Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина и пурина

Долинкин, Андрей Олегович

Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина и пурина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Долинкин, Андрей Олегович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Краснодар МЕСТО ЗАЩИТЫ

2010 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина и пурина»

Автореферат диссертации на тему "Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина и пурина"

¿Жа,

На правах рукописи

ИИ46И7030

Дол им кпп Андрей Олегович

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОСТАТИКОВ - ТИОАМИДОВ НА ОСНОВЕ ПИРИДИНА, ПИРИМИДИНА И ПУРИНА

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Краснодар - 2010

004607030

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет».

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Черновьянц Маргарита Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Буков Николай Николаевич кандидат химических наук Бозина Татьяна Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная

фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Пятигорск

Защита диссертации состоится «29» июня 2010г. в 14 часов в аудитории 231 на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 при Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

Автореферат разослан «¿У» мая 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Н.В. Киселева

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Биологически активные соединения (БАС) на основе гетероароматических тиоамидов широко известны как лекарственные препараты с различной фармакологической активностью (производные пиридина, пиримидина, пурина, тиоурацила и др.). Фармакофором, ответственным за антитиреоидпое действие, считается тиоамидная группа, включенная в структуры соединений на основе пиридина, пиримидина, урацила, пурина, приобретающих после этого антитиреоидные и гойтрогенные свойства. Иод - важнейший элемент, вовлеченный в функционирование щитовидной железы, синтез тиреоидных гормонов и секрецию. Тиоамиды ингибируют синтез тиреоидных гормонов: тироксина Т4 и его активной формы трииодтиронина Тз, главным образом, на этапе органификации иода - включения активированного иода в тирозильные фрагменты тиреоглобулина.

Несмотря на длительное применение в международной клинической практике, механизм их физико-химического действия на этапе органификации иода остается до конца не определенным. Возрастающий интерес к изучению устойчивости комплексов переноса заряда иода с тиоамидами вызван не только стремлением детализировать механизм органификации иода, но и направленным поиском новых препаратов тиреостатического действия, аналогов используемых в клинической практике. Антитиреоидная активность тиоамидов зависит от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Фармакологическая активность лекарственных препаратов во многом определяется фармакокинетическим фактором, влияющим на их распределение в организме, актуальным является также изучение протолитических свойств тиоамидов (основности и кислотности), соотношения молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН, а также оценка констант ассоциации препаратов с транспортными белками плазмы крови.

Поскольку большинство антитиреоидных препаратов при физиологических условиях существуют частично в биологически активной - ионной форме, то существует потребность в разработке простых в исполнении, высокочувствительных и экспрессных электрофоретических методик разделения и анализа, применимых для мониторинга лекарственных препаратов и биообъектов.

Предварительный проведенный анализ научных публикаций позволил сделать вывод о лидирующей позиции методов хроматографии при определении биологически активных тиоамидов в лекарственных формах и биообъектах, в том числе ГХ-масс-спектрометрия (ГХ-МС), ВЭЖХ-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), включающие способы пробоподготовки (предварительную экстракцию и дериватизацию).

Дополнительным аргументом в пользу потребности в простых и доступных методиках определения тиреостатиков является необходимость контроля их содержания в кормах, биологических жидкостях и тканях животных. Этот контроль обусловлен использованием тиреостатических средств в качестве несанкционированных пищевых добавок, увеличивающих массу животных.

Цель работы заключалась в разработке современных методик идентификации и определения тиоамидов, производных пиримидина, пиридина и пурина на основе систематического исследования их физико-химических характеристик.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- сравнительная оценка устойчивости и-о*-комплексов гетероароматических тиоамидов с молекулярным иодом в неполярной среде (хлороформе);

- исследование окислительно-восстановительного взаимодействия тиоамидов с молекулярным иодом в полярных средах (вода и водно-этанольный раствор);

- оценка протолитических свойств и констант протолитических равновесий исследуемых соединений;

- изучение взаимодействия лекарственных препаратов с белком-переносчиком (бычьим сывороточным альбумином) и расчет констант ассоциации;

- подбор условий идентификации гетероароматических тиоамидов, основанных на зависимости хроматографической и электрофоретической подвижности (методы ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, капиллярный зонный электрофорез) и оптических характеристик УФ-, ИК-, масс-спектров от природы гетероцикла;

- разработка комплекса методик определения препаратов на основе тонкослойной хроматографии (в том числе с применением оптической денситометрии, газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ);

- апробация разработанной методики в анализе биологических жидкостей.

Научная новизна.

- Установлена взаимосвязь между структурой гетероароматических тиоамидов, их способностью формировать и-а "-комплексы с иодом в неполярных средах, а также восстановительными свойствами в водно-этанольных растворах, что послужило основой их иодиметрического определения;

- Подобраны оптимальные условия капиллярного электрофоретического разделения и определения тиреостатиков на основании оценки протолитических свойств тиоамидов (рКа и РКШ,)-

- Определены константы ассоциации молекулярных (методом гашения люминесценции альбумина) и ионных (методом КЗЭ) форм препаратов-тиреоетатиков с белком-переносчиком и сделано предположение о природе связывающих сайтов в молекуле альбумина;

Разработаны методики идентификации, разделения и определения гетероароматических тиоамидов хроматографическими (ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ), электромиграционными (КЗЭ) и спектроскопическими (УФ-, ИК-) методами.

Практическая значимость.

Предложены условия идентификации, разделения и определения гетероароматических тиоамидов с использованием спектроскопических, хроматографических и электрофоретических методов, которые могут быть применены также при составлении фармакопейных статей лекарственных субстанций. Разработана методика ТСХ определения тиреостатика 6-н-пропил-2-тиоурацила с применением оптической денситометрии.

Разработаны подходы и показана возможность оценки констант ассоциации активных ионных форм тиреостатиков, производных 2-тиоурацила, с транспортным протеином-сывороточным альбумином методом капиллярного зонного электрофореза.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты спектроскопических и потенциометрических исследований взаимодействия ряда гетероароматических тиоамидов, производных пиримидина, пиридина, урацила и пурина с молекулярным иодом в различных средах. Влияние природы гетероцикла на электронодонорные свойства тиоамидов и возможность их иодиметрического определения.

2. Оценка протолитических свойств гетероароматических тиоамидов, установление соотношения молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН и подбор оптимальных условий капиллярного электрофоретического разделения и определения тиреостатиков.

3. Результаты исследования ассоциации тиреостатических препаратов на основе 2-тиоурацила с транспортным альбумином и оценка констант связывания методами гашения люминесценции и КЗЭ.

4. Комплекс современных спектроскопических (ИК-, УФ-, масс-спектрометрия), хроматографических (ТСХ, ГХ, ВЭЖХ, КЗЭ) методик идентификации гетероароматических тиоамидов.

5. Аналитические преимущества методик хроматографического (ГХ-МС, ВЭЖХ-УФ и КЗЭ) определения тиоамидов на основе пиримидина, пиридина, урацила и пурина.

6. Практическое применение методики ВЭЖХ-УФ определения тиреостатика 6-н-пропил-2-тиоурацила в моче здорового человека.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном конгрессе студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива» (Нальчик, 2007г.); XVII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007г.); XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007г.); II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008г.); V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009г.); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика» (Йошкар-Ола, 2009г.); III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ в виде 4 статей, которые входят в список журналов, рекомендованных ВАК, материалов докладов и конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа выполнена на 136 страницах машинописного текста, включающего 57 рисунков, 17 таблиц и библиографию из 180 наименований.

Основное содержание работы

Во введении обосновывается актуальность темы и формулируется цель работы.

Обзор литературы

Обзор состоит из двух разделов, посвященных структурной и аналитической химии гетероароматических тиоамидов - лекарственных препаратов тиреостатического действия.

В первом разделе обобщены структурные исследования продуктов взаимодействия препаратов антитиреоидного действия (гетероароматических тиоамидов) с иодом. Показано (в основном по данным рептгеноструктурного анализа и Рамановской спектроскопии), что структурные параметры молекулярных комплексов иода высоко чувствительны к изменению типа гетероатома и характера заместителя в гетерокольце. Приведена модель ингибирующего действия препаратов - тиреостатиков на биосинтез гормонов щитовидной железы. Проанализировано влияние структуры тиоамидов на механизм их антитиреоидной активности.

Во втором разделе представлены широко применяемые в фармацевтической и клинической практике методы идентификации и количественного определения препаратов тиреостатического действия. Уделено внимание стадиям пробоподготовки образцов (твердофазной и жидкостной экстракции из биологических матриц) и химического

модифицирования молекул препаратов. Представленные в обзоре аналитические характеристики отдельных методик определения тиреостатиков могут быть использованы в производстве на стадии контроля качества.

Базируясь на приведенных в литературе данных, сформулированы задачи для достижения поставленной в работе цели.

Объекты исследования

В работе исследовались традиционно используемые препараты и потенциальные тиреостатики - гетероароматические тиоамиды: 1-11: производные пиридин-2-тиона

N Н

Ш-1У: производные пиримидин-2-тиона

№ Я Название соединения

I Н пиридин-2-тион

II СРз 5-трифторметил-пиридин-2-тион

У-УН: пр изводные 2-тиоурацила

№ И. Название соединения

III Н пиримидин-2-тион

IV СРз 4-трифторметил-пиримидин-2-тион

№ я Название соединения

V Н 2-тиоурацил, Т11

VI СНз 6-метил-2-тиоурацил, МТ11

VII н-С3Н7 6-н-пропил-2-тиоурацил, РТУ

УШ-1Х: производные пурин-6-тиона

1 Н-пурин-6(9Н)тион, 6МР (VIII)

1Н-пиразоло[3,4-^]пиримидин-4(5Н)-тион (IX)

Исследование взаимодействия гетероароматических тиоамидов с иодом в различных средах

Проявление антитиреоидной активности гетероароматическими тиоамидами зависит от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Реакция между тиреостатиками и молекулярным иодом приводит к образованию аддуктов состава 1:1, посредством допирования электронной плотности с ВЗМО тиоамида на НСМО (а*-типа) молекулы иода.

В системе тиоамид - элементарный иод в хлороформе спектрофотометрическим методом сдвига равновесия исследовано образование молекулярных комплексов о-типа тиоамид-12. Константы устойчивости молекулярных аддуктов (/3) и количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида, рассчитывали с использованием

функции «среднеиодмое число» (п: ) характеризующей количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида. Равновесная концентрация иода [/2] рассчитывалась из оптической плотности в максимуме полосы поглощения иода (510 нм) по уравнению [12] = А/(е ■ I), где е- молярный коэффициент светопоглощения молекулярного иода; / - толщина поглощающего слоя. Для каждой равновесной концентрации иода определено соответственное значение функции ппо уравнению

П1 =(С,! -[/2])/где Со - общая концентрация тиоамида. Расчет констант устойчивости выполнялся по формуле /(!-«/,) = Р[1г] ■ Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения констант

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиона производные 2-тиоурацила

I 1 II III IV V VI VII

1 ёд 4.52 | 3.45 4.93 3.68 2.91 3.14 3.23

Введение электроноакцепторного -СРз заместителя в пиридиновый и пиримидиновый цикл тиоамидов уменьшает их о-донорные свойства по отношению к молекулярному иоду. Поскольку производные 2-тиоурацила образуют малоустойчивые комплексы с молекулярным иодом, их тирсостатичсское действие в организме связано с ингибированием процесса превращения прогормона Т4 в гормон Тз.

Для исследования окислительно-восстановительного взаимодействия тиоамидов с элементарным иодом в полярных средах (водные и водно-этанольные растворы) нами было применено обратное потенциометрическое (иодиметрическое) титрование. Точку эквивалентности фиксировали иономером «ЭВ-74» в режиме вольтметра и визуально по обесцвечиванию титруемого раствора. Степень протекания реакции (<э) определяли по

Л. ' ~ ^Ка^.о. ' СкаЛ.О, . ,, п . т/

формуле со =—--8-!-г-3-^ • 100%, где «о - количество тиоамида, моль; V, -

1000-у0

объем добавленного раствора иода, мл; С, - концентрация раствора иода, моль-экв/л;

" объем раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование, мл; СА.оДО]-концентрация раствора тиосульфата натрия, моль-экв/л.

Таблица 2 - Результаты потенциометрического (иодиметрического) титрования тиоамидов 1-1Х в водных и водно-этанольных средах__

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиона производные 2-тиоурацила производные пурин-6-тиона

вода этанол:вода (1:1 об.)

I II III IV V VI VII VIII IX

100 85 83,5 71 88 89 86 68 75

Результаты иодиметрического титрования (табл. 2) свидетельствуют о различии в окислительно-восстановительных свойствах и химической активности изучаемых

тиоамидов по отношению к молекулярному иоду. Из числа изучаемых тиоамидов, лишь пиридин-2-тион количественно окисляется молекулярным иодом с образованием 2,2'-

Продукт окисления пиридин-2-тиона координирует избыточное количество иода в составе аниона и способствует выведению его из организма. Соединения I-VI можно отнести к группе тиреостатиков, работающих в организме подобно 1-метилимидазолин-2-тиону. Соединения (I,V,VI) количественно окисляются молекулярным иодом, что служит основой методик их потенциометрического определения.

Протолитические свойства тиоамидов

Знание протолитических свойств необходимо как для аналитического изучения сложных равновесных систем (экстракции, комплексообразования и др.), так и для комплексного исследования молекул соединений, рассматривающихся как биологически активные. Процессы всасывания, распределения, метаболизма и экскреции лекарственных препаратов зависят от протолитических свойств. Кроме того, для подбора оптимальных условий идентификации и количественного определения требуется знание констант протолитических равновесий.

Исследуемые тиоамиды являются амфолитами и их протолитические свойства количественно характеризуются константами кислотности рКа и основности (протонирования, рКшГ). Нами определены протолитические свойства тиоамидов (I-IX)

потенциометрическим титрованием 0.200 ммоль тиоамида (или его сопряженной кислоты) раствором NaOH. Постоянную ионную силу (ц=0.100) поддерживали добавлением к исходному раствору КС1. Значение рН фиксировалось рН-метром «рН-150М». Расчет констант протолитического равновесия исследуемых соединений проводили методом наименьших квадратов (МНК) (табл. 3) по уравнению

(1 -а)Ск-[Н+) + [01Г] пГ „„

lg---———-.,„_.,— = ~Г'1 ¡, где Сц - аналитическая концентрация

aCR+[H ]-[01Г] '

титруемого вещества с учетом разбавления в процессе титрования (моль/л); а - степень оттитрованное™, рассчитывающаяся по формуле О = CNa0H VNa0H /и; где СмаОН И У NaOH ~ концентрация и объем (мл) раствора NaOH, о- количество тиоамида (ммоль).

Обращает на себя внимание близость протолитических свойств производных 2-тиоурацила, а также соединения VIII и его изомера IX. Введение электроноакцепторного -CF3 заместителя в пиридиновый и пиримидиновый цикл тиоамидов повышает Ка приблизительно на два порядка (табл. 3).

Оценка протолитических свойств позволила подобрать оптимальные условия капиллярного электрофоретического разделения и ВЭЖХ определения тиреостатиков, установить соотношение молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН.

Таблица 3 - Значения констант протолитических равновесий тиоамидов I-IX в водных и водно-этанольных средах, ^=0.100 (KCI)__

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиопа производные 2-тиоурацила производные пурин 6-тиона

вода этанол:вода(1:1 об.)

I II III IV V VI VII VIII IX

9.80 7.56 7.22 5.27 8.20 8.40 8.37 8.61 8.50

РКшГ 1.21 2.41 1.36 2.40 2.13 1.84 1.81 2.56 2.40

Методы идентификации гстсроароматических тиоамидов

Электронные спектры поглощения (ЭСП) исследуемых тиоамидов содержат несколько полос поглощения, что позволяет достаточно надежно их идентифицировать (табл. 4). Длинноволновые полосы поглощения гетероароматических тиоамидов представлены я-я* переходами. Поскольку тиоамиды III, IV, VIII и IX малорастворимы в хлороформе была использована добавка полярного растворителя - этанола (5 об.%).

ИК-спектроскопия (4000-400 см"1) использована в основном как метод установления подлинности, так как совокупность всех полос поглощения, образующая ИК-спектр данного вещества, однозначно определяет его индивидуальность. В ИК-спектрах соединений присутствуют полосы, характерные для групп N-H (3500-3100 см"1), C-N (936890 см"1), а также и C-S (1600-1460 см"'), характеристическая в присутствии атома азота, т.е. полоса тиоуреидной группировки, которая довольно интенсивна. К колебаниям связи C-S можно отнести полосы поглощения в области 743 см"1 (I), 452-465 см"1 (V-VII), 471 см1 (III). Идентифицировать соединения V-VII можно по полосе валентных колебаний С=0 группы в области 1831-1876 см"1. Такое положение полосы поглощения С=0 объясняется ее слабым сопряжением с малоароматичным пиримидиновым циклом.

Таблица 4 - Характеристики спектров поглощения растворов исследуемых соединений

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиона производные 2-тиоурацила производные пурин 6-тиона

i i и III | IV V | VI | VII VIII | IX

ЕЮН:Н20(1:1 об.)

К.*, нм ORÍ) 270(4.10) 344(3.95) 300(4.16) 365(3.74) 275 (4.41) 290 (4.40) 214(4.49) 271(4.37) 212(4.01) 272(3.88) 214(4.42) 273(4.29) 310* (4.72) 305» (4.82)

CHCI,

НМ (ig*) 290(4.14) 370(3.73) 305(4.28) 370(3.88) 290(4.32) 375(3.55) 295(4.40) 410(3.48) 290 (3.88) 284 (4.20) 285 (4.35) 330 (3.45) 325 (3.53)

* - УФ-спектры соединений VIII и IX получены в 0.1 М NaOH.

Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) изучена подвижность тиоамидов в тонком слое сорбента (силикагеле). Подобраны условия хроматографирования для качественного определения субстанций. В таблице 5 приведены значения подвижности Rf , величины относительного стандартного отклонения (п=5, Р=0.95) и состав подвижной фазы для хроматографического определения тиоамидов.

Таблица 5 - Результаты хроматографического определения тиоамидов

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиона производные 2-тиоурацила производные пурин-6-тиона

I 1 И III | IV V | VI | VII VIII | IX

СНСЬ: МеС№МеОН 9:1:0 1:1:0 7:3:0 3:7:0

0.55 0.75 0.62 0.68 0.32 0.39 0.29 0.26 0.34

¡г 0.03 0.02 0.02 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02

В работе проведено исследование электрофоретической подвижности тиоамидов и подобраны условия их идентификации, установления подлинности и чистоты с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель 103Р». Применяли ^модифицированный кварцевый капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 60 см (эффективная длина 50 см). Детектировали фотометрически при 253.7 им. Благодаря высокой растворимости соединений в щелочных средах определение удобно проводить в виде анионов. В качестве ведущего электролита использован боратный буферный раствор (10 мМ буры, рН 9.18). Рабочее напряжение составляло 20 кВ и было постоянным во всех экспериментах.

Таблица 6 - Результаты исследования электрофоретической подвижности тиоамидов (п=4, Р=0.95)___

производные пиридин-2-тиона производные пиримидин-2-тиона производные 2-тиоурацила производные пурин 6-тиона

I II III IV V VI VII VIII IX

(л, мин 5.48 6.23 7.15 8.12 7.35 6.64 6.16 8.02 8.47

0.03 0.02 0.02 0.04 0.03 0.02 0.02 0.03 0.04

Данный фоновый электролит при прямом детектировании позволяет получить хорошо сформированные пики. В таблице 6 приведены значения времени выхода /д исследуемых тиоамидов и величины относительного стандартного отклонения для четырех параллельных измерений.

Методы разделения н определения гетероароматических тиоамидов

Хронология представленных в обзоре литературы методов разделения и определения тиоамидов свидетельствует о преобладании в современном фармацевтическом анализе хроматографических методов. Метод капиллярного зонного электрофореза, относящийся к перспективным комбинированным методам разделения и анализа, до настоящего времени не использовался для идентификации и определения тиреостатиков - производных 2-тиоурацила.

Нами изучено электрофоретическое поведение 6-замещенных 2-тиоурацилов (V-VII) и подобраны оптимальные условия их разделения и определения (боратный буферный раствор рН=9.18, напряжение 20 кВ) методом КЗЭ. Определение методом внешнего стандарта проводили, используя систему капиллярного электрофореза «Капель-103Р». Электрофореграмма смеси исследуемых соединений представлена на рис. 1.

успед.

1234567B9""N

Рис. 1. Электрофореграмма смеси Н0"3МТи, MTU и PTU на фоне боратного буферного раствора (рН 9.18).

Результаты электрофоретического определения TU, MTU и PTU представлены в таблице 7. Предлагаемая методика позволяет оценить содержание веществ в диапазонах концентраций 1.3-103 мкг/мл, 1.4-114 мкг/мл и 1.7-136 мкг/мл, с пределами обнаружения (cmin) 0.93, 0.73 и 0.86 мкг/мл для TU, MTU, PTU соответственно.

Выбраны оптимальные условия определения PTU (рис. 5) в присутствии лекарственных препаратов 1-метилимидазолин-2-тиона (ММ1) и З-метил-1-этоксикарбонилимидазолин-2-тиона (Carb) методом ВЭЖХ при элюировании смесью (75:25) ацетонитрил-фосфатный буферный раствор (рН 6.86)., Определение методом внешнего стандарта выполняли на жидкостном хроматографе «Хромое ЖХ-301» с детектором «UVV 104М». Использовали колонку размером 150x4.0 мм, заполненную обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 5 мкм. Мертвое время колонки составляет 99 с, мертвый объем - 1.32 мл. Скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/мин. Детектировали в максимуме светопоглощения PTU (275 им). Зависимость площади пика от концентрации определяемого вещества линейна в диапазоне концентраций: 0.51-170.23 мг/л. Предел обнаружения PTU составляет 0.26 мг/л. Время удерживания (/Д уравнение градуировочной функции и метрологические характеристики методики приведены в таблице 7.

J 2000 t I

$ 1500

f О

1000

500

0 1 2 3 4 5

Время, мин

Рис. 2. Хроматограмма смеси MMI (/), PTU (2) и Carb (3) (7-Ю4 М).

Метод ГХ-МС широко используется в аналитической и экспертной практике лекарственных препаратов и предложен в качестве контрольного при определении PTU.

Нами предложены условия ГХ-МС определения 6-н-пропил-2-тиоурацила (линейный диапазон концентраций 10-50 мкг/мл, предел обнаружения 5.22 мкг/мл). Определение проводили на аналитической системе Agilent Technologies GC 6890N/5973N, работавшей в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованной капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной жидкой фазы (5% Phenyl Methyl Siloxane) 0.25 мкм. В качестве газа-носителя использовался гелий (расход 1 мл/мин). Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 30 до 550m/z. Запись хроматограммы вели по полному ионному току. Концентрацию определяли методом внутреннего стандарта с помощью градуировочного графика. Внутренним стандартом служил 1-метил-имидазолин-2-тион. В предлагаемых условиях PTU может быть селективно определен, так как его пик отделяется до базовой линии от пиков TU и MTU, идентификация которых возможна (времена удерживания составляют 10.79 и 11.16 соответственно), но для количественного определения необходима их предварительная химическая дериватизация. Время удерживания и метрологические характеристики ГХ-МС определения PTU представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Уравнения градуировочных функций вида У=к}Х+к2 и метрологические характеристики определения 6-замещениых 2-тиоурацилов методом КЗЭ и 6-н-пропил-2-тиоурацила методами ГХ-МС* и ВЭЖХ-УФ** (п=5, ^.95=2.78)

Тиоамид tR, мин Уравнение градуировочной функции г Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл Sr Cmin, мкг/мл

TU 7.35 0.218с+0.07 0.999 12.8 12.5±0.5 0.03 0.93

MTU 6.64 0.175с+0.05 0.999 14.2 13.9±0.5 0.03 0.73

PTU 6.16 0.142с+0.045 0.999 17.0 16.7±0.5 0.02 0.86

PTU* 12.90 1.25с/с,„.ип.-0.45 0.999 30.0 30.1±1.0 0.03 5.22

PTU** 2.52 2.262с+2.83 0.999 17.0 16.5±0.1 0.01 0.26

Примечание. с,шст - концентрация внутреннего стандарта 1-метил-имидазолин-2-тиона в пробе, мкг/мл.

Масс-спектр РТ11, полученный в вершине хроматографического пика, представлен на рис. 3.

« Я

je и « м M íü bu « ice ijj w i» iw 17-3

Рис. 3. Масс-спектр 6-н-пропил-2-тиоурацила: 170 - (МП)+, 155 - (МП-СН3)+; 142 - (МП-С2Н4)+, 127 - (МП-С3Н7)+.

Таким образом, метод ВЭЖХ-УФ отличается наибольшей чувствительностью и воспроизводимостью результатов определения. Преимуществом КЗЭ является простота разработки методики, малый расход реагентов, высокая эффективность разделения и малая продолжительность анализа.

Исследование связывания тиоамндов с бычьим сывороточным альбумином

Эффективность действия лекарственного препарата, в том числе тиреостатического действия зависит от его распределения в организме. Нами изучено взаимодействие TU, MTU, PTU с транспортным протеином, определены константы ассоциации и число связывающих сайтов молекулы белка. В качестве белка-переносчика выбран бычий сывороточный альбумин (БСА), молекула которого представляет собой полипептидную цепь (585 остатков аминокислот). Раствор альбумина {Alb) обладает природной флуоресценцией, обусловленной наличием триптофановых (2) и тирозиновых (20) фрагментов. Связывание альбумина с тиреостатиком сопровождается гашением флуоресценции вследствие образования устойчивого ассоциата белок-препарат. Равновесие ассоциации альбумина с тиреостатиком Alb + nL = характеризуется [AlbLJ

константой ассоциации Л. = где п - число связывающих сайтов молекулы

[Alb\[L\

белка. Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Varian Сагу Eclipse при длинах волн облучающего света 280 (возбуждается тирозиновый и триптофановый фрагменты белка) и 295 нм (возбуждается триптофановый фрагмент белка) при постоянной концентрации альбумина и переменной - препарата (рис. 4). Применяли фосфатный буфер со значением рН 7.37, близким к рН крови. Для построения концентрационной зависимости использовали интенсивность люминесценции при длине волны 346 нм.

длина волны, нм

Рис. 4. Спектры флуоресценции для системы РТО-А1Ь при >,=295 нм (0.4/4=1.010"5 М; Срти=0, 3.0-10"6 М, б.О Ю-6 М, 1.0-105 М, 2.0-10"5 М, 4.0-10"5 М, 6.0-10-5 М, 1.0-10"4 М, 2.0-104 М).

По данным гашения флуоресценции рассчитаны константа ассоциации белок-препарат (1:1) и число связывающих сайтов молекулы белка линейным и нелинейным МНК:

Модель МНК Уравнение расчета К

линейная

нелинейная Апах С Alb ~ ~ ~ CL + J (CL ~ СAlb+ —) + 4 — См

' 2 С Alb

где /тах, /, - значение интенсивности флуоресценции альбумина в отсутствие и в присутствии препарата; [I] - равновесная концентрация препарата; Си Смь -аналитические концентрации препарата и альбумина.

Рассчитанные линейным и нелинейным МНК величины констант ассоциации находятся в хорошем соответствии и демонстрируют высокое сродство тиреостатиков, производных тиоурацила, по отношению к сывороточному альбумину (табл. 8). Ассоциация с альбумином реализуется за счет образования водородных связей между атомом кислорода молекул тиоурацилов и протонами триптофанового и тирозинового остатков белка.

Таблица 8 - Результаты определения параметров связывания тиреостатиков, производных 2-тиоурацила с альбумином методом гашения флуоресценции_

Соединение линейная модель (lgiQ коэффициент корреляции (г) число связывающих сайтов (п) нелинейная модель (lgК)

ти 4.21 ±0.14 0.998 0.96 4.30 ±0.17

мти 4.17 ±0.15 0.996 0.98 4.30 ±0.29

рти 4.71 ±0.11 0.998 1.08 4.51 ±0.25

Использование метода капиллярного зонного электрофореза позволило нам определить константы ассоциации с альбумином депротонированных (при

физиологических условиях) форм тиреостатиков. При введении альбумина вследствие связывания ионной формы препарата с белком уменьшается площадь пика и увеличивается площадь пика ассоциата тиреостатика с альбумином (рис. 5).

Измерения проводили, используя систему капиллярного электрофореза «Капель-103Р». Фоновый электролит - фосфатный буферный раствор (рН 7.37). Рабочее напряжение (15 кВ) поддерживалось постоянным во вссх экспериментах. В качестве маркера электроосмотического потока (ЭОП) использовали бензиловый спирт. Детектировали фотометрически при 253.7 нм. Константы ассоциации анионных форм

препаратов (1дАГ) можно рассчитать МНК по уравнению ^-— = \%К + \%[АЩ, где п -

(1-й)

среднее число анионов тиреостатика, связанного с молекулой альбумина, п = \ — ББ0 (5'),/50- отношение площадей пиков тиреостатика в присутствии и в отсутствие альбумина; [АЩ - равновесная концентрация белка). В физиологических условиях (рН 7.4) бычий сывороточный альбумин находится преимущественно в анионной форме (р/ 4.7). Этим объясняется низкое сродство анионных форм тиреостатиков к сывороточному альбумину (табл. 9). Повышенная липофильность молекулы РТи способствует связыванию препарата с сывороточным альбумином в основном за счет гидрофобного взаимодействия.

8 9 10 ьпш 7 8 9 10 ьпн

Рис. 5. Электрофореграммы для системы РТи-А1Ь Срти=2.14-10"4 М; Сан,: 2.14-К)-4 М (1), 4.2910 4 М (2), 8.57-10"4 М (3), 2.14-10"3 М (4).

Таблица 9 - Результаты определения констант ассоциации анионных форм тиреостатиков, производных тиоурацила с альбумином методом капиллярного зонного электрофореза ___

Соединение Время миграции, с Электрофоретическая подвижность, см2/кВ с Константа ассоциации (1о§К)

рти 452 -2.1 2.99 ±0.01

мти 560 -7.2 1.85 ±0.04

ти 498 -4.5 2.11 ±0.02

Практическое использование разработанной ВЭЖХ методики определения 6-н-пропил-2-тноурацила

Разработанная ВЭЖХ-УФ методика определения РТО апробирована при анализе мочи здорового человека. Анализируемый образец готовили модификацией свежесобранной мочи здорового человека стандартным раствором РТи в фосфатном буфере (рН 6.86). Экстракцию РТ11 проводили тремя порциями по 5 мл этилацетата (ч.д.а.) из 5 мл мочи. Экстракты упаривали при комнатной температуре, растворяли в 5 мл подвижной фазы и анализировали методом ВЭЖХ. Хроматограмма образца мочи после пробоподготовки (рис. 7) содержит пик соэкстрактов матрицы урины (1-2.4 мин) и хорошо сформированный пик пропилтиоурацила (2.53 мин). Анализ занимает не более 6 минут, хроматографические пики хорошо сформированы и разделяются до базовой линии (рис. 6, табл. 10).

Рис. 6. Хроматограмма образца мочи (введено 2.05 мг/л РТи); • всплеск светопоглощения при переключении длины волны детектора.

Таблица 10 - Результаты ВЭЖХ-УФ определения содержания РТЦ в моче (п=5, Р=0.95)

Введено, мг/л Найдено, мг/л £>,%

2.13 2.05 3.52

3.06 3.08 0.46

3.40 3.28 3.59

4.26 4.35 2.23

5.11 5.24 2.63

Выводы

1. Исследован ряд тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина, урацила и пурина и оценена их способность координировать молекулярный иод в хлороформном растворе. Установлено, что устойчивость молекулярных аддуктов тиоамидов с иодом уменьшается в ряду пиримидин-2-тион (\&р=4.93) > пиридин-2-тион (^Д=4.52) > 4-трифторметил-пиримидин-2-тион (1§/?=3.68) > 5-трифторметил-пиридин-2-тион (^/¡=3.45) > 6-н-пропил-2-тиоурацил (1§Д=3.23) > 6-метил-2-тиоурацил (^/3=3.14) > 2-тиоурацил (\^р=2.9\).

тиоурацил и 6-метил-2-тиоурацил количественно окисляются иодом, что служит основой их иодиметрического определения. Методом потенциометрического титрования определены кислотно-основные свойства тиоамидов-амфолитов (рКаи рК t). В результате оценки протолитических свойств тиреостатиков установлено соотношение молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН и подобран ведущий электролит (боратный буферный раствор, рН=9.18) для капиллярного электрофоретического их определения в форме анионов.

3. Определены константы ассоциации (lgiO молекулярных форм препаратов-тиреостатиков: TU (4.21), MTU (4.17), PTU (4.71) методом гашения люминесценции; а также их ионных форм (2.11, 1.85, 2.99) методом КЗЭ с белком-переносчиком. На основе этих данных проведена оценка степени распределения лекарственных препаратов в организме.

4. Предложены условия разделения и определения антитиреоидных препаратов - 6-R-2-тиоурацилов, где R=H (TU), СН3 (MTU), н-С3Н7 (PTU) методом КЗЭ. Методика позволяет определить вещества в диапазонах концентраций 1.3-103 мкг/мл, 1.4-114 мкг/мл и 1.7-136 мкг/мл, с пределами обнаружения 0.93, 0.73 и 0.86 мкг/мл для TU, MTU, PTU соответственно.

5. Разработаны методики определения тиреостатика PTU с линейным диапазоном концентраций 10-50 мкг/мл и пределом обнаружения 5.22 мкг/мл (методом ГХ-МС), а также в диапазоне концентраций 0.51-170.23 мг/л с пределом обнаружения - 0.26 мг/л (методом обращенно-фазовой ВЭЖХ). Методика апробирована при анализе образца мочи здорового человека с добавкой PTU. Степень извлечения PTU составила 70±2%, предел обнаружения в моче 0.38 мг/л.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Долинкин, А.О. Определение гетероароматических тиоамидов, препаратов тиреостатического действия; исследование их ст-комплексов с молекулярным иодом [Текст] // Международный конгресс студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива»: тез. докл. - Нальчик, 2007. - T.III. - с.269-271.

2. Черновьянц, М.С. Определение протолитических свойств гетероциклических тиоамидов [Текст] / М.С. Черновьянц, Е.В. Хохлов, А.О. Долинкин // Проблемы теоретической и экспериментальной химии: XVII Российская молодежная научная конференция: тез. докл. - Екатеринбург, 2007. - с. 166-167.

3. Долинкин, А.О. Квантово-химическое изучение структуры и устойчивости молекулярного комплекса 1-метилимидазолин-2-тиона с иодом в различных средах [Текст] / А.О. Долинкин, Е.В. Хохлов // XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»: тез. докл. - Москва, 2007. Электронная.

4. Долинкин, А.О. Полуколичественное определение 6-пропил-2-тиоурацила методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с применением оптической денситометрии [Текст] // Труды аспирантов и соискателей Южного федерального университета: сб. трудов. - Ростов-на-Дону, 2007. - Т. XII. - с. 42-43.

5. Черновьянц, М.С. Хроматографическое определение 6-замещенных 2-тиоурацилов, препаратов тиреостатического действия [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, И.В. Браславская // Журнал аналитической химии. - 2008. - Т.63. - №9. - С. 930934.

6. Черновьянц, М.С. Определение 6-меркаптопурина, препарата цитостатического действия методом капиллярного зонного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц,

А.О. Долинкин // II Международный форум «Аналитика и аналитики»: тез. докл. -Воронеж, 2008. - Т.2. - С. 489 .

7. Долинкин, А.О. Определение 6-замещенных 2-тиоурацилов, препаратов тиреостатического действия методом капиллярного зонного электрофореза [Текст] // Труды аспирантов и соискателей Южного федерального университета: сб. трудов. - Ростов-на-Дону, 2008. - Т. XIII. - С. 59-62.

8. Черновьянц, М.С. Определение константы связывания б-метил-2-тиоурацила, препарата тиреостатического действия, с сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, A.B. Чернышев // Разработка, исследование, и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. трудов. - Пятигорск, 2009. - С. 357-358.

9. Черновьянц, М.С. Использование метода гашения флуоресценции для определения константы связывания противолейкемического препарата 6-меркаптопурина с бычьим сывороточным альбумином [Текст] / М.С. Черновьянц, A.B. Чернышев, С.А. Тучков, А.О. Долинкин // III Международная конференция по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды: тез. докл. - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 45-46.

10. Черновьянц, М.С. Разделение и количественное определение тиреостатических препаратов, производных 2-тиоурацила, методом капиллярного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // VI Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика»: тез. докл. - Йошкар-Ола, 2009.-С. 229.

11. Черновьянц, М.С. ВЭЖХ разделение и количественное определение препаратов антитиреоидного действия [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, Е.В. Хохлов // Журнал аналитической химии - 2009. - Т.64. - №8. - С. 850-853.

12. Черновьянц, М.С. Использование капиллярного электрофореза для определения констант связывания антитиреоидных препаратов, производных тиоурацила, с бычьим сывороточным альбумином [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева): тез. докл. - Краснодар, 2009. - С. 109.

13. Черновьянц, М.С. Исследование взаимодействия антитиреоидных препаратов, производных 2-тиоурацила, с бычьим сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, A.B. Чернышев, А.О. Долинкин // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева): тез. докл. - Краснодар, 2009. - С. 431.

14. Долинкин, А.О. Анализ гетероароматических тиоамидов - препаратов тиреостатического действия (обзор) [Текст] / А.О. Долинкин, М.С. Черновьянц // Химико-фармацевтический журнал -2010. - Т.44. -№2. - С. 46-53.

15. Chernov'yants, M.S. Interaction of antithyroid drugs with bovine serum albumin: electrophoretic and fluorimetric study [Текст] / M.S. Chernov'yants, A.O. Dolinkin, A.V. Chernyshev [и др.] // Journal of Pharmaceutical Sciences - 2010. - V.99 - №3. -P.1567-1573.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1716. Тираж 110 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Долинкин, Андрей Олегович

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Синтез гормонов щитовидной железы и механизм действия их антагонистов - антитиреоидных препаратов.

1.2 Структурные и спектральные характеристики комплексов переноса заряда тиоамидов с иодом.

1.2.1 Молекулярные аддукты.

1.2.2 Иодониевые соли.

1.2.3 Дисульфиды моно(ди-) катионов.

1.3 Термодинамическая устойчивость комплексов иода с тиоамидами и продуктами их окисления.

1.4 Анализ гетероароматических тиоамидов - препаратов антитиреоидного действия.

1.4.1 Хроматографические методы анализа.

1.4.2 Вольтамперометрические методы анализа.

1.4.3 Спектрофотометрические методы анализа.

1.4.4 Титриметрические и электротитриметрические методы анализа.

Введение диссертация по химии, на тему "Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина и пурина"

Аналитическая химия биологически активных соединений (БАС) является приоритетной областью развития современной аналитической химии. К БАС относится ряд классов органических соединений, среди которых выделяются гетероароматические тиоамиды - группа синтетических органических веществ, способных участвовать в перехвате свободных радикалов, благодаря наличию атома серы, а также биохимических редокс-процессах с участием иода.

Производные гетероароматических тиоамидов широко известны как лекарственные препараты с различной фармакологической активностью: противовирусной, антибактериальной, противогрибковой, противотуберкулезной (производные пиридина), их применяют для лечения гипертиреоза (производные пиримидина), лейкемии (производные пурина), цереброваскулярных заболеваний, болезней Альцгеймера, Паркинсона, мигреней, депрессий, нарушений памяти, в качестве ингибиторов обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (производные тиоурацила).

Фармакофором, ответственным за антитиреоидное действие, считается тиоамидная группа, включенная в структуры соединений на основе пиридина, пиримидина, урацила, пурина, приобретающих после этого антитиреоидные и гойтрогенные свойства. Иод - важнейший элемент, вовлеченный в функционирование щитовидной железы, синтез тиреоидных гормонов и секрецию. Тиоамиды ингибируют синтез тиреоидных гормонов: тироксина Т4 и его активной формы трииодтиронина Т3, главным образом, на этапе органификации иода - включения активированного иода в тирозильные фрагменты тиреоглобулина.

Применяемые сегодня препараты для лечения патологий, связанных с гиперфункцией щитовидной железы (тиреотоксикоз, болезнь Грейвса и др.) ограничиваются производными 2-тиоурацила (метилтиоурацил, пропилтиоурацил). Однако, несмотря на длительное применение в международной клинической практике, детальный механизм их действия на этапе органификации иода остается дискуссионным. Возрастающий интерес к изучению устойчивости комплексов переноса заряда иода с тиоамидами вызван не только стремлением детализировать механизм органификации иода, но и направленным поиском новых препаратов тиреостатического действия, аналогов используемых в клинической практике. Специфические особенности антитиреоидной активности тиоамидов зависят от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Многие авторы на основании гистологического исследовании щитовидной железы и анализа гормонов Т3 и Т4 отмечают хорошую корреляцию между антиреоидной активностью тиоамидов in vivo и константами устойчивости их комплексов с молекулярным иодом в хлороформе. Весьма актуальной задачей представляется выявление корреляционной зависимости между структурой гетероароматических тиоамидов и их реакционной способностью по отношению к молекулярному иоду в полярных и неполярных средах.

Поскольку фармакологическая активность лекарственных препаратов во многом определяется фармакокинетическим фактором, влияющим на распределение их в организме, актуальным является изучение протолитических свойств тиоамидов (основности и кислотности), соотношения молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН, а также оценка параметров связывания (число связывающих сайтов и константа ассоциации) препаратов с транспортными белками плазмы крови.

Предварительный проведенный анализ научных публикаций позволил сделать вывод о лидирующей позиции хроматографии среди методов определения биологически активных тиоамидов в лекарственных формах и биообъектах, в том числе ГХ-масс-спектрометрия (ГХ-МС), ВЭЖХ-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), включающие сложные способы пробоподготовок (предварительную экстракцию и дериватизацию). Эти методы дороги и не всегда доступны. Поскольку большинство антитиреоидных препаратов при физиологических условиях существуют частично в биологически активной - ионной форме, то существует потребность в разработке простых в исполнении, высокочувствительных и экспрессных электрофоретических методик разделения и анализа, применимых для мониторинга лекарственных препаратов и биообъектов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: сравнительная оценка устойчивости и-о*-комплексов гетероароматических тиоамидов с молекулярным иодом в неполярной среде (хлороформе);

- оценка протолитических свойств и констант протолитических равновесий исследуемых соединений;

- апробация разработанной методики в анализе биологических жидкостей.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

6. Черновьянц, М.С. Определение 6-меркаптопурина, препарата цитостатического действия методом капиллярного зонного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // II Международный форум «Аналитика и аналитики»: тез. докл. — Воронеж, 2008. - Т.2. — С. 489.

8. Черновьянц, М.С. Определение константы связывания 6-метил-2-тиоурацила, препарата тиреостатического действия, с сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, А.В. Чернышев // Разработка, исследование, и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. трудов. - Пятигорск, 2009. - С. 357358.

9. Черновьянц, М.С. Использование метода гашения флуоресценции для определения константы связывания противолейкемического препарата 6-меркаптопурина с бычьим сывороточным альбумином [Текст] / М.С. Черновьянц, А.В. Чернышев, С. А. Тучков, А.О. Долинкин // III Международная конференция по новым технологиям и- приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды: тез. докл. - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 45-46.

10. Черновьянц, М!С. Разделение и количественное определение тиреостатических препаратов, производных 2-тиоурацила, методом капиллярного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // VI Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика»: тез. докл. - Йошкар-Ола, 2009. — С. 229.

13. Черновьянц, М.С. Исследование взаимодействия антитиреоидных препаратов, производных 2-тиоурацила, с бычьим сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, А.В. Чернышев, А.О. Долинкин // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева): тез. докл. - Краснодар, 2009. - С. 431.

15. Chernov'yants, M.S. Interaction of antithyroid drugs with bovine serum albumin: electrophoretic and fluorimetric Study [Текст] / M.S. Chernov'yants, A.O. Dolinkin, A.Y. Chemyshev [и др.] // Journal of Pharmaceutical Sciences -2010.-V. 99 - №3. — P.1567-1573.

На защиту выносятся следующие положения:

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

Выводы

1. Исследован ряд тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина, урацила и пурина и оценена их способность координировать молекулярный иод в хлороформном растворе. Установлено, что устойчивость молекулярных аддуктов тиоамидов с иодом уменьшается в ряду пиримидин-2-тион (lg/M.93) > пиридин-2-тион (lg/M.52) > 4-трифторметил-пиримидин-2-тион (lg/?=3.68) > 5-трифторметил-пиридин-2-тион (lg/?=3.45) > 6-я-пропил-2-тиоурацил (lg/?=3.23) > 6-метил-2-тиоурацил (lg/£=3.14) > 2-тиоурацил (lg/?=2.91).

2. Изучены реакции взаимодействия тиоамидов с молекулярным иодом в водных и водно-спиртовых растворах, которые показали различия в их окислительно-восстановительных свойствах и химической активности: пиридин-2-тион, 2-тиоурацил и 6-метил-2-тиоурацил количественно окисляются иодом, что служит основой их иодиметрического определения. Методом потенциометрического титрования определены кислотно-основные свойства тиоамидов-амфолитов (рКа и рКтг). В результате оценки протолитических свойств тиреостатиков установлено соотношение молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН и подобран ведущий электролит (боратный буферный раствор, рН=9.18) для капиллярного электрофоретического их определения в форме анионов.

3. Определены константы ассоциации (1§Д) молекулярных форм препаратов-тиреостатиков: TU (4.21), MTU (4.17), PTU (4.71) методом гашения люминесценции; а также их ионных форм (2.11, 1.85, 2.99) методом КЗЭ с белком-переносчиком. На основе этих данных проведена оценка степени распределения лекарственных препаратов в организме.

4. Предложены условия разделения и определения антитиреоидных препаратов - 6-Е1-2-тиоурацилов, где R=H (TU), СН3 (MTU), 7/-С3Н7 (PTU) методом КЗЭ. Методика позволяет определить вещества в диапазонах концентраций 1.3-103 мкг/мл, 1.4-114 мкг/мл и 1.7-136 мкг/мл, с пределами обнаружения 0.93, 0.73 и 0.86 мкг/мл для TU, MTU, PTU соответственно.

5. Разработаны методики определения тиреостатика PTU с линейным диапазоном концентраций 10-50 мкг/мл и пределом обнаружения 5.22 мкг/мл (методом ГХ-МС), а также в диапазоне концентраций 0.51170.23 мг/л с пределом обнаружения - 0.26 мг/л (методом обращенно-фазовой ВЭЖХ). Методика апробирована при анализе образца мочи здорового человека с добавкой PTU. Степень извлечения PTU составила 70±2%, предел обнаружения в моче 0.38 мг/л.

Заключение

Сравнительная оценка электронодонорной способности тиоамидов по отношению к молекулярному иоду позволяет установить связь между структурой соединений и механизмом их антитиреоидной активности. На основании данных рентгеноструктурного анализа и Рамановской спектроскопии установлено, что молекулярные аддукты демонстрируют исключительную чувствительность структурных параметров (длин I-I и S-I связей и ориентации молекулы иода) к изменению типа гетероатома, введению заместителей и бензаннелированию молекулы гетероцикла.

Очевидно, что антитиреоидные препараты, подобные N-метилимидазолин-2-тиону или пиридин-2-тиону, вмешиваются в механизм иодинации, взаимодействуя с соединениями активного иода и конкурируя с тирозильными фрагментами тиреоглобулина. Препараты на основе тиоурацила или Л'-метилимидазола и его конденсированных аналогов вмешиваются в формирование иодирующего центра в составе гемового фрагмента тиреопероксидазы [97,98]. В отличие от них алкилированные по обоим атомам азота имидазолин-2-тионы полностью теряют антитиреоидную активность из-за невозможности формирования водородной связи с гистидиновым остатком белка и возникновения стерических эффектов при координации тиреостатиков атомом железа порфиринового цикла.

Тиоамиды, производные имидазола и пиридина, при взаимодействии с иодом образуют протонированные продукты окисления состава [D-S-S-D]n+ (I3")n (п=1 и 2), способные координировать избыточное количество иода в составе анионов.

Тиреостатики на основе тиазола, тиазолина, тиадиазола и бензимидазола, образуя n-а*-комплекс с молекулярным иодом, инициируют полный перенос заряда в молекуле иода и формируют иодониевые соли за счет образования 3-центровой 10-электронной молекулярной орбитали с линейным S-I+-S линкером!

Производные тиоурацила ингибируют активность энзима иодотиронин деиодиназы, ответственного за превращение прогормона Т4 в гормон Тз [41]. Помимо этого, пропилтиоурацил инактивирует окислительную реакцию конденсации дииодтирозинов в синтезе Т4.

В настоящее время исследования в направлении синтеза и дизайна новых препаратов класса гетероароматических тиоамидов, сочетающих способность обратимо ингибировать активность ТПО и лимитировать процесс превращения прогормона Т4 в гормон Тз, продолжаются [38].

Хронология представленных в обзоре методов разделения и количественного определения антитиреоидных препаратов свидетельствует о преобладании в современном фармацевтическом анализе хроматографических методов. Метод капиллярного зонного электрофореза, относящийся к перспективным комбинированным методам разделения и анализа, до настоящего времени не использовался для идентификации и количественного определения тиреостатиков — производных 2-тиоурацила.

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Рабочие растворы, реактивы, оборудование

Рабочие растворы исследуемых тиоамидов готовили растворением точных навесок в соответствующем растворителе. Органические растворители марки «хч» очищали по известным методикам [171]. Для потенциометрического титрования использовали стандартный раствор тиосульфата натрия, приготовленный из фиксанала согласно [172]. В работе использовали иод марки «хч», очищенный сублимацией. Различные значения рН водной фазы создавали буферными растворами, приготовленными в соответствии с рекомендациями [173].

Электронные спектры поглощения (ЭСП) соединений регистрировали на спектрофотометрах Сагу 50 и Сагу 100 (Varian) и «Specord UV VIS». Для измерения оптической плотности использовали спектрофотометр «СФ-46». Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлюориметре Сагу Eclipse (Varian). ИК-спектры веществ регистрировали на ИК-спектрометре «Perkin Elmer FT/IR Spectrum 1000» в виде таблеток КВг, число сканирований не менее 10.

Измерение рН растворов производили на рН-метре «рН-150М» со стеклянным и хлоридсеребряным электродами. Потенциометрическое титрование проводили на иономере универсальном ЭВ-74 с платиновым индикаторным и хлоридсеребряным вспомогательным электродами.

Для хроматографического определения с использованием оптической денситометрии применяли систему «Денскан-04» с программным обеспечением, которое позволяет выполнять полный цикл процедур, связанных с обработкой хроматограмм в видимой и ультрафиолетовой области спектра (?w4=254 нм, Хтах=365 нм) [174].

Для проведения капиллярного электрофореза использовался прибор «Капель-103Р» (Люмекс) с немодифицированным кварцевым капилляром и фотометрическим детектором (^=253.7 нм). Внутренний диаметр капилляра составляет 75 мкм, длина 60 см, расстояние от ввода пробы до детекторного окна 50 см. Пробу вводили гидродинамическим способом под давлением 30 мбар в течение 5 с.

Анализ исследуемых соединений методом ВЭЖХ проводили с использованием обращенно-фазового жидкостного хроматографа «Хромое ЖХ-301» (ЗАО НТК «Синтеко») с UV-Vis детектором «UVV 104М» (ЗАО «НПКФ Аквилон»). Применяли колонку размером 4.0x150 мм, заполненную обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 5 мкм (ЗАО «БиоХимМак СТ»). Мертвое время колонки составляет 99 с, мертвый объем — 1.32 мл. Для приготовления подвижных фаз использовали ацетонитрил марок осч или "для хроматографии".

ГХ-МС определения проводили на аналитической системе Agilent Technologies GC 6890N/MS 5973, работавшей в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой НР-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной жидкой фазы (5% Phenyl Methyl Siloxane) 0.25 мкм

2.2 Объекты исследования

В настоящей работе были исследованы новые соединения антитиреоидного действия - гетероароматические тиоамиды, производные пиридина, пиримидина, урацила и пурина: производные пиридин-2-тиона пиридин-2-тион (I) 5-трифторметил-пиридин-2-тион (П) н н

М = 111.17 г/моль М= 179.16 г/моль tim = 127-130°С t™ = 154-159°С

Производные пиридин-2-тиона — желтоватые кристаллические порошки со слабым специфическим запахом и горьким вкусом. Умеренно растворимы в воде, спирте и хлороформе. Биологическое действие заключается в замедлении роста бактерий, грибков, дрожжей, плесени. Препараты этой группы могут служить основой для применения в качестве биологически активных агентов, обладающих противовирусным, антибактериальным, противогрибковым, противотуберкулезным и антитиреоидным (тиреостатическим) действием.

Производные пиримидин-2-тиона

4-трифторметил-пиримидин-2~тион (IV) пиримидин-2-тион (ИГ)

F,C N

-N

-NH

M= 112.15 г/моль

M= 180.15 г/моль tnjl = 230°C tnjI = 164-166°C

Производные пиримидин-2-тиона - желтые кристаллические порошки со слабым специфическим запахом и горьким вкусом. Хорошо растворимы в воде, умеренно растворимы в спирте и хлороформе.

Производные 2-тиоурацила

2-тиоурацил, 6-метил- 6-и-пропил-

TU (V) 2-тиоурацил, MTU (VI) 2-тиоурацил, PTU (VII)

Н Н3С ^.N^^S

NH L.NH с О с

М= 128.15 г/моль М= 142.18 г/моль М= 170.23 г/моль пл = 340°С tnn = 320-330°С tIUI = 218-220°C

Производные 2-тиоурацила - белые кристаллические порошки без запаха и с горьким вкусом. Очень мало растворимы в воде, хлороформе ацетонитриле, ацетоне и эфире, хорошо растворимы в этаноле (-750 г/л). Являются синтетическими антитиреоидными средствами.

Производные пурин-6-тиона

1Н-пурин-6(9Н)тион моногидрат, 6МР (VIII) 1Н-1шразоло[3,4-*/]пиримидин-4(5Н)-тион (IX)

S У -н20 N н S NH ^^Т^^Чч N N н

М= 170.19 г/моль М= 152.18 г/моль tpa3fl 308°С ^разл = 300°С

Производные пурин-6-тиона - желтые кристаллические порошки. Практически нерастворимы в воде, растворимы в горячем спирте и растворах щелочей. Тиоамиды этой группы подавляют обмен веществ в клетке, вступая в конкуренцию с нормальными метаболитами - предшественниками нуклеиновых кислот, обладают определенным тиреостатическим действием.

2.3. Исследование взаимодействия гетероароматических тиоамидов с иодом в различных средах

Проявление антитиреоидной активности гетероароматическими тиоамидами зависит от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Физико-химические свойства растворителя (полярность, диэлектрическая проницаемость, способность к протонированию и т.п.) коренным образом влияют на характер взаимодействия тиоамидов с иодом. Изучение изменений в системе тиоамид - молекулярный иод под действием различных типов растворителей является интересной и малоизученной областью химии иода.

2.3.1 Спектрофотометрическое исследование устойчивости с-комплексов тиоамидов с элементарным иодом в хлороформе

Реакция между молекулами гетероароматических тиоамидов и иода в малополярных растворителях (CHCI3, СН2С12) приводит к образованию комплексов переноса заряда (КПЗ) состава 1:1, посредством донирования электронной плотности с ВЗМО донора на НСМО (а*-типа) молекулы иода. Равновесие комплексообразования между тиоамидом (Z)) и молекулярным иодом характеризуется константой устойчивости /? (3).

В системе тиоамид - элементарный иод в хлороформе спектрофотометрическим методом сдвига равновесия исследовано образование молекулярных комплексов сг-типа тиоамид-12. Константы устойчивости молекулярных аддуктов /? и количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида, рассчитывали с использованием функции «среднеиодное число» (Щ) характеризующей количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида:

- (С,2 -И)

7--С7) D где Сд - аналитическая концентрация тиоамида; С, — аналитическая концентрация молекулярного иода; [12] - равновесная концентрация иода. Для каждой равновесной концентрации иода определено соответствующее значение функции Щ по уравнению (7). Равновесная концентрация иода [/2] рассчитывалась из оптической плотности в максимуме полосы поглощения молекулярного иода (510 нм) по уравнению (8):

ГГ 1 А

1Л=71 («) где е - молярный коэффициент светопоглощения молекулярного иода; / -толщина поглощающего слоя.

Для определения состава и устойчивости образующихся комплексов готовились серии хлороформных растворов с постоянной концентрацией тиоамида (1.0-10"4 - для I и II, 5.0-10"5 - для III и IV, 4.0-Ю-5 - для V-VII) и переменной - иода: 0.4<СЛ /Со<9.0 (рис.21). Значения констант устойчивости длина волны, им

Рисунок 21 - ЭСП MTU с молекулярным иодом (c(MTU)= 4.0-10"5 М; с(I2): 1 - 2.40-10"5; 2 - 4.0-10"5; 3 - 6.0-10'5; 4 - 8.0-10"5; 5 - 1.2-10"4; 6 - 2.0-10"4; 7 - 4-10"3 М) в хлороформе, /=1 см.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Долинкин, Андрей Олегович, Краснодар

1. Кубарко А.И., Yamashita S., Денисов С.Д., Демидчук Ю.Е., Дубовик Б.В., Романовский Д.И., Ashizava К., Ito М., Takamura N. Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты. Текст. Минск Нагасаки: Omuro-Print, 1998. -С. 31-115.

2. Кеттайл В.М., Арки Р.А. Патофизиология эндокринной системы. Текст. М.: Бином. 2001. С.5-79.

3. Кононов Е.И., Курдюмов Ф.И. Гормоны щитовидной железы. Текст. М.: изд-во Московского гос. ун-та, 2004. С. 15-34.

4. Кандрор В.И. Гормоны щитовидной железы: биосинтез и механизмы действия Текст. / В.И. Кандрор // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева) 2005. - T.XLIX, №1. - С.75-83.

5. Laurence, С. Structure and molecular interactions of anti-thyroid drugs. Part 2. Electron donor properties of carbimazole Текст. / С. Laurence, M.J. El Ghomari, M. Berthelot // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1998 - P.l 163-1167.

6. Brent, G.A. The molecular basis of thyroid hormone action Текст. / G.A. Brent //New Engl. J. Med. 1994. - V.331, - No. 13. - P.847-853.

7. Ericson, L.E. Thyroperoxidase and Thyroid Autoimmunity Текст. / L.E. Ericson, V. Johanson, J. Molne [et al.] / Eds. P. Carayon and J. Ruf // London: John Libbey Eurotext, 1990. P. 107.

8. Taurog, A. In: The Thyroid Текст. / A. Taurog / Eds. L.E. Braverman and R.D. Utiger // Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000. P.61.

9. Dunford, H.B. Comprehensive Biological Catalysis Текст. / H.B. Dunford // Eds. M. Sinnott, 1998, P. 196

10. П.Штейнман А.А. Железосодержащие оксигеназы: структура, механизмдействия и моделирование Текст. / А.А. Штейнман // Успехи химии. -2008.-Т. 77,№ 11.-С. 1013-1035.

11. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов. Текст. СПб: ГИОРД, 2004. С. 11-30.

12. Furtmiiller P.G. Active site structure and catalytic mechanisms of human peroxidases Текст. / P.G. Furtmuller, M. Zederbauer, W. Jantshko [et al.] // Arch. Biochem. Biophys. 2006. - V.445, - No.2. - P.199-213.

13. Denisov, I.G. Structure and chemistry of cytochrome P450 Текст. / I.G. Denisov, T.M. Malms, S.G. Sligar [et al.] // Chem. Rev. 2005. - V.105, No.6. — P.2253-2278.

14. Bollinger, J.M. Jr. Stalking intermediates in oxygen activation by iron enzymes: Motivation and method Текст. / J.M. Bollinger, Jr., C. Krebs // J. Inorg. Biochem. 2006. - V. 100, -No.4. -P.586-605.

15. Hersleth, H.P. Structures of the high-valent metal-ion haem-oxygen intermediates in peroxidases, oxygenases and catalases Текст. / H.P. Hersleth, U. Ryde, P. Rydberg [et al.] // J. Inorg. Biochem. 2006. - V.100. - No.4. -P.460-476.

16. Hersleth, H.P. Crystallographic and spectroscopic studies of peroxide-derived myoglobin compound II and occurrence of protonated Felv-0. Текст. / H.P. Hersleth, T. Uchida, A.K. Rohr [et al.] // J. Biol. Chem. 2007. - V.282. -No.32. -P.23372-23386.

17. Laurence, C. Structure and molecular interactions of anti-thyroid drugs. Part 3.1 Methimazole: a diiodine sponge Текст. / С. Laurence, MJ. El Ghomari, J.Y. Le Questel [et al.] // Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 1998. - P. 1545-1553.

18. Jayaram, P.N. Effect of thione-thiol tautomerism on the inhibition of lactoperoxidase by anti-thyroid drugs and their analogues Текст. / P.N. Jayaram, G. Roy, G. Mugesh // J. Chem. Sci. 2008. - V.120. -No.l. - P. 143154.

19. Aragoni, M.C. Anti-thyroid drug methimazole: X-ray characterization of two novel ionic disulfides obtained from its chemical oxidation by I2 Текст. / M.C.

20. Aragoni, M. Area, F. Demartin et al. // J. Am. Soc. 2002. - Y.124, - No. 17. -P.4538-4539.

21. Ruf, J. Structural and functional aspects of thyroid peroxidase Текст. / J. Ruf, P. Carayon // Arch. Biochem. Biophys. 2006. - V.445. - No.2. - P.269-277.

22. Roy, G. Selenium analogues of antithyroid drugs recent developments Текст. / G. Roy, G. Mugesh // Chem. Biodivers. - 2008. - V.5. - No.3. -P.414-439.

23. Bianco, A.C. Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, and Physiological Roles of the Iodothyronine Selenodeiodinases Текст. / A.C. Bianco, D. Salvatore, B.Gereben [et al.] // Endocrine Rev. 2002. - V.23. - No.l. -P.38-89.

24. K6hrle, J. Iodothyronine deiodinases Текст. / J. Kohrle // Methods Enzymol. -2002.-V. 347-P. 125-167.

25. Roy, G. Biomimetic studies on anti-thyroid drugs and thyroid hormone synthesis Текст. / G. Roy, M. Nethali, G. Mugesh // J. Am. Chem. Soc. -2004. V.126 — P.2712—2713.

26. Roy, G. Anti-thyroid drugs and thyroid hormone synthesis: effect of methimazole derivatives on peroxidase-catalyzed reactions Текст. / G. Roy, G. Mugesh // J. Am. Chem. Soc. 2005 - V. 127 - P. 15207-15217.

27. Долинкин, A.O. Анализ гетероароматических тиоамидов препаратов тиреостатического действия (обзор) Текст. / А.О. Долинкин, М.С. Черновьянц // Хим.-фарм. журн. - 2010. - Т.44. - №2. - С. 46-53.

28. Divi, R.L. Inhibition of thyroid peroxidase by dietary flavonoids Текст. /

29. R.L.Divi, D.R. Doerge // Chem. Res. Toxicol. 1996. - Y.9. - No. 1. - P. 1623.

30. Doerge, D.R. Mechanism for the anti-thyroid action of minocycline Текст. / D.R. Doerge, R.L. Divi, J. Deck [et al.] // Chem. Res. Toxicol. 1997. - V.l. No.l. — P.49-58.

31. Roohi, H. Quantum mechanical study of tautomerism of methimazole and the stability of methimazole-b complexes Текст. / H. Roohi, A. Ebrahimi, S.M. Habibi // J. Mol. Struct. (Theochem) 2004. - V.710, P.77-84.

32. Черновьянц М.С. Органические комплексы иода: структурное и функциональное многообразие Текст. / М.С. Черновьянц, И.В. Бурыкин // Изв. АН. Сер. хим. 2009. - №9. - С. 1716-1728.

33. Papayannis, D.K. Quantum mechanical investigation of the charge transfer molecular complexes of methimazole with I2, IBr and IC1 Текст. / D.K. Papayannis, A.M. Kosmas // J. Mol. Str. (Theochem). 2008. - V.851. - Is. 1-3. - P.175-182.

34. Aragoni, М.С. C.T. complexes and related compounds between S and Se containing donors and I2, Br2, IBr, IC1 Текст. / М.С. Aragoni, M. Area, F. Demartin [et al.] // Trends Inorg. Chem. 1999. - V.6. - P.l-18.

35. Aragoni, M.C. Charge-transfer adducts between donors containing chalcogens (S and Se) and di-iodine: solution studies Текст. / M.C. Aragoni, M. Area, F.A. Devillanova [et al.] // Coord. Chem. Rev. 1999. - V.184. - P.271-290.

36. Hadjikakou, S.K. Interaction of Thioamides, Selenoamides, and Amides With Diiodine Текст. / S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis // Bioinorg. Chem. Appl. -2006. Article ID 60291, P. 1-10.

37. Parigoridi, I.E. Structural motifs of diiodine complexes with amides and thioamides Текст. / I.E. Parigoridi, G.J. Corban, S.K. Hadjikakou [et al.] // Dalton Trans. 2008. V.2008. -No.38. -P.5159-5168.

38. Corban, G.J. Pressure-tuning raman spectra of diiodine thioamide compounds: models for antithyroid drug activity Текст. / G.J. Corban, C. Antoniadis, S.K. Hadjikakou [et al.] // Bioinorg. Chem. Appl. 2006. - Article ID 68542, P.l-5.

39. Boyle, P.D. The reactions of sulfur and selenium donor molecules with dihalogens and interhalogens Текст. / Boyle P.D., Godfrey S.M. // Coord. Chem. Rev. 2001. - V.223. - No.1. - P.265-299.

40. Nather, C. Investigation on the interaction between sp2-sulfur atoms and iodine molecules using the Cambridge Structural database Текст. / С. Nather, M. Bolte // Phosphorus, Sulfur and Silicon and Related Elements. 2003. -V.178. -No.3. -P.453-464.

41. Raczynska, E. D. Tautomeric Equilibria in Relation to Pi-Electron Derealization Текст. / E.D. Raczynska, W. Kosinska, B. Osmialowski [et. al.] // Chem. Rev. -2005 -V. 105. No. 10. -P.3561-3612.

42. Moran, D. 2-Pyridinethiol/2-Pyridinethione Tautomeric Equilibrium. A Comparative Experimental and Computational Study Текст. / D. Moran, K. Sukcharoephon, R. Puchta [et. al.] // J. Org. Chem. 2002. - V.67. -No.25. -P.9061-9069.

43. Van Bolhuis, F. Refinement of the crystal structure of iodine at 110° К Текст.

44. F. van Bolhuis, P.B. Kotter, T. Migchelsen // Acta Crystallogr. 1967. -V.23-P. 90-93.

45. Cooper, D.S. Antithyroid drugs Текст. / D.S. Cooper // N. Engl. J. Med.2005. V.352. - No.9. - P.905-917.t

46. Cristiani, F. UV-visible, IR, and С NMR studies on CT complexes between some thiohydantoins and molecular diiodine Текст. / F. Cristiani, F.A. Devillanova, A. Garau [et al.] // Heteroatom. Chem. 1994. - V.5. - P.65-69.

47. Esseffar, M. An experimental and theoretical study on some thiocarbonyl-I2 molecular complexes Текст. / M. Esseffar, W. Bouab, A. Lamsabhi [et al.] // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122 - P. 2300-2308.

48. Zhdankin, V.V. Chemistry of polyvalent iodine Текст. / V.V. Zhdankin, P J. Stang // Chem. Rev. 2008. - V.108. - No. 12. - P.5299-5368.

49. Stang, P.J. Organic Polyvalent Iodine Compounds Текст. / P.J. Stang, V.V. Zhdankin // Chem. Rev. 1996. - V.96. -No.3. P. 1123-1178.

50. Черновьянц M.C. Изучение взаимодействия 5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона с молекулярным иодом Текст. / М.С. Черновьянц, Н.В.Алешина, З.А. Старикова [и др.] // Изв. АН. Сер. хим., в печати.

51. Подгорная, М.С. Черновьянц, И.Н. Щербаков и др. // Журн. общ. химии 1999. - Т.69. - № 1. - С. 109-113.

52. Симонян С.С. Квантово-химическое изучение влияния сольватации на устойчивость дииодгалогенид-анионовТекст. / С.С. Симонян, М.С. Черновьянц // Журн. физ. химии 2005. - Т.79. -№11.- С.2014-2021.

53. Симонян, С.С. Квантово-химическое изучение устойчивости молекулярных комплексов иода с кластерными фрагментами растворителей Текст. / С.С. Симонян, М.С. Черновьянц, Е.О. Лыкова // Журн. физ. химии.-2005.-Т.79.-№ 10. С. 1814-1821.

54. Raby, C. The mechanism of action of synthetic antithyroid drugs: iodine complexation during oxidation of iodide Текст. / С. Raby, J.F. Lagorce, A.C. Jambut-Absil [et al.] // Endocrinology 1990. - V.l26. - No.3. - P. 16831691.

55. Lagorce, J.F. Spectroscopic analysis of iodinated molecular complexs of thiazole and thiazoline derivatives Текст. / J.F. Lagorce, J. Buxeraud, A.C. Jambut-Absil [et al.] //Heterocycles 1990. - V.31. -No.9. -P.1609-1615.

56. Devillanova, F.A. Charge transfer complexes between iodine and the thioamido entity contained in some pentaatomic rings Текст. / F.A. Devillanova, G. Verani // J. Heterocycl. Chem. 1979. - V.16. -P.945-948.

57. Berry, M.J. Selenocysteine confers the biochemical properties characteristic of the type I iodothyronine deiodinase Текст. / M.J. Berry, J.D. Kieffer, J.W. Harney [et al.] //J. Biol. Chem. 1991. -V.266. -No.22. - P. 14155-14158.

58. Kusmierek, K. Determination of endogenous thiols and thiol drugs in urine by HPLC with ultraviolet detection Текст. / К. Kusmierek, G. Chwatko, R. Glowacki [et al.] // J. Chromatogr. B. 2009. - V.877. Is.28. - P.3300-3308.

59. Zou, Q.H. A rapid method for determination and confirmation of the thyreostats in milk and urine by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass spectrometry Текст. / Q.H. Zou, Y. Liu, M.X. Xie // Anal. Chim. Acta -2005.-V.551, 184-191.

60. Hollosi, L. MMSPE-RP-HPLC method for the simultaneous determination of methimazole and selected metabolites in fish homogenates Текст. / L. Hollosi, A. Kettrup, K.-W. Schramm // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. -V.36. - Is.4. - P.921-924.

61. Zhang, L. Simultaneous determination of thyreostatic residues in animal tissues by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass spectrometry Текст. / L. Zhang, Y. Liu, M.X. Xie [et al.] // J. Chromatogr. A. 2005. -V. 1074.-Is. 1-2.-P. 1-7.

62. Sanchez-Pedreno, С. Flow-injection spectrophotometric determination of carbimazole and methimazole Текст. / С. Sanchez-Pedreno, M.I. Albero, M. S. Garcia [et al.] // Anal. Chim. Acta. 1995. - V.308. - Is. 1-3. -P. 457-461.

63. Batjoens, P. Rapid and high-performance analysis of thyreostatic drug residues in urine using gas chromatography-mass spectrometry Текст. / P. Batjoens, K. De Wasch, H.F. Be Brabander // J. Chromatogr. A 1996. - V.750. - Is.l-2. - P.127-132.

64. Buick, R.K. Determination of thyreostat residues from bovine matrixes using high-performance liquid chromatography Текст. / R.K. Buick, C. Barry, I.M. Traynor [et al.] // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1998. - V.720. -Is.1-2. - P.71-79.

65. Wang Z. Determination of thiamazole in human plasma by a rapid HPLC method Текст. / Z. Wang, L.-M. Zhang, Z.-W. Yang [et al.] // Yaoxue Fuwu Yu Yanjiu 2002. - V.2. - Is.2. - P.92-93.

66. Moretti, G. Determination of thyreostatic residues in cattle plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection G. Moretti, R. Betto, P. Cammarata et al. // J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1993. - V.616. -Is.2.-P. 291-296.

67. Escarpenter, C.F. Analysis of thyrostatics in the thyroid glands by thin, layer chromatography and HPLC-UV Текст. / F.C. Escarpenter, D.R. Hernandez // Anales de Bromatologia 1990. - V.42. - Is.2. - P.337-344.

68. Akimasa, O. An improved method for plasma methimazole assay and its clinical application Текст. / О. Akimasa, Y. Kohichi, I. Fumie [et al.] // Nippon Naibunpi Gakkai Zasshi 1984. - V.60. - No.8. - P.985-994.

69. Meulemans, A. Determination of methimazole in plasma by high-performance liquid chromatography Текст. / A. Meulemans, C. Manuel, C. Ferriere [et al.] // J. Liq. Chromatogr. 1980. - V.3. - Is.2. - P.287-298.

70. Skellern, G.G. Improved method for the determination of methimazole in plasma by high-performance liquid chromatography Текст. / G.G. Skellern, B.I. Knight, J.B. Stenlake // J. Chromatogr. 1976. - V.124. - Is.2. - P.405-410.

71. Черновьянц, M.C. ВЭЖХ разделение и количественное определение препаратов антитиреоидного действия Текст. / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, Е.В. Хохлов // Журнал аналитической химии 2009. - Т.64. — №8.-С. 850-853.

72. Ku'smierek, К. Determination of methimazole in urine by liquid chromatography Текст. / К. Ku'smierek, E. Bald // Talanta 2007. - V.71. -P. 2121-2125.

73. Floberg, S. Determination of methimazole in plasma using gas chromatography-mass spectrometry after extractive alkylation Текст. / S. Floberg, K. Lanbeck, B. Lindstroem // J. Chromatogr. 1980. - V.182. - Is.l. -P. 63-70.

74. Bending, M. R. Measurement of methimazole in human plasma using gas-liquid chromatography Текст. / M. R. Bending, D. Stevenson // J. Chromatogr. 1978. - V.154. -Is.2. -P.267-271.

75. Duarte, C.G. Optimization of HPLC analysis for the determination of propylthiouracil levels in plasma and serum Текст. / C.G. Duarte, A.C. M. Polizello, A.I. Assis-Pandochi [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. -V.23. - Is.l. - P.237-241.

76. Rosseel, M.T. High-performance liquid chromatographic determination of prophylthiouracil in plasma Текст. / M.T. Rosseel, R.A. Lefebvre // J. Chromatogr. A 1990. - V.507. -P.247-251.

77. Cannell, G.R. Selective liquid chromatographic assay for propylthiouracil in plasma Текст. / G.R. Cannell, J.P. Williams, A.S. Yap [et al.] // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1991. -V.564. - Is.l. -P.310-314.

78. Esteve-Romero, J. Determination of thyreostatics in animal feed by micellar electrokinetic chromatography Текст. / J. Esteve-Romero, I. Escrig-Tena, E.F. Simo-Alfonso, [et al.] // Analyst (Cambridge, United Kingdom) 1999. -V.124. — Is.2. -P.125-128.

79. Perrett, D. Capillary electrophoresis in clinical chemistry Текст. / D. Perrett //Ann. Clin. Biochem. 1999. -V.36. -Is.2. -P.133-150.

80. Mardis, E.R. Capillary electrophoresis platforms for DNA sequence analysis Текст. / E.R. Mardis // J. Biomolec. Techn. 1999. - V.10. -No.3. - P.137-143.

81. Britz-McKibbin, P. Focusing of catecholamines and weakly acidic analytes in capillary electrophoresis using a dynamic pH junction selective Текст. / P. Britz-McKibbin, D.D.Y. Chen // Anal. Chem. 2000. - V.72. - No.6. -P.1242-1252.

82. Zhou, IT. DNA sequencing up to 1300 bases in two hours by capillary electrophoresis with mixed replaceable linear polyacrylamide solutions Текст. / H. Zhou, A.W. Miller, Z. Sosic, [et al.] // Anal. Chem. 2000. -V.72. -No.5. -P.1045-1052.

83. Gtibitz, G. Recent progress in chiral separation principles in capillary electrophoresis Текст. / G. Giibitz, M.G. Schmid // Electrophoresis 2000. -V.21.-No.l8.-P.4112-4135.

84. Рожнова С.А. Использование метода капиллярного электрофореза для изучения фармакокинетики амлодипина безилата Текст. / С.А. Рожнова, М.В. Гаврилин, С.П. Сенченко [и др.] // Хим.-фарм. журн. 2007. - Т.41. -№8. -Р.46-48.

85. Комарова Н.В., Каменцев Я.С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза. Текст. СПб: «Капель», Веда. 2006.

86. Морзунова Т.Г. Капиллярный электрофорез в фармацевтическом анализе (обзор) / Т.Г. Морзунова // Хим.-фарм. журн. 2006. - Т.40. -№3. -Р.39-52.

87. Черновьянц, М.С. Электрофоретическое определение 1-метил-2-меркаптоимидазола в препарате «Мерказолил». Текст. / М.С. Черновьянц, Е.О. Лыкова, Е.В. Хохлов [и др.] // Журнал аналитической химии 2007. - Т. 62. - № 3. - С. 295-298.

88. Государственная фармакопея СССР Текст. // 10-е изд. М.: Медицина, 1968. С.410.

89. Черновьянц, М.С. Хроматографическое определение 6-замещенных 2-тиоурацилов, препаратов тиреостатического действия Текст. / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, И.В. Браславская // Журнал аналитической химии. 2008. - Т.63. - №9. - С.930-934.

90. Kim, К. Analysis of 2-mercapro-l-methylimidazole in controlling drug of thyroid by differential pulse polarography Текст. / К. Kim, H.J. Chun, S.S. Han // J. Korean Chem. Soc. 2004. - V.48. - Is.2. - P. 137-143.

91. Lim, S.H. Determination of 2-mercapto-l-methyl-imidazole in antithyroid drug by differential pulse polarography Текст. / К. Kim, H.J. Chun, S.H. Lim // Anal. Sci. Tech. 1995. - V.8. - Is. 1. - P. 17-23.

92. Arzamastsev, A.P. Anodic polarography for the determination of mercazolyl in bulk and formulations Текст. / A.P. Arzamastsev, N.B. Grigoryev, S.K. Ordabayeva, [et al.] // Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal 1992. - V.26. -Is.9-10. - P.126-127.

93. Lebedeva, M. I. Determination of mercazolyl by a polarographic method Текст. / M. I. Lebedeva, R. V. Borisova, В. I. Isaeva [et al.] // Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal 1979. - V.13. — Is.l2. -P.89-91.

94. Zbigniew, F. Determination of imidazole-derived drugs in pharmaceutical formulations by electrochemical methods. II. Methimazole and carbimazole Текст. / F. Zbigniew, W. Malgorzata // Acta Pol. Pharm. 1991. - V.48. -Is.3-4. -P.23-26.

95. Zbigniew, F. Determination of methimazole and carbimazole using polarography and voltammetry Текст. / Z. Fijalek, P. Zuman // Anal. Lett. -1990. V.23. - Is.7. - P. 1213-1223.

96. Katarzyna, S. Voltammetric and electrochemical quartz crystal microbalance study of antithyroid drugs Текст. / S. Katarzyna, F. Zbigniew // Chemia Analityczna — 1997. V.42. -Is.3. -P.425-433.

97. Lopez, J. M. // J. M. Lopez, P.C. Gonzalez // Chem. Abstr. 1981, V.95, 175874b.

98. Ma Soledad, G. Kinetic determination of carbimazole, methimazole and propylthiouracil in pharmaceuticals, animal feed and animal livers Текст. / G. Ma Soledad, A. Ma Isabel, C. Sanchez-Pedreno // Analyst 1995. - V.120. -Is.l. -P.129-133.

99. Jovanovic, T. Spectrophotometric determination of thiamazole (methimazole) in water and pharmaceutical dosage form Текст. / Т. Jovanovic, В. Stankovic, Z. Koricanac // Pharmazie 1992. - V.47. - Is. 10. - P.798-799.

100. Ciesielski, W. Spectrophotometric determination of methylthiouracil and 1-methyl-2-thioimidazole with the induced iodine-azide reaction Текст. / W. Ciesielski // Acta Pol. Pharm. 1987. - V.44. - Is.2. - P.202-205.

101. Ciesielski, W. Determination of carbimazole with the use of iodine-azide reaction Текст. / W. Ciesielski, M. Skowron, R.Zakrzewski // Chem. Anal. (Warsaw) 2001. - V.46. - P.873-875.

102. Zakrzewski, R. Detection of heterocyclic tiols in planar chromatography with iodine-azide reaction as a detection system Текст. / R. Zakrzewski, W. Ciesielski // JPC-J. Planar Chromatogr. 2006. - V.19. - P.4-10.

103. Kurzawa, J. Stopped-flow determination of 2-mercaptopyrimidines as inductors of the iodine-azide reaction Текст. / J. Kurzawa, A. Wisniewska, K. Janowicz // Anal. Chim. Acta 2006. - V.567. - Is.2. - P. 286-292.

104. Zakrzewski, R. Determination of methimazole in urine with iodine-azide detection system following it separation by reversed-phase HPLC Текст. / R. Zakrzewski // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 2008. - V.869. - Is. 1-2. -P.67-74.

105. Zakrzewski, R. High-performance liquid chromatographic determination of propylthiouracil in human urine by post-column iodine-azide reaction Текст. / R. Zakrzewski // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 2008. - V.48. -Is.l. -P.145-150.

106. Патент СССР 83-3611223 (1984).

107. Gallo, N. Interaction of methimazole and quinones. Spectrophotometric determination of methimazole in plasma Текст. / N. Gallo, P. Bianco, R. Tapino [et al.] //Minerva Medica- 1983.-V.74. Is.16.-P.875-877.

108. Biedris, I. Method for determining mercazolyl in blood Текст. /1. Biedris, V. Rudzitis // Klin. Paraklin. Paralleli Izuch. Soedin. Tkani. 1981. - P.4-7.

109. Gatti, R. Colorimetric assay for methimazole in tablet formulations using the 2,6-dichloroquinone chloroimide reagent Текст. / R. Gatti, V. Cavrini, B. Balboni [et al.] // Farmaco Edizione Pratica- 1985. V.40. - Is.3. - P.71-76.

110. Jaksevac-Miksa, M. Spectrophotometric determination of thiamazole with ammine- and nitrosyl-pentacyanoferrate(II) ions Текст. / M. Jaksevac-Miksa, V. Honkonyi, V. Karas-Gasparec // Acta Pharm. Jugoslavica 1979. - V.29. -Is.2 -P.91-96.

111. Aslanoglu, M. Potentiometric and voltammetric determination of methimazole Текст. / M. Aslanoglu, N. Peker // J. Pharm. Biomed. Anal. -2003. V.33. - Is.5. - P. 1143-1147.

112. Zhao, Y. Analysis of sulfa drugs by oscilloscopic potentiometric titration Текст. / Y. Zhao, S. Zhang // Lihua Jianyan, Huaxue Fence. 1994. - V.30. -Is.6. -P.353-355.

113. Berka, A. Conductometric determination of methimazole Текст. / A. Berka, K. Velasevic, K. Nikolic // Pharmazie 1989. - V.44. - Is.7. - P.499-499.

114. Nikolic, K. Determination of methimazole Текст. // К. Nikolic, К. Velasevic // Pharmazie 1987. - V.42. - Is. 10. - P.698-700.

115. Бажина Л.М., Кудинов Г.И., Камельянова Г.А. (ВИНИТИ 1415-83) (1983).

116. Алиев, А. М. Количественное определение мерказолила меркуриметрическим титрованием Текст. / A.M. Алиев, Б.М. Гусейнов // Фармация 1983 - №5. - С.80-82.

117. Pinzauti, S. Potentiometric titration of thiols, cationic surfactants and halides using a solid-state silver-silver sulfide electrode Текст. / S. Pinzauti, G. Papeschi, E. La Porta // J. Pharm. Biomed. Anal. 1983. - V.l. - Is.l. - P.47-53.

118. Гейн, Л.Г. Потенциометрическое определение меркаптопурина и мерказолила в таблетках Текст. / Л.Г. Гейн, В.К. Рубцов, З.А. Сумбайкина // Фармация. 1975. - №3. - С.70-73.

119. Aboul-Enein, Н. Y. Conductimetric determination of methimazole Текст. / H. Y. Aboul-Enein, H. M. El-Fatatry, Е. A. Lotfi // Pharmazie 1980. - V.35.- Is.10. P.604-605.

120. Przyborowski, L. W.Cupric ion-selective electrode for the potentiometric determination of drugs Текст. / L. W. Przyborowski // Ion-Sel. Electrodes, Conf. 1978. Meeting Date 1977. P.519-522.

121. Ciesielski, W. Potentiometric and coulometric titration of 6-propyl-2-thiouracil Текст. / W. Ciesielski, R. Zakrzewski // Analyst 1997. - V.l22.- Is. 10. — P.491-494.

122. Ciesielski, W. Potentiometric titration of 2-thiouracils Текст. / W. Ciesielski, R. Zakrzewski // Arch. Pharm. 1998. - V.331. - P.371-372.

123. Ciesielski, W. Iodimetric determination of 2-mercaptopyrimidines Текст. / W. Ciesielski, R. Zakrzewski, A. Krenc, [et al.] // Talanta 1998. - V.47. -P.745-752.

124. Ciesielski, W. Iodimetric determination of 2-mercaptopyridines Текст. / W. Ciesielski, R. Zakrzewski // Chem. Anal. 1999. - V.44. - P.1055-1058.

125. Ciesielski, W. Iodimetric determination of 2-thiouracils Текст. / W. Ciesielski, R. Zakrzewski // Chem. Anal. 2000. - V.45. - P. 135-144.

126. Ciesielski, W. Potentiometric and coulometric determination of carbimazole Текст. / W. Ciesielski, A. Krenc // Anal. Lett. 2000. - V.33. - Is.8. -P.1545-1552.

127. Гордон, А. Спутник химика Текст. / А. Гордон, P. Форд. M.: Мир. -1976.-541 с.

128. Коростелев, П.П. Приготовление растворов для химико-аналитических работ Текст. / П.П. Коростелев. М.: Изд-во АН СССР. - 1962. - 312 с.

129. Лурье, Ю.Ю. Справочник по аналитической химии Текст. / Ю.Ю. Лурье. М.: Химия. - 1979. - 480 с.

130. Коган Ю.Д. Современное отечественное оборудование для тонкослойной хроматографии (ТСХ) Текст. / Ю.Д. Коган // Журнал аналитической химии 1999. - Т.54. - №10. - С. 1102-1106.

131. Беллами, Л. Инфракрасные спектры сложных молекул Текст. / Л. Беллами.-М.: ИЛ. 1957.

132. Дерффель, К. Статистика в аналитической химии Текст. / К. Дерффель. -М.: Мир.- 1994.-268 с.

133. Yang, F. Effect of human serum albumin on drug metabolism: Structural evidence of esterase activity of human serum albumin Текст. / F. Yang, C. Bian, L. Zhu, [et al.] // J. Structural Biology 2007. - V.157. - P.348-355.

134. Peters, J.T. All about albumin: biochemistry, genetics and medical applications Текст. / San Diego: Academic Press, 1996. P.432.

135. Bourassa, P. Resveratrol, genistein, and curcumin bind bovine serum albumin Текст. / P. Bourassa, C.D. Kanakis, P. Tarantilis, [et al.] // J. Phys. Chem. B. 2010. - V.l 14. - Is.9. - P.3348-3354.

136. Carter, D.C. Structure of serum albumin Текст. / D.C. Carter, J.X. Ho // Adv Protein Chem. 1994. - V.45 - P. 152-203.