Структурно-функциональные характеристики пептидов при эндогенных интоксикациях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГб од

2 8-1110111993

АКАДЕМИЯ НЛУЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА СЛДЫКОВА.А.С.

На правах рукописи

СУЛТАНОВА ЗДЬВЙРА МИТХАТОВНЛ

УДК 577.112 .

сдаКТУРНО-ФУНКВДОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕПТИДОВ ПРИ ЭНДОГЕННЫХ ЙНТСКСИК/ЩШХ .

Специальность 02.00.10 - "Биоорганичеекая химия, ::иния природных и физтааогйчески ак'хившх веявтв"

/ВТОРЕФЕРАТ диссертации т соисканяо ученой степени кандидата хямичесник наук

Ташкент - 1993".

Диссертационная работа ьшеднена в Институте биоорганической химри ш. шсадеынка Садыкова A.C.

Академии наук Республики Узбекистан.

Научный руководитель! доктор биологических наук,

ррофесоор Садихов Ш.И.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор КШдаяюв II. X.

кандидат биологических наук Голубенко 3.

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУв.

Защита состоится u¿0¿ií 1993 г. в 3_час. на

заседании специализированного совета Д 015 21.21 при Институте биоорганической химии имени академика Садыкова A.C. АН Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент, проспект акад. Аб-дуллаева, '83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академика Садыкова A.C. АН Республики Узбекистан.

Автореферат разослан " ¿ICLf 1593 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук

Н.И.Барам

Актуальность исследования. При многих патологических состояниях,, сопровождающихся' эндогенной интоксикацией, в организме больных образуются и накапливаются пептиды о молекулярной массой 300-5000 Да, так называемые пептиды средней молекулярной массы (СМИ), отсутствующие в крови здоровых доноров. Отдельные фракции пептидов СМИ, выделенные из плазмы крови больных с эндогенной интоксикацией, обладают различной биологической активностью, вызывают расстройство ряда регуляторвых процессов. Целш"! ряд тяжелых осложнений, таких как полинейро-патия, перекардиты, анемия, расстройство гемодинамики,.сердечной деятельности, связывают с увеличением содержания пептидов СММ в организме больного. Одяако многие вопросы, связанные с происхождением пептидов СММ в организме, механизмом их действия остаются еще невыясненными.

В исследовании гнойно-септических заболеваний и острой почечной недостаточности - (ОТШ), сопровождающихся эндогенной интоксикацией, большое значение придается нарушениям системы гемостаза и функций биологических мембран. 'Данные нарушения связывают с пептидами СММ, накапливающимися г. организме борных. Нарушение системы гемостаза'является грозным осложнением и может быть причиной кровотечений и тромбозов в медицинской практике. Наиболее тяжелые проявления интоксикации связывают с нарушениями функции•мембран организма. В связи с этим актуальной является проблема выделения факторов,, влияющих на ге-мостаэиологические характеристики крови и Функции биологических мембран, изучение их физико-химических свойств й структуры. ;

Выделение в индивидуальном состоянии пептидов СММ, определение их биологических и фьзико-химических свойств и структуры позволило бы найти подходы к методам их выведения из организма с- использованием биоспецифических методов, выяснить происхождение их в организме и создать в будущем эффективные ингибиторы.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось- выделение, исследование физико-химических параметров и биологических свойств пептидов СМ иа плазмы крови больных с ОШ и гнойно-септическими заболеваниями, исследование одного из методов детоксикации крови аутотрансфуэии ультрафиолетом

облученной крови! Для достижения поставленной цели решались следующие задачи : ' '

-■ выделение- из плааыы крови ¡больных с СЩ и гнойно-септическим» заболеваниями фракций пептидов СШ ;

- исследование влияния давних фракций на систему .свертывания' крови и функции мембран;

- выделение из этих фракций гомогенных пептидов, ответственных за биологическое действие;

- определение аминокислотной последовательности пептида с ме^браиотропиш действием;

- исследование механизма дейстшы существующего метода де-токсикацш крови путем аутотрансфугни ультрафиолетом облученной крови (АУФОй). '

Научная новизна и прь.стическаь значимость. Из плазмы крови больных с Olííl и гнойно-септическими заболеваниями впервые выделены в индивидуальном состоянии три пептида: пептид "Г-2" ■ с пшеркоагуляцнопной активностью, пептид "Ц-К" с неспецифи-чеогаш мембранотротшм действием, проявляющимся в уменьшении среднего времени шзни биелошшх фозфолинкдных мембран (БФМ), и п.-.итвд "Д-3", увеличивающий проводимость Ш1. Установлена, полная аминокислотная последовательность пептида "Д-3", содержащего 44•аминокислотных остатка 'й состоящего из.двух одинаковых полипептидных цепей, соединенных мезд'у собой дисульфидной связью, [¡оказано, что..амииокиелотНс.ч последовательность пенти-' да "Д-3" идентична участку одного. ií;i белков' 'Вено-Джонса SCW, занимавшему в молекуле- положение 79-1Ш.

Показано, что процедура АУФСЙ приводит-к снижению в крови больных с гнойно-септическими заболеваниями уровня пептидов (•¡¿М. Исследовано участие в этом процессе альбумина и установлено, что облучение ультрафиолетозын светом альбумина in-vitío способствует увеличению его связывающей- способности по отношение к пептидам СШ. На основании атнх .данных разработана программа' лечения- больных с гнойно-септическими заболеваниями, ^г_к..ч;едая .необходимое .число сеансов 'АУФОК'. в зависимости от исходного уровня пептидов СЩ1. в,, крови-больных,.

Показано,-что у. беременных с почечными ка'гюйно-септи-" Че-скини заСшк-ьанилми повышено содержание'пептидов СММ и контроль уроскя - пептп^ов мелет служить прогностическим признаком {'лзгнтнн змзегешюй интоксикации' у беременных с патологией.

Публикации и апробация исследований ■ Оснопше положения . диссертационной работы были доложены и обсуждены на 1 конференции биохимиков Узбекистана, г. Ташкент (1986), на 14 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, г. Ташкент (1983), на 14. Международном конгрессе по биохимии в ЧСОР, г. Прага (1988), на Международном симпозиуме по биотехнологии, г. Прага (1983), на 10 Всемирном.конгрессе по ^ивотннм, растительный и микробным токсинам, г.Сингапур (109.1), 1га 5 конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, г. Ташкент (3991). По полученным данным имеется 10 публикатцш.

Структура и обьем работы. Диссертация нзлояена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения', экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 118 наименований, из них 56 зарубежных авторов. Работа содержит 15 рисунков.

Результаты и их обсуждение.

1. Выделение и свойства пептидов СММ.

Исследовали плазму крови больных' с ОПН " гнойно-септическими заболеваниями, находившихся на лечеИии в отделении реаниматологии и анестезиологии 1 клиники ТашГосМИ и в отделении патологии беременности Института акушерства и гинекологии МЗ ГУз. Для первоначального выделения фракций пептидов СШ использовали общепринятый .метод гель-хроматографии на колонке (1,5x100 см) с сефэдексом 0-25 . На рис.1 представлены типичные злюционные диаграммы разделения плазмы больных с ОПН (А) и гнойно-септическим состоянием (Б). Для контроля в аналогичных условиях Фракционировали плазму крови здоровых доноров (рис.

Анализ ялюционннх диаграмм разделения пдаями болы^:* и

1В).

Рис.1.Гель-филь трация пла-йми крови больных о СЩ(А), гнойно-септическими заболеваниями (Б) и здоровых доноров (В) на колонке (1,6x100 см) с сефадексом Г-Р.5 в

- 4 -плазмы здоровых' доноров показал, что в плазме больных присутствовали фракции • А-5 и А-б, не обнаруживаемые в крови здоровых доноров. Содержание же пептидной фракции А-4 увеличено .

Для характеристики выделенных пептидных фракций исследовали их действие на систему свертывания крови и биологические мембраны.

Исследование фракций пептидов (ММ, влияющих на систему свертывания крови . Для идентификации фракций, влияющих на систему свертывания крови, исследовали действие всех выделенных фракций на параметры тромбоз,истограшы (ТЭГ) и агрегацию тромбоцитов . Исследования были проведены совместно с Институтом акушерства и гинекологии №3 РУз.

На состояние системы свертывания крови, если его оценивать по интегральным показателям ТЭГ, влияли две пептидные фракции А-4 и А-б, выделенные из плазмы крови всех групп больных (таблица 1). Фракция пептидов из плазмы здоровых доноров АЗ-2 заметным эффектом не обладала.

' Таблица 1

Фракция I г(мин) I К (мин)I г+К I мА (мм) 1ИТП (усл.ед.)

А-4 13,8^,6 12,2+0,4 25,0 ■аз, 4+0,9 5,2+2,1

£-1,3 ¿-0,8 ¿-2,1 ¿-3,2

А-5 11,2+0,6 9,0+0,7 20,2 44,0+1,5 10,1+1,5

£-2,0 £-1,8 ¿-2,3 ■г-4,0

А-б 8,2+0,8 5,7-Ю,5 13,7 . 50,7+0,8 18,4+2,2

¿-1,8 «-1,2 £-2,1 ¿-3,2

АЗ-2 12,0+0,6 9,НО,8 21,1 43,0+1,1 9,1+1,8

£-1,4 £-1,6 £-1,8 £-2,8

норма 11,8+0,8 8,7+0,7 20,5 43,2+1,9 9,35+1,3

¿-2,04 £-1,9 £-4,6 ■■ ¿-3,2

Фракция А~4 увеличивала показатель '"г+К" ТЭГ, что свидетельствует об увеличений времени свертывания крови и замедленном образовании сгустка и расценивается как хронометрическая (зависания от времени)- гипокоагуляция . Гг.локоагуляцию подтверждает уменьшение показателя " п\А" ТЭГ. Уменьшение же показателя ''¿ЛИ" ТЭГ является следствием структурной гипокоагуля-.

ami.

Противоположным эффектом обладала' фракция .А-б: Данная', фракция вызывала снижение показателя " г+К" Т'РГ, т.е. уменьшение времени свертывания крови.. Это состояние хронометрической гиперкоагуляции подтверждается и- увеличением показателя " тА" и "ИТП" ТЭГ. ' .

При определении .агрегации-тромбоцитов использовали метод, ' основанный па регистрации изменений оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы после введения в нее индуктора агрегации аденозиндифосфата (АДФ1 -в концентрации 1x10 М, обеспечивающие максимальную агрегацию тромбоцитов.

Фракция А-4 угнетала.агрегационну»- активность тромбоцитов, что проявлялось в уменьшении их максимальной агрегаций, фракция А-6 вызывала активацию агрегамионной активности тромбоцитов, что проявлялось в повышения максимальной агрегации'под воздействием АДФ-.

По данным ТЭГ и агрегации тромбоцитов можно сделать вывод о том, что фрашш А-4 вызывала хронометрическую » структурную гипокоагуляцгао, обусловленную, по-видимому, угнетением агрега-дионной активности тромбоцитов. Фракция А-6 .опадала- протиго-золшш эффектом в отнояешм агрегаций тромбоцитов и вызывала фонометрическую гиперкоагухлциго.

Исследование действия фракций пептидов'СШ на биологичес-зде мембраны. Исследовали влияние-фракций А-4, А-5 и А-6, выделенных из плазмы крови больных с ОПН,- гнойно-септическим :остоянием и здоровых допоров на колонке с.сефадексом G-25 [рио.1), на проницаемость бислойшх фссфолицидных мембран, :ШМ), сформированных из суммарной фракции фосфолипидЬв бкчь-;го мозга. Исследования проводились 'совместно с лабораторией ¡иофиэики клетки Института физиологии АН рУэ. Из всех фракций ¡вменение проводимости БФМ выбывала только фракция А-б, причем ¡ля:. реализации мембранотропного эффекта необходимо было при-:утствие в среде, омывающей ЕФМ, ионов калия или натрия. Так, ipn наличии в среде, смывающей БФМ, 10 мМ КШ или NaCl и фрак-щи А-б, выделенной из Б мл плазмы крови, проводимость ВШ озрастала на 2 'порядка, достигала 2,15 хЮ ом'/см при норме ,34x10 ом /ом'. Суммарная фракция АЭ-2, выделенная из плазмы доровых доноров, не.вызывала изменений проводимости ИМ.

В крови больных с ОПН и гнойно-септическим состоянием

имеется эрекции' среднемолекулярных пептидов, обладающая мемо-ранотропнш действием. Возможно, наличие этой фракции в крови бачьных к вызывает нарушение функций мембран клеток и. в какой-то степени обуславливает проявления эндогенной ии-токсмкац-ш. С целью получения в гомогенном состоянии пептидов, ответственных за влияние на систему свертывания кроьи и биологические мембраны, активные фракции А-4 и А-6 были подвергнуты дальнейшей очистке,

Выделение индивидуальных пептидов,_едияшич ца систему

сВертьтакпя крови. Зля-выделения'использовали хроматографию на колонке (1,0 х 100 см) .с ТСК-гелем HW-40. После разделения фракции Л-4,- обладающей-гииокоагуляционной активностью, . было получено 3 фрсКЩ'И' (рис.2А). При этом ни в одной из фракций не обнаружено гишжоагуляционной активности.Объединение трех выделенных фракций пептидов, упаривание до исходного объема не приводило к восстановлении 1гипокоагуляционной активности. По-видимому, гипокоагулдционный эффект обусловлен не каким-либо отдельным пэпачедом, а комплексом пептидов, который разрушался при хроматографии.

.Л__)

-г— й • m 1 „

Рис.2. Разделение фракций А-4(А) и А-о (Б) на колонке (1,0x100 ем) с ТСК-гелем }Ы-40 в воде, доведенной аммиаком до pH 8,0. Скорость алюции-12 мл/час.

При; разделении на этой же колонке фракции а-6 такле было получено 3 фракции (рис 2Б). Гиперкоагуляционная активность, была обнаружена ' во фракции Б-1. Фракцию Б-1 подвергали гидрофобной хроматографии. на колонке (1,6x8,6' см) с полихромом-1 . Пептидные фракции элюировались путем повышения концентрации ийопропанола в воде (.рис.3). ' - .

При 50 Хгной концентрации иаоиропанола элюировалаеь фракций В-2, сохраняк-ля гиперкоагулйц'лонйш свойства. Далее фракция В-2 бкла дочищена-БсйХ на колонке (4,6x75 мы ) 'Ultropaok

X.

Рис.3. Гидрофобная хроматография фракции Б-1 на колог-е- (1 »0x8,5 см) с • полихромом-1.Элющго проводили ступенчатым градиентом изопропэнола в воде. Скорость элвцик 20 мл/час.

ТМС-250 в градиенте ацетонитрила (рис. 4). Из полученных трех фракций лвдяь фракция Г-2 обладала гиперкрагуляцгашой активностью и была гомогенна при анализе на тонком слое ■ в системе 311УВ. Аминокислотный состав пептида Г-,? представлен п таблице 2.

Ат

г(! .w.tif рис.4. Высокоэффективная

хроматография франции Ъ-2 Па колонке (4,6x75 мм) и^гораск ТМС 250 в градиенте котрнтрации ацетони-. трила в О,, I: ТФУК.

Скорость потока 0,5 мл/мин

^ £ ? ^ ¡1" 1« ; ¡¡Г г

я '

Моле1сулярную массу пептида определяли методом масо-спект-ометрии, она равна 2'112 Да. При определении Н-концевого аминокислотного остатка были о'знеоужены только дансильные произ-одные е-лизина и о-тлрозина-. Следовательно, гу-концевой остаток ептида Г-2 был блокирован. ,

Т.о.-, из плазмы крови больных о ОПН я гнойно-септическими гболеваниями выделен в гомогенном состоянии гептадекапептид ■2 , функциональная активность которого проявлялась в шеркоагуляционных нарушениях системы свертывания крови.

Выделение и характеристика пептидов,_обладающих .мембра-

ггропным действием. Фракции пептидов Б-1, ё-2 и'Б-3, подучен-19 при разделении мембранотропной фракции А-б на колонке с 'К-гелем (М-40 (см. рис.2Б), исследовали на проводимость ММ. 1И атом обнаружили , что активность в отношении БМ сохраняла ть фракция Б-2. Даннуг. фракцию разделяли на колонке (1,0x90 ) с еефядексом 0-25 (рис.Б). При этом получено три фракции,

две из которых сохраняли ыеморанотрсшше действие.

Таблица 2

Аминокислотный'состав пептидов, выделенных из плазмы крови больных с 0I1H и гнойяо-сепгичесгаши заболеваниями.

Аминокислоты 1 Пептид Г-2 1 Пептид Д-2 1 Пептид Д-3

Азх 2,01 (2) 4,60 (4) 3,20 (4)

Thr 1,00 (1) 2,67 (2) 0,92 (1)

Ser 1,92 (2) 4,54 (4) 0,17 (-)

Six 2,52 (2) 5,71 (5) 4,b7 (5)

Pro 0,83 (1) 3,33 (3) 1.81 (2)

Gly 1,20 (1) 3,52 (3) 2,60 (2)

Ala 1,63 (1) 2,80 (3) 0,19 (-)

1/2 Cys - • - 1,10 (1)

Val 0,94 (1) 2,64 (2) 1,41 (1)

Met 0,23 (-) 0,78 (1)

lie' 0,36 (-) 1,11 'CD 2,30 (2)

Leu 1,97 (2) 3,33 (3)

Tyr 0,50 (1) 1,59 (2) 2,ao (3)

Phe 0,97 (1) 1,55 (2) 1,24 (1)

His 0,46 (-) 1,02 (1)

Lys 1,31 (1) 2,67 (2) -

Arg 0,65 (13 1,70 (2)

Количество 17 42 22

остатков

Молекулярная

касса (Да) - - 2112 ' 6660 2500

w

/L'

Рис,{). Хроматография <ррак-■ ции U-2 на колонке (1,5x100 ом) с сефаде'ксом Г-25 ь 0,01 .vS натрий-ацетатном буфере, рН 6,7. Скорое ь элюции 13 мл/чао.

D I

Эти Фракции , Д-2 и Д-3, дочитали о помоядю обращенноФаэо-вой ВЭ5Х на колонка (4,0x50 мм) Zorbax ODS . Очищенная Франция Д-2 обладала неппешфшееким мембрэнотрогиад действием, что проявлялось-в уменьшении среднего времени жизни мембран. Очищенная йракция Л-3 увеличивала проводимость FTM дл1 исчов натрия и калия.

Гомсгечность выделенных пептидов была доказана электрофорезом в градигите концентрации гол!кч<риламидиого геля (--ПЛАТ) и распределительной хроматографией в тонком слое целлюлозы в системе БПУВ. Аминокислотный ■ состав пептидов представлен в таблице 2. Молекулярная масса (Мм) пептидов определялась двуйя методами. Перпьш метод- зто ВРЯХ на колонке (8,0x300 мм) •'' Glaspack G-300Ö SW *то сравнению с белками-маркерами, При згом Мм для пептида Д-2 составляла 5С>Ш'Да, а для игптила Д-3 5012 • Да. Второй метод' - это электрофорез в градиент? концентрации ПЛАТ в присутствии додецилсульфата патрич. т , отделенная вторым способов, составляла для пептида Д-Р ПБОО Да, для пептида Д-3 - 2000 Да'. Для пептида-Д-2 ;-ím , спр'елеляшне двумя способами, совпадали и находились в чороием соответствии о расчетными данными по аминокислотному составу. Для пептида Д-3 Мм , полученная с помощью электрофореза, сопиадала с Мм , рассчитанной по аминокислотному составу, но была в два раза меньше Мм , определенной путем сравнения с белками-маркерами при ВЭЖХ. Так как в составе пептида Д-3 содержался один остаток пслуциотина, то можно предположить, что пептид Д~3 состоял из двух одинаковых цепей, соединенных днсульфйдной сиязаю. Основанием для этого служило проявление пептида, обработанного меркаптозтанслом, в виде одной полосы при электрофорезе а ПЛАТ. Для подтверждения этого предположения сравнивала аминокислотные 'составы нат'ивного пептида Д-3 и пептида Д-3, обработанного надмуравьиной' кислотой. При зтом молярные соотношения и составы всех аминокислотных остатков совпадали.

При определении N-концеиых аминокислотных остатков были обнаружены для пептида Д-2 лишь дансйдыше производные е-лизина и о-тирозина, а для пеп-тида Д-3 только о-тирозйна. Следовательно, N-концевые остатк: данных пептидов Омли блокированы.

2. Определена« последовательности аминокислотных

остатков пептида Д-3. Так как пептид Д-3 состоит из двух одинаковых цепей, соединенных днсульфидной связью, ю первоначально- проводили восстановление дисульфвдных связей и карбоксшетмирование образовавшихся дисудьфидных групп ююиодуксуеной кислотой.

Ы-концеьой аминокислотный остаток пептида Д-3 блокирован Так как в составе пептида Д-3 омоется пять остатков глутамино-вой кислоты или ее амида, можно предположить, что на N-конце молекулы пептида Д-3 находится гдутаиин. который макет дезами-дироваться с образованием лакгаыа'Ширродидонкарбоговой кислоты!. Мы попытались раскрыть аирродидоновое кольцо,обработав пептид Д-3 метнламиноы по методу, предложенному Мураноьой Т.Д. Обработка метиламином'в течение 14 часов при 37*0 не привела к раскрытию нольца. Липа, после обработки в течение двух суток при сО*С даьсилнрование нозьояило обнаружить дансйлглу-тамшювую кислоту. Т.о., ыо.чшо сделать вывод, что Н-кояцс-вш остатком пептида Д-3 был глугашн.

Для установления С-концегой последовательности пептида Д-3 использовали расщепление карбоксипеитида&ой У.Посла научения построенных кинетических кривых установлена следующая С-концеьая последовательность: -1 1е-111Г~РЬе-01у-01п--С0Ь'Нг .

Первичное расщепление пег.гида Д-3 проводили хиыотрипси -ном. Химотриитическпй гидролиз приводили при рЕ 8,3 в течении 4 часов при фермент-субстратном соотношении 1:50 . Гидролиз останавливали подкисленном реакцисщюй смеси до рН 3,0. В хи-ыотрнптическом гидролизате пептида Д-3 И-концевой анализ подводил обнаружить остатки глицина,- треонина, аспарагиновой кислоты и цистеина.' Полученную смесь как минимум четырех пептидов разделяли методом В&ЖХ на колонке (4,6x250 мм) 2огЪая С-18 (рис.6). При этом било получено пептидов,обозначенных нами ХТ-1.... .ЧТ-7, которые по анализу И-концевых аминокислотных .остатке» раоиредемтеллюй хроматографии на пластинках с тонким слоем целлюлозы'были гомогенны .Г"

аминокислотная последовательность выделенных пептидов определяли классическим мс-годг,м Уды&ла ь ручной модификации с. идентификацией .Н-кэннеь^х амннокымютных остатков укороченных и-лш«оь в виде 'дг-.ч^шлроааьодных -таблица 3). У пептида ХТ-5 Я-ьч'-нцеьл} ышнэкислота не iiu.ua обнаружена. По-видимому, фрат-

!-ио. 6. Высокоэффективная хроматография химотрипти-' ескрго гидрэлиэата пептида Д-З на колонке (4,6x260 к-м) гогЬах С-18 в градиенте концентрации метанола в 0,1 X ТФУК.

мент ХТ-5 занимает в исходном пептиде Д-З Н-копщщое положение. После обработки метиламином на Н-кон:;е фрагмента ХТ-Б был обнаружен остаток глутанина. Деградацию £оагмента ХТ-б проводили после обработки его метиламином.

Таблица 3

Пептид I Аминокислотная послеловаткщьность

ХТ-1 Qly-Gln

ХТ-2 Tbr-Pho'

ХТ-3 Cys-Glx-Glx-Tyr

XT-4 Glv-Asx-Туг

ХТ-5 Gln-Pro-GIx-Asx- Jle '

ХТ-6 Asx-Asx-Val-Pro- lie

ХТ-7 Asx-Asx-Val*-Pro- ¡le-Thr-Phe

Как видно из таблицы 3, фрагмент ХТ-1 являлся С-концевым в пептиде Д-З. Б целом химотриптипеспий гидролиз пептида Д-З прошел достаточно специфично, только в пептиде XT-7 связь Tle-Thr была частично устойчива,' что позволило локализовать гептацы ХТ-2 и ХТ-6.

. Для получения перекрываниях пептидов пептид Д-З был расщеплен стафиллококковой протеин ээой из St. aureus но ос таг ¡сам глутаминовой и аепарагиновой кислот. Гидролиз проводили при рН 8,0 в течение 4 часов и останавливали подкислением до рН 3,0. Гидролизат был разделен обраиэннофазоной ВсйХ на колонке

I (4,6x250 мм) Zorbax С-18 (рис.7 ). при этом было получено 5

фракций, обозначенных нами СП-1____СП-о, две из которых по

данным тонкослойной хроматографии на пластинках с целлюлозой и N-концевого анализ? были гомг-еннн, это фракции СП-1 и СП-2.

f'iic. 7. Еисашоф^ентианий хроматография смеси пептидов после гидролиза пептида Д-3 глута*ишовсн\ протеина-зой на колонке (4, <3x260 |.ш) Zorbax О-ii» в градиенте концентрации метанола в 0,1 % ПУК.

Фракция СН-З была дочищена на пластинках с тонким слоеы целшлози. Фракции ОН 4 и 0II-5 состояли из смеси .нескольких пептидов и даиее нами не рассматривались.

Результаты определении структур!.! выделенных пептидов предот^.'лени в таблице А . Деградацию фрааннта ОП-l проводили после об}аботки его метиламином.

Таблица 4

Пептид I Аминокислотная последовательность

СП-'l Шп-Pro-ßlx-Asx

СИ-2 . Asx-Val-Pro-Ile-Thr-Pi-Ui (Q]y.,ülx)

СГ1-3 I'le-Gix-Asx-T/r-1'уг-Cys-Glx (61 кДуг,Аз>П

Как видно не таблицы 4, фрагмент СИ-2 является С-концевьш пептида Д-3. Установлений аминокислотной последовательности фрагментов СП-1 и СП-£ позволило локализовать шптиди .ХТ-3, ХТ-4 и ХТ-5 в следующем порядке: ?'Г-5 'ХТ-4 - ХТ-З. Фрагмент С11-2 дал возможность установить порядок расположения пептидов ХТ-7 и ХТ-1. -

Результаты определения структуры выделенных пептидов, данные но определению О-концевой последовательности остатков в молекуле позволили реконструлроьать полную аминокислотную последовательность .пептида Д-3 (схема 1 ) . ..

Одним из основных механизмов сбразова.шя пептидов СШ б плазме крови больных в настоящее время считают гидролиз белков плазмы крови различными протоиназыи. Поэтому мы провели ана-лиа аминокислотных последовательностей основных белков плазмы крови на. содержание последовательности, соответствующей пептиду Д-3. Последовательность аминокислотных сстатков, идентичную

- 1.3 -

Сксна 1

Полная аминокислотная последоватьиное?!, пептида Д-3.

01п-Рго-31х-Азх-11в-81у-Азх--Туг-Туг-(!,,&-й15,'-|'з1*-Туг-

„__ХТ-5 ^_ХТ-4____ _______ХТ--3____„

__ОП-1_____ __________сп-з_______.______

-Азх-Азх-'/а1~Рго-11е-ТЬг-Г-П'З-у-С] п

_____.хт-'б_______хг-г____хт-1^

___________ХТ-7______

.. __________________ОП-2__________■_______

Х'Г - пептиды химотриптяческсго гидролша

СП - пептиды гидролица глуташяовой протеинами

пептиду Д-3, мы обнаружили в юриаоедьной ооласти шшуиоглсбу-лина-одаого из белков Вено-Джонса . Белки Ьэнс-Д.ганса накапливаются в организме некоторых больных со злокачественными новообразованиями б относительно высоких концентрациях и выводятся с мочой. У болышх с различной патологией белки Бенс-Дюнса различаются по последовательности аминокислотных остатков только в и-концевой части полипептидных цепей в положениях от 1 до 108 остатков. Аминикнолотная последовательность пептида Д-3 занимает положение 79 -100 молекулы белка Ввнс-Д-ионса

3.- Пептиды СШ'и аутотранефузия ультрафиолетом облученной крови.

При септических заболеваниях интоксикация сопровоадается повышением концентрации пептидов СШ в плазме крови больных. В то же время после процедуры АУФОК у больных уменьшаются признаки интоксикации и улучшается самочувствие. Поэтому ми исследовали действие АУФОК на содержание пептидов ОЩ в плазме крови больных с гнойно-септическими заболеваниями акушерской этиологии. Уровень пептидов СШ в плазме крови определяли экспресс-методом, основанный на реагацш Лоури, до и после сеансов АУФОК. Полученные данные представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, после сеансов АУФОК происходит снижение оптической плотности раствора на 30-40 X. Так как крупные белки были предварительно осаэдеяы ТХУК, то данное снижение оптической плотности указывает на соответствующее снижение концентрации пептидов СШ в сунернатанте.

Таблица Б

Оптическая плотность плазмы крови больных с гнсййо-септическими заболеваниями акушерской этиологии до и после 5 сеансов АУФОК.

I Оптическая плотность Больные I до ЛУ'ШС I после б сеансов АУФОК

1

2 3

Здоровый донор

0,410 0,720 0,960

0,200-0,300

0,260 0,400 0,670

Для того, чтобы определить изменение фракционного состава пептидов СИМ после АУФОК, исследовали плазму крови больных на колонке Г Г,5x100 см) с сефадексом в-25 до и после сеансов АУ-СОК (рис.8). Как видно из рис. в , после процедуры АУФОК наблюдается снижение в крови всех фракций пептидов СММ - А-4, А-5 и А~б. Наиболее эффективное снижение, достигалось, для фракции А-б, наименьшее - для фракции А-4.

'110

Рис.8. Гель-хроматография плазмы крови больных с гнойно-септическими .заболеваниями ло процедуры АУФОК (А) и после 6 сеансов -АУФОК (В) на колонке (1,5x100 см) с сефадексом Г-25 в 0,01 М натрий-ацетатном буфере,рЯ-6,7.

Так как Фракция А-6 обладала мем6ранг>тропным действием, то мы исследовали проводимость БФМ в присутствии плазмы крови до и после процедуры АУФОК. Плазма•крови ?дорового донора не изменяла проводимости БФМ. После процедуры АУФОК исходная проницаемость плазмы крови больных уменьшалась.

]'з литературы известно, что при заболеваниях, связанных с накоплением пептидов-СММ. в крови, наблюдается снижение свободных мест связывания на молекуле альбумина . В то же время из-

иеапю, что гог.-ле УФ облучения повышается еиявиьакшщя способность альбумина по отношению к ьэокрасителю. Поэтому наш были проведены модельные эксперименты по связыванию альбумина непосредственна со мнемолекулярными фракциями до и после облучения УФ светом в тех- же условиях, как и при АУЖЖ.

Смесь альбумина с отдельными пептидными фракциями до и после облучения УФ светом пропускали через колонку (1.5x100см)

Рис.9. Разделение фракций пептидов СММ с альбумином, до облучения (слева) и после облучения УТ-светом (справа) на колонке (1,5х 100 см) с сефадексоы Г-25 в натрий-ацзти^-ном буфере, рН 6,7. Скорость элоции 12 мл/час.

До оолучения на элюцнонной диаграмме имеется два пика: ,ик альбумина и пик пептидной фракции. После облучения на элю-[ионной диаграмме остаются те же два гшга, но соотношение их 1еняется . Уменьшается. пик, сосп-ветстьунщй па ^ средиемоде-;улярной пептидной фракции, увеличиваемся пик, соответствующий шьбумину. По-видимому, после облучения УЙ - светом повышаются орбционные свойства альбумина. При этом в большей степени орбируется на альбумине мембранотрспная фракция А-&.

В вдоровом организме пептиды СШ выводятся из организма .зрев почкк. Поэтому исследовали мочу больных с гнойно-септи-ескими заболеваниями до и через 30 часов после одного сеанса .УФОК на содержание пептидов СММ на колонке с сефадекеом 0-25. ровень всех пептидных фракций в моче после АУ20К увеличивает-я. Зто связано, по-видимому, со стимуляцией ¿кскреции пенти-св СЩ из организма.

Полученные данные позволили нам совместно с Институтом кушерства и гинекологии Ю РУа разработать программу лечения ольных с гнойно-септическими заболеваниями акушерской этиоло-ии, основанной на контроле за содержанием пептидов ОММ в кро-

сефадексом 0-25 (рис.9 ).

Л/ V

Ч » и

•Н Л

~ТЙ--

I "

_/1А

¡й—т^—эг~1>»1 *i

тА 4о

Аш

иА-,^'

50

и*—я—

ни. Вольные па степени тяяостй были разделены на три группы. Экспресс метод-м определяли уровень пептидов СММ до и после., каждого сеанса АУ-ГОК для. веек групп больных. Результаты опре-., деления преде ыв.*екы в таблице С .

!1о раираОохинной нами программе сеансы АУ'ЮК проводили через 1 день, до 4 сеансов при оптической плотности .пептидов СММ в крови до 0,500, до 7 сеансов при оптической плотности 0,900 . При оптической плотности выше 0,900 проводили по 3 сеанса в день в течение трех дней. ■ затем 7-В сеансов через день. В таких условиях уровень пептидов после АУФОК снижался практически до нормы.

Таблица б

Вольные

Число сеансов АУФОК 1 Средней 1 1 тяжести 1 Тяжелые 1 - 1 Крайне . ! Здоровый тяжелые 1 донор

До сеанса

АУФОК 0,410+0.039 0,720+0,041 0,980+0,044 0,270+0,032

1 0,420+0,040. 0,800+0,039 1,100+0,054

2 0,38040,037 0,690+0,044 0,990+0,051

3 , 0.300-Ю,033 0.600+0.038 0,860+0,053 ,

4 0,280+0,029 0,580+0,035 0,800+-0,047

5 0,260+0,031 '0,400+0,031 '0,670+0,043 •

0 0,370+0,030 0,620+0,038

V ■ 0,320+0,0^2 0,570+0,042

ь 0,300+0,027 0.480+0,036

9 0,440+0,037

ю ■0,380+0,050

11 0,3*70+0,039

Разработанная нами программа, возможно, пригодна, для лечения и других заболеваний, сопровождающихся увеличением в крови содержания пептидов СММ, таких как Ж1Н, ОГЙ, ожоги.

, - IV -

4.11ецу|1ды СММ при осложненном течении беременности. Одной из актуальных проблем здравоохранения нашего региона является осложненное течение беременности. Такие осложнения как почечнне и гнойно-воспалительные заболевания обуславливают неблагоприятное течение родов, а иногда и летальный исход, наступающий в результате кровотечений и ОГШ. Нами исоледоьана корреляция между уровнем пептидов СММ и осложнениям'.! при неблагоприятном течении беременности.

Для определения уровня пептидов СММ в 1фови баян выбраны два экспресс-метода, разработанные в лаборатории химии белков и пептидов Института биоорганической химии им. академика Сады-кова A.C., я также метод гель-хроматографии на колонке с сефадексом Г-25. Полученные данные представлены в таблице 7 .

Таблица 7

N I • Диагиоз 1 1 метод ! 1 2 метод

I 1 e-Dns-Lys(hm) i I К (750 нм)

1 Гнойно-септическое

заболев шие 8,ОНО,15 0,900-1,300

г Гнойно- .-ентическое за-

болевайте акушерской

этиолог, ш 8,5rO,Ü8 о,8оо-1, ах

3' ОПН S.0+0,16 1,00-1,200

4 ОШ акуле рекой

этиолог 1и в,5+0,19 1,00-1,200

5 Нефропв ,'ия 7,0+0,16 0,800-0,900

ö Нефропй 'ия беременных 7,5+0,17 0,000-0,900

7 Пмелоне 1рит 4.2+0,15 0,470-0,600

S Ииелоне ,/рит беременных 4,0+0,11 0,450-0,600

9 Здоровье доноры 0.0 0,160-0,2-'

10 Здоровь-л беременные 0,5t0,09 0,200-0,300

'При п -глонефрите беременных количество пептидов СМЫ по сравнению ?о здоровыми беременными повышено в два раза, при нефропатш - в четыре раза, при ОШ -в пять раз, при гной-но-сентиче.-чих заболеваниях - в четыре раза. У больных без акушерской ттологии уровень пептидов ОШ был повышен по сравнению со з орояыми донорами примерно в TfrX пропорциях.

- 16 -

Далее последовали плазму крови больных методом гель-хро-матогрзйии на колонке (1,0х&0 см ) с сефадексом О-£5 . Анализ элюционных диаграмм разделения обнаружил значительные различий у беременных с патологией и здоровых беременлмх. Б крови здоровых .беременных увеличено содержание фракции А-4 (рис. 10 Б).

- При нефропатии и пиелонефрите на элюционных диаграммах разделения- плазмы кров« обнаружены фракции А-5 и А-6, отсутствующие в крови эдоровых беременных, содержание фракции Л-4 увеличено (рис.10 В и Г), причем наблюдалась корреляция между клиническим состоянием больных и увеличением содержания этих фракций.

При ОПН и гнойно-септических . заболеваниях содержание фракций А-4, А-5 и Л-б резко возрастает.

Итак, при осложненном течении беременности наблюдается достоверное увеличение содержания в крови больных пептидов СММ, что модет служить прогностическим признаком развития эндогенной интоксикации у беременных с патологией .

—г—*?—

ЛЛ

Л_

»' дь

Рис.10.Гель-хроматография плазмы крови здоровых доноров (А), здоровых беременных (Б), беременных с ' нефропатией (В) и пиелонефритом (Г) на колонке (1,0x00 см) с сефадексом Г-25. Скорость элюции • 12 мл/час.

10 и

..Для определения уровня пептидов СММ в практическом акушерстве могут быть 'использованы два экспресс-метода и метод гелевой хроматографии. Эти три метода модно рекомендовать в практическое акушерство как взаимодополняющие методы определения уровня пептидов СШ в крови больных в качестве критерия развития эндогенной интоксикации у беременных, что послужило бы решению проблем регионального здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. Исследована плазма крови больных с острой почечной недостаточностью й гнойно-септическими заболеваниями и покапано,

что в плазме этих больных накапливаются среднемолекулярние пептидные фракции, обл<-щакщие мембранотропной, гипо- и гипер-коагуляционной активностями , отсутствующие в плазме крови здоровых доноров.

2. Из этих активных фракций впервые выделены в индивидуальном состоянии три пептида:

пептид Г-2 с молекулярной массой 2112 Да, ооладающий ги-перкоагуляционным действием,

пептид Д-2 с молекулярной массой £660 Да, обладающий неспецифическим ыембранотропным действием, что проявлялось в уменьшении среднего времени лизни бисдойных фосфолнпидных

I

мембран,

пептид Д-'З.с молекулярной массой 6(312 Да, увеличивающий проводимость бислошшх фосфолииидных мембран.

3. Установлена полная аминокислотная последовательность пептида Д-3, содержащего 44 аминокислотных остатка и состоящего из двух одинаковых полипептидных цепей, соединенных мелду собой дисульфидной связью. Проведен сравнительный анализ известных белков плазмы крови и показано, что последовательность пептида Д-3 идентична аминокислотной последовательности в положений 75-100 белка Еенс-Дконса SOW.

4. а) Исследовано влияние процедуры аутотрансфузии ухь-трафиолетом облученной крови на уровень пептидов средней молекулярной массы в крови больных с гнойно-септическими заболеваниями. Показано, что процедура аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови приводит к снижению уровня пептидов средней молекулярной массы В крови бОЛЫа.'Х £1J..»<»'|.1'J«CKH до нормы.

б) исследовано участие в этом процессе ам.оумина и показано, ' что облучение ультрафиолетовым светом альбумина способствует увеличению его .связывающей способности но отношению к пептидам средней молекулярной массы в опытах ш vitro.

в) На основании полученных данных разработана программа лечения больных с гнойно-септическими заболеваниями, включающая необходимое число сеансов аутотрансфузии ультрафиолетом облученной крови в зависимости от ;исходного уровня пептидов средней молекулярной массы в крови больных.

5. йсследован уровень содержания пептидов средней молекулярной массы у больных с почечными и гнойно-септическими заболеваниями акушерской этиологии. Показано, что при этих заболе-

ваниях в »шовк беременных повышено содержание пептидов средней молекулярной насей и контроль уровня пептидовможет служить прогностическим признаком развития эндогенной интоксикации у беременных-с патологией. " '

Список опубликованных раЗот по теме диссертации.

1. Султанова Н;Н., Мухамедиена 11!.Г., Далимон Х.Н., Кордухович • А. С. .Салихов П.'Л. Эндогенные, токсины пептидной природы'при

осложненном течении беременности.//1 Конференция биохимиков Узбекистана. Тезис» докладов. -Ташкент, 1935. - С. 258 -259.

2. Мухамадиева Ш.Г/, Султанова Э.;М., Султанов С. А. .Хаджнметов Л. А., ХоджаеВа Р.Х., Салихов Ш.И.'' Физико-химические характеристики фракций -пептидных эндотоксинов при нарушениях системы.гемостаза у беременных// 1 Конференция биохимиков Узбекистана. Тезисы длкпадов.-Таикеит, 1936.-С. 113.

3. Sallkho.f Sh. 1., Kadyrova A.F., Sultanova E.M., Kasymov Sh.K. Stady of structyre and function of toxic peptides formed during various pathologies // 14 International Congress of Biochemistry . Prague, July 1988.-Abstracts. -Prague.-1988-V.5-P.51.

4. Salikhof Sh. 1. ,■ Kadyrova A.F. .Sultanova.E.M. Kasymof Sh.K. Peptjde . endotoxins are bioregulators . of cells proliferation // Rlotechnological aspects of protein production by cults- red cells.. Prague, 1988: Abstracts.-Prague,1988.-V.5- P.233.

5. Султанова Э.М., Мухамедиева Щ.Г., Салихов Ш.И., Мордухович А.О. Эндогенные токсины пептидной природы при осложненном течении беременности.// Медицинский журнал ■ Угбекиста-

'Hal939.-N7-C.43-46. - ' ' '

6. Султанова Э.М., Сагдиев II.Ж.,. Мухамедиева ш.Г., Салихов Ш.И. Физиологически активные пептиды из плазмы больных с различной эндогенной интоксикацией.// 14 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии.' Тезисы докладов.- Ташкент, 1989.-С.492.

7. Степенями Р.И., Мухамедиева Ш.Г., ЛиМ.А., Султанова Э.М., Казаков И., Салихов Ш.И. Методы диагностики и коррекции эндогенной интоксикации при гнойно-воспалительных заболеваниях в акушерской практике.// Вопросы медицинской хи-MHH-1990-N2-C.37-39.

8. Султанова Э.М..Мухамедиева Ш.Г., Сагдиев Н.Ж., Клюев О.А.,

. - 21 - ,

Хаджиметоа A.À., Султанов С.H., Аваков B.C., Салихов Ш.И. Пептидные эндотоксины и нарушение системы гемостаза при осложненном течении беременности.// Вопросы медицинской химии-1931-N3-C.53-54.

9. Salikhov Sh.I..Sultanova E.M., Sagdlev N.Zh., Mukhamadieva Sh.G., Kadyrova A.F., Kasymov Sh.K. £liysi - ologlgally active peptides from plasma of patients with endogenous intoxication.// 10th World congress on animal, plant and microbial toxins.-Abstracts.-Singapore,1991,- P.305.

10. Сали:;ов Ш.И., Кадырова А.Ф., Султанова Э.М., Далкмов Б.З, Нурвддинов А.Р. Структура, механизм действия и элиминация пептидных эндотоксинов из крови больных.//5 Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана . Тезисы докладов, Ташкент.-1991-С.91.

Эндоген захарланишда пептидларнинг туз шиш ва функцияси тавсифи.

. Йирингли септик ва огир буйрак етшмовчшшги касажликдари билан хасталанган бегморлар кони плазмаси тадцицот нилннди. Ана шу беъморлар rçoHH плазмасида, соглом донорлар конида учрамайди-ган >{амда мембрана функциясига ва цоннинг ивиш оиетэмаенга таъ-сир чиладиган урта молекулар массали пептид фракциялари тупла-ниши курсатилди.

Ана шу фракциялардан, гипо- ва гиперкоагуляцил з$амда мемб-ранотроп фаолликка эга булган пептидлардан учтаси якка холда &*ратиб олинди. Уеаро дисульфид боги билан богланган иккита бнр хил поилпептид занжиридан тузилган, 44 аминокислота колдигидан ташкил топтан Д-3 пептидига тула аминокислота кетма-кэтлик ту-енлиши уряатилди.

йирингили септик касаллиги билан хасталанган беъморлар ¡^они ультрабикафма нурлари-билан'иурлаш аутотрзнсфузияси процедураси (АУФОК) урта молекуляр массали иептидларни (СШ1) каыайшига олиб кедтеи 1{урсатилди. СШ пептедларишшг дастлабки мтдорига 6ofлик ' булган ва кераклн АУФОК сеаш.лари сонини уз ичига олган - йирингли септик касалликлари билан хасталанган беъморларни даволаш программам ишлаб чичилди.

Йирингли септик ва буйрак касалликлари билан хасталанган хомиладор аедларнинг rçoim таркибида СШ пептнларининг мшудери

остиб кетмии аник курсатилди. Ана шу пептидлар миедорини нааорат ф!либ турилса хомиладор беъморларни эндоген захарланиш дараша-cviim • кучайшшни олдиидак айтиб беркш имконият'ига эга булиниши мумкимиги курсатилди/

Structurally functional characteristics of the peptides In endogenic intoxications.

Blood plasma of the patients with acute renal insufficiency and purulent-septic deseases has been studied. It was showi that, in the plasma of these patients middle-moleculas peptide fractions, which are absent in the blood plasma of the normal donors and affecting the membranes functions and system of blood' coagulation are acccumulating in plasma of the patients.

From these active fractions three peptides, possessing hypo and hypercoagiilatlorial and membranotropic activities are isolated in individual state. Complete aminoacld sequence of D-3 peptide, containing 44 aminoacid residues and consisting of two similar polypeptide chains, connected by dlsulphide coupling «as established.

It was shown that, autotransfusion procedure UV exposed blood (AUVEB) results in the decrease of the peptides of middle- molecular mass (МММ) in the blood of the patients with purulent- septic deseases. The program of the treatment of tho patients with purulent-septic diseases is worked out, induding the neces- sary number of AUVEB treatments depending on the initial level of МММ peptides. - "

It was shown that in the blood of pregnant, women with renal and purulent-septic diseases МММ peptides content increased and control of peptides level may serve a prognostic sign of endoge- nlc intoxlcatiom development In the pregnants with pathology.