Хроматографическое и спектрофотометрическое определение тиоамидов на основе азолов и анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом

Алешина, Наталия Владимировна

Хроматографическое и спектрофотометрическое определение тиоамидов на основе азолов и анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Алешина, Наталия Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Краснодар МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Хроматографическое и спектрофотометрическое определение тиоамидов на основе азолов и анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом»

Автореферат диссертации на тему "Хроматографическое и спектрофотометрическое определение тиоамидов на основе азолов и анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом"

На правах рукописи

•V

Алешина Наталия Владимировна

Хроматографическое и спектрофотометрическое определение ткоамкдов на основе азолов п анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005046406

Краснодар - 2012

005046406

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Черновьянц Маргарита Сергеевна

Рувинский Овсей Евелевич, доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО "Кубанский

государственный технологический университет" (г. Краснодар), профессор

Мусорина Татьяна Николаевна, кандидат химических наук,

ФГБОУ

ВПО

"Кубанский

государственный университет" (г. Краснодар), старший сотрудник

научный

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Пятигорская

государственная фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России» (г. Пятигорск)

Защита диссертации состоится «22» мая 2012 г. в 14 часов в аудитории 231 на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 при Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный университет" по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.

Автореферат разослан 20 апреля 2012 г.

Ученый секретарь ^/ШсМ

диссертационного совета v ' Киселева Наталия Владимировна

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Получение и исследование свойств новых биологически активных соединений во многом зависит от уровня развития и достижений современной аналитической химии. Гетероароматические тиоамиды, синтетические органические вещества, способные участвовать в перехвате свободных радикалов благодаря наличию атома серы, а также биохимических редокс-процессах с участием иода, вызывают значительный практический интерес у специалистов-фармацевтов.

Специфические особенности антитиреоидной активности тиоамидов зависят от термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Весьма актуальной задачей в этой связи представляется выявление корреляционной зависимости между структурой гетероароматических тиоамидов и их реакционной способностью по отношению к молекулярному иоду в полярных и неполярных средах. Представляет значительный интерес изучение протолитических свойств тиоамидов, а также оценка параметров связывания препаратов с транспортными белками плазмы крови, которые определяют фармакологическую активность лекарственных препаратов и во многом влияют на их распределение в организме. Малоизученными являются вопросы оценки антиоксидантной активности гетероароматических тиоамидов, тиреостатиков, взаимодействующих в организме с активными формами иода.

Среди методов определения биологически активных тиоамидов в лекарственных формах и биообъектах лидирующие позиции занимают методы хроматографии, особенно в сочетании с масс-спектрометрическим методом детектирования. Существующие на сегодняшний день аналитические методики определения этих веществ характеризуются весьма сложными способами пробоподготовки, включают предварительную экстракцию и дериватизацию. Поскольку большинство антитиреоидных препаратов при физиологических условиях существуют частично в биологически активной - ионной форме, то существует потребность в разработке простых в исполнении, высокочувствительных и экспрессных электрофоретических методик разделения и анализа, применимых для мониторинга лекарственных препаратов и биообъектов.

Цель работы заключалась в изучении физико-химических свойств гетероароматических тиоамидов с использованием зависимости «структура -свойство - антитиреоидная активность in vitro» и разработке на их основе комплекса методик идентификации и определения тиреостатиков - тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- сравнительная оценка электронодонорной способности гетероциклических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола по отношению к молекулярному иоду и определение констант устойчивости образующихся п-о*-аддуктов в неполярной среде (хлороформе);

- исследование структуры, состава и свойств продуктов реакции взаимодействия препаратов с молекулярным иодом в полярной и неполярной средах;

- оценка протолитических свойств и констант протолитических равновесий исследуемых соединений;

- изучение взаимодействия препаратов с белком-переносчиком (бычьим сывороточным альбумином) и расчет параметров связывания (числа связывающих сайтов и константы ассоциации);

- изучение антиоксидантной активности гетероциклических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола, оценка порядка и константы скорости реакции взаимодействия с хромоген-радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом, разработка методики кинетического определения препаратов;

идентификация гетероароматических соединений, основанная на зависимости их хроматографической и электрофоретической подвижности (методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонного электрофореза) и спектроскопических характеристик (методами УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектрометрии) от природы гетероцикла;

- разработка методик определения препаратов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

Научная новизна.

- Установлена взаимосвязь между структурой гетероароматических тиоамидов, их способностью формировать аддукты с иодом л-а*-типа в неполярных средах и восстановительными свойствами по отношению к молекулярному иоду в водно-этанольных растворах;

- изучены протолитические свойства тиоамидов (рКа и рКвн.), установлена взаимосвязь между структурой тиоамидов и их протолитическими свойствами;

- изучены молекулярные и кристаллические структуры продуктов взаимодействия препаратов (5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона в хлороформе и 1,2,4-триазолин-З-тиона и 1-метилтетразолин-5-тиона в этанольном растворе) с элементным иодом;

- изучена антиоксидантная активность гетероароматических тиоамидов, определены порядок и константа скорости реакции взаимодействия соединений с хромоген-радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом. Разработана высокочувствительная методика определения тиоамидов кинетическим методом;

- исследовано связывание препаратов in vitro с белком-переносчиком (бычьим сывороточным альбумином) методом гашения флуоресценции, определены константы ассоциации молекул тиоамидов с белком, и сделано предположение о природе связывающих сайтов в молекуле белка;

- установлены оптимальные условия идентификации, разделения и спектроскопического, хроматографического и электромиграционного определения гетероароматических тиоамидов.

Практическая значимость.

На основе современных методов физико-химического анализа разработаны условия идентификации, разделения и определения ряда гетероароматических тиоамидов, которые могут быть применены при биофармакологическом анализе и мониторинге биообъектов.

Выявлена зависимость антиоксидантной активности тиоамидов от природы гетероцикла и полярности растворителя. Разработана спектрофотометрическая методика кинетического определения тиоамидов в этанольных растворах, характеризующаяся высокой чувствительностью, хорошей прецизионностью и правильностью результатов.

Методом рентгеновского дифракционного анализа установлены кристаллические и молекулярные структуры продуктов взаимодействия препаратов: 5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона в хлороформе и 1,2,4-триазолин-З-тиона и 1-метилтетразолин-5-тиона в этанольном растворе с элементным иодом.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты спектроскопических и потенциометрических исследований взаимодействия гетероароматических тиоамидов - производных тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола - с молекулярным иодом в различных средах. Данные по установлению влияния структуры тиоамидов на устойчивость их п-о*-комплексов с иодом в хлороформных растворах и восстановительную активность в водно-спиртовых растворах.

2. Данные по оценке влияния структуры тиоамидов на их протолитические свойства.

3. Результаты исследования равновесий и оценка констант ассоциации тиреостатических препаратов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола с транспортным белком альбумином методом гашения флуоресценции.

4. Результаты исследования кристаллических и молекулярных структур соли пентаиодида бис(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-илтио)иодония и дисульфидов - 3,3'-дитиобис(1Н, 2, 4-триазола) и 5,5'-дитиобис(1-метил-1Н-тетразола) - продуктов взаимодействия тиоамидов с элементным иодом.

5. Комплекс разработанных спектроскопических (ИК-, УФ-, ЯМР-, масс-спектрометрия) и хроматографических (ВЭЖХ, КЗЭ) методик идентификации и определения гетероароматических тиоамидов.

6. Результаты исследования антиоксидантной активности тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола и методика их кинетического определения.

7. Практическое применение методики ВЭЖХ-УФ определения тиреостатика тиазолидин-2-тиона в моче здорового человека.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2009" (Йошкар-Ола, 2009 г.), IV Международной научно-практической конференции "Наука и современность" (Новосибирск, 2010 г.), Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010 г.), Всероссийской очно-заочной конференции "Современные проблемы естествознания" (Чебоксары, 2011 г.), XXI Российской молодежной научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Екатеринбург, 2011 г.), VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2011" (Архангельск, 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ в виде 4 статей, которые входят в список журналов, рекомендованных ВАК, материалов докладов и конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа выполнена на 126 страницах машинописного текста, включающего 35 рисунков, 47 таблиц и библиографию из 127 наименований.

Основное содержание работы

Обзор литературы

Аналитический обзор состоит из двух разделов, посвященных структурной и аналитической химии гетероароматических тиоамидов - лекарственных препаратов тиреостатического действия. В первом разделе обобщены структурные исследования продуктов взаимодействия препаратов антитиреоидного действия (гетероароматических тиоамидов) с иодом. Показано (в основном по данным рентгеноструктурного анализа и Рамановской спектроскопии), что структурные параметры молекулярных комплексов зависят от типа гетероатома и характера заместителя в гетерокольце. Приведена модель ингибирующего действия препаратов-тиреостатиков на биосинтез гормонов щитовидной железы.

Во втором разделе представлены широко применяемые в фармацевтической и клинической практике методы идентификации и определения препаратов тиреостатического действия. На основе анализа приведенных в научной литературе данных сформулированы задачи для достижения поставленной в работе цели.

Объекты исследования

В работе исследовались традиционно используемые препараты и потенциальные тиреостатики - гетероароматические тиоамиды: 1-Н: производные тиазола

№ Я Название соединения

I Н тиазолин-2-тион

II с6н5 4-фенилтиазолин-2-тион

III: производное тиазолина

/—N Н тиазолидин-2-тион

1У-У: производные 1,3.4-тиадиазола

ы-ын

У1-УП: производные 1,2,4-триазола

ы-ын

№ Я Название соединения

IV н 1,3,4-тиадиазолин-2-тион

V СНз 5-метил- 1,3,4-тиадиазолин-2-

тион

№ И. Название соединения

VI Н 1,2,4-триазолин-З-тион

VII СНз 4-метил-1,2,4-триазолин-З-тион

VIII: производное тетразола

N-N11 1-метилтетразолин-5-тион

к ь

СНз

Исследование взаимодействия гетероароматических тиоамндов с иодом в малополярных средах

Реакция между гетероароматическими тиоамидами и иодом в малополярных растворителях приводит к образованию п-о* аддуктов, в основном состава 1:1, посредством донирования электронной плотности с ВЗМО тиоамида на НСМО молекулы иода.

В системе тиоамид - элементарный иод в хлороформе спектрофотометрическим методом сдвига равновесия исследовано образование молекулярных комплексов тиоамид-12. Константы устойчивости молекулярных аддуктов (/3) и количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида, рассчитывали с использованием функции «среднеиодное число» (/7, ), характеризующей количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида. Равновесная концентрация иода [/2] рассчитывалась из оптической плотности в максимуме полосы поглощения иода (510 нм) по уравнению 1Л] = Л/(£-0, где е - молярный коэффициент светопоглощения молекулярного иода; I - толщина поглощающего слоя. Для каждой равновесной концентрации иода определено соответственное значение функции п,г по уравнению

>»2 =((?2 -ЩУО,, где С0 - общая концентрация тиоамида. Если значения среднеиодного числа находятся в пределах 0<л, <1, то расчет констант устойчивости выполняется по формуле п,,/(1-п,,) = р-[1г]. Установлено, что в малополярной среде (хлороформе) исследуемые тиоамиды взаимодействуют с элементарным иодом, образуя молекулярные аддукты в соотношении 1:1, константы устойчивости которых представлены в логарифмических единицах в табл. 1.

Таблица 1

Результаты спектрофотометрического определения констант устойчивости

ст-комплексов тиоамидов (1-У1Н) с молекулярным иодом в хлороформе

производные производное производные 1,3,4-тиадиазола производные 1,2,4-триазола производное

тиазола тиазолина тетразола

I II III IV V VI VII VIII

№ 2.90 2.87 3.66 2.60 3.09 2.56 3.16 3.87

Поскольку производные тиазола, тиазолина, 1,3,4-тиадиазола, 1.2,4-триазола и тетразола образуют малоустойчивые комплексы с молекулярным иодом, их тиреостатическое действие в организме, возможно, связано с ингибированием селенсодержащего энзима - иодтирониндеиодиназы (ГО-5еН), ответственного за превращение прогормона Т4 в гормон Т3.

Исследование молекулярных н кристаллических структур продуктов взаимодействия исследуемых тиоамидов с иодом

Помимо исследований продуктов взаимодействия гетероароматических тиоамидов с молекулярным иодом в растворе нами выделялись эти соединения с

целью их идентификации. Исследования проводились методом рентгеноструктурного анализа. Кристаллическая структура продукта взаимодействия тиона (V) с молекулярным иодом, полученного в хлороформном растворе при молярном соотношении тиона и иода 1:2, образована иодониевыми катионами (С3ІІ4^82)2І+ и пентаиодид-анионами І5" (рис. 1), объединенными в цепочки, вытянутые вдоль оси с, межмолекулярными водородными связями Ы(4)...Н^(Г) и 1(1)...Н-Ы(3') (рис. 2).

Рисунок 2 - Цепочки молекул, объединенные за счет водородных связей; расстояния Ы(4)...Н-Т*Г(Г) 2.16 А, 1(1)...¡[-N(3') 2.74А

Характерной особенностью кристаллического соединения является образование сдвоенных цепочек за счет различных диполь-дипольных взаимодействий между атомами иода и серы. Сдвоенные цепочки объединяются в слои, параллельные плоскости ас (рис. 3), в которых реализуется большое количество контактов иод-сера и сера-сера; кратчайшие контакты: 1(2)...8(1') (3.846(2)А) и 8(4)...8(4') (3.645(2)А).

Рисунок 3 - Образование слоев за счет контактов иод...иод и иод...сера; показаны кратчайшие контакты 8...8 и 1...8

Кристаллы 3,3'-Дитиобис(1Н,2,4-триазола) получены смешением этанольных растворов 1,2,4-триазолин-З-тиона и молекулярного иода в молярном соотношении 1:1с последующим медленным выпариванием растворителя на воздухе. Молекулы 3,3'-Дитиобис(1Н-триазола) соединяются в бесконечные цепи посредством N(2)11...N(30) взаимодействий атомов азота триазольных колец (атом пиррольного типа действует как донор водородной связи) (рис. 4). Цепи молекул формируют слои посредством диполь-дипольных взаимодействий 8...М(1) (3.190(1) А).

Рисунок 4 - Структура соединения С4[14^82

Добавочные взаимодействия N(2)11...N(38) и 5..ЛЧ(1) способствуют дальнейшей стабилизации структуры. Кристаллическая упаковка слоев, параллельных плоскости 011, показана на рис. 5.

Рисунок 5 - Кристаллическая упаковка слоев, параллельных плоскости 011

5,5'-Дитиобис(1-метил-1Н-тетразол) синтезирован смешением этанольных растворов 1-метилтетразолин-5-тиона и иода в молярном соотношении 1:1. Молекулярная структура 5,5-дитиобис(1-метил-1Н-тетразола) показана на рис. 6.

Рисунок 6 - Структура соединения C4H6N8S2

В кристаллической упаковке наблюдаются сильное взаимодействие между S(l) и N(3'), межатомное расстояние (3.0179(17) А) на 0.33 А короче, чем сумма ван-дер-Ваальсовых радиусов. Это самый короткий межмолекулярный контакт

между гетероциклическим атомом азота и ациклическим дисульфидным атомом серы, зарегистрированный в Кембриджской структурной базе данных.

Соединенные по принципу "голова к хвосту" молекулы дисульфида формируют бесконечные одномерные зигзагообразные цепочки, которые протянуты вдоль оси кристалла Ь, как показано на рис. 7. Эти цепочки формируются вследствие взаимодействий, в которые включается лишь один из двух тетразольных фрагментов, представленных в молекуле (с атомами S(l) и

С(1».

Бесконечные одномерные супрамолекулярные цепочки образуют двухмерный слой (который параллелен 011 плоскости) путем взаимодействий, в которых участвует "второй" тиотетразольный фрагмент (с S(2) и С(3) атомами). Взаимодействие между бесконечными цепочками довершается п-п стэкинговыми взаимодействиями (рис. 7).

Рисунок 7 - Супрамолекулярные взаимодействия в кристаллической структуре С4Н6Ы882 (атомы водорода пропущены для ясности рисунка). Коды симметрии: (¡) 1-х,-1/2+у,1/2-г; (И) 1-х, 1/2+у, 1/2-г; (ш) 1-х,2-у,-г

Потенциометрическое (иодиметрическое) определение тноамидов

Адиабатические потенциалы ионизации молекул тиолов (тионов) достаточно низкие, это обусловливает легкость их окисления с образованием тиильных радикалов в результате потери атома водорода. Реакция окисления особенно быстро протекает в полярных растворителях. Тиильные радикалы димеризуются с образованием дисульфидов: 08-+-8П)-,0550. Для определения тиоамидов в водно-этанольном растворе 1:1 нами было применено обратное потенциометрическое титрование. Точку эквивалентности фиксировали иономером «ЭВ-74» в режиме вольтметра и визуально по обесцвечиванию титруемого раствора. Степень

V ■ С - V ■ с

протекания реакции (со) определяли по формуле ю = ——--л'"'л"'0'—-юо%,

1000-V,)

где у0 - количество тиоамида, моль; V, - объем добавленного раствора иода, мл; С,г - концентрация стандартного раствора иода, моль-экв/л; ^ - объем раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование, мл; СКа5Л- концентрация стандартного раствора тиосульфата натрия, моль-экв/л.

Таблица 2

Результаты потенциометрического (иодиметрического) титрования тиоамидов _I-VIII в водно-этанольной среде (1:1 об.)__

производные тиазола производное тиазолина производные 1,3,4-тиадиазола производные 1,2,4-триазола производное тетразола

I II III IV V VI VII VIII

со, % 72±1.0 100±1.5 80±1.1 88±1.3 94±1.2 90±1.4 85±1.0 118±1.6

Из полученных результатов можно заключить, что соединения II, V и VI могут быть количественно определены методом иодиметрического титрования (табл. 2), а 1-метилтетразолин-5-тион (VIII) подвергается многоэлектронному окислению с образованием сульфоксидов за счет высокой реакционной способности по отношению к активным формам кислорода.

Протолитическне свойства тиоамидов

Знание протолитических свойств необходимо как для аналитического изучения сложных равновесных систем (экстракции, комплексообразования и др.), так и для комплексного исследования молекул биологически активных соединений. Процессы всасывания, распределения, метаболизма и экскреции лекарственных препаратов зависят от протолитических свойств. Кроме того, для подбора оптимальных условий идентификации и количественного определения требуется знание констант протолитических равновесий.

Исследуемые тиоамиды являются амфолитами, и их протолитическне свойства количественно характеризуются константами кислотности рКа и основности (протонирования) рКт.. Нами определены протолитическне свойства тиоамидов (1-УШ) потенциометрическим титрованием 0.100 ммоль тиоамида (или его сопряженной кислоты) раствором ЫаОН. Постоянную ионную силу (ц=0.050) поддерживали добавлением к исходному раствору КС1. Значение рН фиксировалось рН-метром «рН-150М». Расчет констант протолитического равновесия исследуемых соединений проводили методом наименьших квадратов , - . О-а)Ск-[Н*] + [ОН~]

(табл. 3) по уравнению Ш--= рКа-рН,, где Ск -

аСя+[И \-\UH ]

аналитическая концентрация титруемого вещества с учетом разбавления в процессе титрования (моль/л); а - степень оттитрованности, рассчитанная по формуле а = С„аОН УЫаОН / V, где Сцаон и Уы„оп - концентрация (моль/л) и объем (мл) раствора №ОН, и - количество тиоамида (ммоль).

Таблица 3

Значения констант протолитических равновесий тиоамидов I-VIII в водно_этанольной среде (1:1 об.), //=0.050 (КС1)_

I II III IV V VI VII VIII

8.50 7.69 >12* 5.69 6.03 7.86 8.88 4.04

РКвн- 2.83 * 2.74 2.78 2.21 2.74 2.71 *

- Точное потенциометрическое определение рКа{Ш) и рКВ11.(II, VIII) невозможно в значениях шкалы pH

Исследование связывания тиоамидов с бычьим сывороточным альбумином

Распределение лекарственных препаратов в организме зависит от степени их ассоциации с белками-переносчиками плазмы крови. Нами определены константы связывания потенциальных тиреостатиков - 2-меркаптотиазола (I), 2-меркапто-4-фенилтиазола (II), 2-меркаптотиазолина (III), 2-меркапто-1,3,4-тиадиазола (IV), 2-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазола (V) - с транспортным протеином, а также число связывающих сайтов молекулы белка методом гашения флуоресценции. В качестве модельной системы выбран бычий сывороточный альбумин, молекула которого представляет собой полипептидную цепь (585 остатков аминокислот), образующую несколько доменов. Раствор альбумина (Alb) обладает природной флуоресценцией, обусловленной наличием триптофановых (2) и тирозиновых (20) фрагментов. Связывание альбумина с тиреостатиком сопровождается гашением флуоресценции вследствие образования устойчивого ассоциата белок-препарат. Равновесие ассоциации альбумина с тиреостатиком (Tr) Alb + nTr = А1ЬТг„ характеризуется „ [AlbTr]

константой ассоциации К =-—, где п - число связывающих сайтов молекулы

[Alb][Tr]

белка.

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Varian Сагу Eclipse при длинах волн облучающего света 280 (возбуждается тирозиновый и триптофановый фрагменты белка) и 295 нм (возбуждается только триптофановый фрагмент белка) при постоянной концентрации альбумина (1.0-10 М) и переменной - препарата. Применяли фосфатный буфер со значением pH 7.37, близким к физиологическому значению pH крови. Для построения концентрационной зависимости измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны 346 нм (длина волны возбуждающего излучения 295 нм).

По степени уменьшения флуоресценции были рассчитаны константа ассоциации белок-препарат и число связывающих сайтов молекулы белка линейным методом наименьших квадратов по уравнению (1). Результаты расчета свидетельствуют об образовании ассоциатов состава 1:1. Для определения равновесной концентрации альбумина [Alb] вычисляли отношение интенсивности флуоресценции альбумина при определённом соотношении тион:альбумин (/,) к

предельному значению интенсивности флуоресценции альбумина в отсутствие тиона (/„,,„)):

[Л1Ь] = -^-Сш; откуда I, _ 1__1_ (1),

Л--Л к I

где СА1Ь, СТг- аналитические концентрации альбумина и препарата, М.

Таблица 4

Результаты определения констант связывания (^К) тиреостатиков с альбумином

Название соединения lgK

Тиазолин-2-тион (I) 4.91±0.27

4-Фенилтиазолин-2-тион (II) 4.52±0.34

Тиазолидин-2-тион (III) 5.40±0.40

1,3,4-Тиадиазолин-2-тион (IV) 4.65±0.20

5-Метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тион (V) 4.75±0.19

Полученные величины lgK (табл. 4) свидетельствуют о достаточно высокой степени сродства потенциальных тиреостатиков по отношению к сывороточному альбумину.

Производные триазола (VI, VII) и тетразола (VIII) не вызывали гашения флуоресценции при длинах волн облучающего света 280 и 295 нм, заметно не проявляя сродства к альбумину.

Исследование аитноксидантной активности н определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов кинетическим методом

Гетероароматические тиоамиды как тиреостатики взаимодействуют с активными формами иода (молекулярным иодом, Г или HOI) и выполняют роль антиоксидантов. Эта "профилактическая" антиоксидантная защита опосредована через систему гормональной регуляции синтеза тиреоидных гормонов, избыточная концентрация которых приводит к окислительному стрессу.

Нами оценены антиоксидантные свойства гетероароматических тиоамидов I-VIII путем изучения кинетики их взаимодействия с хромоген-радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом в этанольных, ацетонитрильных растворах и четыреххлористом углероде.

Кинетика взаимодействия хромоген-радикала с тиоамидами I-VIII, взятыми в изомолярных концентрациях, удовлетворительно описывается уравнением реакции второго порядка (2):

R' + ХН -» RH + X"

где С0 - исходная концентрация компонентов реакции, М; Х- координата реакции, М; / - время, мин; к - константа скорости, М"' мин"1.

Об антирадикальной активности тиоамидов (I-VIII) судили по величине констант скорости реакций второго порядка их взаимодействия с радикалом в четыреххлористом углероде, ацетонитриле, этаноле, которые определяли

спектрофотометрическим методом с использованием уравнения (2). Гипохромия длинноволновой полосы поглощения хромоген-радикала в области 517 нм (СС14, е = 1.17-104 М"' см"'), 518 нм (С2Н5ОН, е = 7.27-103 М"'-см"' в присутствии 10 мМ СН3СООН), 519 нм (CH3CN, е = 1.15-104 М"'см"') свидетельствовала о степени протекании реакции между радикалом и тиоамидом. Электронные спектры поглощения в системе 5-меркапто-1-метилтетразол (VIII) - хромоген-радикал представлены на рис. 8.

Длина волны, нм

Рисунок 8 - Электронный спектр поглощения 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила в этаноле с добавлением 10 мМ СНзСООН (линия максимального поглощения) и динамика его уменьшения во времени после добавления изомолярного количества 1-метилтетразолин-5-тиона (VIII) (4.0-10"5 М) (жирные линии, проведенные через 7; 14; 21; 28; 35; 42; 49; 56; 63; 70 мин после начала реакции)

Результаты спектрофотометрического определения констант скорости взаимодействия тиоамидов I-VIII в растворителях представлены в табл. 5.

Таблица 5

Константы скорости реакции тиоамидов I-VIII с хромоген-радикалом

в различных растворителях

Константы скорости реакции, М"' мин"' (р>0.99)

Соединения С2Н5ОН (10 мМ СН3СООН) CH3CN СС14

I 592 2.50-104 2.01-10J

II 1.06-104 4.01-104

III 20 0

IV 147 354 223

V 174 377 265

VI 77 1.05-103

VII 22 87 *

VIII 380 3.81-103 447

* - Соединения нерастворимы в СС14

Установлено, что кинетика взаимодействия хромоген-радикала с тиоамидами I, IV, VI и VIII при избыточной концентрации 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила описывается уравнением реакции псевдопервого порядка по реагирующим компонентам. Падение светопоглощения хромоген-радикала во времени находится в хорошей корреляции с изменением исходных концентраций тиоамидов в этанольном растворе в присутствии уксусной кислоты (0.04 % об.). Параметры градуировочных графиков (Y=b'C+a, где Y - коэффициент линейной регрессии зависимости ln(C0/C) - f (t)) и метрологические характеристики методики кинетического определения соединений I, IV, VI и VIII приведены в табл. 6.

Таблица 6

Параметры градуировочных функций и метрологические характеристики

определения соединений I, IV, VI и VIII

Соединение Параметры градуировочной функции Y=bC+a Sr Д % (wlO7, М

b'102 a-IO7 Р

I 2.77 -0.20 0.994 0.05 -3.0 7.6

IV 0.15 0.40 0.991 0.05 2.7 6.9

VI 2.52 -1.0 0.991 0.04 2.1 7.0

VIII 2.41 2.0 0.995 0.05 2.5 5.0

Разработанная спектрофотометрическая методика кинетического определения тиоамидов (I, IV, VI, VIII) в этанольных растворах характеризуется высокой чувствительностью, хорошей прецизионностью и правильностью результатов.

Методы хроматографического определения гетероароматическнх тиоамидов

Хронология представленных в обзоре литературы методов разделения и определения тиоамидов свидетельствует о преобладании в современном фармацевтическом анализе хроматографических методов. Метод капиллярного зонного электрофореза, относящийся к перспективным комбинированным методам разделения и анализа, до настоящего времени не использовался для идентификации и определения тиреостатиков - производных тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола.

Нами изучено электрофоретическое поведение тиоамидов на основе пятичленных азотсодержащих гетероциклов (I-VIII) и подобраны оптимальные условия их разделения и определения (боратный буферный раствор, рН=9.18, напряжение 20 кВ) методом КЗЭ. Определение методом внешнего стандарта проводили с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель-ЮЗР». Электрофореграмма смеси исследуемых соединений представлена на рис. 9.

6.86 шли

_, I_J_LuJi_

Capel [/

1 2 3 4 5 6 7 8 «■■

Рисунок 9 — Электрофореграмма смеси соединений I (9.76 мкг/мл), IV (9.84 мкг/мл), V (11.01 мкг/мл), VI (8.42 мкг/мл) и VII (9.59 мкг/мл) на фоне боратного буферного раствора (рН 9.18). 1 - ЭОП, Ш; 2 - II; 3 - VII; 4 - V; 5 -1; 6 - VI; 7 - IV Результаты электрофоретического определения соединений I-II и IV-VIII представлены в табл. 7. Соединение III, находящееся в молекулярной форме при рН 9.18, выходит вместе с электроосмотическим потоком. Совместное определение соединений IV и VIII невозможно из-за их близкой электрофоретической подвижности. Предлагаемая методика позволяет оценить раздельное содержание веществ в диапазонах концентраций 1.17-93.75 (I); 1.93-193.30 (II); 1.18-94.54 (IV); 1.32-105.76 (V); 1.01-101.13 (VI); 1.15-115.16 (VII); 1.16-116.15 (VIII) мкг/мл.

Таблица 7

Метрологические характеристики методики определения соединений I, II,

IV-VIII методом капиллярного зонного электрофореза (п=5, Р=0.95)

Соединение МО4, см2/кВс Параметры градуировочного графика h=aC+b sr Д % с мкг/мл

а b Р

I 3.23 0.0204 0.0738 0.984 0.011 -4.1 1.10

II 2.41 0.0616 -0.1290 0.999 0.011 5.0 0.23

IV 3.49 0.0161 1 0.0657 0.990 0.010 2.2 1.11

V 3.01 0.0267 -0.0086 0.999 0.009 -1.5 1.20

VI 3.34 0.0361 1 0.0359 0.993 0.013 1.0 0.96

VII 2.95 0.0384 0.0515 0.999 0.013 -1.1 1.01

VIII 3.50 0.0223 0.0078 0.999 0.009 1.2 1.02

При выборе оптимального состава подвижной фазы (ПФ) объемные соотношения компонентов (ацетатного буферного раствора и ацетонитрила) варьировали от 15:85 до 5:95. Уменьшение объемной доли ацетонитрила в составе ПФ приводило к сильному увеличению времен удерживания препаратов. Для определения методом ВЭЖХ ПФ готовили смешением ацетонитрила и ацетатного буферного раствора с pH 4.70 в объемных отношениях 5:95. Определение методом внешнего стандарта выполняли на жидкостном хроматографе «Хромое ЖХ-301» с детектором «UVV 104М». Использовали колонку размером 150x4.0 мм, заполненную обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 5 мкм. Мертвое время колонки составляет 99 с, мертвый объем - 1.32 мл. Скорость подачи подвижной фазы — 1 мл/мин. Детектирование определяемых компонентов

проводили в соответствующих максимумах светопоглощения субстанций I (320 нм), IV (305 нм), V (310 нм), VI (260 нм), VII (254 нм), VIII (245 нм).

=Э so

С.

2 1)0

= 40

w :о

о -20 -40

-60

0 12 3 4 5 6 7 8

Время, мин

- Всплеск светопоглощения при переключении длины волны детектора Рисунок 10 - Хроматограмма смеси соединений I (4.69 мкг/мл), IV (4.73 мкг/мл), V (5.29 мкг/мл), VI (4.05 мкг/мл) и VII (4.61 мкг/мл)

Определение тиреостатиков проводили методом внешних стандартов с использованием линейной зависимости высоты пика (/г) от концентрации определяемого вещества (с). Градуировочные функции линейны в широком диапазоне концентраций: 0.47-11.72; 0.47-11.82; 0.53-13.22; 0.40-10.11; 0.46-11.52; 0.46-11.62 мкг/мл соответственно для соединений І, IV-VIII. Времена удерживания ^я), параметры градуировочных графиков (И=аС+Ь) и метрологические характеристики методики определения приведены в табл. 8.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики определения соединений І, ІУ-УІІІ методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (п=5, Р=0.95)

Соединение tR, мин Параметры градуировочного графика И=а-С+Ь Sr Д % с мкг/мл

а Ь Р

I 3.72 10.2171 -16.9403 0.989 0.012 -5.0 0.45

IV 2.99 15.3302 -27.5782 0.996 0.011 4.9 0.43

V 7.03 6.7827 -11.0509 0.995 0.010 -1.5 0.50

VI 1.42 16.4840 -2.8716 0.997 0.014 3.3 0.37

VII 2.16 14.4514 -1.9828 0.998 0.013 5.0 0.41

VIII 1.55 10.0207 -0.2544 0.999 0.011 5.0 0.42

Соединения II и III являются более гидрофобными в данном ряду азолов, для их определения и разделения ПФ готовили смешением ацетонитрила и ацетатного буферного раствора с рН 4.70 в объемных отношениях 50:50. Хроматографировали при расходе ПФ 1 мл/мин. Детектирование определяемых компонентов проводили в соответствующих максимумах светопоглощения субстанций II (325 нм) и III (275 нм). Для построения градуировочных функций методом внешнего стандарта

использовали серию стандартных растворов соединений II и III с концентрациями 1.55-19.33 и 0.95-11.92 мкг/мл соответственно.

Градуировочные функции линейны в широком диапазоне концентраций: 1.55-19.33 и 0.95-11.92 мкг/мл соответственно для соединений II и III. Времена удерживания (1К), параметры градуировочных графиков (И=а-С+Ь) и метрологические характеристики методики определения приведены в табл. 9.

Таблица 9

Метрологические характеристики методики определения соединений II и III методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (п=5, Р=0.95)

Соединение ІК, мин Параметры градуировочного графика И=аС+Ь Д % С мкг/мл

а Ь Р

II 3.17 13.3175 -4.7723 0.999 0.017 -4.0 0.34

III 1.66 28.3796 -1.8916 0.999 0.015 -2.5 0.27

Разработанная методика ВЭЖХ определения используемого в медицинской практике препарата III была апробирована при анализе урины. Анализируемый образец урины готовили модификацией свежесобранной урины здорового человека стандартным раствором соединения III в фосфатном буфере (рН=6.86). Экстракцию тиреостатика проводили тремя порциями по 5 мл этилацетата (ч.д.а.) из 5 мл урины. Экстракты испаряли при комнатной температуре, растворяли в 5 мл ПФ и анализировали методом ВЭЖХ. При расходе ПФ 1.0-0.6 мл/мин разделить пики матрицы урины и тиреостатика не удалось. При расходе ПФ 0.5 мл/мин хроматограмма образца урины содержит пик (1) соэкстрактов матрицы урины (1.83.2 мин) и хорошо сформированный пик (2) препарата Ш (3.6 мин). Результаты хроматографического определения тиазолидин-2-тиона в урине представлены в табл. 10. Анализ занимает не более 5 минут, хроматографические пики хорошо сформированы и разделяются до базовой линии (рис. 11).

Таблица 10

Результаты ВЭЖХ-УФ определения содержания тиазолидин-2-тиона в урине (п=5, Р=0.95)

Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл о,%

3.53 3.37 -4.53

4.41 4.35 -1.36

5.29 5.14 -2.84

7.06 7.34 3.96

8.82 8.96 1.59

Рисунок 11 - ВЭЖХ-УФ хроматограмма образца урины: тиазолидин-2-тион, 7.06 мкг/мл (2)

Выводы

1. Исследованы особенности образования тиоамидами на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола п-а*-комплексов с молекулярным иодом в хлороформе. Решающими факторами, определяющими устойчивость образующихся комплексов, являются природа гетероцикла и заместителей в его составе. Изучено взаимодействие тиоамидов с элементарным иодом в водно-спиртовых растворах и установлено влияние их структуры на механизм окисления: образование тиильных радикалов, катион-радикалов или иодониевых солей.

2. Установлены молекулярные и кристаллические структуры продуктов взаимодействия соединений V, VI и VIII с элементным иодом в различных средах. Кристаллическая структура продукта взаимодействия тиона (V) с молекулярным иодом, полученного в хлороформном растворе, образована иодониевыми катионами (C3H4N2S2)2r и пентаиодид-анионами 15\ объединенными в цепочки, вытянутые вдоль оси с, межмолекулярными водородными связями N(4)...H-N(1') и I(1)...H-N(3'). Характерной особенностью кристаллических соединений является образование сдвоенных цепочек за счет различных диполь-дипольных взаимодействий между атомами иода и серы.

3. Определены константы ассоциации молекул тиреостатиков с белком-переносчиком. Ассоциация тиоамидов с альбумином реализуется за счет образования водородных связей и гидрофобного взаимодействия. Полученные величины lgK свидетельствуют о достаточно высокой степени сродства потенциальных тиреостатиков к сывороточному альбумину.

4. Проведена оценка антиоксидантной активности гетероциклических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола, тетразола по величине константы скорости реакции их взаимодействия с хромоген-радикалом 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом. Установлено, что для реакции псевдопервого порядка скорость реакции линейно зависит от концентраций тиоамидов.

Разработана спектрофотометрическая методика кинетического определения гетероароматических тиоамидов с 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом.

5. Разработана методика определения тиоамидов I, IV-VIII методом обращенно-фазовой ВЭЖХ при элюировании смесью (5:95) ацетонитрил - ацетатный буферный раствор с рН 4.70. Градуировочные графики линейны в диапазонах 0.4711.72 (I), 0.47-11.82 (IV), 0.53-13.22 (V), 0.40-10.11 (VI), 0.46-11.52 (VII), 0.46-11.62 (VIII) мкг/мл, пределы обнаружения составляют 0.45; 0.43; 0.50; 0.37; 0.41; 0.42 мкг/мл для соединений I, IV-VIII соответственно.

6. Разработана методика обращенно-фазового ВЭЖХ определения тиоамидов II и III. Градуировочные графики линейны в диапазонах 1.55-19.33 (II) и 0.95-11.92 (Ш) мкг/мл, пределы обнаружения составляют 0.34 и 0.27 мкг/мл для соединений II и III соответственно. Методика апробирована при анализе образца урины на тиазолидин-2-тион.

7. На основе оценки протолитических свойств тиоамидов установлены оптимальные условия разделения смеси соединений (I, V, VI, VII) и определения соединений (I, II, IV-VIII) методом капиллярного зонного электрофореза. Методика позволяет оценить содержание веществ в диапазонах концентраций 1.17-93.75 (I), 1.93-193.30 (II), 1.18-94.54 (IV), 1.32-105.76 (V), 1.01-101.13 (VI) 1.15-115.16 (VII), 1.16-116.15 (VIII) в мкг/мл, с пределами обнаружения 1.10; 0.23; 1.11; 1.20; 0.96; 1,01; 1.02 мкг/мл для соединений I-VIII соответственно. Методики отличаются хорошей прецизионностью и правильностью результатов, простотой и экспрессностью.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Черновьянц М.С., Алешина II.B., Старикова З.А., Сульженко Е.Н. "Изучение взаимодействия 5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона с молекулярным иодом" // Известия Академии наук. Серия химическая. 2010. №9. С. 1750-1754.

2. Черновьянц М.С., Алешина Н.В., Бурыкин И.В. "Хроматографическое и электрофоретическое определение тиоамидов на основе тиазола, 1,3,4-тиадиазола, 1,2,4-триазола, тетразола" // Журнал аналитической химии. 2011.№3. С. 287-291.

3. Aleshina N. V., Chernov'yants M.S., Shcherbakov I.N. and Starikova Z.A. "Solvent mediated reaction of 1-methyl-lH-tetrazoline-5-thione" // Structural Chemistry. 2011. 22. Pp. 313-317.

4. Черновьянц M.C., Алешина II.B. "Исследование антиоксидантной активности и определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов кинетическим методом" // Журнал аналитической химии, 2012. № 3. С. 253-257.

5. Бурыкин И.В., Алешина Н.В., Черновьянц М.С. Использование капиллярного электрофореза при определении производных тиазола и тиадиазола // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2009", г. Йошкар-Ола, июнь 2009 г. С. 47.

6. Алешина Н.В. Исследование устойчивости комплексов переноса заряда гетероароматических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, тетразола с молекулярным иодом // Тезисы докладов IV Международной научно-практической конференции "Наука и современность", 2010. С. 195-199.

7. Алешина Н.В., Черновьянц М.С. ВЭЖХ-УФ определение тиоамидов на основе тиазола, 1,3,4-тиадиазола, 1,2,4-триазола // Тезисы докладов Всероссийской конференции "'Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез", г. Краснодар, 26 сентября -01 октября 2010 г. С. 155.

8. Алешина Н.В. Определение протолитических свойств препаратов тиреостатического действия // Тезисы докладов Всероссийской очно-заочной конференции "Современные проблемы естествознания", 2011. С. 46-48

9. Алешина Н.В., Черновьянц М.С. Исследование антиоксидантных свойств тиоамидов на основе азолов // Тезисы докладов 65-й Итоговой научной конференции молодых учёных РостГМУ с международным участием, г. Ростов-на-Дону, 22 апреля 2011 г. С. 423-424.

Ю.Алешина Н.В. ВЭЖХ разделение и количественное определение препаратов тиреостатического действия // Тезисы докладов XXI Российской молодежной научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии", г. Екатеринбург, 19-23 апреля 2011 г. С. 225226.

11. Алешина Н.В., Черновьянц М.С. Кинетическое определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2011", г. Архангельск, 26 июня-2 июля 2011 г. С. 64.

Автор выражает глубокую признательность старшему научному сотруднику Института элементоорганических соединений им. Несмеянова Российской академии наук Стариковой З.А. за выполнение рентгеноструктурного анализа продуктов окисления соединений V, VI и VIII элементным иодом, а также старшему преподавателю химического факультета ЮФУ Щербакову КН. за участие в обсуждении молекулярных и кристаллических структур дисульфидов на основе соединений VI и VIII.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 2638. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Алешина, Наталия Владимировна

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Синтез гормонов щитовидной железы и биологическая активность антитиреоидных препаратов.

1.2 Исследование комплексов гетероароматических тиоамидов

1-VIII с а-акцептором (молекулярным иодом) и л-акцептором

1.3 Исследование связывающей способности антитиреоидных препаратов по отношению к белку-переносчику.

1.4 Исследование антиоксидантной активности тиреостатиков.

1.5 Практическое использование тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола, тетразола.

1.6 Аналитическое определение тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола, тетразола.

Глава 2 Экспериментальная часть.

2.1 Рабочие растворы, реактивы, оборудование.

2.2 Объекты исследования.

2.3 Исследование протолитических равновесий.

2.3.1 Определение констант диссоциации соединений методом потенциометрического титрования.

2.3.1.1 Определение констант диссоциации тиазолин-2-тиона.

2.3.1.2 Определение констант диссоциации 4-фенилтиазолин

2-тион а.

2.3.1.3 Определение констант диссоциации тиазолидин-2-тиона.

2.3.1.4 Определение констант диссоциации 1,3,4тиадиазолин-2-тиона.

2.3.1.5 Определение констант диссоциации 5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона.

2.3.1.6 Определение констант диссоциации 1,2,4-триазолин-З-тиона.

2.3.1.7 Определение констант диссоциации 4-метил-1,2,4-триазолин-3-тиона.

2.3.1.8 Определение констант диссоциации 1-метилтетразолин-5-тиона.

2.4 Исследование взаимодействия соединений с молекулярным иодом.

2.4.1 Исследование устойчивости молекулярных аддуктов органических соединений I-VIII с элементарным иодом в хлороформе.

2.4.2 Исследование взаимодействия гетероароматических тиоамидов I-VIII с молекулярным иодом в водно-этанольной среде.

2.4.2.1 Потенциометрическое титрование.

2.5 Исследование 71-донорной способности изучаемых тиоамидов при комплексообразовании с тетрацианоэтиленом.

2.5.1 Определение константы устойчивости комплексов переноса заряда исследуемых соединений с 7с-акцептором.

2.5.2 Исследование устойчивости л-комплексов в неполярном растворителе.

2.5.3 Исследование устойчивости ^-комплексов в полярной среде.

2.5.4 Расчет значений энергий электронных переходов в ^-комплексах.

2.6 Методы идентификации и установления подлинности исследуемых соединений.

2.6.1 Спектроскопические методы исследования состава и структуры органических субстанций.

2.6.1.1 ИК-спектроскопия.

2.6.1.2 Спектроскопия ЯМР ]H.

2.6.1.3 Масс-спектрометрия.

2.6.1.4 Рентгеноструктурный анализ кристаллов.

2.6.1.4.1 Пентаиодид бис(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-илтио)иодония.

2.6.1.4.2 3,3'-Дитиобис-( 1 Н,2,4-триазол).

2.6.1.4.3 5,5' - Дитиобис( 1 -метил-1Н-тетразол).

2.6.2 Хроматографические методы исследования состава и структуры органических субстанций.

2.6.2.1 Методы тонкослойной хроматографии.

2.7 Хроматографические методы определения исследуемых соединений.

2.7.1 Определение соединений методом капиллярного электрофореза.

2.7.2 Определение соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.8 Определение констант связывания гетероароматических тиоамидов с альбумином методом гашения флуоресценции.

2.9 Исследование антиоксидантной активности и определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов кинетическим методом.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Хроматографическое и спектрофотометрическое определение тиоамидов на основе азолов и анализ продуктов их взаимодействия с молекулярным иодом"

Аналитическая химия биологически активных соединений является приоритетной областью развития современной аналитической химии. К таким препаратам относятся гетероароматические тиоамиды - группа синтетических органических веществ, способных участвовать в перехвате свободных радикалов благодаря наличию атома серы, а также биохимических редокс-процессах с участием иода.

Иод - важнейший элемент, вовлеченный в функционирование щитовидной железы, синтез тиреоидных гормонов и их секрецию. Тиоамиды ингибируют синтез тиреоидных гормонов на этапе органификации иода -включения активированного иода в тирозильные фрагменты тиреоглобулина.

Специфические особенности антитиреоидной активности тиоамидов зависят от термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Весьма актуальной задачей представляется выявление корреляционной зависимости между структурой гетероароматических тиоамидов и их реакционной способностью по отношению к молекулярному иоду в полярных и неполярных средах.

Поскольку фармакологическая активность лекарственных препаратов во многом определяется фармакокинетическим фактором, влияющим на их распределение в организме, актуальным является изучение протолитических свойств тиоамидов, а также оценка параметров связывания препаратов с транспортными белками плазмы крови. Представляет интерес исследование антиоксидантной активности гетероароматических тиоамидов, взаимодействующих в организме с активными формами иода.

Предварительно проведенный анализ научных публикаций позволил сделать вывод о лидирующей позиции хроматографии среди методов определения биологически активных тиоамидов в лекарственных формах и биообъектах, особенно в сочетании с масс-спектрометрическим методом детектирования. Обычно аналитические методики характеризуются сложными способами пробоподготовки, включают предварительную 6 экстракцию и дериватизацию. Более дешев и доступен метод ВЭЖХ с УФ-детектированием. Поскольку большинство антитиреоидных препаратов при физиологических условиях существуют частично в биологически активной -ионной форме, то существует потребность в разработке простых в исполнении, высокочувствительных и экспрессных электрофоретических методик разделения и анализа, применимых для мониторинга лекарственных препаратов и биообъектов.

Цель работы заключалась в изучении физико-химических свойств гетероароматических тиоамидов с использованием зависимости «структура -свойство - антитиреоидная активность in vitro» и в разработке на их основе комплекса методик идентификации и определения как используемых в клинической практике, так и потенциальных препаратов антитиреоидного действия: тиреостатиков - тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: сравнительная оценка электронодонорной способности гетероциклических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола по отношению к молекулярному иоду и определение констант устойчивости образующихся п-а *-аддуктов в неполярной среде (хлороформе); рентгеноструктурное исследование продуктов взаимодействия препаратов с молекулярным иодом в полярной и неполярной средах;

- оценка протолитических свойств и констант протолитических равновесий исследуемых соединений; изучение взаимодействия препаратов с белком-переносчиком (бычьим сывороточным альбумином) и расчет параметров связывания (числа связывающих сайтов и констант ассоциации);

- изучение антиоксидантной активности гетероциклических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола, оценка порядка и константы скорости реакции взаимодействия с хромоген-радикалом 2,2'7 дифенил-1-пикрилгидразилом, разработка методики кинетического определения соединений;

- подбор условий идентификации гетероароматических соединений, основанных на зависимости хроматографической и электрофоретической подвижности (методы ТСХ, ВЭЖХ, капиллярный зонный электрофорез) и спектроскопических характеристик (УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектров) от природы гетероцикла;

- разработка комплекса методик определения соединений методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1.Черновьянц М.С., Алешина Н.В., Старикова З.А., Сульженко E.H. "Изучение взаимодействия 5-метил-1,3,4-тиадиазолин-2-тиона с молекулярным иодом" // Известия Академии наук. Серия химическая, 2010. № 9. С. 1750-1754.

3. AleshinaN. V., Chernov'yants M.S., Shcherbakov I.N. and StarikovaZ.A. "Solvent mediated reaction of 1-methyl-lH-tetrazoline-5-thione" // Structural Chemistry, 2011. V. 22. Pp. 313-317.

4. Черновьянц M.C., Алешина H.B. "Исследование антиоксидантной активности и определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов кинетическим методом" // Журнал аналитической химии, 2012. № 3. С. 253-257.

6. Алешина Н.В. Определение констант связывания препаратов антитиреоидного действия с альбумином методом гашения флуоресценции // Тезисы докладов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", г. Москва, 12-15 апреля 2010 г. Электронная.

7. Алешина Н.В. Исследование устойчивости комплексов переноса заряда гетероароматических тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, тетразола с молекулярным иодом // Тезисы докладов IV Международной научно-практической конференции "Наука и современность", 2010. С. 195-199.

8. Алешина Н.В., Черновьянц М.С. ВЭЖХ-УФ определение тиоамидов на основе тиазола, 1,3,4-тиадиазола, 1,2,4-триазола // Тезисы докладов Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез", г. Краснодар, 26 сентября-01 октября 2010 г. С.155.

9. Алешина Н.В. Определение протолитических свойств препаратов тиреостатического действия // Тезисы докладов Всероссийской очно-заочной конференции "Современные проблемы естествознания", 2011. С. 46-48.

П.Алешина Н.В. Определение тиреостатических препаратов методом окислительно-восстановительного титрования // Тезисы докладов XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", г. Москва, 11-15 апреля 2011 г. Электронная.

12. Алешина Н.В., Черновьянц М.С. Кинетическое определение тиоамидов на основе азотсодержащих пятичленных гетероциклов // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2011", г. Архангельск, 26 июня-2 июля 2011 г. С. 64. 1 З.Алешина Н.В., Черновьянц М.С. Исследование антиоксидантных свойств тиоамидов на основе азолов // Тезисы докладов 65-й Итоговой научной конференции молодых учёных РостГМУ с международным участием, г. Ростов-на-Дону, 22 апреля 2011 г. С. 423-424. 14.Алешина Н.В. 7г-Донорные свойства тиоамидов на основе тиазола, тиадиазола, триазола, тетразола // Тезисы докладов XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", г. Москва, 11-15 апреля 2011 г. Электронная.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты спектроскопических и потенциометрических исследований взаимодействия ряда гетероароматических тиоамидов, производных тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола, с молекулярным иодом в различных средах. Установление влияния структуры тиоамидов на устойчивость их п-а*-комплексов с иодом в хлороформных растворах и восстановительную активность в водно-спиртовых растворах.

2. Оценка влияния структуры тиоамидов на их протолитические свойства.

3. Результаты исследования равновесия и оценка констант ассоциации тиреостатических препаратов на основе тиазола, тиадиазола, триазола и тетразола с транспортным белком альбумином методом гашения флуоресценции.

4. Результаты исследования кристаллических и молекулярных структур соли пентаиодида бис(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-илтио)иодония и дисульфидов - 3,3'-Дитиобис(1Н, 2, 4-триазола) и 5,5'-дитиобис(1-метил-1Н-тетразола) - продуктов взаимодействия тиоамидов с элементным иодом.

5. Комплекс разработанных спектроскопических (ИК-, УФ-, ЯМР-, масс-спектрометрия) и хроматографических (ТСХ, ВЭЖХ, КЗЭ) методик идентификации гетероароматических тиоамидов.

7. Аналитические преимущества методик хроматографического (ВЭЖХ-УФ) и электрофоретического определения тиоамидов.

8. Практическое применение методики ВЭЖХ-УФ определения тиреостатика тиазолидин-2-тиона в моче здорового человека.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

Выводы

2. Установлены молекулярные и кристаллические структуры продуктов взаимодействия соединений V, VI и VIII с элементным иодом в различных средах. Кристаллическая структура продукта взаимодействия тиона (V) с молекулярным иодом, полученного в хлороформном растворе, образована иодониевыми катионами (СзН4М282)21+ и пентаиодид-анионами 15", объединенными в цепочки, вытянутые вдоль оси с, межмолекулярными водородными связями N(4).H-N(1') и I(1).H-N(3'). Характерной особенностью кристаллических соединений является образование сдвоенных цепочек за счет различных диполь-дипольных взаимодействий между атомами иода и серы.

Разработана спектрофотометрнческая методика кинетического определения гетероароматических тиоамидов с 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразилом.

5. Разработана методика определения тиоамидов I, IV-VIII методом обращенно-фазовой ВЭЖХ при элюировании смесью (5:95) ацетонитрил -ацетатный буферный раствор с рН 4.70. Градуировочные графики линейны в диапазонах 0.47-11.72 (I), 0.47-11.82 (IV), 0.53-13.22 (V), 0.40-10.11 (VI), 0.4611.52 (VII), 0.46-11.62 (VIII) мкг/мл, пределы обнаружения составляют 0.45; 0.43; 0.50; 0.37; 0.41; 0.42 мкг/мл для соединений I, IV-VIII соответственно.

6. Разработана методика обращенно-фазового ВЭЖХ определения тиоамидов II и III. Градуировочные графики линейны в диапазонах 1.5519.33 (II) и 0.95-11.92 (Ш) мкг/мл, пределы обнаружения составляют 0.34 и 0.27 мкг/мл для соединений II и III соответственно. Методика апробирована при анализе образца урины на тиазолидин-2-тион.

7. На основе оценки протолитических свойств тиоамидов установлены оптимальные условия разделения смеси соединений (I, V, VI, VII) и определения соединений (I, II, IV-VIII) методом капиллярного зонного электрофореза. Методика позволяет оценить содержание веществ в диапазонах концентраций 1.17-93.75 (I), 1.93-193.30 (II), 1.18-94.54 (IV), 1.32105.76 (V), 1.01-101.13 (VI) 1.15-115.16 (VII), 1.16-116.15 (VIII) в мкг/мл, с пределами обнаружения 1.10; 0.23; 1.11; 1.20; 0.96; 1,01; 1.02 мкг/мл для соединений I-VIII соответственно. Методики отличаются хорошей прецизионностью и правильностью результатов, простотой и экспрессностью.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Алешина, Наталия Владимировна, Краснодар

1. Кеттайл В.М., Арки Р.А. Патофизиология эндокринной системы. М.: Бином. 2001. 334 с.

2. Алефиров А.Н. Фитотерапия заболеваний щитовидной железы. Санкт1. Петербург. 2008

3. Hart М. Е., Suchland К. L., Miyakawa М., Bunzow J. R., Grandy D. К., and Scanlan T. S // J. Med. Chem. 2006. Vol. 49. P. 1101-1112

4. Roy G., Das D., Mugesh G.// Inorg. Chim. Acta. 2007. Vol. 360. P. 303-316

5. Surks M. I., M.D.,and Sievert, R.M.D. // The New J. of medicine. Vol. 333. No. 251. P. 1688-1694

6. Roy G. and Mugesh G. // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127. No. 43. P. 1520715217

7. Fawcett D. M. and Kirkwood S. // J. Biol. Chem. 1953. Vol. 204. P. 787-796

8. Mayberry W. E. and Hockert T. J. // J. Biol. Chem. 1970. Vol. 245. No. 4. P. 697700

9. Fawcett D. M. and Kirkwood S. // J. Biol. Chem. 1954. Vol. 205. P. 249-256

10. Cunningham L. W. and Nuenke B. J. // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. No. 6. P.1447-1451

11. Lamas L., Taurog A., Salvatore G., and Edelhoch H. // J. Biol. Chem. 1974. Vol.

12. No. 9. P. 2732-2737 12.Sakuradas J., Takahashie S., and Hosoyast T. // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 9. P. 4007-4010

13. Fukuyama K., Sato K., Itakura H., Takahashi S., and Hosoyai T. // J. Biol. Chem.1997. Vol. 272. No. 9. P. 5752-5756

14. Shah M. M. and Aust S. D. // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. No. 12. P. 8503-8506

15. Fukuyama K, Kunishima N., Amada F., Kubota Т., and Matsubarai H.// J. Biol.

16. Chem. 1995. Vol. 270. No. 37. P. 21884-21892

17. Niccoli-Sire P., Fayadat L., Siffroi-Fernandez S., Malthierry Y., and Franc J. L. //

18. Biochem. 2001. Vol. 40. P. 2572-2579

19. Flakus H. Т., Miros A., Jones P. G. // Spectrochim. Acta P. A 58. 2002. P. 225-237.120

20. Flakus H. T., Miros A., Jones P. G. // Spectrochim. Acta P. A 58. 2002. P. 225-237.

21. Laurence C., Ghomari M. J. E. and Lucon M.// J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2. 1998.1. P. 1159-1162.

22. Hipler F., Fischer R. A. and Müller J.// J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 2002. P.1620-1626

23. Hipler F., Winter M., Fischer R.A. // J. Mol. Struct. 2003. Vol. 658. P. 179-191

24. Трифонов P.E., Островский В.A. // Журн. орг. химии. 2006. Т. 42. Вып. 11. С.1599-1620

25. Бузыкин Б.И., Миронова Е.В., Губайдуллин А.Т. // Журн. общей химии. 2008.1. Т.78. Вып. 4. С. 653-667

26. Herbstein F. H., Schwortzer W. // J. Am. Chem. Soc. 1984. Vol. 106. P. 2367-2373

27. Bigoli F., Deplano P., Mercuri M.L., Pellinghelli M.A., Sabatini A., Trogu E.F.,

28. Vacca A. // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1996. P. 3583

29. Esseffar M., Bouab W., Lamsabhi A., Abboud J. L. M., Notario R., Yanez M. // J.

30. Am. Chem. Soc. 2000. Vol. 122, P. 2300-2308

31. Bigoli F., Deplano P., Mercuri M.L., Pellighelli M.A., Trogu E.F. // Phosphorus

32. Sulfur Silicon Relat. Elem. 1992. Vol. 72. P. 65

33. Hope H., Hung-Yin Lin G. // Chem. Commun., 1970. P. 169

34. Boyle P.D., Christie J., Dyer T., Godfrey S.M., Howson I.R., McArthur C., Omar

35. В., Pritchard R.G., Williams G. R. // J. Chem. Soc., Dalton Trans. 2000. P. 31063112

36. Arzei D., Deplano P., Trogu E.F., Bigoli F., Pellinghelli M. A., Vacca A. // Can. J. Chem. 1988. Vol. 66. P. 1483-1489

37. Laurence C., Ghomari M.J.EI, Questel J.Y.Le, Berthelot M., Mokhlisse R. J. //

38. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1998. P 1545

39. Roohi H., Ebrahimi A., Habibi S.M. // J. Mol. Struct. (Theochem). 2004. Vol. 710.1. P. 77

40. Черновьянц M.C., Бурыкин И.В., Алешина H.B. // Изв. АН. Сер. хим. 2007.1. Вып. 56. С. 1341-1344.

41. P.D.Boyle , S.M.Godfrey// Coord. Chem. Rev. 2001. Vol. 223. P. 265121

42. Daga V., Hadjikakou S. K., Hadjiliadis N., Kubicki M., dos Santos J. H. Z., and

43. Butler I. S. // Eur. J. Inorg. Chem. 2002. P. 1718-1728

44. Antoniadis C. D., Corban G. J., Hadjikakou S. K., Hadjiliadis N., Kubicki M.,

45. Warner S., and Butler I. S. // Eur. J. Inorg. Chem. 2003. P. 1635-1640

46. Suszka A. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1985. P. 531-534

47. Черновьянц M.C., Хохлов E.B., Лыкова E.O., Кажева О.Н., Александров Г.Г.,

48. Дьяченко O.A. //Изв. АН. Сер. хим. 2008. Т. 57. №6. С. 1215-1219

49. Salman Н.М.А., Abu-Krisha М.М., El-Sheshtawy H.S. // Can. J. Anal. Sciences

50. Spectrosc. 2004. Vol. 49. P. 5.

51. Cristiani F., Demartin F., Devillanova F.A., Isaia F., Saba G., Verani G.J. // Chem.

52. Soc. Dalton Trans. 1992. P. 3553-3560

53. Apperley D.C., Bricklebank N., Burns S.L., Hibbs D.E., Hursthouse M.B., Malik

54. K.M.A. // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1998. P. 1289-1292.

55. Godfrey S.M, McAuliffe C.A., Jackson S.L., Pritchard R.G. // J. Chem. Soc. Dalton1. Trans. 1997. P. 4499.

56. Demartin F., Deplano P., Devillanova F.A., Isaia F., Lippolis V., Verani G.II Inorg.

57. Chem. 1993. Vol. 32. P. 3694

58. Aragoni M.C., Area M., Devillanova F.A., Garau A., Isaia F., Lippolis V., Verani

59. G. // Coord. Chem. Rev. 1999. Vol. 184 P. 271

60. Area M., Aragoni M.C., Devillanova F.A., Garau A., Isaia F., Lippolis V., Mancini

61. A., Verani G. // Bioinorg. Chem. Appl. 2006. Article ID 5893745. dos Santos J. H. Z., Butler I. S., Daga V., Hadjikakou S., Hadjiliadis N.//

62. Spectrochim. Acta P. A. 2002. Vol. 58. P. 2725-2735

63. Zhdankin V.V., Stang P.J. // Chem. Rev. 2008. Vol. 108. P. 5299-5358.

64. Herndon W.C., Feuer J. // J. Am. Chem. Soc. 1968. Vol. 90. P. 5914.

65. Rüssel T.D., Levy D.H. // J. Phys. Chem. 1982. Vol. 89. P. 2718.

66. Sulkowska A. // J. Mol. Strukt. 2002. Vol. 614. P. 227-232

67. Bi S., Sun Y., Qiao C., Zhang H., Liu C.II J. of Luminescence. 2009. Vol. 129. P.541.547

68. Rudnev A. V., Aleksenko S. S., Semenova О., Christian G. Hartinger С. G., Timerbaev A. R., Keppler В. K. // J. Sep. Sei. 2005. Vol. 28. P. 121-127

69. Кольтовер B.K. // Изв. АН. Сер. хим. 2010. №1. С. 37-50

70. Nelson D.L., Сох М.М. Lehninger principles of biochemistry. Freeman W.H., New1. York, 2008. 1119 p.

71. Волков В.А., Дорофеева H.A., Пахомов П.М. // Хим-фарм. жури. 2009. Т. 43.6. С. 27-30

72. Maroz А., Anderson R. F., Smith R. A. J., Murphy M. P. // Free Radical Biol. Med.2009. Vol. 46. P. 105

73. Wayner D.D., Burton G.W., Ingold K.U., Locke S. // FEBS Lett. 1985. Vol. 187. P.33.

74. Плотников М.Б., Просенко A.E., Смольякова В. И., Иванов И.С., Чернышева

75. Г.А., Кандалинцева Н.В. // Хим-фарм журн. 2010. Т. 44. №4. С.25.

76. Рогинский В. А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность иэффективность. М.: Наука, 1988. 128 с.

77. Tubaro F., Ghiselli A., Rapuzzi P., Maiorino M., Ursini F // Free Radicals in Biol. Med. 1998. Vol. 24. P. 1228.

78. Lussignoli S., Fraccaroli M., Andrioli G., Brocco G., Bellavite P. // Anal. Biochem.1999. №269. P. 38.

79. Chen I.C., Chang H.C., Yang H.W., Chen G.L. // J. of Food Drug Analysis. 2004.1. Vol. 12. №1. P. 29.

80. Cao G., Verdon C.P., Wu A.H.B., Wang H., Prior R.L. // Clinical Chem. 1995. Vol.41. P. 1738.

81. Yang X.F., Guo X.Q. // Analyst. 2001. № 126. P. 928.

82. Короткова Е.И. // Журн. физ. химии. 2000. Т. 74. № 9. С. 1544.

83. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Shevchuk A.V. // J. Electroanal. Chem. 2002. Vol.518. № l. p. 56.

84. Yang В., Kotani A., Arai K., Kusu F. // Anal. Sei. (Japan). 2001. Vol. 17. P. 599.

85. Snelgrove D.W., Lusztyk J., Banks J.T., Mulder P. and Ingold K.U. // J. Am.

86. Chem. Soc. 2001. Vol. 123. P. 469.

87. Fischer H. Radical Reaction Rates in solution. Berlin: Landolt-Börnstein, New

88. Series; Springer-Verlag, 1994. Vol. 18. Subvolumes 18a-e2. 3000 p.

89. Abraham M. H., Grellier P. L., Prior D. V., Morris J. J., Taylor P. J. // J. Chem.

90. Soc. Perkin Trans. 2. 1990. P.'521.

91. Abraham M. H., Grellier P. L., Prior D. V., Duce P. P., Morris J., Taylor P. J. // J.

92. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 1989. P. 699

93. Litwinienko G., Ingold K. U. // J. Org. Chem. 2003. Vol. 68. P. 3433.

94. Laurence C., Ghomari M. J. El, Questel J. Y. Le, Berthelot M., Mokhlisse R. // J.

95. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1998. P. 1545

96. Aragoni M.C., Area M., Demartin F., Devillanova F.A., Garau A., Isaia F., Lippolis

97. V., Verani. G. // J. Am. Soc. 2002. Vol. 124. P. 4538.

98. Кочикян T.B., Самвелян M.A., Арутюнян Э.В., Арутюнян B.C. и др. // Хим,фарм. журн. Т. 44. № 10. 2010. С. 3-5.

99. Schmidt U., Pfleiderer G., Bartkowiak F. // Anal. Biochem. 1984. V. 138. P. 217.

100. Karthikeyan J., Parameshwara P., Shetty A. N., Shetty P. // J. Braz. Chem. Soc.2006. Vol. 17. No. 2. P. 316.

101. Jian-Hua Qin, Pu-Zhou Hu, Jian-Ge Wang and Bang-Tun Zhao // Z. Kristallogr. NC S 222. 2007. P. 451-452

102. Шестаков А.Ф., Шульга Ю. M., Емельянова Н.С., Санина H.A., Алдошин С.М.

103. Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 7. С. 1244-1252

104. Аминджанов A.A., Кабиров Н.Г., Сафармамадов С.М. // Журн. неорг. химии,2007. Т. 52. №12, С. 1998-2002

105. Shetty P., Shetty А. N. // J. Serb. Chem. Soc. 2005. Vol. 70. No.ll. P. 1357.

106. Wujec M., Pitucha M., Dobosz M., Kosikowska U., Malm A. // Acta Pharm. 2004.1. Vol. 54. P. 251.

107. Mirza S. P., Raju N. P., Madhavendra S. S., Vairamani M. // Rapid Commun. Mass

108. Spectrom. 2004. V. 18. P. 1666.

109. Raju N. P., Mirza S. P., Vairamani M., Ramulu A. R., Pardhasaradhi M. // Rapid

110. Commun. Mass Spectrom. 2001. Vol. 15. P. 1879.

111. Palraj Kalimuthu P., S. Abraham John // Electrochemistry Communications 11.2009. P. 367-370

112. Ku'smierek K. and Bald E. // Talanta. 2007. Vol. 71 (5). P. 22121-22125

113. Blanchflower W.J., Hughes P.J., Cannavan A., et. al. //Analyst. 1997. Vol. 122(9).1. P. 967-972

114. Zhang L., Liu Y., and Xie M.X., et. al. // J. Chromatogr. A. 2005. Vol. 1074. P. 1-7

115. Buick R.K., Barry C., Traynor I. M., et. al. // J. Chromatogr. B. 1998. Vol. 720 (12.. P. 71-79

116. Bald E., Kaniowska E., Chwatko G., Glowacki R. // Talanta. 2000. Vol. 50. P.1233-1243

117. Batjoens P., Be Brabander H.F., and De Wasch K. // J. Chromatogr. A. 1996. Vol.750 (1-2). P. 105-114

118. Zhang L., Liu Y., and Xie M.X., et. al. // J. Chromatogr. A. 2005. Vol. 1074. P. 1-7

119. Blanchflower W.J., Hughes P.J., Cannavan A., et. al. //Analyst. 1997. Vol. 122(9).1. P. 967-972

120. Zou Q.H., Liu Y. and Xie M.X., et. al. //Anal. Chim. Acta, 2005, Vol. 551. P. 184191

121. De Wasch K., Be Brabander H.F. and Impens S., et. al. // J. Chromatogr. A. 2001.1. V. 912(2). P. 311-317

122. Hollosi L., Kettrup A., and Schramm K.W. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2004. Vol.36(4). P. 921-924

123. Wei Y., Zhang Z.J., Zhang Y.T., and Sun Y.-H. // J. Chromatogr. B. 2007. Vol.854(1-2). P. 239-244

124. Meulemans A., Manuel C., Ferriere C., et. al. // J. Liq. Chromatogr. 1980. Vol.3(2), P. 287-298

125. Sun Z.S., Zhang W.L., Wen-yu Q., et. al. // Anal. Chim. Acta. 1999. Vol. 386 (1-2).1. P. 21-30

126. Skellern G.G., Knight B.I., and Stenlake J.B. // J. Chromatogr. 1976. Vol. 124(2).1. P. 405-410

127. Черновьянц М.С., Долинкин А.О., Хохлов Е.В. // Журн. аналит. химии. 2009. Т. 64. №8. С. 850-853

128. Черновьянц М. С., Хохлов Е. В., Лыкова Е. О., Долинкин А. О. // Журн. аналит. химии. 2007. Т. 62. № 3. С. 295.

129. Черновьянц М.С., Долинкин А.О., Браславская И.В. // Журн. аналит. химии. 2008. Т. 63. №9. С. 930-934

130. Арзамасцев А.П., Григорьев Н.Б., Ордабаева С.К. и др. // Хим.-фарм. журн. 1992. Т. 26(9-10). С. 126-127

131. Лебедева М.И., Борисова Р.В., Исаева Б.И. и др. // Хим.-фарм. журн. 1979. Т. 13 (12). С. 89-91

132. Katarzyna S.and Zbigniew F. // Chem. Analit. 1997. Vol. 42 (3). P. 425-433

133. Sanchesz-Pedreno C., Albero M.I., Garcia M.S., et. al. // Anal. Chim. Acta. 1995. Vol. 308 (1-3). P. 457-461

134. Anastasios E., Paraskevas T.D., Maria N., et.al. // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 505 (1). P. 129

135. Soledad G.M., Albero M.I. and Sanchesz-Pedreno C. // Analyst. 1995. Vol. 120 (1). P. 129-133

136. Aslanoglu M. and Peker N. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. Vol. 33 (5). Р. 11431147

137. Berka A., Velasevie K. and Nikolic K. // Pharmazie. 1989. Vol. 44(7). P. 499

138. Nikolic K.and Velasevie K. // Pharmazie. 1987. Vol. 42(10). P. 698

139. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М: Мир. 1976. С.541.

140. Boraei А. А. А. // J. Chem. Eng. Data. 2001. Vol. 46. Р. 939

141. Boraei А. А. А., Mohamed А. N. // J. Chem. Eng. Data. 2002. Vol. 47. Р. 987.

142. Rosokha S.V., Newton M.D., Head-Gordon M., Kochi J.K. // Chemical Physics. 2006. Vol. 324. P. 117-128

143. Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. М.: ИЛ. 1957.

144. Sheldrick G.M. (1998а). SAD ABS v.2.01, Bruker/Siemens Area Detector Absorption Correction Program, Bruker AXS, Madison, Wisconsin, USA

145. Sheldrick G.M. (1998b). SHELXTL v. 5.10, Structure Determination Software Suite, Bruker AXS, Madison, Wisconsin, USA.

146. Степин Б.Д. // Усп. хим. 1987. Т. 8. С. 1273-1295.

147. Зефиров Ю.В., Зоркий П.М. // Усп. хим. 1995. Т. 64. С. 446-461

148. Dongsheng Liu, Yaping Xu, Xinfa Li, Shaoming Ying and Wentong Chen // Acta Cryst. 2008. E64, o247

149. Brito I, Ca'rdenas A, Mundaca A, Villalobos H, Lo'pez-Rodn'guez M // Acta Crystallogr. Sect E 63. 2007. o2581

150. Kim Y-J, Han J-T, Kang S, Han WS, Lee SW // Dalton Trans. 2003. P. 3357

151. Allen FH (2002) Acta Crystallogr Sect В 58:380

152. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир. 1994. 273 с.

153. Курбатова С. В., Сайфутлинов Б. Р., Ларионов О. Г., Мешковая В. В. // Журн. физ. химии. 2009. Т. 83. № 3. С. 557-567.

154. Litwinienko G., Ingold К. U. // J. Org. Chem. 2003. Vol. 68. P. 3433-3440.