Выделение и встречный синтез гликозидов, обладающих адаптогенными свойствами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПАТОВ Сергей Александрович

Выделение и встречный синтез гликозидов, обладающих адаптогенными свойствами

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Институте химик Коми Научного Центра Уральского ' отделения Российской Академии наук г. Сыктывкар

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН А. В. Кучин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Э.Э. Шулъц

кандидат химических наук Л. Б. Дмитриев

Ведущая организация:

Институт органической и физической химии им. Арбузова, г. Казань

Защита диссертации состоится декабря 2006 года в /V

сгО

часов

на заседании диссертационного совета К 220.043.04 при Российском государственном аграрном университете МСХА имени К.А. Тимирязева, по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская улица, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НЦБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан < »ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.П. Токмаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяется разработке лекарственных средств растительного происхождения, обладающих адаптогенным эффектом. Родиона розовая (Rhodiola rosea L.) в этом смысле обладает уникальными свойствами. * Основными действующими веществами этого растения являются фенил пропаноиды: гликозиды коричного спирта (розин, розавин, розарии) и салидрозид. Соотношение мажорных компонентов R. rosea зависит от климатических условий и мест произрастания. Для установления качества растительного сырья необходимы стандартные вещества, полученные либо из экстрактов данного растения, либо синтетическим путем.

Кроме того, известны соединения терпеновой природы, проявляющие физиологические свойства, сходные с фенилпропаноидами родиолы розовой. Однако их использование в качестве лекарственных средств затруднено, что частично связано с плохой растворимостью соединений данного класса в воде, и физиологических жидкостях. Для улучшения растворимости и проницаемости через клеточную стенку вещества терпеновой природы часто переводят в гликозидную форму. Поэтому выделение, исследование и синтез гликозидов различной природы, обладающих физиологической активностью, является актуальной задачей.

Работа выполнена в Институте химии Коми НЦ УрО РАН в рамках НИР по теме: «Химия и технология растительных веществ. Научные основы переработки и использования низкомолекулярных компонентов из растительного сырья как источника химических продуктов для органического синтеза, изучение физиологических свойств полученных соединений» (№01.2.00102727), при поддержке Научного совета «Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья», ХТРС №8.1.38.

Цель работы. Синтез гликозидов растения Rhodiola rosea L., а также гликозидов некоторых моногерпеновых спиртов и стероидов. Испытание полученных соединений на биологическую активность. Разработка методов анализа растительного сырья Rhodiola rosea L.

Научная новизна.

Впервые осуществлены синтезы гликозидов R. rosea — салидрозид а, розина и розавина, а также ряда моногерпеновых спиртов и стероидов. Показано, что реакционная способность гидроксильных групп а-экдизона в реакциях гликозилирования различна, наибольшую активность ОН-группы проявляют в положении С-3 и С-22. Разработаны методы анализа экстрактов R. rosea, позволяющие оценить качество растительного сырья. Впервые

показано, что синтетический розин при внутрибрюшннном введении лабораторным животным в концентрации 0.05 мг/кг проявляет адаптогенные свойства. Впервые установлено, что синтетический розин способен увеличивать продолжительность жизни биологической модели Drosophila melanogasfer при введении в рацион в малых дозах (0.05 мг/кг).

Практическая значимость. Усовершенствованы экстрактивные и синтетические методы получения нативных гликозидов Д. rosea, что позволит расширить перечень Государственных стандартных образцов химически чистых веществ. Синтетические гликозиды могут применяться для обогащения экстрактов R. rosea с целью увеличения их биологической ценности. Основные гликозиды R. rosea салидрозид и розавин впервые выделены с помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных реагентов, что более приемлемо при получении лекарственных средств из растительного сырья. Установлено, что R rosea накапливает гликозиды (салидрозид и розавин) в количествах, удовлетворяющих требованиям Государственной' фармакопеи Российской Федерации, к третьему году вегетации. Растения, произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов на 23% больше, чем культурные растения. Синтетические аналоги гликозидов Rhodiola rosea L. проявляют высокую физиологическую активность и могут являться альтернативным источником получения лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на I Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2002), II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002), Ш Всероссийской конференции: "Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2005), IV Всероссийской научной конференции: "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2006) •

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и тезисы 10 докладов на научных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Библиография включает литературные ссылки на 153 научные публикации. Объем работы составляет 140 стр., включая _ таблиц, _ схем, __ рисунков. Первая глава посвящена методам выделения и синтеза гликозидов различной природы, вторая глава посвящена изложению результатов собственных исследований, в третьей главе приведены экспериментальные данные, методы получения и характеристики веществ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение гликозидов Rhodiola rosea L.

Для исследования экстрактов корней с корневищами R rosea L. были отобраны растения второго-пятого годов жизни в конце вегетации, произрастающие в ботаническом саду Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Выделение экстрактивных веществ осуществляли исчерпывающим экстрагированием измельченных корней с корневищами 70%-ным этиловым спиртом. Полученную экстракционную смесь обрабатывали сульфатом цинка для удаления части флавонондов н производных галловой кислоты. Осадок отфильтровывали, водный слой экстрагировали и-бутанолом. Получали фракцию веществ, обогащенную гликозидами коричного спирта (циинамилгликозндами, ЦГ) н сапидрозидом R. rosea L. (схема 1).

Сим а 1. Экстракция н частичная очистка цнннамн л глн коз идо в (ЦГ) н салидрогида A rotea L.

Концентрированный экстракт наносили на колонку с сорбентом Диасорб 130С-16Т и элюировали растворами этилового спирта различной концентрации. Установлено, что салидрозид элюируется 10%-ным, а ЦГ — 14%-ным этиловым спиртом. Полученные очищенные фракции исследовали методом ВЭЖХ с УФ детектированием при длине волны 276 нм для ЦГ и 256 нм для салндрознда.

Фракции, содержащие индивидуальные вещества, исследовали методами ЯМР 'Н и "С спектроскопии. Результаты проведенного анализа позволяют утверждать, что салидрозид 1 выделен в чистом виде, а в образце розави-на 2 присутствует примесь, которую мы идентифицировали как розиридин 3.

В спектре ЯМР ,3С смеси веществ 2 и 3 сигналы при 120.6 мл и 136.5 м.д., принадлежат углеродным атомам у двойных связей молекулы розирндина в положениях 2,6 и 3,7 соответственно. Сигнал при 101.4 мл. (CV) в спектре свидетельствует о наличии p-D-гликозидной связи. Сигналы метальных групп в положениях 8, 9 и 10 при 17.8 мл, 25.7 мл- и 33.8 м.д. соответственно, являются дополнительным подтверждением, что примесью является розиридин т.к. в розавине отсутствуют метильные группы. Сигналы при 128.6 мл. и 126.3 м.д. соответствуют углеродным атомам бензольного кольца розавина в положениях 2,6 и 3,5. Четвертому углеродному этому бензольного кольца соединения 2 отнесен сигнал 126.1 м.д. Для С] атома сигнал смещен в область слабого поля (131.5 мл.) из-за наличия сопряженной связи пропнлиденового фрагмента молекулы розавина. Сигнал С|'-атома арабинопиранозы при 103.4 м.д. в спектре розавина указывает на наличие «-конфигурации глнкозидной связи с глюкопиранозой, связанной P-D-гликозидиой связью при С]'-атоме 101.9 м.д. с коричным спиртом.

Использование УФ детектора для ВЭЖХ анализа основных компонентов экстрактивной смеси R. rosea L. глнкозидов коричного спирта и салидрозид а оказалось не совсем корректным при исследовании выделенных индивидуальных компонентов. Минорный компонент исходной смеси терпеновый глнкознд розиридин не поглощает УФ излучение при длине волны 276 нм. Поэтому, в дальнейшем для исследования фракций, обогащенных циннамил-гликоз идами и рознриднном, мы использовали рефрактометрический детектор. Рехроматография смеси веществ 2 и 3 в тех же условиях позволила получить индивидуальные розавин и розиридин в чистом виде.

Калибровка аналитического хроматографа "Милихром 2" была проведена с использованием полученных рабочих образцов гли коз вдов R rosea, Калибровочные кривые для розавина и салидрозида построены согласно хроматографическим данным, что позволяет определять их концентрации в экстракте. Полученные результаты могут служить оценочным показателем качества сырья родиолы розовой.

Анализ экстрактов, выделенных из Rhodiola rosea L. разных годов жизни и места произрастания

Сбор растительного сырья проводили в 1999-2003 г. в ботаническом саду Института биологии Коми Научного центра УрО РАН. Часть отобранного материала — корни с корневищами R. rosea второго-пятого годов жизни экстрагировали сразу, а часть сырья сушили при 70°С. Кроме того, был собран растительный материал на Северном Урале в долинах рек Большой Пэток (2003) и Щугор (1999). Все растительное сырье отбирали в период отмирания надземной массы растения (август-октябрь).

Таблица 1

Содержание гликозидов в экстрактах корней с корневищами R. rosea в зависимости от года жизни и места произрастания, (%, от а.с.с.)

Год жизни р. Щугор р. Большой Паток

2 3 4 5

Салидрозид 0.7 0.9 1.2 1.1 2.1 1.0

Розавии 0.4 0.9 1.4 1.5 1.9 0.9

Розарии 0.3 0.8 1.3 1.3 1.9 0.7

Розин 0.03 0.1 0.1 0.2 0.3 0.01

К четвертому году жизни в растениях происходит небольшое снижение концентрации салидрозида по сравнению с гликозидами коричного спирта. К пятому году вегетации существенных изменений содержания гликозидов A rosea не происходит. Анализ экстракта корней с корневищами растений, произрастающих в долине реки Щугор, показал, что содержание гликозидов в них намного выше, чем в и (продуцированных растениях (табл.1). Низкое содержание гликозидов в корнях с корневищами R. rosea, собранных в долине реки Большой Паток, обусловлено климатическими условиями данного года: средняя температура превышала среднее значение для лета на 5-7 "С, количество выпавших осадков за июль-август 2003 года меньше среднего значения.

Таким образом, показано, что при интродукции на Европейском Северо-востоке можно получать растения A rosea, удовлетворяющие

требованиям Государственной фармакопеи, лишь на 3-й год жизни. Средняя массовая доля гликоэидов в экстрактах дикой R. rosea на 23% больше, чем в культурных растениях. Показано, что накопление гликозидов A rósea на Северном Урале также зависит от природных условий.

В виду низкого содержания целевых компонентов в растительном сырье, трудоемкости их выделения и, следовательно, высокой себестоимости, нами был проведен синтез трех мажорных компонентов экстракта R. rosea: розина 18, розавина 2, салидрозида 1,

Синтез салидрозида (1) Синтез салидрозида проводили в две стадии: на первой — ацил провал и тирозол 4 по фенольной группе, на второй — гликозилировали 5 ацетобром-глюкозой с получением соединения 7 (схема 2).

Схема 2. Синтез салндрошдя

После снятия защитных групп строение полученного соединения изучали методом ЯМР *Н спектроскопии. В спектре вещества видны сигналы протонов ла/га-замещенного фенола в положении 2, 6 и 3,5 которые проявляются в виде дуплетов при 7.1 и 6.7 м.д., водород при фенольной группе дает сигнал при 4.5 мл. Сигналы протонов при 7 и 8 углеродных атомах проявляются при 2.7 и 3.7 мл. соответственно. Сигнал при 3.9 мл. (д.д.) соответствует водороду при С(' атоме глюкозы и говорит о наличии Р-Р-гликозидной связи глкжозиого фрагмента с фенольным. Сигналы протонов глюкозы лежат в интервале 3.4 — 4.2. м.д., протоны гидроксильных групп глюкозы наблюдаются в виде уширенного сигнала при 4.9 м.д. Таким образом, показано, что синтезированное соединение имеет структуру салидрозида.

Синтез розавина (2)

Синтез розавина проводили двумя способами: способ А: предусматривает получение дисахарида и на его основе получение

гликозипирующего агента и синтез непосредственно самого гликоэида — розавина; в способе Б первоначально синтезируют глнкозид - розин, и далее, наращивая гликозидную цель, получают розавин.

Способ А (схема 3): С этой цепью был получен 1,2,3,4-тетра-О-ацетил-б-О-трифенилметил-О-глюкопиранозид, который обрабатывали бромоводо-родом для удаления трифенилметильной группы. Полученный таким образом 1,23,4-тетра-0-ацетил-0-глюкопиранозид (8) гликозилировали, используя различные катализаторы (карбонат серебра, хлорат серебра, оксолат меди) арабинопнранозилбромидом (9) "в хлористом метилене (табл. 2).

Схема 3. Синтез розавина, способ А

Таблица 2

Выход 1,2,3,4-тетра-0-ацетил-р-0-гл »копира нозил-2,3>4-три-0-я цети л-а-Ь-арабиио пира позы при использовании различных катализаторов

Катализатор а-Ь-про изводные, %

А&СОэ 13±2

АеСЮ^, СаСОз 27±2

ТЮЦ 20±2

ВРэ-Е^О 18±2

С целью получения гликозилирующего агента дисахарнд 10 обрабатывали в хлороформе метилмеркаптаном, в качестве катализатора использовали эфират трехфтористого бора (ВРэ^гО).

Далее проводили гликозшшрованне коричного спирта 12 реагентом 11 при комнатной температуре в течение 8 ч с кристаллическим йодом в качестве катализатора. Полный ацетат розавииа выделяли колоночной хроматографией на силикагеле и подвергали гидролизу по реакции Земплена для удаления защитных ацетатных групп. Продукт гидролиза очищали и анализировали методом ВЭЖХ на колонке 5йа$огЬ С-18 детектированием при длине волны 252 нм. Получили розавин 2 с общим выходом ~5%.

Строение 2 доказали С помощью ЯМР |3С спектроскопии: фенольное кольцо С1- 136.7, Сг.4-126.3, С3.5- 127.4, Се- 128.5 м.д., сигналы Ст- 131.5, С» — 127.5, С»—70.5 мл. оксипропиленового остатка, р-Р-гликозидную связь Сг при 102.3 м.д., д.д. 4.3 мл., а-Ь-гликозидную связь Сг при 103.5 м.д., дл. 4.3 мл., сигналы остальных атомов углерода углеводной части лежат в области 62-76 м.д. Таким образом показано, что синтезированный розавин идентичен выделенному из растения.

Способ Б (схема 4); 2,3,4-три-0-ацетил-б-0-трифенипметил-Р-В-глюкопиранозилбромид 13 присоединяли к агликону (коричному спирту) 12. В качестве катализаторов реакции использовали соли серебра, дибензо-18-краун-6 эфир, оксалат меди (табл. 3).

Следующим этапом синтеза стало снятие защитной трифенилмстильной группы по 6-му положению глюкозы. С этой целью полученный продукт транс- ци н намил-0-Р-0-б-0-трифенилметил-2,3,4-три-0-ацетипгл10копира-нозу 14 обрабатывали бромоводородом, растворенным в уксусной кислоте. При этом трифенилметильная группа отщеплялась, не затрагивая остальные ацетатные группы. Недостатком способа являлось то, что частично разрушался и сам продукт 15, поэтому выходы данной реакции были порядка 60-70 %. На последнем этапе проводили конденсацию т/злнс-цнннамил-О-р -Р-2,3,4-три-0-ацетилглюкопиранозы 15 с арабинопиранозилбромидом 9 в присутствии хлората серебра как катализатора:

Таблица 3

Выходы продуктов гликозилнроваиия тетря-О-ацетил-б-О-трифенилметил-р-1)-глюкопнранозилбромида и коричного спирта при использовании различны! катализаторов

Катализатор Р-1>-производное, %

А&СО) 15±2

А^Ю*, СаСОз 20±2

18-Краун-б 18±2

СиС204 12±2

ОСРЬэ

+

ОАс1 и ВГ

Агсю4

12

АсО

ОАс 14

НВг

АСД°сО

ОН

ОАс

15

ОАс

16

МеОЫа, МеОН

—О

Схема 4. Синтез розавина, способ Б Полученное соединение транс-ии»намил-0-{6'-О-а-Ь-трн-О-ацетил-арабинопиранозил-р-О-тетра-О-ацетил-глюкоииранозид) 16 вьщеляли колоночной хроматографией на ЗЮ2, гидролизовали метилатом натрия в метаноле и получали розавлн 2 с общим выходом до 1%.

Полученные результаты указывают на то, что синтез розавина через образование дисахар ндного мостика и последующего присоединения коричного спирта дает продукт с большим выходом (1-5%), чем при постепенном достраивании углеводной цепи (0.2-1 %). Строение полученных соединений по данным ЯМР |3С и 'Н-спектрос копии полностью соответствует гликозиду, выделенному из растения.

Синтез розина (18) Синтез розина проводили по схеме 5. Вначале восстановливали коричную кислоту до коричного спирта 13. При этом в качестве примеси (0.3%) дополнительно с коричным спиртом происходит образование 3 -фен ил-! -пропанола. Разделение и выделение индивидуальных веществ проводили на колонке с сшшкагелем. Данные ЯМР 13С и *Н спектроскопии подтверждают структуру коричного спирта: С) — 1413 мл-, С^— 126.4 м.д., C^j - 128.3 м.д., С4 - 127.9 мд. С,- 130.0 м.д., Cs - 126.8 мд„ С>- 62.3 м.д., ЯМР 'Н: бензольное кольцо 73 м.д. (м.), С7 - 6.5 м.д. (д.), Cs - 6.3 мд. (тд.), С» - 4.2 м.д. (д.), -ОН - 4.3 м.д. (е.). ЯМР |5С и 'Н спектры З-фенил-1-пропанола указывают на отсутствие сопряженной двойной связи в соединении (ЯМР "С: Ci- 141.7 м.д„ Cv-Cs,í-Í2S.2 мл., С4 - 414.7 м.д., Ст- 31.9 мл., Cg—33.9 м.д., С*—61.7 мл.; ЯМР 'Н: бензольное кольцо 7.2-7.4 м.д., С?— 2.6 мд,(т.), Cg- 1.9 мл. (тт.), Cs—3.7 мл. (т.)).

rooc^/^jO LlA1"4' но^^О + но.

13

^ОАе

0.3%

+ НО^^^СЗ 2- МЛН* МЛН "«^^^^^О^^^хС^

6 ВГ 13 0Н 18

Схема 5. Смите! ронша Гликознлирование коричного спирта 13 проводили ацетобромглюкозой в присутствии катализатора А(*СЮ4-СаСО} в течение суток в темноте при комнатной температуре, выход продукта после колоночной хроматографии на 8К>2 составил 25%, гидролизом которого был получен гликоэнд 18.

Наличие р-Е>-глнкозидной связи подтверждается в спектре ЯМР |3С сигналом 102.0 м.д. (Сг), углеводного фрагмента — 713-62.0 мл., фенильной группы - С, - 141.7 мл., С2.4 - 125.6 мд., С3>5 - 128.4 мл., С4 - 126.3 м.д., С7-132.1 м.д., Св — 128.2 м.д., С9 — 68.7 мл. Таким образом, синтезированный розин полностью соответствует природному, выделенному из родиолы розовой.

Синтез гликозидов монотерпеноидов

Известно, что терпеноиды являются биологически активными веществами. Однако использование соединений данного класса в качестве лекарственных средств затруднено, что частично связано с их плохой растворимостью в водных растворах и малой проницаемостью через клеточную стенку. Поэтому для фармакопеи интерес представляют гликозиды терпе-ноидов, которые, как известно, хорошо растворяются в физиологических жидкостях. Среди монотерпеноидов различной природы особый интерес представляют борнеол 19, г^с-вербенол 20, 4-(1-гид-роксиэтнл)карен-2 21, миртенол 22, которые проявляют ярко выраженную бактерицидную и фунги- 19 20 21 22

цндную активность.

Синтез монотерпеновых гликозидов проводили по. методу Кеннигса-Кнорра (схема б), используя в качестве катализатора карбонат серебра. По окончании реакции избыток монотерпеноидов удаляли отгонкой с водяным паром, затем синтезированные гликозиды выделяли хроматографией на колонке с енликагелем.

оас

¿4. £

оае

оас) оас

Вг

Схема 6. Синтез гликозидов монотерпеноидов Выходы полученных гликозидов варьируется от 35 до 57% (табл.4). Вероятно такой разброс объясняется наличием стерических затруднений в структуре монотерпеноидов. В частности, в структуре вербенола, для которого выход гликозида наибольший, гидроксильная группа оказывается более реакционнеспособной, так как находится в аллильном положении, а также она максимально удалена от С« мастиковой связи. Низкий выход гликозида борнеола объясняется тем, что гидроксильная группа в положении Сг экранируется мостиковой связью при С7> что создает дополнительные стери-ческие затруднения при проведении реакции гликозилирования. Выход гликозидов миртенола и 4-( 1 -гидроксиэтил)карена-2 меньше, чем цновебенола, несмотря на то, что гццроксильные группы находятся в более выгодном положении с точки зрения реакционной способности и доступности.

Таблица 4

Выходы терпсновы.у глишиддв_

Агликон (ЯОН) Выход, %

Борнеол (19) 35.4±0.5

Чис-Вербенол (20) 57.5±0.5

4-( 1 -гидрокс иэтил) каре н-2 (21) 42.2±0.5

Миртенол (22) 41.б±0.5

Методами спектроскопии ЯМР 'Н и ,3С установлено, что полученные гликозиды имеют рир-гликозидную связь, что подтверждается наличием в спектрах сигналов при 4.2-4.6 м.д. 8 Гц) и 99-101 м.д. соответственно. Полученные гликозиды монотерпеноидов в настоящее время испытываются на биологическую активность.

Гликозиды стероидов и тритерпенов

В связи с тем, что растворимость стероидов в физиологических жидкостях человека — крови, слюне, пищеварительном соке сравнительно невелика (8-10 мг/мл), представлялось целесообразным разработать методы и схемы синтеза полу синтетических гликозндов стероидов, более приемлемых как для перорального, так и инъекционного введения их в организм человека.

Гликознд р-ситостерика (24)

По литературным данным из надземной части растения Кгохеа были выделены вещества стероидной природы, в частности р-сигостерин 23 и даукостерин 24. Но в виду их низкого содержания в данном растении нами в качестве растительного материала была взята кора осины, которая кроме того, содержит салидрозид и некоторые другие терпеновые н фенольные соединения.

Для выделения соединения 23 проводили экстракцию осиновой коры этил ацетатом в аппарате Сокслетта. После упаривания растворителя экстракционную смесь наносили на колонку с сорбентом Диасорб 130С-16Т и элюи-ровали водными растворами этилового спирта различной концентрации (0-30 %). Фракции анализировали методом ВЭЖХ. В ЯМР !Н спектре р-ситостерина сигналы кольцевой системы стероида лежит в пределах 0.5-2,5 м.д., четко видны сигналы протонов при Сз атоме, связанном с гидрокс ильной группой (3.5 м.д. (1Н, м)) и С«, находящемся при двойной связи в цикле (5.3 мл. (1Н, т», протон при гндрохсильной группе дает уширенный синглет при 3.0 м.д.

Синтез гликозида р-ситостерина проводили, используя в качестве гли-козилирующего агента меркаптопроиз водное глюкозы — 2,3,4,6-тетра-О-

ацел1л-р-метап-1 -тио-О-глюкопиранозид 25, в качестве катализатора выступал кристаллический йод (схема 7). Выход целевого продукта 24 составил

30-35 %.

Схема 7. Синтез глмкозида р-ситоетернна

Спектр ЯМР "С позволил нам сделать вывод, что агликон связан а-Г>-гликозидной связью с глюкозой (86.3 м.д.). Таким образом, наше соединение имеет структуру гликоэида даукостернна 24.

Гликозид а-экдизона (27)

Еще одним из интересных объектов исследований в последнее время является а-экдизон, 20-гидроксиэкдизон и инокостерон. Основными источниками для получения экдистероидов стали растения родов ИЪаропИсит и БНепе.

Экстракцию фитоэкди стероидов проводили 40%-ным этиловым спиртом из измельченного растительного сырья БеггаЫа согопша Ь. (серпуха венценосная), после чего экстракт обрабатывали раствором сульфата цинка и сумму стероидов разделяли на колонке, заполненной сорбентом Диасорб 130-С16Т. После разделения суммарного экстракта были получены а-экдизон 16,20-гндроксиэкдизон и ннокостерон.

Полученный а-экдизон гликозил провал и двукратным избытком глико- -зилирующего агента 2,3,4,6-тетра-О-ацети л-(^-мети л-1 -тио-О-глюкопи рано-зид 25, в качестве катализатора реакции использовали кристаллический йод (схема 8), выход продукта составил 30-35%. ЯМР |ЭС спектр указывает на то, что гликозипирование эвдистероида проходит по двум положениям: происходит смещение сигналов, соответствующих С) и Сц атомам в область слабого поля (80.8 м.д. и 90.1 мл. соответственно), с образованием (Ю-гликозидной связи (С]' 100.5 мд. и С]-101.4 м.д.).

Таким образом можно утверждать, что полученный препарат а-экдизо-на является бигликозидом 27, а наиболее реакционноспособные гидрокснль-ные группы находятся в положениях Сз и Сл- По литературным данным, из

15

растений родов Ме/апс/пит, ЛИшт были выделены гликозиды стероидной природы, причем углеводные фрагменты находились по положениям С3, Си и Саз. он

Исследования физиологической активности синтетического розина

В связи с тем, что природные аналоги синтезированных препаратов проявляют высокую биологическую активность, представлялось целесообразным провести тестирование на активность синтетических аналогов. В качестве образца был взят гликозид родиолы розовой — розин. Испытания на биологическую эффективность проводились в Институте Биологии КНЦ УрО РАН в лаборатории генетики. Хоз. договор № 56-2004 «Исследование биологической активности синтетического рознна на лабораторных животных».

Тест на лабораторных мышах

Испытание физиологической активности розина проведено на лабораторных мышах линии СВА (100 мг/кг) и С57В1. Физическую работоспособность и влияние на нее розина оценивали по выносливости к динамической и статической нагрузке. Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе, Розин в концентрации 100 мг/кг (мыши линии СВА); 5, 0.5 и 0.05 мг/кг (мыши линии С57В1) вводили внутрибрюшинно. В качестве контроля использовали физиологический раствор (0.9%-ный раствор ЫаС1).

В результате исследования физиологической активности розина было установлено, что только минимальная из исследованных концентраций оказывает положительное воздействие на увеличение выносливости к динамическим нагрузкам — продолжительность плавания увеличилась более чем на 40%. При - этой дозе также наблюдается увеличение массы семенников. Высокие дозы (5 и 100 мг/кг) наоборот приводили к резкому снижению устойчивости к статической и особенно к динамической нагрузкам — продолжительность плавания снизилась в 10 раз. Следует обратить особое внимание, что только при максимальной концентрации обнаружено увеличение частоты хромосомных аберраций. Установлено, что низкие концентрации розина могут увеличивать устойчивость к физическим нагрузкам, т.е. обладают адаптогениыми свойствами.

Учитывая тот факт, что некоторые концентрации розина приводили к увеличению уровня генетической изменчивости были проведены испытания препарата на дрозофиле. Данный объект позволяет, используя стандартные методы, оценить биологическую эффективность. Тесты на дрозофиле (линии Drosophila meîanogasten Canton-S, mei-A 1, mus 209,4015, 4018) показали, что воздействие розина на ранние стадии развития, независимо от генотипа, приводит к достоверно значимому увеличению медианной продолжительности жизни (на 23%) у самцов.

Выводы

1. С помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных растворителей из экстракта корней с корневищами растения Rhodiola rosea L. выделены в нативном виде гликознды — розавин и салидрозид. Разработаны методы анализа, позволяющие оценить качество растительного сырья Rhodiola rosea L„ в частности показано, что к третьему году вегетации интродуцированное сырье накапливает гликозиды в количествах, удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации. Растения, произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают глнкозидов в среднем на 23% больше, чем культурные растения.

2. Синтезированы гликознды Rhodiola rosea L. — салидрозид и розин. Из разработанных и апробированных двух схем синтеза розавина наиболее эффективной является получение гликозида построением углеводного фрагмента и присоединением его к агликону. Синтезированные гликозиды являются альтернативой природным соединениям как в качестве биологически активных веществ, так и в качестве эталонных соединений.

3. Выполнен ряд. синтезов гликозидов монотерпеноидов по методу Кеннигса-Кнорра. Найдено, что практический выход гликозидов в ряду монотерпеноидов может достигать 50%.

4. Впервые синтезированы гликозиды э иди стероидов. Показано, что реакционная способность гидроксильных групп различна, гликозилирование проходит в положения Cj и С22-

5. Проведены испытания синтетического препарата розина на биологическую активность. Исследования на мышах (линии СВА и C57BI) показали: высокие концентрации розина (100 и 5 мг/кг) снижают выносливость к статической и, особенно, к динамической нагрузке. Минимальная из тестируемых концентраций розина (0,05 мг/кг), привела к увеличению выносливости к динамической нагрузке. Исследование генотоксической эффективности розина не выявило достоверно значимых изменений в половых и соматических клетках. Обнаружено увеличение уровня микроядер только при максимальной дозе розина. Тесты на дрозофиле (линии Drosophila melanogaster:Canton-S, mei-41, mus 209, 4015, 4018) показали что воздействие розина на ранние стадии развития, независимо от генотипа, приводит к достоверно значимому увеличению медианной продолжительности жизни (на 23%) у самцов.

Публикации

1. Патов СЛ., Захожий ИТ., Пунегов В.В., Кучин A.B., Кодесс М.И. Выделение гликозидов Rhodioia rosea L. с помощью обращен нофазовой хроматографии и встречный синтез сапидрозида 11 Бутлеровские сообщения, 2002. №7. С. 85-87.

2. Туманова Е.А., Патов С.А., Пунегов В.В., Кучин A.B., Фролова JIЛ„ Кодесс М.И. Гликозилирование монотерпеноидов, входящих в состав эфирных масел растений, методом Кеннигса-Кнорра // Бутлеровские сообщения. 2002. №7. С. 89-91.

3. Патов С.А., Пунегов В.В.., Кучин A.B., Фролова ЛЛ.. Синтез гликозидов некоторых монотерпеноидов il Химия природных соединений. 2006, №4. С. 431-433.

4. Патов С.А., Пунегов В.В,., Кучин A.B. Синтез розавина - гликозида Rhodioia rosea Н Химия природных соединений. 2006, №4. С. 397-399.

5. Патов С.А., Пунегов В.В., Кучин A.B. Выделение гликозидов Rhodioia rosea L. с помощью обращеннофазовой хроматографии и встречный синтез салидрозида И II Всероссийская конференция; "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. — Казань, 2002. — С. 3-4.

6. Туманова Е.А., Патов С.А. Гликозилирование моноггерпеноидов, входящих в состав эфирных масел растений, методом Кеннигса-Кнорра // II Всероссийская конференция: ""Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. —Казань, 2002.— С.5.

7. Патов С.А., Пунегов В.В., Сычев PJL, Кучин A.B., Кодесс М.И. Синтез гликозидов бетулнна и экдистероидов // II Всероссийская конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. - Казань, 2002.-С.35.

8. Захожий ИТ., Пунегов В.В., Патов С.А. Об эффективности твердофазной экстракции При подготовке проб препаратов Rhodiola rosea L. для ВЭЖХ анализа гликозидов. //1 Всероссийская конференция: "Аналитические приборы": Тез. докл.-СПб, 2002.-С. 177.

9. Патов С.А., Кучин A.B. Синтез розавина — гликозида родиолы розовой Rhodiola rosea L. // III Всероссийская конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. — Саратов, 2004. — С. 69.

10. Пунегов В.В., Патов С.А., Сычев P.J1., Туманова Е.А. Электрохимическая трансформация а-пинена в нестационарном поле импульсного тока как способ получения кислородсодержащих мопотерпеноидов // III Всероссийская конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл.-Саратов, 2004.-С. 109-110.

11. Патов С.А., Пунегов В.В., Кучин A.B. Гликозцды Rhodiola rosea L. выделение, анализ состава, встречный синтез // Всероссийская конференция: "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья": Тез. докл. - Барнаул, 2005. - С.246.

12. Патов С.Л., Пунегов В.В., Кучин A.B. Выделение и синтез гликозидов Rhodiola rosea L. И IV Всероссийская научная конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. — Сыктывкар, 2006. — С. 152.

13. Пэтов CIA., Зайнуллин В.Г., Пунегов В JB., Кучин A.B. Исследование биологической активности синтетического розина // IV Всероссийская научная конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. -Сыктывкар, 2006. -С. 153.

14. Патов С.А., Туманова Е.А., Пунегов В.В., Фролова Л.Л., Кучин A.B. Синтез гликозидов некоторых монотерпеноидов // IV Всероссийская научная конференция: "Химия и технология растительных веществ": Тез. докл. — Сыктывкар, 2006. -С. 154.

Лицензия № 0047 от 10.01.1999 Заказ Л» 53_Тираж 100 экз.

Издательство Коми научного центра УрО РАН 167982, ГСП, г. Сыктывкар, ул. Первомайская, 4$.

Введение.

Глава I. Литературный обзор

Выделение и синтез гликозидов различной природы.

1.1. Фенилпропаноиды.

1.2. Гликозиды родиолы розовой (Rhodiola rosea L.).

1.3. Терпеноиды растений. Классификация, распространенность в природе, биологическая активность.

1.4. Экдистероиды.

1.5. Методы синтеза О-гликозидов.

1.5.1. Синтез олигосахаридов.

1.5.2. Наращивание олигосахаридной цепи.

Родиола розовая (.Rhodiola rosea L.) с давних пор применяется в народной и традиционной медицине как стимулирующее, общеукрепляющее, тонизирующее средство. В настоящее время возник особый интерес к лекарственным средствам растительного происхождения, обладающим адаптогенным эффектом. Родиола розовая в этом смысле обладает уникальными свойствами. Основными действующими веществами этого растения являются фенилпропаноиды - гликозиды коричного спирта (розин, розавин, розарин) и салидрозид. В связи с тем, что растительное сырьё R. rosea L. в различных климатических условиях имеет различное содержание мажорных компонентов, встает проблема установления его качества, что повлекло за собой поиск методов получения стандартных веществ из растительного сырья, либо путей их синтеза.

Кроме того, известны соединения терпеновой природы, проявляющие эффекты, сходные с фенилпропаноидами родиолы розовой. Однако их использование в качестве лекарственных средств затруднено - частично из-за плохой растворимости в воде и физиологических жидкостях. Для повышения их растворимости и улучшения проницаемости в клетку терпеноиды переводят в гликозидную форму.

Механизмы синтеза гликозидов в большинстве случаев известны, их разнообразие заключается в использовании различных катализаторов. Однако в большинстве случаев высокая стереоспецифичность реакций гликозилирования достигается редко, практически всегда получается смесь изомеров.

Целью настоящей работы являлось выделение и синтез физиологически активных О-гликозидов фенилпропаноидов (на примере гликозидов R. rosea L.), О-гликозидов терпеноидной и стероидной природы.

Для разрешения данной проблемы поставлены следующие задачи:

1. получение стандартных веществ (розавина и салидрозида) из экстрактов корней с корневищами R rosea L. и калибровка аналитической аппаратуры по полученным стандартным веществам;

2. разработка методик стереоспецифичного синтеза гликозидов R rosea L.\ исследование синтетических аналогов гликозидов родиолы розовой на физиологическую активность;

3. синтез гликозидов монотерпеноидов, тритерпеноидов и экди-стероидов; исследование их строения и реакционной способности в реакциях гликозилирования.

- V* •

Науная новизна: синтезированы гликозиды R. rosea - салидрозид (2-[4-оксифенил]-этанол-1 -(З-О-глюкопиранозид), розин (трянс-циннамил-О-13-D-глюкопиранозид), розавин (траис-циннамил-0-[6'-0-а-Ь-арабинопиранозил-P-D-глюкопиранозид]).

Синтезированы некоторые гликозиды монотерпеноидов методом Кеннигса-Кнорра (борнеола, вербенола, 4-(1-гидроксиэтил)карен-2, миртенола).

Как показали эксперименты по синтезу стероидных гликозидов, наибольшую химическую активность проявляют гидроксильные группы при С3 и С22 положениях.

Впервые установлено, что синтетический розин при внутрибрюшинном введении лабораторным животным в концентрации 0.05 мг/кг проявляет адаптогенные свойства.

Впервые установлено, что синтетический Розин способен увеличивать продолжительность жизни биологической модели - Drosophila melanogaster, при введении в рацион в малых дозах (0.05 мг/кг).

Практическая значимость: отработаны экстрактивные и синтетические методы получения нативных гликозидов R. rosea, что позволит расширить перечень Государственных стандартных образцов химически чистых веществ. Синтетические гликозиды могут применяться для обогащения экстрактов R. rosea с целью увеличения их биологической ценности.

Основные гликозиды R. rosea - салидрозид и розавин, впервые выделены с помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных реагентов, что более приемлемо при получении лекарственных средств из растительного сырья.

Разработаны методы анализа и с их помощью установлено, что при интродукции R. rosea на Европейсом Северо-Востоке, накапливает гликозиды (салидрозид и розавин) в количествах (более 1% от а.с.с.), удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации, к третьему году вегетации. Растения произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов на 23% больше, чем в культурных растениях.

4. ВЫВОДЫ

1. С помощью обращеннофазовой хроматографии низкого давления без применения токсичных растворителей из экстракта корней с корневищами растения Rhodiola rosea L. выделены в нативном виде гликозиды - розавин и салидрозид. Разработаны методы анализа, позволяющие оценить качество растительного сырья Rhodiola rosea L., в частности показано, что к третьему году вегетации интродуцированное сырье накапливает гликозиды в количествах, удовлетворяющих требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации. Растения, произрастающие в горных районах Северного Урала, накапливают гликозидов в среднем на 20-25% больше, чем культурные растения.

2. Синтезированы гликозиды Rhodiola rosea L. - салидрозид и розин. Из разработанных и апробированных двух схем синтеза розавина наиболее эффективной является получение гликозида построением углеводного фрагмента и присоединением его к агликону. Синтезированные гликозиды являются альтернативой природным соединениям как в качестве биологически активных веществ, так и в качестве эталонных соединений.

3. Выполнен ряд синтезов гликозидов монотерпеноидов по методу Кеннигса-Кнорра. Найдено, что практический выход гликозидов в ряду монотерпеноидов может достигать 50%.

4. Впервые синтезированы гликозиды экдистероидов. Показано, что реакционная способность гидроксильных групп различна, гликозилирование проходит в положения С3 и С22

5. Проведены испытания синтетического препарата розина на биологическую активность. Исследования на мышах (линии СВА и С57В1) показали: высокие концентрации розина (100 и 5 мг/кг) снижают выносливость к статической и, особенно, к динамической нагрузке. Минимальная из тестируемых концентраций розина (0,05 мг/кг), привела к увеличению выносливости к динамической нагрузке. Исследование генотоксической эффективности розина не выявило достоверно значимых изменений в половых и соматических клетках. Обнаружено увеличение уровня микроядер только при максимальной дозе розина. Тесты на дрозофиле (линии Drosophila т elan о gas ter: Can to n-S, mei-41, mus 209, 4015, 4018) показали что воздействие розина на ранние стадии развития, независимо от генотипа, приводит к достоверно значимому увеличению медианной продолжительности жизни (на 23%) у самцов.

1.6. Заключение

К настоящему времени накоплен большой опыт по выделению и идентификации гликозидов R. rosea L. Разработаны способы стандартизации сырья родиолы розовой по содержанию розавина и салидрозида. Хорошо изучена биологическая активность суммы гликозидов и описано их применение в медицине./Методики разделения гликозидов R. rosea L. w проводятся с использованием токсичных растворителей (метанол, хлороформ). Отсутствуют сведения по получению синтетических гликозидов и их активности. В связи с этим, становится актуальной проблема получения г"" гликозидов родиолы розовой в чистом виде с использованием нетоксичных реагентов.

Кроме того, следует отметить необходимость разработки эффективных способов синтеза гликозидов терпеноидов и экдистероидов для получения растворимых производных, способных эффективно попадать в межклеточное пространство и в клетку.

Глава II. Обсуждение результатов

2.1. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L.

Целью данной части работы являлось получение гликозидов из растения R. rosea L., выделение препаративно чистых веществ (розавина (7) и салидрозида (31)) для калибровки аналитической аппаратуры по двум веществам, и последующей оценки качества сырья родиолы розовой, произрастающей на территории Европейского Северо-востока, а также частичный встречный синтез салидрозида и гликозидов коричного спирта. Кроме того, испытание синтетических аналогов гликозидов на биологическую активность.

При извлечении гликозидов из растительного сырья, одной из ключевых проблем является автоферментация материала при сушке и хранении, что сопровождается гидролизом гликозидов до агликонов и углеводных компонент. Сушкой сырья при температуре 40°С преимущественно сохраняется салидрозид (31). При температуре сушки 70°С, в сырье остаются циннамилгликозиды, розавин (7) и розарин (8) [55]. Таким образом, данный метод сушки сырья родиолы розовой не позволяет сохранить все находящиеся в растении гликозиды.

Для сравнения методов высушивания сырья родиолы розовой были отобраны корни с корневищами 4-го года жизни. Сушку сырья проводили при комнатной температуре (20°С), при 40°С и 70°С. Как видно из таблицы 1 при высушивании корней с корневищами при комнатной температуре из сырья теряется примерно 25% гликозидов. Использование температуры 40°С он 7

ОН

31 позволяет сохранять салидрозид той же концентрации, что и в исходном сырье; уменьшается лишь количество гликозидов коричного спирта. Данный факт можно объяснить действием фермента вицианозидазы, которая вызывает разрушение гликозидов (7) и (8) при температуре 40-50°С [39, 55].

1. Куркин, В А. Фенилпропаноиды - перспективные природные биологически активные соединения / В.А. Куркин, Сам. ГМУ. - Самара, 1996. - 80 с.

2. Aoshima, Н. Phenilpropanoid glycosides from Veronica persicci. H. Aoshima, T. Miyase, A. Ueno // Phytochemistry, 1994. Vol.37, №2. - P. 547-550.

3. Aoshima H. Phenilpropanoid glycosides from Veronica undulate / H. Aoshima, T. Miyase, A. Ueno // Phytochemistry, 1994. Vol.37, №6. - P. 1557-1558.

4. Galis I. Iridoid and Phenilpropanoid glycosides from Stachys macrantha /1. Galis, A.A. Basaran, I. Saracoglu, 0. Sticher // Phytochemistry, 1992. Vol.31, №1. -P. 167-169.

5. Galis I. Two phenilpropanoid glycosides from Leonurus glaucescens / I. Galis, T. Ersoz, D. Tasdemiz, P. Ruedi // Phytochemistry, 1992. Vol.31, №1. -P. 357-359.

6. Yoshizawa F. The constituents of Cistanche tubelosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolation and structures of new phenilethanoid glycoside and a neolignan glycoside / F. Yoshizawa, T. Deyama, N. Takizawa // Chem. Pharm. Bull., 1990. Vol.38, №7.-P. 1927-1930.

7. Molgaard P. HPLC method validated for the simultaneous analysis of cichoric acid and alkamides in Echinacea purpurea plants and products / P. Molgaard, S. Johnsen, P. Christensen, C. Cornett // J. Agric. Food. Chem., 2003. Nov. 19, 51(24).-P. 22-33.

8. Федосеева JIM. Анализ арбутина подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia crassifola (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае / JIM. Федосеева // Химия раст. сырья, 2003. №1. -С. 73-77.

9. Бубенчиков Р.А. Фенольные соединения и полисахариды фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Вестник ВГУ. Сер.: Химия, Биология, Фармация, 2004. -№1. С. 156-159.

10. Vrchotova N. Extrakce a analyza fenolickych latek z trapatky nachove / N. Vrchotova, S. Kuzel, J. Triska, L. Kolar, J. Totoushek // Chem. Listy, 2002. -Vol. 96.-P. 636-639.

11. Diaz P.P. New C6-C3 fnd C6-C. compounds from Piper lenticellosus / P.P. Diaz.

12. B.C. Ramos, G.E. Matta//J. Nat. Prod., 1986. -Vol.49, №4. -P. 689-691.

13. Kabayashi H. New phenilpropanoid glycosides from Cistanche tubelosci (Schrenk.) Hook. f. I / H. Kabayashi, H. Oguchi, N. Takizawa // Chem. Pharm. Bull., 1987. -Vol.35, №8. P. 3309-3314.

14. Запесочная Г.Г. Гликозиды коричного спирта из корневищ Rhodiola rosea / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин // Химия природ, соединений, 1982. №6.1. C. 723-727.

15. А.с. 11622813 СССР, МКИ3 С07Н 15/08; А61К 31/70. Способ получения (3,7-диметил-окта~2,6-диен-1,4-диол)-1 -O-p-D-глюкопиранозида / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, А.Н. Щавлинский (СССР) №3666518/23-04; заявл. 28.11.83; опубл. 23.06.85, Бюл. №23. 20 с.

16. Куркин В.А. Фармакогностическое исследование лекарственных растений рода родиола, элеутерококк, сирень, ива, содержащих фенилпропаноиды / В.А. Куркин // Современные аспекты изучения лекарственных растений: Научные труды.-М, 1995.-С. 81-86.

17. Дар дымов И.В. Женьшень, элеутерококк (к механизму биологического действия) / И.В. Дардымов. М.: Наука, 1976. - 184 с.

18. Краснов Е.А. Растения семейства толстянковых / Е.А. Краснов, А.С. Саратиков, Ю.П. Суров. Томск: Изд-во Томского университета, 1979. -208 с.

19. Куркин В.А. Химический состав и фармакологические свойства растений рода родиола (обзор) / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная // Хим.-фарм. журнал, 1986. -Т.20, №10. С. 1231-1244.

20. Оводов Ю.С. Гликозиды Eleutherococcus senticosus. II. Строение элеутерози-дов А, В, С и Д / Ю.С. Оводов, Г.М. Фролова, М.Ю. Нефедова, Г.Б. Еляков // Химия природ, соедин., 1967. -№1. С. 63-64.

21. Саратиков А.С. Родиола розовая ценное лекарственное растение: золотой корень / А.С. Саратиков, Е.А. Краснов: - 3-е изд., испр. доп. - Томск, 1987. -254 с.

22. Запесочная Г.Г. Фенилпропаноиды перспективные биологически активные вещества лекарственных растений / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, В.П. Бойко, В.К. Колхир // Хим. фарм. журнал, 1995. - Т.29, №4. - С. 47-50.

23. Ikeya Y. Antihepatotoxic actions of flavonolignans from Silybum marianum fruits / Y. Ikeya, N. Ookawa, H. Wagner // Planta Medica, 1984. Vol.50, №3. -P. 248-250.

24. Badawi М.М. Antileucemic and citotoxic constituents of Dirca occidentalis (Thymelaeceae) / M.M. Badawi, S.S. Handa, A.D. Kinghorn // J. Pharmaceutical Sciences, 1983.-Vol.72, №11.-P. 1285-1287.

25. Красная книга СССР: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных и растений / М.: Лесная пром-сть, 1984. Т.2. - 480 с.

26. Гаврилов Г.С. Новые лечебнопрофилактические препараты Родиолы розовой / Г.С. Гаврилов, А.А. Щеголев, Л.П. Ларионов // Хим. фарм. журнал, 2003. -Т.37, №12. С. 18-20.

27. Барнаулов О.Д. Сравнительная оценка биологической активности соединений, выделенных из видов Rhodiola L. / О.Д. Барнаулов, А.Ю. Лимаренко, В.А. Куркин // Хим. фарм. журнал, 1995. С. 229-230.

28. Куркин В.А. Анализ состава корневищ Rhodiola rosea L. / В.А. Куркин, Л.Г. Бондаренко // Хим. фарм. журнал, 1995. №4. - С. 47-50.

29. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ / И.М. Коренман. М.: Химия. - 1977. - 200 с.

30. Солдатиков А.Т. Основы органической химии лекарственных веществ /

31. A.Т. Солдатиков, Н.М. Колядина, И.В. Шендрик. 2-е изд., испр., доп. - М.: Мир, 2003.- 192 с.

32. Дубичев А.А. Изучение химического состава корневищ Rhodiola rosea методом ВЭЖХ / А.А. Дубичев, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.Д. Воронцов //Химия природ, соедин., 1991.-№2. -С. 188-193.

33. Кирьянова А.А. Определение биологически активных компонентов корневищ Rhodiola rosea / А.А. Кирьянова, JI.T. Бондаренко, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, А.А. Дубичев, Е.Д. Воронцов // Химия природ, соедин., 1991. -№3- С. 320-323.

34. Запесочная Г.Г. Флавоноиды надземной части Rhodiola rosea / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, А.Н. Щавлинский // Химия природ, соедин., 1985. -№4. С. 496-507.

35. А.с. 1168254 СССР, МКИ3 С07Н 15/08; А61К 31/70. Способ получения розавина / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, А.Н. Щавлинский, В.М. Ивашин, С.Я. Соколов, А.И. Шретер (СССР) № 3648994/28-13; заявл. 04.10.83; опубл. 23.07.1985, Бюл. №27.-4 с.

36. Базыкина Н.И. Оптимизация условий экстрагирования антиоксидантов из растительного сырья / Н.И. Базыкина, А.Н. Николаевский, Т.А. Филлипенко,

37. B.Г. Калоерова // Хим. Фарм. журнал, Т.36, №2. 2002. - С. 46-49.

38. Коренман Я.И. Экстракция фенолов / Я.И. Коренман. Горький: Волго-Вят. Изд-во,- 1973.- 150 с.

39. Быков В.А. Родиола розовая (Rodiola rosea L.)\ традиционные и биотехнологические аспекты получения лекарственных средств / В.А. Быков, Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин // Хим. Фарм. журнал, 1999. №1, Т.ЗЗ.1. C. 28-39.

40. Ganzera М. Analysis of the marker compounds of Rhodiola rosea L. (golden root) by reversed phase high performance liquid cromatography / Marcus Ganzera, Yurdanur Yayla, Ikhlas A. Khan // Chem. Pharm. Bull., 2001. V.49, №4. -C. 465-467.

41. Куркин B.A. Терпеноиды Rhodiola rosea / B.A. Куркин, Г.Г. Запесочная, A.H. Щавлинский II Химия природ, соедин., 1985. №5. - С. 632-636.

42. Куркин B.A. Терпеноиды корневищ Rhodiola lineariforlia / B.A. Куркин, Г.Г. Запесочная // Химия природ, соедин., 1986. №5. - С. 643-644.

43. Пангарова Т.Т. Строение алгинозида, у-лактона Rhodiola algida / Т.Т. Пангарова, Г.Г. Запесочная, В.А. Чертков // Химия природ, соедин., 1975.-№3.-С. 334-339.

44. Запесочная Г.Г. Флавоноиды корневищ Rhodiola rosea. II. Флавонолигнан и гликозиды гербацетина / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин // Химия природ, соедин., 1983.-№1,-С. 23-32.

45. Государственная фармакопея СССР / 11-е изд. М.: Медицина, 1989. -С. 364-366.

46. Запесочная Г.Г. Совершенствование методов стандартизации сырья родиолы розовой / Г.Г. Запесочная, В.А. Куркин, В.А. Кирьянов, JI.T. Бондаренко // Химическая и медико-биологическая оценка новых фитопрепаратов: Сб. научн. тр.-М., 1989.-С. 3-7.

47. Ишмуратова М.М. О фармакологических и экологических свойствах видов рода Rhodiola, определяемых их химическим составом / М.М. Ишмуратова // Вестник Башкирского университета. Уфа, 2001. - №2 (II). - С. 74-76.

48. Соболевская К.А. К изучению флоры Алтая как источника флавоновых веществ / К.А. Соболевская, В.Г. Минаева // Известия СО АН СССР. -Новосибирск, 1961.-№4.-С. 68-72.

49. Ишмуратова М.М. Биологические и химические особенности, культура тканей Rhodiola rosea L. и Rhodiola iremelica Boriss. и возможность их интродукции в Башкиртостан (на примере г. Уфы) / М.М. Ишмуратова. Автореф. канд. дис.-Уфа, 1996.-22 с.

50. Фролов Ю.М. Родиола розовая на европейском северовостоке / Ю.М. Фролов, И.И. Полетаева. Екатеринбург, 1998. - С. 172-176.

51. Нухимовский E.JI. Основные особенности выращивания родиолы розовой / E.JL Нухимовский, Г.И. Климахин // Лекарственное растениеводство, 1982. -№4. С. 40-47.

52. Штер Г.Е. Термический анализ корневищ родиолы розовой / Г.Е. Штер, В.А. Куркин, А.С. Космынин, Е.В. Авдеева // Журнал Фармация, 1992. №1. -С. 67-70.

53. Куркин В.А. Фенилпропаноиды калусной культуры Rhodiola rosea / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, А.Г. Дубичев // Химия природ, соедин., 1991. -№4.-С. 481-490.

54. Терпеноиды / П. Де Майо. М. - 1977. - 300 с.

55. Бугорский П.С. Свободные и глюкозидносвязанные монотерпеновые спирты в лепестках Rosa gallica / П.С. Бугорский, В.Н. Мельников // Химия природ, соедин., 1997,-№6.-С. 864-865.

56. Ivanka N. Kostova. A monoterpene glucoside from Paeona peregrine root / Ivanka N. Kostova, Mario F. Simeonov, Daniela I. Todorova // Phytochemistry, 1998. -Vol.47, №7.-P. 1303-1307.

57. Ivanka N. ICostova. Two acylated monoterpene glucosides from Paeonia peregina / Ivanka N. ICostova, Mario F. Simeonov, Daniela I. Todorova, Petja L. Petkova // Phytochemistry, 1998. Vol.48, №3. - P. 511-514.

58. Hagn-Ching Lin. Monoterpene glycosides from Paeonia suffruticosa / Hagn-Ching Lin, Hsiou-Yu Ding Wu, Pei-Lin Wu // Phytochemistry, 1996. Vol.41, №1. -P.237-242.

59. Анисимов M.M. Свободные и гликознлнрованные тритерпеноиды как модификаторы структурно-функциональных свойствбиологических и модельных мембран / М.М. Анисимов // Успехи в изучении природных соединений: сб. науч. тр. Владивосток, 1999. - 200 с.

60. Чирва В.Я. Тритерпеновые гликозиды видов семейства Araliaceae / В.Я. Чирва //Растительные ресурсы, 1990.-Т.26, №1.-С. 15-17.

61. Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды Hedera taurica / В.И. Гришковец, А.А. Лолойко, А.С. Шашков, В.Я. Чирва // Химия природ, соедин., 1990. -№6.-С. 779-783.

62. Исаев М.И. Тритерпеновые гликозиды Astragalus и их генины / М.И. Исаев, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1990. №6. - С. 783-787.

63. Ралдугин В.А. Тритерпеноиды растений рода Abies Hill. / В.А. Ралдугин, С .А. Шевцов // Химия природ, соедин., 1990. №4. - С. 443-455.

64. Тимбекова А.Э. Тритерпеновые гликозиды люцерны / А.Э. Тимбекова, A.JI. Верещагин, А.А. Семенов, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1990. -№2.-С. 221-227.

65. Архем А.А. Экдизоны стероидные гормоны насекомых / А.А. Архем, И.С. Левина, Ю.А. Титов. - Минск: Наука и техника, 1973. - 232 с.

66. H. Nildno. Isocyasteron, an insect metamorfosing substans from Cyathula capitata / H. Nildno, K. Nomoto, T. Takemoto // Phytochemistry, 1971. V.10. -P. 3173-3178.

67. Nakanishi K. Quantitative determination of phytoecdisones as illustrated by application to species of Helleborus / K. Nakanishi, M. Roreeda, S. Sasaki // J. Cromatogr., 1977. V. 131. - P. 468-470.

68. Lafont K. Phytoecdisteroids: structures and occurense / Lafont K., Horn D.H.S. // Ecdysone from chemistry to mode action. Ed. by J.A. Koolman. Georg Thieme, Stuttgart, 1989.-P. 39-41.

69. Саатов 3. Фитоэкдистероиды растения Dianthus hoeltzeri / 3. Саатов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров // Химия прир. соедин., 1990. №6. - С. 837.

70. Абубакиров Н.К. Экдистероиды цветковых растений / Н.К. Абубакиров // Химия прир. соедин., 1981. №6. - С. 685-702.

71. Nikino Н. Isocyasteron, an insect metamorfosing substans from Cyathula capitata I H. Nikino, 1С. Nomoto, T. Takemoto // Phytochemistry, 1971. V.10. -P. 3173-3178.

72. Якубова M.P. Спектрофотометричекий метод определения экдистерона в растительном сырье / М.Р. Якубова, Г.Л. Генкина, Т.Т. Шакиров, Н.К. Абубакиров // Химия природ.соединен., 1978. №6. - С. 737-740.

73. Ахрем А.А. Экдистероиды: химия и биологическая активность / А.А. Ахрем, Н.В. Ковганко. Минск: Наука и техника, 1989.-327с.

74. Туханова А.В. Исследование взаимодействия С27-стеринов с мембранами эритроцитов / А.В. Туханова, А.В. Коцюрубова // Укр. биохим. журн., 1996. -Вып.68,№6.-С. 61-67.

75. Муравьева Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева. М.: Медицина, 1978. -656 с.

76. Маматханов А.У. Выделение экдистерона из корней Rhaponticum carthamoides / А.У. Маматханов, М.-Р.И. Шамсутдинов, Т.Т. Шакиров // Химия природ, соедин., 1980,-№6.-С. 23.

77. Якубова М.Р. Контроль производства экдистерона / М.Р. Якубова, А.У. Маматханов, М.-Р.И. Шамсутдинов, Т.Т. Шакитов // Химия природ, соедин., 1983.-№3.-С. 45-48.

78. Кравец С.Д. Стероиды ряда спиростана и фуростана растений рода Allium / С.Д. Кравец, Ю.С. Воллернер, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1990. №4. - С. 429-443.

79. Саатов 3. Фитоэкдистероиды растений рода Melandrium / 3. Саатов, Р.У. Умарова, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1990. -№4.-С. 480-483.

80. Зибарева JI.H. Распространение экдистероидов в роде Silene L. и динамика их содержания / Л.Н. Зибарева // Раст. ресурсы, 1999. Вып.1. - С. 79-87.

81. Зибарева Л.Н. Новые экдистероидоносные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона / Л.Н. Зибарева, В.И. Еремина, Н.А. Иванова // Раст. ресурсы, 1997. Вып.З. - С. 73-76.

82. Кича А.А. Минорные полисахариды из морской звезды Crossaster papposus / А.А, Кича, А.И. Калиновский, В.А. Стоник // Химия природ, соедин., 1990. -№2.-С. 218-221.

83. Бочков А.Ф. Образование и расщепление гликозидных связей / А.Ф. Бочков, С.А. Афанасьев, В.В. Заиков. -М.: Наука, 1978. С. 24-41.

84. Методы химии углеводов / Под ред. Чл.-корр. Н.К. Кочеткова. М.: Мир, 1967.-300 с.

85. Титце Л. Препаративная органическая химия / Л. Титце, Т. Айхер. Пер. с нем. под. ред. Ю.Е. Алексеева. -М.: Мир, 1999. - С. 572-574.

86. Агрономов А.Е. Избранные главы органической химии / А.Е. Агрономов. -М.: Химия, 1990.-560 с.

87. Мартч Дж. Реакции, механизмы и структура / Дж. Мартч. Т.2. - М.: Мир, 1987.-504 с.

88. Кочетков Н.К. Химия углеводов / Н.К. Кочетков, А.Ф. Бочков, Б.А. Дмитриев, А.И. Усов, О.С. Чижов, В.Н. Шибаев. М.: Химия, 1976. - 672 с.

89. Практикум по химии углеводов / Под ред. член-корр. Ю.А. Жданова. М.: Высшая школа, 1973. - 300 с.

90. Пивоваренко В.Г. Синтез 7-0-(3-Б-глюкопиранозидов изофлавонов и их гетероциклических аналогов / В.Г. Пивоваренко, В.П. Хиля // Химия природ, соедин., 1993. №2. - С. 220-227.

91. Макаревич И.Ф. Новые полусинтетические сердечные гликозиды и их биологическая активность / И.Ф. Макаревич, И.С. Терно, Т.В. Слюсарская, С.Н. Петрова, Л.Я. Топчий, А.А. Шепель // Химия природ, соедин., 1990. -№6. С. 776-779.

92. Пальянц Н.Ш. Гликозилирование карденолидов 5-а-Ь-рамнозид и 3,5-бисгли-козиды строфантидина / Н.Ш. Пальянц, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1976. №6. - С. 765-772.

93. Одинокова Л.Э. Гликозилирование бетулина и его ацетатов в присутствии карбоната кадмия / Л.Э. Одинокова, Г.И. Ошиток, В.А. Денисенко, В.Ф. Ануфриев, A.M. Толкач, Н.И. Уварова//Химия природ, соедин., 1984. -№2. -С. 182-187.

94. Evans Philip G. The utility of glicoside copper chelates for effecting regioselective glicosidation / Philip G. Evans, Helen M. I. Osborn, William G. Suthers // Tetrahedron Lett., 2002. V.43, №44. - P. 7855-7857.

95. Осянин В.А. Синтез и гликозилирование 4-(1Н-азол-1-илметил)фенолов / В.А. Осянин, П.П. Пурыгин, З.П. Белоусова, П.Е. Красников // Химия и хим.технол.: Изв.вузов., 2003. Т.46, №1. - С. 138-141.

96. Китов П.И. Реакционная способность 1,2-О-цианоалкилдиеновых производных углеводов в тритил-цианоалкилдиеновой конденсации / П.И. Китов, Ю.Е. Цветков, JI.B. Бакиновский, Н.К. Кочетков // Известия АН: Серия химическая, 1993,-№8.-С. 1485-1489.

97. Китов П.И Реакционная способность тритиловых эфиров Сахаров в тритил-цианоалкилиденовой конденсации / П.И. Китов, Ю.Е. Цветков, Л.В. Бакиновский, Н.К. Кочетков // Известия АН: Серия химическая, 1993. №11. -С. 1992-1998.

98. Абросимов B.K. Биологически активные вещества в растворах: структура, термодинамика, реакционная способность / В.К. Абросимов, А.В. Агафонов, Р.В. Чумакова. М.: Наука, 2001. - 403 с.

99. ПО.Бухаров В.Г. Синтез гликозидов гипсогенина и гипсогениновой кислоты ортоэфирным методом / В.Г. Бухаров, С.П. Щербак // Химия природ, соедин., 1975.-№3,-С. 373-377.

100. Пальянц Н.Ш. Гликозилирование карденолидов / Н.Ш. Пальянц, А.Ф. Бочков, Н.К. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1976. №1. - С. 58-60.

101. Пальянц Н.Ш. Гликозилирование карденолидов. Фукозид периплогенина и дирамнозид строфантидола / Н.Ш. Пальянц, К.Н. Абубакиров // Химия природ, соедин., 1977.-№1.-С. 125-126.

102. ИЗ.Полоник С.Г. Синтез глюкозидов 2-окси-3-алкил-(алкенил)-1,4-нафтохинонов / С.Г. Полоник, A.M. Толкач, В.А. Денисенко, Н.И. Уварова // Химия природ, соедин., 1983.-№3.-С. 328-331.

103. Уварова Н.И. О некоторых особенностях гликозилирования полициклических спиртов 1,2-ортоэфирами углеводов / Н.И. Уварова, Г.И. Ошиток, A.M. Толкач, Г.Б. Еляков // Химия природ, соедин., 1977. -№1. С. 13-17.

104. Хираока М. Краун-соединения. Свойства и применения / М. Хираока. М.: Мир, 1986.-365 с.

105. Пб.Курьянов В.О. Использование иодида натрия и краун-эфира в синтезе гликозидов N-ацетилглюкозамина / В.О. Курьянов, А.Е. Земляков, Т.А. Чупахина, В .Я. Чирва // Биоорг. химия, 1998. Т.24, №4. - С. 319-320.

106. Флехтер О.Б. Прямой стереоселективный синтез тритерпеновых и стероидных 2-дезокси-а-гликозидов / О.Б. Флехтер, JI.A. Балтина, Г.А. Толстиков // Известия АН: Сер. химическая, 1997. №7. - С. 1390-1393.

107. Флехтер О.Б. Стереоселективный синтез тритерпеноидов и стероидных 3-0-2-дезокси-гликозидов на основе гликолей О.Б. Флехтер. Автореф. канд. дис. -Уфа, 1996.-25 с.

108. Толстиков А.Г. Гликали в энантиоспецифическом синтезе / А.Г. Толстиков, Г.А. Толстиков // Успехи химии, 1993. Т.62, №6. - С. 621-643.

109. David C. Direct Synthesis of р-Mannopyranosides by the Sulfoxide Method / Crich David, Sun Sanxing // J. Org. Chem., 1997. №62. - P. 1198-1199.

110. Suhr R. Sintesis of dihydrodiosgenin glycosides as mimietics of didesmosidic steroidal saponins / Rene Suhr, Martina Lahmann, Stefan Oscarson, Joachim Thiem // J. Org. Chem., 2003. №20. - P. 4003-4011.

111. Кочетков Н.К. Твердофазный синтез олигосахаридов и гликоконьюгатов Н.К. Кочетков // Успехи химии, 2000. Т.69, №9. - С. 869-896.

112. Seeberger P. Н. Solid phase oligosaccharide synthesis / P. H. Seeberger // J. Carbohydr. Chem., 2002. V.21, №7-9. - P. 613-643.

113. Miura T. Oligosaccharide synthesis on a fluorous support / Tsuyoshi Miura, ICohtaro Goto, Daisuke Hosaka, Toshiyuki Inazu // Angew. Chem. Int. Ed., 2003. -V.42, №18.-P. 2047-2051.

114. Lam Son N. Solution phase hexasaccharide synthesis using glucosyl iodides / Son N. Lam, Jacquelyn Geruay-Hague // Org. Lett., 2002. V.4, №12. - P. 2039-2042.

115. Ning J. A highly efficient synthesis of an octasaccharide, the repeating unit of the cell-wall mannan of Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum / Jun Ning, linsen Heng, Fanzuo Kong// Carbohydr. Res., 2002. V.337, №13. - P. 1159-1164.

116. Zeng Y. Synthesis of the p-glucan from the micro fungus Epicoccum nigrum Ehrenb. Ex Schlecht / Ying Zeng, Wenhui Zhang, Jun Ning, Fanzuo Kong // Carbohydr. Res., 2002. V.337, №24. - P. 2383-2391.

117. Wang H. A one-pot strategy for synthesis of 5-0-(a-D-arabinofuranosyl)-6-0-(p-D-galactofuranosyl)-D-galactofuranose present in motif E of the Micobacterium tuberculosis cell wall / Hairong Wang, Jun Ning // J.Org.Chem., 2003. V.68, №6.-P. 2521-2524.

118. А. С. 346876 СССР, МКИ3 С 07g 3/00. Способ получения сложных эфиров моносахаридов / Роланд Жак, Альберто Росси (СССР). № 1453457/23-4; заявл. 02.07.69; опубл. 28.07.72, Бюл. № 23. - 8 с.

119. Spangenberg P. a-Galactosyl fluoride in ice / Petra Spangenberg, Corinne Andre, Virginie Langlois, Michel Dion, Claude Rabiller // Carbohydr. Res., 2002. V.337, №3.-P. 221-228.

120. Ладыгина Е.Я. Химический анализ лекарственных растений / Е.Я. Ладыгина, Л.Н. Сафронич, В.Э. Отряшенкова. М.: Высш. школа, 1983. - 176 с.

121. Ernest J. Parry. The chemistry of essential oils and artificial perfumes / J. Parry Ernest. London, 1922. - 368 p.

122. Ткаченко К.Г. Эфирномасличные растения и эфирные масла. Некоторые аспекты использования для санации помещений и носителей инфекций / К.Г. Ткаченко, Н.В. Казаринова // Мед. Технологии, 1995. №1-2. - С.50.

123. Ivanic R. Comparative analysis of essential oils from several wild species of Salvia / R. Ivanic, K. Savin// PlantaMed., 1976. Vol.30. - P. 25-31.

124. Фролова JI.JI. Благотворное влияние Се111 на стереоселективность восстановления вербенона в г/ис-вербенол / Л.Л. Фролова, И.В. Древаль, М.В. Пантелеева, Е.У. Ипатова, И.Н. Алексеев, А.В. Кучин // Изв. АН., Сер. хим., 2003. -№2.- С. 475-478.

125. Рылова М.Л. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте / М.Л. Рылова. Л.: Медицина, 1964. - 228 с.

126. Hedlle J.A. A rapid in vivo test for chromosomal damage / J.A. Hedlle // Mutation Research, 1973.-V. 18.-P. 187-190.

127. Шевченко В.А. Генетические последствия действия ионизирующих излучений / В.А. Шевченко, М.Д. Померанцева. М.: Наука, 1985. - 278 с.

128. Методы изучения природных очагов болезней человека / Под ред. Е.А. Петрищевой, Н.Г. Олсуфьева. -М.: Медицина, 1964. 308 с.

129. Органикум. Практикум по органической химии / Пер. с нем. Под. ред. В.М. Потапова, С.В. Пономарева. - Т.2. - М.: Мир, 1979. - 442 с.

130. Репинская И.Б. Избранные методы синтеза органических соединений / И.Б. Репинская, М.С. Шварцберг. Новосибирск, 2000. - 284 с.

131. Беркенгейм A.M. Практикум по лекарственным синтетическим и душистым веществам и фотореактивам / A.M. Беркенгейм. М.: Хим. литература, 1942.-234 с.

132. Стыскин Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде. М.: Химия, 1986. - 215 с.

133. David Harvey. Modem analytical Chemistry / Harvey David. Boston: De Pauw University, 2000. - 816 p.

134. Мак Оми. Дж. Защитные группы в органической химии / Оми. Дж. Мак. М.: Мир, 1976.-395 с.о о о1oei?'6eгючэ ■

135. Ю8 69 • р9£'£i ■ 1-8/-9L ■1. OV/SOI.6£9'63l919'991