1995. V.706. P.59-68.

71. Нестеренко П.Н., Копылов Р.В., Тарасенко Д.А., Шпигун О.А., Золотое Ю.А. Одновременное разделение анионов и катионов в одноколоночном варианте ионной хроматографии. //Докл. РАН. 1992. Т.326. N5. С.838-841.

72. Alpert A.J., Regnier F.E. Preparation of a porous micro particulate anion exchanger chromatography support for proteins. //J.Chromatogr. 1979. V.185. P.375-392.

73. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Сопоставление свойств привитых к поверхности кремнезема лигандов и их комплексов с гомогенными аналогами. //Адсорбция и адсорбенты. 1984. N12. Р.33-39.

74. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В. Методы гетерогенизации функциональных органических соединений на минеральных носителях. //Докл. АН СССР. 1979. Т.247. N1. С.117-121.

75. Тессман А.Б. Расчет кислотно-основных равновесий с применением компьютерного программирования. / "Ломоносов-98". Тез. докл. Межд. конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам. Москва, 1998. С.6.

76. Евсеев A.M., Николаева Л.С. Математическое моделирование химических равновесий. М.: Изд-во МГУ, 1988. 192с.

77. Hearn M.T.W., Lyttle D.J. Buffer-focusing chromatography using multi-component electrolyte elution systems. //J.Chromatogr. 1981. V.218. P.483-495.

78. Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusung high-performance liquid chromatography I. Practical aspects. // J.Chromatogr. 1997. V.762. N762. P.207-217.

79. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Иванов B.M. Кислотно-основные свойства кремнезема с химически привитым к его поверхности этилендиамином. // ЖВХО им.Д.И.Менделеева. 1981. Т.26. N 3. С.345-347.

80. Tanford С. Physical chemistry of macromolecules. New York: Wiley, 1961. 457 p.

81. Tipping E„ Reddy M.M., Harley M.A. Environ.Sci.Technol. 1990. V.24. P.1700.

82. Тессман А.Б., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1999. Т.73. N 8. С.1476-1479.

83. Мудров А.Е. Численные методы для ПЭВМ на языках Бейсик, Фортран и Паскаль. Томск: Раско, 1991. 270 с.

84. Haddad P.R., Heckenberg A.L. Determination of inorganic anions by high-perfomance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1984. V.300. P.357-394.

85. Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ. (russian translation). .Stockholm-Uppsala: LKB, 1981.44 c.

86. Пол И. Объектно-ориентированное программирование с использованием С++. Киев: Диасофт, 1995. 480 с.

87. Страуструп Б. Язык программирования С++. Киев: Диасофт, 1993. Часть 1. 264 с. Часть 2. 296 с.

88. Пирогов А.В. Компьютерная оптимизация в ионной хроматографии. Дис. . кан. хим. наук. М.: МГУ, 1994.178 с.

89. Mulholland М., Hibbert D.B., Haddad P.R., Compton P. Teaching a computer ion chromatography from a database of published methods. // J.Chromatogr. 1996. V.739. P. 15-24.

90. Mulholland M., McKinnon K., Haddad P.R. Practical evalution of ion chromatography methods developed by an expert system. // J.Chromatogr. 1996. V.739. P.25-33.

91. Учи Г. Персональные компьютеры для научных работников. М.: Мир, 1990. 268 с.

92. Золотое Ю.А. Аналитическая химия: фрагменты картины. М.: РАН, 1999. С.115-116.

93. Дайсон Э. Жизнь в эпоху Интернета: Release 2.0. М.: Бизнес и компьютер, 1998. 400 с.

94. Ланг Ч. Публикации баз данных в Интернете (+www-pecypcbi). СПб: Символ-Плюс, 1998. 480 с.

95. Вейскас Д. Эффективная работа с Microsoft Access 7.0 для Windows 95. СПб: Питер-Ком, 1998. 864 с.

96. Гончаров A. Access 97 в примерах. СПб: Питер, 1997. 320 с.

97. Райтенгер М., Муч Г. Visual Basic 6: полное руководство. Киев: BHV, 1999. 720 с.

98. Гармаш А.В., Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н. Физико-химическая и математическая модели формирования внутреннего линейного градиента рН в хроматографической колонке. // Журн.физич.химии. 1997. Т.71. N9. С. 1683-1689.

99. Клупт Ф.Б., Агте А.Н. Вычисление результатов титрования (алкали-ацидиметрическая таблица). Л.:Союзоргучет, 1934.

100. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. 448 с.

101. Апексеевский Е.В., Гольц Р.К., Мусакин А.П. Количественный анализ. Л.: Госхимиздат, 1955. 630 с.

102. Analytical Chemistry. Editor: R.Kellneret al. Weincheim: Wiley-VCH, 1998. 916 p.

103. Malinowski E.R. Methods for calculating the pH of aqueous solutions of solts of monoprotic acids and bases. // J.Chem.Educ. 1990. V.67. N6. P.502-504.

104. Ramette R.W. Buffers Plus. //J.Chem.Educ.Software 1989. V.2B. N2. P.220.