Иммобилизация ферментов на неорганических и органических полимерных носителях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

УДК 541.64+577.15+547.558

На правах рукописи

Г Г 5 ОД

БЕКТЕНОВА ГУЛЬНАРА АМАНТАЕВНА ' ' ' ^

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ И ОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ

02.00.6 - химия высокомолекулярных соединений 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Республика Казахстан Алматы 2000

Работа выполнена в лаборатории физической химии ордена Трудового Красного Знамени Института химических наук им. А.Б.Бектурова Министерства образования и науки Республики Казахстан

член-корреспондент НАН РК, доктор химических наук, профессор Е.А. Бекгуров

доктор химических наук, профессор Б.А. Мухитдинова

член-корреспондент НАН РК, доктор химических наук, профессор С.М. Адекенов

доктор химических наук, профессор Б.Р. Таусарова

Казахский государственный национальный университет им. Аль-Фараби.

Защита диссертации состоится 23 июня 2000 г. в 14 00 час. па заседании диссертационного совета Д 53.18.01 при Институте химических наук им. А.Б. Бектурова Министерства образования и науки Республики Казахстан по адресу: 480100, г. Алматы, ул. Ш. Уалиханова, 106.

" С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химических наук им. А.Б.Бектурова МОН РК.

Автореферат разослан_ мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Г9Р9.С\ О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство практически важных химических реакций протекает при участии различных катализаторов. Среди них особое место занимают полимерные катализаторы биологического происхождения - ферменты, обладающие исключительно высокой каталитической активностью и уникальной групповой или индивидуальной специфичностью. К сожалению, широкое практическое применение натавных ферментов затруднено из-за их недостаточной технологичности, связанной, прежде всего с их лабильностью и экономической нецелесообразностью использования в гомогенных растворах. Эти недостатки можно ликвидировать с помощью ферментов, связанных с носителем различными способами, т.е. путем их иммобилизации.

В настоящее время преимущества использования иммобилизованных ферментов очевидны, поэтому их применение ежегодно расширяется. Получение иммобилизованных ферментов является, например, одним из ключевых моментов создания ферментативных аналитических систем. Несмотря на широкий выбор носителей и методов иммобилизации, проблема поиска, разработки и исследования новых способов, спенсеров и носителей для иммобилизации ферментов является одной из актуальных задач фундаментальной химической науки. При этом наиболее перспективны методы иммобилизации, позволяющие максимально сохранять каталитическую активность ферментов в процессе иммобилизации и повышающие стабильность иммобилизованных препаратов при последующем использовании. В зависимости от метода иммобилизации и дальнейшего использования связанных форм фермента к носителям предъявляются определенные требования. В качестве подложек, носителей для иммобилизации ферментов с успехом могут применяться природные и синтетические материалы органического и неорганического происхождения, например, целлюлозы, синтетические полимеры и гели, иониты, неорганические оксидные материалы.

Среди различных методов иммобилизации наиболее широкое распространение получило ковалентное связывание фермента с носителем. При этом носитель должен иметь жесткую структуру, легко модифицироваться и активироваться, не проявлять сорбционных свойств. Связывание фермента с матрицей носителя в этом случае происходит за счет функциональных боковых и концевых амино- и карбоксильных групп белка. При этом часто нарушается нативная конформация белковой макромолекулы, что приводит к частичной или полной потере каталитической активности фермента. Глубина этой инактивации зависит от условий проведения реакции, а также от свойств носителя и сшивающего агента - спейсера. Поэтому во многих случаях спенсеры являются критическим звеном в технологии получения иммобилизованных ферментов и создания биосенсоров на их основе. Используя в качестве спейсеров соединения, специфически взаимодействующие с функциональными группами фермента, не входящими в его активный центр и, следовательно, не участвующими в каталитическом процессе, можно значительно снизить отрицательные последствия иммобилизации. Для ферментов-гликопротеинов, например, имеется возможность осуще-

ствить иммобилизацию за счет карбогидратной части, не входящей в активный центр фермента. В этой случае вероятность потери ферментативной активности в процессе иммобилизации уменьшается.

В последние годы бурное развитие претерпевает синтез и исследование полимерных материалов с новыми специфическими свойствами - полимерных гидрогелей, способных обратимо реагировать на незначительные изменения свойств внешней среды, и высокопроницаемых ионитов. Это открывает новые возможности конструирования и использования функциональных иммобилизованных биокаталитических систем с новыми полезными свойствами, что также, несомненно, является актуальной задачей. Сорбционные системы, полученные в результате необратимой или высокоселективной сорбиии ферментов с сохранением их физиологических функций, представляют большой теоретический и практический интерес. С их помощью можно моделировать различные биологические процессы, на их основе разрабатываются высокостабильные лекарственные формы пролонгированного действия, создаются высокоэффективные и высокочувствительные ферментные анализаторы. Все сказанное указывает на актуальность теоретического и экспериментального рассмотрения сорбционно иммобилизованных на различных носителях ферментативных систем с единых теоретических позиций. Кроме того, несмотря на существенные различия методов иммобилизации, два основных из них - ковалентный и сорбционный - также могут рассматриваться с единых позиций как процессы с прямоугольной изотермой.

Цель работы - разработка научных основ и методов химической и сорбци-онной иммобилизации ферментов на различных носителях, выявление основных закономерностей и особенностей взаимодействия биологических макромолекул с полимерными гидрогелями, разработка и получение высокоактивных и стабильных биокатализаторов для использования в различных областях биотехнологии, медицины, пищевой промышленности, а также для анализа и контроля окружающей среды.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- синтез, спектральное и хроматографическое исследование производных фенилбороновой кислоты, определение их кислотных свойств в водных растворах, корреляция структура - свойство;

- модельное исследование комплексообразования бороновых кислот с диодами в динамических и статических условиях;

- активирование неорганических кремнеземных носителей бифункциональными бороновыми кислотами;

разработка химического метода иммобилизации ферментов-гликопротеинов и оптимизация условий иммобилизации глюкозооксидазы с помощью спейсеров на основе бороновых кислот;

- разработка нового метода иммобилизации ацетилхолинэстеразы;

- систематическое теоретическое рассмотрение термодинамики локальных сорбционных равновесий с участием белков в системе гелевый сорбент - внеш-

ний раствор и некоторые подходы к исследованию неравновесных сорбционных систем;

- экспериментальное исследование сорбционной иммобилизации ферментов на примере каталазы на различных ионных полимерных гидрогелях в зависимости от различных условий внешней среды (рН, ионной силы, концентрации фермента), кинетики и обратимости процесса;

- исследование адсорбционной иммобилизации ацетилхолинэстеразы и глю-козооксидазы на углеродных и кремниевых носителях;

- исследование возможности использования иммобилизованных ферментов для анализа метаболитов, ингибиторов и токсичных соединений.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• Синтезированы новые спейсеры на основе бифункциональных производных фенилбороновой кислоты и изучено влияние различных заместителей на их кислотные свойства; впервые методом ВЭЖХ установлена их индивидуальность. Детальное ПМР-спектроскопическое исследование синтезированных спейсеров позволило впервые охарактеризовать вклад дигидроксиборильной группы в химические сдвиги ароматических протонов замещенных бензолов.

• Впервые спектрофотометрическим методом определены константы ионизации 16 бороновых кислот в водных растворах, охарактеризовано влияние различных заместителей на кислотность В(ОН)2-группы. На основании полученных спектральных, хроматографических, физико-химических данных впервые установлена корреляция связи структура - свойство для данного класса соединений.

• Впервые проведено систематическое теоретическое и экспериментальное исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержащими твердыми фазами как моделями гликопротеинов в статических и динамических условиях. Впервые получены систематические данные по хроматографическому удерживанию бороновых кислот на диолсодержащих носителях в водных растворах, а также по их константам комплексообразования с поливиниловым спиртом.

• Получены новые активированные кремнеземные носители для химической иммобилизации ферментов-гликопротеинов, целых клеток и клеточных компонентов, а также для аффинной хроматографии диолсодержащих соединений.

• Разработан новый способ и оптимизированы условия химической иммобилизации глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы путем использования подходящих спейсеров на основе бороновых кислот и проведения иммобилизации в условиях образования стабильного боронат-диольного комплекса, с одной стороны, и проявления максимальной ферментативной активности, с другой, при сохранении этой активности в процессе иммобилизации, в условиях хранения и непрерывной эксплуатации. Для ацетилхолинэстеразы иммобилизация данным методом проведена впервые.

• Впервые проведено систематическое рассмотрение с единых теоретических позиций сорбционной иммобилизации биополимеров на различных типах полимерных гелевых носителей.

• Впервые систематически экспериментально исследованы процессы сорб-ционного взаимодействия каталазы с различными ноногенными полимерными

гидрогелями в зависимости от различных факторов внешней среды, установлены основные закономерности и особенности этого взаимодействия. Показано, что сорбция глобулярных белков полимерными гидрогелями происходит в пространстве и времени как типичный процесс образования и эволюции неравновесных систем и представляет собой полифункциональное, многоточечное взаимодействие, приводящее к большим коэффициентам распределения и необратимости процесса, что позволяет рассматривать химическую и сорбцион-ную иммобилизацию ферментов на гелевых носителях с единых позиций как процессы с прямоугольной изотермой сорбции, характерной для необратимо иммобилизованных ферментных систем.

• Впервые показана возможность использования катионных полимерных гидрогелей полналлнламина и полиэтиленимина, а также полученных на основе ВЭМЭА для традиционной сорбционной иммобилизации каталазы.

Практическая ценность работы состоит в проведении систематических исследований по разработке нового способа химической иммобилизации фер-ментов-гликопротеинов на кремнеземных носителях, обладающих полупроводниковыми свойствами, с помощью новых бифункциональных спенсеров на основе фенилбороновых кислот. Разработанный метод иммобилизации обладает несомненными преимуществами при необходимости близкого расположения фермента, например, к электродной поверхности для достижения эффективного прямого электронного переноса между ними и может быть рекомендован при создании чувствительных элементов биосенсорных систем для клинической диагностики, биоскрининга новых физиологически активных соединений и других областей биотехнологии. Кроме того, предлагаемый метод может быть рекомендован для иммобилизации целых клеток и клеточных компонентов за счет полисахаридной части клеточных стенок. Хроматографические носители, модифицированные бифункциональными бороновыми кислотами, могут успешно применяться в аффинной хроматографии для разделения и анализа диолсодер-жащих соединений, в частности, Сахаров.

На основе развиваемой теории и выявления основных закономерностей сорбционного взаимодействия белков с гелевыми носителями разработаны простые и эффективные методы и оптимальные условия сорбционной иммобилизации ферментов, в частности каталазы, на катионных и анионных полимерных гидрогелях. Получены высокоактивные полимерные комплексы каталазы, стабильные при хранении, при высоких температурах и при высоких концентрациях пероксида водорода, что резко расширяет области их применения.

Полученные в работе иммобилизованные ферменты могут найти применение в различных аналитических биосенсорных системах, в ингибиторном анализе токсичных соединений, в биоскрининге новых физиологически активных соединений, что продемонстрировано на примере холинэстеразной, каталазной и люциферазной систем.

На защит)' выносятся следующие положения (в скобках указаны шифры специальностей, которым соответствует выносимое на защиту положение):

■ методы синтеза и исследования новых спенсеров на основе производных фе-нилбороновой кислоты для химической иммобилизации ферментов, корреляция их спектральных, хроматографических, физико-химических характеристик с химическим строением (02.00.10);

■ модели и теоретическое описание комплексообразования бороновых кислот с диолами и закономерности их взаимодействия в статических и динамических условиях (02.00.06, 02.00.10);

■ новый способ химической иммобилизации ферментов-гликопротеинов на активированных бифункциональными бороновыми кислотами носителях, на примере глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы (02.00.10);

теоретическое описание локального равновесного распределения белков между полимерными гидрогелями и внешним раствором на фоне низкомолекулярного электролита и некоторые подходы к описанию неравновесных сорбционных систем (02.00.06);

- закономерности и особенности сорбционного взаимодействия ферментов с новыми полимерными материалами - полимерными гидрогелями в зависимости от различных факторов внешней среды (02.00.06);

методы получения новых полимерных комплексов фермента (иммобилизованной каталазы), обладающих высокой ферментативной активностью, повышенной устойчивостью к действию температуры, pH, ингибиторов и стабильных при хранении (02.00.06);

■ методы анализа метаболитов, ингибиторов и токсичных соединений с использованием иммобилизованных ферментов (02.00.10).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе на-травления и постановке исследований, теоретическом обосновании задач, раз-)аботке методических подходов, непосредственном участии в проведении экс-1еримента, интерпретации и обобщении полученных результатов

Публикации п апробация работы. Основное содержание диссертации из-южено в 62 печатных работах. Результаты работы докладывались на IV Всесо-озном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1987), Международном симпозиуме "Новые достижения в жидкостной хромато-рафни" (Балатон-Цеплак, 1986), I Всесоюзном симпозиуме "Препаративная ;роматография физиологически активных веществ на полимерных сорбентах" Ленинград, 1988), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология: потение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине" Москва, 1991), XVIII Межвузовской конференции молодых ученых Современные проблемы физической химии растворов" (Ленинград, 1991), 36->м Международном конгрессе ИЮПАК по макромолекулярной химии (Женева, 997), Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики юлисахаридов (целлюлоза, хитин, пектин) (Ташкент, 1997), Международном 1икросимпозиу.ме "Коллоиды и поверхности" (Алматы, 1998), 2-ом Междуна-юдном симпозиуме по полиэлектролитам (Нагойя, 1998), Международной парной конференции "Природные соединения - регуляторы метаболизма и адап-ации растений" (Алматы, 1999), 5-ом Международном симпозиуме ученых

тюрко-язычных стран по полимерам и полимерным композитам (Алматы, 1999), 4-ом и 5-ом Международных симпозиумах по полимерам для продвинутых технологий (РАТ-97, Лейпциг,1997; РАТ-99, Токио, 1999), Международных рабочих совещаниях "Неравновесность и неустойчивость динамических структур в природе" (Алматы, 1998) и "Неравновесные системы многих тел" (NEMBS-99, Алматы, 1999), 219-ой Международной конференции Американского химического общества (ACS Spring 2000, Сан-Франциско, 2000).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести разделов основной части, в которых обобщены результаты проведенных автором исследований, критически освещено состояние изучаемого вопроса в литературе, обоснованы направления и описаны экспериментальные методики исследований автора, заключения, списка использованных источников.

Первый раздел посвящен систематической разработке химического способа иммобилизации ферментов-гликопротеинов на примере ацетилхолинэстеразы и глюкозооксидазы, включая синтез спейсеров на основе фенилбороновой кислоты, характеристики их свойств, модельные исследования их взаимодействия с диолами, позволившего оптимизировать условия иммобилизации, и иммобилизацию ферментов на активированных бороновыми кислотами кремнеземных носителях и исследование их стабильности.

Во втором разделе, учитывая сложность взаимодействующих объектов, изложены модельные представления о различных типах сорбентов и белков.

В третьем разделе рассмотрены термодинамика локальных сорбционных равновесий с участием белков для различных типов сорбентов с применением моделей, а также изотермы сорбции биополимеров из буферных систем геле-выми носителями. Изложены некоторые подходы к описанию неравновесных сорбционных систем..

Четвертый раздел посвящен экспериментальному исследованию сорбцион-ной иммобилизации ферментов на различных синтетических полимерных гидрогелях и природных гелевых. носителях, а также на углеродных и неорганических оксидных материалах. При этом показано, что основные теоретические положения работы согласуются с экспериментом.

В пятом разделе отражена практическая ценность работы. Рассмотрены новые возможности использования и исследования иммобилизованных ферментов по релаксации ферментативной активности на примере холинэстеразнон, ката-лазной и люциферазной систем при воздействии ингибиторов.

В экспериментальной части работы (раздел 6) описаны материалы, аппаратура и методы исследований, использованные в работе, приведены методики выполненных экспериментов.

В заключении кратко сформулированы основные результаты проведенного исследования, приведены общие выводы по работе.

Диссертация изложена на 287 страницах текста, содержит 25 таблиц, 97 рисунков. Список использованных источников включает 5S3 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Химическая иммобилизация ферментов-глнкопротеинов

Конструирование поверхностей носителей для иммобилизации ферментов-гликопротеинов, а также целых клеток и клеточных компонентов через их кар-богидратную часть с целью создания биосенсорных устройств предполагает использование спенсеров, полученных на основе ароматических производных борной кислоты - фенилбороновых кислот (ФБК) с геминальными гидроксиль-ными группами.

Первая стадия происходящего при этом комплексообразования представляет собой кислотно-основное взаимодействие, глубина которого зависит от силы бороновой кислоты и, следовательно, рН раствора.

Представлялось целесообразным для каждого фермента-гликопротеина подбирать в качестве спейсера бороновую кислоту, ионизация которой происходила бы в области рН, оптимальной как для образования стабильного боро-нат-диольного комплекса, так и для функционирования фермента.

С этой цель.1 нами были составлены удобные для практического использования схемы синтез борсодержащих соединений и синтезирован ряд бороно-вых кислот (БК) с учетом влияния различных заместителей на их кислотные свойства.

1.1 Синтез новых С1юйССр0В „а основе бороновых кислот к установление их структуры

В результате проведения синтети-еских работ были получены различные двух- и трехзамешенные производные и (Ж. Исходными соединениями в ряду п- и м-толилборных кислот были п-бромто;.70л и м-бромтолуол соответственно.

Полученные п- и м-толилборные кислотк подвергали дальнейшим превращениям. Нужно отметить, что как синтез само» М-ТБК, так и ее превращения проходят значительно легче и во многих случаях Лучшим выходом, чем соответствующие превращения в ряду п-производных.

Индивидуальность полученных соединений устансалена и подтверждена методом высокоэффективной жидкостной хроматографчи (ВЭЖХ) Анализ эсуществляли в изократическом режиме на стандар'ной колонке с носителем содержащим нитрильные группы. Результаты хрома-о>тафИроваШ1Я представ-пей ы в таблице 1.

Бороновые кислоты выходили одним узким сим- ~трично. „,,ком за ключением карбоксипроизводных, которые, по-в,дИМОМУ> пзаим0Я6"- ..от с матрицей носителя, что приводит к увеличен--0 констант удерживания их и., колонке и расширению соответствующих <^оматогРаФическнх пиков. При па-1ичии примесей вещества очищались дополнительной перекристаллизацией, "ледует отметить, что в литературе не найдено сведений по хроматогра-

фии бороновых кислот, и метод ВЭЖХ применен для установления индивидуальности БК впервые.

Таблица 1. Удерживаемые объемы индивидуальных бороновых кислот

№ п/п Бороновые кислоты Удерживаемые объемы, мл

1. ФБК 4,65

2. м-ЫН2-ФБК 13,70

3. п-ТБК 4,99

4. п-СООН-ФБК 16.48

5. п-СООСНтФБК 6,48

6. 2-МОз-4-СООН-ФБК 15,81

7. 2-Ш2-4-СООСНгФБК 5,20

8. м-ТБК 6,28

9. м-СООН-ФБК 11,19

10. м-СООСНтФБК 5,36

11. 3-СООН-5-ЫО,-ФБК 13,22

12. З-СООСНгЗ-ЯСь-ФБК 8,69

13. З-Шз-ТБК '6,84

14. ш-Вг-п-ТБК 12,70

С целью подтверждения структуры полученных соединений и введения В(ОН);-группы было проведено их спектральное исследование методами ЯМР-' Н, -ПС, -"В, ИК- и масс-спектроскопии.

Метод ПМР-спектроскопии был выбран в качестве основного для установления и подтверждения структуры полученных соединений. Этот метод, основанный на принципе аддитивности, позволяет с довольно высокой точностью (±0,24 м.д.) определять химические сдвиги кольцевых протонов с помошыо констант экранирования, полученных из данных ПМР монозамешенных бензолов. Чтобы вычислить химические сдвиги ароматических протонов бороновой кислоты, к химическому сдвигу протонов бензола прибавляют соответствующие константы экранирования. В качестве растворителя был выбран метанол. Найденные константы экранирования о-, м- и п-протонов монозамешенных бензолов приведены в таблице 2.

Таким образом, используя эмпирически найденные константы экранирования и соответствующие модельные соединения, можно с большой достоверностью определять структуру новых синтезированных полизамещенных бензолов. Полученные результаты позволяют извлечь новую информацию о вкладе В(ОН)2-группы в химический сдвиг сигнала ароматических протонов в замещенных бензолах.

Проведенное спектральное исследование, наиболее детально выполненное методом ПМР-спектроскопии, полностью подтверждает структур}' полученных

соединений. Кроме того, для установления индивидуальности БК впервые в практике синтеза и изучения этих соединений был использован метод ВЭЖХ

Таблица 2. Химические сдвиги ароматических протонов монозамешенных бензолов в разбавленных растворах метанола и константы экранирования

(5 = - бгмтоаа)

Заместители 5К, м.д. 5, м.д.

орто мета пара орто мета пара

Н 7,30 7,30 7,30 0 0 0

СН3 7,13 7,13 7,13 -0,17 -0,17 -0,17

(-0,20)" (-0,20)' (-0,20)*

СООН 8,03 7,43 7,53 0,73 0,13 0,23

(0,85) (0,18) (0,27)

N02 8,10 7,56 7,86 0,80 0,26 0,38

(0,95) (0,26) (0,38)

В(ОН), 7,72 7,32 7,32 0,42 0,02 0,02

(-)* (-)' (-Г

* в скобках приведены литературные данные. Растворитель СС14. " литературные данные отсутствуют.

7 из синтезированных БК являются бифункциональными и могут использоваться в качестве новых спенсеров для иммобилизации гликопротеинов, либо для создания биоспецифических носителей для аффинной хроматографии.

1.2 Константы ионизации бороновых кислот

Поскольку иммобилизация ферментов с помощью бороновых кислот осуществляется в водных растворах, для нас чрезвычайно важны были характеристики кислотности, полученные в воде. Весьма удобным методом при определении рКа труднорастворимых веществ является спектрофотометрический метод. Результаты спектрофотометрического титрования всего ряда синтезированных производных ФБК приведены в таблице 3.

Как известно, под действием электроотрицательных заместителей сила кислот существенно увеличивается в ряду СО ОН < Вг < С1 < Б < NОг.

Введение электроноакцепторной карбоксильной группы в молекулу ФБК должно повышать константу ионизации дигидроксиборильной группы. Однако в области ионизации В(ОН)2-группы (рН>6) карбоксильная группа полностью тонизирована (рКа1), что приводит к подавлению ионизации соединений по В(ОН)гфуппе (,рК„Д Поэтому для п- и м-карбоксипроизводных ФБК мы, вероятно, получили более низкие значения второй константы ионизации, чем можно 5ыло ожидать. Показано, что "защита" карбоксильной группы в метиловых

эфирах п- и м-карбокси-ФБК обеспечивает независимость ионизации В(ОН)2-группы, в результате увеличивается кислотность последней.

Таблица 3. Константы ионизации бороновых кислот

N п/п Производные фенилбороновой кислоты Рка Ка

СООН-Ф В(ОН)2-гр СООН-гр В(ОН)2-гр

I. ФБК' 8.90 1,2бхЮ"9

2. м-Шз-ФБК* 9,15 7,08x10"'°

3. п-ТБК 9,26 5.50x10'"'

4. п-СООН-ФБК 3,95 8,56 1,12x10-' 2,75x10"9

5. п-СООСНз-ФБК 7,69 2.04x10"к

6. м-ТБК 9,00 1,00x10"9

7. м-СООН-ФБК 4.04 8,56 9.12x10"5 2,75x10"9

8. м-СООСН,-ФБК 7,94 1,15x10"8

9. 2-ЫО2-4-С00Н-ФБК 3,42 8,79 З^хЮ-1 1,62x10"9

10. 2-КО,-4-СООСН,-ФБК 8,36 4,35x10"9

11. 3-С00Н-5-Ы02-ФБК 3,43 6,85 3,80x104 1,41х10'7

12. 3-С00СН,-5-Ы03-ФБК 6,59 2,57x10"7

13. 3-СО-№1-С6Н4-№Н2-5--ЫОг-ФБК 6,45 3,55x10"'

14. З-ЫСЬ-ТБК 7,70 2,00x10"*

15. и-Вг-п-ТБК 9,49 3,24x10"'"

16. 3-Ш2-4-Вг-ФБК' 5,52 З^бхЮ"1'

* Получены в ИОХ УРО РАЛ.

Как 15 ожидалось, значительно повышены кислотные свойства бороновых кислот, содержащих нитрогруппу. Особенно эффективно введение нитрогруппы с другими электроноакцепторными заместителями.

Таким образом, с учетом влияния различных заместителей и их положения в молекуле бороновой кислоты можно предположить, что сила бифункциональных производных ФБК должна увеличиваться в ряду:

I II III IV V VI VII

(Для общности ФБК (II) также внесена в этот ряд).

Это предположение полностью подтверждается экспериментальными данными, за исключением соединения (VI). Аномально низкая кислотность 2-ЫО;-

4-СООН-ФБК, объясняется взаимодействием нитро- и дигидроксиборидьной групп, что подтверждается также данными ПМР-спектральных исследований.

Влияние электронодонорных заместителей проявилось, как и ожидалось, в уменьшении констант ионизации бороновых кислот. Следовательно, кислотные свойства бороновых кислот определяются их структурой, что является новым подтверждением корреляции структура - свойство для данного класса соединений.

При сравнении константы ионизации ФБК, определенной ранее потенцио-метрическим методом в воде, с нашими данными, полученными спектрофото-метрическим методом (Катл=1,37x10"9, Касф=1,26х10"9), показано, что результаты вполне сопоставимы и очень близки (Капмшо/ КасФ=1,08). Однако константы ионизации, определенные в водном и водно-спиртовом растворах при 25 "С, существенно различаются, что говорит о важной роли растворителя в процессе ионизации.

Таким образом, имея набор бороновых кислот и сопоставляя полученные новые данные по их константам ионизации и оптимальные значения рН-оптимума действия ферментов, можно для любого гликопротеина подобрать спейсер и проводить иммобилизацию в условиях наименьшей потери и максимального проявления каталитической активности.

1.3 Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолами

Различия кислотности дигидроксиборильных групп в синтезированных нами соединениях, должны обусловливать варьирование условий иммобилизации при использовании разных спейсеров. Поэтому нам представлялось целесообразным провести модельное исследование взаимодействия ряда БК с диолсодержащими твердыми фазами в зависимости от рН для выявления оптимальных условий образования стабильного боронат-диольного комплекса. Исследование ком-плексообразования проведено в динамических и статических условиях.

Исходя из известных представлений о механизме взаимодействия бороновых кислот с диолами и принимая, что в процессе взаимодействия происходит образование комплекса четырехкоординационного бора, была рассмотрена схема происходящих в динамических условиях равновесных процессов для различных состояний ионизации бороновой кислоты Я-В(ОН)2.

В качестве количественной характеристики комплексообразования можно рассматривать коэффициент распределения вещества (ФБК) между неподвижной фазой и раствором.

Были получены выражения для коэффициента распределения бороновых кислот для всех трех случаев и показано, что он зависит от значений констант лонизации соединений по дигидроксиборильной группе, констант связывания с толом, концентрации диольных групп на носителе и от рН раствора. Для кар-зоксипроизводных на коэффициент распределения оказывает влияние также 5еличина константы ионизации СООН-группы.

В первом приближении (без учета ионизации диольных групп) был проведен расчет коэффициентов распределения для всех трех случаев. Для всех производных ФБК получены однотипные э-образные кривые зависимости коэффициента распределения от рН, смещенные в более кислую или более щелочную область в соответствии с их константами ионизации. Точка перегиба на этих кривых соответствует рКа дигидроксиборильной группы бороновых кислот.

Таким образом, на основании теоретического рассмотрения и результатов численного эксперимента можно предполагать, что наиболее прочный комплекс бороновая кислота - диол образуется при рН, близких к рКа В(ОН)2-группы. Дальнейшее увеличение рН нецелесообразно, так как при незначительной стабилизации комплекса возникает угроза разрушения связи С-В, неустойчивой в щелочной среде.

Экспериментальное исследование, в системе бороновая кислота - диол проведено методом ВЭЖХ в интервале рН 5,5-9,0. Прочность боронат-диольного комплекса характеризовали константой удерживания соответствующих бороновых кислот на колонке с носителем, содержащим привитые цис-1,2-диольные группы. Полученные результаты приведены на рисунке 1.

Зависимость констант удерживания бороновых кислот от рН 0,1 М фосфатного буферного раствора

а-1. ФБК (рКа 8,90); 2. п-ТБК (рКа 9,26); 3. м-ТБК (рКа 9,00); 4. м-АФБК (рКа9,15). б- 1. п-СООН-ФБК (рКа 8,56); 2. м-СООН-ФБК (рКа 8,56): 3. п-СООСНз-ФБК (рКа 7,69); 4. м-СООСН,-ФБК (рКа 7,94). в-1. 2-Ш;-4-СООН-ФБК (рКа 8,79); 2. 3-СООН-5-Ш2-ФБК (рКа 6,85); 3. 2-М02-4-С00СНгФБК (рКа 8,36 в водном спирте); 4. 3-СООСН,-5-ЫО:-ФБК (рКа 6,79). г-1. З-ЫСЬ-ТБК (рКа 7,70); 2. 3-Ы02~4-Вг-ФБК (рКа 5,52). Условия хроматографирования: скорость потока элюента 0,5 мл/мин, длина волны регистрации 254 нм, колонка 7,3 см х 3,0 мм, концентрация бороновых кислот 2х10"5 М.

Рисунок 1.

Неплохое совпадение с результатами численного эксперимента получено для фенилбороновой кислоты и ее производных, имеющих электронодонорные заместители. Кривые имеют точку перегиба в области ионизации соответст-

вующей бороновой кислоты, что говорит об образовании стабильного комплекса в этой области рН.

Слабо удерживаются на колонке карбоксипроизводные ФБК (рисунок 16, кривые ¡,2), что объясняется, по-видимому, сильным электростатическим отталкиванием карбоксилат-анионов ФБК-СОО" от одноименно заряженной в исследуемой области рН матрицы носителя (рКазюн=7,1)- Это предположение подтверждается ходом зависимости от рН констант удерживания метиловых-эфиров п- и м-карбокси-ФБК (рисунок 16, кривые 3, 4), когда карбоксильная группа "защищена" и ионизация отсутствует. Для них наблюдается сильное увеличение констант удерживания при рН 6,5-8,0, то есть в области, близкой к рКи эфиров (7,69 и 7,94 соответственно). Резкое уменьшение связывания при рН около 9,0, вероятно, объясняется катализируемым в щелочной среде гидролизом соединений по эфирной связи, в результате чего образуется анион карбок-си-ФБК, и на комплексообразование начинает влиять электростатическое отталкивание.

Похожие зависимости были получены для нитрокарбоксипроизводных ФБК. Некоторые отличия в ходе кривых вызваны, вероятно, влиянием ЫОг-группы на процесс комплексообразования (рисунок 1в).

Таким образом, полученные нами новые экспериментальные зависимости хроматографического удерживания бороновых кислот на колонке с диолсодер-жащим носителем от рН подвижной фазы имеют более сложный характер по сравнению с теоретическими предсказаниями, сделанными в первом приближении без учета всех факторов, влияющих на взаимодействие, и, прежде всего, определяются структурой бороновых кислот, т.е. вновь проявляется связь структура-свойство. Наиболее высокие константы удерживания наблюдаются в области рК соответствующих бороновых кислот. Таким образом, можно оптимизировать условия комплексообразования в процессах модифицирования различных носителей бороновыми кислотами, как для иммобилизации гликопро-теинов, так и для аффинной хроматографии диолсодержаших соединений.

Далее систему БК-диол исследовали в статических условиях. При исследовании физико-химического процесса в статических условиях появляется возможность изучения стационарного равновесного состояния, не осложненного кинетическими факторами. Удобство применения ПВС обусловлено тем, что он представляет собой полимер регулярной структуры, содержащий равноценные гидроксильные группы, связанные с вторичными углеродными атомами, вследствие чего реакции с ПВС протекают более закономерно и дают более четкие результаты, чем, например, с целлюлозой, содержащей ОН-группы, связанные как с первичными, так и с вторичными углеродными атомами и обладающие различной реакционной способностью.

Предварительно была рассмотрена математическая модель комплексообразования, соответствующая случаю образования простейшего боронат-диольного комплекса, когда две ОН-группы БК взаимодействуют с гидроксилами одной молекулы диола. Было получено выражение для оптимального значения рН,

при котором происходит образование стабильного боронат-диольного комплекса:

рНовт = 1/2 рКа - 1/2 рКп + .7. - (1)

Полеченное уравнение не только подтверждает наше предположение о зависимости значения рН011Т от константы ионизации бороновой кислоты и диола, но и указывают на его смешение в более кислую область относительно рКа (таблица 4).

Таблица 4. Зависимость рН максимального взаимодействия ПВС с бороновыми кислотами от кислотности В(ОН)ггруппы

N п/п Соединение рКа рНоит

1. ФБК 8,90 7.70

2. п-ТБК 9.26 7,90

л .5. п-СООН-ФБК 8.56 7,70

4. п-СООСНгФБК 7.69 6,35

5. 2-ЫО,-4-СООН-ФБК 8,79 7.65

6. 2-К Ог 4-СООСИ ,-ФБК 8,36 5,95

7. м-ТБК 9.00 8,40

8. м-СООН-ФБК 8,56 6,95

9. м-СООСЬЬ-ФБК 7,56 6,35

10. 3-СООН-5-ШгФБК 6,85 5,20

11. 3-СО0СН?-5-Ы02-ФБК 6,59 5.20

12. З-ЯСЬ-ТБК 7,70 6,345

13. 3. ЫОг4-Вг-ТБК 5,52 4,36

14. Бензойная кислота 4,12 -

Экспериментальное исследование комплексообразования бороновых кислот с диолом в статических условиях проводили, используя модель БК-ПВС, модифицированный циклогексаноном. Мерой прочности комплекса являлось относительное изменение оптической плотности раствора до и после взаимодействия. Результаты исследования приведены в таблице 4 и на рисунке 2. Полученные зависимости представляют собой практически однотипные кривые, имеющие максимумы, лежащие в более кислой области, чем рКа соответствующей кислоты.

Таким образом, на основании проведенного экспериментального исследования, которое в основном соответствует предложенной модели, можно достаточно точно подобрать оптимальные условия иммобилизации гликопротеинов с использованием в качестве слейсеров производных ФБК.

Зависимость относительного изменения оптической плотности растворов бороновых кислот до и после взаимодействия с поливиниловым спиртом отрН

ол о.г.

■ ■ • ' - * 1—1-1—1_I—I_

Л ^ 3 Т Л РН 4 7 4 рН

а - 1 - ФБК, 2 - п-ТБК, 3 - м-ТБК, 4 - 3-1ЧОгТБК, 5 - 3-Ж)2-4-Вг-ФБК, 6 - ю-Вг-п-ТБК; 6-1- п-СООН-ФБК, 2 - м-СООН-ФБК, 3 - 2-М02-4-С00Н-ФБК, 4 -3-СООН-5-Ю2-ФБК, 5 - бензойная кислота; в-Г- п-СООСН3-ФБК, 2 -м-СООСНз-ФБК. 3 - 2-Ы02-4-С00СН,-ФБК, 4 - 3-С00СНз-5-М02-ФБК; г -1 -м-ЫН2-ФБК, 2 - 3-СО-Ш-С6Н4-МН2-5-1чЮгФБК.

Рисунок 2.

1.4 Активирование кремнеземных носителей бороновыми кислотами

Иммобилизацию ферментов осуществляли на кремнеземных носителях - си-тохромах, содержащих на поверхности реакционноспособные карбокси- и ами-гюгруппы. Выбор кремнеземных носителей был обусловлен, прежде всего, тем, по они могут быть элементами полупроводниковых кремниевых структур и л про ко применяются при создании биосенсорных устройств. Кроме того, они являются механически прочными, химически инертными ко многим растворителям, устойчивыми к воздействию микроорганизмов. Наконец, они хорошо «учены, доступны и сравнительно дешевы.

Первой стадией разработанного нами способа иммобилизации является ак-ивирование носителей бороновыми кислотами хлорангидридным методом пу--ем образования связи по типу пептидной между аминогруппой носителя и кар-юксильной группой спейсера или наоборот.

Все синтезированные нами карбоксилсодержащие бороновые кислоты об-вдают различной реакционной способностью по СООН-группе и их можно >асположить в ряд:

4-СООН-ФБК < 3-СООН-ФБК < 2-Ж)2-4-СООН-ФБК < 3-С00Н-5-Ы02-ФБК

Эту закономерность можно объяснить влиянием различных заместителей и их положения на распределение электронной плотности в молекулах бороновых кислот. Как и следовало ожидать, самой реактивной является 3-С00Н-5-Ы02-ФБК. Взаимодействие данного соединения с пентахлоридом фосфора начиналось уже при растирании веществ, образовывался РОСЬ, и смесь быстро разжижалась, в то время как при получении хлорангидридов 2-Ы02-4-С00Н-ФБК и 3-СООН-ФБК реакция начиналась лишь при нагревании до 70 °С и 90 "С соответственно. Таким образом здесь также прослеживается влияние структурных особенностей БК на их свойства и соответственно реакционную способность.

Контроль за процессом модифицирования силохромов бороновыми кислотами осуществляли методом диффузного отражения в УФ-области, позволяющим снимать спектры твердых порошкообразных веществ.

Количественную оценку степени ковапентного связывания бороновых кислот с матрицей носителя проводили по разности статических обменных емкостей исходного и активированного силохромов по СООН- и ЫНт-группам. Во всех случаях наблюдалась высокая степень пришивки (94% - 100%). Результаты по степени заполнения белком модифицированных и немодифицированных бороновыми кислотами носителей также подтверждает высокую степень их связывания со спейсером (таблица 5).

Кроме того, был модифицирован с помощью 3-С00Н-5-М02-ФБК хромато-графический носитель на основе силикагеля УсЬгозрЬег БьЮО, предварительно обработанный 3-аминопропилтрнэтоксисиланом. В результате получен новый носитель, содержащий дигидроксиборильные группы, который может использоваться для аффинной хроматографии Сахаров, нуклеозидов и др. Колонка (0,3 см х 15 см), заполненная суспензионным методом этим носителем, не уступает по эффективности разделения стандартным хроматографическим колонкам.

Таким образом, были получены новые кремнеземные носители, активированные различными бифункциональными бороновыми кислотами: 3-№Ь-ФБК; 3-СООН-ФБК; 2-Ш2-4-СООН-ФБК, 3-С00Н-5-1М02-ФБК, которые могут использоваться для иммобилизации ферментов-гликопротеинов, целых клеток и клеточных компонентов, а также для аффинной хроматографии диолсодержа-щих соединений. Все карбоксипроизводные бороновых кислот были использованы в качестве спейсеров впервые.

1.5 Химическая иммобилизация фсрментов-глпкопротеинов

Иммобилизацию глюкозооксидазы (ГО) и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) проводили при +4 °С в фосфатном буферном растворе на четырех образцах силохромов, модифицированных бифункциональными бороновыми кислотами. рН буферного раствора подбирали на основе результатов проведенного нами на моделях изучения оптимальных условий образования боронат-диольного комплекса. Для стабилизации комплекса и уменьшения сорбции добавляли ЫаС1.

Для контроля параллельно для каждого образца в тех же условиях проводили сорбционную иммобилизацию гликопротеинов на силохромах, не модифицированных бороновыми кислотами. Это позволило сравнить влияние на каталитическую активность способа связывания ферментов с носителями.

Количество связанного фермента определяли по разности флюоресценции растворов гликопротеинов'до и после иммобилизации. В таблице 5 приведены результаты по степени заполнения поверхности носителей ферментом в зависимости от способа и условий иммобилизации.

Таблица 5. Условия иммобилизации и характеристики иммобилизованных

ферментов

рН Содержание Относитель

№ Метод им- им- фермента на ная актив-

п/ Носитель Спейсер мобилизации моби носителе, ность,%

п лиза- мг/г

ции

ГО ХЭ ГО ХЭ

1 Амино- 3-СООН- химическая 6,35 1,95 2,80 39,0 41,5

С\Х фбк

сорбционная 6,35 0,46 0,31 37,0 38,0

2 Амино-С\Х 2-И02-4-СООН-ФБК химическая 6,00 4,80 3,65 54,0 29,0

сорбционная 6,00 0 0 - -

л :> Ам и ноСАХ З-СООН-5- ш2-фбк химическая 5,40 4,00 2,75 55,0 30,0

сорбционная 5,40 0 0 - -

4 Карбокси-С\Х з-ЫНг-фбк химическая 7,90 3,93 2,90 25,0 49,0

сорбционная 7,90 0,72 0,78 27,0 52,0

Как видно из таблицы 5, степень сорбции ферментов зависит от рН и максимальна при проведении иммобилизации на карбоксшшрованном силохроме при рН 7,9, что составляет лишь 18% и 26% от количества ГО и АХЭ соответственно, иммобилизованных в тех же условиях на силохроме, модифицированном бороновой кислотой. В кислой среде сорбция практически не идет.

Эти данные достаточно убедительно свидетельствуют о разном характере связывания белка с модифицированным и немодифицированным носителем и указывают на то, что при использовании активированных бороновыми кислотами силохромов происходит химическое взаимодействие ферментов с носителем. Кроме того, тот факт, что иммобилизация происходит в растворе с высокой ионной силой (1 М ЫаС1), когда сорбция практически полностью подавляется, также говорит в пользу комшгексообразования между дигидроксибориль-ными группами носителя и карбогидратной частью фермента.

Была оценена потеря каталитической активности в процессе иммобилизации таблица 5), а также исследована стабильность иммобилизованных препаратов.

Активность иммобилизованных препаратов определяли амперометрическим методом, предполагая, что ее величина пропорциональна изменению силы тока электрохимического окисления одного из субстратов или продуктов ферментативной реакции: пероксида водорода в случае глюкозооксидазы или ацетилтио-холина в случае ацетилхолинэстеразы.

На основании приведенных в таблице 5 результатов по остаточной активности можно сделать вывод, что используемый в работе метод химической иммобилизации гликопротеинов через полисахаридную часть является таким же мягким по условиям проведения, как и сорбционный, способствующим сохранению высокой относительной активности. Остаточная активность зависит от рН раствора и максимальна при проведении «пришивки» в условиях, наиболее благоприятных для функционирования ферментов. Следовательно, при иммобилизации ГО и АХЭ не происходит сдвига рН-оптимума действия ферментов. Так, иммобилизованная ГО сохраняет более 50% активности нативного фермента, если иммобилизация проводится при рН около 6,0. При этом в качестве спенсера используются карбокси- и нитрокарбоксипроизводные ФБК с более высокими константами ионизации по дигидроксиборильной группе. Для АХЭ же, напротив, максимальная относительная активность (49%) наблюдалась при использовании буфера с рН 7,9, соответствующим рН-оптимуму действия АХЭ. Наиболее подходящим спейсером в этом случае является 3-ЫН2-ФБК, образующая прочный комплекс с ферментом в щелочной области рН. Необходимо подчеркнуть, что для АХЭ этот метод был разработан нами впервые.

В работе была также исследована стабильность иммобилизованных гликопротеинов при хранении и в рабочих условиях в сравнении с растворимой и сорбционно иммобилизованной формами ферментов.

На рисунке 3 приведены зависимости изменения активности ферментных препаратов во времени в присутствии субстратов и без них. Как видно из рисунка, устойчивость обоих ферментов к инактивации резко повышается при их иммобилизации. Сравнение полученных нами данных с литературными позволяет констатировать, что основной вклад в стабилизирующий эффект вносят химическая природа сшивающего агента (бороновые кислоты), поверхности носителя (силохромы) и способ иммобилизации (комплексообразование дигид-роксиборильных групп активированного носителя с полисахаридной частью фермента).

Таким образом, показано, что путем подбора подходящих бифункциональных спенсеров на основе бороновых кислот можно осуществлять химическую иммобилизацию ферментов-гликопротеинов, в частности, глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы, в оптимальных условиях прочного комплексообразова-ния фермента с носителем и максимального проявления исходной ферментативной активности при сохранении этой активности в процессе иммобилизации и во времени.

Предлагаемый метод сочетает в себе преимущества сорбцнонного по мягким условиям проведения и ковалентного по достигаемой прочности связи фермента с носителем, что позволяет получать иммобилизованные препараты ГО и АХЭ, обладающие высокой относительной каталитической активностью и стабильностью, как при хранении, так и в условиях непрерывной эксплуатации.

Кинетика инактивации иммобилизованных препаратов глюкозооксндазы (I) и ацетилхолинэстеразы (II) при хранении (а) и в условиях непрерывной

эксплуатации(б) I II

! - фермент сорбирован на носителе, 2 - фермент иммобилизован с помощью бороновых кислот: • - 3-С00Н-5-Ы02-ФБК, о - 2-Ы02-4-С00Н-ФБК,

п-СООН-ФБК, х - м-АФБК, 3 - растворимая форма. I. Условия хранения: 0,1 М фосфатный буферный раствор, рН 6,0, температура +4 "С. Условия эксплуатации: те же + 0,5 М раствор глюкозы. II. Условия хранения: 0,1 М фосфатный буферный раствор, рН 7,5, температура +4 "С. Условия эксплуатации: те же + 0,1 М раствор хлористого ацетилтиохолина.

Рисунок 3.

Этот метод особенно удобен при необходимости близкого расположения фермента к поверхности носителя, например, для достижения эффективного прямого электронного переноса между ферментом и электродной поверхностью при создании биосенсорных систем для клинической диагностики, биоскрининга новых физиологически активных соединений и других областей биотехнологии. Кроме того, разработанный метод может быть рекомендован также для иммобилизации целых клеток и клеточных компонентов, содержащих, как известно, полисахариды в составе клеточных стенок.

3 Теоретическое описание сорбциоинон иммобилизации глобулярных

белков

Сорбция белков является довольно сложным и часто практически необратимым процессом, а сорбционное равновесие устанавливается, как правило, очень медленно. Иногда описывают сорбционное поведение биологических макромолекул без подтверждения обратимости процесса, однако такой подход

недостаточно обоснован и корректен. Такие системы следует описывать с позиций термодинамики неравновесных процессов. Показана необходимость учета при описании реальных сорбционных систем, как термодинамических, так и кинетических факторов. Поэтому получаемые из термодинамического рассмотрения изотермы сорбции белков в обшем случае не применимы к сорбциониым состояниям в масштабах зерен (блоков) сорбентов и гелей. Однако можно принять, что они правомерны для локальных объемов в носителе.

Были рассмотрены модели термодинамического описания локальных сорбционных равновесий в системах объемный гомогенный сорбент - внешний раствор, гелевый сорбент - внешний раствор, адсорбционная поверхность - внешний раствор. Показано, что наиболее удобной является модель гелевого носителя, позволяющая наглядней и проще отражать и сопоставлять различные механизмы сорбции.

Рассмотрены особенности сорбции глобулярных белков гелевыми ионита-ми. Были получены различные виды изотерм сорбции белка для локальных объемов гелевых сорбентов, учитывающие основные взаимодействия в системе. При условии однородности сорбционных ячеек сорбента и частиц белка по заряду и другим состояниям изотерма сорбции глобулярных белков при низких заполнениях сорбента описывается уравнением:

[8]=[5г](1 + К[ь°])к! (2)

и для коэффициента распределения белка имеем:

кЕ = г„([Г]+[Е5,7-,01])/[Бг]=г1;(1 + к[ь"11)кг, (3)

где [б ]= [б ] и [§]= [б ] - суммарные концентрации сорбата (белка) во внешнем растворе и сорбенте; к - коэффициент распределения низкомолекулярных ионов; 9 и Ъ - заряды ионогенных групп сорбента и белка; 1ГЬ - молскулярио-ситовой коэффициент; К - константа комплексообразования. При отсутствии комплексообразования (К = 0)

Кг = гЛГ]/[Бг]=Г«кг (4)

Учет электростатических взаимодействий в обеих фазах в рамках теории Дебая-Хюккеля позволяет получить из (3) и (4) следующие зависимости:

к^^Ц^^НГуГ^Ы ке=^(у/УГ'\ (6)

где у и у - коэффициенты активности однозарядных ионов во внешнем растворе и ионите, 1 - число ионогенных групп в сорбционной ячейке.

Из (3)-(6) следует, что с увеличением концентрации внешнего раствора к = ]/[ь" ] будет уменьшаться, соответственно должен уменьшаться коэффициент распределения белка между понятом и внешним раствором. При этом очень большое значение имеет заряд белковой глобулы, который в первую очередь определяется рН раствора. Следует также подчеркнуть, что константы ионизации и, следовательно, эффективный заряд белковой молекулы, степень ионизации самого ионита и коэффициент распределения низкомолекулярных ионов изменяются с увеличением концентрации электролита (ионной силы).

Показано, что влияние гетерогенности в распределении ионогенных групп в объеме ионита на сорбцию также в значительной мере определяется зарядом сорбата, приводя к большим коэффициентам распределения полиэлектролитов (белков).

Известно, что образование дополнительных неионных связей сорбата с носителем ведет к повышению избирательности сорбции. В случае биополимеров роль этого фактора усиливается в результате увеличения числа и типа контактов сорбента и сорбата. Показано, что коэффициент распределения растет по экспоненте от числа связанных фрагментов (многоточечное взаимодействие) и пропорционально числу различимых ассоциатов (полифункциональное взаимодействие), которые может образовывать сорбат с адсорбционной поверхностью. И в том, и в другом случае это может привести к очень большим коэффициентам распределения и практически к прямоугольной изотерме сорбции и, следовательно, способствовать необратимости процесса сорбции белков.

Анализ изотерм сорбции глобулярных белков показывает, что они могут достаточно точно аппроксимироваться изотермой Лэнгмюра с крутым начальным наклоном, а в пределе - прямоугольной изотермой. Прямоугольные изотермы сорбции белков позволяют осуществлять прочную сорбционную иммобилизацию ферментов. Сорбция является наиболее мягким методом иммобилизации, при котором структура активного центра ферментов и структуры более высокого порядка изменяются минимально. Сорбционный метод прост в осуществлении, при этом иммобилизованный фермент обладает высокой каталитической активностью, сравнимой с активностью в растворе. Обычно считается, что сорбционные методы иммобилизации имеют существенный недостаток -невысокую прочность связи. Однако это имеет и свои преимущества, например, при регенерации носителя. В отличие от других методов иммобилизации, сорбированные ферменты после их инактивации в процессе работы могут быть легко заменены на активные ферменты непосредственно в реакторе без замены носителя. В ряде случаев иммобилизация приводит к повышению термостабильности ферментов. Помимо иммобилизующего фактора, ионогенные носители, благодаря повышенной ионной силе в них, иногда могут обеспечить увеличение стабильности ферментов, не выдерживающих деионизированные среды. Существующий в ионите значительный сдвиг рН по сравнению с раствором позволяет расширить в определенную сторону диапазон рН рабочих сред. Кроме того, ионит способен защитить фермент от ряда ингибиторов, связывая их. Поэтому, даже тогда, когда он сам не обеспечивает эффективной иммобилиза-

цин, его все равно целесообразно брать в качестве иммобилизующей основы, обеспечив иммобилизацию дополнительными средствами - ковалентным связыванием или заключением в гель.

Таким образом, иммобилизация ферментов на различных носителях позволяет использовать преимущества гетерогенного катализа и резко расширяет области их применения, а также открывает новые перспективы в исследовании ферментов.

Наиболее полно требованиям иммобилизации отвечают гидрофильные сорбенты и гели, позволяющие просто и достаточно эффективно осуществлять иммобилизацию ферментов при сохранении их активности. Несмотря на большое количество разнообразных способов и носителей для иммобилизации, исследования в этой области интенсивно продолжаются, особенно в связи с синтезом и исследованием новых полимерных материалов - полимерных гидрогелей, позволяющих получать обратимо и необратимо иммобилизованные биокатализаторы с новыми полезными свойствами.

4 Сорбционная иммобилизация ферментов на гелевых носителях

Для выявления границ применимости теории сорбционной иммобилизации глобулярных белков и ферментов и решения ряда прикладных задач были изучены процессы сорбции каталазы на ряде ионогенных (катионных, анионных, полиамфолитных) синтетических полимерных гидрогелей, широком наборе ионообменных целлюлоз, а также глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы на неорганических кремнеземных и углеродных материалах. При этом для всех перечисленных носителей, несмотря на их различные природу, текстуру и физико-химические свойства (степень гетерогенности, обменная емкость, набухаемость и др.) применима модель гелевого сорбента, позволяющая с достаточной степенью надежности рассматривать полимерные гидрогели (р—>-1) и неорганические оксидные носители (р->0) как крайние проявления гетерогенности сорбента, а ионообменные целлюлозы (0<р<1) имеют гелевые участки, на которых, в основном и происходит сорбция белков.

4.1 Исследование кинетики и обратимости сорбции

Основным условием применимости теории сорбции, базирующейся на равновесной термодинамике, к описанию реальных макросистем является равновесное состояние системы в момент ее экспериментального изучения и обратимость процесса. Состояние равновесия рассматривается как промежуточное состояние системы, ограниченное масштабами пространства и времени.

Систематической экспериментальное исследование сорбции ферментов в нашей работе проведено в основном на различных ионогенных полимерных гидрогелях.

Анализ состояния проблемы кинетического описания сорбционных систем на примере ионообменных целлюлоз показывает, что в настоящее время объек-

тивно существует большой разрыв между достаточно развитой теорией кинетики сорбции и экспериментальными возможностями решения кинетических задач. Это также касается исследования сорбции лабильных белков на относительно непрочных слабосшитых полимерных гидрогелях. В связи с этим кинетические данные используются нами в основном только для определения среднего времени установления промежуточного равновесия.

Скорость процесса сорбции и ее обратимость в значительной мере определяется природой и проницаемостью матрицы сорбента, размером сорбата и силой его взаимодействия с ионогенными группами и матрицей носителя.

Для карбоксильных катеонитов, имеющих различную природу и пористость матриц, было показано, что скорость и обратимость процесса сорбции макромолекул каталазы зависит от текстуры сорбента, количества поперечных связей и размера зерен сорбента. Во всех случаях процесс завершается установлением промежуточного равновесия в ограниченном приповерхностном слое зерен носителей, доступном для фермента. В результате резкого уменьшения коэффициента диффузии от периферии к центру зерна образуется оболочка, в которой находится основная масса белка. Полученные на различных гелевых носителях сорбционные системы термодинамически необратимы и для изотерм сорбции характерно явление гистерезиса. Однако при изменении условий процесса иногда можно добиться его частичной или полной обратимости.

Для определения параметров сорбционной иммобилизации также исследовалась кинетика сорбции каталазы P.vitale на различных ионогенных полимерных гидрогелях, которые, как указывалось выше, в высшей степени отвечают требованиям гомогенности. Полученные результаты показывают, что процесс сорбции макромолекул фермента развивается во времени, состояние равновесия в реальных условиях практически недостижимо. Проведение десорбции в тех же условиях не приводит к выходу фермента в раствор. Лишь меняя условия, можно десорбировать от 10% до 50% белка.

Кинетические кривые выходят на стационарный уровень в течение 5-10 дней, причем степень связывания и время сорбции зависят от степени сшивки, соответственно от степени набухания гелей. Наличие коротких линейных начальных участков на кинетических кривых может указывать на то, что процесс сорбционного связывания каталазы полимерными гидрогелями подчиняется закономерностям гелевой (внутридиффузионной) кинетики, следовательно, лимитирующей стадией процесса является диффузия макромолекул фермента с поверхности в объем геля, т.е. сорбция происходит не только во времени, но и в пространстве, причем масштаб пространства определяется размерами фазы геля или ограниченной глубиной проникновения сорбционного фронта.

Кинетические кривые, представленные в шкале логарифмического времени, показывают, что наиболее близки к состоянию насыщения процессы сорбции каталазы на ГПАК и ПААГ П-150, взаимодействие с которыми вследствие их относительно низкой набухаемости и соответственно низкой проницаемости матрицы для макромолекул каталазы происходит, по-видимому, в поверхностном слое геля. Сорбционные процессы на других гелях далеки от завершения.

Следовательно, мы имеем дело в основном с неравновесными сорбционными системами. Следует отметить, что кинетические кривые сорбции на ГГ1 и ГГЗ при больших временах имеют точки перегиба, особенно ярко выраженные из-за меньшей набухаемости для ГГЗ и связанные, видимо, с тем, что взаимодействие идет по разным механизмам, обусловленным структурными особенностями сополимеров ГГ1 и ГГЗ, либо сначала также происходит заполнение ферментом поверхностного слоя геля и образование сорбционной оболочки, а затем сорбированный белок равномерно распределяется во всем объеме геля, что соответствует равновесному состоянию системы. Скорость этого перераспределения зависит от ионной силы раствора и определяется диффузионными факторами. Это позволяет рассматривать сорбцию белков полимерными гелями как модель образования и эволюции неравновесных систем. В дальнейшем все эксперименты по сорбции на гидрогелях проводили выдерживанием одинаковых равновесно набухших в водном, водно-солевом или буферном растворе навесок гелей в течение 5-10 дней с целью достижения максимальной степени завершенности процесса.

4.2 Сорбционное взаимодействие ферментов с гелсвымп носителями

4.2.1 Зависимость сорбционного взаимодействия каталазы с полимерными

гидрогелям» от рН

Из теоретического рассмотрения следует, что основными параметрами, управляющими процессом сорбции белков на гелевых ионитах, являются рН, ионная сила внешнего раствора, свойства ионогенных групп и матрицы носителя. В связи с этим большой интерес представляло изучение зависимости сорбции каталазы от рН. Экспериментальные зависимости сорбции каталазы Р.укаЬ на различных катионных и анионных полимерных гидрогелях от рН фосфатного буферного раствора представляют собой изохроны сорбционного процесса. Для сопоставления с теорией они представлены на рисунках 4-5 в координатах коэффициент распределения - рН. Контроль за процессом сорбционного взаимодействия проводили по разности ферментативной активности и оптической плотности раствора до и после сорбции. Параллельно измеряли коэффициенты набухания гелей. Экспериментальный коэффициент распределения по определению равен отношению суммарной концентрации белка в сорбенте (геле) к его концентрации во внешнем растворе:

(где (2£ и - количество белка в сорбенте и растворе; - объем внешнего раствора, мл; \ус - навеска сорбента, г) и пропорционален теоретически рассчитываемому по уравнениям (5), (6), причем коэффициент пропорциональности равен коэффициенту набухания.

(7)

В общем случае коэффициент распределения белка между ионообменными гелевыми носителями и внешним раствором определяется коэффициентом распределения низкомолекулярных ионов к, зарядом белковой молекулы Z и временем проведения процесса. Представленные на рисунках 4, 5 результаты получены для изомолярных буферных растворов.

Зависимость коэффициента распределения (а, в) каталазы P.vitale между катионными гелями и внешним раствором и коэффициента набухания (б) гелей от рН 0,1 M фосфатного буферного раствора

1. ГПАлА; 2. ГПЭИ; 3. ГГ 1; 4. ГГ 2; 5. ГГ. КА„сх=80-100 Е/мл.

Рисунок 4.

Зависимость коэффициента распределения (а, б) каталазы между анионными гелями и 0,1 М фосфатным буферным (а) и водным (б) раствором и коэффициента набухания (в) гелей от рН

К)КС-Л?3, мп/г

I

Г рН

! рЫ

6 { рН

а, б - 1 - ПАкА - ПАК П-300; 2 - ПАК (№"); 3 - ПАкА - ПАК П-150; 4 - ПАкА -ПАК П-4; в - 1 - ПААГ; 2 - ПАкА - ПАК П-300; 3 - ПАК (№+). КАИсх.-70-100 Е/мл; Т=25 °С Рисунок 5.

Расчетным путем были получены зависимости заряда Z и log к2 от рН. Для катионных полимерных гелей, содержащих аминогруппы, в области рН от 4 до 8 степень их ионизации практически постоянна и варьирует в пределах от I до

0,97, поэтому степень набухания и молекулярно-ситовой коэффициент изменяются незначительно! Следовательно, изменение коэффициента распределения белка должно определяться изменением его заряда Ъ. Сопоставление полученных зависимостей с экспериментальными позволяет сделать следующие выводы.

Во-первых, наличие сорбции при рН<р1, где энергия электростатического взаимодействия белка с сорбентом равна нулю или даже положительна, указывает на то, что в данном случае имеет место гидрофобное взаимодействие или образование комплексов, стабилизированных системой водородных связей, что определяется структурой и составом гелевого носителя.

Другой причиной связывания каталазы в этой области рН может быть несоблюдение предпосылок упрощенной теории - возможности рассматривать заряд белка как точечный, электрическое поле вокруг глобулы в ионите симметричным. что выполняется при внедрении глобулы в гелевую фазу носителя. В этом случае белковая молекула приобретает свойства диполя и определяющую роль в связывании с носителем могут играть ион-дипольные или диполь-дипольные взаимодействия. Такая возможность рассматривается также рядом других авторов. Если сорбция каталазы ввиду ее большой молекулярной массы (250000) завершается на поверхности гелей и гелевых образований, то сорбция при рН< р1 может быть также объяснена неравномерным распределением заряда по поверхности макромолекул этого фермента. Такой эффект был продемонстрирован при моделировании сорбции АДГ на заряженной поверхности. Однако для каталазы, являющейся тетрамером и, следовательно, более симметричной глобулой, этот эффект должен проявляться в меньшей степени.

Во-вторых, относительно слабая сорбция белка при рН>р1 (1цКБ«^к/) указывает на то, что ионообменная емкость ионита используется незначительно вследствие стерических и кинетических причин. Особенно следует отметить кинетическую сторону вопроса, неучет которой не позволяет интерпретировать полученные изохроны сорбции. В частности, из равновесной теории следует, что при сорбционном взаимодействии каталазы с аминосодержащими полимерными гидрогелями зависимость сорбции от рН (в исследуемой области рН) должна быть без экстремума, монотонно возрастающей при увеличении рН, что можно видеть из результатов моделирования. Однако на экспериментатьных кривых рН-зависимости сорбции каталазы на указанных катионных (анионообменных) гелевых носителях (рисунок 4) имеется выраженный максимум сорбции в области рН 6,0-8,0. Наблюдаемые различия между результатами, ожидаемыми из равновесной теории, и экспериментальными данными можно объяснить на основе кинетико-термодинамического рассмотрения изохрон сорбции. Было показано, что при монотонном увеличении селективности равновесной сорбции на изохронах сорбции могут наблюдаться экстремумы. Именно такой случай реализуется при сорбционном взаимодействии каталазы с катионными гидрогелевыми сорбентами. С ростом заряда белка при рН>р1 растет равновесная селективность, однако при этом еще быстрее уменьшается коэффициент диффузии белка в гелевых носителях. В результате произведение

возрастающей и убывающей функций дает функцию с максимумом, который и проявляется на рН-зависимостях сорбции при не слишком больших временах процесса.

Выводы о неравновесном характере процесса сорбции катал азы на аминосо-держащих гелевых носителях могут быть распространены на сорбцию фермента и на других ионогенных сорбентах и гидрогелях. Ввиду того, что строгая теория неравновесных процессов, учитывающая кинетику заполнения сорбентов, для таких высокомолекулярных взаимодействующих объектов чрезвычайно сложна и громоздка, ограничимся лишь качественным или полуколичественным обсуждением полученных экспериментальных данных по сорбционному взаимодействию белков с полимерными гидрогелями.

С позиций равновесной теории рН-зависимости сорбции каталазы можно интерпретировать следующим образом. Для анионных гидрогелей, в качестве которых мы использовали частично гидролизованные (карбоксилированные) полиакриламидные гели (ПААГ) (.таблица 6) с различной степенью набухания и гель полиакриловой кислоты (ГПАК) (рисунок 5), а также для катионнообмен-ных целлюлоз выводы теории совпадают с экспериментальными данными. Таблица б.

Состав и некоторые свойства исследуемых полимерных гидрогелей (ГП

Образ Состав сополиме- Набуха- СОЕ, КА Содержание

цы ГГ ра, мол.% ем ость, мг-экв/г х Ю',Е/г. белка, мг/г

г/г

А'апшонные ГГ

ггГ ВЭМЭА-ВЭЭГ 20,3 4,4 55,0 67,0

(28:72)

ГГ2* ПВЭМЭА 6,0 7.2 10,5 12.6

ггз" ВЭМЭА - ЫВП 12,2 4.0 52,0 64,5

(40:60)

ПАлА ПАлА 11,0 6,8 70,0 101,2

ПЭИ ПЭИ 8,6 6.8 79,0 115,0

Полшшфолитные ГГ

ГГ4* ВЭМЭА-АкЫа 78,3 -Ш2:8,18 93,0 212,0

(55:45) -СООН:3,56

Анионные ГГ

П-300 ПАА- ПАК 250,0 2,0 27,5 57,9 (159,0)

(85:15) (77,0)

П-150 ПАА - ПАК 60,0 2,0 11,3 23,7

(85:15)

П-4 ПАА- ПАК 5,7 1,6 4,0 8,4

(88:12)

ПАК ПАК(Н+) 300.0 11.2 26,1 43.4

где ВЭМЭА - виниловый эфир моноэтаноламина, ВЭЭГ - виниловый эфир эти-ленгликоля, Ь'ВП - Ы-винилпирролидон, ПАлА - полиаглила.мин, ПАА - поли-акриламид, ПАК - полиакриловая кислота, ПЭИ - полиэтиленимин. - образцы предоставлены кафедрой ВМС КазГНУ им. Аль-Фараби.

В щелочной области рН, где катиониты и белок заряжены одноименно и белок подвергается доннановскому исключению, сорбция минимальна. С уменьшением рН растет положительный заряд каталазы, соответственно должна расти сорбция, проходя через максимум, положение которого с позиции равновесной теории определяется константами ионизации функциональных групп гелевого носителя и изоэлектрической точкой каталазы. На его положение должна также влиять глубина комплексообразования фермента с ионогенными группами сорбента. В результате в интервале рН от 4,0-4,5 до 5,35 происходит электростатическое взаимодействие разноименно заряженных макроионов. Следовательно, рН-зависнмости сорбции каталазы на анионных гелевых носителях имеют ожидаемый вид.

При взаимодействии фермента с сильно набухающим образцом карбоксилн-рованного ПААГ в водном растворе наблюдается два максимума при рН 4,5-5,0 и 7,0 (рисунок 56). Появление второго максимума вызвано, вероятно, образованием водородных связей между боковыми карбоксильными группами белка и амидными группами полимера. Это предположение подтверждается отсутствием такого максимума при взаимодействии каталазы с гелем чистой ПАК и, напротив, наличием только этого максимума при взаимодействии фермента с исходным негидролизованным ПААГ. Кроме того, как видно из рисунка 10 б, в, положение второго максимума сорбции при рН 7,0 совпадает с максимальным набуханием ПААГ, приводящим к увеличению его проницаемости для крупных макромолекул и, следовательно, к возрастанию вклада молекулярно-ситового эффекта.

Для катионных полимерных гелей (рисунок 4) экспериментальные зависимости сорбционного взаимодействия от рН (изохроны сорбции) носят более сложный характер, чем это следует из теоретических представлений о сорбции белка на монофункциональных ионитах. Основной причиной такой сложной зависимости от рН может быть дополнительное связывание белка за счет сил неионного характера. Здесь помимо максимума в области анионообмена (рН 6,0 -8,0) имеется явно выраженный максимум в области рН, близкой к изоэлектрической точке белка. Особенно отчетливо дополнительное взаимодействие белка с полимерной матрицей проявляется для сополимеров винилового эфира моноэтаноламина и гомополнэлектролитных гелей ПАлА и ПЭИ, содержащих ионо-генные аминогруппы и имеющих некоторые структурные особенности.

С учетом состава и структуры гидрогелей (таблица 6) очевидно, что здесь происходит дополнительное взаимодействие частиц белка с матрицей геля путем образования полимерных комплексов с водородной связью между свободными карбоксильными или аминогруппами молекул белка и карбонильными

группами ЫВП (ГГЗ), гидроксильными группами ВЭЭГ (ГГ1) и аминогруппами ГПАлА и ГПЭИ. Кроме того, возможно участие гидрофобных взаимодействий в стабилизации белок-полимерных комплексов. Особенно это касается ГПАлА и ГПЭИ, где может происходить ассоциация между гидрофобными участками макромолекул белка и гидрофобным каркасом этих гидрогелей.

Поскольку максимум сорбционного связывания каталазы на катионных гидрогелях при рН 5,0 находится в области изоэлектрическои точки фермента, где наблюдается максимальная величина дипольного момента белка (если при изменении ионизации не происходят конформационные изменения), не исключена также возможность ион-дипольного взаимодействия между полиэлсктроли-том и белком. Так как известно, что водородная связь между амино- и карбоксильной группой имеет двойственную природу, приведенные выше рассуждения не противоречат друг другу. . ..

Если сорбция белков, как отмечалось выше, в состоянии промежуточного равновесия в значительной степени определяется диффузионными процессами (скоростью диффузии), то следует ожидать 1) неполное использование белком полной обменной емкости ионита и 2) сильное отличие экспериментально определяемой концентрации белка в ионите от равновесной. Действительно, учитывая высокую обменную емкость ГПАК (11,2 иг-экв/г) и ГГ2 (7,2 мг-экв/г) можно было ожидать увеличения степени связывания с этими гелями. Однако сравнение с соответствующими сополимерами показало, что как в случае ГПАК, так и ГГ2 полная обменная емкость не реализуется вследствие более низкой набухаемости и соответственно меньшей доступности функциональных групп геля для макромолекул каталазы и возникающих при этом диффузионных затруднений.

Отсутствие полной десорбции фермента при изменении рН и ионной силы раствора указывает на частичную необратимость сорбции каталазы на анионных полимерных гидрогелях, свидетельствующую о прочности комплекса белка с гелем.

Измерение баланса ферментативной активности в растворе и в геле показало отсутствие инактивации фермента в условиях проведения эксперимента (рН 4.09,0). Кажущееся увеличение сорбционного связывания на всех гидрогелях при 9<рН<4 вызвано щелочной и кислотной инактивацией фермента. Наблюдаемая нами необратимая сорбция является прежде всего следствием неравновесности процесса. Ее можно объяснить комплексообразованием между ионогеиными группами геля и белка, которое должно сопровождаться уменьшением заряда матрицы полимерного гидрогеля и ее сжатием. В этом случае может происходить "захлопывание" белка, что равносильно его необратимой сорбции.

На рисунке 6 представлены также изохрона сорбции каталазы P.vitale на по-лиамфолитном гидрогеле - сополимере ВЭМЭА и акриловой кислоты (ГГ4, таблица 7) и коэффициент набухания геля до и после сорбции в зависимости от рН. Видно, что максимальная степень связывания каталазы находится в области рН между изоэлектрическими точками полиамфолита-белка (pi 5,35) и полиам-фолита-гидрогеля (pl 4,7). Указанная область, в которой оба макроиона имеют

противоположные заряды, является наиболее благоприятной для образования полиэлектролитного комплекса между гелем и белком. Параллельное измерение коэффициентов набухания исходного гидрогеля и после взаимодействия с каталазой показало, что в результате взаимодействия коэффициент набухания геля уменьшается почти вдвое.

Зависимость коэффициента распределения (1) каталазы P.vitale между полиамфолитным гидрогелем ВЭМЭА-АК (ГГ4) и внешним раствором и коэффициента набухания геля до (2) и после (3) сорбции от рН 0,1 M фосфатного буферного раствора (а) и концентрации NaC! (б) а б

«„„ю-*

М.1/Г

4

К г/г K^ItT1,

W/r ..

К н, Г/Г

0-04 0.08 0.12 0 16 0.20 С, M

КАЦСХ. = 70-80 Е/мл ; Т=25 "С. Рисунок 6.

Таким образом, можно констатировать, что сорбционное взаимодействие белка с полимерными ионогенными гидрогелями и ионообменными целлюлозами, происходит во времени и в пространстве и представляет собой полифункциональное многоточечное взаимодействие за счет большого числа слабых не-ковалентных связей (электростатических, водородных, гидрофобных взаимодействий), причем вклад того или иного типа взаимодействий в суммарную энергию связывания определяется структурным« особенностями и свойствами гидрогелей.

Получаемые для промежуточных равновесий коэффициенты распределения определяются кинетическими факторами в не меньшей мере, чем равновесными термодинамическими параметрами. В результате такого полифункционального взаимодействия а) повышается избирательность взаимодействия, б) в большей или меньшей степени меняется набухаемость гелей, в) достигается частичная необратимость процесса, указывающая на прочность образующихся полимерных комплексов фермента и полезная при его иммобилизации, г) после потери части ферментативной активности происходит ее стабилизация.

4.2.2 Влияние ионной силы внешнего раствора на сорбцнонное взаимодействие каталазы с гелевыми носителями

На рисунках 7, 8 приведены зависимости сорбционного взаимодействия каталазы Р.\'1(а1е с различными ионогенными полимерными гидрогелями от концентрации фонового внешнего раствора/

Зависимость коэффициента распределения каталазы между анионными (а) и катионными (б) гидрогелями и внешним раствором от концентрации №С1.

С,М С, M

(а) 1. ГПААГ П-300; 2. ГПААГ П-150; 3, ГПААГ П-4; 4. ГПАК. Исходная кон-цетрация фермента 92-102 Е/мл; (б) I. ГПАлА; 2. ГПЭИ. Исходная концетрация фермента 93, 104 Е/мл.

Рисунок 7.

Зависимость взаимодействия каталазы Penicilimn vitale с полимерными гидрогелями на основе ВЭМЭА от концентрации внешнего фосфатного буферного раствора при Т=25°С

с, м

а - ГП (рН=5,5), б - ГГ2 <рН=7,0), в - ГГЗ (рН=5,0); время взаимодействия 1 - 1 сутки, 2-4 суток, 3-8 суток, 4-13 суток, начальная концентрация каталазы - КА_ ,,„=80-100 Е/мл.

Рисунок 8.

Для сопоставления с теорией эти зависимости (сорбшюнные ветви) так же, как и рН-зависимости, представлены в координатах коэффициент распределения - концентрация. Как и следовало ожидать из уравнений (5) и (6), с увеличением концентрации внешнего раствора коэффициент распределения низкомолекулярных ионов будет уменьшаться, соответственно должен уменьшаться коэффициент распределения белка между ионитом и внешним раствором. Однако кривая зависимости сорбции каталазы на всех исследуемых нами гелевых носителях от концентрации внешнего раствора носит экстремальный характер. Интервал концентраций 0,05М-0,15М является оптимальным и соответствует стабильному состоянию белок-полимерной системы. Положение максимума определяется константами ионизации ионообменных групп геля. Уменьшение концентрации внешнего раствора (обессоливание системы), также как и ее увеличение выше 0,15 М приводит к резкому уменьшению коэффициентов распределения, или к электростатической дестабилизации полимерных комплексов фермента. Следует отметить, что в литературе также отмечается существование нижнего и верхнего предела стабильности белок-полимерных комплексов по ионной силе.

Уменьшение коэффициентов распределения при дальнейшем увеличении концентрации внешнего раствора в широком диапазоне концентраций вполне закономерно, так как увеличивается конкурентная сорбция низкомолекулярных ионов. Однако в области низких концентраций соли (С<0,05) имеются существенные отклонения от предсказаний равновесной теории, которые можно объяснить тем, что низкая концентрация фонового электролита приводит к значительному уменьшению коэффициентов взаимодиффузии и, как следствие этого, к неравновесности сорбции белка. Кроме того, сильное набухание гелевых сорбентов в деионизированных средах и соответствующее уменьшение концентрации ионогенных групп в геле способствует снижению равновесных коэффициентов распределения.

Как в бессолевых растворах, так и при увеличении концентрации соли характер изменения набухаемости исходных гелей и после взаимодействия с ка-талазой одинаков. В диапазоне концентраций от 0 до 0,02-0,05 М наблюдается резкое уменьшение набухаемости в обоих случаях, причем в результате взаимодействия с каталазой происходит более сильное сжатие полимерной сетки (матрицы) гелей. Коэффициент набухания полиамфолитного гидрогеля в результате взаимодействия с белком в бессолевой среде уменьшается почти на порядок, однако он становится нечувствительным к взаимодействию с каталазой при увеличении ионной силы раствора (рисунок 66). Небольшое увеличение коэффициента набухания геля после взаимодействия с каталазой при С>0,2 М может свидетельствовать о разрушении полиэлектролнтного комплекса.

Таким образом, достаточно прочное и полное связывание каталазы с полимерными гелевыми сорбентами происходит при умеренных концентрациях фонового электролита и в деионизированной среде при больших временах процесса, причем, чем выше степень набухания гелей, тем быстрее завершается процесс и выше степень взаимодействия.

4.2.3 Изотермы сорбции каталазы на полимерных гидрогелях и гелевых сорбентах

Получены изотермы сорбции каталазы P.vitale на различных поликатионных гидрогелях, а также на карбоксильных (полианионных) гидрогелях и ионитах при рН максимальной сорбции. Изотермы сорбции в основном представляют собой типичные изотермы Лэнгмюра, характерные для сорбции в монослое. В некоторых случаях (например, для ПАлА, ГГ1, ГГЗ, биосорба) наблюдается некоторая нелинейность начального участка изотермы, т.е. они имеют S-образный вид, что может свидетельствовать о наличии нескольких типов участков связывания, как уже отмечалось при обсуждении зависимости сорбции от рН, либо соответствовать двум стадиям процесса. При малом • заполнении гидрогелей белком изотерма сорбции принимает вид изотермы Лэнгмюра, и процесс определяется в основном взаимодействием белок - гидрогель. При высоких степенях заполнения существенную роль могут играть взаимодействия между сорбиро-ваннымн макромолекулами белка-лиганда. Крутизна изотерм свидетельствует о кооперативном характере взаимодействия белка с гелевыми сорбентами (прямоугольные изотермы). Приведенные изотермы также показывают, что состояние равновесия практически недостижимо. Ни в одном случае не удалось получить обратный ход изотерм простым разбавлением внешнего раствора буферным (солевым) или водно-солевым раствором, из которого проводилась сорбция фермента, т.е. для них характерно явление гистерезиса, что свидетельствует о термодинамической необратимости процесса. Меняя же рН или ионную силу, можно десорбировать от 10?'о до 50% (для биосорба до 60%) фермента, т.е. сорбция, как отмечалось выше, во всех случаях является в большей или меньшей степени необратимой. Сорбционная емкость полимерных гидрогелей по белку довольно высока и сильно зависит от степени набухания гелей (таблица 6).

Изотерма сорбции каталазы на сильнонабухающем карбокснлированном ПААГ имеет необычный экстремапьный характер. Подобные колоколообразные зависимости были получены также Г.В.Самсоновым с соавторами для сорбции белков на высокопроницаемых карбоксильных катионитах. Изотерма сорбции белка на карбоксильном геле определяется кооперативным взаимодействием в данной системе и состоит из участков резкого подъема (положительный кооперативный эффект) и падения (отрицательный кооперативный эффект) емкости сорбции при увеличении равновесной концентрации белка во внешнем растворе. Причиной возникновения кооперативных эффектов при сорбции белка на полимерных гелевых сорбентах является наличие дополнительных взаимодействий в системе сорбент-белок. При отсутствии таких взаимодействий изотерма сорбции имеет лэнгмюровский вид. Однако в этом случае необходимо строгое доказательство равновесности процесса во всем объеме гелевого сорбента по отношению к внешнему раствору. Возможно, что эти изотермы по существу являются изотермами-изохронами, и их описание невозможно без кинетического подхода.

4.3 Необратимость сорбции и иммобилизация ферментов

4.3.1 Сорбционная иммобилизация каталазы на полимерных гидрогелях

Одним из перспективных направлений использования полимерных гидрогелей также являются выделение, очистка, концентрирование и иммобилизация биологически активных соединений, в том числе ферментов, сорбционньшн методами. Традиционно применяя для сорбции белков ненабухающие сильно-сшитые макропористые сорбенты, можно значительно увеличить обратимость ионообменной сорбции белков. Поэтому именно эти сорбенты представляют наибольший интерес для сорбционной очистки и хроматографического разделения биополимеров, где обратимость процесса - необходимое условие его успешного проведения. Напротив, для сорбционной иммобилизации белков и ферментов наиболее пригодны гелевые сорбенты, необратимость процесса, на которых в данном случае играет полезную роль.

Как отмечалось выше, ионогенные полимерные гидрогели в известной степени можно рассматривать как синтетические гелевые набухающие сорбенты, так как степень гомогенности для них р—>1. Иными словами, они представляют собой предельный случай гелевых сорбентов и в высшей степени отвечают требованиям гомогенности, В этом случае к ним применимы закономерности ионообменной сорбции (с учетом набухаемости) и иммобилизации биополимеров на гелевых сорбентах.

Можно было ожидать, что сильно набухающие ионогенные полимерные гидрогели будут обладать, в отличие от целлюлоз, высокой сорбционной емкостью, достаточно прочно и необратимо связывать белки и ферменты и, следовательно, являться весьма подходящими носителями для сорбционной иммобилизации ферментов.

Проведенное исследование сорбционного поведения каталазы P.vitale на различных катионных и анионных полимерных гидрогелях позволило установить основные закономерности сорбционного процесса и подобрать оптимальные условия иммобилизации.

Как и следовало ожидать, наиболее подходящими носителями для сорбционной иммобилизации каталазы оказались поликатионные гидрогели, образующие прочные полимерные комплексы с ферментом в результате полифункционального, многоточечного необратимого взаимодействия. Были получены иммобилизованные препараты фермента с высокой относительной каталазной активностью (таблица 6) и исследованы их некоторые физико-химические и каталитические свойства в сравнении с растворимой формой фермента. Результаты представлены в таблице 7 и на рисунке 9.

Как известно, при иммобилизации ферментов, как правило, повышается их термостабильность, особенно при высоких температурах. Показано, что наиболее термостабильными являются полимерные комплексы каталазы с катионны-ми гидрогелями ГГЗ, ГПАпА и особенно с ГПЭИ, его каталазная активность при повышении температуры от 37 °С до 60 °С практически не меняется в тече-

ние длительного времени, лишь при 70 °С потеря активности составляет около 50% (время полуинактивации 20 часов). Таблица 7.

Некоторые свойства иммобилизованных ферментов

Образцы иммобилизованных препаратов Относительная активность, % Относительная КА при хранении при +4 °С, %, в течение Термостабильность в течение 4 часов, %

10 дн. 1 м ее. 3 мес. 6 мес. 25 °С 37 °С 50 °С 60 °С 70 °С

ПААГ П-300 22 95100 7580 5055 2530 100 94 82 60 30

ГПАК 24 95100 8085 5560 3035 100 92 75 50 25

ГПАлА 60 95100 9095 8085 7580 100 86 82 75 38

ГПЭИ 57 95100 95100 8590 8085 100 92 83 72 63

Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых термоинактивации каталазы P.vitale, иммобилизованной на катионных и анионных полимерных

гидрогелях

2-0 1.8 1.4

1.6

1 А

1 2

1 0

20 1.8 1 6 V. I'60'C k t=?0'C

1 < 12 1 0 \ 4 ®\ \5 \ф

О 5 10 15 20 0 5 10 15 20

I, час

1.ГЛАлА: 2.ГПЭИ; З.ПААГ П-300; 4.ГПАК; 5.растворимая форма фермента.

Рисунок 9.

В данном случае в стабилизации белок - полимерных комплексов существенную роль, по-видимому, играют гидрофобные взаимодействия, наиболее характерные для ГПЭИ, имеющего разветвленную гидрофобную структуру и, как следствие, высокую каталитическую активность связанной с ним кататазы.

Комплексы ферментов с полианионными гелями менее устойчивы при высоких температурах. Это объясняется, по-видимому, менее выраженной полифункциональностью и многосвязанностью взаимодействия фермента с гелями, либо ее отсутствием, и как следствие большой конформационной подвижностью макромолекул фермента в цепях полимерного геля вследствие его большей набухаемости. В результате фермент также больше подвержен термоинактивации. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых термоинак-тивацип различных образцов иммобилизованной каталазы, представленные на рисунке 9, показывают, что термоинактивация каталазы проходит через 2 стадии: после быстрой потери части ферментативной активности (1 стадия) наступает вторая, более медленная, когда фермент длительное время сохраняет почти постоянную активность, т.е. стабилизируется, причем эффект стабилизации сильно зависит от структуры и свойств полимерного гелевого носителя. Здесь можно еще раз отметить факт существования корреляции структура - свойство. В некоторых случаях растворимый фермент стабильнее иммобилизованного.

Сравнительный анализ термостабильности препаратов каталазы, иммобилизованной на катионных гидрогелях и аниопообменных целлюлозах, показал, что в первом случае иммобилизация каталазы оказывает более сильный стабилизирующий эффект, особенно при высоких температурах. Так, при 60 °С эффект стабилизации на гелях в 6-10 раз, а при 70 °С в 10-25 раз выше такового для целлюлоз. Это происходит, по-видимому, за счет многоточечного связывания ферментной глобулы с полимерными цепями геля, что приводит к ужесточению белковой глобулы, значительному ограничению ее конформационной подвижности и. как следствие, к максимальному сохранению нативной конформации фермента. Таким образом, при иммобилизации каталазы на катионных полимерных гидрогелях значительно повышается ее термостабильность при высоких температурах. При взаимодействии с другими гидрогелями эффект стабилизации менее выражен.

В работе была также изучена рН-стабилыюсть некоторых полимерных форм каталазы P.vitale. Показано, что при иммобилизации каталазы на ГПАлА и ГПЭИ в 2-3 раза повышается ее кислотоустойчивость по сравнению с растворимой формой, а рН-оптнмум действия иммобилизованной кататазы сдвигается в более кислую область (рН=6,0) в случае катионных и расширяется (рН 5,0 -7,0) в случае анионных полимерных гидрогелей.

Температурный оптимум действия каталазы P.vitale при ее иммобилизации не меняется.

При исследовании влияния концентрации пероксида водорода на каталаз-ную активность растворимой и иммобилизованных форм фермента было показано, что при иммобилизации каталазы на ГПАлА и ГПЭИ оптимум концентрации Н:0: увеличивается почти на порядок, вследствие диффузионных ограни-

чений проникновения субстрата в активный центр фермента, что открывает перспективы их использования в условиях высоких концентраций пероксмда водорода (до 3 М), без проявления ингибирующего и инактивирующего действия субстрата на фермент.

4.3.2 Адсорбционная иммобилизация ферментов-гликопротеинов на кремнеземных и углеродных носителях

В работе проведена сорбционная иммобилизация ферментов-гликопротеинов на аминированных и карбоксилированных карбохроме и сило-хроме, адсорбционная способность которых обусловлена, как уже отмечалось выше, высокоразвитой поверхностью пор и наличием на поверхности различных функциональных групп, способных к образованию разного типа связей. Кроме того, они относительно легко модифицируются и им могут быть приданы электростатические и гидрофобные свойства. В частности, в работе использовали макропористые силохромы, поверхность которых в результате модифицирования 3-аминопропил-трнэтоксисиланом включает ал ¡сильную углеводородную цепь и аминогруппу, приобретающую при рН>7,8 положительный заряд. При этом полученные силохромы, так же как и карбохромы, становятся полифункциональными сорбентами.

Получен ряд зависимостей сорбции, который позволил количественно охарактеризовать иммобилизацию на этих носителях.

Полученные экспериментальные данные соответствуют представлениям об электростатической природе сорбции АХЭ на аминированном карбохроме и си-лохроме, имеющем рК ионизации аминогрупп в интервале 7,6-8,4. Наличие сорбции АХЭ в кислой среде при рН<5,0, где ион-ионное взаимодействие не работает, позволяет сделать вывод о полифункциональности связывания (многосвязанности) белка с ионитом, включающим помимо кулоновского, другие типы взаимодействий, например, гидрофобные. Гидрофобный характер связывания гликопротеннов с аминированным силохромом подтверждается опытами по частичной десорбции ферментов с поверхности носителя 50%-ным раствором этанола.

На карбоксисилохромах сорбция происходит в области ионного обмена (рН 4-5), однако и в щелочной области рН наблюдается сорбция на матрице.

Таким образом, изучение сорбционного поведения ферментов-гликопротеинов ацетилхолинэстеразы и глюкозооксидазы на модифицированных силохромах и карбохроме в зависимости от различных факторов (рН, времени, концентрации фермента) показало, что определяющую роль в адсорбционном связывании ферментов играет электростатическое взаимодействие противоположно заряженных групп носителей и молекул фермента. Однако в случае модифицированных силохромов существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия, т.е. связывание фермента с поверхностью адсорбентов носит многоточечный, полифункцнональный характер и является частично необратимым. Полученные сорбционно иммобилизованные препараты АХЭ и ГО ста-

бильны при хранении и в условиях непрерывной эксплуатации по сравнению с растворимой формой и могут применяться в различных биотехнологиях, например. при создании биосенсорных систем.

5 Иммобилизованные ферментные системы в анализе метаболитов, ингибиторов н токсичных соединений

Применение растворимых ферментов в аналитических системах, предполагающих большой расход дорогостоящих биокатализаторов, оправдано при лабораторных исследованиях. Однако часто возникает необходимость непрерывного контроля (мониторинга) токсичности в объектах окружающей среды. В этом случае важно обеспечить минимальный расход реагентов при возможно большей продолжительности автономной работы. Применение иммобилизованных ферментов позволяет не только резко сократить их расход, но и повысить информативность анализа. Гетерогенность реакционной системы дает возможность пространственно разделять компоненты реакций и, следовательно, изучать релаксацию системы при резком изменении концентрации ее компонентов. На этом принципе основано определение кинетических параметров взаимодействия в системе иммобилизованный фермент-ингибитор методом ''концентрационного скачка" по релаксации активности биокатализатора при резком изменении концентрации ингибитора. Предполагается, что в опытах используется реактор идеального смешения, а процесс происходит в кинетическом режиме, что оправдано для относительно больших характеристических времен процесса ингибирования и невысокой концентрации фермент-ингибиторного комплекса.

Типичный вид экспериментальных кривых, получаемых в результате измерения концентрации продукта на выходе из реактора для системы ацетилхоли-нэстераза - прозерин представлен на рисунке 10.

Общий вид кривых релаксации активности иммобилизованной холинэстсразы при резком изменении концентрации ингибитора в потоке.

45 Л

Ь

10

20

30

^ мин

Рисунок 10.

По оси ординат отложено отношение величины активности биокатализатора, регистрируемое в ходе эксперимента, к зарегистрированной в отсутствие ингибитора. На экспериментальной кривой можно выделить 4 участка: I - нулевой сигнал (в системе нет субстрата), II - фоновый сигнал, регистрируемый при пропускании через реактор раствора субстрата (стрелка - момент начала подачи), III - инактивация фермента (в реакторе смесь растворов субстрата и ингибитора, сигнал падает), IV - реактивация биокатализатора при взаимодействии с обратимым ингибитором (стрелка - момент переключения подачи смеси растворов субстрата и ингибитора на подачу только раствора субстрата, сигнал возрастает). Непосредственно по виду экспериментальной кривой можно оценить токсичность изучаемого соединения (величина отрезка "а"), сделать вывод о степени обратимости взаимодействия фермента с ингибитором (отношение отрезков "а" и "б"), степени '"сродства" фермент - ингибитор (величина т), который для растворимых ферментов может.быть сделан лишь опосредованно. Таблица 8.

Характеристика ангихолинэстеразной активности некоторых соединений

Субстрат, (моль/л) Ингибитор, (моль/л) ток фона (мка) "а" (мка) "в" (мка) к-з, с-' кз' М-'с"1 К,, моль/ л

1 2 3 4 5 6 7 8

Ацетилтиохолини одид (3,2x10"4) Прозерин (5,1x10"*) 0,68 0,14 0,14 5,Ох ю-5 8,2х ю- 6.8х 10'8

0,67 0,07 0.07 - - -

(3.2x10"1) (2.4) - -

(4,7) 0.14 0,14 - -

(5,6x10'") 0,16 0,16 - - 4,7х ¡О"8

(7.3) 0,18 0.18 - -

(9.5) 0.21 0.21

(П.9) 0.25 0,25 - -

-"- 0,79 0,12 0.12 5,3х ю-5 8,Ох 102 6,6х 10"*

(9.3x10"*) (5,1x10"°) 10° 101 10"*

(3,2x10"1) теграбутил-аммоний ио-дистый (5.0x10"') 0,68 0,07 0,07 3,2х 10 * 5,5х 102 5,8х 10"4

(3,2x10"*) хлорофос (1.2x10°) 0,67 0,16 - - 1.4х Ю2 -

(ЗДхЮ"1) цианистый калий (2.1x10"2) 0,66 0

Для количественной обработки данных нужно записать ветви инактивации (III) и реактивации (IV) фермента и используя данные эксперимента рассчитывают соответствующие константы. В случае взаимодействия с обратимым конкурентным ингибитором процессы, происходящие в системе, описываются упрощенной схемой:

Результаты расчета и некоторые дополнительные данные суммированы в таблице 8. Из нее, в частности, следует, что тетрабутиламмоний йодистый - обратимый ингибитор, константы для которого определяются по той же методике, хлорофос - необратимый ингибитор, наконец, цианистый калий вообще не проявляет антихолинэстеразную активность.

Рассмотренный метод представляет собой мощный инструмент для количественного анализа биологической активности широкого ряда веществ.

Была проведена работа по оптимизации условий функционирования ката-лазного анализатора токсичности с электрохимической регистрацией при заданной температуре (25 °С) н рН среды (0,015 М фосфатный буферный раствор, рН 7,5). Показано, что для получения достоверных данных необходимо использовать разбавленные растворы фермента (активность 5 Е/мл и ниже) и субстрата (1x10"'-1x10"5 М). При такой концентрации субстрата наблюдается линейная зависимость величины сигнала, а при более высоких концентрациях происходит резкое уменьшение скорости процесса, что по всей вероятности можно объяснить частичной инактивацией фермента высокими концентрациями пероксида водорода. На примере работы ферментативного анализатора с электрохимической регистрацией при определении КСМ показана возможность обнаружения наномольных концентраций цианида. Таким образом данный способ регистрации обеспечивает оценку токсичности и может быть использован для экологической экспертизы окружающей среды.

Исследована также интенсивность люминесценции иммобилизованной лю-циферазной системы при различных изменениях состава раствора, пропускаемого через ферментативный реактор. В отличие от холинэстеразной системы, в которой при отсутствии ингибитора равновесие по субстрату устанавливается очень быстро, в люциферазной системе оно достигается замедленно. Результат эксперимента свидетельствует, что КСЫ - обратимый ингибитор люциферазной системы, но за время опыта полная реактивация фермента не достигается. При длительном же времени эксперимента падает стабильность измерений.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов в аналитических системах открывает принципиально новые возможности для ингибиторно-го анализа. Измеряя релаксацию активности ферментов при задаваемых изменениях концентраций на входе в реактор, можно получить ценную информацию об обратимости ингибирования. Кроме того, в случае ИФ можно вычислять кинетические константы ферментативных стадий, тогда как при измерении стационарных скоростей в случае растворимых ферментов можно найти только равновесные и стационарные константы. Знание не только равновесных, но и кинетических констант, естественно, увеличивает полезную информацию о биологической активности соединений.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез ряда п- и м-производных фенилбороновой кислоты. Семь из синтезированных бороновых кислот являются бифункциональными и могут применяться в качестве новых спейсеров для иммобилизации ферментов-гликопротеннов. Впервые методом ВЭЖХ установлена их индивидуальность. Методами ЯМР 'Н-, ЯМР |3С- и ЯМР "В-, ПК- и масс-спекгроскопии подтверждена структура синтезированных соединений. Наиболее детально структурное исследование проведено ПМР-спектроскопическим методом, позволившим впервые охарактеризовать вклад дигидроксиборильной группы в химические сдвиги ароматических протонов. Впервые спектрофотометрическим методом определены константы ионизации 16 бороновых кислот в водных растворах. Охарактеризовано влияние различных заместителей на кислотность В(ОН)? -группы. Полученные результаты по спектральным, хроматографическим и кислотным свойствам бороновых кислот подтверждают корреляцию структура -свойство для данного класса соединений (02.00.10).

2. Впервые проведено теоретическое и экспериментальное исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержащими твердыми фазами как моделями гликопротеинов в статических и динамических условиях. Рассмотрены различные состояния ионизации функциональных групп бороновых кислот, содержащих, помимо дигидроксиборильной, карбокси- и аминогруппы. Впервые получены систематические данные по хроматографическому удерживанию бороновых кислот на диолсодержащих носителях в водных растворах, а также по их константам комплексообразования с поливиниловым спиртом. Показано, что образование стабильного боронат-диольного комплекса происходит в более кислой области рН относительно рКа соответствующей бороновой кислоты. Полученные экспериментальные результаты согласуются с теоретическими выводами и позволяют оптимизировать условия иммобилизации различных фермен-тов-гликопротеинов с учетом их рН-оптимума действия путем подбора подходящих спейсеров и рН среды (02.00.06, 02.00.10).

3. Проведено модифицирование амино- и карбоксисилохромов бифункциональными бороновыми кислотами хлорангидридным методом. Получены новые активированные кремнеземные носители для химической иммобилизации фер-ментов-гликопротеинов, целых клеток и клеточных компонентов, а также для аффинной хроматографии диолсодержащих соединений (02.00.10).

4. Разработан новый метод и оптимизированы условия химической иммобилизации глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы на активированных бороновыми кислотами силохромах при использовании в качестве спейсеров более сильных производных БК в кислой среде для глюкозооксидазы (рН-оптимум действия 5,5-6,0) и более слабых бороновых кислот в щелочной среде для ацетилхолинэстеразы (рН-оптимум действия 7,5-8,0). Для ацетилхолинэстеразы иммобилизация данным методом за счет взаимодействия карбогидратной части этого фермента с дигидроксиборильнымн группами БК проведена впервые.

Получены иммобилизованные препараты ГО и АХЭ с высокой ферментативной активностью, исследована их стабильность при хранении и в условиях непрерывной эксплуатации. Полученные результаты и сравнение с литературными данными указывают на то, что предлагаемый способ сочетает в себе преимущества сорбционного по мягким условиям проведения и ковалентного по прочности связи между белком и носителем, и позволяют рекомендовать его как перспективный метод для иммобилизации гликопротеинов и интеграции биологического материала, содержащего полисахариды, на поверхности полупроводниковых структур (02.00.10).

5. Проведено систематическое теоретическое рассмотрение сорбционной иммобилизации белков на различных типах полимерных гелевых носителей и поверхностных сорбентов с учетом различных моделей взаимодействующих объектов, получены уравнения коэффициентов распределения биологических макромолекул на фоне низкомолекулярных электролитов с учетом комплексо-образования ионогенных групп полимерных гелевых носителей с функциональными группами белков. Показана необходимость учета кинетических факторов и плодотворность кинетико-термодинамического подхода к описанию реальных сорбционных процессов (02.00.06).

6. Впервые систематически экспериментально исследованы процессы сорбционной иммобилизации каталазы на различных ионных полимерных гидрогелях, наиболее полно отвечающих требованиям гомогенности, в зависимости от различных факторов внешней среды. Полученные результаты показали, что они подчиняются общим закономерностям ионообменной сорбции белков, в значительной степени определяются кинетическими факторами и развиваются не только во времени, но и в пространстве, что позволяет рассматривать сорбцию белков полимерными гидрогелями как типичный процесс образования и эволюции неравновесных систем (02.00.06).

7. Показано, что сорбция глобулярных белков гелевыми носителями представляет собой полифункциокальное, многоточечное взаимодействие с участием разных типов нековалентных сил, таких как электростатические, гидрофобные взаимодействия, водородные связи, вклад которых в суммарную энергию связывания определяется свойствами белка и структурными особенностями полимерных гидрогелей. Показано, что такое полифункциональное взаимодействие приводит к большим коэффициентам распределения и необратимости процесса, что позволяет рассматривать химическую и сорбционную иммобилизацию ферментов на различных носителях с единых позиций как процессы с прямоугольной изотермой сорбции, характерной для необратимо иммобилизованных ферментных систем (02.00.06).

8. Впервые показана возможность использования катионных полимерных гидрогелей полиаллиламина и полиэтиленимина, а также полученных на основе ВЭМЭА для традиционной сорбционной иммобилизации каталазы. Получены высокоактивные полимерные комплексы каталазы, исследованы их термо-, рН-и стабильность при хранении и некоторые каталитические свойства. Показано, что иммобилизация каталазы, особенно на гелях полиаллиламина и полиэтиле-

нимина, приводит к высокотемпературной стабилизации фермента, повышению pH-стабильности в кислых средах, расширению и сдвигу в кислую область рН-оптимума ферментов, увеличению почти на порядок оптимальной концентрации субстрата - пероксида водорода, что повышает устойчивость фермента к ингибирующему и инактивируюшему действию высоких концентраций пероксида водорода. Этот факт имеет важное практическое значение (02.00.06).

9. Проведена и изучена адсорбционная иммобилизация ферментов-глнкопротеинов ацетилхолинэстеразы и глюкозооксидазы на модифицированных кремнеземных и углеродных носителях. Показано, что связывание ферментов с поверхностью адсорбентов также носит полифункциональный характер, приводящий к частичной необратимости процесса. Полученные сорбционно иммобилизованные препараты АХЭ и ГО стабильны при хранении и в условиях непрерывной эксплуатации в сравнении с растворимой формой, однако эти характеристики хуже, чем для химически иммобилизованных с помощью сороковых кислот препаратов (02.00.06, 02.00.10).

10. Продемонстрированы новые возможности использования иммобилизованных ферментов в различных аналитических биосенсорных и биоскрининго-вых системах по релаксации ферментативной активности на примере холинэ-стеразной, каталазной и люциферазной ферментных систем для анализа ингибиторов, метаболитов и токсичных соединений (02.00.10).

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Гладышев П.П., Горяев М.И., Бекгенова Г.А., Мамлеев В.Ш. Распределение ионов фосфатного буфера между ионитом и внешним раствором // Изв. АН КазССР. Сер. хим. - 1981, № 3. - С. 34-42.

2. Гладышев П.П., Горяев М.И., Бектенова Г.А., Матанцева Е.Ф., Каменский Н.П. Ионообменная хроматография опийных алкалоидов на Ф-целлюлозе // Изв. АН КазССР. Сер. Хим. - 1981. - № 4. - С. 33-43.

3. Гладышев П.П., Мамлеев В.Ш., Шаповалов Ю.А., Бектенова Г.А., Гладышев В.П. Использование электроферментативных датчиков для избирательного анализа органических соединений // Тезисы докладов на Всес. конф. "Электрохимические методы анализа". - Томск, 1981. - Ч. II. - С. 57-58.

4. Гладышев П.П., Бектенова Г.А., Мамлеев В.Ш. Ферментативные датчики в анализаторах загрязнений окружающей среды // Тезисы докладов на Всес. научно-техн. конф. "Технология и техника мясн. и мол. пром-сти на основе совр. исследований". - М., 1981. - С. 27-28.

5. Гладышев П.П., Мамлеев В.Ш., Бектенова Г.А., Козлов В.А., Шаповалов Ю.А. Функционирование проточного электроферментативного датчика при импульсном амперометрическом анализе субстратов // Изв. АН КазССР. Сер. хим! - 1982, №3,-С. 49-54.

6. Гладышев П.П., Мамлеев В.Щ., Шаповалов Ю.А., Бектенова Г.А., Козлов В.А. Иммобилизованные фермент-кофакторные системы в импульсном ана-

лизе субстратов // Тезисы докладов на 4-ом Всес. симл. по инж. этимологии. -Киев, 1983.-С. 39.

7. Бектенова Г.А., Нурадиева А., Гладышев П.П., Аймухамедова Г.Б. Сравнительное исследование хроматографических свойств пектиновых и декстрано-вых ионитов // Современные проблемы биоорганической химии й химии природных соединений // Сб. научн. тр. - Алматы. (Деп. в КачНИИНТИ, 24.10.1984, № 769 Ка-Д-84. - С. 393-398).

8. Гладышев П.П., Бектенова Г.А. Области применения различных моделей ионного обмена // Современные проблемы биоорганической химии и химии природных соединений // Сб. научн. тр. - Алматы. (Деп. в КазНИИНТИ, 24.10.1984, № 769 Ка-Д-84. - С. 315-349).

9. Gladysliev P.P., Bektenova G.A., Volodin V.S. Theoretical and Practical Aspects of Liquid Chromatographic Analysis of Alkaloids // Abstracts of Present, on Int. Symp. "New Adv. in Liquid Chromatogr."- Balaton-Szeplak, Hungary, 1986. - P. 30

10.Гладышев П.П., Бектенова Г.А. Жидкостная хроматография алкалоидов // Тезисы докл. На 7-ом Советско-инд. Симп. по химии природных соединений. -М: Наука, 1986. -С. 35.

1 [.Бектенова Г.А, Темирбаев М.А., Хасенов Б.Д., Гладышев ГШ. Ацилярова-ние сывороточного альбумина хлорангидридом метакриловой кислоты // Материалы III съезда общ-ва стоматологов Казахстана. - Алма-Ата, 1986. - С. 5457.

12.Мамлеев В.Ш., Бектенова Г.А., Быкова Л.Н., Гладышев П.П. Хроматографи-ческое изучение неоднородности ионообменников по изотермам конкурентной сорбции трех- и одновалентных ионов // Тезисы докладов на IV Всес. симп. по молек. жидкости, хроматогр. - Алма-Ата, 1987. - С. 59.

13.Гладышев П.П., Мамлеев В.Ш., Бектенова Г.А., Быкова Л.Н. Анализ смесей ингибиторов ферментативных реакций динамическим методом // Там же. - С. 76.

14.Нурадиева А., Аймухамедова Г.Б., Бектенова Г.А. Исследование хроматографических свойств различных полисахаридных сорбентов // Там же. - С. 13!.

15.Нурадиева А., Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Аймухамедова Г.Б. Хроматография алкалоидов на полисахаридных сорбентах // Изв. АН КазССР. Сер. хим. - 1988, № 1.-С. 51-54.

16.Мамлеев В.Ш., Гладышев П.П., Бектенова Г.А., Быкова Л.Н. Анализ смесей ингибиторов ферментативных реакций динамическим методом II Изв. АН КазССР. Сер. хим. - 1988, № 4. - С. 80-87.

17.Бектенова Г.А., Нурадиева А., Аймухамедова Г.Б., Гладышев П.П. Сорбенты на основе пектиновых веществ для препаратитвной жидкостной хроматографии // Тезисы докладов на I Всес. симп. "Препаративная хроматогр. физиол. активных веществ на полимерных сорбентах". - Л., 1988. - С. 42-43.

18.Мамлеев В.Ш., Гладышев П.П., Бектенова Г.А., Новиков Б.Е., Быкова Л.Н. Построение изотерм по десорбционным кинетическим кривым // Изв. АН КазССР. Сер. хим. - 1989, № 3. - С. 44-50.

19.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова В.В., Цой Л.А., Юсупова Ф.Г., Монаков Ю.Б. Спейсеры для иммобилизации гликопротеинов на полупроводниковых и других структурах биосенсоров // Тезисы докладов на VII Всес. симп. "Инж. энзимология (получение и применение биокатализаторов в нар. хоз-ве и мед.*'- М., 1991. - С. 113-114.

20.Веколова В.В., Каражанова А.Н., Бекгенова Г.А. Определение констант ионизации бороновых кислот // Тезисы докладов на XVIII Межвуз. конф. мол. уч. "Совр. проблемы физ. химии растворов". - Л., 1991. - С. 10.

21.Бектенова Г.А., Веколова В.В., Гладышев П.П., Юсупова Ф.Г. Определение констант ионизации бороновых кислот спектрофотометрическим методом // Изв. АН РК. Сер. хим. - 1992, № 4. - С. 68-75.

22.Клепикова С.Г., Бектенова Г.А., Цой Л.А., Веколова В.В., Гладышев П.П. Определение структуры ароматических производных борной кислоты методом ПМР// Изв. АН РК. Сер. хим. 1992, № 2. - С. 57-61.

23.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова В.В. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержащими твердыми фазами. 1. Описание химических равн овесий в системе // Изв. АН РК. Сер. хим. - 1992, № 6. - С. 63-69.

24.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова В.В., Каражанова А.Н. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержащими твердыми фазами. II. Изучение взаимодействия бороновых кислот с диодами жидкостно-хроматографическим методом // Изв. АН РК. Сер. хим. - 1992, № 6. - С. 69-75.

25.Бектенова Г.А., Веколова В.В., Гладышев П.П., Быкова Л.Н. Исследование взаимодействия бороновых кислот с диолсодержащими твердыми фазами. III. Изучение комплексообразования бороновых кислот с поливиниловым спиртом в статических условиях // Изв. АН РК. Сер. хим. - 1994, № 5. - С. 22-27.

26.Предпатент РК. № 3684. Способ иммобилизации ферментов-гликопротеинов // Бектенова Г.А., Веколова В.В., Гладышев П.П., Быкова Л.Н., Бектуров Е.А. Опубл. 16.09.96.

27.Бектенова Г.А., Сулекешова Г.К., Сигитов В.Б., Нуркеева З.С., Бектуров Г.А. Иммобилизация каталазы Pcnicillium vitals на полимерных гидрогелях. Влияние концентрации фонового электролита. Термостабильность иммобилизованных препаратов // Изв. МН-АН РК. Сер. хим. - 1997, № 3. - С. 65-71.

28.Bektenova G.A., Suiekeshova G.K., Bekturov Е.А. Sorption Immobilization of Enzymes on the Polymer Hydrogels . Thennostability of Immobilized Preparations // Abstracts of Reports of the 36-th IUPAC Congr. - Jeneva, Switzerland, 1997. -Ref. 229.

29.Bektenova G.A., Suiekeshova G.K., Kudaibergenov S.E., Bekturov E.A. Immobilization of enzymes on Polymer Hydrogels: Influence of pH, Kinctics of Process and Isotherms of Sorption // Abstracts of reports on the 4-th Int. Symp. on Polymer Adv. Techn. ( PAT-97). - Leipzig, Germany, 1997. - P. 112.

30.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Взаимодействие ферментов с ионообменными целлюлозами: кинетика и обратимость процесса // Тезисы

докл. на Межд. конф. "Некоторые проблемы химии и физики полисахаридов (целлюлоза, хитин, пектин)". - Ташкент, 1997. - С. 63.

ЗКБектенова ГА., Гдадышев П.П., Бектуров Е.А, Сорбшгонная иммобилизация ферментов на ионообменных целлюлозах // Там же. - С. 20.

32.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Аймухамедова Г.Б. Хроматографические носители на основе пектиновых веществ для разделения биологически активных соединений // Там же. - С. 61.

33.Бектенова Г.А.. Быкова Л.Н., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Адсорбционная иммобилизация ферментов-гликопротеинов на кремнеземных и углеродных поверхностях // Вестн. КазГНУ им. Алъ-Фараби. - 1998, № 3 (11). - С. 87-91.

34.Бектснова Г.А. Синтез производных фенил бороновой кислоты. - Ал маты. (Дел. в КазГосИНТИ, 28.10.98, № 8481-КА 98).

35.Bektenova G.A., Sutekeshova G.K., Bckturov Е.А. Interaction of Catalase with Anionic Polymer Hvdrogels // Abstracts of Present, on MRS 1998 Fall Meeting, Symp.GG. - Boston," USA, 1998, - GG3.2.

36.Bektenova G.A., Bekturov E.A. Oxide Surfaces Activated by Boronic Acids for Immobilization of Enzymes-Glycoproteins // Abstracts of Internal. Microsymp. "Colloids and Surfaces"' - Almaty, 1998. P-Cl. - P. 61.

37.Bektenova G.A., Bykova L.N., Gladyshev P.P. Adsoфtion of Enzymes-Glycoproteins on Silica and Carbon Surfaces // Ibid., 1998. P-C2. - P. 62.

38.Bektenova G.A., Bykova L.N., Gladyshev P.P., Bekturov E.A. Sorption Immobilization of Enzymes on Ion Exchange Cellulose's // Abstracts of 8-th Int. Coiif. on Polymer Based Techn. (POC'98). - Israel, 1998. - № 363. - P. 11.

39.Bektenova G.A., Gladyshev P.P. Affinity Chromatography of Boronic Acids // Ibid., 1998,-№ 363. - P. 12.

40.Sigitov V.B., Raimbekov R.F., Akimbekova K.Zh., Bektenova G.A., Nurkeeva Z.S., Kudaibergenov S.E. Complexation of Polyelectroiyte Gels with Metal Ions, Dyes, Proteins and Linear Polymers // In Poiyelectrolytes. Proc. of 2-nd Int. Symp. on Poiyelectrolytes (Yamada Conf. L). - 1998. - P. 300-304.

4!.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Влияние гетерогенности ио-нита на сорбцию полиэлектролитов // Изв. МН и ВО РК. Сер. хим. - 1999, № 1.-С. 14-18.

42.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Пленочные и поверхностные иониты // Изв. МН и ВО РК. Сер. хим. - 1999, № 1.-С. 18-22.

43.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Быкова Л.Н., Сулекешова Г.К., Бектуров Е.А. // Ферментные окислительно-восстановительные системы в анализе метаболитов, ингибиторов и токсичных соединений // Материалы Межд. научн. конф. "Природные соединения - регуляторы метаболизма и адаптации растений", поев. 90-летню Л.К. Клышева. - Алматы, 1999. - С. 14-15.

44.Bektenova G.A., Gladyshev P.P., Bykova L.N. Activation of Silica and Carbon Carriers by Boronic Acids for Immobilization of Biocatalysts // Abstracts of pre-OMCOS Symp. on Organometallics and Catalysis. - Rennes, France, 1999. - P. 19.

45.Сулекешова Г.К., Бектенова Г.А. Взаимодействие катапазы с гидрогелем по-лиаллиламина II Тезисы докл. на Респ. конф. мод. уч. "Химики XXI века"',

поев. 100-летию К.И.Сатпаева. - Алматы, КазГНУ им. Аль-Фараби, 1999. - С. 76.

46.Бектенова Г.А., Сулекешова Г.К., Бектуров Е.А. Сорбционяая иммобилизация ферментов на полимерных гидрогелях: влияние рН, времени и концентрации фермента // Изв. МН и ВО РК. Сер. хим. - 1999, № 1. - С. 66-74.

47.Бектенова Г.А. Иммобилизация ферментов-гликопротеинов на кремнезем* ных носителях // Proc. of the 5-th Int. Symp. of Scientists of Turkish Languages Countries on Polymers and Polymer Composites. - Almaty, 1999. - P. I78-180.

48.Бектенова Г.А., Сулекешова Г.К., Бектуров Е.А. Взаимодействие каталазы с гелем полиакриловой кислоты // Там же. 1999. - С. 285-288.

49.Bektenova G.A., Kudaibergenov S.E., Bekturov Е.А. Interaction of Catalase with Cationic Hydrogels: Influence of pH, Kinetics of Process and Isotherms of Adsorption //Polym. Adv. Technol. - 1999. - Vol. 10. - P. 140-145.

50.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова B.B., Быкова J1.H., Бектуров Е.А. Иммобилизация ферментов-гликопротеинов на кремнеземных носителях. I. Активирование кремнеземных носителей бороновыми кислотами // Изв. МН и ВО РК. Сер. хим. - 1999, № 3. - С. 14-23.

51.Bektenova G.A., Gladyshev P.P., Bekturov Е.А. Complexation of Boronic Acids with Polyvinyl Alcohol and Immobilization of Glycoproteins // Abstracts of 5-th Int. Symp. on Polymers for Adv. Technol. (PAT-99). PI-01a.- Tokyo, 1999. - P. 194.

52.Bektenova G.A., Sulekeshova G.K., Bekturov E.A. Interaction of Catalase with Polyallylamine Hydrogel // Ibid. PI-02b. - Tokyo, 1999. - P. 195.

53.Бектенова Г.А., Сулекешова Г.К., Бектуров Е.А. Сорбционное взаимодействие ферментов с полимерными гидрогелями // Проблемы эволюции открытых систем // Сб. научи, тр. - Алматы: Дайк Пресс, 1999. - С. 180-188.

54.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Сорбция макромолекул на ге-левых сорбентах как модель образования и эволюции неравновесных систем //'Тезисы докл. на Межд. рабоч. совещании "Неравновесные системы многих тел". - Алматы, 1999. С1-Р. - С. 47-48.

55.Бектенова Г.А, Бектуров Е.А. Комплексообразованис бороновых кислот с поливиниловым спиртом // Тезисы докл. на Межд. конф. "Химия полимеров на пороге XXI века". - Ташкент, 1999. - С. 53.

56.Бекгенова Г.А., Гладышев П.П. Модельные представления о сорбционно иммобилизованных системах. - Алматы. (Деп. в КазгосИНТИ, 9.03.2000, №

8760-Ка00).

57.Bektenova G.A., Bekturov Е.А., Sulekeshova G.K., Kudaibergenov S.E. Interaction of Amphoteric Hydrogels with Catalase // ACS 219th National Meeting. Symp. Polym. Gels. - San Francisco, 2000. - Abstr. P-348.

58.Бектенова Г.А., Гладышев ПП. Термодинамика локальных сорбционных равновесий с участием белков. - Алматы (Деп. в КазгосИНТИ, 9.03 2000, N°

8761-Ка00).

59.Бектенова Г.А., Быкова JI.H., Новиков Б.Е., Гладышев П.П. Иммобилизованные ферментные системы в решении прикладных задач. - Алмэты. (Деп. в КазгосИНТИ, 9.03.2000, № 8763-КаОО).

60.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Бектуров Е.А. Термодинамическое равновесие, кинетика и обратимость сорбции глобулярных белков полимерными ге-левыми сорбентами. - Алматы. (Деп. в КазгосИНТИ, 9.03.2000, № 8762-КаОО).

61.Бектенова Г.А., Гладышев П.П., Веколова В.В., Быкова Л.Н., Бектуров Е.А. Иммобилизация ферментов-гликопротеинов на кремнеземных носителях. II. Химическая иммобилизация глюкозооксидазы и ацетилхолинэстеразы на активированных бороновыми кислотами кремнеземных поверхностях // Изв. МН и ВО РК. Сер. хим. - 2000, № 2. - С. 30-39.

62.Bektenova G.A., Bekturov Е.А., Suiekeshova G.K., Kudaibergenov S.E. Interaction of Amphoteric Hydrogels vvitli Catalase: Influence of pH and Ionic Strength // Amer. Chem. Soc. Polym. Prepr. - 2000. - Vol. 41, N2 1. - P. 750-751.

Бектснова Гулнэр Амантайкызы

ФЕРМЕНТТЕРД1 БЕЙОРГАНИКАЛЫК, ЖЭНЕ ОРГАНИКАЛЫК, ПОЛИМЕРЛ1 ТАСЫРЫШТАРДА ИММОБИЛИЗАЦИЯЛАУ

02.00.06 - жогары молекулалык, к,осылыстар химиясы

02.00.10 - биоорганикалык химия, табиги жоне физиологиялык, актияп затгар химиясы

РЕЗЮМЕ

Фсрмслттсрд! ортурл1 бсйорганикалык, жоне органикалык поли-исрл1 тасыгыштарда химиялык; жэне сорбциялык, иммобилизация-ллныц жогары оссрл1 од!стер1 мен гылыми нспздср1 к,алыптастырыл-1Ы. Бул оравда жада спсйссрлср мен полимерл! матсриалдар колда-

гШЛДЫ.

Ферменттердщ сорбциялы орскеггесу! тунгыш рст жуйслг турдс гсориялык, жоне тож1рибслк тургылардан зерттелдь Ол ушш каталазаньщ иондык, гидрогельдермен эрскетгсеушде рН, сырткы орта :рпгкшп мен фермент концентрацияларына байланыстылык, занды-тыктары непзге алынды. Полимсрл1 гидрогельдердщ гомогендшк та-паптарына сойкес кслстшдш жоне оларды гсльд!К сорбснттсрдщ шск-пк мысалы ретвде карастыруга болатындыгы корсетшген. Тспс-тсщлз жуйслердщ тузига мен эполюциясыныд квр'иии рспндс балоктар мен гтолимерл1 гидрогельдердщ кдтысында журстш реалды сорбциялык процесетерд1 карастырганда кинстикалык,-термодинамикалык тужы-рымдамаеынын колданбалылыгы керсст1лгсн. Биополимсрлсрдщ по-пимсрл1 гидрогельдерде сорбциялы иммобилизациясыныд непзп завдылыктары мен срскшсл'исгср! адыктаяган. Жогары ферментатпгпк ютинтипк жоне турактылык, корсететш каталазаньщ жана полимсрл1 комплекстер1 алынды. Олардыц ксйб1р каталитикалык; касисттср! зерттелген.

Гликопротеин ферменттершщ жада химиялык иммобилизация одь -шщ неп'здсмслср] комплсксп теориялык жоне тож1рибсл1К тургыдан гунгыш рет зерттелдь Фенилборонды кышкылдары непзшде жана глсйсерлср синтсзделген, олардын, спектралдык, хроматографиялык, жоне кышкылдык, мшездсмелер1 алынды жоне крсылыстардыд куры-пымы мен каеистгершщ араеындагы сойкестшп аныкталды. Борон кышкылдарымен акггивтелген жада крсмнсземд1 таеыгыштар алынган. Жогары активтшпмен жэне аса турактылыгымен сипатталатын осы гаеыгыштарда иммобилизацияланган ацетилхолинэсгераза жоне глю-козоокеидаза препараттары алынды. Ацетилхолинэстеразанын, каталазаньщ жэне люциферазанын ингибиторлармсн эрскеттссу мысалында иммобилизацияланган фсрмснгтсрд1 ортурл! аналитика-лык жуйслсрде колдану жагда1'5шары карастырылган.

Bektenova Gulnara Amantaevna

IMMOBILIZ ATION OF ENZYMES ON rNORGANIC AND ORGANIC POLYMER CARRIERS

The Doctor of Chemistry Applicant's Thesis

02.00.06 - Polymer Chemistry 02.00.10 - Bioorganic Chemistry, Chemistry of Natural and Physiologically Active Substances

SUMMARY

The scientific principles and high effective methods of chemical and sorption immobilization of enzymes on different inorganic and organic both synthetic and natural polymer carriers have been developed, the new spacers and new polymer materials being used.

The theoretical and experimental investigations of sorption interaction of enzymes with ionic polymer hydrogels in dependence on different factors of external medium were systematically carried out. It was shown that polymer hydrogels corresponds maximally to homogeneity conditions and are the limit case of gel sorbents. This allowed us to consider the sorption immobilization on different gel sorbents from the same theoretical positions. It was shown that both thermodynamic and kinetic parameters are necessary to be taken into account when the real sorption processes occurring in time and space and representing a model of formation and evolution of nonequilibrium systems are considered. The main principles and peculiarities of sorption immobilization of biopolymers on polymer hydrogels were studied. The sorption interaction of these two complicated objects is shown to be polyfunctional with participation of several types of weak noncovalent forces resulted in irreversibility of the process. The new polymeric complexes of catalase possessing high enzymatic activity, thenno- and operation stability were obtained and their some catalytic properties have been discussed. The theoretical and experimental researches on creation and systematic development of the new chemical method of immobilization of enzymes-glycoproteins, for example acetylcholine esterase (AChE) and glucose oxidase (GO), by means of boronate-diol complex formation have been carried out. A number of new spacers on tlie basis of bo-ronic acids (BA) were synthesized. Their spectral, chromatographic and acidic characteristics were obtained and were established to correlate with their structure. Model studies of interaction of B A with diols in static and dynamic conditions have allowed us to optimize the immobilization conditions not only for AChE and GO but also for any glycoprotein. The new preparations of AChE and GO with high activity and stability immobilized on activated by BA silica carriers were obtained in optimal conditions for enzyme function. Possibilities for investigation and use of immobilized enzymes in different analytical systems by relaxation of its activity for acetylcholine esterase. catalase and luciferase systems under inhibitors affecting have been considered.