Химический состав почечных камней и фракционный состав белков сыворотки крови и мочи тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИЙ И УПЕХИМИИ ■и. 1.М, ИТВИНЕНКО АКАДЕМИИ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

На правах рукописи

МИРОНОВ Олег Леонидович

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ПОЧЕЧНЫХ КАМНЕЙ И ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И МОЧИ

02.00.04 Физическая химия

Автореферат

диссертации на соиокание ученой отепеня кандидата химических наук

Донецк - 1991

Работа выполнена в Институте физико-органической химии в углехимии им. Л,И. Литвиненко Академик наук Украинской ССР

Научный руководитель - кандидат химических наук, старший научнвй

сотрудник Билобров В.М.

Официальные оппоненты; доктор физико-математических наук,

профессор ДобрЬцов Г.Е.

кандидат химических неук, старший иупеш сотрудник Капкан Л.И,

Ведущая организация — Отделение физико-химии и технологии

горячих ископаемых Института физической ' химии им. Л.В. Писаржевского ЛЯ УССР

Защита состоится " /Л« " N■61К " 1991 г. в ' I часов на заседании специализированного совета К 016.21.01 в Институте физико-органической химии и углехимии им.Л.М. Литвшкйха АН УССР, Э40Ш, Доноцк-Ш, ул. Р. Люксембург, 70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физико-органической химии в углехимии им. Л.Ы. Литвиненко АН УССР

Автореферат разослан *ОЭ? - 1991 г'

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.Н. ЕЕВДРИК

- У -

Акт/вльtootл^п^облемы. Изучение, физико-химических, овойств.биологических жидкостей организма человеке, применительно к формирование к деструкции: биоминералов, »ажио как в теоретическом плане, так и-дли практических целей. В то же время, исследования по физико-химическим' проблемам мочекаменной болезни (МКБ) в напей стране до оих пор носят опизодический характер. Изучение таких сложных оиотвн, как твердая фаза - многокомпонентный раствор, не получили долхгного развития для случая моча - конкремент. В литературе отоут-отвурт также околь-нибудь достоверные данные о связи между химическим составом почечных камней (конкрементов) и содержанием и свойствами белков крови и мочи.

Использование физико-химических методов для определения химического состава почечных камней, а также количественного содержания и*фракционного состава белковых макромолекул, является необходимым условием практического решения вопросов, связанных о нарушением водмо-солёвого обмена человека. В связи с естественной вариабель-ноотыг количественных Параметров биологических жидкостей важным представляется^ так» поиск оптимальных способов обработки полученной информации; с вироккм'использованием методов регрессионного я корреляционного анализвг;

Работа выполнена в соответствии1о планом научно-исследовательских работ лаборатории физико-химических' основ" ¿одно-солевого обмена человека Института фидико-органическей1 химии* и' углехимии им. Л.М. Литвиненко АН УССР по теме: "Исследование- фйзико-химичео-ких и биохимических закономерностей образований^ растворения я особенностей раздельной диагностики почечных камней'с целью создания качественной модели "почечного здоровья'"' (по поста'йов'лбиив-Президиума АН УССР fklH от 27.12.1985 г.. & гос. per. 0I660I2090I), а также в соответствии с постановлением Президиума АН 7ССР' №136 от 23.05.1990 г. об интенсификации исследований по проблеме: "Физико-химические основы нарушения биоминерализации и водно-. солевого обмена у человека".

Цель_работы. Изучение состава и свойств белковых макромолекул биологических жидкостей организма человека в зависимости от химического состава почечных камней. Поиск достоверных корреляций между физико-химическими характеристиками белкового обмена н химической разновидность!) конкрементов в почках. Разработка новых диагностических критериев МКБ на основе полученных результатов»

Научная новизна. С использованием триметинового красителя IlK-IM разработан высокочувствительный способ определения концен-.

трации белков в биологических жидкостях. Впервые получены » проанализированы данные по количественному содержанию в фракционному составу белков крови и мочи людей в зависимости от химического состава конкрементов. На основе полученных результатов расчитаны параметры селективности "почечного фильтра" для исследуемых групп больных. Выявлен новый, достоверный фактор риска образования каль-цийоксалатных почечных камней - фенотип гаптоглобина крови 1-1. Показана принципиальная возможность практического использования количественных соотношений между белками крови и мочи людей, с одной стороны, и химическим составом камней в их почках, с другой.

Практическая_ценность. Разработана и апробирована простая методика количественного определения белков в биологических жидкостях организма человека. Разработка защищена авторским свидетельством и используется в медицинской практике. Сконструирована и изготовлена денситометрическая установка для количественного и качественного анализа электрофореграмм в полиакриламидном геле. Установка пригодна как для рутинного анализа в клинических лабораториях, ♦ак и для научно-исследовательских целей. Предложены и внедрены в клиническую практику новые способы дооперациоиного диагностирования химического состава почечных камней.

На_защиту выносятся. Способ определения концентрации белков в биологических жидкостях на основе использования триметинового Красителя. Найденные закономерности, связывающие соотношения и функциональные способности белковых фракций сыворотки крови и мочи к Химический состав почечных камней. Новый, достоверный фактор риска образования конкрементов из оксалата кальция - наличие в крови же— дей гаптоглобина фенотипа 1-1.

Апдобация £аботы. Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции "Биохимия - ме-дицике" (Ленинград, 1986); 2-ой конференции молодых ученых-химиков (Донецк. 3(990); IX конгрессе Европейской ассоциации урологов (Амстердам» 1990); научных конференциях ИнЗОУ АН УССР (Донецк, 1989, 1990).

Публикации. Основное содержание1 диссертационной работы отражено в 4 статьях и 3 тезисах докладов-, а также в материалах автора ского свидетельства.

Ст^укт^ра и объем работы. Диссертация состоит из введения,. Обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов. Работа изложена на 143 страницах, иллюстрирована 18 рисунками й 14-таблицами. Список литературы содержит 190 наименований. Приложение к диссертации документально отражает практическое применение результатов работы.

Содержание работы

I. Обзод литературы.

Рассмотрены основные теории камнеобразоаания, обсуждены их сходства и противоречия. Проанализированы данные по содержание и составу макромолекул в органической матрице почечных камней, а также в сыворотке крови и моче больных МНЕ. С позиций существующих концепций камнеобразования обсуждены результаты исследований влияния органических макромолекул на физико-химические процессы в системе моча - конкремент. Рассмотрены механизмы зарождения и роста конкрементов в почках. Отдельный раздел посвящен структуре и проницаемости "почечного фильтра". На основании анализа литература ных данных оделан ряд выводов:

1.1. Содержание органической матрицы почечных камней, а также таких ее компонентов, как сывороточные, тканевые белки и гликозами* ногликаны, широко варьируют как в пределах одной химической разновидности почечных камней, так и в случае камней различного химического состава.

1.2. Изменение содержания указанных макромолекул в почечных камнях является характерной особенностью условий их формирования и в значительной мере объясняется переменным составом мочи, среды, где происходит их зарождение и рост.

1.3. При рассмотрении роли различных макромолекул в камнеобра-зовании возникает противоречие, заключающееся в том, что как белки, так и гликозаминогликаны мочи могут выступать одновременно в качестве промоторов и ингибиторов различных стадий процесса кристаллизации камнеобразувших солей.

1.4. Естественная вариабельность состава минеральной и органической составляющих конкрементов, а также общего содержания и фракционного состава макромолекул в биологических жидкостях, значительно усложняют исследования по установлению связи между химичео-ким составом почечных камней и особенностями различных макромолекул,

1.5. Практически отсутствуют систематические исследования, направленные на изучение состава белков крови и мочи больных МКБ,

и использование таких данных для разработки методов дифференциальной диагностики химического состава почечных камней.

1.6. Вместе с тем, сделано предположение о наличии в моче процессов, обусловленных специфическим взаимодействием определенных макромолекул о минеральными компонентами камня, приводящих к образованию конкрементов различного химического состава.

г,Эксп0£иментальная_чаоть,

Химический состав почечник камней определяли .методом ИК-спектроокопии по положении и интенсивности характеристических полос иа спектрофотометре UR-20 в матрице иа КВг- » интервале частот ¿»ООО - 400 см . Общий вид опектров химических соединений, входящих в состав почечных камней, совпадал о таковыми, приведенными в литературе.

Количественное определение концентрации общего белка биологических жидкостей. в основном проводилось фотомотрированием комплексов белок-краситель поноо5. Поглощение щелочного элюата комплекса определяли при Л"560 ни на спектрофотометре СФ-26 или фотоколориметре КФК-2.

Для повышения точности определения концентрации белка в области малых значений нами был разработан способ, основанный на при- . менении высокочувствительного красителя - тетракалиевой соли бис-/ 1-('(-сульфофенил)-3-карбоксипиразолон-5 / трикетоксанина (тривиальное название красителя ЛК-Ш), Определение концентрации белка в данном случав проводилооь приД*540 им.

На рис Л представлены спектры поглощения использованных нами красителей (SPECOftD щ Vis ), Больший коэффициент экстннкции красителя ПК-Ш (£ = 4,6'Ю4 я- моль~*см~* при Лма„о"540 ни в 0,2hl растворе л/аОИ 5 по сравнение с красителем понсо S ■■: (£»2,МО* л-моль"".*см~* при Йиако"5б0 нм я тех же условиях) обеспечивал более высокую точность определения концентрации белка в различных био-НО Ш 00 ^ веских жидкостях..

'Рио.1. Спектры поглощения красителей ПК-144 (I) и понсо S (2),

Для разделения белковых макромолекул по фракциям использовался катод диск-электрофореза в полиакрилемидном геле (ПААГ), обладавция ваоокой раэреваящой способностью. Высокая прозрачность ПААГ обеспечивает условия для прямых денойтонатричэских измерений образцов. Фиксация голой после электрофореза производилась в растворе трихлор-

уксусной кислоты, а окраска - раствором амидового черного 10 Б. Для идентификации белковых фракций использовали величину их подвижности относительно наиболее интенсивной фракции - альбумина 0^а)> Фракции гаптоглгобина (Нр) крови выявляли по пероксидазной активности их комплексов с гемоглобином в системах, содержащих бензидин к перекись водорода. Идентификацию фенотипов Нр проводили по количеству к относительной подвижности фракция.

Для количественного анализа электрофореграмм белков« разделенных на фракции в ПААГ, нами изготовлена денситомеТрйческая установка (ДУ) на базе спектрофотометра ЙКС-14, ДУ состоит из: стабилизированного источника излучения; оптического канала; механизма протяжки квввты с образцом о дискретной регулировкой скорости в диапазоне 5,5 - 0,04 мх/мин; фотоэлементе $-5; регистрирующего устройства» включающего ЙМТ-5 и КСП-<>. Использовалась однолуче-вая схема, в которой образец перемещается вдоль неподвижной цели ДУ, а параллельные диеки белковых фракций, ориентированные перпендикулярно продольной оси геля, последовательно пересекают световой пучок. Регистрацию сигнала осуществляли в шкале пропускания Т ($). Проверка линейности шкалы Т на ДУ осуществлялась при помощи набора нейтральных светофильтров (рио.2).

Линейность шкалы Т сохранялась практически на всем диапазоне работы ДУ. Логарифмический контур интегральной интенсивности полос белковых фракций на полученных денситограммах рассчитывался с использованием формулы Симпсона. Воспроизводимость и точность результатов, полученных на ДУ, определялась путем рассчета относительного содержания белковых фракций б параллельных проб стандарта

1б 40 СО То ЮОЩ) сыворотки крови, разделенных в ПААГ.

•

Рис.2. Зависимость показаний регистрирующей системы ДУ (шкала ординат) от величины пропускания нейтральных светофильтров (икала абсцисс).

В табл.1 приведены данные измерения на ДУ относительного содержания белковых фракций, значения среднеквадратичных отклонений и коэффициентов вариации. Представленные данные практически совпадают с результатами:1, других работ, где использовались различные

«О

го 60 Ю ¡0

денситометрические приборы (НеЕепа. Франция; 1КВ , Швеция). На сконструированной и изготовленной нами ДУ получены и идентифицированы денситограммы белковых фракций более 500 образцов биологических жидкостей.

Таблица I

Относительное содержание (£) белковых фракций стандарта нормальной сыворотки крови

Белковая фракция '¡Подвижность ! Относительное,содер-"^ Коэффициент [фракции,Яа | жание фракции, (м+5)^ вариации (*)

Преальбумин 1,23 0.2+0,1 50,0

Альбумин 1,00 69,6+1,3 1,9

Постальбумины.I 0,83 1,7+0,3 17,9

0,73 0.М.1 25,0

3 0,68 0,5+0,1 20,0

ч 0,59 1,3+0,2 15,4

Трансферин 0,55 8,6+0,2 2,3

Посттрансферины I 0.« 0,8+0,2 25,0

2 0,34 0.7+0,1 14,3

3 0,26 2,5+0,4 16,0

0,23 1,6+0,3 18,8

5 0,20 0,9+0,2 22,2

— " — 6 0,15 1,3+0,2 15,4

? 0,13 0,9+0,1 И,1

— " — 8 0,Ю I,4+0,2 в,з

М 9 0,08 1,2+0,3 25.0

10 0,05 1,3+0,1 7,7

о1р-макроглобулин 0,04 2,6+0,1 3.6

^-липопротеин 0,01 2,5+0,2 6,0

С целью поиска количественных связей между фракционным составом белков крови и мочи и химическим составом почечных, камней определялись среднеарифметические значения, среднеквадратичные отклонения и параметры распределения полученных данных для всех групп испытуемых; рассчитывались выборочные коэффициенты парных корреляций для значений индивидуальных фракций и выделенных электрофорети-ческих зон; методом выборочной множественной регрессии составлялись многопарамётровые линейные уравнения связи между белками биологических жидкостей внутри изучаемых групп.

3. Обоуадениа_рвз^льтатов.

ЭЛ. Общий белок сыворотки крови и мочи при почечных камнях различного химического состава.

Спектральный анализ почечных камней показал, что значительное их количество является смешанным по химическому составу, тем не менее можно выделить три основные группы конкрементов: I) оксалатные камни почек (СаОх), состоящие из моногидрата оксалата кальция СаС20^~ Н^О, дигидрата оксалата кальция СаС20^* 2^0 или их смесей; 2) фосфатные камни почек (Са1^ ), состоящие из среднего фосфата кальция Са^(Р0^)2 или его смесей с гексагидратом магнийаммоний фосфата Мд^Н^РО^- бН^О; 3) уратныэ камни почек (НУг), состоящие в основном из мочевой кислоты С^Н^О^. Фосфатные конкременты, состоящие только из М^Н^РО^* 6^0 или гидрофосфата кальция (СаНРО^), встречаются исключительно редко, и в отдельные группы не выделя-• лись. Нам не встречались почечные камни, состоящие из смесей химически:: соединений 1-ой и Э-ей групп, а также 2-ой и 3-ей групп. По литературным данным такие конкременты действительно встречаются редко, что объясняется существенно различающимися физико-химическими особенностями осаждения образующих их соединений. 3 то же время часть конкрементов представляла собой смеси соединений 1-ой и 2-ой групп. Однако, как показано нами ранее, такие камни по своим литолитическим свойствам практически не отличаются от конкрементов, образованных чистым Са^РО^. Более того, биохимичео-кие показатели мочи больных с такими камнями в почках аналогичны. Поэтому испытуемые сс смешанными конкрементами были отнесены ко 2-ой группе.

Химический состав почечных камней, общее содержание и фракционный состав белков крови и мочи были определены более чем у Ю0.;

больных МКБ. ' '

Для группы здоровых людей (п»10), а также для больных МКБ с

СаОх камнями почек (а*52), СаР^ (п.*29) и НИг* (а=23) определена концентрация общего'белка крови (ОБК). Среднегрупповые значения ОбК для здоровых и больных МКБ, а также для любых двух групп о МКБ достоверно Ср>0,05) не отличались (по критерию Стьюдента). На рис.3 показан общий вид кривых распределения частот встречаемости (Н) значений ОБК в группах о камнями почек различного химического состава. На представленном рисунке отчетливо видно значительное перекрывание распределений для случаев с СаОх и СаР1 камнями, в то же время для НУг* конкрементов характерно острое распределении»

значений ОБК с выраженной асимметрией со стороны больших значений. Встречаемость значений ОБК ниже предельного уровня нормы (¿60 г/л) для Са1* камней*в 3 раза выше, чем для случаев с СаОх и НСг камней.

т)

50 АО

30 20 Ю

Рис.3. Распределение значений ОБК у больных с: СаОх (- -),

НЦг (-) и СаР^ (•••)' камнями

почек.

6070 ТО ЩШ/гА)

Для измерения концентрации общего белка мочи (ОБМ) использу-ртся разные методы. В нашей стране для этой цели широко применяется метод с сульфосалициловой кислотой (ССК). Однако, по литературным данным этот метод занижает результаты определения ОБМ, что обусловлено существенно различавшейся растворимостью продуктов взаимодействия ССК с некоторыми белками мочи ( уропротеинами), Поэтому анализу данных по содержанию ОБМ у здоровых людей и больных ЫКБ, предшествовало обстоятельное обсуждение результатов определения ОБМ методом с ССК и путем фотометрирования комплекса белок-краситель понсо Б . Для этого в произвольно выбранной группе из 24 больных МКБ нами были проведены контрольные определения концентрации ОБМ двумя методами. Хотя, в некоторых случаях результаты измерений совпадали, ССК-метод давал заниженные на 6-84# данные по сравнению с методом с понсо5 .

В ССК-раствор»моЯ части уропротеинов методом диск-электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия обнаружено 5-7 белковых фракций с молекулярной массой 14-200 кД. Как количество фракций, так и их относительное содержание существенно варьировало, поэтому имевшаяся выборка была разделена на две группы согласно Химическому составу камней почек. Первую группу составили больные с Мг камнями, вторую - с Са-содержащими камнями (СаОх и СаР^).

На рис.4 точки, отвечающие значениям ОБМ при Ниг камнях, леглц на прямую I и описываются уравнением I;

у - (39+24) + (1,ОЭ+01О4)х Г - 0.998 (5общ"42.'~а-6)

Для второй группы, коэффициент корреляции составлял лиаь 0,733, что обусловлено выпадением точек I и 2 из общей зависимости. Оказалось, что данные точки отвечают значениям ОБМ больных с коралловидными Са1^ камнями. По клиническим показателям это наиболее тяжелая форма МКБ ив прикладной урологии ее выделяют в отдельную группу. Поэтому на основании формальных и клинических признаков эти точки были исключены при рассчете уравнения

ССН.мтоЬ ш"^р0гр0ООИИ-Рис.4. Сопоставление значений ОБМ больных МКБ,измеренных методом с ССК и методом с лонсо&.

В результате для второй группы с МКБ получено следующее уравнение регрессии, описывающее прямую II:

у « (52+47) + (1,79+0,И)х (2)

г» 0,975 (5общ"105~ и-16)

Сопоставляя ход зависимостей I и II, сделан вывод, что в моче .рольных с Шг камнями отсутствует заметное количество ССК-раство-римых уропрптсинов, в отличие от больных с Са-содержащими камнями. В составе СС1'-растворимых белков обнаруживается значительное количество уропротеинов с молекулярной массой 45 и 90 *сД, которые идентифицируются как. Л^-киолый гликопротеин и мукопротеин Тамм-Хоро-фалл. Кислотостабильность данных белков по отношение к ССК обеспечивается их химическим составом, ъ частности, наличием значительного количества дикарбоновых (аспарагиновой н глутаминовой) аминокислот, а, также сиаловой кислоты. Это обуславливает низкое значение изоэлектрической точки Щелков, препятствует их денатурации с ССК и обеспечивает высокие Са-связывавдие свойства. Присутствие в моче киолотостабильных белков оказывает влияние на образование Са-содержащих почечных камней.

Методом с понсо 5 определена концентрация ОБМ у здоровых и выделенных ранее группах больных МКБ (отдельную группу составили

больные с СаР^ коралловидными камнями), Наиболее существенные отличия по значениям ОБМ наблюдались медду здоровыми людьми и больными МКБ. При этом достоверно (0,001 < р< 0,03) отличались и их средние значения.

На рис.5 представлены процентнонормированные кумулятивные функции распределения значений OEM для выделенных групп.

Рис.5. Кумулятивные функции распределения концентраций ОБМ: а) здоровые люди; б) больные с СаОх почечными камнями; в) ниг- камнями; г) СаР; кам-

I»

нями; д) СаР^ коралловидными камнями.

• м га " $ОШЛ)

Видно, что различия максимально выражены для, так называемой 75-ой процентили. ¿месте с тем .среднегрупповые различия значений концентрации ОБМ достоверны (р < 0,05) лишь для Сольных с СаОХ и ШУг', с одной стороны, и коралловидными СаР£ камнями, с другой. Широкое перекрывание совокупностей распределений для больных МКБ объясняет низкую диагностическую ценность представленных данных,

3.2. Фракционный состав белков сыворотки крови и мочи при почечных камнях различного химического состава.

Метод диск-электрофореза в ПААГ является высокоразрешающим методом, однако, вызывает затруднение при количественной оценке на денситограммах белков, имеющих генетические варианты. Поэтому существует и применяется следующий подход при сравнении белковых .фракций биологических жидкостей как здоровых людей, так и различ- ' ных групп Сольных. Все электрофоретическое поле (см. табл.1) разделяется на зоны: преальбумина (ПрА), альбумина (Альб), постальбу-минев (ПА), трансферина (Тр), посттрансферинов быстрых (ПТрб) и медленных (ПТрм). Для каждой зоны определяется диапазон электрофо-ротических подвивностей и количественно определяется сумма всех белковых фракций, попадающих в ту или иную зону.

При сравнении содержания белковых фракций в указанных зонах,

накя были обнаружены достоверные отличия (0,001 <р <0,05) между здоровыми людьми и больными МКБ, в то время как среднегрупповые различяя для лсдей с выделенными разновидностями химических типов камней, были недостоверны. Более информативным и чувствительным параметром оказался коэффициент селективности (Р), определяемый как логарифм отношения концентрации белковой зоны в крови к концентрации той же белковой зоны в моче, и имевщий ясный физический смысл. В практике существует и используется модель почки, основанная на селективности фильтрации макромолекул, когда почка рассматривается как молекулярное сито о фиксированным распределением пор' по размеру. При этом коэффициент селективности Р показывает степень фильтрации белков в зависимости от их размера и заряда. Для всех выделенных групп о МКБ нами были определены значения Р и рассчитаны коэффициента парных корреляций Р внутри каждой из групп с различными по химическому составу камнями почек (см.табл.2).

Таблица 2

Коэффициенты парных корреляций значений Р белковых зон для больных МКБ

птРм

1,000

Альб ПА Тр ПТрм Альб ПА Тр

Альб "1,000 1,000

ПА 0,765 1,000 0,835 1,000

Тр 0,951 0,758 1,000 0,947 0,847 1,000

птРк 0,861 0,729 0,951 1,000 0,937 0,810 0,944

СаОх Щ/1*

Альб ПА Тр птРм

Альб ' 1,000

ПА -0,046 1,000

Тр 0,907 -0,022 1,000

птРн 0,661 -0,797 0,911 1,000

СаР,

Наиболее близкой к функциональной оказалась связь между значениями Р для альбумина и трансферина-при СаОх конкрементах. Для данной пары было рассчитано уравнение линейной регрессии (3):

Ральб" (0,315+0,150) + С0.871±0,054)Ртр (3)

г - 0,951 (Б^-О.Ш; я-Л)

Значение углового коэффициента уравнения (3) мэньше единицы, что г©

-Го-

ворит о сохранении селективности почки и лучшей фильтрации альбумина, имеющего меньшую молекулярную массу. 6 пределах уравнение (3) выполняется для СаОх камней почек и не выполняется для СаР^ конкрементов, что позволило разделить людей с указанными разновидностями почечных камней с достоверностью 79|.

По сравнению с белковыми фракциями крови, концентрации и количество фракций уропротеинов значительно варьировали для всех групп с МКБ. Вместе с тем, для них удалось выделить наиболее характерные виды уропротеинограмм. Первый тип уропротеинограмм характеризуется преимущественным содержанием полоо альбумина и трансферм-на, что указывает на высокоселективный характер фильтрации белков и неповрежденность "почечного,фильтра". Для второго типа, наряду с указанными выше полосами, встречаются также интенсивные полосы белков в зоне преальбумина и постальбумина. Третий, несколько реже встречающийся тип уропротеинограмм, характеризуется присутствием . набора полос для белков в посттрансфериновой зоне.,Наличие сывороточного спектра белков в моче свидетельстует о неселективной фильтрации, характерной для значительного повреждения гломерулярного аппарата почки. Таким образом, формирование даже одной химической разновидности почечных камней происходит в среде, где концентрация и фракционный состав белковых макромолекул значительно варьирует. Поэтому рассмотрим один из возможных механизмов вовлечения различных уропротеинов в камнеобразование - адсорбцию белков на поверхности камнеобразующих солей.

На модельных системах, в условиях близких к физиологическим (рН»6,0; 1;-Э70С), нами была изучена адсорбция сывороточных белков крови На поверхности моногидрата оксалата кальция (МОК) для двух случаев селективности.

Ммг/А

/

2

"Первая система - МОК+сыворо-точный альбумин (кривая I на рис.б), вторая система - М0К+ стандарт белков крови (кривая 2, рис.б). Полученные зависимости величины адсорбции (А) от концентрации белков (С)

' "¿оо ' юдо С("ГА)

имеют вид Лэнгмюровских изотерм сорбции.

Рис.б. Ленгмюровские изотермы сорбции для систем МОК+сывороточные белки.

Экспериментальные результаты были обработаны о помощью уравнения Ленгмвра в линейной форме:

_С _ _+ £ С2»)

А Аов' К А«м

Получены оледующие значения параметров сорбции: А„а* 28,2+2,1 мг/г, К ■ (1,02|0,3б)' 10 л/мг (сиотема I); А..* 50,5+4,2. иг/:Г, К=(0,20+

л/иг, Значения Ам полученные для систем, моделирующих камнеобразование в условиях выоокоселективной и низкоселективной фильтрации, как оказалось, лежат в диапазоне значешй количественного оодеркания белков в реальных конкрементах,

3.3. Определение химического составе почечных камней по индивидуальным белковым фракциям биологических жидкостей.

Наибольшие индивидуальные отличия в белковом спектре крови Проявляются а зоне посттрансферянов, где располагаются генетичеокие рарйанты гаятоглобияов (Ир). Используя метод диск-олектрофореза в (1ААГ, по числу а электрофоретичэской подвижНоотй фракций идентифицированы три основных фенотипа: Нр 1-1, Нр 2-1 и Нр 2-2 . Частота встречаемости каждого Из трех фенотипов Нр алй больных МКБ показана в табл.3 и сравнена ч таковой для группы здоровых , в .которой чаотота встречаемости фвнотипоз характерна для среднеевропейской.

Таблица 3

Распределение {%) фенотипов Нр в различных группах о МКБ

Группа исоледувмых ^ » ! Нр 2-1 | Нр 1-1

Здоровые люди 202 38,6 47,5 13,9

Больные МКБ 98 41,6 36,7 21,4

Больные о Н1)г 26 53,8 34,6 II.5

Больные с СаР^ 23 47,8 39,1 ; 13,0

Больные о СаОх 49 32,7 36,9, 30,6

Рецидив о С^Ох 22 31,8 27,3 40,9

Встречаемость фенотипов Нр у здоровых в больных МКБ достоверно нэ отличается (р>0,05) по критерию^ , В'то ла время, При дифференцировании, групп испытуемых согласно химическому составу почёчных камней показано, что в случае СаОх конкрементов доотог^риб Ср< 0,05) увеличивается встречаемость Нр 1-1 по сравнению со здоро-, выми людьми и больными с Св!^ и Н1/г* камнями. При этом для группы о рецидивными (повторными) СаОх камнями встречаемость Нр 1-1 допод-

нительно возрастает (р<0,01). Это дает основание рассматривать фенотип Нр I-I в качестве фактора риска заболевания СаОх камнями.

Для /становления количественных соотношений между относительным содержанием индивидуальных белковых фракций в сыворотке крови-нами использовался метод многопараметрового линейного регрессионного анализа. Вследствие значительных различий в количественном и качественном составе белков крови в посттрансфериновой зоне, поиск количественных соотношений рассматривался для разных фенотипов Нр.

Для фенотипа Нр I-I выборка была.довольно ограничена, однако, показано, что только определение частоты встречаемости Нр I-I позволяет достаточно надежно дифференцировать больных с СаОх камнями ¡ почек от больных с CaP¡_ и HUr-конкрементами. Для фенотица Нр 2-1 выделен ряд белковых фракций, определяющихся с наибольшей достоверностью. В качестве зависимой переменной рассматривалась фракция альбумина, а Нр 2-1 определялся как сумма 7 индивидуальных фракций. Нами был использован эмпирический подход, основанный на исключении одной или сразу нескольких переменных и поиске уравнений с высоким значением коэффициента множественной корреляции (40,95) и достоверными коэффициентами регрессии. Адекватность моделей проверялась с использованием Р -критерия. Оказалось, что из множества рассмотренных уравнений вышеназванным критериям удовлетворяло лишь уравнение регрессии (5), составленное для больных с СаОх камнями почек, свя- i зывающее относительное содержание в крови альбумина с относительным содержанием трансферика, фенотипа Нр 2-1 и «^-макроглобулина:

Альб • 86,29 - 0,99(Тр) - 1,27(Нр 2-1) - 1,7$(<*2-и) (5)

Корреляционная матрица, составленная по значениям парных коэффициентов корреляции, показала независимость используемых переменных.

Анализируя уравнение (5), отметим, что остатки, полученные после подстановки первичных данных для больных с СаОх камнями, лежат в пределах +2S В случае же с СаР-^ камнями, значения остатков оказываются >2S0¡j|lt, что дает возможность разделить людей с СаОх и СаВъ камнями о достоверностью 96#. Однако, предложенный метод реализуется только для больных МКБ о фенотипом Нр 2-1. Неожиданным представляется тот факт, что в уравнение (5) вошли белки, изменения относительного содержания которых в крови наиболее существенны при различных почечных заболеваниях.

Таким образом, количественные связи между определенными белка-га биологических жидкостей могут быть использованы в качества чувствительного тяста для определения химического состава камней в почках.

- 17 -

в и в о а ы

1. Разработан новый высокочувствительный способ определения концентрации белков в биологических жидкостях на основе использования трикетикового красителя ПК-1'й. Сконструирована и изготовлена высокоразрешающая денситометрическая установка, позволившая определить количественный и качественный состав белковых фракций более чем в 500 пробах различных биологических жидкостей.

2. Получены и проанализированы плотности распределения значений общего белка и фракционного состава белков сыворотки крови и мочи испытуемых с различными по химическому составу почечтшинг камняг ки. Показано широкое перекрывание совокупностей распределений, обуславливающее их низкую диагностическую ценность.

3. При кальцийсодержащих камнях выявлено значительное количество кислотостабильных уропротеинов, оказывающих влияние на образование данного типа камней. Отмечается, что: кислотостабильные белки характеризуются наличием в их составе большого количества остатков сиаловой кислоты- и дикарбоновых (аспарагиновой и глутаминовой) аминокислот, обуславливающих их кальцийсвязывающую способность.

По данным фракционного состава белков сыворотки крови и мочи определены коэффициенты селективности протеинурии. Показана значи- ' тельная вариация определяемых параметров для всех групп с МКБ. Выявлены характерные отличия в показателях селективности, отражающие нарушение фильтрационной способности почек при СаР^ конкрементах.

5. Проанализированы физико-химические особенности влияния уро-протеинов на камнеобразованив. Показано, что включение белков в состав почечных конкрементов в значительной мере объясняется их адсорбцией на поверхности камнеобразующих соединений, а широкое варьирование количественного и качественного состава белков органической матрицы почечных камней отражает варьирование содержания и фракционного совтава уропротвинов индивидуальных больных.

6. Определена частота встречаемости основных фенотипов гапто-глобина кров» в зависимости от химического состава почечных камней. В' распределении фетотнпов гаптоглобина для больных с СаР[ и Н11г-' . камнями не обнаружен© достоверных различий от здоровых людей. Для бо-льных с СаОх почечными камнями вероятность встречаемости фенотипа Нр 1-1 значительно возрастает. Особенно это выражено для подгруппы с рецидивными СаОх камнями. Последнее рассматривается как обнаружение нового, достоверного фактора риска образования СаОх конкрементов в почках.

7» Получены и проанализированы многопараметровые уравнения линейной регрессии, связывающие относительное содержание белков крови при различных по химическому составу камнях в почках. Показано пркн-

- IS -

ципиальная возможность использования количественных соотношений между белками для дифференциальной диагностики конкрементов. Найдено 4-х параметровое уравнение овязи между относительным содержат' нием в крови альбумина, траноферина, гаптоглобина фенотипа 2-1 к с^-макроглобулина о множественным коэффициентом корреляции 0,967. позволяющее о достоверностью 96% разделить группы с CaPt и СаОх камнями в почках.

СПИС0"_РАБ0Т_0ДгаИ1ШАННЬХ ПО_ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Билобров В.М., Миронов О Л. Биохимический состав и струк*-тура органической матрицы почечных камней // Структура органических соединений и механизмы реакций: Сб. науч. тр. - Киев: Наукова думка, 1990. - С. 149-179.

2. Билобров В.М., Миронов 0.J1., Хилько С.Б. Метод диск-электрофореза белков мочи в полиакриЛамдном геле // Лаб. дело. - 1967. -*9. - С. 678-680.

3. Билобров В.М., Миронов ОЛ. Простая денситометричэская установка для количественного анализа электрофореграмм в полиакрил-амидном геле. Донецк, 1990. - 14 с. Рукопись деп. ВИНИТИ,"* 2851 -В 90.

4. Билобров В.М., Миронов ОЛ., Повх Н.Ю. Кислоторастворимые уропротеины больных мочекаменной болезнью // Биохимия - медицине. Тез. докл. Всесоюзной конф. - Л,: BMA, 1988. - С. 37-38.

5. Миронов О.Л, Адсорбция сывороточных балков на поверхности моногидрата оксалата кальция. Тез. докл. 2-й конф, молодых ученых-химиков. - Донецк, 1990. - С. 138.

6. Применение триметиновогб красителя для окрашивания белков поело электрофореза на ацетате целлюлозы / О.Л. Миронов, В.М. Билобров, О.С. Коврижкина и др.// Лаб. дело. - 1990. - №6. - С. 9-II.

7. A.c. #1624323 СССР, МКИ , G Ol V 33/48. Способ определения белка в моче / ОЛ. Миронов, В.М. Билобров, Т.Н. Соломойченко

и др. И Заяв. JÊ460B975 от 25.11.68; Опубл. 30.01.91, Бюл. №4.

8. Bilofcror Y.Iii , MlroroT O.L. , Ulm bJ ant в S.Z. Several peculiarities of the blood «arua an) urine proteire fractional ccn-poeition in patiente with various types of nephrollthineia // froo. Ü oougrQBs Uurop. Левое. Urol. - Amsterdam} Karger, 1990. -

P. 457.