ВЫДЕЛЕНИЕ И ВСТРЕЧНЫЙ СИНТЕЗ ГЛИКОЗИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПАТОВ Сергей Александрович

Выделение и встречный синтез гликозидов, обладающих адаптогенными свойствами

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте химии Коми Научного Центра Уральского отделения Российской Академии наук г Сыктывкар

Научный руководите чь Официальные оппоненты

Ведущая организация

член-корреспондент РАН А В Кучин

доктор химических наук, профессор ЭЭ Шульц

кандидат химических наук Л Б Дмитриев

Институт органической и физическои химии им Арбузова, г Казань

Защита диссертации состоится «^УС » декабря 2006 года в часов

на заседании диссертационного совета К 220 043 04 при Российском государственном аграрном университете МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, Тимирязевская утица, 49

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НЦ-РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан « ноября 2006 I

Ученый секретарь ___ е

диссертационного совета . *ес и ГЦ ¡окмаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяется разработке лекарственных средств растительного происхождения, обладающих адаптогенным эффектом. Родиола розовая (Rhodiola rosea L.) в этом смысле обладает уникальными свойствами. ■ Основными действующими веществами этого растения являются фенилпропаноиды: гликозиды коричного спирта (розин, розавин, розарин) и салидрозид. Соотношение мажорных компонентов R. rosea зависит от климатических условий и мест произрастания. Для установления качества растительного сырья необходимы стандартные вещества, полученные либо из экстрактов данного растения, либо синтетическим П)игем. -

Кроме того, известны соединения терпеновой природы, проявляющие физиологические свойства, сходные с фенилпропаноидами родиолы розовой. Однако их использование в качестве лекарственных средств затруднено, что частично связано с плохой растворимостью соединений данного класса в воде и физиологических жидкостях. Для улучшения растворимости и проницаемости через клеточную стенку вещества терпеновой природы часто переводят в гликозидную форму. Поэтому выделение, исследование и синтез гликозидов различной природы, обладающих физиологической активностью, является актуальной задачей. .

Работа выполнена в Институте химии Коми НЦ УрО РАН в рамках НИР по теме: «Химия и технология растительных веществ. Научные основы переработки и использования низкомолекулярных компонентов из растительного сырья как источника химических продуктов для органического синтеза, изучение физиологических свойств полученных ■ соединений» (№01.2.00102727), при поддержке Научного совета «Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья», ХТРС №8.1.38.

Цель работы. Синтез гликозидов растения Rhodiola rosea L., а также гликозидов некоторых монотерпеновых спиртов и стероидов. Испытание полученных соединений на биологическую активность. Разработка методов анализа растительного сырья Rhodiola rosea L. '

Научная новизна.

Впервые осуществлены синтезы гликозидов R. rosea — салидрозида, розина и розавина, а также ряда монотерпеновых спиртов и стероидов. Показано, что реакционная способность гидроксильных групп а-экдизона в реакциях гликозилирования различна, наи ольшую iiiibi— проявляют в положении С-3 и С-22. Разрг эотаншм^д&ЗДаод^^^дщцов R. rosea, позволяющие оценить качестЕ )

Фонд t^HH^ /mt^^p

I

1

показано, что синтетический розин при внутрибрюшинном введении лабораторным животным в концентрации 0 05 мг/кг проявляет адаптогенные свойства Впервые установлено, что синтетический розин способен увеличивать продолжительность жизни биологической модели Drosophila melanogaster при введении в рацион в малых дозах (0 05 мг/кг)

Практическая значимость. Усовершенствованы экстрактивные и синтетические методы получения нативных гликозидов R rosea, что позволит расширить перечень Государственных стандартных образцов химически чистых веществ Синтетические гликозиды могут применяться для обогащения экстрактов R rosea с целью увеличения их биологической ценности Основные гликозиды R rosea сапидрозид и розавин впервые выделены с помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных реагентов, что более приемлемо при получении лекарственных средств из растительного сырья Установлено, что R rosea накапливает гликозиды (сапидрозид и розавин) в количествах, удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации, к третьему году вегетации Растения, произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов на 23% больше, чем культурные растения Синтетические аналоги гликозидов Rhodiola rosea L проявляют высокую физиологическую активность и могут являться альтернативным источником получения лекарственных препаратов

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на [ Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2002), II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002), III Всероссийской конференции ' Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии раститетьного сырья" (Барнаул, 2005), IV Всероссийской научной конференции "Химия и технология распгтельных веществ" (Сыктывкар, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и тезисы 10 докладов на научных конференциях

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой -штературы и приложений Библиография включает литературные ссылки на 153 научные публикации Объем работы составляет 140 стр, включая _ таблиц, _ схем, _ рисунков Первая пава посвящена методам выделения и синтеза гликозидов различной природы, вторая глава посвящена изложению резучьтатов собственных исследований, в третьей главе приведены экспериментальные данные, методы получения и характеристики веществ

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение гликозидов Rhodiola rosea L.

Для исследования экстрактов корней с корневищами R. rosea L. были отобраны растения второго-пятого годов жизни в конце вегетации, произрастающие в ботаническом саду Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Выделение экстрактивных веществ осуществляли исчерпывающим экстрагированием измельченных корней с корневищами 70%-ным этиловым спиртом. Полученную экстракционную смесь обрабатывали сульфатом цинка для удаления части флавоноидов и производных галловой кислоты. Осадок отфильтровывали, водный слой экстрагировали н-бутанолом. Получали фракцию веществ, обогащенную гликозидами коричного спирта (циннамилгликозидами, ЦГ) и салидрозидом R. rosea L. (схема 1).

Схема 1. Экстракция и частичная очистка циннамилгликогидов (ЦГ)

и салидрозида R. rosea L.

Концентрированный экстракт наносили на колонку с сорбентом Диасорб 130С-16Т и элюировапи растворами этилового спирта различной концентрации. Установлено, что салидрознд элюируется 10%-ным, а ЦГ — 14%-ным этиловым спиртом. Полученные очищенные фракции исследовали методом ВЭЖХ с УФ детектированием при длине волны 276 нм для ЦГ и 256 нм для салидрозида.

но*

Фракции, содержащие индивидуальные вещества, иссчеяовали методами Я V1P 'н и "С спектроскопии Результаты проведенного анализа позволяют утверждать, что салидрозид 1 выделен в чистом виде, а в образце розави-на 2 присутствует примесь, которую мы идентифицировали как розиридин 3

В спектре ЯМР ПС смеси веществ 2 и 3 сигналы при 120 6 мд и 136 5 мд, принадлежат углеродным атомам у двойных связей молекулы розиридина в положениях 2,6 и 3,7 соответственно Сигнал при 1014 мд (Сі*) в спектре свидетельствует о наличии P-D-гликозидной связи Сигналы метальных групп в положениях 8, 9 и 10 при 17 8 м д, 25 7 м д и 33 8 мд соответственно, являются дополнительным подтверждением, что примесью является розиридин т к в розавине отсутствуют метальные группы Сигналы при 128 6 мд и 126 3 мл соответствуют углеродным атомам бензольного кольца розавина в положениях 2 6 и 3,5 Четвертому углеродному атому бензольного кольца соединения 2 отнесен сигнал 126 1 мд Для С] атома сигнал смещен в область слабого поля (131 5 мд) из-за наличия сопряженной связи пропилиденового фрагмента молекулы розавина Сигнал Сі'-атома арабинопиранозы при 103 4 мд в спектре розавина указывает на наличие а-конфигурации гликозидной связи с глюкопиранозой, связанной P-D-гликозидной связью при С і'-атоме 101 9 м д с коричным спиртом

Использование УФ детектора для ВЭЖХ анализа основных компонентов экстрактивной смеси R rosea L гликозидов коричного спирта и салидро-зида оказалось не совсем корректным при исследовании выдепенных индивидуальных компонентов Минорный компонент исходной смеси терпеновый пикозид розиридин не поглощает УФ излучение при длине волны 276 нм Поэтому, в дальнейшем для исследования фракций, обогащенных циннамил-гликозидами и розиридином, мы использовали рефрактометрический детектор Речроматография смеси веществ 2 и 3 в тех же условиях позволила получить индивидуальные розавин и розиридин в чистом виде

Калибровка аналитического хроматографа "Милихром 2" была проведена с использованием полученных рабочих образцов гликозидов A rosea. Калибровочные кривые для розавина и салидрозида построены согласно хроматографическим данным, что позволяет определять их концентрации в экстракте. Полученные результаты могут служить оценочным показателем качества сырья родиолы розовой.

Анализ экстрактов, выделенных из Rhodiola rosea L. разных годов жизни и места произрастания

Сбор растительного сырья проводили в 1999-2003 г. в ботаническом саду Института биологии Коми Научного центра УрО РАН. Часть отобранного материала — корни с корневищами A rosea второго-пятого годов жизни экстрагировали сразу, а часть сырья сушили при 70°С. Кроме того, был собран растительный материал на Северном Урале в долинах рек Большой Паток (2003) и Щугор (1999). Все растительное сырье отбирали в период отмирания надземной массы растения (август-октябрь).

Таблица 1

Содержание гликозидов в экстрактах корней с корневищами R. rosea в зависимости от года жизни и места произрастания, (%, от а.с.с.)

Год жизни р. Щугор р. Большой Паток

2 3 4 5

Салидрозид 0.7 0.9 1.2 1.1 2.1 1.0

Розавин 0.4 0.9 1.4 1.5 1.9 0.9

Розарин 0.3 0.8 1.3 1.3 1.9 0.7

Розин 0.03 0.1 0.1 0.2 0.3 0.01

К четвертому году жизни в растениях происходит небольшое снижение концентрации салидрозида по сравнению с гликозидами коричного спирта. К пятому году вегетации существенных изменений содержания гликозидов A rosea не происходит. Анализ экстракта корней с корневищами растений, произрастающих в долине реки Щугор, показал, что содержание гликозидов в них намного выше, чем в интродуцированных растениях (табл.1). Низкое содержание гликозидов в корнях с корневищами A rosea, собранных в долине реки Большой Паток, обусловлено климатическими условиями данного года: средняя температура превышала среднее значение для лета на 5-7 °С, количество выпавших осадков за июль-август 2003 года меньше среднего значения.

Таким образом, показано, что при интродукции' на Европейском Северо-востоке можно получать растения A rosea, удовлетворяющие

требованиям Государственной фармакопеи, лишь на 3-й год жизни Средняя массовая доля гликозидов в экстрактах дикой R. rosea на 23% больше, чем в культурных растениях Показано, что накопление гликозидов R rosea на Северном Урале также зависит от природных условии

В виду низкого содержания целевых компонентов в растительном сырье, трудоемкости их выделения и, следовательно, высокой себестоимости, нами был проведен синтез грех мажорных компонентов экстракта R rosea розина 18, розавина 2, салидрозида 1

Синтез салидрозида (1) Синтез салидрозида проводили в две стадии на первой - ацилировали тирозол 4 по фенольной группе, на второй - гликозилировали 5 ацетобром-глюкозой с получением соединения 7 (схема 2)

ОН ^ОАс

Ас,0 AcONa ^ НО^ НО*

JI

5

ОАс ,

ОАс

Схема 2. Синтез салидрозида После снятия защитных групп строение полученного соединения изучали методом ЯМР 'Н спектроскопии В спектре вещества видны сигналы протонов паря-замешенного фенола в положении 2, 6 и 3, 5 которые проявляются в виде дуплетов при 7 1 и 6 7 м д, водород при фенольной группе дает сигнал при 4 5 м д Сигналы протонов при 7 и 8 углеродных атомах проявляются при 2 7 и 3 7 м д соответственно Сигнал при 3 9 м д (д д ) соответствует водороду при С]' атоме глюкозы и говорит о наличии Р-О-гликозидной связи глюкозного фрагмента с фенольным Сигналы протонов глюкозы лежат в интервале 3 4—42 м д, протоны гидроксильных групп глюкозы наблюдаются в виде уширенного сигнала при 4 9 м д Таким образом, показано, что синтезированное соединение имеет структуру салидрозида

Синтез розавина (2)

Синтез розавина проводили двумя способами способ А предусматривает получение дисахарида и на его основе получение

гликозилирующего агента и синтез непосредственно самого гликозида — розавина; в способе Б первоначально синтезируют гликозид — розин, и далее, наращивая гликозидную цепь, получают розавин.

Способ А (схема 3): С этой целью был получен 1,2,3,4-тетра-О-ацетил-б-О-трифенилметил-О-глюкопиранозид, который обрабатывали бромоводо-родом для удаления трифенилметильной группы. Полученный таким образом 1,2,3,4-тетра-0-ацетил-В-глюкопиранозид (8) гликозилировали, используя различные катализаторы (карбонат серебра, хлорат серебра, оксолат меди) арабинопиранозилбромидом (9) в хлористом метилене (табл. 2).

Схема 3. Синтез розавина, способ А

Таблица 2

Выход 1,2г3,4-тетра-0-ацет11л-р-0-глюкопиранозил-2,3,4-три-0-ацет11л-а-Ь-арабинопнранозы при использовании различных катализаторов

Катализатор а-Ь-производные, %

А&СОз 13±2

AgC104, СаСОз 27±2

Т1СЦ 20±2

ВР3*Е120 18±2

С целью получения гликозилирующего агента дисахарид 10 обрабатывали в хлороформе метилмеркаптаиом, в качестве катализатора использовали эфират трехфтористого бора (ВИз Ег20)

Далее проводили гликозилирование коричного спирта 12 реагентом 11 при комнатной температуре в течение 8 ч с кристаллическим йодом в качестве катализатора Полный ацетат розавина выделяли колоночной хроматографией на силикагеле и подвергали гидролизу по реакции Земплена для удаления защитных ацетатных групп Продукт гидролиза очищали и анализировали методом ВЭЖХ на колонке Ь11ахогЬ С-18 детектированием при длине волны 252 нм Получили розавин 2 с общим выходом ~5%

Строение 2 доказали с помощью ЯМР ИС спектроскопии фенольное кольцо С, - 136 7, С;*-126 3, С,5- 127 4, С6- 128 5 м д. сигналы С7- 131 5, С8 — 127 5, С9— 70 5 м д оксипропиленового остатка, р-О-гликозидную связь С| при 102 Змд,дд 4 3 м д , а-Ь-пикозидную связь С| при 103 5 м д, д д 4 3 м д, сигналы остальных атомов углерода углеводной части лежат в области 62-76 мд Таким образом показано, что синтезированный розавин идентичен выделенному из растения

Способ Б (схема 4) 2,3,4-три-0-ацетил-6-0-трифенилметил-Р-0-глюкопиранозилбромид 13 присоединяли к агликону (коричному спирту) 12 В качестве катализаторов реакции использовали соли серебра, дибензо-18-краун-6 эфир, оксалат меди (табл 3)

Следующим этапом синтеза стало снятие защитной трифенилметиль-ной группы по 6-му положению глюкозы С этой целью полученный продукт транс-циннамил-0-Р-0-6-0-трифенилметил-2,3,4-три-0-ацетилпюкопира-нозу 14 обрабатывали бромоводородом, растворенным в уксусной кислоте При этом трифенилметильная группа отщеплялась, не затрагивая остальные ацетатные группы Недостатком способа являлось то, что частично разрушался и сам продукт 15 поэтому выходы данной реакции были порядка 60-70 % На последнем этапе проводили конденсацию транс-циннамил-О-Р-0-2,3,4-три-0-ацетилглюкопиранозы 15 с арабинопиранозилбромидом 9 в присутствии хлората серебра как катализатора

Таблица З

Выходы продуктов гликозилировання тетра-О-ацетил-б-О-трнфенилметнл-Р-О-глюкопиранозилбромида и коричного спирта при использовании различных катализаторов

Катализатор Р-О-производное, %

Аё2СО, 15±2

AgCЮ4. СаСОз 20±2

18-Краун-6 18±2

СиС:04 12±2

ОСРЬз

ЛСАсО-Л——+ НО. О Ас 13 Вг

16

ОН но

г

МеОЫа МеОН

НО' НО-

Схема 4. Синтез розавнна, способ Б Потученное соечинение /лраис-циннамил-СНб'-О-а-Ь-три-О-ацетил-арабиноиирамазил-р-Ц-гетра-О-ацетил-глюкопираногии) 16 выделяли котоночнон хроматографией на гидроаизовали метилатом натрия в

метаноче и пслучали розавин 2 с общим выходом до 1%

Полученные результаты указывают на то, что синтез розавина через образование дисахаридного мостика и последующего присоединения коричного спирта дает продукт с большим выходом (1-5 %), чем при постепенном достраивании углеводной цепи (0.2-1 %). Строение полученных соединений по данным ЯМР 13С и 'Н-спектроскопии полностью соответствует гликозиду, выделенному из растения.

Синтез розина (18) Синтез розина проводили по схеме 5. Вначале восстановливали коричную кислоту до коричного спирта 13. При этом в качестве примеси (0.3%) дополнительно с коричным спиртом происходит образование З-фенил-1-пропанола. Разделение и выделение индивидуальных веществ проводили на колонке с силикагелем. Данные ЯМР 13С и 'Н спектроскопии подтверждают структуру коричного спирта: Сі — 141.3 м.д., С2 6- 126.4 м.д., Сз.5 - 128.3 м.д., С4 - 127.9 м.д., С7- 130.0 м.д., С8 - 126.8 м.д., С9 - 62.3 м.д., ЯМР 'Н: бензольное кольцо 7.3 м.д. (м.), С7 — 6.5 м.д. (д.), С8 - 6.3 м.д. (т.д.), С9 - 4.2 м.д. (д.), -ОН - 4.3 м.д. (е.). ЯМР 13С и !Н спектры З-фенил-1-пропанола указывают на отсутствие сопряженной двойной связи в соединении (ЯМР ,3С: С, - 141.7 м.д., С2,3-С5.б-128.2 мл., С4-414.7 м.д., С7- 31.9 м.д., С8- 33.9 м.д., С9-61.7 м.д.; ЯМР 'Н: бензольное кольцо 7.2-7.4 м.д., С7-

2.6 мд.(т.), С8- 1.9 м.д. (т.т.), С,-3.7 мд. (т.)). ^

ноос.

Схема 5. Синтез розина Гликозилирование коричного спирта 13 проводили ацетобромглюкозой в присутствии катализатора AgC104-CaC03 в течение суток в темноте при комнатной температуре, выход продукта после колоночной хроматографии на Si02 составил 25%, гидролизом которого был получен гликозид 18.

Наличие ß-D-гликозидной связи подтверждается в спектре ЯМР 13С сигналом 102.0 м.д. (Cr), углеводного фрагмента - 71.3-62.0 м.д., фенильной группы - Сі - 141.7 мд., С2.6 - 125.6 м.д., С3,5 - 128.4 м.д., С4 - 126.3 м.д., С7-132.1 м.д., С8— 128.2 м.д., Сч - 68.7 м.д. Таким образом, синтезированный розин полностью соответствует природному, выделенному из родиолы розовой.

Синтез гликозидов монотерпеноидов

Известно, что терпеноиаы являются биологически активными веществами Однако использование соединений данного класса в качестве лекарственных средств затруднено, что частично связано с их плохой растворимостью в водных растворах и малой проницаемостью через клеточную стенку Поэтому для фармакопеи интерес представляют гликозиды терпе-ноидов, которые, как известно, хорошо растворяются в физиологических жидкостях Среди монотерпеноидов различной природы особый интерес представляют борнеол 19, г;ис-вербенол 20, 4-(1-гид-роксиэтил)карен-2 21, чиртенол 22, которые проявляют ярко выраженную бактерицидную и фунги-цидную активность

Синтез монотерпеновых гликозидов проводили по методу Кеннигса-Кнорра (схема 6), используя в качестве катализатора карбонат серебра По окончании реакции избыток монотерпеноидов удаляли отгонкой с водяным паром, затем синтезированные гликозиды выделяли хроматографией на колонке с силикагелем

ОАО

Аас°оХ^А + ROH

OAcj Br

Схема 6 Синтез гликозидов монотерпенандов Выходы полученных гликозидов варьируется от 35 до 57% (табл4) Вероятно такой разброс объясняется наличием стерических затруднений в структуре монотерпеноидов В частности, в структуре вербенола, для которого выход гликозида наибольший, гидроксильная группа оказывается более реакционноспособной, так как находится в аллильном положении, а также она максимально удалена от С6 чостиковой связи Низкий выход гликозида борнеола объясняется тем. что гидроксильная группа в положении С; .жранируется чостиковой связью при С-, что создает дополнительные стери-ческие затруднения при проведении реакции гликозилирования Выход гликозидов чиртенола и 4-(1-гидроксиэтил)карена-2 меньше, чем «нс-вебенола, несмотря на то, что гидроксильные группы находятся в более выгодном положении с точки зрения реакционной способности и доступности

ОАО

ОАО

Таблица 4

Выходы терпеновых гликозидов__

Агликон (ЯОН) Выход, %

Борнеол(19) 35.4±0.5

Чнс-Вербенол (20) 57.5±0.5

4-(1-гидроксиэтил)карен-2 (21) 42.2±0.5

Миртенол (22) 41.6±0.5

Методами спектроскопии ЯМР *Н и 13С установлено, что полученные гликозиды имеют р-О-гликозидную связь, что подтверждается наличием в спектрах сигналов при 4.2-4.6 м.д. Ог г- 8 Гц) и 99-101 м.д. соответственно. Полученные гликозиды монотерпеноидов в настоящее время испытываются на биологическую активность.

Гликозиды стероидов и тритерпенов

В связи с тем, что растворимость стероидов в физиологических жидкостях человека — крови, слюне, пищеварительном соке сравнительно невелика (8-10 мг/мл), представлялось целесообразным разработать методы и схемы синтеза полусинтетических гликозидов стероидов, более приемлемых как для перорального, так и инъекционного введения их в организм человека.

Гликозид Р-ситостерина (24)

По литературным данным из надземной части растения Кгозеа были выделены вещества стероидной природы, в частности р-ситостерин 23 и даукостерин 24. Но в виду их низкого содержания в данном растении нами в качестве растительного материала была взята кора осины, которая кроме того, содержит сапидрозид и некоторые другие терпеновые и фенольные соединения.

Для выделения соединения 23 проводили экстракцию осиновой коры этилацетатом в аппарате Сокслетга. После упаривания растворителя экстракционную смесь наносили на колонку с сорбентом Диасорб 130С-16Т и элюи-ровали водными растворами этилового спирта различной концентрации (0-30%). Фракции анализировали методом ВЭЖХ. В ЯМР !Н спектре Р-ситостерина сигналы кольцевой системы стероида лежит в пределах 0.5-2.5 м.д., четко видны сигналы протонов при С3 атоме, связанном с гидроксильной группой (3.5 м.д. (1Н, м)) и Се, находящемся при двойной связи в цикле (5.3 м.д. (1Н,.т)), протон при гидроксильной группе дает уширенный синглет при 3.0 м.д.

Синтез гликозида р-ситостерина проводили, используя в качестве гли-козилирующего агента меркаптопроизводное глюкозы — 2,3,4,6-тетра-О-

ацетил-Р-метил-1-тио-0-глюкопиранозид 25, в качестве катализатора выступал кристаллический йод (схема 7) Выход целевого продукта 24 составил

30-35 %

24

Схема 7. Синтез глинозмда р-ситостерииа Спектр ЯМР ,3С позволил нам сделать вывод, что агликон связан a-D-гликозидной связью с глюкозой (86 3 м д) Таким образом, наше соединение имеет структуру гликозида даукостерина 24

Гликозид а-экдизона (27)

Еще одним из интересных объектов исследований в последнее время является a-экдизон, 20-гидроксиэкдизон и инокостерон Основными источниками для получения экдистероидов стали растения родов Rhaponttcum и Silene

Экстракцию фитоэкдистероидов проводили 40°íi-HbiM этиловым спиртом из измельченного растительного сырья Serratilla coronata L (серпуха венценосная), после чего экстракт обрабатывали раствором сульфата цинка и сумму стероидов раздетяли на колонке, заполненной сорбентом Диасорб 130-С16Т После разделения суммарного экстракта были получены а-экдизон 26, 20-гидроксиэкдизон и инокостерон

Полученный а-экдизон гликозилировали двукратным избытком глико-зшшрующего агента 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-Р-метил-1 -тио-О-глюкопирано-зид 25, в качестве катализатора реакции использовали кристаллический йод (схема 8), выход продукта составил 30-35% ЯМР ПС спектр указывает на то, что гликозилирование экдистероида проходит по двум положениям происходит смещение сигналов, соответствующих Ci и атомам в область спабого поля (80 8 м д и 90 I м д соответственно), с образованием p-D-гликозидной связи (Ci 100 5мд иС| 1014мд)

Таким образом можно утверждать, что полученный препарат а-ждизо-на является бигликозидом 27, а наиболее реакционноспособные гидроксиль-ные группы находятся в положениях Сх и С;: По литературным данным, из

растений родов Melandrium, Allium были выделены гликозиды стероидной природы, причем углеводные фрагменты находились по положениям С3, Са

Исследования физиологической активности синтетического розина

В связи с тем, что природные аналоги синтезированных препаратов проявляют высокую биологическую активность, представлялось целесообразным провести тестирование на активность синтетических аналогов. В качестве образца был взят гликозид родиолы розовой — розин. Испытания на биологическую эффективность проводились в Институте Биологии КНЦ УрО РАН в лаборатории генетики. Хоз. договор № 56-2004 «Исследование биологической активности синтетического розина на лабораторных животных».

Тест на лабораторных мышах

Испытание физиологической активности розина проведено на лабораторных мышах линии СВА (100 мг/кг) и С57В1. Физическую работоспособность и влияние на нее розина оценивали по выносливости к динамической и статической нагрузке. Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе. Розин в концентрации 100 мг/кг (мыши линии СВА); 5, 0.5 и 0.05 мг/кг (мыши пинии С57В1) вводили внутрибрюшинно. В качестве контроля использовали физиологический раствор (0.9%-ный раствор ЫаС1).

В результате исследования физиологической активности розина было установлено, что только минимальная из исследованных концентраций оказывает положительное воздействие на увеличение выносливости к динамическим нагрузкам — продолжительность плавания увеличилась более чем на 40% При этой дозе также наблюдается увеличение массы семенников Высокие дозы (5 и 100 мг/кг) наоборот приводили к резкому снижению устойчивости к статической и особенно к динамической нагрузкам — продолжительность плавания снизилась в 10 раз Следует обратить особое внимание, что только при максимальной концентрации обнаружено увеличение частоты хромосомных аберраций Установлено, что низкие концентрации розина могут увеличивать устойчивость к физическим нагрузкам, т е обладают адаптогенными свойствами

Учитывая тот факт, что некоторые концентрации розина приводили к увеличению уровня генетической изменчивости были проведены испытания препарата на дрозофиле Данный объект позволяет, используя стандартные методы, оценить биологическую эффективность Тесты на дрозофиле (линии Drosophda melanogaster Canton-S, met-41, mus 209, 4015, 4018) показали, что воздействие розина на ранние стадии развития, независимо от генотипа, приводит к достоверно значимому увеличению медианной продолжительности жизни (на 23%) у самцов

Выводы

1 С помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных растворителей из экстракта корней с корневищами растения Rhodiola rosea L выделены в нативном виде гликозиды — розавин и салидрозид Разработаны методы анализа позволяющие оценить качество растительного сырья Rhodiola rosea L , в частности показано, что к третьему году вегетации интродуцированное сырье накапливает гликозиды в количествах, удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации Растения, произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов в среднем на 23% больше, чем культурные растения

2 Синтезированы пикозиды Rhodiola rosea L — салидрозид и розин Из разработанных и апробированных двух схем синтеза розавина наиболее ^фективной является получение пикозида построением упеводного фрагмента и присоединением его к агликону Синтезированные гликозиды являются альтернативой природным соединениям как в качестве биологически активных веществ, так и в качестве эталонных соединений

3. Выполнен ряд. синтезов гликозидов монотерпеноидов по методу Кеннигса-Кнорра. Найдено, что практический выход гликозидов в ряду монотерпеноидов может достигать 50%.

4. Впервые синтезированы гликозвды экдистероидов. Показано, что реакционная способность гидроксильных групп различна, гликозилирование проходит в положения Сз II С22- '

5. Проведены испытания синтетического препарата розина на биологическую активность. Исследования на мышах (линии СВА и C57BI) показали: высокие концентрации розина (100 и 5 мг/кг) снижают выносливость к статической и, особенно, к динамической нагрузке. Минимальная из тестируемых концентраций розина (0,05 мг/кг), привела к увеличению выносливости к динамической нагрузке. Исследование генотоксической эффективности розина не выявило достоверно значимых изменений в половых и соматических клетках. Обнаружено увеличение уровня микроядер только при максимальной дозе розина. Тесты на дрозофиле (линии Drosophila melanogaster:Canton-S, mei-41, mus 209, 4015, 4018) показали что воздействие розина на ранние стадии развития, независимо от генотипа, приводит к достоверно значимому увеличению медианной продолжительности жизни (на 23%) у самцов.

Публикации

1. Патов С.А., Захожий И.Г., Пунегов В.В., Кучин A.B., Кодесс М.И. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L. с помощью обращеннофазовой хроматографии и встречный синтез салидрозида // Бутлеровские сообщения. 2002. №7. С. 85-87.

2. Туманова Е.А., Патов С.А., Пунегов В.В., Кучин A.B., Фролова Л.Л., Кодесс М.И. Гликозилирование монотерпеноидов, входящих в состав эфирных масел растений, методом Кеннигса-Кнорра // Бутлеровские сообщения. 2002. №7. С. 89-91. '

3. Патов С.А., Пунегов В.В.., Кучин A.B., Фролова Л.Л.. Синтез гликозидов некоторых монотерпеноидов // Химия природных соединений. 2006, №4. С. 431-433.

4. Патов С.А., Пунегов В.В.., Кучин A.B. Синтез розавина - гликозида Rhodiola rosea // Химия природных соединений. 2006, №4. С. 397-399.

5. Патов С.А., Пунегов В.В., Кучин A.B. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L. с помощью обращеннофазовой хроматографии и встречный синтез салидрозида // II Всероссийская конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. — Казань, 2002. — С. 3-4.

6 Туманова Е А, Патов С.А. Гликозилирование монотерпеноидов входящих в состав эфирных масел растений методом Кеннигса-Кнорра // II Всероссийская конференция * Химия и технология растительных веществ' Тез докл - Казань, 2002 - С 5

7 Патов С.А., Пунегов В В , Сычев Р Л , Кучин А В , Кодесс VI И Синтез гтикозидов бетулина и экдистероидов // II Всероссийская конференция "Химия и технология растительных веществ ' Тез докл - Казань. 2002,-С 35

8 Захожий И Г, Пунегов В В , Патов С.А. Об эффективности твердофазной экстракции при подготовке проб препаратов Rhodwla rosea L для ВЭЖХ анализа гтикозидов /' I Всероссийская конференция 'Аналитические приборы' Тез докл - СПб, 2002 -С 177

9 Патов С.А., Кучин А В Синтез розавина - гпикознда родиолы розовой Rhodwla rosea L К III Всероссийская конференция "Химия и технология растительных веществ Тез докл — Саратов, 2004 - С 64

10 Пунегов В В Патов С.А, Сычев РЛ, Туманова ЕА Электрохимическая трансформация а-пинена в нестационарном поле импульсного тока как способ получения кислородсодержащих монотерпеноидов // III Всероссийская конференция " Химия и технология растительных веществ" Тез докл - Саратов, 2004 -С 109-110

11 Патов С.А , Пунегов В В , Кучин А В Гтикозиды Rhodiola rosea L выделение, анализ состава, встречный синтез // Всероссийская конференция 'Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" Тез докл - Барнаул, 2005 -С 246

12 Патов С.А . ГКнегов В В , Кучин А В Выделение и синтез гликозидов Rhfd,ola rmea i 1\ Всероссийская научная конференция ' Химия и технология р^сгигельныч нешеогв Тез -Сыктывкар 2006 -С 152

1 1 Патов С. V jjuHVL'iiiH В Г , IIvhciob Н В , Кучин Л В Исследование биологическом активности ииггелического розина / IV Всероссийская научная конференция Чичия и темю югия растшельных веществ Гез докл — Сыктывкар, 2006 -С 153

14 Патов С. V Туманова Е А ГКнегов В В Фролова Л Л Кучин А В Синтез пикишлои некоторых монотерпеноидов / IV Всероссийская научная конференция Химия и техно огня растительных веществ" fei докл -Сыктывкар 2006 -С И4

Лицензия № 0047 от 10.01.1999 Заказ № 53_Тираж 100 экз.

Издательство Коми научного центра УрО РАН 167982, ГСП, г. Сыктывкар, ул. Первомайская, 48.