Химический синтез длинных олигодезоксирибонуклеотидов N-метилимидазолидным фосфотриэфирным методом в растворе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

Обзор литературы).

1.1. Развитие химических методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов.

1.2. Защитные группы в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеотидов.

I.2.I. Защита гетероциклических оснований

1.2.1.1. Блокирование экзоциклических аминогрупп.

1.2.1.2. Защита оксо- и иминофункций остатков Gua и Thy.

1.2.2: Защита гидроксильных групп дезоксирибозы . 34 1.2.3. Защита фосфатных групп

1.3. Создание межнуклеотидной связи

1.3.1. Фосфотриэфирный метод.

1.3.2. Фосфитный метод.

1.4. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов растворным методом

1.5. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов на твердой фазе.

1.6. Удаление защитных групп, выделение и очистка полученных олигодезоксирибонуклеотидов, доказательство их структуры

1.6.1. Удаление защитных групп.

1.6.2. Выделение и очистка синтетических олигодезоксирибонуклеотидов

1.6.2.1. Хроматографические методы.

1.6.2.2. Электрофорез в полиакриламидном геле ♦

1.6.3. Анализ структуры синтетических олигодезоксирибонуклеотидов.

Глава II. ШЖЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДЛИННЫХ 0ЛИГ0ДЕ30КСИРИБ0-НУКЛЕОТИДОВ

Обсуждение результатов).

Глава Ш. ЭКШРИШНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Ш.1. Материалы.

Ш.1.1. Растворители

Ш.1.2. Реактивы.

Ш.1.3. Сорбенты.

Ш.2. Оборудование.

Ш.З. Методы.

Ш.3.1. Получение 5-0,И-защищенных дезоксирибонуклеозидов.

Ш.3,2. Получение З'-О-бензоил-^-ацилдезоксирибонуклеозидов.

Ш.3.3. Получение защищенных мононуклеотидов

Ш.3.4. Получение динуклеотидных блоков.

Ш.З.5. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов

Ш.З.6. Получение полностью деблокированных олигодезоксирибонуклеотидов

Ш.З.7. Выделение олигонуклеотидов после полного удаления защитных групп.134

ВЫВОДЫ.

Разработка методов синтеза олиго- и полинуклеотидов привлекает всё большее внимание исследователей. Это связано с тем, что синтетические олигонуклеотиды заданной структуры являются уникальными инструментами для решения важных молекулярно-биологических задач, для понимания различных биологических процессов на молекулярном уровне. Например, еще в 60-х годах благодаря доступности всех 64-х синтетических олигонуклеотидов, а также полирибонуклеотидов с чередующимися ди-, три- и тетранук-леотидными последовательностями стала возможной расшифровка генетического кода /1,2/. Достижения в области направленного химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот сделали возможным получение искусственных генетических структур, таких как биологически активный ген тирозиновой супрессорной тРНК из E.coli , полный синтез которого был впервые осуществлен в лаборатории Г.Кораны /3/. Последующее стремительное развитие синтетических методов привело к созданию целого ряда генов, например, пептидного гормона ангеотензина П /4/, лейцин-энкефалина /5/, соматостатина /6/, человеческого фактора роста /7/, гастропеп-тидов /8,9/, человеческого инсулина /10/, проинсулина /11-16/, гена белка рибонуклеазы s /11/ и некоторых других. Возможности химического синтеза иллюстрируют создание и экспрессия гена человеческого интерферрона dk2 (511 нуклеотидных остатков) /18/ и гена протеиназного ингибитора, белка эглин С ( eglin С) /19/.

Следует отметить, что среди'существующих в настоящее время способов получения генов, полный химический синтез имеет ряд преимуществ: I) возможность получения заранее запланированных последовательностей, в которые по желанию можно ввести регуля-торные элементы для экспрессии в прокариотических системах или подходящие сайты рестрикции; 2) отсутствие сложного этапа выделения соответствующей мРНК или геномной ДНК; 3) упрощение модификации гена и соответствующего ему белка путем удлинения или укорочения кодирующего участка гена, а также путем замены определенных кодонов (и соответственно, кодируемых ими. аминокислот) на другие. С другой стороны, синтетические олиго- и полинуклеотиды необходимы для выделения генов из природных источников (как специфические зонды для гибридизации и как прай-меры при обратной транскрипции) или для "редактирования" природных последовательностей.

Химический синтез олигонуклеотидов открывает возможности искусственного получения регуляторных элементов гена - таких как операторы, промоторы /5,20-23/, рибосом - связывающие участки /24/. Олигонуклеотиды используются в качестве линкеров и адаптеров при введении новых рестрикционных сайтов, а также для введения в ген регуляторных элементов. Олигодезоксирибонуклео-тиды зарекомендовали себя как исключительно специфичные, универсальные и эффективные мутагены in vitro /24/, являющиеся одновременно и инструментами для поиска мутантной ДНК /26/. С их помощью можно осуществлять точечные мутации, вызывая, например, замену всего лишь одной аминокислоты в активном центре фермента.

Широкое применение нашли олигодезоксирибонуклеотиды в определении первичной структуры ДНК /27/. Возможность быстрого синтеза коротких олигонуклеотидных фрагментов позволяет резко повысить скорость и качество определения. По данным авторов /28/ им удалось за небольшой промежуток времени сиквенировать клонированный в векторе MI3 фрагмент ДНК длиной 3000 нуклеотидов без разбивки его на более мелкие сегменты.

Доступность олиго- и полинуклеотидов, кроме того, делает возможным изучение физико-химических свойств нуклеиновых кислот, а также открывает широкие перспективы для изучения специфического взаимодействия нуклеиновых кислот с белками - явления узнавания, лежащего в основе многих фундаментальных биологических процессов.

Современные методы олигонуклеотидного синтеза (см.главу I) позволяют довольно быстро синтезировать 8-14-звенные последовательности, интенсивно используемые в молекулярно-биологических исследованиях. Однако существует и ряд проблем, в общих чертах рассматриваемых; в приводимом нихе литературном обзоре, с которыми приходится сталкиваться в процессе синтеза. Так например, общим недостатком используемых методов создания межнуклеотидной связи является значительное образование побочных соединений, таких как продукты модификации гетероциклических оснований и сульфонилирования нуклеозидного компонента реакции, что затрудняет получение более длинных синтетических последовательностей. Тем не менее, для некоторых целей использование более длинных одноцепочечных полинуклеотидов является весьма перспективным. Доступность 30-60-звенных фрагментов позволяет осуществлять сложные варианты направленного мутагенеза клонированных участков ДНК /25/ и открывает новые возможности для физических исследований нуклеиновых кислот. Наличие синтетических олигодезоксирибо-нуклеотидов - зондов длиной более 30 зреньев позволяет идентифицировать и выделять из природных объектов гены различных белков на основании информации, полученной анализом небольших фрагментов этих белков /29 ,30/. Большим преимуществом использования длинных фрагментов ДНК является существенное упрощение и ускорение процесса химико-ферментативного получения искусственных генетических структур. Ранее предложенный Г.Кораной с сотрудниками /6/ метод создания генов предполагает химический синтез всех составляющих обе комплементарные цепи будущего гена олиго-дезоксирибонуклеотидов (IO-15-звенных), с последующим соединением коротких фрагментов посредством ДНК-лигазы. Иной подход, позволяющий более чем на 40% сократить объем химического синтеза , состоит в использовании длинных химически синтезированных олигодйзоксирибонуклеотидов, имеющих попарно на З^-концах небольшие взаимокомплементарные участки. После отжига соответствующих олигонуклеотидов происходит достраивание их до двунитча-тых фрагментов ДНК посредством репарационного синтеза в присутствии ДНК-полимеразы I (Кленовского фрагмента) и четырех дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов Д9 ,31/.

Из всего выше сказанного следует, что разработка методов синтеза длинных олигодезоксирибонуклеотидов является весьма актуальной. Этой проблеме посвящена и данная работа, являющаяся частью исследований, проводимых в лаборатории химии белка Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Автор выражает свою глубокую признательность академику ЮЛ .Овчинникову за постоянное внимание к данной работе, а также старшим научным сотрудникам, кандидатам химических наук В.А. Ефимову и О.Г.Чахмахчевой за ценные советы и помощь в процессе работы и написания диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Разработан подход к химическому синтезу длинных олигодезоксирибонуклеотидов в растворе. Основными особенностями подхода являются: а) использование для создания межнуклеотиодной фосфотриэфир-ной связи высокоэффективных конденсирующих реагентов -арилсульфонилхлоридов в присутствии N-метилимидазола , что позволяет значительно сократить время, затрачиваемое на синтез и выделение олигонуклеотидов, при общем повышении качества синтезируемых последовательностей и их выходов ; кроме того, это создает возможность проведения межнуклео-тидных конденсаций не только в пиридине , являющемся традиционным растворителем для олигонуклеотидного синтеза, но и в других органических растворителях, таких как ацето-нитрил, нитрометан, дихлорэтан и др.,; б) применение обращенно-фазовой хроматографии для эффективной очистки промежуточных синтетических блоков, что позволяет при каждом следующем наращивании цепи исходить из олиго-меров высокой степени чистоты и способствует успешному протеканию реакции межнуклеотидной конденсации, а следовательно, и высокому выходу целевого продукта.

2. Сочетание использованных методов образования фосфотриэфирной связи с обращенно-фазовой хроматографией промежуточных и конечных соединений позволяет при синтезе в растворе повысить реальные выходы олигонуклеотидов по сравнению с выходами, обеспечиваемыми стандартным подходом, и надежно получать соединения с любым нуклеотидным составом с длиной цепи 16 и более мономерных звеньев.

3. Разработанный подход был применен для синтеза большого числа олигодезоксирибонуклеотидов длиной несколько десятков нуклео-тидных остатков , являющихся фрагментами генов проинсулина человека, фибробластного, лейкоцитарного и иммунного интер-феронов человека, гена бактериородопсина , а также некоторых генетических регуляторных элементов. Впервые в мире осуществлен химический синтез олигодезоксирибонуклеотида длиной в 62 нуклеотидных остатка, являющегося фрагментом гена препро-инсулина человека.

1. Khorana H.G., Biichi H.,Ghosh H., Gupta N., Jacob T.M., Kossel H,, Morgan R., Narang S.A., Ohtsuka E., Wells R.D. Polynucleotide Synthesis and the Genetic Code.- Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1966, v.31, p.39-49.

2. Khorana H.G., Biichi H., Jacob T.M. , Kossel H. , Narang S.A., Ohtsuka E. Studies on Polynucleotides. ЫХ. Polynucleotide Synthesis in Relation to the Genetic Code. General Introduction.- J.Am.Chen.Soc., 1967, v.89, N89, p.2154-2158.

3. Khorana H.G. Total Synthesis of a Gene. Science, 1979, v.203, NS 4381, p. 614-625.

4. Koster H., Blocker H., Prank R., Geussenhainer S., Kaiser W.

5. Total Synthesis of a Structural Gene for the Human Peptide Hormone1975,

6. Itakura K., Hirose T., Crea R., Riggs A.D, Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthesized Gene for the Hormone Somatostatin. Science, 1977, v.198, p.1056-1063.

7. Goeddel D.V., Heyneker H.L., Hozumi T., Arentzen R., Itakura K., Yansura D.G., Ross M.J., Miozzari G., Crea R., Seeburg P.H. Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for a human growth hormone. Nature, 1979» v. 281, p.544-548.

8. Urdea M.S., Merryweather J.P., Mulleribach G.T., Coit D., Heber-lein U., Valenzuella P., Barr P,J. Chemical synthesis of a gene for human epidermal growth factor urogastrone and its expression in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1983, v.80, p.7461-7465.

9. Crea R., KraszewskL A., Hirose 0?., Itakuxa K. Chemical synthesis Of genes for human insulin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1978,v. 75» P.5765-5769.

10. Ovchinnikov Yu.A., Efimov 7.A., Ivanova I.N., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.G., Skiba N.P.' Synthesis of DNA coding for human proinsulin. Gene, 1984, v.31, p. 65-78.

11. Brousseau R., Scarpulla R., Sung W., Hsiung H.M., Narang S.A.^

12. Wu R. Synthesis of a human insulin gene. V. Enzymatic assembly, ra.cloning and chacterization of the human proinsulin DNA. Gene, 1982, v.17, p. 279-280.

13. Nambiar K.P., Stackhouse J., Stauffer D.M., Kennedy Y.P., Eld-redge J.K., Benner S.A. Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein. Science, 1984, v.223, Ж 4642, p.1299-1300.

14. Dobrynin V.N., Korobko V.G., Severtsova I.V., Chuvpilo S.A., Bystrov N.S., Kolosov M.N. Synthesis of a model promoter for gene expression in Escherichia coli. Nucl.Acids Res.Symp. Series, 1980, № 7, p. 365-375.

15. De Haseth P.L., Goldman R.A., Gech C.L., Caruthers M.H. Chemical synthesis and biochemical reactivity of bacteriophage lambda PR promoter. Nucl.Acids Res., 1983, v.11, № 3,p.773-787.

16. Rommens J., Mac Knight D., Pomery-Cloney L., Jay ^ E. Gene expression: chemical synthesis and molecular cloning of a bacteriophage T5 (T5P25) early promoter. Nucl.Acids Res., 1983,v. 11, m 17, p. 5921-5940. ••

17. Jay E., Seth A.K. , Rommens J., Sood A., Jay G. &ene expression: chemical synthesis of E. coli ribosome binding sites and their use in directing the expression of mammalian proteins in bacteria. Nucl.Acids Res., 1982, v.10, N220, p.6319-6329.

18. Wallace R.B., Johnson P.F., Tanaka S., Schold M., Itakura K., Abelson J. Directed Deletion of a Yeast Transfer RNA Intervening Sequence. Science, 1980, v.209, № 44-63, p.1396-1400.

19. Smith M. Site-directed mutagenesis. Trends Biochem.Sci., 1982, NS 12, p. 440-442.

20. Sanger P., Coulson A.R., Barrel B.G., Smith A.G.H., Roe B.A., Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. J.Mol.Biol., 1980, v.143, № 2, p.161-178.

21. Hunkapiller M., Kent S., Caruthers M., Dreyer W., Pirca J.,

22. Griffin C., Horvath S., Hunkapiller Т., Tempst P., Hood L. feci iity

23. A microchemical for the analysis and synthesis of genes and proteins. Nature, 1984, v.310, № 12, p. 105-111.

24. Ullrich A., Berman C.H., Dull T.J., Gray A., Lee J.M. Isolation of the .human insulin-like growth factor I gene using a single synthetic DNA probe. EMBO Journ., 1984, v.3, N! 2, p. 361-364.

25. Rossi J.J., Kierzek R., Huang Т., Walker P.A., Itakura K.

26. An alternate method for synthesis of double-stranded DNA seg-. ments. J.Biol.Chem., 1982, v. 257, N2 16, p. 9226-9229.

27. Michelson A.M., Todd A.R. Nucleotides. Part XXXII. Synthesis of a Dithymidine Dinucleotide Containing a 3':5' Internucleo-tidic Lineage. J.Chem.Soc., 1955, № 8, p. 2632-2638.

28. Корана Г. Новые направления в химии биологически важных эфи-ров фосфорной кислоты, М.: Мир, 1964, с. 22-36.

29. Lohrmann R., Khorana H.G. Studies on Polynucleotides. Ы1. The Use of 2,4,6-Triisopropylbenzenesulfonyl Chloride for the Synthesis of Internucleotide Bond. J. Am.Chem.Soc., 1966, v. 88, KS 4, p. 829-833.

30. Грайфер Д.М., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Лебедев А.В., Рез-вухин А.И. Структура активного фосфорилирующего производногоот тфосфомоноэфиров по данным ЯМР Р и Н. Докл.Акад.Наук СССР, 1978, т. 242, р 3, с. 616-619.

31. Stav/inski J., Hozumi Т., Narang S.A., Bahl С.P., Wu R. Arylsul-fonyltetrazoles, new coupling reagents and further improvements in the triester method for the synthesis of deoxyribooligonuc-leotides. Nucl.Acids Res., 1977, v. 4, № 2, p. 353 - 371.

32. Stawinski J., Hozumi Т., Narang S.A. Arylsulfonyltetrazoles asa highly effective condensing reagents for polynucleotide synthesis. Can.J.Chem., 1976, v. 54, p. 670-672.

33. Reese C.B., Ubasawa A. Reaction between 1-arenesulfonyl-3-nitro -1,2,4-triazoles and nucleoside base residues. Elucidation of the nature of side reactions during oligonucleotide synthesis. - Tetrahedron letters, 1980, v. 21, Jfi 23, p.2265-2268.

34. Reese C.B., Skone P.A. The Protection of Thymine and Guanine Residues in Oligodeoxyribonucleotide Synthesis. J.Chem. Soc. Perkin Trans.I, 1984, Ш 6, p. 1263-1271.

35. Letsinger R.L., Lunsford V/.B. Synthesis of Thymidine Oligonucleotides by Phosphite Triester Intermediates. J.Am.Chem.Soc., 1976, v. 98, N2 12, p. 3655-3661.

36. Letsinger R.L., Finnan J.L., Heavner G.A., Lunsford W.B. Phosphite Coupling Procedure for Generating Internucleotide Links.- J.Am.Chem.Soc., 1975, v. 97, N811, p.3278-3279.

37. Кабачник M.M., Потапов В.К., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Новый метод синтеза межнуклеотидной связи с использованием полимерных носителей. Докл.Акад.Наук СССР, 1971,т.201,с.858-861.

38. Zhdanov R.I., Zhenodarova S.M. Chemical Methods of Oligonucleotide Synthesis. Synthesis, 1975, NS 4, p. 222-245.

39. Amarnath V., Broom A.D. Chemical Synthesis of Oligonucleotides.- Chem.Rev., 1977, v. 77, NS 2, p. 183-217.

40. Reese C.B. The chemical synthesis of oligo- and polly-nucleoti-des by the phosphotriester approach. Tetrahedron, 1978,v. 34, p. 3141-3179.

41. Ikehara M., Ohtsuka E., Markham A.F. The synthesis of polynucleotides. Adv.Carbohydr.Chem.Biochem., 1979, v.36, p.135-213.

42. Ohtsuka E., Ikehara M., Soil D. Recent developments in the chemical synthesis of polynucleotides. Nucl.Acids Res., 1982,v. 10, № 21, p. 6553-657o.

43. Davies J.E., Gassen H.G. Synthetic Gene Fragments in Genetic

44. Engineering The Renaissanse of Chemistry in Molecular Biology. - Angew. Chem. Int. Ed.Engl., 1983, v. 22, № 1, p. 13-31.

45. Narang S.A. DNA synthesis. Tetrahedron, 1983, v.39,№1, p.3-22.

46. Ralph R.K., Khorana H.G. Studies on Polynucleotides. XI. Chemical Polymerisation of Mononucleotides. The Synthesis and Characterisation of Deoxyadenosine Polynucleotides. J.Am. Chem.Soc., 1961, v. 83, N2 13, p. 2926-2934.

47. Brown E.L., Belagaje R., Ryan M.J., Khorana H.G. Chemical Synthesis and Cloning of a Tyrosine tRNA Gone. Methods Enzymol., 1979, v. 68, p. 109-151.

48. Watanabe K.A., Pox J.J. Eine einfache Methode zur selectiven Acylierung des Cytidins an der 4-Aminogruppe. Angew. Chem., 1966, v. 78, m 11, p. 589.

49. Neilson Т., Werstiuk E.S. Oligoribonucleotide Synthesis. II. Preparation of 2'-0-tetrahydropyranyl Derivatives of Adenosine and Cytidine Necessary for Insertion in Stepwise Synthesis. -Can.J.Chem., 1971, v. 49, N2 3, p. 493-499.

50. Hata T., Kurihara T. The N^-ben^oylation of deoxycytidilic and cytidilic acids by means of 2-chlormethyl-4-nitrophenylbenzoate. Chem. Lett., 1973, № 8, p.859-862.

51. Takaku H., shimada Т., Morita Y., Hata T. A convenient method for N^- benzoylation of cytidilic and deoxycytidilic acids by means of 0-ethy1-S-benzoyldithiocarbonate. Chem. Lett., 1976, H2 1, p. 19-22.

52. Steinfold A.V., Naider P., Becker J.M. A simple method for selective acylation of cytidines and cytosines under mild reaction conditions. J.Chem.Res.Synop., 1979, P* 129.

53. Igolen J., Morin C. Rapid synthesis of protected 2*-deoxy-cytidine derivatives. J.Org.Chem., v, 45, Ш 23, p.4802-4804.

54. Ti G.S., Gaffney B.L., Jones R.A. Transient Protection: Effective One-Flask Synthesis of Protected Deoxynucleosides. -J.Am.Chem.Soc., 1982, v. 104, № 5, p. 1316-1319.

55. Heikkila J., Chattopadhyaya J. The 9-fluorenylmethoxycarbo-nyl (Fmoc) group for the protection of aminofunctions of cytidine, adenosine, guanosine and their 2f-deoxysugar derivatives. Acta Chem.Scand., 1983, v.37B, №3, p. 263-265.

56. Heikkila J., Balgobin N., Chattopadhyaya J. The 2-nitrophe-nylsulfenyl (NPS) group for the protection of amino functions of cytidine, guanosine, adenosine and their 2f-de-oxysugar derivatives. Acta Chem.Scand., 1983, v. 37 В,1. Hi 9, p. 857-862.

57. Koster H. , Hoppe N., Kohli V., Kropelin M., Kaut H., Kuliko-wsfci K. Some improvements in the synthesis of DNA of biological interest. Nucl.Acids Res., Symp.Ser., 1980, N27,p.39-60.

58. Koster H., Kulikowski K., Liese T., Heikens W., Kohli V. N-acyl protecting groups for deoxynucleosides. A quantative and comparative study. Tetrahedron, 1981, v.37, N12, p.363-369.

59. Chattopadhyaya J.В., Reese C.B. The 9-Phenylxanten-9-yl-Protecting group. J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1978, № 15,p. 639-640.

60. Kohli V., Kumar A. Synthesis of deoxypolynucleotid.es a novel protecting group for deoxyguanosine. - Indian J. Chem.Ser.B, v.18,NS 3, p. 272-273.

61. Marrug J.E., Tromp M., Jhurani P., Hoyng C.F., van der Ma-rel G.A., van Boom J.H. Synthesis of DNA fragments by the hydroxybenzotriazole phosphotriester approach. Tetrahedron, 1984, v.40, № 1, p. 73-78.

62. Chattopadhyaya J.B., Reese G.B. Chemical synthesis of a tri-decanucleoside dodecaphosphate sequence of SV 40 DNA. -Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N! 9, p. 2039-2053.

63. Letsinger R.L., Miller P.S. Protecting Groups for Nucleosides Used in Synthesizing Oligonucleotides. J.Am.Chem.Soc.,1969, v. 91, N8 14, p. 3356-3359.

64. Ogilvie K.K., Nemer M.J., Hakimelahi G.H., Zbigniew P.A., Lucas M. N-Levulination of nucleosides. Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, N2 26, p. 2615-2618.

65. Rapoport H., Watkins B.E. Synthesis of benzyl and benzyl-oxycarbonyl base-blocked 2'-deoxyribonucleosides. J.Org. Chem., 1982, v. 47, № 23, p. 4471-4477.

66. Himmelsbach F., Pfleiderer W. The use of p-nitrophenyletho-xy-carbonyl group for aminoprotection in cytidine and adenosine chemistry. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, №34,p. 3583-3586.

67. Himmelsbach F., Schulz B.S., Trichtinger Т., Charubala R., Pfleiderer W. The p-nitrophenylethyl (Npe) group. A versatile new blocking group for phosphate and aglycone protection in nucleosides and nucleotides. Tetrahedron , 1984, v. 40,1, p. 59=72.

68. Kume A., Sekine M., Hata T. Phtaloyl group: a new amino protecting group of deoxyadenosine in oligonucleotide synthesis, Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, N2 42, p. 4365-4368

69. Kume A., Hata T., Sekine M. Further improvements ofoligodeoxyribonucleotide synthesis: synthesis of A^ on agnew silica gel support using N -phtaloyldeoxyadenosine. -Chem.Lett., 1983, NHO, p. 1597-1600.

70. Kume A., Iwase R., Sekine M., Hata T. Cyclic diacyl groupsgfor protection of the N -aminogroups of deoxyadenosine in oligodeoxynucleotide synthesis, Nucl.Acids Res., 1984, v. 12, № 22, p. 8525-8538.

71. Froehler B.C., Matteucci M.D. Dialkylformamidines: Depurignation resistant N -protecting groups for deoxyadenosine. -Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, № 22, p. 8031-8036.

72. Sung W.L. Synthesis of 4-(1,2,4-triazol-1-yl)pyrimidin-2(1H)-one Ribonucleotide and its application in the synthesis of Oligoribonucleotides. J.Org.Chem, 1982, v.47, N219, p. 3623-3628.

73. McBride L.J., Caruthers M.H. N6(N-methyl-2-pyrrolidine ami-dine) deoxyadenosine a new . deoxynucleoside protecting group. - Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, N2 29, p. 2953-2956.

74. Hayakawa Y., Aso Y., Uchiyama M., Noyori R. Chemoselective phosphorylation of N-unprotected nucleosides via aluminium alkoxides. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, № 50, p. 56415644.

75. Hayakawa Y., Uchiyama M., Royri R. A convenient method for the formation of internucleotide linkage. Tetrahedron Letters, 1984, V. 25, N236, p. 4003-4006.

76. Honda S., Urakami Ken-ichi, Koura K. , Terada K. , Sato Y. , Kohno K., Sekine M., Hata T. Synthesis of oligoribonucleotidesby use of S,S-diphenyl N-monomethoxytrityl ribonucleoside 3'-phosphorodithioates. Tetrahedron, 1984, v. 40, NS 1, p.153-164.

77. Broka C., Hozumi Т., Arentzen R., Itakura K. Simplifications in the synthesis of short oligonucleotide blocks. Nucl.Acids Res., 1980, v.8, NS 22, p.5461-5471.

78. Gao X., Gaffney B.L., Senior M., Riddle R.R., Jones R.A. Me-thylation of thymidine residues during oligonucleotide synthesis. Nucl.Acids Res. 1985, v. 13, №=2, p. 573-584.

79. Gaffney B.L., Jones R.A., Synthesis of 0-6-alkylated deoxy-guanosine nucleosides. Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, № 22, p. 2253-2256.

80. Gaffney B.L., Jones R.A. A new strategy for the protection of deoxyguanosine during oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, N3 22, p. 2257-2260.

81. Trichtinger Т., Charubala R., Pfleiderer W. Synthesis of 06-nitrophenylethyl guanosine and 2'-deoxyguanosine derivatives. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, NS 7, p. 711-714.t lL

82. Daskalov H.P., Sekine M., Hata T. Synthesis and propertiesсof 0 -substituted guanosine derivatives. Bull.Chem.Soc. Japan, 1981, v.54, № 10, p. 3076-3083.

83. Takaku H., Ueda S., Tomita Y. Dimethoxybenz/yl Group: a new protecting group for the guanine residue during oligonucleotide synthesis. Chem.Pharm.Bull., 1984, v.32, Hi 7,p. 2882-2885.

84. Sekine M., Matsusaki J., Hata T. A New Type of Protection Mode for the Guanine Residues by Using 1,2-Diisobutyriloxyethy-lene Group. Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, N2 50, p. 52875290.

85. Ogilvie K.K., Beaucage S.L. Fluoride ion promoted deprotection and transesterification in nucleotide triesters. Nucl.Acids Res., 1979, v. 7, № 3, p. 805-823.

86. Ocupniak J., Adamiak R.W., Wiewiorowski M. New conditions for a selective introduction of a trityl type protecting group into adenosine- and cytidine-З»-phosphates. Pol.J.Chem., 1981, v. 55, N2 3, p. 679-682.

87. Denny W.А., Leupin V/., Kearns D.R. Simplified liquid-phase preparation of four deca-deoxyribonucleotides and their preliminary spectroscopic characterisation. Helv.Chim.Acta,1982, v. 65, 8, p. 2372-2393.

88. Corey E.L,, Gras J.-L., Ulrich P. A new general method for protecting of the hydroxy 1 function. Tetrahedron Letters, 1976, N2 11, p. 809-812.

89. Matteucci M.D., Caruthers M.H. The use of ZnBr2 for removal of dimethoxytrityl ethers from deoxynucleosides. Tetrahe-hedron Letters, 1980, v. 21, N3 34, p. 3243-3246.

90. Waldm^eier F., De bernardini S., Leach C.A., Tamm C. Nucleosides and nucleotides. Part 19. On detritylation with ZnBr2 in oligonucleotide synthesis. Helv.Chim.Acta, 1982, v. 65, IE 8, p. 2472-2475.

91. Chow F., Kempe T., Palm G. Synthesis of oligodeoxyribonucle-otides on silica gel supports. Nucl.Acids Res., 1981, v. 9, N2 12, p. 2807-2817.

92. Matteucci M.D., Caruthers M.H. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer support. J.Am.Chem.Soc., 1981, v. 103, №11, p. 3185-3191.

93. Vasella A. Syntliese und Umwandlungen von Isoxazolidin-Nucleosiden. Helv.Chim.Acta, 1977, v. 60, №47, p. 426-446.

94. Буткус В.В., Климашаускас С.И., Берлин Ю.А. Трифторуксусная и хлористый алюминий как реагенты детритилирования в фосфотриэфирном синтезе, олигодезоксирибонуклеотидов. -Виоорпан.химия, 1982, т. 8, W 10, с. 1343-1348.

95. Kierzek R., Ito H., Bhatt R., Itakura Iv. Selective N-deacy-lation of N,0-protected nucleosides by zink bromide. Tetrahedron Letters, 1981, v. 22, № 38, p. 3761-3764.

96. Kohli V., Balland A., Wintzerith M., Sauerwald R., Staub A.P., Lecocq J.P. Silica gel: an improved support for the solid-phase phosphotriester synthesis of oligonucleotides. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, № 22, p. 7439-7448.

97. Duckworth M.L., Gait M.J., Goelet P., Hong G.F., Singh M.,

98. Titmas R.C. Rapid synthesis of oligodeoxyribonucleotides.

99. VI. Efficient, Mechanized synthesis of heptadecadeoxyribo-micleotides by an improved solid phase phosphotriester route. Nucl.Acids Res., 1981, v. 9, N2 7, p. 1691-1706.

100. Tanaka 0?., Letsinger R.L. Syringe method for stepwise chemical synthesis of oligonucleotides. Nucl.Acids Res., 1982, v. 10, N2 10, p. 3249-3260.

101. Letsinger R.L., Groody E.P., Lander N., Tanaka T. Some developments in the phosphite triester method for synthesis of oligonucleotides. - Tetrahedron, 1984, v.40, N21, p.137-143.

102. Adams S.P., Kavka K.S., Wykes E.J., Holder S.B., Gallupi G.R. Hindered Dialkylamino Nucleoside Phosphite Reagents in the Synthesis of Two DNA 51-mers. J.Am.Chem.Soc., 1983, v. 105, MS 3, P. 661-663.

103. Matthes H.W.D., Zenke W.M., Grundstrom Т., Staub A., Wint-zerith M., Chambon P. Simultaneous rapid chemical synthesis of over one hundred oligonucleotides on a microscale. -EMBO Journ. , 1984, v. 3, N2 4-, p. 801-805.

104. Catlin J.C., Cramer F. Deoxy Oligonucleotide Synthesis via the Triester Method. J.Org.Chem., 1973, v.38, N22, p.245-250.

105. Pless R.C., Letsinger R.L. Solid support synthesis of oligo-thymidilates using phosphochloridates and 1-alkylimidazoles. Nucl.Acids Res., 1975, v. 2, N2 6, p. 773-786.

106. Sekine M., Matsuzaki J., Hata T. Phosphotriester approach to oligothymidilate synthesis utilizing a simple thymidine unit and a new type of condensing agents. Tetrahedron Letters, 1981, v.22, N233, p. 3209-3212.

107. Ефимов B.A., Бурякова A.A., Ревердатто C.B., Чахмахчева О.Г. Применение N-метилимидазолидного фосфотриэфирного методадля получения олигонуклеотидов, полезных при изучении реком-бинантных ДНК. Биоорган.химия, 1983, т.9, №10, с.1367-1381.

108. Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Выстров Н.С., Северцова И.В., Колосов М.Н. Катализируемый метилимидазолом быстрый синтез олигодезоксинуклеотидов фосфотриэфирным путём на силика-гельном носителе в дихлорэтане. Биоорган.химия, 1983,т. 9, № 5, с. 706 710.

109. Patel Т.P., MiHiсan Т.А., Bose Т.С., Titmas R.C., Mock G.A., Eaton M.A.W. Improvements to solid phase phosphotriester synthesis of deoxyoligonucleotides. Nucl.Acids Res., 1982,v. 10, N2 18, p. 5605-5620.

110. Greene G.L., Letsinger &.L. Use of the naphtalene radical ion in deblocking O-methoxytrityl nucleotide derivatives. -Tetrahedron Letters, 1975, N8 25, p. 2081-2084.

111. Fisher E.F., Caruthers M.H. Color coded triarylmethyl protecting groups useful for deoxypolynucleotide synthesis. -Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, HS 5, p. 1589-1599.

112. Balgobin N., Josephson S., Chattopadhyaya J.B. A general approach to the chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides.- Acta Chem.Scand., 1981, v. 35 В, N2 3, p. 201-212.

113. Ott J., Eckstein F. Filter disc supported oligonucleotide synthesis by the phosphite method. Nucl.Acids Res., 1984, v. 12, № 23, p. 9137-9142.

114. Srivastava S.C. Selective Cleavage of O-Acyl Protecting Groups From Blocked Deoxyribotides. Bioorg.Chem., 1981, v. 10, N2 2, p. 161-168.

115. Smrt J. 31-0-forrayl-(N-acyl)-cLeoxyri'boiiucleosides new building units for the synthesis of oligodeoxyribonucleo-tides. - Nucl.Acids Res.Symp.Ser., 1981, N2 9, p. 153-155.

116. Smrt J. 3l-0-formyl(N-acyl)-2'-deoxyrihonucleosides as building units in the synthesis of oligodeoxyribonucleo-tides. Collect.Czech.Chem.Commun. , 1982, v.47, N22, p. 21572169.

117. Werstiuk E.S., Neilson T. Oligoribonucleotide Synthesis. IV. Approach to Block Synthesis. Can.J.Chem., 1972, v. 50,1. NS 8, p. 1283-1291.

118. Arenther A., Reese C.B. The Phosphotriester Approach to Oligonucleotide Synthesis: Preparation of Oligo- and Polythy-midilic Acids. J.Chem.Soc.Perkin Trans.I, 1977, NS . 4,p. 445-460.

119. Константинов B.B., Мишарин АЛО., Синтез замещённых дезо-ксирибоолигонуклеотидных блоков фосфодиэфирным методом с использованием З'-О-метоксиацетильной защиты нуклеотидного компонента. Виоорган.химия, 1981, т.7, № 3, с. 365-371.

120. Letsinger R.L., Caruthers M.H., Miller P.S., Ogilvie K.K. Oligonucleotide Synthesis Utilizing B-Benzoylpropionyl, a Blocking Group with a Trigger for Selective Cleavage. J. Am.Chem.Soc., 1967, v. 89, N2 26, p. 7146-7150.

121. Chattopadhyaya J.B., Reese C.B., Todd A.H. 2-Dibromomethyl-benzoyl: an Acyl Protecting Group Removable Under Exceptionally Mild Conditions. J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1979,1. MS 22, p. 987-988.

122. Brown J.M., Christodoulou C., Reese C.B., Sindona G. Two New Protected Acyl Protecting Groups for Alcoholic Hydroxy Functions. J.Chem.Soc.Perkin Trans.I, 1984, №8, p.1785-1790.

123. Ogilvie K.K. , Beaucage S.L., Schifman A.L., Theriault N.Y., Sadana K.L. The synthesis of oligoribonucleotides. II. The use of silyl protecting groups in nucleoside and nucleotide chemistry. VII. Can.J.Chem., 1978, v.56, Ш 14, p. 27682780.

124. Jones R.A., Fritz H.J., Khorana H.G. Use of Lipophilic tert-Butildiphenylsilyl Protecting Group in Synthesis and Rapid Separation of Polynucleotides. Biochemistry, 1978, v. 17, p. 1268-1278.

125. Markiewicz IV. T., Wiewiorowski M. A new type of silyl protecting groups in nucleotide chemistry. Nucl.Acids Res. Spec.Publ., 1978, № 4, p. 185-188.

126. Gough G.R., Brunden M.J., Gilham P.T. Phosphocybidines as versatile 3•-protecting groups in triester synthesis of oligodeoxyribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1983,v. 24, NS 48, p. 5317-5320.

127. Tener G.M. 2-Cyanoethyl phosphate and its use in the synthesis of phosphate esters. J.Am.Chem.Soc., 1961, v. 83, N2 1, p. 159-163.

128. Miller P.S., Cheng D.M., Dreon M., Jayaraman K., Kan L.-S., Leutzinger E.E., Pulford S.M., Ts'o P.O.P. Preparation ofa Decadeoxyribonucleotide Helix for Studies by Nuclear Magnetic Resonance. Biochemistry, 1980, v. 19, № 20, p. 4688- 4698.

129. Adamiak R.W., Barciszewska M.Z., Biala E., Grzeskowiak K.,

130. Kierzek R., Kraszewski A., Markiewicz W.T., Wiewiorowsski M.

131. Marrug J.E., Dreef G.E., van der Marel G.A., van Boom J.H. The use of 2-cyano-1,1-dimethylethy1 as a protecting group in the synthesis of DNA via phosphite intermediates. -Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 1984, v. 103, № 3, p. 97-98.

132. Josephson S., Balgobin N., Chattopadhyaya J.B. Chemical synthesis of tetradecadeoxyribonucleosidetridecaphosphate using 2-phenylsulfonylethyl as a phosphate protecting group. -Nucl.Acids Res.Symp.Ser. , 1981, N§9, p. 177-181.

133. Balgobin N., Josephson S., Chattopadhyaya J.B. 2-Phenylsul-fonylethyl, a new phosphate protecting group: its application in the synthesis of dodecathymidilic acid. Tetrahedron Letters, 1981, v. 22, N! 20, p. 1915-1918.

134. Felder E., Schwyzer R., Charubala R., Pfleiderer W., Schulz B. A new solid phase approach for rapid syntheses of oligonucleotides hearing a 3*-terminal phosphate group. Tetrahedron Letters, 1984, v. 25, 36, p.3967-3970.

135. Thuong N.T., Chassignol M., Chabrier P. A new method of preparing of phosphoric esters having a B-mercaptoethyl group which can be used in nucleotide synthesis. Bull.Soc.Chim.

136. Prance, 1981, v. 2, p. 51-56.

137. Kraszewski A., Stawinski J. Studies on the new phosphate protecting group. Nucl.Acids Res., Symp.Ser., 1981, № 9»1. P. 135-139.

138. Uhlmann E., Pfleiderer W. New phosphate blocking group in nucleotide synthesis. Nucl.Acids Res.Spec.Publ., 1978, NS 4, p. 25-28.

139. Uhlmann E., Pfleiderer W. Nucleotide. XIV. Substituierte B-Phenylathyl-Gruppen. Neue Schutzgruppen fur Oligonucleo-tiden Synthesen nach dem Phosphorsauretriester Verfahren. - Helv.Chim.Acta, 1981, v. 64, NS 5, p. 1688-1703.

140. Uhlmann E., Pfleiderer W. New improvements in oligonucleotide synthesis by use of the p-nitrophenylethyl phosphate blocking group and its deprotection by DBU or DBN. Tetrahedron Letters, 1980, v. 21, N3 13, p. 1181-1184.

141. Beiter A.H., Pfleiderer W. Solution synthesis of protected cli2,-deoxynucleoside phosphotriesters via the phosphorami-dite approach. Tetrahedron Letters, 1984, v.25, N219,1. P. 1975-1978.

142. Honda S., Kamimura T., Sato M., Terada K., Sekine M., Hata T. A study on the protecting group for the internucleotide phosphate in oligoribonucleotide synthesis. Nucl.Acids Res. Symp.Ser., 1979, № 6, p. 185-186.

143. Honda S., Hata T. 2-Diphenylmethylsilylethyl group as a new protecting group of internucleotide phosphates in oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1981, v. 22, NS 22,p. 2093-2096.

144. Itakura K., Katagiri N., Bahl G.P., Wightman R.H., Narang S.A. Improved Triester Approach for the Synthesis of Penta-decathymidilic Acid. J.Am.Chem.Soc., 1975, v. 97, NE 25, P. 7327-7332.

145. Reese C.B. O-Aryl-S-methylphosphorochloridothioates: terminal phosphorylating agents in the phosphotriester approach to oligonucleotide synthesis. J.Chem.Soc.Chem.Oommun., 1978,1. K223, p. Ю5О-1052.

146. Kohli V., Kumar A. Deoxypolynucleotides: Part I synthesis of thyпlidy.l-(3,-5, )-thymidylyl-(3,-5, )-thymidine and a comparison of a phosphodiester and phosphotriester approaches.- Indian J.Chem., v. 17 B, p. 253-256.

147. Takaku H., Yamaguchi R., Nomoto Т., Hata T. 5-CI-8-quinolyl group as high efficient phosphate protecting group for the synthesis of oligoribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1979, № 40, p. 3857-3860.

148. Takaku H., Yamaguchi R., Hata T. 5-Cloro-8-quinolyl group as a protecting group on phosphomonoesters in the synthesis of oligonucleotides. Chem.Lett., 1979, № 1, p. 5-8.

149. Caruthers M.H., Beaucage S.L., Efcavitch J.W., Fisher E.F., Matteucci M.D., Stabinsky Y. New chemical methods for syn-thesing polynucleotides. Nucl.Acids Res.Symp.Ser., 1980, Hi 7, p. 215-223.

150. Ohtsuka E., Murao K., Ubasawa M., Ikehara M. Studies on transfer ribonucleic acids and related compaunds. I. Synthesis of ribooligonucleotides using aromatic phosphoramidites as a protecting group. J.Am.Chem.Soc, 197o, v. 92, № 11, p. 34413445»

151. Ohtsuka E., Tanaka T,, Wakabayashi Т., Taniyama Y., Ikehara M, A new ribo-oligonucleotide block synthesized by phosphorylation with p-chlorphenyl-N-phenylchlorophosphoramidate. -J.Chem.Soc.Chem.Commun., 1978, № 19, p. 824-825.

152. Ohtsuka E., Ono T., Ikehara M. Studies on Deoxyribonucleic Acids and Related Compounds. II. Synthesis of Decanucleotide Containing a Restriction Enzyme (Pst I) Recognition Site. -Chem.Pharm.Bull., v. 29, № 11, p. 3274-3280.

153. Daub Gr.W., van Tamelen E.E. Synthesis of Oligoribonucleotides Based on the Facile Cleavage of Methyl Phosphotriester Intermediates. J.Am.Chem.Soc., 1977, v. 99, Ni 12, p. 3526-3528.

154. Smith D.J.H., Ogilvie K.K,, Gillen M.F. The methyl group as a phosphate protecting group in nucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1980, v. 21, Ni 9, p. 861-864.

155. Christodoulou 0., Reese C.B. Dealkylation of Nucleoside Aryl-methyl 2-Chlorophenyl Phosphates: The 2,4-dinitrobenzyl Protecting Group. Tetrahedron Letters., 1983» v. 24, N2 9,1. P. 951-954.

156. Takaku H., Kono T. A comparative study on phosphate protecting groups in the synthesis of internucleotide bonds by the phos-photriester approach. Chem.Pharm.Bull., v. 30, N2 8, p. 2991-2995.

157. Kraszewski A., Stawinski 'J., Wiwiorowski M. The case of sul-fonation in the chemical synthesis of oligonucleotides. -Nucl.Acids Res., 1980, v. 8, N2 10, p. 2301-2305.

158. Srivastava S.O., Nussbaum A.L. Studies on Oligonucleotide Triester Synthesis. The Effect of Internucleotide Protec- • ting Groups. J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides, 1981, v. 8, N2 6, p. 495-505.

159. De Bernardini S., Waldmeier F., Tamm C. Nucleosides and Nucleotides. p. 17. A Simple Preparation of Protected Deoxynucleo-side-З»-Phosphates. Helv.Chim.Acta, 1981, v. 64, N2 7,p. 2142-2147.

160. Ohtsuka E., Yamane A., Doi Т., Ikehara M. Chemical synthesis of the 5»-half molecule of E. coli tRNA|lu . Tetrahedron, 1984, v. 40, m 1, p. 47-57.

161. Takaku H., Nomoto T., Kamaike K. 4-Chlorophenyl-5-chlor-8-quinolylphosphotetrazolide: a highly effective phosphorylating agent for oligoribonukleotide synthesis. Chem.Lett., 1981, N2 4, p. 543-546.

162. Efimov V.A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.G. New Effective method for the synthesis of oligonucleotides via phosphotri-ester intermediates. Nucl.Acids Res., 1982, v. 10, N2 21,p. 6675-6694.

163. Efimov V.A,, Buryakova A,A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.G., Ovchinnikov Yu.A. Rapid synthesis of long-chain deoxy-ribooligonucleotides by the N-methylimidazolide phosphotri-ester method. Nucl.Acids Res., 1983» v, 11, N2 23, p. 83698387.

164. Hayakawa Y., Uchiyama M., Nobori T. , Noyori R. A convenient synthesis of 2'-5' linked oligoribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1985, v. 26, Ж 6, p. 761-764.

165. Marrug J.E., Piel N., Mclaughlin L.W., Tromp M., Veeneman G.H., van der Marel G.A., van Boom J.H. Polymer supported DNA synthesis using hydroxybenzotriazole activated phosphotriester intermediates. Nucl.Acids Res., 1984, v. 12, N2 22, p. 8639-8651.

166. Cashion P.J., Porter K., Cadger Т., Sathe G., Tranquilla Т., Notman H., Jay E. Simplification of DNA synthesis by the phosphotriester method. Tetrahedron Letters., 1976, № 42, p. 3769-3772.

167. Добрынин B.H., Еыстров H.C., Чернов Б.К., Северцова И.В., Колосов М.Н. Нуклеофильный катализ реакций фосфорилирования фос-фотриазолидами в триэфирном синтезе олигонуклеотидов. Биоорган.химия, 1979, т.5, №8, с. 1254-1256.

168. Ueda S., Takaku Н. An efficient phosphorylating agent for thesynthesis of nucleoside-31-phosphotriester intermediates in oligonucleotide synthesis, Chem,Pharm.Bull., 1984, v. 32, Hi 4, p. 1650-1653.

169. Frank R., Heikens W,, Heisterberg-Moutsis G., Blocker H. A new general approach for the simultaneous chemical synthesis of large number of oligonucleotides: segmental solid supports. Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, № 13, p. 4365-4377.

170. Добрынин Б.Н., Чернов Б.К., Колосов М.Н. Новый метод твердофазного синтеза олигодезоксинуклеотидов фосфотриэфирным методом. Биоорган.химия, 1980, т.6, WI, е. 138-140.

171. Miyoshi Ken-ichi, Itakura К. Solid-phase synthesis of polynucleotides: V. Synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the phosphomonotriazolide method. Nucl.Acids Res., Symp. Ser. , 1980, H? 7, p. 281-291.

172. Marrug J.E., McLaughlin L.W., Piel N., Tromp M., van der Marel G.A. Polymer supported DNA synthesis using hydroxybenzotriazole activated phosphotriester intermediates.- Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, N2 37, p. 3989-3992.

173. Letsinger R.L., Mehadovan V. Oligonucleotide Synthesis on a Polymer Support. J.Am.Chem.Soc., 1965, v. 87, N2 15,p. 3526-3527.

174. Letsinger R.L., Ogilvie K.K. A Convenient Method for Stepwise Synthesis of Oligothymidilate Derivatives in Large-Scale Quantities. J.Am.Chem.Soc., 1967, v. 89, № 18, p.4801-4803.

175. Letsinger R.L., Ogilvie K.K. Synthesis of Oligothymidilates via Phosphotriester Intermediates. J.Am.Chem.Soc., 1969, v. 91, N2 12, p. 3350-3355.

176. Takaku H., Kato M., Yoshida M., Hata T. 8-Quinolylsulfonyl-chloride as a coupling agent in oligonucleotide synthesis via phosphotriester approach. Nucl.Acids Res.Spec.Publ., 1978, Til 5, p. 345-343.

177. Takaku H., Yoshida M., Kato M., Hata T. 8-Quinolinsulfonyl-chloride: coupling agent in oligoribonucleotide synthesis via phosphotriester approach. Chem.Lett., 1979, N2 7,p. 811-814.

178. Berlin Yu.A., Chakhmakhcheva O.G., Efimov V.A., Kolosov M.N, Korobko Y.G. Arensulfonyl imidazoles, new reagents for polynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1973, N2 16,p. 1З5З-1З54.

179. Takaku H., Yoshida M., Hata T. 8-Quinolinesulfonyltetrazolide (Qtet) as a new coupling agent for oligonucleotide synthesis via phosphotriester approach. Nucl.Acids Res.Symp.Ser, 1979, N2 6, p. 181-182.

180. Seth A.K., Jay E. Astudy of the efficiency and the problem of sulfonation of several condensing reagents and their • mechanisms for the chemical synthesis of deoxyoligoribonuc-leotides. Nucl.Acids Res., 1980, v. 8, Ш 22, p. 544-5- 5^59.

181. Takaku H., Kamaike K., Suetake M. A simple synthetic method of preparation of deoxyribonucleotide blocks. Ghem.Lett., 1983, 1, p. 111-114.

182. Efimov V.A., Reverdatto S.V. , Chakhmakhcheva O.G. Arylsulfo-nyl chlorides in the presense of N-methylimidazole as efficient condensing reagents in phosphotriester oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1982, v.23, NS 9, p.961-964.

183. Ефимов Б.А., Ревердатто C.B., Чахмахчева О.Г. Применение три-изопропилбензолсульфохлорида и N-метилимидазола для создания фосфотриэфирной межнуклеотидной связи. Биоорган.химия, 1982, т.8, №2, с. 231-238.

184. Sproat B.S., Bannwarth W. Improved synthesis of oligodeoxynuc-leotides on controlled pore glass using phosphotriester chemistry and a flow system. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, NS 51, p. 5771-5774.

185. Zarytova V.F., Knorre D.G. General scheme of the phosphotriester condensation in the о li go deoxyribonucleotide synthesis with arylsulfonyl chlorides and arylsulfonyl azolides. Nucl.Acids Res., 1984, v.12, N2 14, p.2091-2110.

186. Charubala R. , Pfleiderer W. Synthesis and reactivity of di-nucleoside pyrophosphates. Nucl.Acids Res.Symp.Ser., 1981, N2 9, p. 161-164.

187. Зарытова В,Ф., Шипшин Т.В., Халимская JI.M. Исследование механизма химического синтеза олигонуклеотидов. ХУ. Роль пиридина в триэфирном методе химического синтеза олигонуклеотидов. -Биоорган.химия, 1981, т.7, № 6, с. 900-906.

188. Ivanova Е.М., Khalimskaya L.M. , Romanenko V.P. Phosphate tetraester intermediate of coupling reactions in the phos-photriester approach to the synthesis of oligonucleotides, Tetrahedron Letters., 1982, v. 23, N2 51, p. 5447-5450.

189. Кашин A.JI., Берлин Ю.А., Колосов M.H. Нуклеофильный катализ межнуклеотидной конденсации в фосфотриэфирном синтезе олигонуклеотидов. Биоорган.химия, 1982, т.8, Р 5, с." 660-666.

190. Chandrasegaran S., Murakami A. , Lou-Sing Kau. ^P NMR Study of the Mechanism of Activation and Coupling Reactions in the Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides by the Phosphotriester Method. J.Org.Chem., 1984, v. 49, №25, p. 4951-4957.

191. Кашин А.Л., Берлин Ю.А., Колосов M.H. Нуклеофильный катализ межнуклеотидной конденсации в фосфотриэфирном синтезе олигонуклеотидов. П. Катализ I-метилимидазолом в различных растворителях. Биоорган.химия, 1983, т.9, № 4, с. - 5II-5I5.

192. Ogilvie К.К., Theriault N.Y., Seifert J.-M., Pon R.T., Nemer M.J. The chemical synthesis of oligoribonucleotides, IX. A comparison of protecting groups in the dichloridite procedure. Can.J.Ohem., 1980, v. 58, p. 2686-2693.

193. Fourrey J.-L., Varenne J. Improved procedure for preparation of deoxynucleoside phosphoramidites: arylphosphoramiditesas a new convenient intermediate for oligodeoxynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1984, v. 25, NS 40, p.4511-4514.

194. Ogilvie K.K., Pon R.T. The chemical synthesis of oligoribonucleotides. VII. A comparison of condensing agents in the coupling of silylated ribonucleosides. Nucl.Acids Res., 1980, v. 8, NS 9, p. 2105- 2115.

195. Finnan J.L., Varshney A., Letsinger R.L. Developments in the phosphite-triester method of synthesis of oligonucleotides. Nucl.Acids Res.Symp.Ser., 1980, NS 7, p. 133-145.

196. Fourrey J.L., Shire D.J. New intermediates for the synthesis of oligonucleotides by the phosphite triester approach. -Tetrahedron Letters., 1981, v. 22, NS 8, p. 729-732.

197. Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphorami-dites — a new class of key intermediates for deoxypoly— nucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1981, v. 22,m 20, p. 1859- 1862.

198. McBride J., Caruthers M.H. An investigation of several deoxynucleoside phosphoramidites useful for synthesizing deoxyoli-gonucleotides. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24,N23,p. 245-248,

199. Dorper T., Winnacher E.L. Improvements in the phosphorami-dite procedure for the synthesis of oligodeoxyribonucle-otides. Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, N2 9, p. 2575-2584.

200. Beaucage S,L. A simple and efficient preparation of deoxy-nucleoside phosphoramidites in situ. Tetrahedron Letters, 1984, v.25, N2 4, p. 375-378.

201. Barone A.D., Tang J.-Y., Garuthers M.H. In situ activation of bis-dialkylaminophosphines a new method for synthesi-zinng deoxyoligonucleotides on polymer support. - Nucl.Acids Res., 1984, v, 12, N2 10, p. 4051-4061.

202. Schwarz M.W., Pfleiderer W. Solution synthesis of fully protected thymidine dimers using various phosphoramidites. -Tetrahedron Letters, 1984, v. 25, N2 48, p. 5513- 5516.

203. Froehler B.C., Matteucci M.D. Substituted 5f-phenyltetrazoles: improved activators of Deoxynucleoside phosphoramidites in deoxyoligonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, N2 31, p. З171- 3174.

204. Stec W.J., Zon G. Stereochemical studies of the formation of chiral internucleotide linkages by phosphoramidite coupling in the synthesis of oligodeoxyribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1984, v. 25, NS 46, p. 5279- 5282.

205. Ramirez P., Gavin Т.Е., Mandal S.B., Kelkar S.V., Marecek J.P. Synthesis of deoxyribotetra-nucleotides by the cyclicenediol phosphorylation method. Tetrahedron, 1983, v. 39, NS 13, p. 2157-2161.

206. Itakura K., Bahl C.P., Katagiri N., Michniewicz J., Wight^ man R.H., Narang S.A. A Modified Triester Method for the Synthesis of Deoxyribopolynucleotides. Can.J.Chem., 1973, v. 51, MS 21, p. 3649-3651.

207. Chandhuri B., Reese C.B., Weciawec K. Rapid oligodeoxyribo-nucleotide synthesis by the "filtration" method. Tetrahedron Letters, 1984, v. 25, Ш 36, p. 4037- 4040.

208. Hirose T. , Grea R. , Itakura K. Rapid Synthesis of Trideoxy-ribonucleotide Blocks. Tetrahedron Letters, 1978, N2 28, p. 2449- 2452.

209. Gough G.R., BruncLen M. J. , Nadeau J.H., Gilham P.T. Rapid preparation of hexanucleotide tiester blocks for use in polyde-oxyribonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1982,v. 23, N2 34, p. 3439-3442.

210. Crea R., Hirose Т., Itakura K. Rapid synthesis of oligodeoxy-ribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1979, N2 5, p. 395-398.

211. Biernat J., Wolter A., Koster H. Purification orientated synthesis of Oligodeoxynucleotides in solution. Tetrahedron1.tters, 1983, v. 24, N2 8, p. 751-754.

212. Fritz H.-L., Belagaje R., Brown E.L., Fritz R.H., Jones R.A., Lees R.G., Khorana H.G. High-Pressure Liquid Chromatography in Polynucleotide Synthesis. Biochemistry , 1978, v. 17,7, p. 1257-1267.

213. Калашников В.В., Самуков В.В., Шубина Т.Н., Ямщиков В.Ф. Использование обращенно-фазовой хроматографии в олигонуклеотид-ном синтезе. Биоорган.химия, 1983, т.9, № 5, с. 666-672.

214. МеГЬу L.R., Strobach D.R. Oligonucleotide Synthesis on Insoluble Polymer Support, I. Stepwise Synthesis of Thymidine Diphosphate. J.Am.Chem.Soc., 1967, v. 89, № 2, p. 450-4-53.

215. Melby R., Strobach D.R. Oligonucleotide Synthesis on Insoluble Polymer Supports. II. Pentathymidine Tetraphosphate. -J.Org.Chem,, 1969, v. 34-, №2, p. 421-427.

216. Koster H. , Cramer F. Synthesen von Desoxyoligonucleotiden an einem makroporosen Polystyrol. Liebigs Ann.Chem., 1974, N2 6, p. 94-6-958.

217. Gait M.J., Sheppard R.C. A polyamide support for Oligonucleotide Synthesis. -J.Am.Chem.Soc., 1976, v. 98, Hi 26, p. 8514-8516.

218. Синяков A.H., Ломакин А.И., Ямщиков В.®., Попов С.Г. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов на полистирольном носителе фосфо-триэфирным методом. Би о орган, химия, 1982, т.8, №4, с. 490-498,

219. Miyoshi K., Itakura K. Solid phase synthesis of monadeca-thymidilic acid by the phosphotriester approach. Tetrahedron Letters, 1979, N2 38, p. 3635-3638.

220. Norris K.E., Norris F., Brunfeldt K. Solid phase synthesis of oligonucleotides on a crosslinked polyacrylmorpholide support. Nucl.Acids Res., Symp.Ser., 1980, N8 7, p. 233-241.

221. Gait M.J., Singh M., Sheppard R.C. Rapid synthesis of oligo-deoxyribonucleotides. IV. Improved solid phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides through phosphotriester intermediates. Nucl.Acids Res., 1980, v. 8, N2 5, p. 1081-1096.

222. Markham A.F., Edge M.D., Atkinson Т.О., Greene A.R., Heathcliffe G.R., Newton C.R. , Scanlon D. Solid phase phosphotriester synthesis of large oligodeoxyribonucleotides on a polymer support. Nucl.Acids Res., 1980, v.8, N2 22, p. 51935205.

223. Miyoshi Ken-ichi, Miyake T. , Hozumi Т., Itakura K. Solid-phase synthesis of polynucleotides. II. Synthesis of poly-thymidilic acids by the block coupling phosphotriester method. Nucl.Acids Res., 1980, v. 8, N2 22, p. 5473-5489.

224. Crea R., Horn T. Synthesis of oligonucleotides on cellulose by phosphotriester method. Nucl.Acids Res., 1980, v. 8,1. N8 10, p. 2331-2348.

225. М., van Boeckel С.A.A. Phosphotriester synthesis of DNA fragments on cellulose and polysterene solid supports. -Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 1982, v. 101, N2 7-8, p. 234-240.

226. Potapov V.K., Veiko V.P., Shabarova Z.A. Rapid synthesis of oligodeoxyribonucleotides on a grafted polymer support. Nucl.Acids Res., 1979, v. 6, Ki 6, p. 2041-2056.

227. Горн В.В., Зарытова В.Ф., Ярмолинская Е.В. Полуавтоматический твердофазный триэфирный синтез олигодезоксирибонуклеотидов с активацией фосфатного компонента на полимерном носителе. -Биоорган.химия, 1983, т.9, № II, с. I5II-I5I7.

228. Matteucci M.D., Caruthers M.H. The synthesis of oligodeoxy-pyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Letters, 1980, v. 21, N2 8, p. 719-722.

229. Ohtsuka E., Takashima H., Ikehara M. Semiautomated synthesis of oligonucleotides on a silica gel support. Tetrahedron Letters, 1982, v. 23, N2 30, p. 3081-3084.

230. Gait M., Matthes H.W.D., Singh M., Titmas R. Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides by Continuous-Flow Solid-Phase Method using Phosphotriester Intermediates, J.Chem.Soc. Chem.Commun. , 1982, N2 1, p. 37-40,

231. Gough G.R. , Brunden M. J., Gilham P.T. 243* )-0-Benzoyluri-dine 5*-linked to glass:an all-purpose support for solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides. Tetrahedron Letters, 1983, v. 24, N2 48, p. 5321-5324.

232. Ohshima S., Morita K., Takaku H. Solid-phase Synthesis of Deoxyribooligonucleotides by the Phosphotriester Method

233. Employing a New Polymer Support. Chem.Pharm.Bull., 1984, v. 32, NS 11, p. 4690-4693.

234. Poshet S., Huynh-Dinh. Т., Igolen J. Synthese d'oligonucle-tides lies de facon covalente a un support solide. Tetrahedron Letters, 1985, v. 26, NS 5, p. 627-630.

235. Кравченко В.В., Серпинский О.И., Синяков А.Н., Попов С.Г. Синтез 33-членного по динуклеотида, содержащего "core" att сайт ДНК бактериофага Д, и его клонирование. Биоорган.химия, 1984-, т. 10, Р 2, с. 220-225.

236. Kumar G., Poonian M.S. Improvements in Oligodeoxyribonucleotide Synthesis: Methyl N,N-Dialkylphosphoramidite Dimer Unitsfor Solid Support Phosphite Methodology. J.Org.Chem., 1984, v. 49, NS 25, p. 4905-4912.

237. Ike Y., Ikuta S., Sato M., Huang T., Itakura K. Solid phase synthesis of polynucleotides. VIII. Synthesis of mixed oligodeoxyribonucleotides by the phosphotriester solid phase method. Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, NS 2, p. 477-488.

238. Ikuta S., Chattopadhyaya R., Dickerson R.E. The kinetics of phosphotriester condensation on solid support. Nucl.Acids Res., 1984, v. 12, NS 16, p. 6511-6522.

239. Gough G.R., Brunden M.J., Gilham P.T. Recovery and recycling of synthetic units in the construction of oligodeoxyribonucleotides on solid supports. Tetrahedron Letters. , 1981, v. 22, NS 42, p. 4177-4180.

240. Seliger H., Scalfi C., Eis3nbeiss F. An improved syringe technique for the preparation of oligonucleotides of defined sequence. Tetrahedron Letters, 1983, v.24, NS45, p.4963-4966.

241. Зарытова В.Ф., Иванова E.M., Романенко В.П. Синтез олигонуклеотидов в хлороформе триэфирным методом. Биоорган.химия, 1983, т.9, Р 4, с. 516-521.

242. Demoe К.К., Mioshi К., Itakura К., Dembeck Р., Miyoshi Kenichi. Solid-phase synthesis of hentriacontanucleotide. -J.Am.Chem.Soc.-, 1981, v. 103, Hi 3, p. 7o6-708.

243. Reese C.B., Titmas R.C., Yau L. Oximate ion promoted unblocking of oligonucleotide phosphotriester intermediates. -Tetrahedron Letters, 1978, Hi 30, p. 2727-2730.

244. Reese O.B,, Zard L. Some observations relating to the oximate ion promoted unblocking of oligonucleotide aryl esters.- Nucl.Acids Res., 1981, v. 9, Hi 18, p. 4611-4626.

245. Barnett f Letsinger R.L. Debenzoylation of N-benzoyl-• nucleoside derivatives with ethylenediamine-phenol.

246. Tetrahedron Letters., 1981, v. 22, NS 11, p. 991-994.

247. Patel T.P., Ohanncey M.A., Millican T.A., Bose O.C. , Eaton M.A.W. A rapid deprotection procedure for phosphotriester- DNA synthesis. Nucl.Acids Res., 1984, v. 12, NS 17, p. 68536859.

248. Вульфсон A.H., Якимов С.А. Высокоэффективная жцдкостная хроматография нуклеотидов. Основные методы и их развитие. -Биоорган.химия, 1983, т.9, W 3, с. 365-390.'

249. Haupt W. , Pingond A. Comparison of several high-perf omance liquid chromatography techniques for the separation of oli-godeoxynucleotides according to their chain length. J. Chromatogr., 1983,'v. 260, p. 419-427.

250. Pearson J. D. , Regnier F.E. High-perf omance ani on-exchangechromatography of oligonucleotides. J.Chromatography, 1983,v. 255, P. 137-139.

251. Lawson T.G., Regnier F.E., Weith H.L. Separation of Synthetic Oligonucleotides on Columns of Microparticulate Silica Coated with Crosslinced Polyethylene Imine. Anal.Biochem.,1983, v. 133, P. 85-93.

252. Офицеров В.И., Ямщиков В.Ф. Хроматография олигонуклеотидовна пористых носителях, модифицированных полиэтиленимином. -Биоорган.химия, 1983, т.9, № 9, с. 1248-1253.

253. Newton C.R., Greene A.R., Heatchcliffe G.R., Atkinson Т.О., Holland D., Markham A.F., Edge M.D. Ion-Exchange High-Per-fomance Liquid Chromatography of Oligodeoxyribonucleoti-des Using Formamide. Anal.Biochem., 1983, v. 129, p. 22-30.

254. Bischoff R. , McLaughlin L.W. Chemically synthesized hydrophobic anion-exchange high-perfomance liquid chromatography supports used for oligonucleotide resolution by mixed mode chromatography. J.Chromatogr., 1983, v. 270, p. 117-126.

255. Bischoff R., McLaughlin L.W. Nucleic acid resolution by mixed mode chromatography. -J.Chromatogr., 1984, v.296, p.329-337.

256. Colpan M., Riesner D. High-Perfomance Liquid Chromatography of high-molecular-weight nucleic acids on the macroporous ion exchanger, Nucleogen. J. Chromatogr., 1984, v. 296,1. P. 339-353.

257. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1981, с. 7-37, 120-168.

258. Prank R., Koster Н. DMA chain length markers and the influence of base composition on electrophoretic mobility of oli-godeoxyribonucleotides in polyacrylamide gels. Nucl.Acids Res., 1979, v. 6, III 6, p. 2069-2087.

259. Sanger P., Donelson J.E., Coulson A.R., Kossel H., Fischer D. Use of DNA Polymerase I Primed by a Synthetic Oligonucleotide to Determine a Nucleotide Sequence in Phage f1 DNA.

260. Proc. Nat. Ac ad. Sci. USA, 1973, v. 70, N2 4, p. 1209-1213.

261. Jay E. , Bambara R., Padmanabhan R., Wu R. DNA sequence analysis: a general, simple and rapid method for sequencing large oligodeoxyribonucleotide fragments by mapping. -Nucl.Acids Res., 1974, v. 1, № 3, p. 331-353.

262. Tu C.D., Ley E., Bahl C.P. A Reliable Mapping Method for Sequence Determination of Oligodeoxyribonucleotides by Mobility Shift Analysis. Anal.Biochem., 1976, v.74, ГЙ 1, p. 73-93.

263. Maxam A.M., Gilbert W« к new method for sequencing DNA. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1977, v. 74, № 2, p. 560-564.

264. McNeal C.J., Narang S.A., Macfarlane R.D., Hsiung H.M. Sequence determination of protected oligonucleotides containingphosphotriester lineages by Cf-252 plasma desorption mass spectrometry. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1980, v. 77, № 2, . P. 735-739.

265. Seliger H., Bach T.C., Gortz H.-H., Holupirec ,M., Seemann-Preising B. HPLC in combination with field desorption mass spectrometry: separation and identification of building blocks for polynucleotide^ synthesis. J.Chromatogr., 1982, v. 253, p. 65-79.

266. Grotjahn L., Prank R., Blocker H. Ultrafast sequencing ofolisocLeoxyribonucleotid.es by FAB-mass spectrometry. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, № 15, p. 4671-4678.

267. Alder L», Rosenthal A., Cech D. Mass spectrometric monitoring of solid phase phosphate triester synthesis of DNA fragments. Nucl.Acids Res., 1983, v. 11, Ш 23, p. 8431-8441.

268. Grotjahn L., Frank R., Heisterberg-Moutsis G. Fast identification by FAB-mass spectrometry of building blocks for oligonucleotide synthesis. Tetrahedron Letters, 1984, v. 25,1. N2 47, p. 5373-5376.

269. Мирских O.B. Анализ первичной структуры синтетических олигои полинуклеотидов* Дипл. работа, МГУ, Биологический факуль-, тет, каф. Биоорганической химии, 1983.

270. Vanecek G., Regnier F.E. Macroporous High-Perfomance Anion-Exchange Supports for Proteins. Anal.Biochem., 1982,v.121, p. 159-169.