Химия олигомерных проантоцианидинов Rhodiola pamiroalaica тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА САДЫКОВА А.С.

На правах рукописи ' 547.0г2

НСМ АН ЛОВ Аваз Эргешовнч

ХИМИЯ ОЛНГОМЕРНЫХ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВ ГШСЮЮЬА РАМИЮАЬА1СА

• 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТАШКЕНТ - 2000

Работа выполнена в Институте химии растительных веществ им. академика С.Ю. Юнусова Академии Наук Республики Узбекистан.

Научный руководитель: кандидат химических наук , с.н.с. З.А.КУЛИЕВ Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор, г.н.с. А. И. ИСМАИЛОВ, кандидат химических наук с.н.с. М. Н. СУЛТАНХОДЖАЕВ

Ведущая организации :

Национальный Университет РУз. им. Мирзо Улугбека.

о О

Защита состоится " iM ••.. .1ШЧ1... 2000 г. в ..... часов

на заседании Специализированного Совета Д 015.21.01 при Институте биоорганической химии им. академика A.C. Садыкова АН РУз (700143, Ташкент, проспект академика X. Абдуллаева, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академика A.C. Садыкова АН РУз.

Автореферат разослан -¿а.- . . .jujxx. 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук ^ " О.Х. САИТМУРАТОВЛ

вт s/9 f о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные препараты из растений продолжают оставаться популярными и находят довольно широкое применение в медицинской практике. Они привлекательны тем, что различные классы природных соединений имеют довольно широкий спеюр действия и относительно малотоксичны по сравнению с синтетическими биорегуляторами. Поэтому дикорастущие и культивируемые растения являются мощным источником многих лекарственных веществ, разнообразных по своему биологическому действию. Важнейшим аспектом исследований в этом направлении является изучение химического состава и строения биологически активных веществ, выделяемых из растительного сырья. В настоящее время насчитывается около трехсот лекарственных растений, которые успешно используются в медицинской практике, причем в последние годы проявляется устойчивая тенденция к расширению их ассортимента.

Среди лекарственных препаратов заметное место занимают средства, полученные на основе полифенольных соединений. Практика применения этих препаратов обнаруживает их низкую токсичность в терапевтически эффективных дозах. Соединения этого класса применяют при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, регулируют функции почек и мочеотделения..В настоящее время проантоцианидины могут применятся в качестве вяжущих средств, как препараты антигипоксического, гиполипидемического, антиатеросклеротического, капилляроукрепляющего, противоопухолевого, противовоспалительного, бактерицидного действия. В силу этого дальнейший поиск источников полифенолов в культивируемой и дикорастущей флоре, изучение их строения, стереохимии и фармакологической активности являются актуальной задачей.

В Институте химии растительных веществ им. академика Юнусова С.Ю. АН РУз, проводится систематическое изучение кумаринов, флавоноидов и полимерных фенольных соединений растений произрастающих в Центральной Азии.

Настоящая работа является продолжением этих исследований и выполнена в лаборатории химии кумаринов и терпеноидов Института химии растительных веществ АН РУз в 1996 - 1999 гг.

Цель и задачи изучения.

1. Целью настоящей диссертационной работы является выделение, разделение индивидуальных полифенольных соединений, изучение химического состава катехинов и проантоцианидинов Rhodiola parairoalaica А. Bor., произрастающего на территории Кыргызстана.

2. Изучение физико-химических свойств, идентификация известных, установление химического строения и относительной конфигурации выделенных новых соединений.

3. Исследование фармакологической активности выделенных соединений.

Научная новизна. В процессе проведенных исследований были получены результаты, представляющие научную новизну и практическую ценность: впервые был углубленно изучен катехиновый и проантоцианидиновый состав Шюс1ю1а рагшгоакнса. Из этого растения выделено четырнадцать соединений. Все соединения выделены из данного растения впервые. "Идентифицировано шесть мономерных катехинов, одна фенолокарбоновая кислота, три димерных проантоцианидина и четыре новых олигомерных

проантоцианидингликозида. Новые соединения являются олигомерами (+)-катехина, (-)-эпикатехина, (+)-галлокатехина, (-)-эпигаплокатехина и их 3-0-галлоилированными производными, три из которых являются ацилгликозилированными проантоцианидинами. Установлено, что в проантоцианидинах мономеры связаны между собой С-4а—С-8, С- 413-С-8 и С-4В— С-б межфлавановыми связями.

Практическая ценность работы. Фармакологические исследования, проведенные в лаборатории фармакологии Института химии растительных веществ АН РУз (док. мед. наук Сыров В.Н., док. мед. наук Ахмедходжаева Х.С.) показали, что сумма проантоцианидинов корней родиолы памироалаиской обладают выраженной антиатеросклеротической, гиполипидемической и эстрогенной активностью и дальнейшее изучение их биологической активности продолжается.

На защиту выносятся:

- разработка методов выделения катехинов, димерных и олигомерных проантоцианидинов.

доказательство химического строения и относительной конфигурации четырех новых олигомерных проантоцианидингликозидов, идентификация десяти известных катехинов и проантоцианидинов.

изучение эстрогенной, гиполипидемической и антиатеросклеротической активности выделенных соединений.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 3-ем Международном симпозиуме по химии природных соединений (Бухара, 1998 г.), на конференции молодых ученых (Ташкен -1998 г.), научных семинарах лаборатории химии кумаринов и терленондов ИХРВ АН РУз (1996 - 1999 г.) и научно-теоретических семинарах кафедры химии Ошского Государственного Университета (1996 - 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи и два тезиса.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов исследований, экспериментальной части, выводов, списка

литературы и приложения. В литературном обзоре специальные разделы посвящены классификации, распространению в природе, химическим и физическим методам исследования катехинов и проантоцианндинов за последние годы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 9 схем, 8 рисунков.

Список использованной литературы включает 130 наименований и охватывает литературу до 1999 г.

Спектры ЯМР ЬС проантоцианндинов расшифрованы совместно с.н.с. А.Д. Вдовиным и в.н.с., к.х.н. Н.Д. Абдуллаевым.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 .'ОЛИГОМЕРНЫЕ ПРОАНТОЦИАНИДИНЫ ЯНООЮЬА РАМ11ЮАЬА1СА

Мы изучали ироантоцианидиновый состав корней Я1ю(1ю1а раипгоаЫса А.Вогг., произрастающей па каменистых почвах и галечниках в альпийских поясах, верховьях р.Акбура Ошской области Кыргызстана, собранной в фазу цветения и бутонизации.

Таблица 1

Выделенные соединения из ШюсНок рапигоаЫса и их _физико-химические константы. __

Соединения хим. состав ММ МР" Т. пл. "С

1. (+)-катехип С15 Ны Об 290 +21 178-180

2, (+)-галлокатехин Си Нн О7 306 + 15 186-188

3. (-)-эшнгатехин С15 Ни Ос, 290 -69 241-242

4. (-)-эпикатехингаллат С22 Н|8 О)0 442 -135 253-255

5. (-)-эпигаплокатехин С15НН О7 306 -58.2 215-216

б. (-)-зпигаллокатехингаллат С22 Н]8 0„ 458 -184 210-212

7. Галловая кислота С7Н605 170 220-222

8. Процианидин В-1 С30Н26 012 578 +32 290-300 рап.

9. Процианидин В-2 С30Н26 012 578 +25.1 -II-

10. (-)-эпикатехин- (4(3-8)-(-)- С50 Н26 Ои 594 +42.3

эпигаллокатехин

11. Проантоцианидин 11Р-1 С|25 Н)30 0&9 2734 +80.3 -II-

12.Проантоцианиднн ЯР-2 С|2вНц4 0« 2578 +78.4

13.Проантоцианидин ЛР-3 С136 Н120 071) 2872 +65.5 -II-

14.Проантоцианидин ЯР-4 С129 Н106 Об7 2726 +62.5

На территории Кыргызыстана произрастает 7 видов растений, входящих в состав рода родиола. Корни родиолы памироалайской широко используются в кыргызской народной медицине при желудочно-кишечных

заболеваниях, воспалении легких и туберкулезе. В химическом отношении она является малоизученным растением.

Методами хроматографии на колонке с микрокристаллической целлюлозой, силикагелем и гель-фильтрации на сефадексе ЬН-20 из водно-спиртового экстракта корней ШюсЗю1а рагшгоаЫса мы выделили 14 соединений, в том числе 6 мономерных катехинов, 1 фенолокарбоновую кислоту, 3 димериых и 4 олигомерных проантоцианидина (см. таблица 1).

Все проантоцианидины, выделенные из родиолы памироалайской, имеют слабокислый характер, хорошо растворяются в метаноле, этаноле, ацетоне, диметилформамиде и их смесях с водой, не растворимы в эфире, хлороформе.

1.1. Строение олнгомсриого проаитоцчанндпиа ШМ

Проантоцианидин ШМ представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета. Имеет состав СшИ^Лм, /а/и26+ 80.3" (С 0.32, этанол) и молекулярную массу (М) 2734, не плавясь, разлагается прп 290-300°С.

В УФ-спектре проантоцианидина интенсивность поглощения падает от максимума около 209 нм до минимума при 255 нм с плечом при 220 и слабым поглощением при 244 нм. За минимумом следует характерный максимум при 274 нм, который затем постепенно снижается в сторону видимой области спектра и имеет при 305 нм слабое поглощение.

В ИК-спектре вещества имеются характерные полосы поглощения гидроксильной группы (3310 см"1), а-карбонила ароматической кислоты (1698 см"'), конденсированных ароматических колец (1610, 1541, 1517, 1456 см'1), 1340 (= С - ОН), 1230,1032 см"1 (= С - О - С).

Соединение КР-1 поданным спектра ЯМР ПС (таблица 2), относится к гликозилированным проантоцианидинам.

В спектре ЯМР 13С широкий резонансный сигнал в области 157.2 м.д. относится к углеродным атомам С-5, С-7, С-9 кольца А. Резонансный сигнал при 134.5 м.д. (С-4') свидетельствует о наличии галлокатехинового блока, в то же время сигналы при 117.0 и 120.4 м.д., относящиеся к углеродным атомам С-2', С-5', С-6' сответственно, показывают, что в составе КР-1 имеются катехиновые блоки.

Сигналы С-2 во фрагментах соединения ММ проявляются при 78.6, 80.3, 83.6, 84.5 м.д., что однозначно указывает на реализацию как 2,3 - цис, так и 2,3 - транс стереохимии флаван-3-олов в этом соединении. Сигналы в пределах 101.6-105.0 м.д., относящиеся к атомам С-10, характерны для проантоцианидинов с межфлавановой связью С-4—С-8. Сигналы атомов С-1, С-3, С-5. глюкозы при 104.2, 78.6, 77.8 м.д. соответственно показывают, что аномерный центр имеет р-конфигурацию. Остатки глюкозы соединены между собой 6—1 связями, на это указывает химический сдвиг (ХС) С-6

65.3, 64.8 м.д. Концевой углеводный остаток ацилирован в шестом положении, что доказывается наличием сигналов при 63.0 и 63.3 м.д., относящихся к этерифицированному атому С-6 терминальной глюкозы.

При щелочном расщеплении Р.Р-1 (см. схему 1) в атмосфере азота образовались три соединения, которые по физико-химическим параметрам идентифицировали с флороглюцином (19), протокатеховой (20) и галловой кислотами (7). Кислотный гидролиз ШМ привел к образованию молекул (+) -катехина (1), цианидина (17), дельфинидина (18), глюкозы (15) и глюкогаллата (16). Путем мягкого тиолитического расщепления из "нижнего" блока получили (+)-катехин (1), из "верхних" блоков - смесь трех тиоэфиров (21,22,23), которые подвергли каталитической деструкции в присутствии никеля Ренея. Полученные вещества идентифицировали с (+)-катехином (1), (-)-эпикатехимом (3) и (+)-гаплокатехином (2).

Таблица 2.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов углеродных атомов в _спектре ЯМР |3С прознтоцианидина ЯР-1._

Атом Углерода Фрагмент 11Р-1

а б в р Галлоил глюкоза

С-2 84.5" 78.6" 83.6" 80.3

С-3 74.4' 72.6*,72.0 70.2* 68.2

С-4 ' 38.1 36.1 38.1 30.6

С-6 98.6 98.6 98.6 98.6

С-8 97.5 108.0 108.0 108.0

С-10 101.6' 104.2* 105.0й 104.2"

С-5,7,9 157.2

С-Г 132.2 132.2 132.2 132.2 122.8 104.2"

С-2' 108.0 127.0 117.0 117.0 111.2 75.0'

С-3' 147.3 ■ 147.3 147.3 147.3 147.3 78.6

С-4' 134.5 147.3 147.3 147.3 140.6 71.3*

С-5' 147.3 117.0 117.0 117.0 147.3 77.8"

С-6' 108.0 120.0' 120.4' 120.4' 111.2

С-6 Глюк. 65.3,64 8

С-6 Галл.. 63.0, 63.3

-СОО- 167.4, 168.8

Сигналы, обозначенные одинаковыми надстрочными знаками можно

инвертировать.

Ферментативное расщепление в присутствии фермента Р-глюкозидазы показало, что остатки глюкозы связаны с агликоном и между собой (3-гликозидной связью. Эти данные указывают на смешанный характер соединения.

сн2сж

но • он

19.

соон

он

сооа

он

24.Перметилат Н*

25.2,3,4- три-0-ыетил-В-С1ср

3. ОН

2. ОН

Для изучения строения углеводной части мы также провели метилирование и получили перметилат (24). В результате кислотного гидролиза (24) выделили и идентифицировали 2,3,4-три-0-метил-0-глюкозу (25). Это свидетельствует о наличии 1-6 связи в глюкановой части и о том, что концевая глюкоза имеет заместитель в шестом положении.

В проантоцианидинах углеводная часть обычно присоединяется к агликону в положении 5 или 7 кольца А. Вследствие стереохимических затруднений наиболее вероятными местами присоединения являются положение С-5 "нижнего" и С-7 "верхнего" блоков.

На основании результатов спектральных ( УФ-, ИК-, ЯМР- |3С) и химических методов исследования (метилирование, щелочное, кислотное, тиолитическое, и ферментативное расщепление) вещество отнесли гликозилироваиным проантоцианидшшм и для RP-] предлагаем строение и относительную конфигурацию - (+)-галлокате.чин-7-0-р-0-С1ср*-6-0-Р-D-Glcp<—^-O-ß—D-G!cp<—^-Са11о11-(4а-8)-(-)-эп11катехии(4р-8)-(-)-эпикатехи11-(4ß-8)-(+)-raTexnii-(4a-8)-(+)-KaTexHn-5-0-ß-D-G]cp<-<1-0-ß-D-GIcp-i-6-0-P-D-GIcp<—6-Galloil.

1.2. Строение олигомерного нроантошшпндппя RP-2

Проантоцианидин RP-2 представляет собой оптически активный [а][)25+78.4 "(с 0.25; этанол) аморфный порошок, который разлагается при 290-300 °С и имеет состав С^НтОм, ММ - 2578.

В ультрафиолетовом спектре проантоцнанидина RP-2 имеются характерные для проантоцнанидинов полосы поглощения (ЯМ:1Ч 209, 246, 275, 306 нм, Хтт256 им). Широкая интенсивная полоса поглощения в ИК-спектре этого соединения в области 3216 см"' обусловлена наличием большого количества ОН-групл. В области 1696 см"' имеется интенсивная уширенная полоса сложноэфирной а-карбонильной группы ароматической кислоты. Полосы, относящиеся к скелетным колебаниям ароматического кольца, проявляются в области 1611, 1515, 1440 см"1. При 1207 и 1032 см"1 имеются полосы, обусловленные колебаниями =С-0-С - группы. Полоса при 1101 см"1 вызвана деформационными колебаниями С-О-С этерифицированной вторичной ОН-группы. Характерный пик при 1515 см"' и пики при 775 и 734 см"' указывают на то, что содержание продельфинидиновых единиц в составе проантоцианидина RP-2 менее 50%.

Для дальнейшего исследования особенностей пространственного и химического строения изучати спектры ЯМР nC RP-2.

Спектр ЯМР 13С RP-2 содержит сигналы эпикатехина, эпигаллокатехина, остатка галловой кислоты и глюкозы, (см. табл. 3) Распределение химических сдвигов углеродов циклов С указывает на то, что молекула проантоцианидина состоит из эпикатехииовых и

эпигаллокатехиновых блоков с 2,3-цис конфигурацией. Положение

сигналов С-2, С-3 и С-4 в спектре указывает на то, что часть (лпоков, в том числе и "нижний", галлоилированы. Сигналы при 77.4, 71.4, 35.1 м.д. относятся соответственно к атомам углерода С-2, С-3 и С-4 негаллоилированных "верхнего" и "среднего" блоков. Сигналы соответствующих галлонлированных блоков "в" и "г" проявляются при 75.0, 75.8 и 32.0 м.д. Значение ХС тех же углеродных атомов "нижнего" эпикатехинового фрагмента, 77.4, 69.4 и 26.4 м.д. соответственно, также указывают на наличие сложноэфирной связи при С-3. Наличие сигналов при 98.7 м.д. атомов углерода С-10 позволяет сделать вывод о том, что межфлавановая связь в 11Р-2 осуществляется по типу С-4 — С-6. Остатьные углеродные атомы флороглюциновых систем (цикла А) проявляются со следующими значениями химических сдвигов: 94.9, 95.6 м.д. и относятся к незамещенным ароматическим углеродным атомам циклов А. Сигналы углеродов этого цикла, связанные с кислородом, обнаруживаются в области от 153.8 до 154.5 м.д..

При 129.2, 114.0 и 118.5 м.д. проявляются сигналы, соответствующие атомам С-Г, С-2', С-5', и С-6' катехиновых циклов В. Окисленные атомы

Таблица 3.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов углеродных атомов

в спектре ЯМР |3С проантоцианидина ЯР-2._

Атом Фрагменты ЯР-2

Углерода а б в г д Глюкоза глюкоза галлоил

С-2 77.4 77.4 75.0" 75.0" 77.4

С-3 71.4* 71.4* 75.8' 75.8" 69.4

С-4 35.1 35.1 32.0 32.0 26.4

С-6 95.6 106.0 106.0 106.0 106.0

С-8 94.9 94.9* 94.9* 94.9* 95.6*

С-10 101.5 98.7 98.7 98.7 98.7

С-5,7,9 153.8-154.5

С-Г 129.2 129.2 129.2 129.2 129.2 101.5 101.5 119.2

С-2' 114.0 114.0 108.5 108.5 114.0 75.0" 75.0" 108.5

С-3' 144.0 144.0 144.0 144.0 144.0 77.4 77.4 144.0

С-4' 144.0 144.0 132.9' 133.0' 144.0 69.4 72.8" 137.2

С-5' 114.0 114.0 144.0 144.0 114.0 75.8" 77.4 144.0

С-6' 118.5 118.5 108.5 108.5 118.5 64.7 60.6 108.5

-соо- 162.6 164.1

Сигналы, обозначенные одинаковыми надстрочными знакам», можно

инвертировать.

он

-он

но

таг

т- -

4. ОН

СН; ОН

(он >-он НО^Ч'7 15. он

он

но-

т.

0-10

,ОН

Т " он по 17. Я=Н 18. 1*=ОН

он

о.

он

" . он

:И), , о ДД-

1 ал»,

51 он

он 1 ^он ,

011

но "ОН

19.

:П| ]

-ДХ

он о н

оя2

но т он

7пГг

. ОН / Г

/ I ОЯг

V УУ-У оя, ' \

о-^ок.

.¡СН

НО

ЮТ

,ГО(

он

22. ОН

I 1' "'он

по.,

О I

9Н

.<:> -он

¿а

2 РН

2 ^ОН

24. Перме-шлат Н*

25. 2.3,4-три-0-метил-0-С1ср

26. 2,3,4,6- тетра-0-метил-0-С1ср

К"-(5-П-С!ср--0-Р-И-С1ср

0,1 К, = -р-0-С1ср

3. ОН

он

6. он

Ой,

I

углерода С-3' и С-4' катехинов дают общий сигнал при 144.0 м.д. к нему же относятся углеродные атомы С-3' и С-5' галлокатехинов. Атомы С-2' и С-6' этих циклов проявляют сигналы при 108.5 м.д.. Отличительный сигнал галловых систем дает атом С-4'. В спектре ЯР-2 он обнаруживается при 132.9 и 133.0 м.д.

Сигналы углеродных атомов сахарной части в большинстве своем перекрываются с сигналами углеродных атомов циклов С. Сигнал углеродного атома С-б одной глюкозы выходит из этой области и проявляется при 60.6 м.д. Химический сдвиг углеродного атома С-6 глюкозы при 64.7 м.д. свидетельствует о том, что две молекулы глюкозы соединены друг с другом 6-1 - связью.

В спектре ЯМР 13С также имеются сигналы, характерные для галловой кислоты. В области слабых полей при 162.6 и 164.1 м.д. можно обнаружить сигналы углеродов карбонильной группы. Сигнал С-1 галловой кислоты проявляется при 119.2 м.д.. Углеродные атомы С-2, С-6 дают общий сигнал при 108.5 м.д., совпадающий с С-2' эпигаллокатехинов.

Отличительным сигналом галловой кислоты является таковой атома С-4. Он имеет химический сдвиг 137.2 м.д Сигналы С-3 и С-5 гаплоильных остатков совпадают по величине ХС с С-3', С-4' катехиновых и С-3', С-5' галлокатехиновых циклов.

Щелочное сплавление ЯР-2 также привело к получению флороглюцина (19), протокатеховой (20) и галловой (7) кислот, а при кислотном гидролизе - Б-глюкозы (15), цианидина (17), дельфинидина (18) и эпикатехин-З-О-галлата (4). Тиолиз этого соединения дает следующие соединения: тиоэфиры (22),(27) и флаван-3-ол (4). Деструкция тиоэфиров (22) и (27) приводит к получению флаван-3-олов (3) и (6). Ферментативное расщепление ЯР-2 в присутствии фермента Р-глюкозидазы показало, что, также как и в ИЛМ, остатки глюкозы связаны с агликоном и между собой Р-гликозидной связью. В продуктах гидролиза перметилата КР-2 идентифицировали 2,3,4,6-тетра-0-метил-0-глюкозу (26) и 2,3,4-три-0-метил-0-глюкозу (25). Наличие 2,3,4,6-тетра-0-мегил-0-глюкозы свидетельствует о том, что терминальная глюкоза не

ацилирована, а обнаружение 2,3,4-три-0-метил-В-глюкозы указывает на 1-6-связь между остатками глюкозы.

•■ Исходя из вышеизложенных данных, для этого проантоцианидингликозида предлагаем строение и относительную конфигурацию: (-)-эпикатехин-7-0-Р-В-С1ср<-6-0-Р-П-01ср-(4[5-6)-(-)-эпика-техин-7-0-Р-В-С1ср-(4Р-6)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлоил-(4р-6)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлоил-(4р-6)-(-)-эпикатехин-3-0-галлоил-5-0-Р-0-в1ср (см. схему 2)

1.3. Строение олигомерного проантоцпанндкиа RP-3.

Молекулярная масса RP-3 равна 2872, [а]о24 +65.5°(с 0,25; этанол), аморфный порошок,, который разлагается при 290-300 °С и имеет состав С|ЗбН]20О70-

Максимумы поглощения в УФ-спекчре ( 210, 245, 275, 256 нм ) и данные ИК-спектра ( 3321, 1695, 1611, 1539, 1448, 1339, 1207, 1145, 1103, 1035, 826, 785, 734 см"1) свидетельствуют о наличии в молекуле RP-3 ароматических колец, находящихся в конденсированных таннидных структурах, и сложноэфнрной а-карбонилыюй кислоты. Исследование структуры RP-3 с помощью спектроскопии ЯМР 13С показало, что в его спектре проявляются сигналы эпигаллокатехингаллата, эпикатехина, катехина, р- глюкоза и галловой кислоты (таблица 4).

Резонансные сигналы С-5, С-7, С-9 углеродных атомов флороглюцинового ядра проявляются в виде уширенного сигнала при 153.2-155.4 м.д.. Интенсивный сигнал при 144.7 м.д. относится кС-3' и С-5' кольца В. Углеродный атом С-4' галлокатехина экранируется и в результате диамагнитного сдвига резонирует при 132.4 м.д.. В то же время присутствие сигналов при 116.2 м.д. и 120.3 м.д., относящихся к атомам С-2', С-5', С-6' соответственно указывает на то, что в составе RP-3 имеется катехиновый блок.

Таблица 4.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов углеродных атомов в спектре ЯМР 13С проантоцианидина RP-3.

Атом Углерода Фрагмент RP-3

а б « г глюкоза глюкоза Глюкоза галлат

С-2 75.8 77.1 75.8 81.2

С-3 74.3 71.3* 74.3 65.9

С-4 34.6 36.4 34.6 27.1

С-6 95.4 95.4 95.4 95.4

С-8 93.1 106.8 106.8 106.8

С-10 101.3 101.3 101.3 101.3

С-5,7,9 153.2 - 155.4

с-г 130.5 130.5 130.5 130.5 101.3 101.3 101.3 120.3

С-2' 109.9 116.2 109.9 116.2 75.8 75.8 75.8 109.9

С-3' 144.7 144.7 144.7 144.7 77.1 77.1 77.1 144.7

С-4' 132.4 144.7 132.4 144.7 71.7* 71.7* 72.9* 139.1

С-5' 144.7 116.2 144.7 116.2 75.8 75.8 77.1 144.7

С-6' 109.9 120.3 109.9 120.3 64.4 62.3 60.4 109.9

-СОО- 164.6 166.4

Сигналы, обозначенные звездочками, можно инвертировать

1. он

I он

но 17. 1

18. К=ОН

ОН

А ОН

гот

\ о.д & у гОгон\

11 ° 0 "Т ^ о н

Р» ГГТ!

^ - Т >4Эгон но г

но' он

19.

~0Н

ОН

т

[ОТ

X

24. Перметилат Н+

25. 2,3,4- три-0-м«тнл-С-0!ср 26.2,3,4,6- тетра-О-мегил-С-Окр

3. 011

- %

I СЖ.1 б

011 2 Л'-р-0-01ср-—ОаПоН

К| = -р-и-01ср-<-6- -0-_р-0-0!ср Я,=Оа|1оН

В спектре имеется характерный сигнал для галловой кислоты при 139.1 м.д., относящийся к углеродному атому С-4'.

Сигналы углеродного атома С-2 блоков а, б, в, г во фрагментах соединения ЯР-З проявляются при 81.2, 77.1, 75.8 м.д., что однозначно указывает на наличие как 2,3- кис, так и 2,3- транс - стереохимии флаван-3-олов в этом соединении. Сигналы углеродных атомов С-2, С-3 гетероцнклов айв резонируют при 75.8 и 74.3 м.д. соответственно, откуда следует, что часть "верхних" блоков галлоилирована. "нижний" блок в проантоцианидине ЯР-З не гаплоилирован, на что указывают химические сдвиги (ХС) сигналов углеродных атомов С-2, С-3, С-4 (81.2, 65.9, 27.1 м.д. соответственно). Химический сдвиг углеродного атома С-10 проаптоцианидиновых блоков, наблюдаемый при 101.3 м.д., указывает на то, что межфлавановая связь в проантоцианидине осуществляется но типу С- 4 —С-8. В спектре ЯМР 13С проантоциаиидина ЯР-3 кроме этого имеются сигналы углеродных атомов углеводных остатков. Углеводный остаток галлоилирован в шестом положении, что доказывается наличием сигнала при 62.3 м.д. относящегося к замещенному углеродному атому С-6 глюкозы. Наличие сигнала при 64.1 м.д., относящегося к углеродному атому С-6, указывает на то, что две молекулы глюкозы связаны между собой 1 - 6 связью.

Сигнал при 60.4 м.д. принадлежит атому С-6 терминальном негаллоилированной глюкозы. Химические сдвиги С-1, С-3, С-5 глюкозы указывают на то, что аномерный центр имеет р-конфигурацию.

Ферментативное расщепление и кислотный гидролиз перметилата ЯР-3 показали, что сахарный остаток состоит из молекул глюкозы, соединенных с агликоном и между собой Р-гликозидными связями. Проантоцианидин КР-З, также как и другие вышеописанные соединения, дает при щелочном сплавлении флороглюцин (19), протокатеховую (20) и галловую кислоты (7), а при кислотном гидролизе - (+)-катехин (1), цианидин (17), дельфинидин (18), глюкозу (15) и галлоилглюкозу (16).

В результате тиолитического расщепления проантоциаиидина ЯР-3 получены тиоэфиры (22), (27) и флаван-3-ол (1). Каталитическая деградация тиоэфиров приводит к образованию флаван-3-олов (3), (6).

На основании вышеприведенных данных с учетом биогенеза проантоцианидинов предлагаем для 11Р-3 наиболее вероятную структуру и конфигурацию (схема 3).

1.4. Строение олигомерного проантоцнанндина 11Р-4.

Соединение КР-4, молекулярная масса которого равна 2726, [а]п 24 +62.5° (с 0.22; этанол), имеет состав СдаН^О^. Согласно данным УФ-спектра 208, 245, 274, 305 нм, 257 нм), соединение относится к конденсированным катехннам, т.е. проантоцианидинам. В ИК - спектре

имегтся широкая полоса поглощения в области колебаний гидроксильных групп, которые образуют межмолекулярные и внутримолекулярные водородные связи. Полосы в области 1615, 1540, 1450, 1338, 1210, 1150 см"1 указывают на присутствие ароматических колец и гетероциклов с кислородными атомами. Для дальнейшего исследования особенностей пространственного и химического строения изучали спектры ЯМР ЬС КР-4. Спектры получены в условиях полного подавления спин-спинового взаимодействия с протонами.

В спектре ЯМР 13С проантоцианидина РР-4 (таблица 5) присутствуют сигналы эпигаллокатехингаллата, эпикатехингаллата, Р-глюкозы и галловой кислоты.

Резонансные сигналы в области 151,2-153,7 м.д. относятся к С-5, С-7, С-9 углеродным атомам флороглюцинового ядра - кольца А.

Рассмотрение ХС углеродных атомов кольца В этого соединения позволило идентифицировать в нем наличие эпикагехиповых и эпигаллокатехиновых блоков. Интенсивные сигналы при 142,6 м.д. относятся к углеродным атомам С-3', С-4' кольца В эпикатехина, а также

Таблица 5.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов углеродных атомов в _спектре ЯМР пС проантоцианидина КР-4._

Атом Фрагмент КР-4

Углерода а б в г д глюкоза глюкоза пиит г

С-2 74.0 74.0 74.0 74.0 76.2 !

С-3 74.0 74.0 74.0 74.0 69.2 |

С-4 33.4 33.4 33.4 33.4 26.4 :

С-6 97.0 94.0 94.0 94.0 94.0

С-8 94.0 106.8 106.8 106.8 106.8

С-10 101.3* 103.4* 103.4* 103.4* 103.4

С-5,7,9 151.2-153.7

С-Г 130.2 130.2 130.2 130.2 130.2 103.4* 103.4* 119.2

С-2- 111.6 117.4 111.6 117.4 111.6 74.0 74.0 111.5

С-3' 142.6 142.6 142.6 142.6 142.6 76.2 76.2 142.6

С-4' 131.8 142.6 131.8 142.6 131.8 71.9 72.5 138.8

С-5' 142.6 117.4 142.6 117.4 142.6 76.2 74.0 142.6

С-6' 111.6 119.2 111.6 119.2 111.6 60.4 62.7 111.6

-СОО- ! 162.5 164.9 |

Сигналы, обозначенные звездочками, можно инвертировать.

но

6. он

он

»ЮГГ^

"Г чоК1

27. ОН й

28. ОН

25. 2,3,4- три-О-метил-О-С 1ср 26.2,3,4,6- тетра-0-ыетил-0-01ср

НО

4. ОН

-р-0-01ср К2= ваНоП

С-3' и С-5' кольца В эпигаллокатехина. Углеродный атом С-4' эпигаллокатехина резонирует при 131,8 м.д. Резонансные сигналы при 117.4, 119.2 м.д. относятся к незамещенным атомам углерода кольца В катехинов. Интенсивные сигналы при 111.6 м.д. характерны углеродным атомам С -2\ С-6' цикла В эпигаллокатехина и галловой кислоты. Отсутствие слабопольного смещения сигнала углеродного атома С-2 (81-85 м.д.) и проявление его при 74.0-76.2 м.д. позволяет предположить, что асимметрические центры С-2, С-3 имеют 2,3- цис-конфигурацию.

Резонирование в области 74.0, 33.4, 76.2, 69.2, 26.0 м.д. сигналов, относящихся к атомам углерода С-2, С-3 и С-4 гетероцикла, указывает на то, что все блоки галлоилированы в положении С-3. Сигналы в области химических сдвигов 100.1 - 103.4 м.д., относящиеся к углеродным атомам С-10, характерны для проантоцианидинов с межфлавановой связью С-4.—С - 8. В спектре ЯМР ПС проантоциапидииа 11Р-4, кроме этого имеются сигналы углеродных атомов сахарных остатков. Изучение этой группы сигналов указывает на то, что одна молекула глюкозы при С-6 связывается с галловой кислотой, характерный сигнал которой проявляется при 62.7 м.д., а другую молекулу глюкозы, не ацилированную, определяет сигнал углеродного атома С-6 60.4 м.д. Для выяснения окисленности кольца \В, проводили щелочное сплавление, при котором образуются соединения (19), (20), (7), а при кислотном гидролизе - соединения (6), (15), (16), (17), (18).. Тиолитическое расщепление и последующее восстановление тиоэфиров указывает на то, что в 11Р-4 галлоилированы все блоки. Изучение продуктов ферментативного расщепления ИР-4 показывает, что агликон связан с углеводом р-гликозидной связью. Углеводную часть в проантоцианидине ЫР-4 также анализировали методом метилирования. Образовавшийся перметилат (24) гидролизовали в кислой среде. Получили 2,3,4-три-0-метил-Б-глюкопиранозу (25) и 2,3,4,6-тетра-0-метил-0-глюкопиранозу (26).

На основании спектральных и химических данных предлагаем для ИР-4 строение и относительную конфигурацию: (-)-эпигаллокатехин-З-О-галлат-7-0-Р-В-С1ср-0<-6-0а11011-(4р-8)-(-)-эпикатехнн-3-0-галлат-(4р-8)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлат-(4р-8)-(-)-эпикатехин-3-0-галлат-(-)-эпигаллокатехш1-3-0-галлат-5-0-р-Б-01ср (см. схему 4).

О ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ.

Изучение фармакологической активности проводилось в лаборатории фармакологии Института химии растительных веществ АН РУз (заведующий лабораторией фармакологии доктор мед. наук Сыров В.Н., доктор мед. наук Ахмедходжаева Х.С.). Для выделенных соединений была

обнаружена антиатеросклеротическая, гиполипидемическая и эстрогенная активность. Изучено влияние суммы олигомерных проантоцианидинов на репродуктивную систему животных, в частности на острогенную активность. Сумма выделенных проантоцианидинов Шюс1ю1а ратноа1аюа увеличивала массу матки крысы на 51.3%.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что проантоцианидины, выделенные из этого растения, проявляют выраженный эстрогенный эффект, что позволяет считать перспективным дальнейшее изучение Я1юс1ю1а ратцоаЫса для создания препаратов эстрогенного действия.

Фармакологические эксперименты также обнаружили, что препарат полимерных проантоцианидинов из Шюс1ю!а рагшгоаЫса является малотоксичным средством, оказывает выраженное влияние на обменные процессы в организме, проявляет противовоспалительное действие.

Наибольший интерес представляет его гиполипедсмическая активность. По своему гиполипидемическому и антиатеросклеротическому действию препарат полимерных проантоцианидинов из Шюс1ю!а рапи'гоаЫса превосходил известное лекарственное средство - полиспонин, по ангиопротекторному действию, и был аналогичен продектину. Всё это указывает на перспективность разработки на основе полимерных проантоцианидинов из МюсНоЬ раингоаЬюа высокоэффективного перепарата для лечения различных гиперлипидемий и атеросклероза.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые проведено углубленное исследование катехинового и проантоцианндинового состава 1Июс1ю1а рапн'гоа1аюа, идентификация известных и доказательство строения новых соединений.

2. Из корней Ююс1ю1а рапи'гоа1аюа с использованием адсорбционно-распределительной хроматографии и гельфильтрации изолировано 14 индивидуальных соединений, в том числе 6 мономерных катехинов, 1 фенолкарбоновая кислота, 3 димерных и 4 олигомерных проантоцианидин-гликозида.

3. Анализ данных спектров УФ-, ИК-, ПМР-, ЯМР "С и продуктов химических превращений показал, что четыре из выделенных олигомерных проантоцианидинов являются новыми, остальные вещества известными.

4. Установлено, что выделенные проантоцианидины являются олигомерами (+)-катехина, (-)-эпикатехина, (+)-галлокатехина, (-)-эпигаллокатехина и их З-О-галлоилированными производными:

5. Установлено, что проантоцианидины имеют межфлавановую связь С-4а-С-8, С- 4Д-С-8 и С-4В-С-6.

6. Установлено, что соединение Г1Р-1 является пентамером - (+)-галлокатехин-7-0-Р-0-аср <-6-0-Р-0-С1ср <-6 -О- Р-0-С1ср <-6 Са11о{1-(4а-

8) - (-)-эликатехин-(4р-8)-(-)-эпикатехин-(4р-8)-(+)- катехин-(4а-8) - (+)-катехин-5-O- P-D-Glcp <-6-O-p-D-Glcp *-6-0-P-D-Glcp<-6-Ga!Ioil.

Проантоцианидин RP-2 является (-)-эпикатехин-7-0-р-В-С1ср <-<)-0-Р-В-С1ср-(4р-б)-(-)-эпикатехин-7-0-р-В-01ср-(4р-б)-(-)-эпигаллокатехин-3-О-галлоил- (4Р-б)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлоил-(4р-б)-(-)-эпикатехнн-3-О-галлоил-5 -0-р -D-Glcp.

Проантоцианидин RP -3 - (-)-эпигаллокатехин-3-0-галлат-7-0-р-0-С]ср-0-6-Са11оИ-(4р-8)-[(-)-эпикатехин-(4р-8)-(-)-эпигаллокатехи1]-3-0-raiLnaT)]2-(4P-8)-(+)-i<aTexHH-5-0-p-D-Glcp4-s-0-p-D-Glcp.

Проантоцианидин RP-4 - (-)-эпигаллокатехин-3-0-галлат-7-0-р-0-С1ср-0<-6-.-Оа11о11-(4р-8)-(-)-эпикатехин-3-0-галлат-(4р-8)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлат-(4р-8)-(-)-эпикатехин-3-0-галлат-(4р-8)-(-)-эпигаллокатехин-З-О-галлат-5-O-p-D-Glcp.

7. По данным фармакологических исследований выделенные проантоцианидины обладают антнатеросклеротической,

гиполипидемической и эстрогенной активностью.

Основные результаты изложены в следующих работах:

1. Ismailov А.Е., Kuliev Z.A., Vdovin A.D., Abdullaev N.J., Murzubraimov M.B. / Oligomeric proanthnocyanidinglicosides of Rliodiola pamiroalaica. // Chemistry of Natural Compounds. - 1998, -Vol. 34, -N.4, - p. 450-455.

2. Исмаилов А.Э., Кулиев 3.A., Вдовин Д.А., Абдуллаев Н.Д., Мурзубраимов Б.М., Олигомерные проантоцианидингликозиды Rliodiola pamiroalaica II. // Химия природ, соедин. - 1999, -N. 1С. 42-49.

3. Исмаилов А.Э., Кулиев З.А., Вдовин Д.А., Абдуллаев Н.Д., Строение проантоцианидина RP-1 из Rliodiola pamiroalaica. // Химия природ, соедин. Спец. Выпуск. - 1998. - С. 25 - 28.

4. Ismailov А.Е., Kuliev Z.A., Vdovin A.D., Abdullaev N.J.,Oligomeric Proantocyanidineglicoside derived from Rliodiola pamiroalaica //Third International Simposium on the Chemistry of Natural Compounds (SCNC). - 19-22 october 1998 Bukhara - Uzbekistan. - P.67.

"Памироалай родиоласининг олигомер проантоцианидинлари кимёси" ' Исмаилов Аваз Эргешович

02.00.10 — Биоорганик кимё, табиий ва физиологик фаол моддалар кимёси мутахассислиги

Бирйнчи марта Киргизистоннинг Олой tof тизмаларида усувчи Памироалай родиоласи иддизининг полифеномар таркиби урганилди. Адсорбцион так,симлаш хроматография ва гельфильтрация усулидан фойдаланиб уси.мдикнинг и.лдизидан 14 та соф модда ажратиб олинди. Улардан 6 таси катехин, 3 таси димер,

4 таси олигомер проантоцианидин ва 1 таси фенодкарбон кислотаси эканлиги аник,ланди.

Ажр.атиб олинган 4 та янги олигомер проантоцианидин гликозидларнинг кимёвий тузилиши ва нисбий конфигурацияси, кимёвий (ишк,орий ва тиолитик парчалаш, кислотали мухитда ва фермент таъсирида гидролизлаш, метиллаш) ва спектроскопик усуллар (УБ —, ИК-, ЯМР) ёрдамида урганилди, колган 10 та модда илгари маълум булган моддалар б план идентификация килинди. Ажратиб олинган янги моддалар ( + ) —катехин, ( — ) — эпикатехин, ( + ) — галлокатехин, ( — ) — эпигаллокатехинларнинг олигомерлари эканлиги аникланди.

Улардаги флаванлараро 6of С —4а —С —8, С— 415 — С —8 ва С —4В —С —6 типи буйича амалга ошганлиги исботланди.

Памироалай родиоласи проантоцианидинлари TynAavm антиатеросклеротик, гиполипидемик ва эстрогеплик фаоллпкка эга эканлиги урганилди.

Урганилган усимликни тиббиёт амалиётида куллаш самарали хисобланади.

"The chemistry of oligomcric proantliocyanidins of Rliodiola pamiroalaica" Ismailov Avaz Ergeshovych

Speciality: 02.00.10 - Bioorganical chemistry, chemistry of natural ami physiological active substances

Polyphenol composition of Rhodiolae pamiroalaicae roots, growing at Kirghiz Alay mountiains has been studied for the first time. By using of adsorbtion division, chromatography and gelfiltration methods 14 individual compounds have been isolated. Among them 6 were recognized as catechines, 3- as dimer, 4-as proanthocyanidin oligomer and 1-as phenylcarbon acid. Chmical stuctures and relative configuration of isolated 4 new oligomer proanthocyanidin glicosides were established 'by using of chemical (alkalic and thiolytic decomposition, acidic and fermentative hydrolises, methylation) and spectroscopy (NMR, UV, IR) methods; remaining 10 substances were identified as early known compounds. Isolated new compounds were identified as (+)-catechin, (-)-epicatechin, (+)-gallocatchin and (-)-epigallocatechin oligomers.

Their inerflavone connections were established as C-4a-C-8, C-4(3-C-8 and C-4B - C-6 types.

Proanthocyanidin composition of Rliodiolae pamiroalaicae plant has been established as compound with antiatherosclerotic, hypolipidemic and estrogenic activities.

Studied plant has been recognized as perspective source of medicinal drugs.