Химическая модификация макромолекул для создания полимерных систем направленного транспорта биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ВАЛУЕВ ИВАН ЛЬВОВИЧ

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

Москва - 2007

003068689

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева Российской академии наук.

Научный консультант - академик Платэ Николай Альфредович

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, доктор химических наук,

профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич;

доктор химических наук, профессор Маковецкий Кирилл Львович;

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

им. А.Н. Несмеянова РАН

Защита состоится «_£_» АПрбОЯ 2007,г. в -ff) часов на заседании диссертационного совета Д 002.234.01 при Институте нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинский пр., 29, конференц-зал.

Факс (7-495) 230-22-24; E-mail: sorokina@ips.ac.iu

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН.

Автореферат разослан « \ » 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Шкггй^П Сорокина Е.Ю.

7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современный уровень развития науки и техники ставит ряд задач по созданию нового поколения полимерных веществ и материалов. В настоящее время- не достаточно придать полимерам те или иные химические или физико-механические свойства, такие как механическая прочность, эластичность, устойчивость к действию агрессивных сред и т. д., а во многих случаях требуется создать полимеры, направленно изменяющие свои свойства в процессе эксплуатации. К таким полимерам, получившим название «умные», относятся материалы и системы, способные изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды, например, температуры, рН, освещенности, появление в окружающей среде какого-либо химически или биологически активного соединения в определенной концентрации и т.д.

Одной из наиболее перспективных областей применения таких материалов является химия медико-биологических полимеров. Это, прежде всего, открывает большие возможности в плане создания материалов, способных моделировать отдельные функции некоторых органов и тканей живого организма, то есть активно функционировать в такой сложной, многокомпонентной среде, как живой организм. Активное функционирование подразумевает способность воспринимать информацию, поступающую извне, и изменять свои свойства в соответствии с ней. Очевидно, что эта способность, характерная, в основном, для «живой» материи, может быть придана синтетическим полимерам путем связывания их с соответствующими биологически активными соединениями (БАС). Использование такого подхода позволяет уже на современном уровне развития науки создавать полимерные композиции, моделирующие мышцы, изменяющие свои размеры под действием внешних условий, кожу, способную к самообновлению, модели почек, избирательно выводящие токсичные соединения из организма и др.

Иммобилизация БАС на полимерном носителе позволяет вплотную подойти и к решению еще одной актуальной задачи современной химии медико-биологических полимеров - контролируемому выделению лекарственных препаратов (ЛП) из специально созданных «депо» по мере возникновения в них потребности, а также к повышению избирательности действия лекарственных веществ на ключевую стадию поражения.

Применение макромолекулярных носителей может позволить использовать альтернативные пути введения известных лекарственных препаратов, более физиологичные и комфортные для человека. Последнее особенно важно для белковых и полипептидных препаратов, которые невозможно вводить в организм через пищеварительную систему, где они подвергаются ферментативному гидролизу и расщепляются до составляющих их аминокислот.

. -1 % 1

)

Актуальность работы определяется также задачами возможного применения в клинической практике изделий на основе синтезированных материалов, включая системы для контролируемого выделения лекарств и их направленного транспорта, в том числе, основанные на механизме обратной связи, новые лекарственные формы для защиты лекарств от агрессивной среды живого организма, биологически активные покрытия на раны и ожоги и т.д.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось:

- разработка подходов к созданию биологически активных полимерных систем, целенаправленно изменяющих, свои характеристики при изменении параметров окружающей среды и активно воздействующих на эти параметры по механизму обратной связи;

- разработка методов синтеза полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, и создание на их основе универсальных систем для направленного транспорта БАС;

- разработка приемов и методов получения полимерных матриц, обеспечивающих не только направленный транспорт иммобилизованных в их объеме БАС, но и защищающих эти соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды.

Решение конкретных биомедицинских задач потребовало провести ряд фундаментальных исследований в области химии высокомолекулярных соединений и биохимии, в частности, изучить процессы, происходящие при иммобилизации БАС, и определить основные параметры взаимодействия иммобилизованных БАС с их физиологическими субстратами; выяснить влияние химической природы и молекулярных характеристик полимера-носителя и состава окружающей среды на эти параметры; исследовать конформационное поведение синтетических полимеров и иммобилизованных на них БАС при различных условиях их функционирования; разработать научные основы создания полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, а также носителей, обеспечивающих одновременно защиту содержащихся в них белковых препаратов от ферментативного гидролиза и их направленный транспорт.

В связи с поставленными задачами основное внимание в работе было уделено следующим объектам исследования:

1) синтетическим полимерам, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении, т.е. выполнять «умную» функцию;

2) природным полимерам, биоспецифические свойства которых определяются способностью их макромолекул взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами;

3) полимерным матрицам, в которых БАС не связано с полимером, а самой матрице изначально приданы биоспецифические свойства или эти свойства возникают в процессе эксплуатации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Решение поставленных задач позволило сформулировать и экспериментально проверить на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды.

В работе впервые:

1) изучено поведение полимерных производных белков, обладающих нижней критической температурой смешения (НКТС), вблизи точки фазового перехода и показано, что фазовому расслоению предшествует изменение конформации макромолекул, которое приводит к их ассоциации и образованию нерастворимой фазы;

2) обнаружена зависимость НКТС и биологической активности полимерных производных белков не только от соотношения белок/полимер-носитель, но и от конфигурации этих производных;

3) предложен подход к созданию макромолекулярных терапевтических систем, повышающих устойчивость полипептидов к ферментативному гидролизу и обеспечивающих направленный транспорт полипептидов в кровоток через пищеварительную систему;

4) изучен процесс химической модификации полипептидов соединениями, обеспечивающими их направленный транспорт, и продемонстрирована зависимость активности синтезированных производных от химической природы полипептидов, а также конформации и размеров их макромолекул;

5) предложено использовать биоспецифические взаимодействия для направленного транспорта гидрогелевых частиц и предварительно введенного в них, но химически с ними не связанного полипептида;

6) на основе сополимеров акриламида с М-(2-Б-глюкоз)-акриламидом, сшитых конканавалином А, созданы химические системы, работающие по механизму обратной связи и способные выделять предварительно введенный в них инсулин в ответ на достижение определенной концентрации глюкозы в окружающей среде;

7) обнаружено, что при взаимодействии таких гидрогелей с растворами глюкозы различной концентрации, существует пороговая концентрация глюкозы, при достижении которой наблюдается быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние с эмиссией инсулина, и определены значения пороговой концентрации для сополимеров различного состава.

Разработанные основы создания и применения биоспецифических полимерных материалов, способных целенаправленно изменять свои свойства по механизму обратной связи в процессе эксплуатации, позволяют вплотную подойти к решению некоторых принципиально важных проблем современной химии медико-биологических полимеров. В первую очередь это относится к решению проблемы направленного

транспорта лекарственных веществ путем их иммобилизации на полимерах с НКТС и последующего нагревания мишени до температуры, выше НКТС. Другой решаемой проблемой является проблема контролируемого выделения биологически активного вещества. Нами разработаны подходы к созданию полимерных систем, выделяющих заданное количество биологически активного вещества не только в ответ на изменение температуры или pH окружающей среды, но также реагирующих на изменение концентрации глюкозы, то есть способных моделировать функцию поджелудочной железы - выделять определенное количество инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.

Сформулированные в работе подходы к направленному транспорту полипептидов с одновременным повышением их устойчивости к ферментативному гидролизу путем их ковалентного связывания с ингибиторами ферментов или путем физической иммобилизации в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибитором ферментов, могут быть использованы при создании прлипептидных лекарственных препаратов для перорального применения.

Практическая значимость некоторых частей работы подтверждена патентами РФ, положительными результатами экспериментов на животных и клиническими испытаниями.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном семинаре «Инсулин: получение, производство, применение» (Минск, 1995); Первой и Второй Международных конференциях «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 1996, 1998); European Symposium «Formulation of poorly-available drugs for oral administration» (Paris, 1996); Международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Москва, 1997); Четвертом и Пятом Симпозиумах «Химия протеолитических ферментов», (Москва, 1997, 2002); Третьей Белорусской научно-практический конференции «Эфферентные и физико-химические методы терапии» (Могилев, 1998); The 26th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials (Boston, 1999); 1st Workshop of Young European Scientist (Lodz, 2002), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2005, 2006), 22-ом и 23-ем Симпозиуме по реологии (Валдай, 2004, 2006), конференции "MedBioTech-2006" (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 статей в научных журналах, получено 2 патента Российской Федерации, опубликовано 16 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Личный вклад автора. Автор является инициатором выбора направления данного исследования, лично проводил работы по синтезу полимерных производных биологически активных соединений, изучению их строения и свойств. Разработал новый методический подход к созданию

универсальных транспортных систем ' направленного транспорта биологически активных соединений. Автор принимал непосредственное участие в проведении экспериментов на животных и клинических испытаниях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 211 страницах печатного текста и включает 59 рисунков, 43 таблицы и 13 схем. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (298 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе рассмотрены известные подходы к решению проблемы создания лекарственных препаратов направленного действия, проанализированы их достоинства и недостатки, что позволило определить цели и задачи работы, а также выбрать объекты исследования.

Глава П.

Термо- и рН-чувствительные полимерные носители.

Одной из наиболее важных проблем, связанных с управлением сложными химическими и биохимическими процессами, является избирательное концентрирование из многокомпонентного раствора только одного из растворенных соединений. К таким соединениям относятся, например, катализаторы или один из реагентов, удаление которых может изменять скорость реакции или даже ее направление. Решение этой проблемы особенно важно применительно к избирательному концентрированию лекарственного вещества в определенном органе-мишени живого организма вследствие не только экономических соображений (в условиях обычного применения до 90 % лекарства расходуется зря, не действуя на очаг поражения), но и, главным образом, из-за того, что многие высокоактивные препараты токсичны по отношению к здоровым тканям.

В качестве движущей силы процесса направленного транспорта было предложено использовать термоактивацию, то есть нагревание мишени выше определенной температуры. Для этого лекарство иммобилизуют на полимере с НКТС, ниже которой полимеры растворимы в водных растворах, а при температуре выше НКТС они выпадают в осадок. Следовательно, вводя в кровеносную систему иммобилизованное на таком полимере вещество и нагревая орган-мишень до температуры выше НКТС, следует ожидать концентрирования полимера и связанного с ним активного начала в этом органе. Применительно к лекарствам этот подход представляется достаточно перспективным, поскольку в зонах воспалений или новообразований нередко наблюдается местное

повышение температуры, что должно обеспечивать самопроизвольное концентрирование лекарства в этих зонах. Кроме того, почти всегда существует возможность локального нагревания органа-мишени и принудительного транспорта лекарства в этот орган.

Естественно, что использование термоактивации, как движущей силы транспорта, возможно только при соблюдении двух условий. Во-первых, после иммобилизации БАС полимер-носитель должен сохранять способность к фазовому переходу при температурах выше НКТС, то есть осуществлять транспортную функцию. Во-вторых, полимер-носитель не должен оказывать денатурирующее воздействие на молекулу БАС при температурах выше НКТС. Особенности конформационного поведения макромолекул полимера-носителя, в значительной степени определяющего активность иммобилизованных БАС и поведения всей системы в целом, изучали на примере сополимеров К,1Ч-диэтилакриламида (ДЭАА).

Одной из определяющих характеристик полимера при его использовании в качестве носителя для термоактивируемого транспорта является НКТС, значение которой для гомополимера ДЭАА составляет 33°С. Эту величину можно достаточно' легко регулировать путем сополимеризации ДЭАА с гидрофильными или гидрофобными сомономерами. Сополимеризация с первыми приводит к повышению НКТС, а сополимеризация со вторыми - ее снижению.

Метод сополимеризации позволяет также получать системы, чувствительные не только к изменению температуры, но и других параметров окружающей среды, например, рН. Рассмотрим поведение синтезированных в настоящей работе сополимеров ДЭАА с акриловой кислотой. Оно может быть описано трехмерной диаграммой: содержание акриловой кислоты — рН - НКТС (рис. 1). Рост температур фазового перехода в нейтральных и щелочных средах, соответствующий увеличению количества звеньев акриловой кислоты, связан с повышением гидрофильности сополимера за счет ионизированных карбоксильных групп акриловой кислоты. При содержании звеньев акриловой кислоты более 40% сополимер вообще теряет свойства, присущие гомополимеру ДЭАА (НКТС отсутствует). В кислых средах при рН ниже рК акриловой кислоты, она выступает уже в качестве гидрофобного сомономера, и повышение ее содержания в сополимере приводит к снижению НКТС.

Рис. 1. Зависимость НКТС водных растворов сополимеров ДЭАА с акриловой кислотой от их состава и рН окружающей среды.

В качестве БАС в работе были использованы овомукоид из белка утиных яиц - гликопротеин с ММ 31000, который является природным ингибитором протеолитических ферментов, а также гирудин - ингибитор тромбина прямого действия белковой природы с ММ около 12000.

Иммобилизацию белков проводили либо сополимеризацией ДЭАА с И-акрилоилгидроксифталимидом и последующим взаимодействием сополимера с белком по следующей схеме:

+

ГШ2

[-сн2~9Н — со

Л

С2Н5 С2Н5

либо путем совместной полимеризации ДЭАА и ненасыщенного производного белка, полученного адилированием свободных аминогрупп

белка хлорангидридом акриловой кислоты. Полимеризацию проводили в водных растворах, используя в качестве инициатора окислительно-восстановительную систему персульфат аммония (ПС) - К,К,1Ч',]Ч'-тетра-метилэтилендиамин (ТМЭД).

Поскольку ненасыщенные производные белков, в данном случае овомукоида (НПОМ), содержат более одной двойной связи, в результате реакции сополимеризации образуются как водорастворимые продукты, включая гомополимер ДЭАА, так и нерастворимые гели. При этом, чем больше НПОМ содержится в исходной мономерной смеси, тем меньше выход водорастворимых сополимеров (табл. 1).

Образование гомополимера ДЭАА, вероятно, обусловлено большим мольным избытком ДЭАА, а также особенностями протекания процесса полимеризации макромономеров, главными из которых являются стерические препятствия для взаимодействия растущих макрорадикалов с двойной связью макромономера. Именно этим и обусловлена невозможность получения высокомолекулярных продуктов при гомополимеризации макромономеров.

Таблица 1.

Зависимость содержания и состава водорастворимых сополимеров НПОМ с ДЭАА от состава исходной мономерной смеси. (Концентрация ДЭАА = 0,5 М, концентрация инициатора - ПС+ТМЭД = 0,05 % масс.).

ДЭАА:НПОМ в исходной смеси, моль/моль Содержание растворимых сополимеров, % масс. (±3%) ДЭААЮМ в растворимом сополимере, моль/моль ММ (±5000) НКТС, °С, (±0,5°) Антитри-птическая активность, % от исх., (±4%)

Гомополимер ДЭАА - - 730000 30,0 -

2500:1 100 2500:1 700000 33,5 55

600:1 87 510:1 190000 40,0 75

400:1 68 280:1 130000 Нет 81

200:1 55 130:1 100000 Нет 84

Изучение особенностей конформационного поведения полимерных производных белков проводили методом светорассеяния. Данные упругого светорассеяния растворов сополимеров при температуре ниже НКТС свидетельствуют о том, что в изученном интервале мольных соотношений НПОМ:ДЭАА с увеличением содержания НПОМ среднемассовая ММ сополимеров, рассчитанная путем экстраполяции кривых в координатах Зимма к нулевому углу рассеяния, уменьшается от 700000 до 100000 (рис. 2а). Этот эффект, вероятно, обусловлен стерическими затруднениями,

возникающими при присоединении НПОМ к растущему макрорадикалу и осложняющими формирование макромолекул большей молекулярной массы.

Результаты изучения состава сополимеров свидетельствуют о том, что все сополимеры, независимо от состава исходной мономерной смеси, содержат в цепи в среднем две молекулы овомукоида, соединенные фрагментами полиДЭАА с различной степенью полимеризации:

- СН2- СН - (СН2- СН-)П-СН2- СН -, где п = 250-5000, СО ¿О ¿О /Щ

N11 Н(С2Н5)2 N11 - овомукоид

Как указывает характер кривых светорассеяния, построенных в координатах Кратки и Порода (рис. За), ниже НКТС все сополимеры обладают конформацией статистического клубка.

Повышение температуры растворов сополимеров приводит к увеличению их измеряемых ММ, то есть к ассоциации макромолекул (рис. 26). При этом, чем выше степень полимеризации фрагмента полиДЭАА в сополимере, тем в большей степени наблюдается увеличение ММ. Пространственная организация сополимеров при температуре выше НКТС также зависит от их состава. При содержании ОМ в сополимере выше 0.2 % мол. (ДЭАА:НПОМ<500:1) сополимеры, по-прежнему, остаются в растворе и сохраняют структуру клубка (рис. 36). В то же время при более низком содержании белка сополимеры образуют осадок при температуре выше НКТС и, судя по экстремальному характеру кривых светорассеяния, они обладают разветвленной структурой с достаточно плотной упаковкой сегментов.

В табл. 1 также показана зависимость НКТС от состава синтезированных полимеров. Видно, что увеличение количества овомукоида в сополимере приводит к росту значений НКТС, а при достижении содержания овомукоида 0.2 % мол. и выше все синтезированные сополимеры не имеют НКТС и полностью растворимы в широком интервале температур.

0,2 0,4 0,6

8Ш2(©/2)

Я1П2(0/2)

Рис. 2. Кривые светорассеяния растворов сополимеров НПОМ и ДЭАА в координатах Зимма при температурах ниже (а) и вблизи (б) НКТС. Состав сополимеров (ДЭАА:ОМ): 2500:1 <*); 510:1 (о); 280:1 (•) и 130:1 (о).

Ь2. К(0)/[К*с«М\у] • 106 б)

Ь2.Ю10,нм-2

Рис. 3. Кривые светорассеяния растворов сополимеров ИНОМ и ДЭАА в координатах Кратки и Порода при температурах ниже (а) и вблизи (б) НКТС. Состав сополимеров (ДЭАА:ОМ) - 2500:1 <Ш); 510:1 (п); 280:1 (•) и 130:1 (о).

Очевидно, что при температурах выше НКТС фрагменты полиДЭАА гидрофобны и стремятся сформировать новую фазу, в то время как овомукоид сохраняет высокое сродство к воде при температурах как ниже, так и выше НКТС. В этом случае хорошо просматривается наличие двух противодействующих сил, одна из которых способствует слипанию макромолекул сополимера с конформационно измененными фрагментами полиДЭАА, а другая - предотвращает процесс ассоциации за счет солюбилизирующего эффекта. Для изученной системы визуально наблюдаемое расслаивание раствора сополимера происходит в случае образования ассоциатов из более, чем семи макромолекул (М„ на рис. 2 а и б).

Аналогичные зависимости конформационного поведения макромолекул сополимера при изменении температуры обнаружены и для гирудина, иммобилизованного на сополимерах ДЭАА с И-акрилоил-гидроксифталимидом.

Антитриптическую активность входящего в состав сополимера овомукоида оценивали путем измерения остаточной активности трипсина после его взаимодействия с сополимерами. Видно, что с увеличением содержания звеньев ДЭАА в сополимере удельная активность овомукоида уменьшается (табл. 1). Вместе с тем, даже при высоком содержании ДЭАА активность овомукоида сохраняется на уровне 50% от исходной активности НПОМ. Поскольку в процессе иммобилизации никаких химических превращений с молекулой овомукоида не происходит, то единственной причиной уменьшения активности является экранирование активных центров белка фрагментами полиДЭАА, которое затрудняет взаимодействие белка с достаточно высокомолекулярным соединением (ММ трипсина составляет 24500). При этом, очевидно, что чем выше будет содержание фрагментов полиДЭАА в сополимере, тем большее влияние на антитриптическую активность они будут оказывать.

Вместе с тем, оставалось неясным, в какой степени значение НКТС и активность конечного производного определяются только массовым соотношением полимер-носитель:белок или значения этих параметров зависят также от строения этого производного, т.е. от длины и количества цепей полимера-носителя, присоединенного к молекуле белка.

Для выяснения этого вопроса были синтезированы привитые на макромолекулу овомукоида сополимеры с различной длиной блоков полиДЭАА и различным их количеством. Сначала полимеризацией ДЭАА в присутствии передатчика цепи (меркаптоуксусной кислоты) были синтезированы гомополимеры ДЭАА со степенью полимеризации 13-470, содержащие концевую карбоксильную группу.

Значения НКТС для этих полимеров приведены в табл. 2. Видно, что с увеличением степени полимеризации от 13-15 до 120 вклад концевой карбоксильной группы в растворимость полимера уменьшается, что и сопровождается снижением НКТС. Для более высокомолекулярных

полимеров химическая природа концевой группы уже не влияет на растворимость и НКТС таких полимеров остается постоянной.

Взаимодействием синтезированных полимеров с овомукоидом в присутствии 1-этил-3-(3-диметил-аминопропил) карбодиимида были получены производные белка, содержащие от 1 до 16 полимерных цепей различной длины. Реакция протекала по следующей схеме:

т(ДЭАА)п-СООН + ОМ-(Ш2)16^ [(ДЭАА)П-СО-Ш-]т-ОМ-(Ш2)16.ш, где ОМ - овомукоид, т = 1-16.

Свойства полученных сополимеров приведены в табл. 2. Обращают на себя внимание три обстоятельства. Первые два достаточно прогнозируемы. Иммобилизация объемистой макромолекулы белка увеличивает гидрофильность исходных карбоксилсодержащих полимеров, повышая тем самым их НКТС, и чем больше цепей полимера одинаковой длины связано с макромолекулой овомукоида, тем меньше влияние этой макромолекулы на растворимость полимера и тем ниже значение НКТС. Третье обстоятельство заключается в том, что массовое соотношение полимер-носитель:белок не всегда является определяющим в проявлении НКТС. Так, если связывание макромолекулы овомукоида с 16 цепями полиДЭАА, имеющими степень полимеризации 13-20, не приводит к появлению НКТС у полученного производного, то связывание овомукоида всего с одной молекулой полиДЭАА, имеющей степень полимеризации выше 120, уже обеспечивает получение производного, имеющего НКТС, хотя при этом массовое соотношение между полимером-носителем и овомукоидом у обоих производных одинаково.

Таблица 2.

Свойства сополимеров овомукоида и ДЭАА

(ДЭАА)п-СООН Г(ДЭАА)п-СО-Ш-1т-ОМ-(НН2)16.т

п НКТС, "С т(п) НКТС,иС А *, % от исх. (±5%)

13-15 38-40 16 (13-15) Нет ~0

18-20 37-38 16 (18-20) Нет ~0

80 31-32 6(80) 33-34 30

3(80) 41-42 70

120 29-30 4 (120) 33-34 50

2(120) 34-35 80

1 (120) 36-37 90

470 29-30 1 (470) 35-36 85

А* - антитриптическая активность овомукоида

Таким образом, для получения производных белков, пригодных для термоактивируемого направленного транспорта, молекулу белка необходимо связывать с минимальным количеством цепей высокомолекулярного полимера-носителя. Диблок-сополимер является более предпочтительным по сравнению с сополимером звездообразного строения, в центре которого находится макромолекула белка, а лучами являются молекулы полимера-носителя. Что касается пространственного строения диблок-сополимера, то, скорее всего, это гантель с пространственно разделенными, хотя и химически связанными блоками белка и синтетического полимера. Последнее следует из результатов исследования водных растворов белка, полимера-носителя и их смеси методом ультрацентрифугирования. Седиментация белка и полимера из смешанного раствора происходит так же, как и из растворов индивидуальных веществ, то есть взаимодействие макромолекул полимера с глобулами белка в водном растворе не происходит. Такое строение в сочетании с минимальным изменением химической природы макромолекулы белка и обеспечивает сохранение белком достаточно высокой биологической активности.

Глава III.

Водорастворимые производные инсулина и овомукоида.

В рассмотренных выше макромолекулярных системах синтетические полимеры не обладали собственной физиологической активностью, а служили исключительно в качестве носителей для направленного транспорта БАС. К другим типам носителей относятся природные полимеры, имеющие собственную физиологическую активность. Примером такого носителя является овомукоид из белка утиных яиц. В качестве иммобилизуемого БАС был выбран инсулин -гормон поджелудочной железы с ММ около 6000, влияющий на большое число процессов, протекающих в организме, главным образом, на транспорт глюкозы через клеточную мембрану. Его частичное или полное отсутствие в организме приводит к сахарному диабету. Дефицит инсулина больные вынуждены компенсировать ежедневными инъекциями этого гормона.

Пероральное (через пищеварительный тракт) введение инсулина, как и других белков, неэффективно, в связи с тем, что он полностью гидролизуется под действием протеолитических ферментов пищеварительной системы. В связи с этим, главными задачами при создании белковых препаратов для перорального введения являются защита белка от ферментативного гидролиза и его направленный транспорт на слизистую оболочку тонкого кишечника, где и происходит всасывание препарата. Именно эти проблемы и позволяет решить использование овомукоида в качестве носителя. Белковый участок его молекулы ингибирует действие сериновых протеиназ с константами порядка 108 М1.

В тоже время углеводная часть овомукоида способна связываться с лектинами - белками, содержащимися, в том числе, и в слизистой оболочке тонкого кишечника, что должно обеспечивать избирательное концентрирование препарата в этом месте.

Модификацию молекулы инсулина овомукоидом осуществляли с использованием двух наиболее распространенных в практике получения иммобилизованных белков реактивов - глутарового альдегида и 1-этил-З-(3-диметил-аминопропил) карбодиимида (ЭДК).

Глутаровый альдегид существует в растворе в виде олигомеров, число мономерных звеньев в которых колеблется от 10 до 100, и его реакция с белками протекает по следующей схеме:

В отличие от глутарового альдегида, карбодиимид сам не реагирует с белками, а выступает в качестве катализатора реакции конденсации между карбоксильными и аминогруппами белковых молекул:

Различия в характере процессов, протекающих в присутствии глутарового альдегида и карбодиимида, обусловливают и различное строение получаемых продуктов.

На рис. 3 приведены гель-хроматограммы смеси инсулина и овомукоида (а), а также продуктов их сшивания глутаровым альдегидом (б) и карбодиимидом (в).

СОН СОН

ОН"

I I

>

Видно, что продукты сшивания белков характеризуются широким молекулярно-массовым распределением. В случае сшивания глутаровым альдегидом отчетливо видны пики, соответствующие глобулярным белкам с ММ более 100000. Это указывает на то, что в результате обработки смеси инсулина и овомукоида глутаровым альдегидом, как и следовало ожидать, происходит сшивание макромолекул белков с образованием продуктов, характеризующихся большими значениями ММ и, как следствие, большими гидродинамическими размерами.

. А22о а)

б)

Ул, мл

А А220

В)

15 30

Ук, мл

Рис. 3. Гелъ-хроматограммы смеси овомукоида и инсулина (а), продуктов их совместного сшивания глутаровым альдегидом (б) и продуктов конденсации в присутствии ЭДК (в). Колонка ТБК С20005\У, подвижная фаза - фосфатный буфер (рН 7.4).

Уй, МЛ

Уж, мл

Ук, мл

Рис. 4. Гель-хроматограммы нашивного СА (а) и продуктов его сшивания ЭДК в растворе с концентрацией белка 10 мкмолъ/л (б) и 100 мкмолъ/л (в). Концентрация ЭДК 5,4 мМ.

Иная картина наблюдается для производных белков, полученных в присутствии ЭДК. Видно, что гидродинамические размеры продуктов конденсации инсулина с овомукоидом не только не увеличиваются, но даже уменьшаются по сравнению с исходными размерами молекулы овомукоида. Поскольку условия реакции конденсации исключают деструкцию макромолекул белков, то единственной причиной

наблюдаемого явления может быть уменьшение гидродинамических размеров производных белков.

Это может быть обусловлено тем, что компактная молекула ЭДК, в отличие от относительно высокомолекулярных олигомеров глутарового альдегида, в первую очередь, инициирует взаимодействие между близко расположенными функциональными группами одной макромолекулы. Это приводит к образованию большого количества внутримолекулярных сшивок, в результате которых размер белковых глобул уменьшается.

Данное предположение получило свое подтверждение при изучении сшивания молекул модельного глобулярного белка - сывороточного альбумина (СА) в присутствии ЭДК. На рис. 4 приведены хроматограммы нативного СА (а) и продуктов его сшивания ЭДК при концентрации раствора белка 10 (б) и 100 мкМ (в).

Видно, что гидродинамические размеры образующихся макромолекул сильно уменьшаются по сравнению с нативным СА, имеющим ММ 69000, объем элюции которого для используемой колонки составляет 15 мл. Этот же параметр для продуктов взаимодействия С А и ЭДК (Сса=Ю мкМ) равен 37 и 44 мл, что.отвечает объему элюции глобулярных белков с ММ 16000 и 7000, соответственно. Это означает, что радиус эквивалентной сферы продуктов сшивания (а), рассчитанный по формуле:

а = (ЗМ/4тсКрт)ш, где М - молекулярная масса белка, N - число Авогадро 6.02-1023, рт - плотность материала частицы, принятая для белков 1.38 г/см3,

составляет аг=13 и а2=16 А (для нативного СА радиус ао=27 А).

При Сса=Ю0 мкМ наряду с образованием продуктов с а2= 16 А, которое наблюдалось и при более низкой концентрации СА, образуются частицы с радиусом эквивалентной сферы а3=20 и а4=25 А. Наличие большого мольного избытка ЭДК по сравнению с СА позволяет предположить, что частицы с радиусами эквивалентных сфер а3 и а» представляют собой продукты межмолекулярного сшивания ранее внутримолекулярно сшитых частиц с ах и а2. Подтверждением этого может служить наблюдаемое при этом уменьшение доли частиц с а2=16 А, а также полное исчезновение частиц с а1= 13 А. Аналогичные закономерности были также обнаружены при сшивании других белков при помощи ЭДК (табл. 3). При этом радиусы эквивалентных сфер во всех фракциях образующихся продуктов закономерно возрастают с ростом ММ исходного белка.

Дополнительный вклад в уменьшение гидродинамических размеров макромолекул белков в процессе их сшивания в присутствии ЭДК, вероятно, вносит гидрофобизация макромолекул. В реакции с ЭДК за счет внутримолекулярного сшивания принимает участие существенно большее количество гидрофильных групп (-1Ш2 и -СООН ), чем в реакции с глутаровым альдегидом. Замещение гидрофильных групп приводит к уменьшению гидратной оболочки, которая, как известно, у гидрофильных

белков может своими размерами превосходить размеры самой белковой глобулы.

Таблица 3.

Характеристика продуктов сшивания некоторых глобулярных белков в

присутствии ЭДК.

Белок ММ ао, А • Продукты сшивания

аь А а2, А а3, А а4, А

Овомукоид 31000 21 10 13 16 23

Альбумин 69000 27 13 16 20 25

Альдолаза 158000 36 16 22 27 35

Тироглобулин 669000 58 26 36 48 54

Следовательно, можно утверждать, что при реакции белков с ЭДК происходит как внутри-, так и межмолекулярное сшивание, сопровождающееся изменением размеров и нативной конформации исходных белков. При этом, независимо от исходной концентрации, сначала происходит внутримолекулярное сшивание белковых молекул (без образования каких-либо межмолекулярносшитых продуктов с нативной конформацией белка).

Зависимость состава полимерных производных овомукоида и инсулина от состава исходной белковой смеси представлена в табл. 4. В связи с тем, что молекула овомукоида содержит в семь раз больше участвующих в реакции функциональных групп, по сравнению с молекулой инсулина, оба типа белковых производных обогащены овомукоидом.

Таблица 4.

Зависимость мольного состава производных инсулина и овомукоида, полученных в присутствии ЭДК или ГА, от состава исходной смеси.

Состав исходной смеси Состав производных [овомукоид]:[инсулин]

[овомукоид]: [инсулин] ЭДК, 5.4 мМ ГА, 15 мМ

2:1 2,8:1 2,7:1

1:1 1,7:1 1,8:1

1:2 1:1,1 1,1:1

1:3 1:1,4 1:1,4

1:5 1:2,2 1:2,3

1:10 1:4,3 1:5,2

1:20 1:6,6 1:7,1

При изучении активности овомукоида в составе его белковых конъюгатов с инсулином было установлено, что использование

глутарового альдегида в качестве сшивающего агента не приводит к уменьшению антитриптической активности овомукоида, то есть в результате сшивания не изменяется нативная конформация овомукоида и не затрагиваются функциональные группы его активного центра. К тому же олигомеры глутарового альдегида выступают в качестве спейсеров, исключая стерические препятствия для взаимодействия реактивных центров овомукоида с активными центрами фермента.

В результате же реакции с ЭДК антитриптическая активность овомукоида уменьшается более чем вдвое. Это связано, в первую очередь, с модификацией участвующей в реакции с ЭДК аминогруппы активного центра. Кроме того, определенный вклад в уменьшение активности, вероятно, вносит внутримолекулярное сшивание овомукоида, которое создает стерические препятствия для его взаимодействия с ферментами.

Иная картина наблюдается при изучении биологической активности инсулина в составе его конъюгатов с овомукоидом, определяемой по способности производного инсулина взаимодействовать с соответствующими моноклональными антителами. В результате сшивания с овомукоидом посредством глутарового альдегида активность инсулина резко уменьшается. Вероятно, это обусловлено модификацией аминогрупп инсулина, определяющих активность этого гормона. Действительно, обработка индивидуального раствора инсулина глутаровым альдегидом приводит к практически полному исчезновению свободных аминогрупп в его молекуле, а активность сшитых производных не превышает 8-12 % от активности нативного гормона.

Следовательно, сшитые глутаровым альдегидом конъюгаты инсулина и овомукоида, хотя и обладают высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов (рис. 5), вряд ли могут быть использованы в качестве лекарственного препарата применительно к инсулину из-за резкого уменьшения его активности.

Этот вывод подтверждается и результатами экспериментов на животных. Введение кроликам полученных производных как перорально, так и инъекционно не приводит к снижению концентрации глюкозы в крови.

В результате же реакции овомукоида с инсулином в присутствии ЭДК активность обоих компонентов уменьшается, причем уменьшение активности инсулина происходит в меньшей степени (~15%), чем овомукоида (~40 %). Причиной этого может быть большая конформационная устойчивость менее высокомолекулярной, а поэтому менее гибкой, макромолекулы инсулина. Следует также отметить, что, несмотря на некоторое снижение активности овомукоида, он сохраняет способность защищать молекулу инсулина от гидролиза протеиназами (рис. 5).

-23-

Концентрация инсулина, % от исх.

75 -

50 -

25

0

20

40

Время, мин

60

100

Рис. 5. Зависимость концентрации инсулина от времени его инкубирования с а-химотрипсином. ^ЗСГС, рН=8.0, мольное соотношение инсулин:а-химотрипсин - 200:1. ■ - нативный инсулин, • - сополимер инсулина с овомукоидом, полученный в присутствии ГА, о - сополимер инсулина с овомукоидом, полученный в присутствии ЭДК.

Результаты испытаний этих препаратов на животных показали, что пероральное введение производных инсулина и овомукоида приводит к снижению концентрации глюкозы в крови животных, то есть в крови появляется активный инсулин. Очевидно, это явление обусловлено двумя причинами. Первая причина - это ингибирование овомукоидом действия протеолитических ферментов и предотвращение ферментативного расщепления молекул инсулина. Второй причиной является концентрирование производного на стенках слизистой оболочки кишечника за счет избирательного взаимодействия углеводных участков овомукоида с лектинами слизистой оболочки (измеренное значение константы связывания составляет Ксв=3.8*102 М"1).

Действительно, использование овомукоида, углеводная часть которого удалена гидролизом а-амилазой (ОМГ), приводит к получению производных инсулина, которые обладают повышенной устойчивостью к действию протеолитических ферментов и способны снижать уровень глюкозы в крови животных при инъекционном введении, но при пероральном введении животным не проявляют биологической активности (табл. 5).

♦Испытания на животных проводили в Эндокринологическом научном центре РАМН под руководством д.м.н., проф. Старосельцевой Л.К.

Таблица 5.

Зависимость концентрации глюкозы в крови кроликов от времени при введении 8 ед. инсулина на 1кг массы животного.

Время, Концентрация глюкозы, % от исходной (±4%)*

мин Нативный ОМ-инсулин**. ОМГ-инсулин* *

инсулин, Инъекци- Перораль- Инъекци- Перораль-

инъек. онно но онно но

30 39 52 88 56 100

60 45 59 72 54 -

90 51 66 75 49 95

120 63 70 81 65 98

*-приведены средние значения для трех животных.

**- мольное соотношение ОМ: инсулин = 1,5 :1.

Следует, однако, отметить, что максимальная эффективность действия перорально вводимых производных не превышает 40-50% от эффективности инъекционно введенного нативного гормона. Поскольку активность инсулина в конъюгатах с овомукоидом мало отличается от его активности в нативном состоянии, то можно предположить, что определенный вклад в наблюдаемое снижение эффективности действия инсулина вносит пониженная диффузия этих производных через стенки кишечника. Действительно, инъекционное введение полученных производных животным приводит к более заметному (хотя и меньшему, чем для нативного инсулина) гипогликемическому эффекту (табл. 5).

Таким образом, рассмотренные результаты свидетельствуют о том, что модификация инсулина овомукоидом действительно предотвращает ферментативное разрушение гормона и обеспечивает его проникновение в кровоток через слизистую оболочку тонкого кишечника. Однако происходящие в процессе модификации инсулина изменения химической природы гормона, а также конформации и размеров его макромолекулы приводят к снижению его биологической активности. Очевидно, что наблюдаемые зависимости имеют общий характер, и их следует учитывать при использовании разработанного подхода к модификации других БАС белковой природы. Решением этой проблемы могла быть модификация не самого лекарственного препарата, а полимерной матрицы, которая обеспечит доставку в нужное место предварительно введенного в нее, но химически с ней не связанного, препарата.

Глава IV.

Полимерные частицы — носители белковых препаратов.

Полимерные гидрогелевые контейнеры для доставки белковых лекарственных препаратов на стенки тонкого кишечника синтезировали

сополимеризацией в водном растворе акриламида с ненасыщенным производным овомукоида в присутствии К,№-метилен-бис-акриламида. Затем гидрогели лиофильно высушивали и насьпцали раствором инсулина.

Поскольку в пищеварительной системе гидрогель проходит через области с различным значением рН, а сам инсулин химически не связан с гидрогелем, то необходимым этапом работы было изучение кинетики выделения инсулина из гидрогелевых частиц в окружающий раствор при различных значениях рН. Исследование возможного взаимодействия инсулина с белком-модификатором проводили при рН выше или ниже значения изоэлектрических точек обоих белков (5,5 для инсулина и 3,8 для овомукоида), а также при значении рН между этими точками.

Изучение проводили с использованием метода флуоресцентной спектроскопии. На рис. 6 приведены зависимости интенсивности флуоресценции водных растворов меченного флуоресцеином инсулина (ФИ) и его смеси с родамин-меченным овомукоидом (РО) от концентрации белка. Видно, что при рН 2,5 и 8,0 интенсивность флуоресценции ФИ в его смеси с РО практически не отличается от интенсивности флуоресценции индивидуального ФИ, в то время как при рН 4,3 интенсивность флуоресценции ФИ в его смеси с РО меньше, чем интенсивность флуоресценции ФИ в индивидуальном растворе. Это означает, что в растворе при рН 4,3 молекулы белков образуют ассоциаты, в которых часть энергии передается от донора (флуоресцеин) к акцептору (родамин). Движущей силой этого процесса, вероятно, являются электростатические взаимодействия между противоположно заряженными молекулами белков.

Концентрация инсулина, мг/мл Рис. б. Зависимость интенсивности флуоресценции флуоресцеин-меченного инсулина от его концентрации в индивидуальном водном растворе (о) и в водных растворах его смеси с родамин-меченным овомукоидом при рН=2,5 (•), 4,3 (п) и 8,0 (и). Мольное соотношение белков (ФИ:РО) равно 1:10, длина волны 518 нм.

Обнаруженное взаимодействие между молекулами инсулина и овомукоида является причиной замедления диффузии инсулина из модифицированного овомукоидом гидрогеля при значениях рН в области 3,8-5,5 (табл. 6).

Видно, что при рН<3,8 и рН>5,5 инсулин свободно диффундирует из гидрогеля, и его равномерное распределение между гидрогелем и водой достигается уже через 45 минут. Иная картина наблюдается при рН 4,3. В равновесном состоянии конечная концентрация инсулина в объеме гидрогеля существенно выше его концентрации в окружающем растворе.

Замена воды на 0,1 %-ный раствор ИаС1 устраняет неравномерное распределение инсулина между гидрогелем и раствором, что является дополнительным подтверждением электростатической природы взаимодействия между белками.

Следует также отметить, что количество связанного с гидрогелем инсулина не зависит от соотношения объемов гидрогеля и окружающего его раствора, а является функцией содержания овомукоида в гидрогеле.

Таблица 6.

Кинетика вымывания инсулина из гидрогеля, модифицированного овомукоидом, при различных значениях рН (объем гидрогеля 1 мл, содержание овомукоида в гидрогеле 9,8 мг/мл, исходная концентрация инсулина в геле 1 мг/мл)

Объем Значе- Количество инсулина в гидрогеле, Кол-во

окружа- ние мг (±0,04) связанного

ющего рН через 15 через 30 через 45 инсулина,

раствора, мин мин мин мг (±0,04)

мл

2,5 0,77 0,63 0,51 0

1 4,3 0,81 0,73 0,69 0,16

8,0 0,76 0,62 0,49 0

2,5 0,66 0,46 0,34 0

2 4,3 0,69 0,55 0,47 0,15

8,0 0,66 0,44 0,33 0

2,5 0,59 0,35 0,24 0

3 4,3 0,64 0,48 0,39 0,14

8,0 0,58 0,33 0,25 0

1* 4,3 0,77 0,64 0,5 0

2* 4,3 0,68 0,45 0,32 0

3* 4,3 0,57 0,32 0,22 о

* - окружающий раствор содержит 0,1 % ЫаС1.

На рис. 7 приведены результаты изучения устойчивости различных препаратов инсулина к действию трипсина. Видно, что уже сама по себе физическая иммобилизация инсулина в объеме немодифицированного гидрогеля несколько повышает его устойчивость к действию фермента.

Однако, как и следовало ожидать, в максимальной степени эффект повышения стабильности инсулина к ферментативному гидролизу проявляется в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов. При этом степень повышения стабильности инсулина практически не зависит от наличия углеводной части в молекуле ингибитора, которым был модифицирован полиакриламидный гель.

Время, мин

Рис. 7. Зависимость концентрации инсулина от времени его инкубирования с трипсином. 30° СрН=8.0, мольное соотношение инсулин:трипсин - 200:1. а - нативный инсулин, □ - инсулин, иммобилизованный в немодифицированном гидрогеле, о — инсулин, иммобилизованный в гидрогеле, модифицированном овомукоидом; • -инсулин, иммобилизованный в гидрогеле, модифицированном овомукоидом без углеводного участка.

Влияние природы ингибитора, как и в случае растворимых производных инсулина, проявилось при изучении диффузии инсулина и ряда других белков из гидрогелевых частиц через стенки реактора, моделирующего слизистую оболочку тонкого кишечника.

Изучение диффузии инсулина из гидрогелевых частиц через слизистую оболочку тонкого кишечника проводили с использованием модели кишечника, которая представляла собой сосуд с внутренним диаметром 2,0 см и стенками из вспененного полиуретана толщиной 0,7 см, обеспечивающего механическую прочность всей системы (рис. 8). Открытые поры стенок сосуда были заполнены 3%-ным

полиакриламидным гидрогелем, содержащим лектин - Кон А. Для изготовления реактора стенки сосуда пропитывали смесью мономера, сшивающего агента и инициаторов полимеризации, из которой после полимеризации образовывался вязкий, не обладающий механической прочностью полиакриламидный гель, равномерно распределенный в порах полиуретана.

Полиуретан _

^/Стакан с дистиллированной водой

астицы инсулин-содержащего гидрогеля

Рис. 8. Реактор для изучения диффузии инсулина из частиц полимерного гидрогеля.

На рис. 9 приведены результаты изучения выделения инсулина из частиц немодифицированного и модифицированного ингибитором гидрогеля через стенки реактора.

Время, мин

Рис. 9. Кинетика выделения инсулина через стенки реактора из частиц немодифицированного (п) полиакриламидного гидрогеля, гидрогеля, модифицированного овомукоидом (о), и гидрогеля, модифицированного овомукоидом с удаленной углеводной частью (*).

Видно, что максимальная скорость диффузии инсулина наблюдается для частиц гидрогеля, модифицированного овомукоидом. Это означает, что определяющий вклад в повышение диффузии действительно вносит биоспецифическое связывание углеводной части овомукоида с Кон А (константа взаимодействия Кон А с иммобилизованным овомукоидом равна (2,2±0,7)*103 М"1). Это взаимодействие обеспечивает адгезию полимерной частицы непосредственно на стенках реактора, а, следовательно, повышенную локальную концентрацию белка в этом месте.

Это предположение было также подтверждено опытами на животных, результаты которых представлены в табл. 7.

Таблица 7.

Зависимость концентрации глюкозы в крови кроликов от времени при пероральном введении препаратов инсулина (8 ед. на 1 кг массы животного).

Время, мин Концентрация глюкозы, мг/100 мл (±5 %)*

инсулин+не-модифицированный гель инсулин+гель, модифицированный ОМГ инсулин+гель, модифицированный ОМ

0 160 145 150

30 160 145 115

60 150 150 90

90 160 150 75

120 160 160 80

*-представлены средние значения для трех животных.

Очевидно, что заметная роль биоспецифических взаимодействий и их влияние на адгезию полимерной частицы может проявляться только в случае частиц малого размера и глубокого проникновения этих частиц в мембранный слой, обеспечивающего максимальное число контактов углевода и лектина.

Для выяснения допустимых размеров гидрогелевых частиц, способных к направленному транспорту, они были предварительно высушены, а затем фракционированы по размерам. Были отобраны фракции с диаметром частиц менее 0,05 мм, 0,05-0,2 мм, 0,2-1,0 мм и 1,02,0 мм. После набухания в растворе инсулина объем этих частиц увеличивался в 10-12 раз.

При изучении кинетики выделения инсулина через стенки реактора, (рис. 10) было обнаружено, что для частиц с размерами, превышающими 0,05 мм, скорость выделения инсулина мало зависит от размеров частиц, особенно на начальном участке. Скорость выделения инсулина из частиц с диаметром менее 0,05 мм существенно выше. Это указывает на то, что

именно эти частицы вносят решающий вклад в увеличение скорости диффузии инсулина из частиц полиакриламидного гидрогеля, модифицированного овомукоидом.

Количество выделившегося инсулина, %

Время, мин

Рис. 10. Кинетика выделения инсулина из частиц полиакриламидного гидрогеля, модифицированного овомукоидом, через стенки реактора. Диаметр частиц: о <0,05 мм; □ 0,05-0,2 мм; О 0,2-1,0 мм; О 1,0-2,0 мм.

Действительно, пероральное введение подопытным животным частиц гидрогеля, модифицированного овомукоидом и содержащего инсулин, обеспечивает гипогликемический эффект только в случае использования частиц гидрогеля с диаметром менее 0,05 мм (табл. 8).

Таблица 8.

Зависимость концентрации глюкозы в крови кроликов от времени при пероральном введении инсулинсодержащих частиц полиакриламидного гидрогеля, модифицированного овомукоидом (8 ед. на 1 кг массы животного).

Время, мин Концентрация глюкозы, мг/100 мл (±5 %)

<0,05 мм 0,05-0,2 мм 0,2-1,0 мм 1,0-2,0 мм

0 160 155 165 155

30 110 145 155 155

60 80 130 160 160

90 70 120 170 165

120 80 145 165 160

В настоящее время завершен полный цикл предклинических исследований синтезированного препарата инсулина, получившего название «Рансулин», получено разрешение Фармакологического комитета МЗ России на его клинические испытания и успешно завершена 1-ая фаза клинических испытаний препарата. Достоверное снижение концентрации глюкозы в крови, качественно аналогичное действию инъекционного препарата, наблюдалось у 100 % больных сахарным диабетом 2-го типа (15 человек) и 70 % больных сахарным диабетом 1-го типа (15 человек). Для большинства больных, особенно 2-го типа, наблюдался эффект пролонгирования, а некоторым больным было достаточно для поддержания приемлемого уровня глюкозы в течение суток однократного утреннего приема препарата*.

Следует отметить, что созданная система универсальна и применима к широкому кругу полипептидных препаратов. В опытах на животных было показано, что синтезированный гидрогелевый контейнер обеспечивал доступ в кровоток глюкагона (ММ 3500), гормона роста (ММ 20000) и гирудина (ММ 12000).

* Клинические испытания проводили на кафедре эндокринологии Российской медицинской академии последипломного образования под руководством д.м.н., проф. Аметова A.C. Во всех испытаниях автор принимал непосредственное участие.

В заключение этой главы необходимо отметить следующее. Проведенное исследование, включая клинические испытания, однозначно свидетельствует о том, что модифицированный овомукоидом полиакриламидный гидрогель действительно является уникальным полимерным контейнером, обеспечивающим защиту введенного в него, но химически несвязанного с ним, белка от действия протеолитических ферментов и одновременно транспорт всей системы на стенки тонкого кишечника. Биоспецифические взаимодействия углеводного участка иммобилизованного в объеме гидрогеля овомукоида и лектинов, содержащихся в слизистой оболочке кишечника, приводят к повышению локальной концентрации инсулина непосредственно в слизистой оболочке и, как следствие, к повышению скорости его диффузии в кровоток. Дополнительной причиной достаточно высокой эффективности всей системы может являться то, что овомукоид, наряду с другими функциями, проявляет и функцию соединения, удерживающего инсулин в объеме гидрогеля при определенном значении рН. Вполне вероятно, что образование комплекса между инсулином и иммобилизованным овомукоидом является одной из причин устойчивости препарата при его прохождении через пищеварительную систему.

Что касается эффективности действия препарата, то полученные результаты свидетельствуют о его качественном отличии от всех известных препаратов инсулина для перорального применения: терапевтические дозы перорального вводимого препарата находятся на уровне доз инъекционного инсулина, существует корреляция между количеством вводимого инсулина и уровнем снижения концентрации глюкозы, отсутствует видовая специфичность препарата. Все это позволяет высказать осторожную надежду на возможность его использования в будущем для лечения сахарного диабета по принципиально новой схеме, а также открывает перспективы для синтеза более широкого круга полипептидных лекарственных средств с повышенной устойчивостью к действию протеолитических ферментов.

Нерешенной в плане повышения эффективности лечения сахарного диабета остается проблема сохранения физиологического соотношения между уровнем глюкозы в крови и количеством появляющегося там инсулина. И хотя можно предположить, что при пероральном введении, печень может подключаться к контролю количества инсулина, достигающего определенные органы и ткани, трудно надеяться на сохранение физиологического соотношения между концентрациями глюкозы и инсулина в течение достаточно длительного периода времени. В связи с этим, большой интерес могут представлять системы, способные моделировать всю физиологическую цепочку выделения инсулина, то есть выделять строго необходимое количество гормона в ответ на определенное повышение концентрации глюкозы.

Глава V.

Фазообратимые глюкозочувствительные гидрогели.

Возможность создания полимерных систем, направленно изменяющих свои свойства при изменении параметров окружающей среды, была изучена на примере создания систем, контролируемо выделяющих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы, то есть моделирующих одну из функций поджелудочной железы. При этом необходимо было решить проблему предотвращения выделения инсулина при низких и физиологически приемлемых концентрациях глюкозы -основной недостаток всех известных к настоящему времени подобных систем.

В качестве макромолекулярной глюкозочувствителыюй системы был использован гидрогель на основе сополимеров акриламида с N-(2-0-глюкоз)акриламидом (ГАА), сшитых конканавалином А (Кон А). Этот лектин имеет четыре места связывания глюкозы с константой Ксв=(3,7±0,7>103 М"1. Константа связывания ГАА конканавалином А по тем же местам связывания составляет Ксв=(1,1±0,3)*102 М"1.

Сополимеры акриламида (МО и ГАА (М2) синтезировали радикальной сополимеризацией водных растворов мономеров, используя в качестве инициатора окислительно-восстановительную систему персульфат аммония - Г^Д'.Г'Г-тетраметилэтилендиамин:

СН2=СН СН2=СН -СН2~СН-СН2~СН~

СО + ¿0 -► СО СО

II 11

ш2 ин ын2 рт

С6н„05 СбНц05

Рассчитанные значения констант сополимеризации этих мономеров составляют Г1=1Д2±0,11 и г2=0,024+0,012.

Характер распределения мономерных звеньев в полимерной цепи был оценен, используя параметр Харвуда, характеризующий количество переходов от звена М] к звену М2 на 100 мономерных звеньев. Значение этого параметра, рассчитанное по формуле:

К=200/(2+Г11У£2+г21У£1), где ^ и - мольные доли сомономеров в мономерной смеси,

при содержании ГАА в мономерной смеси ниже 15 % мол. стремится к 2. При тех же составах мономерной смеси вероятности присоединения М1 к растущему радикалу (Рп и Р21), рассчитанные по формуле:

Р„=г1[М1]/([М2]+г1[М1]), Р21=1- г2[М2]/([М1]+г2[М2]), где М1ИМ2-мольные концентрации сомономеров в исходной смеси, стремятся к единице.

Это означает, что при невысоком содержании ГАА в исходной мономерной смеси полученные сополимеры представляют собой достаточно длинные полиакриламидные блоки, соединенные единичными

звеньями ГАА. Такое распределение звеньев ГАА в сополимере является наиболее благоприятным для их последующего взаимодействия с Кон А, так как в этом случае должны исключаться стерические препятствия для реакции остатка глюкозы с одним из четырех активных центров Кон А.

При смешении водных растворов синтезированных сополимеров и Кон А практически мгновенно происходит образование гидрогелей. При этом Кон А выполняет роль четырехфункционального сшивающего агента, а сшивка цепей сополимеров происходит за счет биоспецифического взаимодействия Кон А с остатками глюкозы в составе сополимера.

Зависимость степени набухания полученных гидрогелей от соотношения между количеством сшивающего агента и количеством звеньев ГАА в сополимере представлена в табл. 9.

Таблица 9.

Зависимость степени набухания гидрогелей в воде от мольного соотношения [ГАА]:[Кон А].

[ГАА]: [Кон А] Степень набухания, г воды/г сухого геля

8:1 29,7±0,8

7:1 25,4±0,6

6:1 22,1+0,6

5:1 19,3±0,7

4:1 15,6±0,5

3:1 15,9±0,6

Видно, что с увеличением количества Кон А степень набухания гидрогелей сначала уменьшается, а затем при достижении мольного соотношения ГАА/Кон А = 4:1 перестает изменяться. Причина этого, вероятно, заключается в том, что при этом соотношении происходит насыщение лектина остатками ГАА и избыток Кон А уже не вступает в реакцию с сополимером. Плотность сетки гидрогеля при мольных соотношениях ГАА/Кон А < 4:1 не зависит от концентрации Кон А, а определяется только содержанием звеньев ГАА в сополимере (табл. 10).

Таблица 10.

Зависимость степени набухания гидрогелей в воде от содержания ГАА в сополимере (мольное соотношение [ГАА]:][Кон А]=4:1).

Содержание ГАА в сополимере, мол.% Степень набухания, г воды/г сухого геля

3,92 34,9±0,7

10,14 15,6±0,4

14,45 11,2±0,4

Таким образом, в результате взаимодействия содержащихся в сополимере остатков глюкозы с Кон А образуется устойчивый во времени гидрогель, степень набухания которого так же, как и для известных гидрогелей с ковалентными сшивками, является функцией концентрации мономера и сшивающего агента.

При добавлении к набухшему гидрогелю глюкозы сначала никаких видимых изменений с гидрогелем не происходит (степень набухания гидрогеля не изменяется). Однако, при достижении некоторого порогового значения концентрации глюкозы происходит быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние, то есть комплекс [Кон А- звено ГАА] распадается с образованием комплекса [Кон А - глюкоза] и водорастворимых макромолекул сополимера ГАА и акриламида (рис. 11).

• -»

О - остаток глюкозы в сополимере; "" * М - Конканавалин А;

¿тщ. - инсулин

I - глюкоза в растворе

в •

I Ш

—1

л

41111»

«тт?»

^•.аци-*

высвобождение инсулина

1--9

Рис. 11. Принцип действия глюкозочувствительных гидрогелей на основе сополимеров акриламида с 1Я-(2-В-глюкоз)акрипсшидом, сшитых Кон А.

Наличие пороговой концентрации глюкозы, вероятно, обусловлено кооперативным эффектом, возникающим при взаимодействии двух полифункциональных макромолекул: Кон А и сополимера ГАА с АА.

При удалении глюкозы из ее комплекса с лектином методом равновесного диализа происходит обратный переход системы в гелеобразное состояние.

Как и следовало ожидать, значение пороговой концентрации является функцией концентрации остатков глюкозы в сополимере (табл.11). Следует отметить, что для изученных сополимеров пороговая концентрация глюкозы имеет именно те значения, при которых в живом организме происходит секреция инсулина. В живом организме пороговой является концентрация глюкозы 80-100 мг/100 мл, а максимальная скорость секреции инсулина достигается при концентрации глюкозы 300500 мг/100 мл.

Таблица И.

Зависимость пороговой концентрации глюкозы от состава сополимера (мольное соотношение [ГАА]:][Кон А]=4:1).

Содержание ГАА в сополимере, мол.% Пороговая концентрация глюкозы, мг/100мл (±5%)

3,92 180

10,14 380

14,45 565

Существование зависимости пороговой концентрации от состава сополимеров позволило сконструировать устройство, обеспечивающее выделение требуемого количества инсулина при достижении определенной концентрации глюкозы. В жесткий сосуд объемом 3 мл, имеющий отверстия диаметром 2 мм, помещали смесь предварительно насыщенных раствором инсулина гидрогелей на основе сополимеров различного состава. Использовали сополимеры с содержанием ГАА 3,92, 10,14 и 14,45 мол.%. Количество гидрогеля каждого типа составляло 1 мл; в каждый гидрогель было введено 1,3 мг инсулина. Затем сосуд помещали в стакан с 10 мл буферного раствора с рН 3,5. Диффузия инсулина из сосуда в отсутствии глюкозы не превышала 15 мкг за 10 часов. При добавлении к буферному раствору глюкозы она диффундировала в сосуд с гидрогелем и при концентрации выше пороговой для каждого типа гидрогеля происходило разрушение этого гидрогеля с выделением содержащегося в нем инсулина. Кинетика выделения инсулина представлена на рис. 12, из которого видно, что, чем выше концентрация глюкозы в окружающей среде, тем большее количество инсулина выделяется из системы.

Для предотвращения выделения в окружающую среду одновременно с инсулином водорастворимых компонентов гидрогеля (Кон А и сополимера) было предложено использовать два приема. Первый заключается в применении для изоляции гидрогеля от окружающей среды мембраны, проницаемой для глюкозы и инсулина и непроницаемой для Кон А и сополимера. Вторым приемом может быть использование в качестве сшивающего агента смеси Кон А и М,]Ч'-метилен-бис-акриламида. При этом часть сшивок в гидрогеле образуется за счет биоспецифического

взаимодействия углевод-лектин, а часть - за счет ковалентного связывания цепей 1^,№-метилен-бис-акриламидом.

Количество выделившегося инсулина, мг

2 -

Л

J

J

_L

_L

150 300 450 600

Концентрация глюкозы, мг/100 мл

Рис. 12. Зависимость количества выделившегося инсулина от концентрации глюкозы в окружающей среде.

Концентрация Кон А, мг/мл

Рис. 13. Зависимости равновесной степени набухания гидрогелей от концентрации Кон А. Концентрация сополимера 50 мг/мл, мольное содержание звеньев ГАА в сополимере - 10,14%. Исходная концентрация N,N'-MemmeH-6uc-aKpwiaMuda 250 (о), 500 (•) и 1000 (а) мкг/мл

В отсутствии в окружающей среде глюкозы степень набухания полученных гидрогелей зависит от концентрации сшивающих агентов (рис. 13). При появлении в окружающей гидрогель среде глюкозы в

концентрации, равной значению пороговой для данного типа гидрогелей, их степень набухания скачкообразно увеличивается. Величина степени набухания при концентрации глюкозы выше пороговой не зависит от содержания Кон А в гидрогеле и равняется степени набухания гидрогелей аналогичного состава, полученных при использовании в качестве сшивающего агента только одного М,1Ч'-метилен-бис-акриламида (концентрация Кон А=0 на рис. 13).

Таким образом, полученные гидрогели представляют собой глюкозочувствительные системы, способные выделять строго определенное количество содержащегося в них вещества, например, инсулина, при достижении определенной концентрации глюкозы в окружающей среде. Значение этой концентрации можно регулировать изменением количества остатков ненасыщенного производного глюкозы в сополимере.

Заключение.

Суммируя изложенные результаты, можно сделать следующее заключение. Развитые в работе идеи и подходы к созданию биологически активных полимерных систем оказались перспективными для решения ряда актуальных задач современной химии медико-биологических полимеров. Реализация этих идей и подходов привела к созданию полимерных носителей для избирательного концентрирования биологически активных соединений в определенном участке организма; гидрогелевых матриц, обеспечивающих не только направленный транспорт иммобилизованных в их объеме соединений, но и защищающих эти соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды; полимерных систем для контролируемого выделения определенного количества лекарственного препарата в ответ на изменение рН или температуры окружающей среды или в ответ на изменение ее химического состава.

Впервые предложенный в работе подход к созданию белковых препаратов для перорального применения, основанный на использовании модифицирующих соединений с повышенным сродством к слизистой оболочке, привел к созданию новой лекарственной формы инсулина и явился основой для синтеза широкого круга носителей, получивших в литературе название мукоэдгезивные полимеры.

Положительные результаты испытаний некоторых синтезированных полимерных систем не только на животных, но и в клинических условиях, не оставляют сомнений в необходимости развертывания работ по созданию технологии их получения.

Обнаруженные в работе закономерности синтеза биологически активных полимеров и создания на их основе принципиально нового поколения полимерных носителей лекарственных препаратов, способных направленно изменять свои свойства в ответ на изменение параметров

окружающей среды, являются фундаментом для исследования более широкого круга биологически активных производных природных и синтетических полимеров, что, в свою очередь, позволит в значительной степени расширить возможности полимерной химии в плане создания материалов с требуемым комплексом физико-химических и биохимических" характеристик.

ВЫВОДЫ

1. Сформулирован, экспериментально доказан и проверен на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и соответствующим образом изменять свои свойства по механизму обратной связи. Этот подход включает иммобилизацию биологически активных соединений на синтетических полимерах, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении; на природных полимерах, способных взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами; или в объеме полимерного гидрогеля, которому изначально приданы биоспецифические свойства или они появляются в процессе эксплуатации.

2. Иммобилизацией белков на водорастворимых полимерах, имеющих НКТС, синтезированы полимерные производные для термоактивируемого направленного транспорта. Показано, что для производных с небольшим содержанием белка при температурах вблизи НКТС наблюдается переход из конформации клубка в конформацию глобулы с последующей ассоциацией макромолекул и образованием осадка. Чем больше доля белка, тем ниже степень ассоциации макромолекул. При увеличении количества иммобилизованного белка его молекулы солюбилизируют систему и предотвращают дальнейшую ассоциацию макромолекул полимера-носителя, а синтезированные производные остаются растворимыми во всем изученном интервале температур (12-75°С).

3. Впервые обнаружена зависимость НКТС и биологической активности синтезированных производных от их конфигурации. Минимальное солюбилизирующее действие белковой молекулы и максимальная биологическая активность наблюдаются в том случае, когда на одну молекулу белка привита одна высокомолекулярная цепь полимера-носителя. Связывание белка с большим количеством низкомолекулярных цепей полимера-носителя приводит к получению производных звездообразного строения, не имеющих НКТС и обладающих низкой биологической активностью.

4. Сформулирован и экспериментально проверен новый подход к созданию макромолекулярных терапевтических систем для направленного транспорта полипептидов в кровоток через пищеварительную систему, заключающийся в модификации полипептидов углеводом и ингибитором

протеолитических ферментов. На примере производных инсулина и овомукоида показано, что основной вклад в механизм действия таких систем вносит предотвращение ферментативного гидролиза полипептида и биоспецифические взаимодействия углеводной части овомукоида с лектинами слизистой оболочки кишечника.

5. Изучены особенности химической модификации полипептидов овомукоидом, повышающим их устойчивость к ферментативному гидролизу и обеспечивающим направленный транспорт полипептидов, и продемонстрирована зависимость активности синтезированных производных от химической природы полипептидов, а также конформации и размеров их макромолекул.

6. Впервые показана возможность использования биоспецифических взаимодействий лектинов с полисахаридами, иммобилизованными на частицах полимерных гидрогелей, для направленного транспорта этих частиц и предварительно введенного в них, но химически с ними не связанного, полипептида. Эффективность такого транспорта доказана в модельных экспериментах, опытами на животных и клиническими испытаниями.

7. Исследована диффузия белков из модифицированных углеводами гидрогелей через стенки реактора, моделирующего слизистую оболочку кишечника, и показано, что заметная роль биоспецифических взаимодействий проявляется только в случае частиц малого размера и глубокого проникновения этих частиц в мембранный слой, которое обеспечивает максимальное число контактов углевода и лектина. Максимально допустимый диаметр частиц для полиакриламидного гидрогеля составляет 0,5 мм.

8. Показана возможность использования гидрогелей на основе сополимеров акриламида с №(2-Б-глюкоз)акриламидом, сшитых конканавалином А, в качестве систем, работающих по механизму обратной связи и способных выделять предварительно введенный в них инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в окружающей среде. Обнаружено, что для таких гидрогелей существует пороговая концентрация глюкозы, определяемая содержанием N-(2-0-глюкоз)акриламида в сополимере, при достижении которой наблюдается быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние.

9. На основе смеси сшитых сополимеров акриламида с N-(2-0-глюкоз)акриламидом различного состава разработана модель поджелудочной железы, представляющая собой химический реактор, выделяющий определенное количество инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

Статьи в российских журналах:

1. Платэ H.A., Валуев Л.И., Старосельцева Л.К., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Ванчугова Л.В., Валуев И.Л., Сытов Г.А., Аметов A.C., Княжев В.А. Макромолекулярные системы с инсулином в связи с проблемой диабета. //Высокомолек. соед. 1994. Т. 36А. № 11. С. 1876-1879.

2. Валуев И.Л., Синани В.А.. Свойства модифицированных полимерных гидрогелей на основе тридекаэтиленгликоль-диметакрилата. // Вестник МГУ. сер.2. Химия. 1996. Т. 37. № 2. С. 181-184.

3. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И. Проблемы создания препаратов инсулина с повышенной устойчивостью к протеолизу. // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 4. С. 371-381.

4. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Синтез и исследование иммобилизованного инсулина. // Биохимия. 1996. Т. 61. № 9. С. 1584-1588.

5. Валуев И.Л., Чупов В.В., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Фазообратимые гидрогели- на основе акриламида и N-(2-D-глюкоз)акриламида. // Высокомолек. соед. 1997. Т. 39Б. № 4. С. 751754.

6. Валуев И.Л., Попович С.Н., Талызенков Ю.А., Сытов Г.А., Чупов В.В., Валуев Л.И., Платэ H.A. О комплексообразовании полисахаридов ряда фуканов с лектинами и полипептидами. // Доклады РАН. 1997. Т. 357. № 5. С. 634-636.

7. Валуев И.Л., Чупов В.В, Валуев Л.И., Платэ H.A. О взаимодействии глобулярных белков с водорастворимыми карбодиимидами. // Прикл. биохим. и микробиол. 1997. Т. 33. № 2. С. 180-182.

8. Платэ H.A., Валуев Л.И., Валуев И.Л.. Полимерные носители: прорыв в фармакологии. // Наука в России. 1998. № 1. С. 21-26.

9. Валуев И.Л., Валуев Л.И., Платэ H.A. О механизме действия препаратов иммобилизованного инсулина для перорального применения. // Доклады РАН. 1998. Т. 360. № 1. С. 57-60.

10. Валуев Л.И., Валуев И.Л. Живые полимеры. // Химия и жизнь. 2000. № 1. С. 16-21.

11. Валуев И.Л., Антипов A.A., Обыденнова И.В., Шаназарова И.М., Розенфельд М.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Транспортные функции системы белок-полидиэтилакриламид. // Высокомолек. соед. 2000. Т. 42Б. № 8. С. 1419-1423.

12. Валуев И.Л., Обыденнова И.В., Шаназарова И.М., Розенфельд М.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Структурно-функциональные свойства сополимеров овомукоида и 1Ч,М-диэтш1акриламида. // Доклады РАН. 2000. Т. 372. № 2. С. 189-191.

13. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Валуев Л.И., Платэ H.A. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета. // Вопр. мед. химии. 2001. Т. 47. № 1. С. 132-139.

14. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Ванчугова Л.В., Пан A.B., Ульянова М.В., Валуев Л.И., Платэ H.A. Стабильность препарата иммобилизованного инсулина при различных значениях pH. // Вопр. мед. химии. 2002. Т. 48. № 6. С. 628-633.

15. Валуев И.Л., Кудряшов В.К., Обыденнова И.В., Сытов Г.А., Валуев Л.И. Исследование свойств гидрогелей на основе сополимеров гидроксиэтилметакрилата. // Вестник' московского университета, сер. 2. Химия. 2003. Т. 44. № 2. С. 149-152.

16. Валуев И.Л., Пан A.B., Розенфельд М.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Полимерные системы с антитромбиновой активностью для термоактивируемого направленного транспорта. // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 3. С. 359-362.

17. Валуев И.Л., Валуев Л.И., Платэ H.A. Новые возможности метода биоспецифической хроматографии. // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 4. с. 478-482.

18. Валуев Л.И., Валуева Т.А, Валуев И.Л., Платэ H.A. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений. // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 307-328.

19. Валуев И.Л., Шаназарова И.М., Пан A.B., Розенфельд М.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. Синтез и свойства блоксополимеров с нижней критической температурой смешения. // Высокомолек. соед. 2003. Т. 45. № 9, С. 1586-1589.

20. Валуев Л.И., Сытов Г.А., Валуев И.Л., Ульянова М.В., Ванчугова Л.В., Платэ H.A. Биоспецифический полимерный носитель полипептидных лекарственных препаратов. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2004. № 11. С. 2504-2509.

21. Валуев И.Л., Обыденнова И.В., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Платэ H.A. pH- и термочувствительные полимерные носители биологически активных соединений. // Высокомолек. соед. 2005. Т. 47Б. № 4. С. 716719.

22. Платэ H.A., Старосельцева Л.К., Валуев Л.И., Сытов Г.А., Ульянова М.В., Валуев И.Л., Ванчугова Л.В. Раствор инсулина для перорального введения. // Химико-фармацевтический журнал.1 2006. Т. 40. № 4. С. 105-108.

23. Валуев Л.И., Валуев И.Л., Шаназарова И.М. Структура и функциональные свойства термочувствительных производных иммобилизованных белков // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т. 42. № 1. С. 33-36.

Патенты:

24. Валуев Л.И., Обыденнова И.В., Валуев И.Л, Чупов В.В., Плата Н.А, Бибби Дж.М., Сытов Г.А., Должанский П.Е. Способ получения полимерных термочувствительных гидрогелей. / Патент РФ. № 2071965. Бюл. № 2.1997.

25. Валуев Л.И., Плата Н.А., Синани В.А., Старосельцева Л.К., Сытов Г.А., Валуев И.Л., Ванчугова Л.В., Ульянова М.В. Способ получения производных инсулина. / Патент РФ. № 2076733. Бюл. № 10.1997.

Статьи в зарубежных журналах:

26. Plate N.A., Valuev L.I., Valuev I.L. Polymeric carriers: a breakthrough in pharmocopeia. // Journal of Journals. 1997. V. 1. P. 37-40.

27. Valuev I.L., Chupov V.V., Valuev L.I. Chemical modification of polymers with physiologically active species using water-soluble carbodiimide. // Biomaterials. 1998. V. 19. № 9. P. 41-43.

28. Plate N.A., Valuev I.L. Drug Delivery by «Smart» Polymer Gels. // Science Spectra. 2000. V. 22. P. 60-69.

29. Plate N.A., Valuev I.L., Valuev L.I., Sytov G.A. Mucoadhesive polymers with immobilized proteinase inhibitors for oral administration of protein drugs. // Biomaterials. 2002. V. 23. P. 1673-1677.

30. Valuev I.L., Valuev L.I., Plat6 N.A. Glucose-sensitive system based on phase-reversible hydrogels. // STP Pharma Sciences. 2003. V. 13. № 6. P. 427-429.

31. Valuev I.L., Valuev L.I., Plate N.A. On the possible mechanism of enhanced absorption of oral immobilized insulin preparations // Journal Drug Delivery Science Technology. 2004. V. 14. № 2. P. 155-158.

32. Plate N.A., Valuev I.L., Valuev L.I. Water-soluble polymers with low critical solution temperature (LCST) as carriers for protein drug delivery // Journal of Biomaterials Science. 2004. V. 15. № 4. P. 415-422.

Подписано в печать 15.01.2007 г. Печать на ризографе. Тираж 120 экз. Заказ № 861. Объем 1,1 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д.6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Список сокращений.3

Введение.5

ГЛАВА I.

Некоторые подходы к созданию полимерных систем для направленного транспорта лекарственных препаратов.12

ГЛАВА II.

Термо- и pH-чувствительные полимерные носители.32

ГЛАВА III.

Водорастворимые производные инсулина и овомукоида.73

ГЛАВА IV.

Полимерные частицы - носители белковых препаратов.112

ГЛАВА V.

Фазообратимые глюкозочувствительные гидрогели.151

Актуальность проблемы. Современный уровень развития науки и техники ставит ряд задач по созданию нового поколения полимерных веществ и материалов. В настоящее время не достаточно придать полимерам те или иные химические или физико-механические свойства, такие как механическая прочность, эластичность, устойчивость к действию агрессивных сред и т. д., а во многих случаях требуется создать полимеры, направленно изменяющие свои свойства в процессе эксплуатации. К таким полимерам, получившим название «умные», относятся материалы и системы, способные изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды, например, температуры, рН, освещенности, появление в окружающей среде какого-либо химически или биологически активного соединения в определенной концентрации и т.д.

Одной из наиболее перспективных областей применения таких материалов является химия медико-биологических полимеров. Это, прежде всего, открывает большие возможности в плане создания материалов, способных моделировать отдельные функции некоторых органов и тканей живого организма, то есть активно функционировать в такой сложной, многокомпонентной среде, как живой организм. Активное функционирование подразумевает способность воспринимать информацию, поступающую извне, и изменять свои свойства в соответствии с ней. Очевидно, что эта способность, характерная, в основном, для «живой» материи, может быть придана синтетическим полимерам путем связывания их с соответствующими биологически активными соединениями (БАС). Использование такого подхода позволяет уже на современном уровне развития науки создавать полимерные композиции, моделирующие мышцы, изменяющие свои размеры под действием внешних условий, кожу, способную к самообновлению, модели почек, избирательно выводящие токсичные соединения из организма и др.

Иммобилизация БАС на полимерном носителе позволяет вплотную подойти и к решению еще одной актуальной задачи современной химии медико-биологических полимеров - контролируемому выделению лекарственных препаратов (ЛП) из специально созданных «депо» по мере возникновения в них потребности, а также к повышению избирательности действия лекарственных веществ на ключевую стадию поражения.

Применение макромолекулярных носителей может позволить использовать альтернативные пути введения известных лекарственных препаратов, более физиологичные и комфортные для человека. Последнее особенно важно для белковых и полипептидных препаратов, которые невозможно вводить в организм через пищеварительную систему, где они подвергаются ферментативному гидролизу и расщепляются до составляющих их аминокислот.

Актуальность работы определяется также задачами возможного применения в клинической практике изделий на основе синтезированных материалов, включая системы для контролируемого выделения лекарств и их направленного транспорта, в том числе, основанные на механизме обратной связи, новые лекарственные формы для защиты лекарств от агрессивной среды живого организма, биологически активные покрытия на раны и ожоги и т.д.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось:

- разработка подходов к созданию биологически активных полимерных систем, целенаправленно изменяющих свои характеристики при изменении параметров окружающей среды и активно воздействующих на эти параметры по механизму обратной связи;

- разработка методов синтеза полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, и создание на их основе универсальных систем для направленного транспорта БАС;

- разработка приемов и методов получения полимерных матриц, обеспечивающих не только направленный транспорт иммобилизованных в их объеме БАС, но и защищающих эти соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды.

Решение конкретных биомедицинских задач потребовало провести ряд фундаментальных исследований в области химии высокомолекулярных соединений и биохимии, в частности, изучить процессы, происходящие при иммобилизации БАС, и определить основные параметры взаимодействия иммобилизованных БАС с их физиологическими субстратами; выяснить влияние химической природы и молекулярных характеристик полимера-носителя и состава окружающей среды на эти параметры; исследовать конформационное поведение синтетических полимеров и иммобилизованных на них БАС при различных условиях их функционирования; разработать научные основы создания полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, а также носителей, обеспечивающих одновременно защиту содержащихся в них белковых препаратов от ферментативного гидролиза и их направленный транспорт.

В связи с поставленными задачами основное внимание в работе было уделено следующим объектам исследования:

1) синтетическим полимерам, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении, т.е. выполнять «умную» функцию;

2) природным полимерам, биоспецифические свойства которых определяются способностью их макромолекул взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами;

3) полимерным матрицам, в которых БАС не связано с полимером, а самой матрице изначально приданы биоспецифические свойства или эти свойства возникают в процессе эксплуатации.

Научная новизна и практическая ценность работы. Решение поставленных задач позволило сформулировать и экспериментально проверить на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды.

В работе впервые:

1) изучено поведение полимерных производных белков, обладающих нижней критической температурой смешения (НКТС), вблизи точки фазового перехода и показано, что фазовому расслоению предшествует изменение конформации макромолекул, которое приводит к их ассоциации и образованию нерастворимой фазы;

2) обнаружена зависимость НКТС и биологической активности полимерных производных белков не только от соотношения белок/полимер-носитель, но и от конфигурации этих производных;

3) предложен подход к созданию макромолекулярных терапевтических систем, повышающих устойчивость полипептидов к ферментативному гидролизу и обеспечивающих направленный транспорт полипептидов в кровоток через пищеварительную систему;

4) изучен процесс химической модификации полипептидов соединениями, обеспечивающими их направленный транспорт, и продемонстрирована зависимость активности синтезированных производных от химической природы полипептидов, а также конформации и размеров их макромолекул;

5) предложено использовать биоспецифические взаимодействия для направленного транспорта гидрогелевых частиц и предварительно введенного в них, но химически с ними не связанного полипептида;

6) на основе сополимеров акриламида с 1Ч-(2-0-глюкоз)-акриламидом, сшитых конканавалином А, созданы химические системы, работающие по механизму обратной связи и способные выделять предварительно введенный в них инсулин в ответ на достижение определенной концентрации глюкозы в окружающей среде;

7) обнаружено, что при взаимодействии таких гидрогелей с растворами глюкозы различной концентрации, существует пороговая концентрация глюкозы, при достижении которой наблюдается быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние с эмиссией инсулина, и определены значения пороговой концентрации для сополимеров различного состава.

Разработанные основы создания и применения биоспецифических полимерных материалов, способных целенаправленно изменять свои свойства по механизму обратной связи в процессе эксплуатации, позволяют вплотную подойти к решению некоторых принципиально важных проблем современной химии медико-биологических полимеров. В первую очередь это относится к решению проблемы направленного транспорта лекарственных веществ путем их иммобилизации на полимерах с НКТС и последующего нагревания мишени до температуры, выше НКТС. Другой решаемой проблемой является проблема контролируемого выделения биологически активного вещества. Нами разработаны подходы к созданию полимерных систем, выделяющих заданное количество биологически активного вещества не только в ответ на изменение температуры или рН окружающей среды, но также реагирующих на изменение концентрации глюкозы, то есть способных моделировать функцию поджелудочной железы - выделять определенное количество инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.

Сформулированные в работе подходы к направленному транспорту полипептидов с одновременным повышением их устойчив,ости к ферментативному гидролизу путем их ковалентного связывания с ингибиторами ферментов или путем физической иммобилизации в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибитором ферментов, могут быть использованы при создании полипептидных лекарственных препаратов для перорального применения.

Практическая значимость некоторых частей работы подтверждена патентами РФ, положительными результатами экспериментов на животных и клиническими испытаниями.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном семинаре «Инсулин: получение, производство, применение» (Минск, 1995); Первой и Второй Международных конференциях «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 1996, 1998); European Symposium «Formulation of poorly-available drugs for oral administration» (Paris, 1996); Международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Москва, 1997); Четвертом и Пятом Симпозиумах «Химия протеолитических ферментов», (Москва, 1997, 2002); Третьей Белорусской научно-практический конференции «Эфферентные и физико-химические методы терапии» (Могилев, 1998); The 26ш International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials (Boston, 1999); 1st Workshop of Young European Scientist (Lodz, 2002), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2005, 2006), 22-ом и 23-ем Симпозиуме по реологии (Валдай, 2004, 2006), конференции "MedBioTech-2006" (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 статей в научных журналах, получено 2 патента Российской Федерации, и опубликовано 16 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Личный вклад автора. Автор является инициатором выбора направления данного исследования, лично проводил работы по синтезу полимерных производных биологически активных соединений, изучению их строения и свойств. Разработал новый методический подход к созданию универсальных транспортных систем направленного транспорта биологически активных соединений. Автор принимал непосредственное участие в проведении экспериментов на животных и клинических испытаниях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 211 страницах печатного текста и включает 59 рисунков, 43 таблицы и 13 схем. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (298 наименований).

выводы

1. Сформулирован, экспериментально доказан и проверен на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и соответствующим образом изменять свои свойства по механизму обратной связи. Этот подход включает иммобилизацию биологически активных соединений на синтетических полимерах, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении; на природных полимерах, способных взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами; или в объеме полимерного гидрогеля, которому изначально приданы биоспецифические свойства или они появляются в процессе эксплуатации.

2. Иммобилизацией белков на водорастворимых полимерах, имеющих НКТС, синтезированы полимерные производные для термоактивируемого направленного транспорта. Показано, что для производных с небольшим содержанием белка при температурах вблизи НКТС наблюдается переход из конформации клубка в конформацию глобулы с последующей ассоциацией макромолекул и образованием осадка. Чем больше доля белка, тем ниже степень ассоциации макромолекул. При увеличении количества иммобилизованного белка его молекулы солюбилизируют систему и предотвращают дальнейшую ассоциацию макромолекул полимера-носителя, а синтезированные производные остаются растворимыми во всем изученном интервале температур (12-75°С).

3. Впервые обнаружена зависимость НКТС и биологической активности синтезированных производных от их конфигурации. Минимальное солюбилизирующее действие белковой молекулы и максимальная биологическая активность наблюдаются в том случае, когда на одну молекулу белка привита одна высокомолекулярная цепь полимераносителя. Связывание белка с большим количеством низкомолекулярных цепей полимера-носителя приводит к получению производных звездообразного строения, не имеющих НКТС и обладающих низкой биологической активностью.

4. Сформулирован и экспериментально проверен новый подход к созданию макромолекулярных терапевтических систем для направленного транспорта полипептидов в кровоток через пищеварительную систему, заключающийся в модификации полипептидов углеводом и ингибитором протеолитических ферментов. На примере производных инсулина и овомукоида показано, что основной вклад в механизм действия таких систем вносит предотвращение ферментативного гидролиза полипептида и биоспецифические взаимодействия углеводной части овомукоида с лектинами слизистой оболочки кишечника.

5. Изучены особенности химической модификации полипептидов овомукоидом, повышающим их устойчивость к ферментативному гидролизу и обеспечивающим направленный транспорт полипептидов, и продемонстрирована зависимость активности синтезированных производных от химической природы полипептидов, а также конформации и размеров их макромолекул.

6. Впервые показана возможность использования биоспецифических взаимодействий лектинов с полисахаридами, иммобилизованными на частицах полимерных гидрогелей, для направленного транспорта этих частиц и предварительно введенного в них, но химически с ними не связанного, полипептида. Эффективность такого транспорта доказана в модельных экспериментах, опытами на животных и клиническими испытаниями.

7. Исследована диффузия белков из модифицированных углеводами гидрогелей через стенки реактора, моделирующего слизистую оболочку кишечника, и показано, что заметная роль биоспецифических взаимодействий проявляется только в случае частиц малого размера и глубокого проникновения этих частиц в мембранный слой, которое обеспечивает максимальное число контактов углевода и лектина. Максимально допустимый диаметр частиц для полиакриламидного гидрогеля составляет 0,5 мм.

8. Показана возможность использования гидрогелей на основе сополимеров акриламида с К-(2-Б-глюкоз)акриламидом, сшитых конканавалином А, в качестве систем, работающих по механизму обратной связи и способных выделять предварительно введенный в них инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в окружающей среде. Обнаружено, что для таких гидрогелей существует пороговая концентрация глюкозы, определяемая содержанием N-(2-D-глюкоз)акриламида в сополимере, при достижении которой наблюдается быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние.

9. На основе смеси сшитых сополимеров акриламида с N-(2-D-глюкоз)акриламидом различного состава разработана модель поджелудочной железы, представляющая собой химический реактор, выделяющий определенное количество инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.

Заключение.

Суммируя изложенные результаты, можно сделать следующее заключение. Развитые в работе идеи и подходы к созданию биологически активных полимерных систем оказались перспективными для решения ряда актуальных задач современной химии медико-биологических полимеров. Реализация этих идей и подходов привела к созданию полимерных носителей для избирательного концентрирования биологически активных соединений в определенном участке организма; гидрогелевых матриц, обеспечивающих не только направленный транспорт иммобилизованных в их объеме соединений, но и защищающих эти соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды; полимерных систем для контролируемого выделения определенного количества лекарственного препарата в ответ на изменение рН или температуры окружающей среды или в ответ на изменение ее химического состава.

Впервые предложенный в работе подход к созданию белковых препаратов для перорального применения, основанный на использовании модифицирующих соединений с повышенным сродством к слизистой оболочке привел к созданию новой лекарственной формы инсулина и явился основой для синтеза широкого круга носителей, получивших в литературе название мукоадгезивные полимеры.

Положительные результаты испытаний некоторых синтезированных полимерных систем не только на животных, но и в клинических условиях, не оставляют сомнений в необходимости развертывания работ по созданию технологии их получения.

Обнаруженные в работе закономерности синтеза биологически активных полимеров и создания на их основе принципиально нового поколения полимерных носителей лекарственных препаратов, способных направленно изменять свои свойства в ответ на изменение параметров окружающей среды, являются фундаментом для исследования более широкого круга биологически активных производных природных и синтетических полимеров, что, в свою очередь, позволит в значительной степени расширить возможности полимерной химии в плане создания материалов с требуемым комплексом физико-химических и биохимических характеристик.

1. Ehrlich P. I I Collected Study on Immunology. / New York: John Wiley & Sons Ltd. 1906. V. 11. P. 442-444.

2. Trail P.A., Willner D., Lasch S.J., Henderson A.J., Hofstead S., Casazza A.M., Firestone R.A. Hailstorm I., Hailstorm K.E. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-Doxorubicin immunoconjugates. // Science. 1993. V. 261. P. 212-215.

3. Uckun F.M., Evans W.E., Forsyth C.J., Waddick K.G., Ahlgren L.T., Chelstrom L.M., Burkhardt A., Bolen J., Myer D.E. Biotherapy of B-cell precursor leukemia by targeting genistein to CD19 associated tyrosine kinases. // Science. 1995. V. 267. P. 886-891.

4. Okano Т., Yui N., Yokoyama M., Yoshida R., Ikoma Т., Karube I., Kuroda R. // Advances in Polymeric System for Drug Delivery. Japanese Technology Reviews (section E : Biotechnology). Yokohama: Gordon and Breach Science Publishers. 1994. V. 4(1).

5. Ringsdorf H. Structure and properties of pharmacologically active polymers. // J. Polymer Science. V. 51. № 1. P. 135-145.

6. Некоторые аспекты синтеза полимеров медицинского назначения. / под ред. Х.У. Усманова. Ташкент: «Фан». 1978. С. 228.

7. Dunkan R., Lloyd F.B., Reimanova P., Kopecek J. Methods of targetting N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymers to particular cell types. // Macromol. Chem. Suppl. 1985. V. 9. №. 1. P. 3-12.

8. Вирник А.Д., Хомяков К.П., Скокова И.Ф. Декстран и его производные. // Успехи химии. 1975. Т. 44. № 7. С. 1280-1307.

9. Macritchi F. Effects of temperature on dissolution and precipitation of proteins and polyaminoacides. // J. Colloid. Interfase Sci. 1973. V. 45. № 2. P. 235-241.

10. Harada A., Kataoka K. Formation of polyion complex micelles in aqueous milieu from a pair of oppositely-charged block-copolymer with

11. Polyethylene glycol) segments // Macromolecules. 1995. V. 28. № 15. P. 52945299.

12. Kojima T., Hashida M., Muranishi S., Sezaki H. Mitomycin C-dextran conjugate: a novel high molecular weight pro-drug of mitomycin C. // J. Pharm. Pharmacol. 1980. V. 32. № 1. P. 30-34.

13. Malek P., Kolc J., Herold M., Hoffman J. Lymphotropic antibiotics-"Antibiolymphins". I I Antibiotics Annual. New York: Medical Encyclopedia Inc. 1958. P. 546-556.

14. Takakura Y., Fujita T., Hashida M., Sezaki H. Disposition characteristics of macromolecules in tumour-bearing mice. // Pharm. Res. 1990. V. 7. № 4. P. 339-346.

15. Nishikawa M., Ohtsubo Y., Ohno J., Fujita T., Koyama Y., Yamashita F., Hashida M., Sezaki H. Pharmacokinetics of receptor-mediated hepatic uptake of glucosylatedalbumine in mice. // Int. J. Pharm. 1992. V. 85. № 1. P. 75-85.

16. Hashida M., Nishikawa M., Yamashita F., Takakura T. Targeting delivery of protein drugs by chemical modification. // Drug Develop. Indust. Pharm. 1994. V. 20. № 4. P. 581-590.

17. Cavallaro G., Pitarresi G., Licciardi M., Giammona G. Polymeric prodrug for release of anantitumoral agent by specific enzymes. // Bioconjug. Chem. 2001. V. 12. № 2. P. 143-151.

18. Липатова Т.Э., Пхакадзе Г.А., Васильченко Д.В., Липатов Ю.С. Биодеструктурирующие сегметированные полиуретаны, содержащие в основной цепи полимера звенья аминокислот и дипептидов. // Доклады АН СССР. 1980. Т. 251. № 2. С. 368-371.

19. Mezo М., Kajtar J., Hudeur F., Szekerke M. Carrier design: conformational studies of aminoacid (X) and oligopeptide (X-DL-AlaJ substituted poly-L-lysine. I I Biopolymers. 1993. V. 33. № 6. P. 873-885.

20. Zubr V., Kopecek J., Dunkan R. Degradation of oligopeptide sequence connecting poly-(N-2-hydroxypropyl) methacrylamide by lisosomal cysteine proteinases. //J. Bioact. Compat. Polym. 1987. V. 33. № 4. P. 133-146.

21. Кацараева P.Д., Кунчулия Д.П., Авалишвили Л.М. Использование активированных бис-пентахлорвиниловых эфиров дикарбоновых кислот для синтеза полиамидов. // Высокомолек. соед. 1979. Т. 21-А. № 12. С. 2696-2701.

22. Кацараева Р.Д., Харадзе Д.М., Кирлилашвили Л.И. Синтез полиамидов, содержащих биоразрушаемые связи пептидного типа в основных цепях макромолекул. // Сообщения АН Груз. ССР. 1984. Т. 114. № 2. С. 321-324.

23. Липатова Т.Э., Лоос С.М. Влияние структуры сетчатыхполимеров на их рассасывание в организме. // Синтез и физико-химия полимеров. 1973. Вып. 2. С. 95-98.

24. Торчилин В.П., Ко П.В., Клибанов A.Jl., Слинкин М.А., Хабер Е. Модификация моноклональных антител полимерами проявляющими хелатные свойства. //Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1986. Т. 102. № 7. С. 63-65.

25. Bader J.H., Ringsdorf H., Schmidt B. Watersoluble polymers in medicine. // Angew. Macromol. Chem. 1984. V. 123. № 3. P. 457-485.

26. Pratten M.K., Lloyd J.B., Hurpel G., Ringsdorf H. Micelle-forming block, copolymers: Pinocytosis by macrophages and interaction with model membranes. // Makromol. Chem. 1985. V. 186. № 4. P. 725-733.

27. Yokoyama M., Miyauchi M., Yamada N., Okano Т., Sakurai Y., Kataoka K., Inoue S. Polymer micelle as novel drug carrier: adriamycinconjugated poly(ethylene glucol)-poly(aspartic acid) block copolymer. // J. Control. Rel. 1990. V.ll. № 2. P.269-278.

28. Yokoyama M., Kwon G.S., Okano T., Sakurai Y., Seto T., Kataoka K. Preparation of micelle-forming polymer-drug conjugates. 11 Bioconj. Chem. 1992. V. 3. № 2. P. 295-301.

29. Yokoyama M., Kwon G.S., Okano T., Sakurai Y., Ekimoto H., Okamoto K., Seto T., Kataoka K. Optimization of in vivo antitumor activity of micelle-forming polymer drug against murine colon adenocarcinoma. // Drug Deliv. 1993. V.l.№ 1. P. 11-15.

30. Kataoka K., Kwon G.S., Yokoyama M., Okano T., Sakurai Y. Block copolymer micelles as vehicles for drug delivery. I I J. Control. Rel. 1993. V. 24. № 1. P. 119-132.

31. Kwon G.S., Naito M., Yokoyama M., Okano T., Sakurai Y., Kataoka K. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(fi-benzyl L-aspartate). I I Langmuir. 1993. V. 9. № 4. P. 945-949.

32. Kwon G.S., Naito M., Kataoka K., Yokoyama M., Sakurai Y., Okano T. Block copolymers micelles for hydrophobic drug. // Colloids Surf. B: Biointerfaces. 1994. V.2. № 2. P. 429-434.

33. Kwon G.S., Naito M., Yokoyama M., Okano T., Sakurai Y., Kataoka K. Physical entrapment of adriamycin in AB block copolymer micelles. // Pharm. Res. 1995. V. 12. № 2. P.192-195.

34. Lim Soo P., Lovrich J., Davidson P., Maysinger D., Einsenberg A. Polycaprolactone-block-poly(ethylene oxide) micelles: a nanodelivery system for 17beta-estradiol. I I Mol. Pharm. 2005. V. 2. № 6. P. 519-527.

35. Park E.K., Kim S.Y., Lee S.B., Lee Y.M. Folate-conjugated methoxy poly(ethylene glycol)/poly(epsilon-caprolactone) amphiphilic blockcopolymeric micelles for tumor-targeted drug delivery. // J. Control. Release.2005. V. 109. № 1-3. P. 158-168.

36. Poste G. Drug targeting in cancer therapy. // Receptor-Mediated Targeting of Drugs. / Ed. Gregoriadis G., Poste G., Senior J., Trouet A./ New York: John Wiley & Sons Ltd. 1983. P. 427-474.

37. Grommelin D. J. A., Schreier H. Liposomes. // Colloidal Drug Delivery Systems in Drugs and Pharmaceutical Science. / Ed. Swarbrick J./ New York: Marcel Dekker, Inc. 1994. P. 73-190.

38. Nasti T.H., Khan M.A., Owais M. Enhanced efficacy of pH-sensitive nystatin liposomes against Cryptococcus neoformans in murine model I I J. Antimicrob. Chemother. 2006. V. 57. № 2. P. 349-352.

39. Cryan S.A., Devocelle M., Moran P.J., Hickey A.J., Kelly J.G. Increased intracellular targeting to airway cell using octaarginine-coated liposomes: in vitro assessment of their suitability for inhalation. // Mol. Pharm.2006. V. 3. № 2. P. 104-112.

40. Thongborisute J., Takeuchi H., Yamamoto H., Kawashima Y. Properties of liposomes coated with hydrophobically modified chitosan in oral liposomal drug delivery. // Pharmazie. 2006. V. 61. № 2. P. 106-111.

41. Goto T., Morishita M., Nishimura K., Nakanishi M., Kato A., Ehara J., Takayama K. Novel mucosal insulin delivery systems based on fusogenic liposomes. // Pharm. Res. 2006. V. 23. № 2. P. 384-391.

42. Lu D., Hickey A.G. Liposomal dry powders as aerosol for pulmonary delivery of proteins. // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2005. V. 6. № 4. P. 641-648.

43. Gulsen D., Li C.C., Chauhan A. Dispersion of DMPC liposomes in contact lenses for ophthalmic drug delivery. // Curr. Eye. Res. 2005. V. 30. № 12. P. 1071-1080.

44. Torchilin V.P., Shtilman M.I., Trubetskoj V.S., Whiteman K., Milstein A.M. Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1195. № 1. P. 181

45. Kreuter J. Nanoparticles. // Colloidal Drug Delivery Systems in Drugs and Pharmaceutical Science. / Ed. Swarbrick J./NewYork: Marcel Dekker, Inc. 1994. P. 219-342

46. Couvreur P., Fattal E., Andremont A. Liposomes and nanoparticles in the treatment of intracellular bacterial infections. I I Pharm. Res. 1991. V. 8. № 9. P. 1079-1086.

47. Couvreur P., Vauthier C. Polyalky Icyanoacrylate nanoparticles as drug carrier: present state and persectives. // J. Control. Release. 1991. V. 17. № 1. P. 187-198.

48. Kohane D.S., Tse J.Y., Yeo Y., Padera R., Shubina M., Langer R. Biodegradable polymeric microspheres and nanospheres for drug delivery in the peritoneum. //J. Biomed. Mater. Res. A. 2006. V. 77. № 2. P. 351-361.

49. Couvreur P., Dubernet C., Puisicux F. Controlled drug delivery with nanoparticles: Current possibilities and future trends. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 1995. V. 41. № 1. P. 101-107.

50. Moghimi S.M., Hawley A.E., Christy N.M., Gray T., Ilium L., Davis S.S. Surface engineered nanospheres with enhahced drainage into lymphatics and uptake by macrophages of regional lymph nodes. I IFEBS Let. 1994. V. 344. № l.P. 25-30.

51. Balland O., Pinto-Alphandary H., Pecquet S., Andremont A., Couvreur P. The uptake of ampicillin-loaded nanoparticles by murine macrophages infected with Salmonella typhimurium. // J. Antimicrobial Chemotherapy. 1994. V. 33. № 3. P. 509-522.

52. Lee R.J., Low P.S. Folate-mediated tumor cell targeting of liposome-entrapped doxorubicin in vitro. // Biochem. Biophys. Act. 1995. V. 1233. №2. P. 134-144.

53. Васильев A.E., Лившиц А.Б., Розенберг ГЛ., Кочетков H.K. Производные декстрана. II. Синтез N-аминоацильных производных карбоксиметилдекстрана. II Химия природных соед. 1969. № 6. С. 525531.

54. Panarin E.F., Kopeikin V.V. Main features of hydrolysis of polymeric enaminones based on water-soluble copolymer from N-vinyl-2-pyrrolidone and 5-methyl-5-hexene-2,4-dione. II Macromol. Chem. 1983. V. 183. №4. P. 701-716.

55. Jacobson K.A., Verlander M.S., Rosekranz R.P., Melmon K.L. Cleavage of drugs from polymer matrix used as drug delivery systems. // Int. J. Peptide Protein Res. 1983. V. 22. № 3. P. 284-304.

56. Montheard J.P., Vergnaud J.M., Chafi N. Polymer drugs carriers of methacrylic and acrylic derivatives. // Polym. Bull. 1988. V. 20. № 2. P. 177182.

57. Hrabak F., Grimova J., Maturova E., Kuchar M. Influence of nature and dimensions of side chain between backbone and drug molecule on the properties of polymer drug delivery system. // J. Biomed. Mater. Res. 1983. V. 17. №1. P. 179-184.

58. Cecchi R., Rusconi L., Tanri M.C., Danusso F., Ferruti P. Lysis and hydrolysis of aminoacids covalently immobilized onto polyacrylic acid. // J. Med. Chem. 1981. V. 24. № 5. P. 622-625.

59. Платэ H.A., Литманович А.Д., Hoa O.B. // Макромолекулярные реакции. M.: Химия. 1977. С. 253.

60. Тураева А.С., Позилов И., Наджимутдинов Ш., Адылов А.А., Усманов Х.У. ИК-спектроскопические изучения сополимеризации метакрилоилхлорида с метакриловой кислотой. II Узб. хим. журнал. 1984. № 2. С. 20-23.

61. Ringsdorf Н. // Polymeric Drug Delivery Systems. / Ed. Kostelnik B.N.Y. NewYork: Gordon Breach. 1978. P. 197.

62. Lackey C.A., Press O.W., Hoffman A.S., Stayton P.S. A biomimetic pH-responsive polymer directs endosomal release and intracellular delivery of an endocytosed antibody complex. 11 Bioconjug. Chem. 2002. V. 13. № 5. P. 996-1001.

63. Davies R.D., Podlan E.A. Antibody-antigen complexes. // Ann. Rev. Biochem. 1990. V. 59. № 4. P. 439-473.

64. Membrane receptor. / Ed. by Kleinzeller A., Martin B.P. New York. Academic Press. 1983.

65. Neufeld E.F., Ashwell G. Garbohydrate recognition system for receptor-mediated pinocytosis. In: The biochemistry of glycoproteins and protoglucans. / Eds. Lennarz I.L., Brown M.S. // Ann. Rev. Biochem. 1977. V. 46. P. 897-901.

66. Kolb-Bachofen V., Schepper-Schafer Y., Roos P., Hulsman D., Kolb H. Gal, NAsGal-specific rat liver lectins: ther role in cellular recognition. // Biol. Cell. 1984. V. 51. № 2. P. 219-226.

67. Regoeczi E., Chimdemi P.A., Matton M.W.C., Berry L.K. Galactose specific elimination of human asialotrasferrin by the bone marrow of the rabbit. // Arch. Biochem. Biophys. 1980. V. 205. № 1. P.76-84.

68. Kawasaki Т., Askwell G. Isolation and characterization of an avian hepatic binding protein specific for N-acetylglucosamine terminated proteins. // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. № 12. P. 6536-6543.

69. Васильев A.E., Давыдов А.Б. Макромолекулярные терапевтические системы: проблемы и перспективы. // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1985. Т. 30. № 4. С. 395-401.

70. Туркова Я. Аффинная хроматография. И М.: Мир. 1980. С. 354.

71. Torchilin V.P. Immobilized enzymes in medicine. // Berlin: Springerr-Verlag. 1991. P. 206.

72. Zee-Cheng R.K.J., Cheng C.C. Delivery of anticancer drugs. // Meth. And Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1989. V. 11. № 7-8. P. 439-529.

73. Molderg E.P. Polymeric affinity drugs. П: Midland macromolecular monograph. / Ed. Elias H.J. New York: Gordon and Breach. 1978. Ser. 5. P. 227.

74. Murrayi G.T., Doeber T.W., Shen I.Y., Wu M.S., Ponpipona M.M., Bugianesi R.L., Brady R.O., Barranger F.A. Targeting of synthetically glycozylated human placental glucocerebrosidase. // Biochem. Med. 1985. V. 34. №1. P. 241-250.

75. Sevilla C.L., Mahle N.H., Boylan C.M., Callwaert D.M. Plasminogen activator antihuman fibrinogen conjugates. I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 130. № 1. P. 91-94.

76. Торчилин В.П., Максименко A.B., Паписов М.И., Смирнов В.Н. Фибринолитическое действие ферментного препарата, конъюгированного со специфическими антителами. II Бюлл. эксперим. биол. мед. 1984. Т. 98. №11. С. 556-559.

77. Cornu L., Michaux J.L., Socal G., Trouet A. Cancerolytic agents based on antibiotics combined through dextrane with antibodies. // Eur. J. Cancer. 1974. V. 10. № 1. P. 695-700.

78. Chang M.S. Magnetic transport. // Drug carriers in biology and medicine. London: Academic Press. 1981. P. 271-273.

79. Tanaka Т., Matsunaga T. Fully automated chemiluminescence immunoassay of insulin using antibody-protein A-bacterial magnetic particle complexes. // Anal. Chem. 2000. V. 72. № 15. P. 3518-3522.

80. Pulfer S.K., Gallo G.M. Enhanced brain tumor selectivity of cationic magnetic polysaccharide microspheres. // J. Drug. Target. 1998. V. 6. № 3. P. 215-217.

81. Данилов Ю.Н., Рудченко C.A., Самохин Г.М. Концентрирование магнитных носителей на основе эритроцитов в сосудистом русле. II Бюлл. эксперим. биол. мед. 1985. Т. 12. № 4. С.701-705.

82. Lübbe A.S., Bergemann С. Riess Н., Schriever F., Reichardt P., Possinger К., Matthias M., Dorken В., Herrmann F., Gurtler R., Hohenberger P., Haas N., Sohr R., Sander В., Lemke A.J., Ohlendorf D., Huhnt W., Huhn D.

83. Clinical experiences with magnetic drug targeting: a phase I study with 4'epidoxorubicin in 14 patients with advanced solid tumors. // Cancer. Res. 1996. V. 56 № 20. P. 4686-4693.

84. Киселев Jl.Jl. Молекулярная онкология. II ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1986. Т. 31. № 1. С. 242-254.

85. Biomedical applications of immobilized enzymes and proteins. / New York: Plenum Press. 1977. V. 1, 2. P. 285.

86. Flynn G., Hackett T.J., McHale L., McHale A.P. Magnetically responsive photosensitizing reagents for possible use in photoradiation therapy. И Cancer Letters. 1994. V. 78. № 1. P. 109-114.

87. Торчилин В.П. Иммуноконъюгаты на основе комплексообразующих полимеров: новые агенты для диагностики. // Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 279-297.

88. Suzuki М., Shinkai М., Kamihira М., Kobayashi Т. Preparation and characteristics of magnetite-labelled antibody with the use of poly(ethylene glycol) derivatives. //Biotechnol. Appl. Biochem. 1995. V. 21. № 3. P. 335-345.

89. Шимолис М.И. Магнитные жидкости. II Успехи физ. наук. 1974. Т. 112. №3. С. 427-450.

90. Практикум по высокомолекулярным соеднениям. / Ред. Кабанов В.А. М.: Химия. 1985. С. 223.

91. Ito S., Hirasa О., Yamaulhi A. Synthesis of thermo-responsive polyacrylamide derivatives. // Kobunshi Ronbunshu. 1989. V. 46. № 2. P. 427428.

92. Eliassaf E. Aqueous solutions of poly-(N-isopropylacrylamide) // J. Appl. Polym. Sci. 1978. V. 22. № 3. P. 873-874.

93. Лебедева Т.Л., Мальчугова О.И., Валуев Л.И., Платэ Н.А. ИК

94. Фурье-спектроскопическое изучение гидрофильно-гидрофобного баланса в водных растворах N-алкилзамещенных полиакриламидов. II Высокомолек. соед. 1992. Т. 34-А. № 9. С. 113-122.

95. Yoshida R., Sakai К., Okano Т., Sakurai Y. Modulating the phase transition temperature and thermos ens itivity in N-isopropylacrylamide copolymer gels. //J. Biomater. Sci. Polum. Ed. 1994. V. 6. № 6. P. 585-598.

96. Vernon В., Kim E.J., Pfuster M., Pettit. G.R. Temperature-responsive delivery systems for phenstatin. // Proceed. 30th Annual Meeting Glasgow: Control Rel. Soc. 2003. P. 162.

97. Bae Y.H., Okano Т., Kim S.W. "On-off" thermocontrol of solute transport. II. Solute release from thermos ens itive hydrogels. // Pharm. Res. 1991. V. 8. № 5. P. 624-628.

98. Zhang X.Z., Wu D.Q., Chu C.C. Synthesis, characterization and controlled drug release of thermosensitive IPN-PNIPAAm hydrogels. // Biomaterials. 2004. V. 25. № 17. P. 3793-3805.

99. Shin Y., Chang J.H., Liu J., Williford R., Shin Y., Exarhos G.J. Hybrid nanogels for sustainable positive thermosensitive drug release. // J. Control. Release. 2001. V. 73. № l.P. 1-6.

100. Gutowska A., Bae Y.H., Jacobs H., Mohammad F., Mix D., Feijen J. Kim S.W. Heparin release from thermosensitive polymer coatings: in vivo studies. II J. Biomed. Mater. Res. 1995. V. 29. № 7. P. 811-821.

101. Ramkissoon-Ganorkar С., Liu F., Baudys M., Kim S.W. Modulating insulin-release profile from pH/thermosensitive polymeric beads through polymer molecular weight. // J. Control. Release. 1999. V. 59. № 3. P. 287-298.

102. Ogawa Y., Ogawa K., Kokufuta E. Swelling-shrinking behavior of a polyampholyte gel composed of positively charged networks with immobilized polyanions. I I Langmuir. 2004. V. 20. № 7. P. 2546-2552.

103. Mujumdar S.K., Siegel R.A. Monomer substituted effects on pH dependent swelling of N-isopropylacrylamide-a-alkulacrylic acid hydrogels. // Controlled Release Society. 32nd Annual Meeting & Exposition TRANSACTIONS. Miami Beach. 2005. P. 402.

104. Vihola H., Laukkanen A., Hirvonen J., Tenhu H. Binding and release of drugs into and from thermosensitive poly(N-vinylcaprolactam)nanoparticles. I I Eur. J. Pharm. Sci. 2002. V. 16. № 1-2. P. 6974.

105. Wu J.Y., Yang Y.Y., Heng P.W.S., Moochhala S. Evaluating protein release and interactions with thermosensitive PNIPAAm hydrogels. // Controlled Release Society. 30th Annual Meeting & Exposition. Glasgow. 2003. P. 696.

106. Wu J.Y., Liu S.Q., Heng P.W., Yang Y.Y. Evaluating proteins release from, and their interactions with, thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide)hydrogels. // J. Control. Release. 2005. V. 102. № 2. P. 3161-372.

107. Yoshida R., Sakai K., Okano T., Sakurai Y. Surface-modulated skin layers of thermal responsive hydrogels as on-off switches: II. Drug permeation. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1992. V. 3. № 3. P. 243-252.

108. Hayashi H., Kono K., Takagishi T. Temperature sensitization of liposomes using copolymers of N-isopropylacrylamide. // Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. №3. P. 412-418.

109. Ichikawa H., Fukumori Y. A novel positively thermosensitivecontrolled release microcapsule with membrane of nano-sized poly(N-isopropylacrylamide)gel dispersed in ethylcellulose matrix. // J. Control. Release. 2000. V. 63. № 1-2. P. 107-119.

110. Kim M.H., Kim J.C., Lee H.Y., Kim J.D., Yang J.H. Release property of temperature-sensitive alginate beads containing poly(N-isopropylacrylamide). // Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 2005. V. 46. № 1. P. 57-61.

111. Jeong B., Bae Y.H., Lee D.S., Kim S.W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. // Nature. 1997. V. 388. P. 860862.

112. Jeong B., Choi Y.K., Bae Y.H., Zentner G., Kim S.W. New biodegradable polymers for injectable drug delivery systems. // J. Control. Release. 1999. V. 62. № 1-2. P. 109-114.

113. Chen S., Singh J. Controlled delivery of testosterone from smart polymer solution based systems: in vitro evaluation. // Int. J. Pharm. 2005. V. 295. № 1-2. P. 183-190.

114. Singh J., Chen S. Controlled release of growth hormone from thermos ens itive triblock copolymer: in vitro and in vivo evaluation. // Controlled Release Society. 32nd Annual Meeting & Exposition TRANSACTIONS. Miami Beach. 2005. P. 442.

115. Jeong B., Bae Y.H., Kim S.W. Drug release from biodegradable injectable thermos ens itive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. // J. Control. Release. 2000. V. 63. № 1-2. P. 155-163.

116. Li Z., Ning W., Wang J., Choi A., Lee P.Y., Tyagi P., Huang L. Controlled gene delivery system based on thermosensitive biodegradable hydrogel ¡1 Pharm. Res. 2003. V. 20. № 6. P. 884-888.

117. Chen S., Pieper R., Webster D.C., Singh J. Triblocj copolymers: synthesis, characterization and delivery of a model protein. // Int. J. Pharm. 2005. V. 288. № 2. P. 207-218.

118. Chen S., Singh J. In vitro release of levonorgestrel from phasesensitive and thermosensitive smart polymer delivery systems. // Pharm. Dev. Technol. 2005. V. 10. № 2. P. 319-325.

119. Bhattarai N., Ramay H.R., Gunn J., Matsen F.A., Zhang M. PEG-grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release. // J. Control. Release. 2005. V. 103. № 3. P. 609-624.

120. Lee J.W., Jung M.C., Park H.D., Park K.D., Ryu G.H. Synthesis and characterization of thermosensitive chitosan copolymer as a novel biomaterial. //J. Biomater. Sei. Polym. Ed. 2004. V. 15. № 8. P. 1065-1079.

121. Ohya Y., Toyohara M., Sasakawa M., Arimura H., Ouchi T. Thermosensitive biodegradablepolydepsipeptide. II Macromol. Biosci. 2005. V. 5. № 4. P. 273-276.

122. Zimm B.H. The scattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions. // J. Chem. Phys. 1948. V. 16. № 6. P. 10931099.

123. Kratky O., Porod G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. II Ree. Trav. Chim. Pays-Bas. 1949. V. 68. № 6. P. 1106-1123.

124. Boudet C., Iliopoulos I., Poncelet O., Cloitre M. Control of the chemical cross-linking of gelatin by a thermosensitive polymer: example of switchable reactivity. II Biomacrimolecules. 2005. V. 6 № 6. P .3073-3078.

125. Acharya A., Mohan H., Sabharwal S. Radiation chemical studies of thermosensitive N-isopropylacrylamide and its polymer in aqueous solutions. // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2003. V. 44. № 4. P. 335-343.

126. Mori S., Nakata Y., Endo H. Purification of rabbit C-reactive protein by affinity precipitation with thermosensitive polymer. // Protein Expr. Purif. 1994. V. 5. № 2. P. 153-156.

127. Lebon F., Bignotti F., Penco M., Gangemi R., Longhi G., Abbate S.

128. Detection by circular dichroism of conformational transitions in pH and thermosensitive copolymers based on N-isopropylacrylamide and N-methacryloyl-L-leucine. // Chirality. 2003. V. 15. № 3. P. 251-255.

129. Labonesse J., Gervais M. Preparation of chemically defined e-N-acetylated trypsin. //Europ. J. Biochem. 1967. V. 2. № 1. P. 215-223.

130. Ding Z., Chen G., Hoffman A.S. Unusual properties of thermally sensitive oligomer-enzyme conjugates of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin. // J. Biomed. Mater. Res. 1998. V. 39. № 3. P. 498-505.

131. Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V.19. P. 924-932.

132. Petersen Т.Е., Roberts H.R., Sottrup-Jensen L., Magnuson S. Primary structure of hirudin, a thrombin-specific inhibitor. 11 Protides of the Biological Fluids. 1976. V. 23. № 2. P. 145-149.

133. Eeckman F., Moes A. J., Amighi K. Evaluation of a new controlled-drug delivery concept based on the use of thermoresponsive polymers. // Int. J. Pharm. 2002. V. 241. № 1. P. 113-125.

134. Kopecek J., Kopeckova P., Brondsted H., Rathi R., Rihova В., Yeh P.-Y., Ikesue K. Polymers for colon-specific drug delivery. // J. Controlled Release. 1992. V. 19. № 1. P. 121-130.

135. Agarwal L., Nazzal S., Reddy I.K., Khan M.A. Transport studies ofinsulin across rat jejunum in the presence of chicken and duck ovomucoids. I I J. Pharm. Pharmacol. 2001. V. 53. № g. P.l 131-1138.

136. Старосельцева JI.К. Межмолекулярные основы механизма действия инсулина. //ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1973. Т. 3. № 1. С.173-182.

137. Murray R., Granner D., Mayes P., Rodwell V. Harper's Biochemistry. / Norwalk, Connecticut/San Mateo, California: Appleton & Lange, 1988. 288 p.

138. Safran M. Oral administration of insulin: Imitating the natural pathway. // Targeting of drugs 3: The challenge of Peptides and Proteins. / Ed. Gregoriadis G. New York: Plenum press. 1992. P. 89-95.

139. Banting F.G., Best C.H. The internal secretion of the pancreas. // J. Lab. Clin. Med. 1922. V. 7. № 2. P. 464-472.

140. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. / M.: Просвещение. 1987. 815 с.

141. Lindsay D.G., Shall S. Monosudstituted 2,2,-Dimethyl-3-Formyl-L-Tiazolidine-4-Carbonyl-Insulins. I I Eur. J. Biochem. 1970. V. 15. P. 547-554.

142. Lindsay D.G. Intramolecular cross-linked insulin. I I FEBS Lett.1971. V. 21. №1. P. 105-108.

143. Brandenburg D. Preparation of If41, IfB29 Adipoylinsulin, an Intramolecular Crosslinked Derivative of Beef Insulin. // Z. Physiol. Chem.1972. V. 353. №4. S. 869-873.

144. Lindsay D.G., Shall S. The Acetylation of Insulin. // Biochem J. 1971. V. 121. №5. P. 737-745.

145. Levy D. The esterification of insulin with triethyloxoniam tetrafluoroborate. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 310. № 3. P. 406-415.

146. Brownlee M., Cerami A. A Glucose-controlled insulin-delivery system: semisynthetic insulin bound to lectin. // Science. 1979. V. 206. № 10. P. 1190-1191.

147. Hashimoto M., Takada K., Kiso Y., Muranishi S. Synthesis of palmitoyl derivatives of insulin and their biological activities. // Pharmaceut. Research. 1989. V. 6. № 2. P. 171-176.

148. Muranishi S., Murakami M., Hashidzume M., Yamada K., Tajima S., Kiso Y. Trials of lipid modification of peptide hormones for intestinal delivery. I I J. Conrolled Release. 1992. V. 19. № 2. P. 179-188.

149. Hashizume M., Douen T., Murakami M., Yamamoto A., Takada K., Muranishi S. Improvement of Large Intestinal Absorption of Insulin by Chemical Modification with Palmitic Acid in Rats. // J. Pharm. Rharmol. 1992. V. 44. № 3. P. 555-559.

150. Haga M., Saito K., Shimaya T., Maezava Y., Kato Y., Kim S.W. Hypoglycemic effect of intestinally administered monosaccharide-modified insulin derivatives in rats. // Chem. Pharm. Bull. 1990. V. 38. № 7. P. 19831986.

151. Hovgaard L., Mack E.J., Kim S.W. Insulin stabilization and GI absorption. //J. Controlled Release. 1992. V. 19. № 1. P. 99-108.

152. Lee S., Kim K., Kumar T.S., Lee J., Kim S.K. Lee D.Y., Lee Y.K., Byun Y. Synthesis and biological properties of insulin-deoxycholic acid chemical conjugates. // Bioconjug. Chem. 2005. V. 16. № 3. P. 615-620.

153. Malkov D., Angelo R., Wang H.Z., Flanders E., Tang H., Comez-Orellana I. Oral delivery of insulin with the eligen technology: mechanistic studies. II Curr. Drug Deliv. 2005. V. 2. № 2. P. 191-197.

154. Singh M., Vasudevan P., Sinha T.J.M., Ray A.R., Misro M.M.,

155. Guha К. An insulin delivery system from oxidized cellulose. // J. Biomed. Mater. Res. 1981. V. 15. № 3. P. 655-661.

156. Власов Г.П., Изварина И.Д., Илларионов И.Г. Синтез внутримолекулярного сшитого азоизобутирилинсулина и получение на его основе полимерных производных гормона. II Биохимия. 1981. Т. 46. № 5. С. 942-950.

157. Manosroi A., Bauer К.Н. Interactions of human insulin with DEAE-dextran. // Drug Development and Industrial Pharmacy. 1990. V. 16. № 5. P. 807-819.

158. Clement S., Dandona P., Still J.G., Kosutic G. Oral modified insulin (HIM2) in patients with type 1 diabetes mellitus: results from a phase //// clinical trial. II Metabolism. 2004. V. 53. № 1. P. 54-58.

159. Lobermann H., Paques E.P., Heimburger N. Insulin derivatives, a process for their preparation and their use. II Патент США N 5049545. 1991. A61K37/26. US 514/3.

160. Calceti P., Salmaso S., Walker G., Bernkop-Schnurch A. Development and in vivo evaluation of an oral insulin-PEG delivery system. // Eur. J. Pharm. Sci. 2004. V. 22. № 4. P. 315-323.

161. Швачкин Ю.П. Новый структурный аналог инсулина глицин-В30'-инсулин. //Биохимия. 1985. Т. 50. № 9. С. 1560-1561.

162. Burton P.S., Conradi R.A., Hilgers A.R., Но N.F.H., Maggiora L.L. The relationship between peptide structure and transport across epithelial cell monolayers. II J. Controlled Release. 1992. V. 19. № 1. P. 87-98.

163. Mrsny R.J. The colon as a site for drug delivery. // J. Controlled Release. 1992. V. 2. № 1. P. 15-34.

164. Touitou E. Enhancement of intestinal peptide absorption. I I J. Controlled Release. 1992. V. 21. № 2. P. 139-144.

165. Touitou E., Donbrow M., Rubinstein A. Effective intestinal absorption of insulin in diabetic rats using a new formulation approach. II J. Pharm .Pharmacol. 1980. V. 32. № 1. P. 108-110.

166. Nishihata T., Rytting J.H., Kamada A., Higushi T. Enhanced intestinal absorption of insulin in rats in the presence of sodium 5-methoxysalicylate. II Diabetes. 1981. V. 30. № 8. P. 1065-1067.

167. Hovgaard L., Mack E.J., Kim S.W. Promoter effects on insulin stabilization and oral absorption. // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. Salt Lake City: Pharm.Univ. Utah. 1991. V. 18. P.621-622.

168. Li Y., Shao Z., Mitra A.K. Dissociation of insulin oligomers by bile salt micelles and its effect on a-chymotrypsin-mediated proteolytic degradation. // Pharmaceut. Res. 1992. V. 9. № 7. P. 864-869.

169. Shilling R.J., Mitra A.K. Intestinal mucosal transport of insulun. // Internat. J. Pharmaceut. 1990. V. 62. № 1. P. 53-64.

170. Katsuma M., Watanabe S., Kawai H., Takemura S., Sako K. Effect of absorption promoters of insulin absorption through colon-targeted delivery. I I Int. J. Pharm. 2006. V. 307. № 2. P. 156-162.

171. Ziv E., Kidron M., Berry E.M., Bar-On H. Bile salts promote the absorption of insulin from rat colon. II Life Sciences. 1981. V. 29. № 8. P. 803809.

172. Kidron M., Bar-On H., Berry E.M., Ziv E. The absorption of insulin from various regions of the rat intenstine. // Life Sciences. 1982. V. 31. № 25. P. 2837-2841.

173. Laskowski M., Jr, Haessler H.A., Miech R.P., Peanasky R.J, Laskowski M. Effect of trypsin inhibitor on passage of insulin across the intestinal barrier. // Science. 1958. V. 127. № 9. P. 1115-1116.

174. Jederstrom G., Grasjo, Nordin A., Sjoholm I., Andersson A. Blood glucose-lowering activity of a hyaluronan-insulin complex after oraladministration to rats with diabetes. // Diabetes Technol. Ther. 2005. V. 6. № 7. P. 948-957.

175. Lee S., Lee J., Lee D.Y., Kim S.K., Lee Y., Byun Y. A new drug carrier, Nalpha-L-:-lysyl-methylester, for enhancing insulin absorption in the intestine. I I Diabetologia. 2005. V. 48. № 3. P. 405-411.

176. Danforth E., Moore R.O. Intestinal absorption of insulin in the rat. //Endocrinology. 1959. V. 65. № 1. P. 118-123.

177. Fujii S., Yokoyama Т., Ikegaya K., Sato F., Yokoo N. Promoting effect of the new chymotrypsin inhibitor FK-448 on the intestinal adsorption of insulin in rats and dogs. // J. Pharm. Pharmacol. 1985. V. 37. № 3. P. 545-549.

178. Bai J.P.F., Chang L.L. Insulin-degrading enzyme limiting insulin absorption across the ileal and colonic epitheleum. // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioac. Mater. Nice: Control. Rel. Soc. Inc. 1994. V. 21. P. 66-67.

179. Marschütz M.K., Bernkop-Schnurch A. Oral peptide drug delivery: polymer-inhibitor conjugates protecting insulin from enzymatic degradation in vitro. II Biomaterials. 2000. V. 21. № 14. P. 1499-1507.

180. Kidron M., Krausz M.M., Raz I., Bar-On H., Ziv E. The absorption of insulin. II Tenside Surf. Det. 1989. V. 26. № 3. P. 352-354.

181. Сологуб Л.И., Пашковская И.С., Сухорская И.Е. Расщепление инсулина ферментами клеток животных и человека. II Проблемы эндокринологии. 1990. Т. 36. № 2. С. 90-95.

182. Woodley J.F., Blanco-Mendez J., Kenworthy S. Cyclodextrins inhibit peptide degradation by intestinal brush border but not luminal enzymes. И Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioac. Mater. Nice: Control. Rel. Soc. Inc. 1994. V. 21. P. 64-65.

183. Xia C.Q., Wang J., Shen W.C. Hypoglycemic effect of insulin-transferrin conjugate in streptozotocin-induced diabetic rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. V. 295. № 2. P. 594-600.

184. Kavimandan N.J., Losi E., Peppas N.A. Novel delivery system based on complexation hydrogels as delivery vehicles for insulin-transferrin conjugates. // Biomaterials. 2006. V. 27. № 20. P. 3846-3854.

185. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.:"Мир". 1991. 544 с.

186. Иммобилизованные ферменты. / Ред. Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К.М.:Издательство Московского Университета. 1976. Т. 1. 296 с.

187. Plate N.A., Valuev L.I., Valueva Т.А., Chupov V.V. Biospecific haemosorbent based on proteinase inhibitor. // Biomaterials. 1993. V. 14. № 1. P. 51-56.

188. Hashimoto M., Takada K., Kiso Y., Muranishi S. Synthesis of palmitoyl derivatives of insulin and their biological activities. // Pharmaceut. Research. 1989. V. 6. № 2. P. 171-176.

189. Schilling R.J., Mitra A.K. Degradation of insulin by trypsin and alpha-chymotrypsin. // Pharmaceut. Recearh. 1991. V. 8. № 6. P. 721-727.

190. Klokkers-Bethke K., Fisher W. Development of the multiple unit drug delivery system for positioned release in the gastrointestinal tract. // J. Controlled Release. 1991. V. 15. № 1. P. 105-112.

191. Lehmann K., Petereit H.-U. Entering coating and delayed dissolution in the intestine at higher pH. // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioac. Mater. Nice: Control. Rel. Soc. Inc. 1994. V. 21. P. 682-683.

192. Greenley R.Z., Brown T.M., Vogt C.E., Zia H., Rodgers R.L.,

193. Christie ML, Luzzi L.A. Polymer matrices for oral delivery. // Polym. Prepr. 1990. V. 31. №2. P. 182-183.

194. Senthil Rajan D., Mandal U.K., Veeran Gowda K., Bose A., Ganesan M., Pal T.K. Oral delivery system of insulin microspheres: effect on relative hypoglycemia of diabetic albino rats. // Boll. Chim. Pharm. 2004. V. 143. №8. P. 315-318.

195. Jain D., Panda A.K., Majumdar D.K. Eudragit S100 entrapped insulin microspheres for oral delivery. I I AAAPS Pharm. Sci. Tech. 2005. V. 6. № 1. P. 100-107.

196. Nakamura K., Murray R.J., Joseph J.I., Peppas N.A., Morishita M., Lowman A.M. Oral insulin delivery using P(MAA-g-EG) hydrogels: effects of network morphology on insulin delivery characteristics. 11 J. Controlled Release. 2004. V. 95. № 3. P. 589-599.

197. Kim B., Peppas N.A. In vitro release behavior and stability of insulin in complexation hydrogels as oral drug delivery carriers. 11 Int. J. Pharm. 2003. V. 266. № 1-2. P. 29-37.

198. Lopez J.E., Peppas N.A. Effect of poly(ethylene glycol) molecular weight and microparticle size on oral insulin delivery from P(MAA-g-EG) microparticles. // Drug Dev. Ind. Pharm. 2004. V. 30. № 5. P. 497-504.

199. Sajeesh S., Sharma C.P. Novel pH responsive polymethacrylic acid-chitosan-polyethylene glycol nanoparticles for oral peptide delivery. // J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 2006. V. 76. № 2. P. 298-305.

200. Mahkam M. Using pH-sensitive hydrogels containing cubane as a crosslinking agent for oral delivery of insulin. // J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 2005. V. 75. № 1. P. 108-112.

201. Kim Y.-H., Bae Y.H., Kim S.W. pH/Temperature-sensitive polymers for macromolecular drug loading and release. I I J. Controlled Release. 1994. V. 28. № 2. P. 143-152.

202. Nam K., Watanabe J., Ishihara K. Modeling of swelling and drug release behavior of spontaneously forming hydrogels composed of phospholipid polymers. II Int. J. Pharm. 2004. V. 275. № 1-2. P. 259-269.

203. Kwon I.C., Bae Y.H., Kim S.W. Electrically erodible polymer gel for controlled release of drugs. // Nature. 1991. V. 354. № 2. P. 291-293.

204. Safran M., Kumar G.S., Savariar C., Burnham J.C., Williams F., Neckers D.C. A new approach to the oral administration of insulin and other peptide drugs. II Science. 1986. V. 233. № 9. P. 1081-1084.

205. Yang C.Z., Xu J., Hu J.L., Zhang Z.B., Wu D.C., Zhao B.Q.

206. Biodistribution and therapeutic effect of orally administrated insulinnanocapsules on experimental diabetes. // Internat. Diabetes Federation Congress. Kobe: Pharm. Inc. 1994. P. 251.

207. Safran M., Kumar G.S., Neckers D.C., Pena J., Jones R.H., Field J.B. Biodegradable azopolymer coating for oral delivery of peptide drugs. // Biochem. Soc. Trans. 1990. V. 18. № 5. P. 752-754.

208. Qi R., Ping Q.N. Gastrointestinal absorption enhancement of insulin by administration of enteric microspheres and SNAC to rats. // J. Microencapsul. 2004. V. 21. № 1. P. 37-45

209. Radwant M.A., Aboul-Enein H.Y. The effect of oral absorption enhancers on the in vivo perfomance of insulin-loaded poly(ethylcyanoacrylate) nanospheres in diabetic rats. I I J. Microencapsul. 2002. V. 19. № 2. P. 225-235.

210. Kopecek J., Kopeckova P., Brondsted H., Rathi R., Rihova B., Yeh P.-Y., Ikesue K. Polymers for colon-specific drug delivery. // J.Controlled Release. 1992. V. 19. № 1. P. 121-130.

211. Koch H.P. Controlled drug delivery systems. // Sci. Pharm. 1991. V. 59. №1. P. 85-100.

212. Radai R., Rubenstein A. In vitro and in vivo analysis of colon specificity of calcium pectinate formulations. // Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioac.Mater. Jerusalem: Control. Rel. Soc. Inc. 1993. V. 20. P. 330-331.

213. Damge C., Michel C., Aprahamian M., Couvreur P., Devis-saguet J.P. Nanocapsules as carriers for oral peptide delivery. // J. Controlled Release. 1990. V. 13. №2. P. 233-239.

214. Yang C.Z., Xu J., Hu J.L., Zhang Z.B., Wu D.C., Zhao B.Q. Biodistribution and therapeutic effect of orally administrated insulinnanocapsules on experimental diabetes. // Internat. Diabetes Federation

215. Congress. Kobe: Pharm. Inc. 1994. P. 251.

216. Damge C., Vranckx H., Balschmidt P., Couvreur P. Poly (alkyl cyanoacrylate) nanospheres for oral administration of insulin. // J. Pharm. Sci. 1997. V. 86. № 12. P. 1403-1409.

217. Hou Z.Q., Zhang Z.X., Xu Z.H., Zhang H., Tong Z.F., Leng Y.S. The stability of insulin-loaded polybutylcyanoacrylate nanoparticles in an oily medium and the hypoglycemic effect in diabetic rats. // Yao Xue Xue Bao. 2005. V. 40. № l.P. 57-64.

218. Attivi D., Wehrle P., Ubrich N., Damge C., Hoffman M., Maincent P. Formulation of insulin-loaded polymeric nanoparticles using response surface methodoly. // Drug Dev. Ind. Pharm. 2005. V. 31. № 2. P. 179-189.

219. Sajeesh S., Sharma C.P. Poly methacrylic acid-alginate semi-IPN microparticles for oral delivery of insulin: a preliminary investigation. // J. Biomater. Appl. 2004. V. 19. № 1. P. 35-45.

220. Onal S., Zihnioglu F. Encapsulation of insulin in chitosan-coated alginate beads: oral therapeutic peptide delivery. // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2002. V. 30. № 3. P. 229-237.

221. Kim B.Y., Jeong J.H., Park K., Kim J.D. Bioadhesive interactionand hypoglycemic effect of insulin-loaded lectin-microparticle conjugates in oral insulin delivery system. // J. Control. Release. 2005. V. 102. № 3. P. 525-538.

222. Cheng J., Teply B.A., Jeong S.Y., Yim C.H., Ho D., Sherifi I., Jon S., Farokhzad O.C., Khademhosseini A., Langer R.S. Magnetically responsive polymeric microparticles for oral delivery of protein drugs. // Pharm. Res. 2006. V. 23. № 3. P. 557-564.

223. Joshi H.M., Bhumkar D.R., Joshi K., Pokharkar V., Sastry M. Gold nanoparticles as carrier for efficient transmucosal insulin delivery. // Langmuir. 2006. V. 22. № 1. P. 300-305.

224. Spangler R.S. Insulin administration via liposomes. // Diabetes Care. 1990. V. 13. № 9. P. 911-922.

225. Zhang N., Ping Q.N., Xu W.F. Enhancing effect of Ulex europaeus agglutinin I modified liposomes on oral insulin absorption in mice. 11 Yao Xue Xue Bao. 2004. V. 39. № 12. P. 1006-1010.

226. Zhang N., Ping Q.N., Xu W.F. The enhancing effect of tomato lectin modified liposomes of insulin on oral absorption in mice. // Yao Xue Xue Bao. 2004. V. 39. № 5. P. 380-384.

227. Wu Z.H., Ping Q.N., Wei Y., Lai J.M. Hypoglycemic efficacy of chitosan-coated insulin liposomes after oral administration in mice. // Acta. Pharmacol. Sin. 2004. V. 25. № 7. P. 966-972.

228. Wu Z.H., Ping Q.N., Song Y.M., Lei X.M., Li J.Y., Cai P. Studies on the insulin-liposomes double-coated by chitosan and chitosan-EDTA conjugates. I I Yao Xue Xue Bao. 2004. V. 39. № 11. P. 933-938.

229. Choudhari K.B., Labhasetwar V., Dorle A.K. Liposomes as a carrier for oral administration of insulin: effect of formulation factors. // J. Microencapsul. 1994. V. 11. № 3. P. 319-325.

230. Валуев Л.И., Валуева T.A., Маклакова И.А., Мосолов В.В., Платэ Н.А. Биоспецифический сорбент для удаления протеиназ из биологических тканей. II Вопр. мед. химии. 1985. Т. 31. № 4. С. 34-39.

231. Kunitz М. Crystalline soybean trypsin inhibitor, II General properties. //J. Gen. Physiol. 1947. V. 30. № 1. P. 291-295.

232. Greene L.J., Rigbi M., Fackre D.S. Trypsin inhibitor from bovine pancreatis juice. // J. Biol. Chem. 1966. V. 241. № 12. P. 5610-5612.

233. Валуев Л.И., Платэ H.A., Синани B.A., Чупов В.В. Особенности иммобилизации модифицированных белков с использованием реакции сополимеризации. И Биотехнология. 1986. Т. 3. С. 173-178.

234. Arakawa Y., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Effect of low-molecular-weight beta-cyclodextrin polymer on release of drugs from mucoadhesive buccal film dosage form. II Biol. Pharm. Bull. 2005. V. 28. № 9. P. 1679-1683.

235. Langoth N., Kahlbacher H., Schoffmann G., Schmerold I., Schuh

236. M., Franz S., Kurka P., Bernkop-Schnurch A. Thiolated chitosans: design and in vivo evaluation of a mucoadhesive buccal peptide drug delivery system. // Pharm. Res. 2006. V. 23. № 3. P. 573-579.

237. Dubolazov A.V., Nurkeeva Z.S., Mun G.A., Khutoryanskiy V.V. Design of mucoadhesive polymeric films based on blends of poly(acrylic acid) and (hydroxypropyl) cellulose. I I Biomacromolecules. 2006. V. 7. № 5. P. 16371543.

238. Vyas T.K., Babbar A.K., Sharma R.K., Misra A. Intranasal mucoadhesive microemulsions of zolmitriptan: preliminary studies on brain-targeting. // J. Drug Target. 2005. V. 13. № 5. P. 317-324.

239. Smart J.D. The basic and underlying mechanisms of mucoadhesion. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2005. V. 57. № 11. P. 1556-1568.

240. Cui F., Qian F., Yin C. Preparation and characterization of mucoadhesive polymer-coated nanoparticles. // Int. J. Pharm. 2006. V. 316. № 1-2. P. 154-161.

241. Serra L., Domenech J., Peppas N.A. Design of poly(ethylene glycol)-tethered copolymers as novel mucoadhesive drug delivery system. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2006. V. 63. № 1. P. 11-18.

242. Grabovac V., Bernkop-Schnurch A. Comparison of mucoadhesive properties of various polymers. // Controlled Release Society. 31st Annual Meeting & Exposition TRANSACTIONS. Honolulu, Hawaii. 2004. P. 714.

243. Brownlee M., Cerami A. A glucose-controlled insulin-delivery system: semisynthetic insulin bound to lectin. // Science. 1979. V. 206. № 10. P. 1190-1191.

244. Yeong S.Y., Kim S.W., Eenink M.J.D., Feijen Y. Self-regulating insulin-delivery systems. I. Synthesis and characterization of glycosylated insulin. //J. Control. Release. 1984. V. 1. № 1. P. 57-66.

245. Sato S., Yeong S.Y., McRea Y.C., Kim S.W. Self-regulating insulin-delivery systems. II. In vitro studies. // J. Control. Release. 1984. V. 1. № 1. P. 67-77.

246. Yeong S.Y., Kim S.W., Holmberg D.L., McRea Y.C. Self-regulating insulin-delivery systems. II. In vivo studies. // J. Control. Release. 1985. V. 1. № 2. P. 143-152.

247. Kim S.W., Pai C.M., Makino K., Semionoff L.A., Holmberg D.L., Gleeson Y.M., Wilson D.E., Mack E.Y. Self-regulated glucosylated insulin delivery. //J. Control. Release. 1990. V. 11. № 2. P.193-201.

248. Makino K., Mack E.Y., Okano T., Kim S.W. A microcapsule self-regulating delivery system for insulin. // J. Control. Release. 1990. V. 12. № 3. P. 235-239.

249. Liu F., Song S.C., Mix D., Baudys M., Kim S.W. Glucose-induced release of glycosylpoly(ethylene glycol) insulin bound to a soluble conjugate of concanavalin A. // Bioconjug. Chem. 1997. V. 8. № 5. P. 664-672.

250. Albin G., Horbett T.A., Ratner B.D. Glucose sensitive membrans for controlled delivery of insulin: insulin transport studies. I I J. Control. Release. 1985. V. 2. № 2. P. 153-164.

251. Kost Y., Wolfrum Y., Langer R. Magnetically enhanced insulin release in diabetic rats. //J. Biomed. Mater. Research. 1987. V.21. № 4. P. 787794.

252. Ito Y., Casolaro M., Kono K., Imanishi Y. An insulin-releasing system that is responsive to glucose. // J. Control. Release. 1989. V.10. № 2. P. 195-203.

253. Chu L.Y., Li Y., Zhu J.H., Wang H.D., Liang Y.J. Control of pore size and permeability of a glucose-responsive gating membrane for insulin delivery. // J. Control. Release. 2004. V. 97. № 1. P. 43-53.

254. Chu L.Y., Liang Y.J., Chen W.M., Ju X.J., Wang H.D. Preparation of glucose-semsitive microcapsules with a porous membrane and functional gates. // Colloids. Surf. B Biointerfaces. 2004. V. 37. № 1-2. P. 9-14.

255. Barbucci R., Casolaro M., Magnani A. The role of polyelectrolytes in the permeability control of insulin: behavior of poly(N-acryloyl-glycine) grafted on porous cellulose membrane. II J. Control. Release. 1991. V. 17. № 1.1. P. 79-88.

256. Chung D.-J., Ito Y., Imanishi Y. An insulin-realising membrane system on the basis of oxidation reaction of glucose. I I J. Control. Release. 1992. V. 18. № 1. P. 45-54.

257. Ito Y., Chung D.-J., Imanishi Y. Enzyme modification for glucose-sensitive insulin-releasing system. // Polymer Preprints. 1992. V. 33. № 2. P.92-93.

258. Гребнев A.JI. Пропедевтика внутренних болезней. / М.: «Медицина». 1995.592с.

259. Klumb L.A., Horbett Т.A. Design of insulin delivery devices on glucose sensitive membranes. // J. Control. Release. 1992. V. 18. № 1. P. 59-80.

260. Kost J., Horbett T.A., Ratner B.D., Singh M. Glucose-sensitive membranes containing glucose oxidase: activity, swelling, and permeability studies. //J. Biomed. Mater. Res. 1985. V. 19. № 9. P. 1117-1133.

261. Goldraich M., Kost J. Glucose-sensitive polymeric matrices for controlled drug delivery. I I Clin. Mater. 1993. V. 13. № 1-4. P. 135-142.

262. Shiino D., Murata Y., Kataoka K., Koyama Y., Yokoyama M., Okano Т., Sakurai Y. Preparation and characterization of a glucose-responsive insulin-releasing polymer device. // Biomaterials. 1994. V. 15. № 2. P. 121-128.

263. Matsumoto A., Ikeda S., Harada A., Kataoka K. Glucose-responsive polymer bearing a novel phenylborate derivative as a glucose-sensing moiety operating at physiological pH conditions. I I Biomacromolecules. 2003. V. 4. № 5. p. 1410-1416.

264. Matsumoto A., Yoshida R., Kataoka K. Glucose-responsive polymer gel bearing phenylborate derivative as a glucose-semsing moiety operating at the physiological pH. // Biomacromolecules. 2004. V. 5. № 3. P. 1038-1045.

265. DeGeest B.G., Jonas A.M., Demeestr J., DeSmedt S.C. Glucose-responsive polyelectolyte capsules. II Langmuir. 2006. V. 22. № 11. P. 50705074.

266. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Пектины. / Львов: «Вища Школа». 1981.156с.

267. Езриелев А.И., Брохина Э.Л., Роскин Б.С. Аналитический метод вычисления констант сополимеризации. //Высокомолек. соед. 1969. Т. И. №8. С. 1670-1680.

268. White M.L., Dorion G.H. Diffusion in a cross-linked acrylamide polymer gel. // J. Polym. Sci. 1961. V. 55. № 3. P. 731-740.

269. Kim J.J., Park K. Modulated insulin delivery from glucose-sensitive hydrogel dosage forms. // J. Control. Release. 2001. V. 77. № 1-2. P. 39-47.

270. Tanna S., Sahota Т., Clark J., Taylor M.J. Covalent coupling of concanavalin A to a Carbopol 934P and 941P carrier in glucose-sensitive gels for delivery of insulin. //J. Pharm. Pharmacol. 2002. V. 54. № 11. P. 1461-1469.

271. Tang M., Zhang R., Bowyer A., Eisenthal R., Hubble J. A reversible hydrogel membrane for controlling the delivery of macromolecules. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 82. № 1. P. 47-53.

272. Tanna S., Taylor M.J., Sahota T.S., Sawicka K. Glucose-responsive UVpolymerized dextran-concanavalin A acrylic derivatised mixtures for closed-loop insulin delivery. I I Biomaterials. 2006. V. 27. № 8. P. 1586-1597.

273. Tanna S., Sahota T.S., Sawicka K., Taylor M.J. The effect of degree of acrylic derivatisation on dextran and concanavalin A glucose-responsive materials for closed-loop insulin delivery. 11 Biomaterials. 2006. V. 27. № 25. P. 4498-4507.

274. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту академику Николаю Альфредовичу Платэ за всестороннюю поддержку на всех этапах работы и теплое отношение, которое, несомненно, всячески способствовало ее успешному завершению.

275. Автор выражает благодарность всем сотрудникам лабораторий модификации полимеров и химии медико-биологических полимеров, а также аспирантам и дипломникам этих лабораторий, принимавшим участие в проведении отдельных экспериментов.

276. Следует отметить, что проведение работы было бы невозможным без организационной и финансовой подержки Министерства РФ по науке и Федерального агентства по науке и инновациям.