Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов

Ожимкова, Елена Владимировна

Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Ожимкова, Елена Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.15 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов»

Автореферат диссертации на тему "Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов"

На правах рукописи

ОЖИМКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ ГЛИКОЗИДАЗЫ -КАТАЛИЗАТОРЫ ГИДРОЛИЗА ГЕТЕРОПОЛИСАХАРИДОВ

Специальность 02.00.15 - Катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 С НОЯ

Москва 2009

003484794

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Сидоров Александр Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

кандидат химических наук Крамарева Наталья Васильевна

Ведущая организация:

Институт органической химии Российской академии наук

Защипа состоится 11 декабря 2009 г. в 10 ч 00 мин на заседании диссертационного совета 212.204.02 Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9, конференц-зал (ауд. 443).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан " 40" ноября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.204.02

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и общая характеристика работы.

В последнее время растительные олигосахариды находят все более широкое применение в различных отраслях пищевой промышленности: при производстве различных напитков (фруктовые воды, чаи и пр.), молочных продуктов (йогуртов, мороженого, порошкового молока), а также при создании пребиотичеких и симбиотических продуктов питания, при производстве кондитерских изделий (желе, кексы, мармелады и т.д.). Что касается непищевого использования олигосахаридов, то 01Ш применяются при создании систем доставки лекарственных средств и различных биоимплантов, а также в косметической промышленности.

На сегодняшний день существует несколько основных способов получения олигосахаридов: непосредственное выделение из растительного сырья; химический и ферментативный синтез из моносахаридов, а также гидролиз (кислотный и ферментативный) растительных полисахаридов, при этом особого внимания заслуживает энзиматическая деградация гетерополисахаридных субстратов иммобилизованными энзимами. Существует довольно много методов иммобилизации, но ни один из них не является универсальным. Одним из эффективных методов иммобилизации является ковалентное закрепление фермента на полимерных носителях, которые должны обладать рядом свойств: механическая прочность, высокая химическая стойкость и невысокая стоимость.

Решить данную проблему можно только с использованием полифункциональных ферментативных систем, позволяющих эффективно получить необходимые фракции низкомолекулярных продуктов гидролиза для использования их в качестве функционально активных компонентов пищи. В связи с этим, создание и установление свойств стабильных катализаторов на основе иммобилизованных на твердом полимерном носителе комплекса ферментов для гидролиза гетерополисахаридов является актуальным, перспективным и экономически выгодным направлением исследований.

Цель работы заключается в разработке эффективных катализаторов гидролиза растительных гетерополисахаридов на основе иммобилизованного гликолитического ферментного комплекса гриба Тпскайегта У1Г1с1е.

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи:

- теоретический анализ методов иммобилизации ферментов и обоснование выбора исходных компонентов каталитической системы;

- оптимизация состава разрабатываемой каталитической системы;

- исследование оптимальной каталитической системы физико-химическими методами для формулировки гипотезы о структуре полученного катализатора;

- теоретическое обоснование выбора источников гетерополисахаридов и разработка эффективного метода экстракции гликанов из растительного сырья;

экспериментальное исследование кинетики гидролиза растительных гетерополисахаридов на оптимальном катализаторе;

- расчет кинетических параметров процесса каталитического гидролиза гликанов и определение условий реакции, при которых достигается максимальное накопление олигосахаридов в реакционной среде.

обыкновенного и валерианы лекарственной. Подобраны оптимальные условия реакций гидролиза гетерополисахаридов для накопления максимального количества три- и иентаолигосахаридов в реакционной среде. Впервые предложены эффективные методики получения доступных гетерополисахаридов, являющиеся перспективными субстратами для ферментативного получения олигосахаридов. Доказана эффективность использования ультразвукового воздействия при экстракции полисахаридов льна, что позволяет существенно сократить время процесса.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на следующих конференциях: XI, XII Региональных Каргинских чтениях - Областной научно-технической конференции молодых ученых "Физика, химия и новые технологии" (Тверь, 2005, 2006), Международных конференциях молодых ученых "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, МГУ ПБ, 2006, 2008), V и VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008, 2009 гг.), XV и XVI Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008, 2009 г.), на втором Международного форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), XIII Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2009)

Публикации. По результатам работы опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 в центральной печати. Получен Патент на изобретение РФ № 2358983 «Способ получения полисахаридов льна».

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Текст изложен на 137 страницах, включает 60 рисунков, 24 таблицы. Список использованных источников содержит 120 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, изложены цель, научная новизна и практическая ценность проведенных исследований.

В первой главе «Литературный обзор» рассмотрены основные сферы применения и методы получения растительных олигосахаридов, а также обобщены имеющиеся в литературе данные по ферментативному гидролизу растительных полисахаридов. Обоснован выбор источников растительных гликанов. Приведены основные методы иммобилизации ферментов, требования к используемым носителям. Охарактеризованы свойства используемого ферментного комплекса Trichoderma viride, а также проанализированы имеющиеся в литературе данные по иммобилизации гликозидаз.

Во второй главе "Методы и методики экспериментов и анализов" приведены методики получения каталитических систем на основе иммобилизованного на полимерных носителях гликолитического ферментного комплекса гриба Тг1с1юс1егта у/ги/е и проведения кинетических экспериментов, описаны использованные лабораторные установки, представлены характеристики используемых носителей и вспомогательных материалов, представлены методики использованных физико-химических методов исследования катализаторов (инфракрасная Фурье-спектроскопия, рептгенофотоэлектронная спектроскопия, низкотемпературная адсорбция азота).

В диссертационном исследовании разработка каталитических систем на основе иммобилизованного гликолитического комплекса проведена с учетом рекомендаций ШРАС. На основе теоретического анализа были выбраны следующие начальные условия:

- структура каталитической системы в первом приближении должна иметь вид:

Н-М-Е, (1)

где Н - носитель, М - модификатор, Е - фермент;

- И - полимерные носители 8ЕРАВЕАБ8 ЕС-ЕР 403 и БЕРАВЕАОЗ ЕС-НА 403 (таблица 1), обладающие высокой механической прочностью и химической стабильностью, имеющие ионогенные эпокси- и аминогруппы соответственно, способные к ион-ионному взаимодействию.

Таблица 1 - Основные характеристики используемых носителей

ЗЕРАВЕАЕ« ЕС-ЕР 403 БЕРАВБАВБ ЕС-НА 403

схематичное изображение фпспЛ

матрица полиметакрилат полиметакрилат

активная группа эпокси гексаметилендиамино

размер частиц 150-300 цм 150-300 цм

плотность 1,1 г/мл 1,1 г/мл

пористость > 50% > 50%

средний радиус пор 60 нм 60 нм

- М - глутаровый альдегид; наиболее широко используемый сшивающий агент для ковалентной иммобилизации ферментов; применение данного реагента основано на образовании в слабощелочной среде азометиновой связи оснований Шиффа (-СН=Ы-) в реакции альдегида с аминогруппами носителя 8ЕРАВЕА1)8 ЕС-НА 403 и фермента;

- Е - ферментный комплекс Тгк1юс1егта \iride - высокоактивный коммерчески доступный ферментный препарат, гидролизующий углеводные субстраты, в частности, производные ксилана.

- в качестве субстратов (в) использовали гетерополисахариды льна обыкновенного (81) (рис.1) и валерианы лекарственной (82) (рис.2). Для определения ксиланазной и пектиназной активности использовали ксилан (БЗ) и пектин (Б4) -модельные субстраты для ферментного комплекса Тгк1юс1егта \iride). Выбор субстратов обусловлен описанными в литературе ценными свойствами продуктов гидролиза указанных гликанов.

МСу1/> 1>Ху1р

1 '

1 4

мыр ^^

1 2

^ Ага/"-^ 4- 0-Са1 рА1->4 Агц/"-1 ~>4 -О-Оа] р -1-> 4-ГХМ/1-1 -»

4 2

->Ь-Юмр- 1^2-И!11ар-1->4-В-СЫрА-Ы2"Ь-Ю1чр- 1-»4-1МЫрА Т

4 1

1 ОХу1 р

1 1 а) б)

Рисунок 1 - Схема строения гетерополисахаридов а) льна обыкновенного; б) валерианы лекарственной

- общие схемы синтеза каталитических систем: с активацией носителя

II + Н-М; Н-М + Е Н-М-Е; (2)

без активации носителя

Н + Е Н-Е; (3)

Схемы синтеза каталитических систем представлены на рисунках 2 и 3.

•Агт + Н Ы-(Т) -*

о 2 -' ^^ ОН Н

Рисунок 2 - Схема закрепления фермента на 8ЕРАВЕА1)8 ЕС-ЕР 403

' ОН Н иб 2

Рисунок 3 - Схема закрепления фермента на БЕРАВЕАББ ЕС-НА 403

н,0 -

Таблица 1 - Синтезированные каталитические системы

Условное обозначение Краткая характеристика

Н1-Е Иммобилизованный на 5ЕРАВЕАИ8 ЕС-ЕР 403 ферментный комплекс

Н1-М1-Е Иммобилизованный на модифицированном фосфатным буфером 8ЕРАВЕА08 ЕС-ЕР 403 ферментный комплекс

Н1-М2-Е Иммобилизованный на модифицированном фосфатным буфером и глутаровым альдегидом 8ЕРАВЕАБ8 ЕС-ЕР 403 ферментный комплекс

Н2-Е Иммобилизованный на БЕРАВЕАОЗ ЕС-НА 403 ферментный комплекс

Н2-М-Е Иммобилизованный на модифицированном фосфатным буфером и глутаровым альдегидом 8ЕРАВЕАГ)8 ЕС-НА 403 ферментный комплекс

В третьей главе "Результаты и обсуждение" обоснован метод получения субстратов - гетрополисахаридов льна обыкновенного и валерианы лекарственной. Подобраны и экспериментально подтверждены оптимальные условия ультразвуковой экстракции полисахаридов льна обыкновенного. Приведены результаты кислотного гидролиза гетерополисахаридов, который проводили с целью определения моносахаридного состава используемых субстратов. Представлены результаты гидролиза ксилана свободным и иммобилизованным ферментным комплексом

Тпскос1егта \4ride, рассмотрено влияние иммобилизации на оптимальные условия действия данного фермента.

Обоснован состав и продолжительность синтеза каталитических систем, приведены результаты кинетических исследований пиролиза ксилана синтезированными каталитическими системами и проведено сравнение эффективности и стабильности полученных катализаторов. Приведены результаты исследований структуры оптимальной каталитической системы физико-химическими методами. Также определены кинетические параметры гидролиза полисахаридов льна обыкновенного и валерианы лекарственной на оптимальной каталитической системе; изучена кинетика накопления три- и пентаолигосахаридов в реакционной среде.

Иммобилизация гидролитического ферментного комплекса Тпскоскгта viride проводилась в соответствии со схемами синтеза (2) и (3) с промежуточной отмывкой соответствующими буферами и бидистиллированной водой от неспецифически связанных компонентов. Полученные катализаторы высушивали под вакуумом и хранили в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре.

Сравнение активностей нативного и иммобилизованного ферментного комплекса проводилось по результатам гидролиза ксилана.

Для определения температуры и рН проведения процесса был проведен ряд опытов в температурном диапазоне от 20°С до 60°С и рН от 3 до 8.

температура, °С

а) 6)

Рисунок 4 - Зависимость активности свободного и иммобилизованного ферментного комплекса ТпсИо^егта угУ/с/е а) от температуры реакционной среды б) от рН среды (кинетический метод)

Как видно из приведенных на рис. 4 (а,б) данных, иммобилизация не привела к изменению оптимальных условий действия фермента (1=40°С и рН 4,8) но увеличила температурную и рН стабильность катализатора.

Для проведения кинетических экспериментов был использован реактор с возвратно-поступательным качанием, обеспечивающий условия процесса, исключающие внешнедиффузионное торможение. В ходе экспериментов была определена относительная активность синтезированных каталитических систем по отношению к нативному ферментному препарату, которая составила для Н1-Е 38%, для Н1-М1-Е 42%, для Н1-М2-Е 54%, для Н2 Е 62%, для Н2-М-Е 71%; а также установлена наиболее устойчивая каталитическая система. Для исследования стабильности каталитических систем на каждой из них проводились до 10 последовательных циклов. Анализ экспериментальных данных (табл. 2) показал, что стабильной является только каталитическая система Н2-М-Е. Остальные системы нестабильны - фермент диффувдирует в реакционную среду.

Таблица 2 - Сравнение активности каталитических систем (С0ксилава = 0,3

мкмоль/л, рН = 4,8,1 = 40°С, ткаташштор1 = 1 г)

Метод приготовления "Уо> мкмоль/л'мин Характеристика системы

111-Е 0,031 Нестабильная

Н1-М1-Е 0,037 Нестабильная

Н1-М2-Е 0,041 Нестабильная

Н2-Е 0,068 Нестабильная

Н2-М-ЕМ 0,092 Стабильная*

* - активность сохраняется в 10 последовательных циклах

Физико-химические исследования системы Н2-М-Е.

ИК-Фурье спектроскопия. При анализе полученных инфракрасных спектров (рис.5) было установлено, что свободный носитель (спектр 1) содержит значительное количество свободных -ЫНг групп, на что указывает пик в области 1730-1740 см"1. На спектрах активированного носителя (спектр 2) и полученного катализатора (спектр 3) этот пик отсутствует, что позволяет говорить о связывании -Жг групп глутаровым альдегидом. Пик в области 1610-1620 см"1, характерный для -N11 групп сохраняется на всех трех спектрах, следовательно, данная группа не участвует в процессе иммобилизации. Кроме того, на всех трех спектрах присутствует пик в области 14601470 см"1, характерный для -ОН групп, что указывает на то, что гидроксильные

группы носителя не принимают участие в иммобилизации фермента. Пики в области 1680 см"1, наблюдаемые на спектрах активированного носителя и синтезированного катализатора, характерны для азометиновой связи, что указывает на образование связей «Н2-М» и «Н2-М-Е». На спектре активированного носителя присутствует широкий пик в области 1200 - 1300 см"1, характерный для С=0 группы альдегидов. Все пики, находящиеся в области 850 - 600 см"1 указывают на наличие звеньев (CHi)^ где п принимает значения больше 4; данные группы входят в состав используемого носителя.

активированный глутаровым альдегидом, 3 - полученный катализатор) (параметры регистрации спектра: от 500 см"1 до 2000 см"1, разрешение 1 см"1)

РФЭ спектроскопия. Метод применялся для установления факта связывания фермента с полимерным носителем, а также количественной оценки результатов иммобилизации.

В таблице 3 представлен состав поверхности исследованных систем и значения энергий связи максимумов подуровней элементов. Спектры высокого разрешения линии ИЬ для чистого носителя и носителя с глутаровым альдегидом имеют тонкую структуру из двух и трех компонентов, соответственно, с энергиями связи 339,3 эВ, 401,8 и 398,5 эВ, которые можно отнести к -МН-, ТМН2-, группам соответственно (табл. 3 и рис.6).

Таблица 3 - Состав поверхности носителя (%ат.) и значения энергий связи

максимумов подуровней элементов (эВ).

Образец С С Ь О О Ь N N15 Б Б2р

(%ат.) эВ (%ат.) эВ (%ат.) эВ (%ат.) эВ

Н2 69.693 285.0 26.494 532.7 2.977 399.3 - -

Н2+М 70.909 285.0 26.612 532.7 2.151 399.3 - -

Н2+М+Е 69.303 285.0 25.334 532.3 5.040 399.8 0.162 163.7

Рисунок 6 - РФЭ-спектр высокого разрешения линии N18 для поверхностна) исходного носителя вЕРАВЕАОВ ЕС-НА 403; б) образца носителя со сшивающим агентом и ферментным препаратом

Подтверждением осаждения белка на поверхность служит появление компоненты с энергией связи N18 399,9 эВ, что можно отнести к пептидной связи и увеличение содержания компонент N112- и -№=, которые встречаются в составе аминокислотных остатков. Кроме того, подтверждением осаждения фермента на поверхность носителя служит увеличение содержания азота на поверхности образца Н2+М+Е и появление серы. Исходя из количества групп N112- у исходного Н2 (0,5ммоль/г) и полученных данных по увеличению содержания азота (на 2, 036 %ат) и предполагая, что источником азота является только ферментный комплекс, была рассчитана масса иммобилизованных ферментов, которая составила 35-н40 мг на 1 г носителя. Таким образом, степень иммобилизации составила 64^-71%, что

коррелирует с данными по активности ферментного комплекса после иммобилизации (71%).

Низкотемпературная адсорбция азота. Для оценки поверхностных характеристик исходного и активированного носителя, а также полученного

катализатора были получены

Таблица 4 - Результаты измерения ,. ... .„А

J изотермы адсорбции II типа (IUPАС),

поверхностных характеристик _ ,.

г_____имеющие точку перегиба в области

Образец St, м2/г УР,мл/г,-10J заполнения монослоя адсорбента

Н2 57,6 0,066 (Ы2). Для анализа подобных изотерм

Н2-М 35,6 0,053 применима модель БЭТ. Полученные

Н2-М-Е 20,3 0,048 значения удельной поверхности (8,),

объема пор (УР) представлены в таблице 4. Поэтапная обработка носителя приводит к постепенному уменьшению поверхности катализатора с 57,6 до 20,3 м2/г. При этом уменьшение объема пор не столь существенно (с 0,066 до 0,048 мл/г), что свидетельствует о блокировании пор малого диаметра.

Определение кинетических параметров

Для определения кинетических параметров процессов гидролиза гликанов были проведены эксперименты при варьировании исходной концентрации полисахаридов (С0П) и количества катализатора Н2-М-Е (Ск) при различных температурах и рН; учитывая, что процесс идет в кинетической области, а кинетику превращения исходных субстратов (ксилан, пектин, полисахариды льна и валерианы) можно описать известными уравнениями формальной кинетики для реакции первого порядка, были определены константы скорости гидролиза исходных гликанов и константы скорости накопления пентаолигосахаридов, тетраолигосахаридов и триолигосахаридов (табл. 5)

Первичные кинетические зависимости представлены на рис. 7-8. Исходя из соотношения отдельных фракций олигосахаридов и моноз в катализатах, следует, что иммобилизация не повлияла на распределение активностей внутри ферментного комплекса.

—ИСХОДНЫЙ -эксг».

-п«нтасахарид -дисахарид -гаяакт. кислота

время, мин

-тетрасахарид трисахарид

-ксилоза —4— ара би н оза

-гвпактсиа —рамнога

-пентасахариД

-дисахарид

-талакимсл

время, мин -тетрасахарид -ксилоза -галактоза

^^ трисахарид —арабиноэа —рамном

а)

б)

Рисунок 7 - Состав катализата после гидролиза гетерополисахаридов льна а)свободным ферментным комплексом; б) катализатором Н2-М-Е (рН 4,8,1=40 °С, скорость перемешивания 300 мин-1)

-пентасахарид -дисахарид -гапакт. кислота

-трисахарид -арабимоаа

пентасахарид дисахарид галакт. кислота

а) б)

Рисунок 8 - Состав катализата после гидролиза ксилана а)свободным ферментным

комплексом; б) катализатором Н2-М-Е

(рН 4,8,1=40 °С, скорость перемешивания 300 мин"1)

Таблица 5 - Константы скорости гидролиза

Субстрат Катализатор Кисход, МИЛ ' К„ак.5 мин'1 К„ак4 мин"1 Кнак.3 мин"1

п/с льна Е 0,040±0,001 0,026±0,002 0,01 ЗАО,003 0,008±0,003

п/с льна Н2-М-Е 0,027±0,001 0,016±0,002 0,007±0,003 0,011±0,003

ксилан Е 0,045±0,001 0,006±0,002 0,006±0,003 0,010±0,003

ксилан Н2-М-Е 0,018±0,001 0,004±0,002 0,005±0,003 0,009±0,003

п/с валерианы Н2-М-Е 0,022±0,001 0,0150±0,002 0,005±0,003 0,006±0,003

константа скорости гидролиза исходных субстратов; константа накопления пентаолигосахаридов; константа накопления тетраолигосахаридов; константа накопления триолигосахаридов

Анализ кинетических зависимостей и значений констант скоростей, позволяет выдвинуть гипотезу о некоторых особенностях механизма гидролиза гетерополисахаридов на катализаторе Н2-М-Е: - иммобилизация существенно не повлияла на механизм действия ферментного комплекса, на что указывает сохранение соотношения констант скоростей до и после иммобилизации; - гидролиз гликанов, вероятно, протекает по последовательно-параллельной схеме; - в случае гидролиза полисахаридов льна обыкновенного и валерианы лекарственной наблюдается торможение процесса продуктами реакции; - при гидролизе ксилана торможение продуктами отсутствует, что вероятно, обусловлено более однородным моносахаридным составом ксилана и продуктов гидролиза.

Для каждого субстрата установлены основные и промежуточные продукты гидролиза (приведены результаты для гидролиза полисахаридов льна обыкновенного рис. 9).

Максимальное содержание промежуточных продуктов, в том числе пентагалактоксилоуронанов (рис.9), наблюдается в первые 30 минут проведения процесса, впоследствии происходит снижение их содержания в реакционной среде в связи с последующим гидролизом до более мелких олиго и моносахаридов. В ходе проведения работы было изучено влияние начальной концентрации полисахаридов на

где Кисход -

К-нак.5 ~

К 1-

скорость гидролиза, при этом было установлено достижение максимальной скорости образования пентагалактоксилоуронанов при концентрации полисахаридов льна 0,7 ммоль/л. Дальнейшее увеличение концентрации полисахаридов приводит к субстратному ингибированшо процесса.

О о 50 100 150

Время, мин

Рисунок 9 - Зависимость накопления пентагалактоксилоуронанов - продуктов гидролиза гетерополисахаридов льна ферментным комплексом Trichoderma wide от времени при различных концентрациях гетерополисахаридов (рН 4,8, t=40 °С, скорость перемешивания 300 мин'1)

Таким образом, на основании экспериментальных данных были установлены условия проведения процесса гидролиза полисахаридов, соответствующие максимальному накоплению олигосахаридов: рН раствора - 4,8, температура процесса 40 °С, начальная концентрация гетерополисахаридов льна 0,035 ммоль/л, гетерополисахаридов валерианы 0,7 ммоль/л; скорость перемешивания 300 мин'1, продолжительность процесса - 30-40 минут (для максимального накопления пентаолигосахаридов) и 50 минут (для максимального накопления триолигосахаридов).

Проведены клинические испытания применения фракции низкомолекулярных углеводов валерианы лекарственной в Тверской государственной медицинской академии. Включение низкомолекулярных углеводов Valeriana officinalis L. в комплексное лечение больных эрозивно-язвенными поражениями гастродуоденальной зоны приводит к значительному улучшению микробиоценоза кишечника и гуморального звена иммунитета по сравнению с общепринятой терапией.

ВЫВОДЫ

1) Разработан и обоснован способ получения гетерогенной каталитической системы на основе гидролитического ферментного комплекса гриба Тг1с1юс!егта чтйе. Для синтезированного катализатора подобраны оптимальные условия процесса гидролиза различных гетерополисахаридов. Установлено, что иммобилизация не приводит к изменению оптимальных условий действия фермента, но расширяет диапазон его рН- и термостабильности. Определено оптимальное соотношение компонентов каталитической системы «носитель-модификатор-фермент», а также обосновано время синтеза катализатора.

2) Методом ИК-Фурье-спектроскопии показано, что существуют прочные ковалентные связи между носителем, модификатором и ферментным комплексом, что определяет стабильность полученной каталитической системы при многократном использовании.

3) Исходя из анализа кинетических зависимостей и значений констант скоростей была выдвинута гипотеза о некоторых особенностях механизма гидролиза гетерополисахаридов на разработанном гетерогенном катализаторе в том числе о незначительном влияние иммобилизации на распределение относительных активностей внутри ферментного комплекса. Каталитическая система пригодна для повторного использования (не менее 10 раз) и может быть использована для гидролиза растительных гликанов с целью получения олигосахаридов различной степени полимеризации.

4) Подобраны оптимальные условия проведения реакции для накопления максимального количества физиологически активных три- и пентаолигосахаридов в реакционной среде для каждого субстрата.

5) Клинические испытания показали перспективность использования фракции низкомолекулярных углеводов валерианы лекарственной в качестве иммуномодуляторов и пребиотиков.

6) Разработаны эффективные методики получения гетерополисахаридов из доступного растительного сырья. Метод ультразвуковой экстракции гликанов льна защищен патентом на изобретение РФ № 2358983.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Ожимкова Е.В. Кинетика ферментативного гидролиза полисахаридов льна ксиланазой Trichoderma viride/ Е.В. Ожимкова // Вестник МИТХТ. - 2009. - т. 4. №5.-С.45 -46

2. Низкочастотная ультразвуковая экстракция гликанов из Ыпит usitatissimum / Е.В. Ожимкова, А.И. Сидоров, И.Г. Плащина, Е.И. Мартиросова, Ущаповский И.В., Даниленко А.Н. / Вестник МИТХТ. - 2009. - т. 4. №3. - с. 70 - 74

3. Ожимкова Е.В. Биокаталитический гидролиз растительных гетерополисахаридов / Е.В. Ожимкова, А.И. Сидоров, В.П. Молчанов // Вестник Тверского государственного технического университета. - 2009 - №. 14- С. 102-105

4. Влияние низкомолекулярных углеводов Valeriana officinalis L. на микрофлору кишечника при эрозивно-язвенных поражениях гастродуоденальной зоны / В.М. Червинец, Е.В. Ожимкова, Ю.В. Червинец, Л.Е. Смирнова // Вестник Санкт-Петербургской академии имени И.И. Мечникова. - № 2/1 (31), 2009, Специальный выпуск, с. 100-104

5. Ожимкова Е.В. Ферментативный гидролиз полиуронидов Li пит usitatissimum. И Материалы докладов XV конференции Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 14-17 апреля 2009 г. - М., 2009 - 1 электрон, опт. диск

6. Ожимкова Е.В. Получение и ферментативный гидролиз полисахаридов льна / Е.В. Ожимкова, А.И. Сидоров, И.В. Ущаповский: Материалы XIII Международной Пугцинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009. - Пущино, 2009. - С.175.

7. Ультразвуковая экстракция и ферментативный гидролиз полисахаридов льна обыкновенного / И.Г. Плащина, Е.И.Мартиросова, А.И.Сидоров, Е.В.Ожимкова: Материалы пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, март 2009г. - Часть 2.- Москва 2009. -С.109-110

8. Пат. 2358983 Российская Федерация МПК С08В37/06 Способ получения полисахаридов льна /Е.В. Ожимкова, М.Г. Сульман, А.И. Сидоров № 2008100613/13, заявл. 09.01.2008, опубл. 20.06.2009, Бюл. № 17

Подписано в печать 27.10.09 Физ.печ.л. 1,25 Заказ № 107 Тираж 100 экз. Типография Тверского государственного технического университета 170026, г. Тверь, наб. А. Никитина, 22

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Ожимкова, Елена Владимировна

Введение

1 Литературный обзор

1.1 Гидролитические ферменты

1.1.1 Гликозидазы

1.1.2 Ферментный комплекс Tricho derma viride

1.2 Ксиланазы

1.2.1 Общая характеристика ксиланаз

1.2.2 Механизм каталитического действия

1.2.3 Применение ксиланаз

1.3 Иммобилизация ферментов

1.3.1 Методы иммобилизации ферментов

1.3.2 Практическое использование иммобилизованных ферментов

1.3.3 Иммобилизация гликозидаз

1.4 Растительные олигосахариды

1.4.1 Общая характеристика олигосахаридов

1.4.2 Применение растительных олигосахаридов

1.4.3 Получение олигосахаридов

1.5 Ферментативный гидролиз полисахаридов

1.5.1 Общая характеристика растительных полисахаридов

1.5.2 Ультразвуковая экстракция полисахаридов из растительного сырья

1.5.3 Применение растительных полисахаридов

1.5.3.1 Полисахариды валерианы лекарственной

1.5.3.2 Полисахариды льна обыкновенного

2 Методы и методики экспериментов и анализов

2.1. Выбор объекта исследований

2.2 Методики получения субстратов

2.2.1 Экстракция полисахаридов валерианы лекарственной

2.2.2 Методы анализа и контроля процесса экстракции полисахаридов валерианы лекарственной

2.2.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.2.2.2 Инфракрасная Фурье - спектроскопия

2.3 Экстракция полисахаридов льна

2.3.1 Обоснование выбора сорта льна

2.3.1.1 Определение концентрации гликанов в экстрактах

2.3.1.2 Определение содержания редуцирующих Сахаров

2.3.1.3 Динамическое светорассеяние

2.3.2 Методика ультразвуковой экстракции полисахаридов

2.3.3 Методы анализа и контроля ультразвуковой экстракции полисахаридов семян льна

2.3.3.1 Определение сухого остатка

2.3.3.2 Измерение вязкости экстрактов

2.4 Методика проведения кислотного гидролиза полисахаридов льна и валерианы лекарственной

2.5 Методика получения катализаторов

2.5.1 Характеристика носителей

2.5.2 Синтез катализаторов

2.5.2.1 Методика получения каталитических систем на основе SEPABEADS ЕС-ЕР

2.5.2.2 Методика получения каталитических систем на основе SEPABEADS ЕС-НА

2.5.2.3 Расчет степени адсорбции и иммобилизации ферментного препарата

2.6 Определение оптимальных условий и кинетических параметров действия ферментного комплекса Trichoderma viride

2.7 Гидролиз полисахаридов льна ферментным комплексом 72 Trichoderma viride

2.8 Определение оптимального катализатора

2.9 Подтверждение полиферментной активности каталитической системы

2.10 Физико-химические методы исследования образцов катализаторов

2.10.1 Рентгенофотоэлектронная спектроскопия

2.10.2 Исследование поверхностных характеристик катализаторов низкотемпературной адсорбцией азота

2.11 Методы клинических испытаний олигосахаридов валерианы

2.12 Использованные реактивы

3 Результаты экспериментов и их обсуждение

3.1 Экстракция гетерополисахаридов из растительного сырья

3.1.1 Анализ полисахаридов валерианы лекарственной

3.1.1.1 Характеристика полисахаридных экстрактов методом ВЭЖХ

3.1.1.2 Характеристика полисахаридных экстрактов методом ИК спектроскопии

3.1.2 Экстракция полисахаридов льна

3.1.2.1 Обоснование выбора сорта льна

3.1.2.2 Определение оптимальных условий и методы контроля ультразвуковой экстракции полисахаридов льна

3.1.3 Результаты кислотного гидролиза полисахаридов валерианы лекарственной и льна обыкновенного

3.2 Оптимизация состава катализаторов

3.3 Результаты физико-химические исследований

3.3.1 Инфракрасная Фурье спектроскопия

3.3.2 Рентгенофотоэлектронная спектроскопия образцов

3.3.3 Исследование поверхностных характеристик образцов

3.4 Определение условий проведения экспериментов по гидролизу гетерополисахаридов

3.5 Определение условий действия иммобилизованного ферментного комплекса Trichoderma viride

3.6 Определение кинетических характеристик катализатора Н2-М-Е

3.7 Операционная стабильность катализатора Н2-М-Е

3.8 Результаты клинических испытаний 123 Выводы 125 Список использованных источников 127 Приложение А

Введение диссертация по химии, на тему "Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов"

В последнее время растительные олигосахариды находят все более широкое применение в различных отраслях пищевой промышленности: при производстве различных напитков (фруктовые воды, чаи и пр.), молочных продуктов (йогуртов, мороженого, порошкового молока), а также при создании пребиотичеких и симбиотических продуктов питания, при производстве кондитерских изделий (желе, кексы, мармелады и т.д.). Что касается непищевого использования олигосахаридов, то они успешно применяются при создании систем доставки лекарственных средств и различных биоимплантов, а также в косметической промышленности.

На сегодняшний день существует несколько основных способов получения олигосахаридов: непосредственное выделение из растительного сырья; химический и ферментативный синтез из моносахаридов, а также гидролиз (кислотный и ферментативный) растительных полисахаридов, при этом особого внимания заслуживает энзиматическая деградация гетерополисахаридных субстратов иммобилизованными ферментами. Разработано довольно много методов иммобилизации ферментов, тем не менее, нельзя выделить метод, который был бы эффективен для всех ферментов. Одним из методов иммобилизации является ковалентное закрепление фермента на полимерных носителях, которые должны обладать рядом свойств: механическая прочность, высокая химическая стойкостью и невысокая стоимость.

В промышленности широко используются моноферментные каталитические системы гидролиза крахмалистых гомополисахаридов. Однако естественными компонентами пищевого рациона человека всегда являлись частично деградируемые кишечной микрофлорой гетерополисахариды, продукты гидролиза которых оказывают многосторонние положительные эффекты на здоровье человека. В рационе современного человека доля подобных соединений существенно уменьшилась и это связано, прежде всего, с тем, что гетерополисахариды рассматриваются как балластные компоненты лекарственного и пищевого растительного сырья, наличие и содержание которых не нормируется, а их главный исочник - отходы переработки зерновых культур и дикорастущих растений игнорируются, что приводит к развитию дисбактериозов у большинства жителей развитых стран и широкому распространению иммунодефицитных состояний. Решить данную проблему можно только с использованием полифункциональных ферментативных систем, позволяющих эффективно получить необходимые фракции низкомолекулярных продуктов гидролиза для использования их в качестве функционально активных компонентов пищи. В связи с этим, создание и установление свойств стабильных катализаторов на основе иммобилизованных на твердом полимерном носителе комплекса ферментов для гидролиза гетерополисахаридов является актуальным, перспективным и экономически выгодным направлением исследований.

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи: теоретический анализ методов иммобилизации ферментов и обоснование выбора исходных компонентов каталитической системы;

- оптимизация состава разрабатываемой каталитической системы; исследование оптимальной каталитической системы физико-химическими методами для формулировки гипотезы о структуре полученного катализатора;

- экспериментальное исследование кинетики гидролиза растительных гетерополисахаридов на оптимальном катализаторе;

- расчет кинетических параметров процесса каталитического гидролиза гликанов и определения условий реакции, при которых достигается максимальное накопление олигосахаридов в реакционной среде.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования полимерных носителей для иммобилизации гликолитического ферментного комплекса гриба Trichoderma viride. Впервые изучено влияние модификации носителя на активность и стабильность полученных катализаторов, а также проведен сравнительный анализ синтезированных катализаторов на основе двух различных полимерных носителей. На основе модифицированного глутаровым альдегидом носителя получена каталитическая система, сохраняющая активность в течение 10 циклов. На основании экспериментальных данных определены кинетические параметры процессов ферментативного гидролиза ксилана, полисахаридов льна обыкновенного и валерианы лекарственной оптимальной каталитической системой. Подобраны оптимальные условия реакций гидролиза гетерополисахаридов для накопления максимального количества три- и пентаолигосахаридов в реакционной среде. Впервые предложены эффективные методики получения доступных гетерополисахаридов, являющиеся перспективными субстратами для ферментативного получения олигосахаридов. Доказана эффективность использования ультразвукового воздействия на процесс экстракции полисахаридов льна, что позволяет существенно сократить время экстракции.

1 Литературный обзор

Заключение диссертации по теме "Катализ"

выводы

1) Разработан и обоснован способ получения гетерогенной каталитической системы на основе гидролитического ферментного комплекса гриба Trichoderma viride. Для синтезированного катализатора подобраны оптимальные условия процесса гидролиза различных гетерополисахаридов. Установлено, что иммобилизация не приводит к изменению оптимальных условий действия фермента. Определено оптимальное соотношение компонентов каталитической системы «носитель— модификатор-фермент», а также обосновано время синтеза катализатора.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ожимкова, Елена Владимировна, Москва

1. Клесов, А.А. Ферментативный катализ: учеб. пособие для хим. спец. ун-тов. Ч. 2 / А.А. Клесов, И.В. Березин. М.: Московский гос. ун-т, 1984. -216 с.

2. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. В 3-х т. - Пер. с англ. Т. 1-2. - М.: Мир, 1982. - 808 с.

3. Кислухина, О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В. Кислухина. М.: Дели Принт, 2002. - 336 с.

4. Rhamnogalacturonase: a novel enzyme that degrades the hairy regions of pectins / H.A. Schols, С .Geraeds, S.-V. Leeuwen, F. Kormelink, A. Voragen // Carbohydr Res. 1990. - Vol. 206. - P. 105-115.

5. Aspergillus Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Wall Polysaccharides / S.L. Christgau, V. Kofod, T. Halkier, L. N. Anderson, M. Hockauf, K. Dorreich, H. Dalboge, and S. Kauppinen. //J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. -P.27172-27178.

6. Petersen, T. The crystal structure of rhamnogalacturonase A from Aspergillus aculeatus: a right-handed parallel beta helix / T. Petersen, S. Kauppinen, S. Larsen II Structure. 1997. - Vol. 5 (4). - P. 533-544.

7. Characterization of recombinant ramnogalacturonan-l-rhamnopyranosyl-(l,4)-d-galactopyranosyl uronide lyase from Aspergillus aculeatus / M. Mutter, I. Colquhoun, G. Beldman, H. Schols, E. Bakx, A.Voragen // Plant Physiol. 1998. -Vol. 117. - P.141-152.

8. Vlugt-Bergmans, V. / Endo-Xylogalacturonan Hydrolase, a Novel Pectinolytic Enzyme / V.Vlugt-Bergmans, P. Meeuwsen, A.Voragen // Appl Environ Microbiol. 2000. - Vol. 66 (1). - P. 36 - 41

9. Endoxylogalacturonan Hydrolase and Endopolygalacturonases / G.Beldman, J.P. Vincken, H.A. Schols, A. Meeuwsen, M. Herweijer, A. Voragen //Biocatal Biotransformation. 2003. - Vol. 21. - P. 189 - 198.

10. Enzymatic degradation studies of xylogalacturonans from apple and potato, using xylogalacturonan hydrolase / J. Zandleven, G. Beldman, M. Bosveld, H. Schols, A. Voragen // Carbohydr Polym. 2006. - Vol. 65. - P.495 - 503.

11. Aspinall, G.O. Gum Tragacanth. Part I. Fractionation of the gum and the structure of tragacanthic acid / G.O. Aspinall, J. Baillie // Chem. Soc. 1963. - № 318. -P.1702-1714

12. Vlugt-Bermans, V. Endo-Xylogalacturonan hydrolase and Endopolygalacturonases, a Novel Pectinolytic Enzymes / V. Vlugt-Bermans// Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 62 (4). - P. 26 - 31.

13. Voragen, A. Cellulases of a mutant strain of Trichoderma viride QM 9414/ A. Voragen, G.Beldman, F.Rombouts // Methods Enzymol. 1988. - Vol. 160. -P. 243-251.

14. Production of beta-glucosidase, exo-beta-l,4-glucanase and endo-beta-1,4-glucanase by selected microscopic fungi // J. Augustin, J. Zemek, B. Kuniak, O.Fassatiova // Folia Microbiol. (Praha). 1981. - Vol. 26. - P. 14 -18.

15. Versteeg, C. Pectinesterases from the orange fruit their purification, general characteristics and juice cloud destabilizating properties / C. Versteeg //Versl. Landbouwkd. Onderz. (Agric. Res. Rep.). - 1979. - Vol. 892. - P. 1-109.

16. Trichoderma xylanases: their properties and application / Y. Kenk A. Wong, N. John, A. Saddler // Critical reviews in biotechnology. 2008. - Vol. 12 (5). -P.413 -435.

17. Ujiie, M. Low-Molecular-Weight Xylanase from Trichoderma viride / M. Ujiie, C. Roy, M. Yaguchi // Applied and environmental microbiology. 1991. -Vol. 4.-P. 1860-1862.

18. Collins, Т. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases / T.Collins, C.Gerday, G. Feller // FEMS Microbiology Reviews. 2005. - Vol. 29, P. 3-23.

19. Kulkarni, N. Molecular and biotechnological aspects of xylanases / N. Kulkarni, A. Shendye, M. Rao //FEMS Microbiology Reviews. 1999. - Vol. 23. -P.411-456.

20. Dekker, R. Purification, properties and mode of action of hemicellulase-produced by Ceratocystis paradoxa / R. Dekker, G. Richards // Carbohydr. Res. -1975.-Vol. 39.- P. 97-114.

21. Mishra, С. Production and properties of extracellular endoxylanases from Neurospora crassa. / C. Mishra, S. Keskar, M. Rao // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - Vol. 48. - P. 224 - 228.

22. Daniels, M. J. Using biological enzymes in papermaking / M.J. Daniels// Pap. Technol. 1992. - Vol.33(6). -P.14.

23. Eriksson, L. Biotechnology: three approaches to reduce the environmental impact of the pulp and paper industry / L. Eriksson // Sci. Progress. -1991.- Vol. 75.-P. 175.

24. Purification and properties of thermostable xylanase from Tuluromyces byssochlamydoides YH-50 / H. Yoshioka, N. Nagato, S. Chavanich, N. Nilubol, S. Hayashida // Agric. Biol; Chem. 1981. - Vol. 45. - P. 2425.

25. The cellulase of Trichoderma viride. Purification, characterization and comparison of all detectable endoglucanases, exoglucanases and P-glucosidases / G. Beldman, S. Leeuwen, M. Rombouts, F. Voragen // Eur. J. Biochem. 1985. - Vol. 146.-P.301. .

26. Tischer, W. Immobilized enzymes: methods and applications / W. Tischer, F. Wedekind // Top Curr Chem. 1999. - Vol. 200. - P. 95 -126.

27. Short recursive procedure for evaluating effectiveness factors for immobilized enzymes with reversible Michaelis Menten kinetics / C.Gomez, A.

28. Santoyo, E. Gomez, J.Rodriguez, M.Maximo Martin, M. Gomez // ' Biochemical Engineering Journal. 2008. - Vol. 39(1). - P. 58-65.

29. Thomas, S.M. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry / S.M. Thomas, R. DiCosimo, V. Nagarajan // Trends Biotechnol.- 2002 . -Vol. 20.-P.23 8-242.

30. Padma, V. Enzyme stability and stabilization Aqueous and nonaqueous environment / V. Padma, L. Ananthanarayan // Process Biochemistry. -2008.-Vol. 43.-P.1019- 1032.

31. Bullock, C. Immobilized enzymes / C. Bullock//Sci Progress. 1995.-Vol.78. - P. 119-34.

32. Tischer, W. Immobilized enzymes: crystals or carriers? / W. Tischer, V. Kasche // Trends Biotechnol. 1999. - Vol.17. - P. 326-335.

33. Jaeger, K.E. Protein technologies and commercial enzymes. White is the hypebiocatalysts on the move. / K.E. Jaeger // Curr. Opin. Biotechnol.- 2004. -Vol.15.-P. 269-271.

34. Дебабов, В.Г. Биотехнология/ В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. М.: Высшая школа, 1988. - 208 с.

35. Биотехнология / под ред. И. Хиггинса / перевод с английского / под ред. А.А. Баева. М.: Мир, 1988. - 479 с.

36. Woodley, JM. Immobilized biocatalysts./ J.M.Woodley // Solid Supports Catal Org Synth. 1992. - Vol.21.-P.254-271.

37. Panke, S. Enzyme technology and bioprocess engineering./ S. Panke, M. Wubbolts//Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - Vol.13.-P. 111-116.

38. Immobilization of Streptomyces olivaceoviridis E-86 xylanase on Eudragit S-100 for xylo-oligosaccharide production // Process BiochemistryVolume.- 2005. Vol. 40 (8). - P.2707-2714.

39. Fungus (3-glycosidases: immobilization and use in alkyl-P-glycoside synthesis / M. Gargouri, I. Smaali, T. Maugard, M. Legoy, N. Marzouk // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2004. - Vol.29 (1-6). - P.89 - 94.

40. Mona, K. Catalytic properties of the immobilized Aspergillus tamarii xylanase / K. Mona, A. Abdel-Naby // Microbiological Research. 2002. - Vol. 157 (4).- P. 275-281.

41. Simultaneous purification and immobilization of Aspergillus niger xylanase on the reversibly soluble polymer Eudragit™ L-100 / S.Merya, R. Ipsita, N. Munishwar // Enzyme and Microbial Technology. 2000. - Vol. 27 (9). - P. 672 -679.

42. Kapoor, M. Immobilization of xylanase from Bacillus pumilus strain MK001 and its application in production of xylo-oligosaccharides./ M. Kapoor , R. Kuhad // Appl Biochem Biotechnol. 2007. - Vol. 142(2). - P.125-138.

43. Gawande, V. Preparation, characterization and application of Aspergillus sp. xylanase immobilized on Eudragit S-100 / V. Gawande, M. Y. Kamat // Journal of Biotechnology. - 1998. - Vol. 66 (2-3). - P. 165-175.

44. Methodology for the immobilization of enzymes onto mesoporous materials. / S. Hudson, E. Magner , J. Cooney, B. Hodnett // J Phys Chem B. 2005. -Vol. 109(41).-P. 19496 -506.

45. Кочетков, H.K. Химия углеводов/Н.К.Кочетков, А.Ф.Бочков, Б.А.Дмитриева, А.И.Усов. -М.:Химия, 1967. 673 с.

46. Stanek, J. The oligosaccharides / J. Stanek, M. Coerny, J. Pacak. стр, 1965 Prague: Pub. House of the Czechoslovak Academy of Sciences, 1965. 635 c.

47. Тихомирова, H.A. Технология продуктов функционального питания./Н.А. Тихомирова —M.: Франтэра. 2002.- 213 с.

48. Sako, Т. Recent progress on research and applications of non-digestible galacto-oligosaccharides./T.Sako, K.Matsumoto, R.Tanaka// International Dairy Journal. 1999. - Vol. 9. - P. 69 - 80.

49. Mussatto, S.I. Non-digestible oligosaccharides: a review/ S.I. Mussatto, I. M. Mancilha //Carbohydrate polymers. 2007. - Vol. 68 (3). - P. 587 - 597.

50. Gibson, G. R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. / G.R.Gibson, M.B.Roberfroid // Journal of Nutrition. 1995. - Vol. 125. - P. 1401-1412.

51. Voragen, A. Technological aspects of functional food-related carbohydrates./ A.Voragen // Trends in Food Science & Technology. 1998. - Vol. 9. -P. 328 -335.

52. Crittenden, R.G. Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides / R.G.Crittenden, M.J. Playne // Trends in Food Science & Technology. 1996. - Vol. 7. - P. 353 - 361.

53. Playne, R. Commercially available oligosaccharides / R. Playne, F. Crittenden //Bulletin of IDF. 1996. - Vol. 313. - P. 10 - 22.

54. Oligosaccharides engineering from plants and algae applications in biotechnology and therapeutics / C. Delattre etc. // Minerva Biotech. 2005. - Vol. 17.-P.107 -117.

55. Хотимченко, Ю.С. Физико-химические свойства, физиологическая активность и применение альгинатов. полисахаридов бурых водорослей /Ю.С. Хотимченко, В.В. Ковалев, О.В. Савченко, О.А. Зиганшина // Биология моря,-2001.-Т. 27 (З).-С. 151-162.

56. Kumar, M. A review of chitin and chitosan applications / M. Kumar // React. Funct. Polym. 2000. - Vol. 46. - P. 1- 27.

57. Yermak, I.M. Chemical properties, biological activities and applications of carrageenans from red algae / I.M. Yermak, Yu.S. Khotimchenko // Rec. Adv. Mar. Biotechnol. Science Publishers. 2003. - Vol. 9. - P. 207 - 255.

58. Plaami, S.P. Content of dietary fiber in foods and its physiological effects / S.P. Plaami // Food Rev. 1997. - Vol. 13. - P. 29-76.

59. Новицкий, Б.Г. Применение акустических колебаний в химико-технологических процессах / Б.Г. Новицкий М.: Химия, 1983. - 192 с.

60. Гершал, Д. А. Ультразвуковая аппаратура / Д. А. Гершал, В.М. Фридман М.: Энергия, 1967. - 300 с.

61. Vinatoru, М. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs / Vinatoru M. // Ultrasonic Sonochemisty. 2001. -№8. -P.303 - 313.

62. Hromadkova, Z. Ultrasonic extraction of plant materials Investigation of hemicellulose release from buckwheat hulls. / Z. Hromadkova, A. Ebringerova // Ultrasonics Sonochemistry. - 2003. - Vol. 10. - P. 127-133.

63. Ultrasound-assisted extraction of xyloglucan from apple pomace./ F. Caili, T. Haijun, L. Quanhong, C. Tongyi, D. Wenjuan // Ultrasonics Sonochemistry. -2006.-Vol. 13.-P. 511-516.

64. Fractional and physicochemical characterization of hemicelluloses from ultrasonic irradiated sugarcane bagasse. / S. Jing, S. RunCang, S. Xiao, S. YinQuan // Carbohydrate Research. 2004. - Vol. 339. - P.291-300.

65. Hromadkova, Z. Comparison of classical and ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Salvia officinalis L. / A. Hromadkova, P. Ebringerova, C.Valachovic // Ultrasonics Sonochemistry. 1999. - Vol. 5. - P.163 -168.

66. Wang, Y. Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of Poria cocos polysaccharides by response surface methodology / Y. Wang, C. Zhong, M. Jianwei, F. Minger. W. Xueqian // Carbohydrate Polymers. 2009. - Vol. 77 (4). - P. 713-717.

67. Polysaccharides from fruit calyx of Physalis alkekengi var. francheti: Isolation, purification, structural features and antioxidant activities / Y. Ge, Y. Duan, G. Fang, Y. Zhang, S. Wang // Carbohydrate Polymers. 2009. - Vol. 77 (2). -P.188-193.

68. Bao, Y. Anti-glycated activity of polysaccharides of longan {Dimocarpus longan Lour.) fruit pericarp treated by ultrasonic wave / Y. Bao, M. Zhao, Y. Jiang // Food Chemistry. 2009. - Vol. 114 (2). - P. 629-633.

69. Bao, Y. Effects of ultrasonic extraction on the physical and chemical properties of polysaccharides from longan fruit pericarp / Y. Bao, Y. Jiang,' M. Zhao, J. Shi, L. Wang // Polymer Degradation and Stability. 2008. - Vol. 93 (1). - P. 268272.

70. Hromadkova, Z. Comparison of conventional and ultrasound-assisted extraction of phenolics-rich heteroxylans from wheat bran. / Z. Hromadkova, Z. Kost'alova, A. Ebringerova // Ultrasonics Sonochemistiy. 2008. - Vol. 15 (6). - P. 1062-1068.

71. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry .A review / V. Kamaljit, M. Raymond, S. Lloyd, P.Darren // Innovative Food Science and Emerging Technologies. 2008. - Vol. 9. - P.161-169.

72. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев М.:Медицина. - 2002. - 656 с.

73. Paulsen B.S. Plant polysaccharides with immunostimulatoiy activities / B.S.Paulsen//Current Organic Chemistry.-2001.- Vol. 5. P. 939-950.

74. О результатах фармакологического изучения полисахаридов, выделенных из ряски и пижмы / Р.Г. Оводова и др. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения. 2001. - №4. - С.260-268.

75. Пилат Т.Д. Биологически активные добавки к пище / Т.Д. Пилат, А.А. Иванов М.: Слово, 2002. - 710 с.

76. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А. Криштанова и др. //Вестник ВГУ. Серия: химия, биология, фармация. 2005. - №1. - С.212 -221.

77. Турова А.Д. Биологическая активность полисахаридов растительного происхождения / А.Д. Турова, А.С. Гладких // Фармакология и токсикология. 1965. -№4. - С.498 - 504.

78. Мельникова Т.И. Растительные олигосахариды перспективный класс пребиотиков / Т.И. Мельникова //Фиторедиум. - 2003. -№2 - С.32-35.

79. Hromadkova Z. Ultrasound-assisted extraction of water-soluble polysaccharides from the roots of valerian (Valeriana officinalis L.) / Z. Hromadkova Z., A. Ebringerova, P. Valachovic // Ultrasonic Sonochemisty. 2002. - Vol. 9. - P. 37-44.

80. Structural investigations of the neutral polysaccharide of Linum usitatissimum L. seeds mucilage / J. Warrand etc. // International Journal of Biological Macromolecules 2005. -№35. - P. 121 -125.

81. Rheological and Light Scattering Properties of Flaxseed Polysaccharide Aqueous Solutions / K.T. Kelvin, D. Goh, N. Pinder, C. Hall Y. Hemar // Biomacromolecules. -2006. Vol. 7. - P. 3098-3103.

82. Flaxseed reduces plasma cholesterol and atherosclerotic lesion formation in ovariectomized Golden Syrian hamsters / E. A. Lucas, A. Lightfoot, L. Hammond, L. Devareddy, A. Khalil, ect //Atherosclerosis. 2004. - Vol. 173. - P. 223 - 229.

83. Варфоломеев, С.Д. Химическая энзимология. / С.Д.Варфоломеев. -М., Academa, 2005. 480 с.

84. Иммобилизованные ферменты. / И.В. Березин, Н.Л.Клячко, А.В.Левашов, К.Мартинек, В.В Можаев, Ю.Л.Хмельницкий М. Высшая школа, 1987.-162 с.

85. Фурье-спектрометр инфракрасный ИнфраЛЮМ ФТ-02. /Руководство по эксплуатации. Версия 2.1 Санкт-Петербург, «Люмекс». -2005.- 110 с.

86. Смит, А. Прикладная ИК-спектроскопия /А. Смит. М., 1982. - 328 е., ил.

87. Viles, F.J. Determination of starch and cellulose with antrone / F.J. Viles, L.Silverman // Analytical chemistry. 1949. - Vol. 31 (8). - P. 950-953.

88. Scherz, H. Analytical chemistry of carbohygidrates. / H.Scherz, G.Boon. // Stuttgart. New York. Georg Thieme, Verlag. 1998. - Vol. 1. - p.33-34.

89. Государственная Фармакопея СССР М.: Медицина, 1968. - 1082 с.

90. Муравьев, А.Г. Руководство по определению показателей качества воды полевыми методами. 3-е изд., доп. и перераб./ А.Г. Муравьев С.-Пб.: «Крисмас+», 2004. - 248 с.

91. The composition of flaxseed mucilage / E. Anderson and H. Lowe // The journal of biological chemistry. 1947. - Vol. 168. - P. 289-297.

92. Паспорт носителя SEP ABE ADS EC-EP403 / PDS 06051

93. Паспорт носителя SEPABEADS EC-EP403 / PDS 06061

94. Рухлядева, А. П. Методы определения активности гидролитических ферментов/ А. П. Рухлядева, Г. В. Полыгалина. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288 с.

95. Koshijima, Т. The number-average molecular weight of native hardwood xylans / T. Koshijima, Т. E. Timell, M. Zinbo // Journal of Polymer Science Part C: Polymer Symposia. 2007. - Vol. 11 (1). - P.265 - 279.

96. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии./ Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова. М.: Просвещение, 1982. - 311 с.

97. Kinetics and subsite mapping of a D-xylobiose- and d-xylose-producing Aspergillus niger endo-(l—»4)-{3-d -xylanase / Y. Bernard, J. Tao, M. Chow, J. Reilly // Carbohydrate Research Volume. 1988. - Vol. 173 (2). - P. 273-283.

98. Expression of endo-1, 4-beta-xylanase from Trichoderma reesei in Pichia pastoris and functional characterization of the produced enzyme / J, He, B. Yu, K. Zhang, X. Ding, D. Chen // BMC Biotechnology. 2009. - Vol. 9. - P.56

99. Functional importance of Asp37 from a family 11 xylanase in the binding to two proteinaceous xylanase inhibitors from wheat / A. Tahir, A. Durand, K. Gebruers, A. Roussel, etc. // FEMS Microbiology Letters. 2004. - Vol. 239 (1). -P. 9-15.

100. Анализ поверхности методами ОЖЕ- и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии / Под ред. Д. Бриггса и М.П. Сиха. М.: Мир 1987.-598 с.

101. Драго, Р. Физические методы в химии / Р. Драго. М.: Мир, 1981. -456 с.

102. Пентин, Ю.А. Физические методы исследования в химии / Ю.А. Пентин, JI.B. Вилков. М: Мир, 2006. - 683 с.

103. Watts J.F. An Introduction to Surface Analysis by XPS and AES./ J. F. Watts, J. Wolstenholme. Изд. John Wiley & Sons Ltd (Англия), 2003. - 226 с.

104. Wagner C.D. Studies of the charging of insulators in ESCA // J. of Electron Spectroscopy and Related Phenomena. 1980. - Vol. 18. - P. 345.

105. Бондаренко, B.M. Экспресс-метод диагностики дисбактериоза кишечника / В.М.Бондаренко, B.M. Виноградов, Ю.В. Червинец // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2004. - №2. - С. 163.

106. Методика изучения адгезивного процесса / В.И. Брилис и др. // Лаб. дело. 1986. - № 4. - С. 210-212.

107. Coaggregation of urogenital bacteria in vitro and in vivo / G.Reid et al. // Curr. Microbiol. 1990. - №20. - P. 47-52.

108. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium / Ю.М. Романова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. - № 4. -С. 38-42.

109. Stephen A.M. The polysaccharides / A.M. Stephen // Academic Press, Orlando (FL), 1983. 480 p.

110. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию,т. 1.Сорта растений,М.,МСХ, 2009. 320 с.

111. Large-Scale Purification of Water-Soluble Polysaccharides from Flaxseed Mucilage, and Isolation of a New Anionic Polymer / J. Warrand etc. // Chromatographic 2003. - Vol. 58. - p.331 -335.

112. Краткое описание и основные технические характеристики.

113. Уровень и масштабы внедрения; конкретные показатели, характеризующие результаты внедрения.

114. От Тверского государственного технического университета,проф., д.х.н-:1. Т^»1. Э. М. Сульман2009 г.проф., д.х.н.