Использование липаз из микроорганизмов для получения жирных кислот из масла сафлора тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

МАЙДИНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПАЗ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ МАСЛА САФЛОРА

02 00 15 - катализ 03 00 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2008

003445264

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научные руководители

доктор химических наук, профессор Клячко Наталья Львовна доктор химических наук, профессор Левашов Андрей Вадимович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович кандидат химических наук, доцент Бачева Анна Владимировна

Ведущая организация

Институт биохимии им А Н Баха РАН, Москва

Защита состоится » июня 2008 года в 1600 час на заседании

диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М В Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан « /£ » мая 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат химических наук ¿^У • И К Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Липаза (гидролаза триглицеридов, К Ф 3 1 1 3) - фермент, катализирующий гидролиз триглицеридов до глицерина и жирных кислот Липазы могут быть выделены из растений, животных, а также из природных и реиомбинантных микроорганизмов В последнее время большую значимость приобретают липазы из микроорганизмов, так как они имеют ряд преимуществ Во-первых, представителей таких липаз существует достаточно много, и имеются возобновляемые и широкодоступные источники их получения Во-вторых, липазы микроорганизмов имеют более широкий рН и температурный диапазон действия по сравнению с липазами животных и растений В-третьих, липазы микроорганизмов достаточно удобны с точки зрения использования в биотехнологии

В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез Наиболее важным из направлений использования липаз является их применение в масло-жировой промышленности

Глицериды - сложные эфиры глицерина и жирных кислот - широко распространены в природе, отличаются значительным разнообразием и представляют практический интерес во многих областях деятельности человека Большое значение для жизнедеятельности человеческого организма имеют глицериды, содержащие несинтезируемые в организме человека линолевую, линоленовую и арахидоновую жирные кислоты Эти кислоты, играющие важную роль в обмене холестеролов, называют эссенциальными кислотами, те жизненно необходимыми для организмов животных

В последнее время возрос интерес к такому источнику линолевой кислоты (цис-9-цис-12-октадекадиеновая кислота), как масло сафлора (Carthamiis tinctori), в котором ее содержание составляет около 80% Линолевая кислота широко используется как лекарственное средство в терапии и профилактике многих серьезных заболеваний Химический гидролиз триглицеридов дает небольшой выход свободных ненасыщенных жирных кислот и требует их очистки от побочных продуктов, образовавшихся в результате термической деградации триглицеридов, окисления ненасыщенных жирных кислот и образования их транс-изомеров В этой связи, на сегодняшний день одним из наиболее перспективных способов получения полиненасыщенных свободных жирных кислот из триглицеридов может считаться мягкий ферментативный гидролиз под действием липаз, не приводящий к окислению двойных связей ненасыщенных жирных кислот и не загрязняющий окружающую среду

Цель работы состояла в выборе липаз из разных источников микроорганизмов (липаза из бактерий Alcaligenes sp и Burkholderia sp, и из дрожжей Candida cylindracea и Candida rugosa), пригодных для гидролиза масла сафлора, оптимизации условий реакции и выделения целевого продукта (свободная жирная кислота) из реакционной смеси

В рамках поставленной задачи были определены кинетические характеристики

использованных в данной работе липаз в реакции ферментативного гидролиза масла сафлора методом рН-статирования Осуществлена оптимизация условий гидролиза масла сафлора под действием данных липаз, и разработан метод выделения целового продукта (Ж К) из реакционной смеси

Научная новизна. Впервые осуществлено комплексное исследование возможностей ферментативной трансформации масла сафлора Показано, что при использовании препаратов липазы Alcahgenes sp достигается 100% гидролиз масла сафлора Предложена и отработана процедура выделения целевого продукта, жирной кислоты

Практическая значимость работы. Работа направлена на решение биотехнологической задачи ферментативного получения полиненасыщенных жирных кислот из растительного сырья Полученный материал может служить основой создания технологичного процесса получения линолевой кислоты из масла сафлора

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены в докладах на следующих конференциях Международная конференция молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» (Москва, Россия, 2006), 4-ый Международный Конгресс по Биотехнологии (Москва, Россия, 2007), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007», (Москва, Россия, 2007), Международная конференция "Biocatalysis-2007" (Moscow, St-Petersburg, Russia, 2007), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего ^U. ссылок Работа изложена на ¡^Л страницах, содержит 35 рисунков и таблиц

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования Для гидролиза масла сафлора использовали следующие коммерческие препараты липаз (КФ 3 113) липаза из Alcahgenes sp (Chirazyme L-10), липаза из Burkholdena sp (Chirazyme L-l) были препаратами фирмы Boehringer; липаза из Candida rugosa - Sigma (США), липаза из Candida cylindracea - Sigma (США) В качестве субстрата было использовано масло сафлора красильного (Carthamus üncton) производства КНР Состав этого масла приведен в таблице 1 В качестве эмульгатора и стабилизатора эмульсии использовали дезоксихолат натрия (С24Н40О4) молекулярной массы 414 56 (ДИА-М, осч)

Таблица 1. Состав масла сафлора (определен методом газовой хроматографии)

Свободная жирная кислот; С]б о пальмитин С180 стеариновая Сш олеиновая Сш линолевая

Количество (%) 5,96 1,75 12,4 79,89

Методы исследования. Для приготовления стабильной эмульсии типа масло в воде использовали обработку в ультразвуковой ванне Активность липаз в водной эмульсии определяли по начальной скорости реакции ферментативного гидролиза масла сафлора методом рН-сгатирования По тангенсу утла наклона зависимости количества выделяемой кислоты от времени определяли начальные скорости реакций, а по объему щелочи, затраченной на титрование выделяемой кислоты рассчитывали выход реакции гидролиза Для измерения: удельной активности липаз в ячейку рН-стата добавляли 5 мл заранее приготовленной эмульсии, состава субстрат от 60 до 100 мкл, ПАВ от 200 до 300 мкл, реакцию инициировали введением фермента (1 мг - для всех липаз, кроме ВигШю1скпа яр, для мэторой использовали 2мг) Устанавливали требуемое значение рН. Температуру в ячейке поддерживали постоянной от 25 до 50°С Определяли тангенс угла наклона (в мкл/мин) на зависимости количества щелочи, израсходованной на титрование выделяемой в процессе реакции кислоты от времени Активность рассчитывали по формуле

ЛА=£а С(ЫаОН) БР/У(фермента>=^а 0,25 ОБ, где С (№ОН) - концентрация гидроксцда натрия для титрования в моль/л (в нашем случае 0,025М), У(фермента) - объем добавленного фермента в мл (в нашем случае 0,1 мл), ББ - коэффициент разбавления фермента до внесения в реакционную смесь Липазная акгавностъ на грамм сухого препарата составила ЛА (единип/мл)* 100 мл/г

Для проведения анализа состава продуктов использовали метод ТСХ (тонкослойная хроматография) В качестве контроля на пластинку наносили раствор линотевой кислоты в гексане Для проявления хроматограмм использовали 10% раствор фосфорномалибденовой кислоты в этиловом спирте Для экстракции продукта использовали гексан

В типичном эксперименте определяли степень конверсии субстрата за 30 мин

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная характеристика липаз для получения линолевой кислоты путем ферментативного гидролиза масла сафлора

1 Зависимость начальной скорости и выхода целевого продукта реакций, катализируемых липазами от рН среды и концентрации фермента

Из литературных данных известно, что оптимум действия большинства липаз лежит в области рН 7-9 На рис 1 приведены рН- зависимости начальных скоростей и \

степень гидролиза масла сафлора (за 30 мин), катализируемые липазами. Из рисунка видно, что липаза Alcaligenes sp работает в диапазоне рН 8,5-10, для неё огпимально рН 9,5. Липаза Burkholderia sp проявляет высокую активность в диапазоне рН 8-9 (оптимальное значение рН 9). Для липазы Candida cylindracea, Candida rugosa отимум наблюдается при рН 8. Кроме липазы Candida Rugosa, другие липазы в нейтральной среде не проявляют активности, они работают в щелочной среде. Для каяздой липазы, в оптимальном диапазоне рН наблюдается и наибольшая степень конверсии субстрата, что видно на рис.. 1В и 1Г

- ■—Alcaligenes sp >—Burkholderia sp

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 pH

M Alcaligenes sp Burkholderia sp

Candida cylindracea EÜSSi Candida rugosa

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 РН

Рис 1. Начальные скорости реакции (ДБ) и количество продукта, образовавшегося через 30 мин реакции (ВД *) в зависимости от рН среды. 25°С. Для липазы Alcaligenes sp: [ПАВ]=24 мМ; [Е]=0,2мг/мл; [S]=20,8 мМ; Для липазы Burkholderia sp: [ПАВ]=19,2 мМ; [Е]=0,4мг/мл; [S]=20,8 мМ. Для липазы Candida Cylindracea: [S]=20,8 мМ; [ПАВ]=19,2 мМ; [Е]=0,2мг/мл. Для липазы Candida Rugosa: [S]=12,5 мМ; [Е]-0,2мг/мл; [ПАВ]=19,2 мМ.

На рис 2 показаны начальные скорости реакции в зависимости от концентрации липазы. Видно, что зависимости липолитичесгой активности от концентрации липаз имеют линейный участок Именно в линейном диапазоне выбирались концентрации ферментов.

б

ООО 0 04 0 08 0 12 0 16 [Е], мг/мл

0 1 02 [Е], мг/мл

Рис. 2. Зависимости начальных скоростей реакции ферментативного гидролиза масла сафлора от концентрации липазы из различных источников Условия эксперимента для Alcahgenes sp рН=9,5, [ПАВ] = 28,8 мМ, [S]= 12 5 мМ, для Burkholckna sp рН=9, [ПАВ]= 28,8 мМ, [S]= 20,8 мМ, для CandidaCylmdracea рН=8, [ПАВ]= 19,2 мМ, [S]= 31,2 мМ, для Candida Rugosa рН=8, [ПАВ]= 28 8 мМ, [S]= 20 8 мМ, 25°С

2 Зависимость начальной скорости и выхода продукта реакций, катализируемых липазами, от концентрации ПАВ

Известно, что соли желчных кислот способны ускорять расщепление жиров, как правила, при низких концентрациях, обычно ниже их ККМ (критической концентрации мицеллообразования) Желчные кислоты функционируют как активаторы, препятствуя разворачиванию и денатурации липазы и увеличивая площадь поверхности раздела фаз масло/вода. Зависимости начальной скорости и степень конверсии субстрата за 30 мин от концентрации дезоксихолага натрия (ПАВ) приведены на рис 3

В соответствии с приведенными графиками (рис 3), зависимости начальной скорости реакции имеют вид кривых с насыщением для использованных липаз Однако, несмотря на то, что активность фермента, например, А1са1щепез хр, практически не зависит от концентрации ПАВ, начиная с 5мМ, выход продукта реакции в стандартных условиях (одна полная бюретка №ОН, идущая на титрование

образовавшейся кислоты, то есть через 30 мин) продолжает расти при увеличении концентрации ПАВ (рис. ЗВ и Г).

Таким образом, дня изучаемых липаз, оптимальный диапазон концентрации ПАВ 19Д-38,4 мМ (0,67-1,3%).

2.4-

—■— Alcaligenes sр 1—• — Burkholderia ар

2.4-

—■— Candida cylindracea —« - Candida rugosa

1.6-

5 >

0.8-

0.0-I

x s

^ 1.i 5

E

> „

o.o 4

10 15 20 25 30 35 40 [ДОХ], мМ

80

60

1?

><

q. о 40

а

С

20

0

5 10 15 20 25 30 35 40 [ДОХ], Ш

I Candida cylindracea Candida rugosa

5 10 15 20 25 30 35 40 [ДОХ], мМ

10 15 20 25 30 35 40 [ДОХ], мМ

Рис 3. Зависимости начальной скорости (А, Б) и количества продукта (В, Г), образовавшегося через 30 мин реакции от концентрации ПАВ. Условия эксперимента: для Alcaligenes sp рН=9,5; [Е]=0,2мг/мл; [S]=12.5 мМ; для Burkholderia sp рН=9; [Е]=0,44мг/мл; [S]=20,8 мМ; для Candida cylindracea рН=8; [ЕН,2мг/мл; [S]=20,8 мМ; для Candida rugosa рН=8; [Е]=0,2мг/мл; [S]=10,4 мМ.

3. Зависимость начальной скорости и количества продукта, образовавшегося через 30 мин реакций, катализируемых липазами от концентрации субстрата

Для того, чтобы определить кинетические параметры реакции (К№ V^ и удельная активность), были изучены зависимости начальной скорости и глубина конверсии субстрата за 30 мин реакции от концентрации субстрата. Результаты приведены на рис. 4 и в таблице 2. Из рисунка видно, что начальная скорость по мере увеличения концентрации субстрата возрастает, но характер кривой зависит от типа липазы. Так, для липазы Alcaligenes (рис. 4 А) наблюдается наиболее высокая скорость гидролиза масла сафлора, при этом не наблюдается ингибирование субстратом; конверсия субстрата также растет при увеличении концентрации субстрата. Сравнительно небольшое значение Км свидетельствует о том, что данная липаза с субстратом легко образует фермент-субстратный комплекс. Липазы из Candida

cylindracea и Candida rugosa, наоборот, ингибируются субстратом (рис.4 Б), которое становится заметным при концентрациях субстрата выше 40 мМ. Зависимость скорости от концентрации субстрата для иммоблизованной липазы из Burkholderia sp (рис. 4 А) также имеет характерный вид кривой с ингибированием субстратом. Однако, на кинетику действия этой липазы могут оказывать влияние и эффекты диффузии субстрата/ продукта Так, известно, если иммобилизованный фермент обладает высокой исходной сдельной активностью, то в частице с таким ферментом возникает большой градиент концентрации субстрата, т.е. в наружных слоях частицы субстрат содержится в высотой концентрации, а в центре он практически отсутствует, вследствие чего субстрат не может проникнуть к центру частицы.

Используя графики (рис. 5), построенные в двойных обратных координатах, были рассчитаны величины Vm и Км реакции гидролиза масла сафлора, которые приведены в таблице 2. Как видно, в случае иммобилизованной липазы Burkholderia, и V, и Км меньше, чем у остальных липаз. Низкое значение Кмозначаел; что эта липаза более легко, чем другие липазы, связывается с субстратом, но вследствие ограничения диффузии субстрата скорость реакции понижается. Кроме того, в данном случае величина Км варьирует в зависимости от выбранного диапазона концентраций субстрата, полому что ограничение диффузии субстрата сильнее проявляется при его низких концентрациях. В случае липаз Candida Cylindracea и Candida Rugosa наблюдается ингибирование субстратом, что видно на рис. 4 Б, ще наблюдается уменьшение начальной скорости с увеличением концентрации субстрата, а также уменьшается выход продукта за 30 мин (рис. 4 В и Г).

2.4-1

X

1 1.8 i 2

. 1.2-

-■— Alcaligertes sp -* — Burkholderia sp

"]l

0 0.0

7

10 20 30 40 50 60 70 [S], мМ

2.4-

X

s s 1.8-

> 1.2-

>

0.6-

no

—■ — Candida cylindracea —«— Candida rugosa

0 10 20 30 40 50 60 70 [S], мМ

40

2 30 fe"

sí 20

o

a

C 10

10 20 30 40 50 60 70 [S], мМ

0 10 20 30 40 50 60 70 [SJ, мМ

Рис 4. Начальные скорости (А, Б) и степень конверсии за 30 мин (В, Г) реакции в зависимости от концентрации субстрата. Условия эксперимента для Alcahgenes sp рН=9,5, [ПАВ] = 28,8 мМ, [Е] = ОДмг/мл, для Burkholderia sp рН=9, [ПАВ] = 28,8 мМ, [Е] = 0,44мг/мл, для Candida Cylindracea рН=8, [ПАВ] = 19,2 мМ, [Е] = 0,2мг/мл„ для Candida Rugosa рН=8; [ПАВ]=28 8мМ, [Е]=ОДмг/мл, 25°С

Рис 5 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в двойных обратных координатах гидролиза масла сафлора под действием разных липаз Условия эксперимента см в подписи к Рис 4

Таблица 2. Кинетические параметры реакции и выход продукта гидролиза масла сафлора под действием разных липаз

^"Параметры Липаза v v max мМ/мин Km мМ удельная активность (мкМ/мин)/мг Конверсия субстрата (ЗОмин) %

Alcahgenes 3,04 2 9,6 50

sp

Burkholderia 0,56 0,66 1,4 41

sp

Candida 1,398 4,13 6,3 20,2

Cylindracea

Candida ' 1,64 5Д 6,5 32,5

Rugosa

для липазы Alcaligenes sp рН=9,5; [ПАВ]- ] 9,2 мМ; [NaCl]=50 мМ; [Е]=ОДмг/мл; для липазы Burkholderia sp. рН=9,0; [ПАВ] = 28,8 мМ; [NaCl]=50 мМ; [Е]=0,4мг/мл; доя липазы Candida Cylindracea рН=8,0; [ПАВ] = 192 мМ; [NaCl]=50 мМ; [Е]=ОДмг/мл; для липазы Candida Rugosa рН=8,0; [ПАВ]=28,8 мМ; (NadHO мМ; [Е]=0^мг/мл;

25°С.

4. Влияние температуры на реакцию гидролиза масла сафлора под действием липаз Хорошо известно, что температура является важным фактором, влияющим на скорость как химических, так и ферментативных реакций. Липсшшические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур. Температурный оптимум большинства липаз лежит в районе 30-37°С. Зависимость начальной скорости и степень конверсии субстрата за 30 мин реакции гидролиза масла сафлора от температуры приведены на рис. 6. Как видно, во всех случаях повышение температуры реакции приводит к её ускорению до некоторого предела, за которым следует уменьшение скорости, как это показано на примерах липаз из Alcaligenes sp (рис. 6А) и Candida rugosa (рис. 6Б). Для липазы из Burkholderia sp (рис. 6А) обнаруживается кажущаяся независимость скорости реакции от температуры.

Такой ход зависимостей может определяться действием различных факторов, среди которых инактивация фермента, переход реакции в диффузионно-контрспируемый режим и т.д. Таким образом, для разных липаз наблюдались различные оптимумы температуры. Так, для липазы Alcaligenes sp оптимум наблюдали в районе 35°С; для липазы Burkholderia sp - 45°С; для липаз Candida cylindracea и Candida rugosa оптимальны 30 и 40°С, соответственно.

3.0 2.4

1 1.1

2

1

2 1.2 >

0.6 0.0

— ■— Alcaligenes sp A

—Burkholderia sp

----—-

______ .--- — •-•

3.0

2.4-) 1

■ 1.20.6

25 30 35 40 45 50 55 t Ce)

0.0

• —Candida cylindracea о — Candida гид osa

25

30 35 t Ce)

40

45

25 30 35 40 45 50 55 t ("с)

80- НЯСandida cylindracea IJXBCandida rugosa Г

60-

Ú

I40'

с

20- _

0- H Я ■ PS

25 30 35 40 45

t Ce)

Рис. 6 Начальные скорости (AJ3) и степень конверсии субстрата за 30 мин (BJQ реакции от температуры Условия эксперимента для Alcaligenes sp рН=9,5, [ПАВ] = 28,8 мМ, [Е]=0,2мг/мл, [S]=12 5 мМ, для Burkholdena sp рН=9, [ПАВ]= 9,6 мМ, [Е]= 0,4мг/мл, [S]=10,4 мМ, для Candida cyhndracea рН=8, [ПАВ]=4,8 мМ, [Е]=0Дмг/мл [S]=l 0,4 мМ, для Candida rugosa рН=8, [ПАВ]=28,8 мМ, [Е] = 0,2мг/мл [S]=12,5mM.

Нами бьшо показано, что некоторое понижение скорости реакции при повышении температуры не сказывалось существенно на количестве продукта реакции гидролиза масла сафлора, линолевой кислоты, образовавшемся через 30 мин Исключением являлась липаза из Candida rugosa, данные для которой приведены на рис 7 А, Б

t °с

Рис. 7. Температурная зависимость начальной скорости (А) и степени конверсии субстрата через 3 0 мин (Б) гидролиза масла сафлора под действием липазы из Candida rugosa

Как видно из рисунка, наряду с уменьшением скорости реакции при температурах выше 40°С (рис 7 А) наблюдалось существенное уменьшение концентрации продукта реакции через 30 мин (рис 7 Б) Так, степень конверсии субстрата для реакции гидролиза масла сафлора, катализируемой липазой из Candida rugosa при 45°С, уменьшается более чем в 2 раза по сравнению с наблюдаемым при 30°С (рис 7 Б) Как уже отмечалось выше, липаза является одним из ферментов, для функционирования которых важно наличие поверхности раздела фаз В данной работе поверхность раздела фаз стабилизировали добавлением поверхностно-активного вещества — дезокеихолота натрия Таким образом, влияние температуры на параметры реакции гидролиза масла сафлора с разными липазами может быть обусловлено инактивацией фермента или «качеством», то есть совокупностью физико-химических характеристик эмульсии Для изучаемых липаз в специальном эксперименте бьшо проведено инкубирование при 45°С отдельно как фермента, так и эмульсии без фермента в течение 45 мин, те времени проведения реакции до полного ее истощения, при котором фиксировалось количество образовавшегося продукта. Результаты представлены на рис 8- Как видно из рисунка, предварительное инкубирование фермента (1) практически не приводило ни к изменению начальной скорости (рис 8 А) реакции гидролиза масла сафлора, катализируемого липазой из Candida rugosa, ни к

изменению величины выхода продукта реакции (рис. 8 Б), В то же время, предварительное инкубирование эмульсии (2) сказывалось как на начальной скорости (рис. 8 А), так и на выходе продукта реакции (рис. 8 Б), существенно снижая оба параметра катализируемого липазой из Candida mgosa процесса

Таким образом, для липазы из Candida rugosa выбор температуры реакции имеет принципиальное значение не только как фактор, влияющий на активность и стабильность фермента, но и как фактор, влияющий на состояние реакционной среды и /или поверхности раздела фаз. Для других липаз выход продукта также не толы® не увеличивался при повышении температуры, но и несколько снижался. В связи с выше сказанным, для ферментативного гидролиза масла сафлора была выбрана комнатная температура (25°С), как наиболее удобная с точки зрения дальнейшего использования этой реакции на практике.

30 45

Температура инкубирования, °С

120

sS ¡f 100Ч 80 о

CL

40-

5 20 с о

Б

1 г

1 1 1

1 □fig

1 1

j 1 щ !

30 45

Температура инкубирования, °С

Рис. 8. Зависимость остаточной активности (А) и относительного выхода продукта через 40 мин протекания реакции (Б), катализируемой липазой из Candida i-ugosa, при предварительном инкубировании в течение 45 мин фермента (1) или эмульсии (2) при температурах 30 и 45°С. Условия эксперимента: для липазы Alcaligenes sp. рН=9,5; [ПАВ]=28,8 мМ; [S]=10,4 мМ; [Е]=0,2мг/мл; для липазы Burkholderia sp. рН=9,0; [ПАВ]=28,8 мМ; [S]=10,4 мМ; [Е]=0,44мг/мл; для липазы Candida cylindracea рН=8; [ПАВ]=28,8 мМ; [S]=10,4 мМ; [Е]=0,2мг/мл; для липазы Candida rugosa рН=8; [ПАВ]=28,8 мМ; [S]=12,5 мМ; [Е]=0,2мг/мл.

Оптимизация условий ферментативного получения линолевой кислоты из масла сафлора

1. Влияние солей натрия на реакцию ферментативного гидролиза масла сафлора под действием разных липаз

Из литературных данных известно, что соли натрия являются важными активаторами липолиза. Хлористый натрий и другие неорганические соли поставляют противоионы на поверхность раздела фаз, оказывая влияние на кажущуюся константу

диссоциации жирных кислот; что приводит к увеличению скорости катализируемого хшпазой гидролиза. В некоторых случаях при полном отсутствии солей липолиз вообще не протекает. В связи с этим, для используемых липаз были изучены зависимости ферментативной активности и выхода продукта реакции от концентрации хлорида натрия.

На рис.9 представлены зависимости начальной скорости (А, Б) и степени конверсии субстрата через 30 мин реакции (В, Г) ферментативного гидролиза масла сафлора под действием разных липаз от концентрации хлористого нагрия. Как видно из рисунка, NaCl практически не оказывает влияния ни на начальную скорость, ни на выход продукта реакции для липазы Alcaligenes sp, принимая практически постоянные значения уже при наличии 20мМ соли в растворе. В то же время для липазы из Burkholderia sp наблюдается существенное увеличение скорости реакции и выхода продукта с увеличением концентрации NaCl в растворе. Это может быть связано с тем, что в присутствии хлористого нагрия, особенно при его концентрациях более 0,1М уменьшаются диффузионные затруднения субстрата, что связано с удалением, от поверхности раздела фаз продукта - свободной жирной кислоты - за счет омыления. Однако, в случае липазы из Candida rugosa и Candida cylindracea начальные скорости реакции уменьшаются при концентрациях соли выше 20мМ; выход же продукта при этом практически не меняется. Следует отметить, что в присутствии хлористого натрия все изучаемые литшы проявляют более высокую активность, чем в бессолевой системе. Наибольшую активность липазы Alcaligenes sp, Candida cylindracea и Candida rugosa проявляют в диапазоне концентраций хлористого нагрия 20-50 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации хлористого нагрия приводит к уменьшению активности ферментов. Таким образом, существует оптимальная для проявления активности фермента концентрация хлорида натрия, связанная, по-видимому, с изменением конформации фермента

2.0 1.6

Z s

5 1.2 Е

5„ 0.8-I >

0.4 0.0

— ■ — Alcaligenes sp A

—Burkholderia sp

Г' - •----- --•

0.00

0.08 0.16 [NaCl] М

0.24 0.32

0.00

0.08 0.16 [NaCl] М

0.24 0.32

-■ — Candida cylindracea Candida rugosa

0.04 [NaCl] M

60-

I Candida cylindracea Candida rugosa_

£ 40-§

o.

E 20

■ i i i

0.00 0.04 0.08 0.1

[NaCl] M

Рис. 9. Зависимости начальной скорости (А, Б) и конверсия субстрата (ЗОмин) (В, Г) реакции гидролиза масла сафлора от концентрации хлористого натрия, катализируемой разными липазами. Условия эксперимента: для Alcaligenes sp. [S]=12,5 мМ; [ПАВ]=19,2 мМ; [Е]=0,2 мг/мл; рН=9,5; для Burkholderia sp. [S]=12,5 мМ; [ПАВ]=19Д мМ; [Е]=0,4мг/мл; рН=9.0; для Candida cylindracea [S]=12,5 мМ; [ПАВ]=19,2 мМ; [Е]=0,2мг/мл; рН=8; для Candida rugosa [S]=12,5 мМ; [ПАВ]=28,8 мМ; [Е]=0,2мг/мл; рН=8; 25°С.

2. Влияние соли кальция на реакцию ферментативного гидролиза масла сафлора под действием разных липаз

Для многих липаз наличие солей, в частности, СаСЬ играет существенную роль в поддержании третичной структуры фермента и, следовательно, в его функционировании и проявлении активности. С целью изучения влияния соли кальция на реакцию ферментативного гидролиза масла сафлора под действием разных липаз сравнивались начальные скорости и выход продукта реакции в оптимальных по NaCl условиях в отсутствие и присутствии СаСЬ-Результаты представлены на рис.10. Как видно, в оптимальных по NaCl условиях добавление СаС12 уменьшало как начальные скорости, так и выход продукта реакции в случае липазы из Candida rugosa и Candida cylindracea. В случае липазы из Alcaligenes sp. влияние солей кальция на начальную скорость реакции практически не наблюдалось (рис. 10А), хотя выход продукта увеличивался. Наиболее существенное влияние на скорость реакции и на выход продукта наблюдалось в случае фермента из Burkholderia sp., что может быть объяснено уходом с поверхности носителя и/или из области активного центра фермента продукта реакции, свободной жирной кислоты, в виде нерастворимой кальциевой соли (дополнительный эффект матрицы).

И

1 -NaCl; А 2-CaCI, NaCl.

ll

100

.„Vi«1'

ir"

uS'

os"

С»«1

Рис. 10. Зависимость начальной скорости (А) и степени конверсии субстрата за 40 мин реакции (Б) в процессе гидролиза масла сафлора от концентрации добавленной соли: ЫаС1 (1) или ИаС1 + СаС12 (2), катализируемого разными липазами. Условия эксперимента: для липазы А1са^епез эр. рН=9,5; [5]=10,4мМ; [ЛАВ]=19,2 мМ; [Е]=0,2мг/мл; для липазы ВигкИо1сЫа рН=9,0; [8]=12,5 мМ;

[ЛАВ]=19,2 мМ, [Е]=0,4мг/мл, дня липазы Candida rugosa рН=8,0, [S]=12,5 мМ, [ПАВ]=28,8 мМ, [Е]=ОДмг/мл, для липазы Candida cylmdracea рН=8,0, [S]=12,5 мМ, [ПАВ]=19,2 мМ, [ЕНДмг/мл, 25 °С

3 Выбор липаз и оптимизация условий для ферментативного гидролиза масла сафлора

Оптимизация параметров гидролиза растительных масел, катализируемых липазами, осложнена тем, та) во многих случаях кинетические кривые имеют весьма сложный характер Так, например, каталитическая активность многих липаз ингибируется высокими концентрациями субстрата или продукта реакции Действительно, для используемых в работе липаз из Candida rugosa и Candida cylmdracea, начальная скорость реакции гидролиза масла сафлора замелю уменьшается при концентрациях субстрата в эмульсии выше 20,8 и 31,2 мМ, соответственно Более того, гидролиз масла сафлора, катализируемый этими липазами, не идет <едо конца», конверсия составляет талью 51 и 44,4%, соответственно Для липаз из Alcahgenes sp и Burkholdena sp эффекта ингибирования субстратом не наблюдается, однаю кинетические кривые гидролиза масла сафлора, катализируемые этими липазами, осложнены ингибированием продуктом реакции В качестве примера на рис 11 показаны полные кинетические кривые «продукт - время» гидролиза масла сафлора под действием липазы из Alcahgenes sp На рис 12 представлен анализ интегральных кривых, приведенных на рис 11, в координатах уравнения Уокера-Шмидта. Важно отметить, что, как вид но на рис 11, несмотря на ингибирование продуктом, реакция гидролиза масла сафлора под действием липазы из Alcahgenes sp идет до юнца, как отсутствие, так и в присутствии соли кальция, однаю, наличие Са+2 повышает скорость реакции и, соответственно, уменьшает время, необходимое для полной конверсии субстрата. Так, 80% конверсии в присутствии соли кальция наблюдается в течение 2 часов, в то время как в отсутствие кальция за 3 5 часа образуется талью 70% продукта.

Рис 11 Полные кинетические кривые (продукт - время) реакции гидролиза масла

сафлора под действием липазы из Alcahgenes sp в отсутствие (А) и в присутствии (Б) соли кальция. Условия эксперимента. рН=9,5, [S]=10,4 мМ, [ПАВ]=28,8 мМ, [Е]=0,2 мг/мл, 50 мМ NaCl (А) и 50 мМ NaCl + 10 мМ СаС12 (Б), 25°С

1815-

I«:

i 9-*г

а 6300

Рис. 12 Анализ интегральных кривых, представленных на рис 11, реакции гидролиза масла сафлора, катализируемого липазой из Alcahgenes sp в отсутствие (черные точки) и в присутствии ([фасные точки) ссии кальция в координатах уравнения Уокера-Шмндга

Как показывает анализ интегральных кривых в координатах уравнения Уокера-Шмидга (рис 12), липсяиз в данном случае действительно характеризуется ярш выраженным эффектом ингибирования продуктом реакции, положительный наклон прямых свидетельствует о том, что продукт эффективнее, чем субстрат, связывается с ферментом Как вцдно на рис 12 (красные точки), этот эффект частично снимается в присутствии ионов кальция в результате образования кальциевых солей жирной кислоты (связывание жирной кислоты с ферментом ослабляется)

В независимосм эксперименте было показано, что использованные в работе фермешы не инакгивируются при их инкубировании в течение суток.

В таблице 3 приведены характеристики ферментативного гидролиза масла сафлора для четырех изученных липаз

Таблица 3 Характеристики фермсшшивного гидролиза масла сафлора

1/t*lnS /(S0-P), (ч1)

^тцшаметры Vmax Выход Ингибирование Влияние Влияние

(мМ/мин) продукта S/P температуры NaCl, СаС12

липаза (%)

Alcahgenes 8,15 100 нет/да 35°С увеличение

sp устранение в не влияет на выхода

присутствии солеи и выход продукта

другим способом

Burkholderia 1,12 83,9 нет/да 45°С существенно

sp 7 (CaCh) 90,2 устранение в не влияет на влияет на

(СаС12) присутствии солей и другим способом выход выход, скорость

Candida rugosa 4,47 51 ингибируется, [s]>40mM 40°С,сильно влияет на скрость и выход практически не влияет

Candida cyhndracea 3,37 44,4 ингибируется, [s]>40mM 40°С сильно влияет на выход и скорость практически не влияет

Как видно из таблицы, все липазы существенно отличаются по кинетическим параметрам, а также по степени влияния различных эффекторов на кинетику и выход продукта гидролиза масла сафлора. Очевидно, что только два из четырех изученных ферментов могут бьпъ использованы для проведения полною гидролиза масла сафлора с 90-100% конверсией субстрата в продукты реакции - жирные кислоты

4 Гидролиз масла сафлора под действием липаз при оптимальных условиях и выделение продукта (жирных кислот) из реакционной смеси

Учитывая рассмотренные выше факторы, влияющие на реакцию ферментативного гидролиза масла сафлора, проводили реакции гидролиза масла сафлора при оптимальных условиях, под действием липазы из АксйщепеБ ¿р и ВигккоШепа зр Проводили реакцию только в присутствие хлористого натрия и совместно в присутсвие хлористого натрия с хлористым кальцием Результаты данного эксперимента приведены в таблице 4 Как видно из таблицы, липаза А1са1щепез ¡р обладает наибольшей активностью, и полностью гидролизует масло сафлора как в присутствии, так и в отсутствие хлористого кальция Иммобилизованная липаза ВигИюЫгпа яр в присутствие хлористого кальция гидрсшизовала масло сафлора на 90,2%, а в отсутствии - на 83,9%, далее реакция останавливается

Таблица 4. Начальные сюэросга и выход продукта реакции гидролиза масла сафлора под действием липазы А1са1^епв5 зр и ВигкИоЫепа ¿р

\Параметры липаза Концентрация соли в эмульсии, (мМ) Начальная скорость (мМ/мин) Конверсия субстрата (40 мин), % Выход продукта, %

Aícaligenessp 50 (№С1) 1325 47,8 100

50(1ЧаС1)+10 (СаС12) 1,236 67,2 100

Burkholdena sp 50 (№С1) 0,223 24 83,9

50(КаС1)+10 (СаСГ2) 1,4 62 90,2

Условия эксперимента. [Б]=10,4 мМ, [ПАВ]=28,8 мМ, 50 мМ№С1,10 мМ СаСЬ; 25°С, рН 9,5, [Е]=0,2 мг/мл для липазы А1ссй%епея щ рН 9 0, [Е]=0 44 мг/мл для липазы ВигккоШпа яр

Экстракцию образовавшейся в ходе реакции свободной жирной кислоты проводили с помощью гексана после доведения рН реакционной смеси до 6,0 В независимом эксперименте было установлено, что именно в этих условиях жирная кислота уже переходит в незаряженную форму, а ПАВ по-прежнему существует в виде натриевой сопи. Приведенная ниже схема отражает происходящие процессы

В случае полного гидролиза

1.Реакционная у 2 Довести рН до 6 * 3 Добавить гексан и смесь перемешать

I 4

Гексановая фаза водная фаза

1 1 жирная кислота дезоксихолат натрия

Таким образом, разработаны методики и оптимизированы условия получения жирных кислот с выходами 90-100% при ферментативном гидролизе масла сафлора

ВЫВОДЫ

1 Изучен гидролиз масла сафлора красильного под действием липаз из разных источников Измерены кинетические параметры ферментативного гидролиза масла сафлора и степень конверсии субстрата под действием 4 липаз - Alcaligenes sp, Burkholderia sp, Candida rugosa, Candida cylindracea, не обладающих специфичностью к положению заместителя Выявлены существенные различия в поведении изученных липаз

2 Показано, что эффективность гидролиза зависит как от препарата фермента, так и от состояния реакционной среды («качества» эмульсии) Изучено влияние температуры как на каталитические характеристики липаз, так и на «качество» эмульсии Обнаружено, что наибольшее влияние состояние реакционной среды оказывает на липазу из Candida rugosa, для которой повышение температуры с 30 до 45°С приводит к существенному снижению выхода продукта именно по причине ухудшения состояния реакционной среды, а не инакшвации фермента.

3 Ферменгаивный гидролиз масла сафлора подавляется целевым продуктом (жирная кислота) Показано существенное снижение этого эффекта в присутствии

хлорида кальция Оптимизированы условия проведения ферментативного гидролиза масла сафлора при совместном действии хлоридов натрия и кальция

4 Оптимизированы условия получения жирных кислот с выходами 90100% при гидролизе масла сафлора под действием двух липаз -А1са1щепея яр и ВигМюЫепа яр Предложена простая схема выделения из реакционной смеси целевого продукта - жирной кислоты

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Майдина, А Б Белова Выбор системы для получения свободной линолевой кислоты путем ферментативного гидролиза Матер Междунар конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» Москва, Россия, 2006, с 33

2 Maidina, А В Belova, A VLevashov, N L Klyachko Optimization of enzyme hydrolysis conditions for linoleic acid production from sufflower (false Saffron) oil Proc 4th Moscow Int Congress on Biotechnology Moscow, Russia, 2007, p 293-294

3 Майдина, А Б Белова, H Л Клячко Влияние температуры на реакцию каталитического гидролиза масла сафлора под действием липазы Матер Междунар конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» Москва, Россия, 2007, с 524

4. Maidina, А В Belova, A VLevashov, NL Klyachko Screening of lipases and optimization of linoleic acid preparation from sufflower oil Proc Int Conference "Biocatalysis - 2007" Moscow - St-Petersburg, Russia, 2007, p 82

5 Майдина, А Б Белова, А В Левашов, H Л Клячко Особенности выбора температуры для проведения реакции каталитического гидролиза масла сафлора под действием липазы из Candida rugosa Вестник Московского университета, сер Химия, 2008, т. 49, с 134-138

6 Майдина, А Б Белова, Н Л Клячко Оптимизация условий реакции гидролиза масла сафлора под действием липазы Матер Междунар конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», Москва, Россия, 2008, с 311

Подписано к печати 29.П4.9.ППЯ Тираж Заказ .4%

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА.

1.1. Общая характеристика липаз из разных источников.

12 Аминокислотный и углеводный состав.

13. Структура активного центра и поверхностная активация липазы.

1.4. Механизм катализа и кинетические модели действия липаз.

1.5. Факторы, влияющие на липолиз.

1.6. Субстратная специфичность липаз.

1.7. Методы определения активности липаз.

П ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПАЗ.

2.1.1. Пищевая промышленность.

2.1.2. Получение ненасыщенных жирных кислот.

2.1.3. Получение моноглицеридов.

2.1.4. Производство моющих средств и производство бытавой химии.

2.1.5 Бумажное производство.

2.1.6. Медицина.

2.1.7. Органический синтез.

2.1.8. Использование липазы в нефтепромышленности и перспективы.

Ш. ИЗУЧЕНИЕ ЛИПАЗ В ХИМИИ ЖИРОВ.

3.1.Общее представление о липидах, жирах и жирных кислотах.

3.2. Применение и получение жирных кислот.

3.3.Изучение и применение липаз в жировой промышленности.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. МАТЕРИАЛЫ.

П. МЕТОДЫ.

2.1. Приготовление стабильной эмульсии.

2.2. Измерение начальной скорости и определение выхода ферментативной реакции.

2.3 . Изучение зависимости активности фермента и выхода продукта от разных факторов.

2.4. Измерение удельной активности липаз.

2.5. Определение максимальной скорости (Утах) и константы Михаэлиса (Км).

2.6. Измерение выхода продукта от времени и расчёт количества входа продукта

2.7.Тонкослойная хроматография.

2.8. Выделение продукта реакции ( свободной жирной кислоты).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

П. Сравнительная характеристика липаз для получения линолевой кислоты путём ферментативного гидролиза масла сафлора.

2.1. Зависимости начальной скорости и выхода продукта реакции ферментативного гидролиза масла сафлора в водной эмульсии.

2.2. Влияние температуры на реакцию гидролиза масла сафлора под действием липаз.

2.3. Гидролиз разных масел под действием разных липаз.

III. Оптимизация условий ферментативного получения линолевой кислоты из масла сафлора.

3.1. Стабильность используемых липаз

3.2. Влияние солей натрия и кальция на реакцию ферментативного гидролиза масла сафлора поддействием разных липаз.

3.2.1. Выбор липаз и оптимальных условий для ферментативного гидролиза масла сафлора.

3.3. Гидролиза масла сафлора поддействием липаз при оптимальном условии и выделение продукта (жирных кислот) из реакционных смесей.

3.4. Выделение продукта (жирных кислот) из реакционных смесей.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Липазы (гидролазы высших триглицеридов) играют ключевую роль в обмене липидов всех живых организмов, а также участвуют в процессах отложения и утилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки. Липазы не только гидролизуют триглицериды в пищеварительном тракте до ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот, но также способны катализировать с высокой стереоспецифичностью ацилирование и деацилирование большого числа субстратов, отличных от глицеридов. Липазы стабильны в водных и органических средах и могут быть получены с хорошим выходом из растений, животных, а также из природных и рекомбинантных микроорганизмов. В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез. В последнее время особое внимание уделяется оптимизации биокаталитических характеристик этих ферментов. Более перспективными считают липазы микроорганизмов. Липазы микроорганизмов имеют некоторые преимущества: во первых, липаз микроорганизмов достаточно много, причем определенные липазы имеют широкий рН и температурный диапазон действия по сравнению с липазами животных и растений; во вторых, липазы микроорганизмов удобно производить в промышленных масштабах.

В настоящее время начался новый этап в изучении липидов и полиненасыщенных жирных кислот. Несмотря на то, что организм обладает разветвлённой ферментативной системой, целый ряд жирных кислот, в первую очередь линолевая и линоленовая кислоты, не могут быть синтезированы в организме человека Дефицит этих кислот в пище приводит к возникновению различных патологических процессов, поэтому их называют «незаменными жирными кислотами». Линолевая и линоленовая кислоты даже носили объединённое название «витамин Б» Считают, что при отсутствии или недостатке этих кислот в организме человека холестерин образует с насыщенными жирными кислотами очень трудно окисляющиеся сложные эфиры. Вследствие химической стойкости они накапливаются в крови и откладываются, в частности, на стенках артерий. Когда эссенциапьные кислоты присутствуют в достаточном количестве, они могут образовывать с холестерином сложные эфиры, которые окисляются до иизкомолекулярных веществ и легко выводятся из организма В последнее время линолевая кислота (цис,цис-9-12-овая кислота) широко используется как лекарственное средство в терапии и профилактике многих серьёзных заболеваний (атеросклероз, ишемическая болезнь и другие). Известно, что растительные масла различаются по составу входящих в их состав жирных кислот. Было обнаружено, что в масле сафлора красильного (Carthamus tinción) может содержаться до 80% линолевой кислоты. Поэтому сафлор красильный может считаться хорошим сырьём для получения линолевой кислоты.

Химический гидролиз ненасыщенных триглидеридов даёт небольшой выход свободных ненасыщенных жирных кислот и требует их очистки от побочных продуктов, образованных в результате термической деградации триглидеридов, окисления ненасыщенных жирных кислот и образования их транс-изомеров. Поэтому на сегодняшний день одним из наиболее перспективных способов получения свободных жирных кислот из триглидеридов можно считать ферментативный гидролиз под действием липаз, не приводящий к окислению двойных связей ненасыщенных жирных кислот и не загрязняющий окружающую среду. Исключительной особенностью липазы, отличающей ее от других эстераз. является свойство поверхностной активации фермента в присутствии агрегированных молекул субстрата (жировых капель), что обусловлено формированием активной конформации фермента в результате его адсорбции на поверхности липида. В литературе имеются указания на то, что адсорбция липазы на липидном монослое является определяющим фактором катализа липазой, предшествуя образованию фермент-субстратного комплекса. Поэтому в данной работе с целью обеспечения больших поверхностей, в качестве реакционной среды мы использовали эмульсию (масло-ПАВ-вода), стабилизированную эмльгатором (дезоксихолат натрия) при помощи ультразвуковой ванны. Таким образом , основной целью работы явилось найти «зелёный путь» для получения линолевой кислоты из масла сафлора. Для решения этой задачи мы изучали характеристики коммерческих липаз из разных микроорганизмов: Alcaligenes, Burkholderia, Candida Rugosa и Candida Cylindracea. рН-Статирование является широко распространённым методом определения активности липаз и удобно для изучения их специфичности. В данной работе именно этим методом изучены параметры реакций и характеристики липаз в реакции ферментативного гидролиза масла сафлора. Осуществлена оптимизация условий гидролиза масла сафлор под действием данных липаз, и разработан метод выделения целового продукта (Ж.К) из реакционной смеси.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА

Выводы

1. Изучен гидролиз масла сафлора красильного под действием липаз из разных источников. Измерены кинетические параметры ферментативного гидролиза масла сафлора и степень конверсии субстрата под действием 4 липаз - Alcaügenes sp, Burkholderia sp, Candida rugosa, Candida cylindracea, не обладающих специфичностью к положению заместителя. Выявлены существенные различия в поведении изученных липаз.

2. Показано, что эффективность гидролиза зависит как от препарата фермента, так и от состояния реакционной среды («качества» эмульсии). Изучено влияние температуры как на каталитические характеристики липаз, так и на «качество» эмульсии. Обнаружено, что наибольшее влияние состояние реакционной среды оказывает на липазу из Candida rugosa, для которой повышение температуры с 30 до 45°С приводит к существенному снижению выход а продукта именно по причине ухудшения состояния реакционной среды, а не из-за инактивации фермента.

3. Ферментативный гидролиз масла сафлора подавляется целевым продуктом (жирная кислота). Показано существенное снижение этого эффекта в присутствии хлорида кальция. Оптимизированы условия проведения ферментативного гидролиза масла сафлора при совместном действии хлоридов натрия и кальция.

4. Оптимизированы условия получения жирных кислот с выходами 90-100% при гидролизе масла сафлора под действием двух липаз - Alcaügenes sp и Burkholderia sp. Предложена простая схема выделения из реакционной смеси целевого продукта - жирной кислоты.

Благодарности

В заключении, с искренней признательностью, выражаю огромную благодорносгь своим научным руководителям, профессорам: Наталье Львовне Клячко и Андрею Вадимовичу Левашову за предоставленную возможность заниматься интересующей меня проблемой, а также за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах исследования.

Особую личную благодарность, хотела бы выразить старшему научному сотруднику нашей кафедры Алле Борисовне Беловой за постоянную и неустанную помощь на всех этапах моей работы.

Глубоко благодарю весь коллектив лаборатории Мицеялярной этимологии Химического ф-та МГУ, в когсром я провела более трёх лет, за создание доброжелательной обстановки и понимание, а также особенная благодорносгь преподавателям кафедры Химической энзимологии за теплую атмосферу и человеческое участие.

1. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. Москва, Мир, 1978.

2. Schmid R., Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. v. 37. p.1608-1633.

3. Wooley P., Petersen S.B. Lipases: Their structure, biochemistry and application. Cambridge University Press, Cambridge, 1994.

4. Miled N., Canaan S., Dupuis L., Roussel A., Riviere M., Carriere F., de Caro A., Cambillau C., Verger R. Digestive Upases: From three-dimensional structure to physiology. // Biochimie. 2000. v. 82. p. 973-986.

5. Carriere F., Bezzine S., Verger R. Molecular evolution of the pancreatic lipase and two related enzymes towards different substrate selectivities. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic, (1997) 3: 55-64.

6. Borgstrom B, Brockman H.L. Lipases. Elsevier, Amsterdam, 1984.

7. Mukherjee K.D., Hills M.J. Lipolytic Enzymes. Brockerhoff H., Jensen R.G. (Eds.), , Academic Press, New York, 1974. v. 21. p. 49-76.

8. Jaeger K.E., Ransas S., Dijkstra B.W., Colson C., van Heuvel M., Misset O. Bacterial lipases. // FEMS Microbiol. Rev. 1994. v. 15: p. 29-63.

9. Gilbert E.J. Pseudomonas lipases: biochemical properties and molecular cloning. // Enzyme Microb. Technol. 1993. v. 15. p. 634-645.

10. Wohlfahrt S., Jaeger K.E. Bacterial lipases: biochemistry, molecular genetics and application in biotechnology. // Bioengineering. 1993. v. 9. p. 39-46.

11. Aires-Barros M.R., Taipa M.A., Cabral J.M.S. Isolation and purification of lipases. Wooley P., Petersen S.B. (Eds.) // Cambridge University Press, Cambridge. 1994. p. 243-270.

12. Carriere F., Barrowman J.A., Verger R., Laugier R. Secretion and contribution to lipolysis of gastric and pancreatic lipases during a test meal in humans. // Gastroenterology. 1993. v. 105. p. 876-888.

13. Verger R. Lipases. Borgstrom В., Brockman H.L. (Eds.), Elsevier, Amsterdam 1984. p. 83-150.

14. Garner C.W., Smith L.C. Porcine pancreatic lipase: A glycoprotein. // J.Biol. Chem. 1972. v. 247. p. 561-565.

15. Verger R., de Haas G.H., Sarda L., Desnuelle P. Purification from porcine pancreas of two molecular species with lipase activity. // Biochim. Biophys. Acta. 1969. v. 188. p. 272 282.

16. Plummer Т.Н., Sarda L. Isolation and characterization of the glycopeptides of porcinepancreatic lipase LA and LB. //J. Biol. Chem. 1973. v. 248. p. 7865-7869.

17. Isobe M., Sugiura M. Studies on the lipase of Chromobacterium viscosum. V. Physical and chemical properties of the Upases. // Chem. Pharm. Bull. 1977. v. 25: p. 1980 -1986.

18. Taipa M.A., Liebeton K., Costa J.V., Cabral J.M., Jaeger K.E. Lipase from Chromobacterium viscosum: biochemical characterization indicating homology to the lipase fromPseudomonas glumae. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. v. 1256. p. 396 402.

19. Lotti M., Tramontane A., Longhi S., Fusetti F., Brocca S., Pizzi E., Alberghina L. Variability within the Candida rugosa lipases family. // Protein Eng. 1994. v. 7. p. 531-535.

20. Huge-Jensen B., Galluzzo D.R., Jensen R.G. Partial purification and characterization of free and immobilized lipase from Mucor miehei. // Lipids. 1978. v. 22. p. 559-565.

21. Nagato T., Shimada Y., Sugihara A., Tominaga Y. Cloning and sequencing of two chromosomal lipase genes from Geotrichum candidum. // J. Biochem. 1993. v. 113. p. 776-780.

22. Veeraragavan K., Colpitts T., Gibbs B.F. Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. v. 1044. p. 26-33.

23. Sugihara A., Shimada Y., Tomonaga Y. Separation and characterization of two molecular forms ofGeotrichum candidum lipase. // J. Biochem. 1990. v. 107. p. 426-430.

24. Semeriva M., Benzonana G., Desnuelle P. Some properties of a lipase from Rhizopus arrhizus: Separation of a glycopeptide bound to the enzyme. // Biochim. Biophys. Acta. 1969. v. 191. p. 598-610.

25. Sarda L., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on emulsified esters. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. v. 37. p. 1608-1633.

26. Winkler F.K., D'Arcy A., Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase // Nature. 1990. v. 343. p. 771-774.

27. Derewenda U., Brzozowski A.M., Lawson D.M., Derewenda Z.S. Catalysis at the ierface:

28. Grochulski P., Li J., Schrag J.D., Bouthillien F., Smith P., Harrisn D., Rubin B., Cygler M. Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase. // Biol. Chem.1993. v. 268. p. 12843-2847.

29. Schrag J.D., Cygler M. 1.8 A refined structure of the lipase from Geotrichum candidum. J.Mol. Biol. 1993. v. 230. p. 575-591.

30. Bourne Y., Martinez C., Kerfelec B., Lombardo D., Chapus C., Cambillau C. Horse pancreatic lipase. The crystal structure refined at 2.3 A resolution. // J. Mol. Biol. 1994. v. 238. p. 709-732.

31. Derevenda U., Swenson L., Green R., Wei Y., Dodson G.G., Yamaguchi S., Haas M.J., ' Derevenda Z.S. An unusual buried polar cluster in a family of fungal lipases. // Nat. Struct. Biol.1994. v.l. p. 36- 47.

32. Noble M.E.M., Cleasby A., Johnson L.N., Frenken L.G.J., Egmond M.R. The crystal structure of triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate. // FEBS Lett. 1993. v. 331. p. 123-128.

33. Uppenberg J, Patkar S, Bergfors T, Jones TA. Crystallization and preliminary X-ray studies of lipase B from Candida antarctica // J Mol Biol. 1994. v. 235. p.790-792.

34. Jaeger K.E., Ransac S., Koch H.B., Ferrato F., Dijkstra B.W. Topological characterization and modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa. // FEBS Lett. 1993. v.332. p.143-149.

35. Nardini M., Lang D.A., Liebeton K., Jaeger K.-E., Dijkstr B.W. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation. // J. Biol. Chem. 2000. v. 275. p. 31219-31225.

36. Hjorth A., Cam'ere F., Cudrey C., Woldike H., Boel E., Lawson D.M., Verger R. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospho)lipase. // Biochemistry. 1993. v. 32. p. 4702-4707.

37. Jennens M.L., Lowe M.E. A surface loop covering the active site of human pancreatic ipase influences interfacial activation and lipid binding. // J. Biol. Chem. 1994. v. 269. p. 2547025474.

38. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M, Dijkstra B.D., Frolow F., Franken S., Harel M.,

39. Remington S.J., Silman J. The alpha / beta hydrolase fold. I I Protein Eng. 1992. v. 5. p. 197-211.

40. De Caro J.D., Boundouard M., Bonicel J .J., Guidoni A., Desnuelle P., Rovery M. Porcine pancreatic lipase: completion of the primary structure. // Biochim. Biophys. Acta. 1981.V. 671. p. 129-138.

41. Benkouka F., Guidoni A., De Caro J.D., Bonicel J.J., Desnuelle P., Rovery M. Porcine pancreatic lipase. The disulfide bridges and the sulfhydryl groups. // Eur. J. Biochem. 1982. v. 128. p. 331-341.

42. Fournet B., Leroy Y., Montreuil J., De Caro J., Rovery M., van Kuik J.A., Vliegenthart IF.G. Primary structure of the glycans of porcine pancreatic lipase. // Eur. J. Biochem. 1987. v.170. p.369-371.

43. Egloff M.P., Marguet F., Buono G., Verger R., Cambillau C., van Tilbeurgh H. The 2.46A resolution structure of the pancreatic lipase-colipase complex inhibited by a Cll alkyl phosphonate.//Biochemistry. 1995. v. 34. p. 2751-2762.

44. Derewenda Z.S., Derewenda U. The crystal and molecular structure of the Rhizomucor tniehei triacylglyceride lipase at 1.9 A resolution. // J. Mol. Biol. 1992. v. 227. p.818-839.

45. Lang D., Hofmann B., Haalck L., Hecht H.-J., Spener F., Schmid R.D., Schomburg D. Crystal structure of bacterial lipase from Chromobacterium viscosum ATCC 6918 refined at Irresolution.//J. Mol. Biol. 1996. v. 259. p. 704-717.

46. Derewenda U., Derewenda Z.S. Relationships among serine hydrolases: evidence for a common structural motif in triacylglyceride Upases and esterases. // Biochem. Cell. Biol. 1991. v.169. p. 842-851.

47. Derewenda Z.S., Sharp A.M. News from the interface: the molecular structures of triacylglyceride Upases. //TIBS. 1993. v. 18. p. 20-25.

48. Blow D. Lipases reach the surface. //Nature. 1991. v. 351. p. 444-445.

49. Verger R., Mieras M.C.E., Haas G.H. Action of phospholipase A at interfaces. // J. Biol. Chem. 1973. v. 248. p. 4023-4045.

50. Verger R. Enzyme kinetics of lipolysis. // Methods Enzymol. 1980. v. 64. p. 340-392.

51. Jain M.K., Berg O.G. The kinetics of interfacial catalysis by phospholipase a: andteulation of interfacial activation: hopping versus scooting. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. v.1002. p. 127-156.

52. Bengtsson G., Olivecrona T. Lipoprotein lipase moves rapidly between lipid droplets. // IS Lett. 1983. v. 154. p. 211-213.

53. Benzonana G., Desnuelle P. Action of some effectors on the hydrolysis of long-chain tri glycerides by pancreatic lipase. // Biochim Biophys Acta. 1968. v. 164 (1). p. 47-58.

54. Entressangles B., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on aggregated glyceride molecules in an isotropic system. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. v. 159 (2). p. 285-295.

55. Borgstrom B. Effect of taurocholic acid on the pH / activity curve of rat pancreatic lipase. //Biochim Biophys Acta. 1954. v. 13 (1). p. 149-150.

56. Ran D., Rhee J.S. Characteristics of lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT-isooctane reversed micelles // Biotechnol. Bioeng. 1986. v. 28. p. 1250-1255.

57. Hofmann A.F., Borgstrom B. The intraluminal phase of fat digestion in man: the lipid content of the micellar and oil phases of intestinal content obtained during fat digestion and absorption. // J. Clin. Invest. 1964. v. 43. p. 247-257.

58. Hofmann A.F., Small D.M. Detergent properties of bile salts: correlation with physiological function. // Annu Rev Med. 1967. v. 18. p. 333-376.

59. Schoor W.P., Melius P. The influence of sodium taurocholate on the pancreatic lipase-substrate adsorption and activity // Biochim. Biophys. Acta. 1970. v. 212. p. 173-175.

60. Alvarez F.J., Stella V.J. The role of calcium ions and bile salts on the pancreatic lipase-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin. // Pharm. Research. 1989. v. 6 (6)'. p. 449-457.

61. Patton J.S., Carey M.C. Inhibition of human pancreatic lipase-colipase activity by mixed bile salt-phospholipid micelles. // Am. J. Physiol. 1981. v. 241. p.328-336.

62. Lairon D., Nalbone G., Lafont H., Leonardi J., Domingo N, Hauton J.C., Verger R. Possible roles of bile lipids and colipase in lipase adsorption, // Biochemistry. 1978. v. 17. p. 5263-5269.

63. Lairon D., Nalbone G., Lafont H., Leonardi J., Domingo N, Hauton J.C. Protective effect I of biliary lipids on rat pancreatic lipase and colipase. // Lipids. 1978. v. 13. p. 211-216.

64. Masoro E J. Lipids and lipid metabolism. // Annu. Rev. Physiol. 1977. v. 39. p. 301-321.

65. Pignol D., Ayvazian L., Kerfelec B., Timmins P., Crenon I., Hermoso J., Fontecilla-Camps J.C., Chapus C. Critical role of micelles in pancreatic lipase activation revealed by angle neutron scattering. // J.Biol. Chem. 2000. v. 275 (6). p. 4220-4224.

66. Pedersen J.S., Egelhaaf S., Schurtenberger P. Critical role of micelles in pancreatic lipase activation revealed by small angle neutron scattering // J. Physiol. Chem. 1995. v. 99. p. 1299-1305.

67. Tso P., Scobey M. Fat Absorption. A. Kuis (Ed.). CRC Press, Boca Raton, Fla., 1986. v. 1. p. 177-196.

68. Hauser H., Guyer w., Howell K. Lateral distribution of negatively charged lipids in lecithin membranes. Clustering of fatty acids. // Biochemistry. 1979. v. 18. p. 3285-3291

69. Neuman R.D. Calcium binding in stearic acid monomolecular films. //. J. Colloid. Interface Sci. 1975. v. 53. p. 161-171.

70. Wieloch T., Borgstrom B., Pieroni G., Pattus F., Verger R. Product activation of pancreatic lipase. Lipolytic enzymes as probes for lipid/water interfaces. // J. Biol. Chem. 1982. v. 257(19) p.11523-11528.

71. Ramsey H.A., Wise G.H., Tove S.B. Fat digestion. //J. Dairy Sci. 1956. v.10. p.1319-1322.

72. Borgstrom B., Dahlquist A., Ludh G., Sjovall J. Studies of intestinal digestion and absorption in the human. //J. Clin. Invest. 1957. v. 36. p.1521-1536.

73. Hamosh M., Scow R.O. Lingual lipase and its role in the digestion of dietary lipid. // J.Clin. Invest. 1973. v. 52. p. 88-95.

74. Plucinski T.M., Hamosh M., Hamosh P. Fat digestion in rat: role of lingual lipase. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1979. v. 237. p. 541-547.

75. Chandler I.C., Quinlan P.T., Mcneill G.P. Lipase-catalyzed synthesis of chiral triglycerides. //J. Am. Oil. Chem. Soc. 1998. v.75. p.1513-1518.

76. Yamaguchi S., Mase T. High yield synthesis of monoglyceride by mono- and diacylglycerol lipase from Pénicillium camembertii U-150. // J. Perm. Bioeng. 1991. v. 72.

77. Mattson F.H., Beck L.W. The digestion in vitro of triglycerides by pancreatic lipase. // J. Biol. Chem. 1955. v. 214. p. 115-125.

78. Courts J.R.T., Stansfield D.A. Pancreatic cholesterol esterases: a comparative study. I I Biochemistry. 1967. v. 104. p. 27-32.

79. Pleis J., Fischer M., Schmid R.D. Anatomy of lipase binding sites: the scissile fatty acid binding site. // Chem. Phys. Lip. 1998. v. 93. p. 67-80.

80. Tattrie N.H., Bailey R.A., Kates M. The action of pancreatic lipase on stereoisomeric triglycerides.//Arch. Biochem. Biophys. 1958. v. 78. p. 319-327.

81. Jensen R.G., Pitas R.E., Quinn J.G., Sampugna J. Pancreatic lipolysis of enantiomeric triglycerides.//Lipids. 1970. v. 5. p. 580-581.

82. Mattson F.H., Beck L.W. The specificity of pancreatic lipase for the primary hydroxyl groups of glycerides. //J. Biol. Chem. 1956. v. 219. p. 735-740.

83. Rogalska E.,Cudrey C., Ferrato F., Verger R. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial Upases. // Chirality. 1993. v. 5. p. 24-30.

84. Rogalska E.,Ransac S., Verger R. Stereoselectivity of lipases. // Stereoselective hydrolysis of triglycerides by gastric and pancreatic lipases. // J. Biol. Chem. 1990. v. 265. 20271-20276.

85. Alford J.A., Pierce D.A., Suggs F.G. Activity of microbial lipases on natural fats and synthetic triglycerides. // J. Lipid Res. 1964. v. 5. p. 390-394.

86. Ory R.L., St. Angelo A.J., Altshul A.M. Castor bean lipase: action on its endogenous substrate. // Lipid Res. 1960. v.l. p.208-213.

87. Berner D.L., Hammond E.G. Specificity of lipase from several seeds and Leptospira pomona. // Lipids. 1970. v. 5. p. 572-573.

88. Shastry B.S., Rao M.R. Studies on rice bran lipase. //J. Biochem. Biophys. 1971. v. 8. p.327-332.

89. Entressangles B., Pasero L., Savary P., Sarda L., Desnuelle P. Influence of the nature ofthe chains on the rate of their hydrolysis by pancreatic lipase. // Bull. Soc. Chim. Biol. 1961. v. 43. p. 581-591.

90. Mani V.V.S., lakshminarayana G. Comparative rate of lipolysis of different fatty acids in pancreatic lipase hydrolysis of ethylene glycol mixed diesters. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. v. 202. p. 547-549.

91. Hellyer S.A., Chandler I.C., Bosley J.A. Can the fatty acid selectivity of plant Upases be predicted from the composition of the seed triglyceride? // Biochim. Biophys. Acta. (1999) 1440: 215-224.

92. Jensen R.G., Sampugna J., Quinn J.G., Carpenter D.L., Marks T.A. Specificity of a lipase from Geotrichum candidum for cis-octadecenoic acid. // J. Amer. Oil. Chem. Soc. 1965. v. 42.p.1029-1032.

93. Jensen R.G., Gordon D.T., Scholfield E.R. Specificity of Geotrichum candidum lipase with respect to double bond position in triglycerides containng cis-octadecenoic acids. // Lipids. 1972. v. 7. p.738-741.

94. Charton E., Macrae A.R. Specificities of immobilized Geotrichum candidum CMICC335426 lipase A and B in hydrolysis and ester synthesis in organic solvents. // Enz. Microbiol. Technol. 1993. v.15. p. 489-493.

95. Charton E., Macrae A.R. Substrate specificities of lipases A and B from Geotrichum candidum CMICC335426. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. v. 1123. p. 59-64.

96. Lie O., Lambertsen O.G. Fatty acid specificity of Candida cylindracea lipase. // Fett. Siefen. Ansstrichm. 1986. v. 88. p. 365-367.

97. Kleiman R., Earle F.R., Tallent W.H., Wolff LA. Retarded hydrolysis by pancreatic lipase of seed oils with trans-3 unsaturation. // Lipids. 1970. v. 5. p.513-518.

98. Brockerhoff H. Substrate specificity of pancreatic lipase. Influence of the structure of fatty acids on the reactivity of esters.//Biochim. Biophys. Acta. 1970. v. 212. p. 92-101.

99. Heimermann W.H., Holman R.T., Gordon D.T., Kowalyshyn D.E., Jensen R.G. Effect of double bond position in octadecenoates upon hydrolysis by pancreatic lipase. // Lipids. 1973. v. 8. p. 45-47.

100. Macrae A.R., Visicchio J.E., Lanot A. Application of potato lipid acyl hydrolase for the synthesis of monoacylglycerols. //J. Am. Oil. Chem. Soc. 1998. v. 75. p. 1489-1494.

101. Ferrato F., Carriere F., Sarda L., Verger R. A critical réévaluation of the phenomenon of interfacial activation. // Methods Enzymol. 1997. v. 286. p. 327-347.

102. Beisson F., Tiss A., Riviere C., Verger R. Methods for lipase detection and assay: a critical review. //Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 2000. p. 133-153.

103. Verger R., de Haas G.H. Enzyme reaction in a membrane model. 1: A new technique to study enzyme reactions in monolaters. // Chem. Phys. Lipids. 1973. v. 10. p. 127-136.

104. Aoubala M., Ivanova M., Douchet I., De Caro A., Verger R. Interfacial binding of human gastric lipase to lipid monolayers, measured with an ELISA. // Biochem. 1995. v. 34.p. 10786-10793.

105. Momsen W.E., Brockman H.L. Recovery of monomolecular films in studies of lipolysis. //

106. Methods Enzymol. 1997. v. 286. p. 292-305.

107. Rietsch J., Pattus F., Desnuelle P., Verger R. Enzyme reactions in a membrane model. III. Futher studies of mode of action of lipolytic enzymes. // J. Biol. Chem. 1977. v. 252. p. 4313-4318.

108. Momsen W.E., Brockman H.L. The adsorption to and hydrolysis of 1,3-didecanoyl glycerol monolayers by pancreatic lipase. Effect of substrate packing density. // J. Biol. Chem. 1981.v. 256. p. 6913-6916.

109. Nielsen L., Risbo J., Callisen T., Bjornholm T. Lag-burst kinetics in phospholipase ai hydrolysis of DPPC bilayers visualized by atomic force microscopy. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. v. 1420. p. 266-271.

110. Walde P., Luisi P.L. A continuous assay for Upases in reverse micelles based on Fourier transform infrared spectroscopy. // Biochem. 1989. v. 28. p. 3353-3360.

111. Brockman H.L. Triglyceride lipase from porcine pancreas. // Methods Enzymol. 1981. v. 71. p. 619-627.

112. Entressangles B., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on aggregated glyceride molecules in an isotopic system. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. v. 159. p. 285-295.

113. Hoppe A., Theimer R.R. Titrimetric test for lipase activity using stabilized triolein emulsion. // Phytochem. 1996. v. 42. p. 973-978.

114. Ceriotti F., Bonin P.A., Murone M., Barenghi L., Luzzana M., Mosca A., Ripamonti M. Measurement of lipase activity by differential pH technique. // Clin. Chem. 1985. v. 31. p. 257-260.

115. Tietz N.W., Astles J.R., Shuey D.F. Lipase activity measured in serum by a continuous-monitoring pH-stat technique: an update. // Clin. Chem. 1989. v. 35. p. 1688-1693.

116. Buncombe W.G. The colorimetric determination of long-chain fatty acids in the 0.05-0.5 Hmole range. // Biochem. J. 1963. v. 88. p. 7.

117. Mahadevan S., Dillard C.J., Tappel A.L. A modified colorimetric micro method for long-chain fatty acids and its application for assay of lipolytic enzymes. // Anal. Biochem. 1969. v. 27. p. 387-396.

118. Kwon D.Y., Rhee J.S. A simple and rapid colorimetric method for determination of free fatty acids for lipase assay. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1986. v. 63. p. 89-92.

119. Kouker G., Jaeger K.E. Specific and sensitive plate assay or bacterial lipases. // Appl. Environ. Microbial. 1987. v. 53. p. 211-213.

120. Chapus C., Semeriva M., Bovier-Lapierre C., Desnuelle P. Mechanism of pancreatic lipase action. 1. Interfacial activation of pancreatic lipase. // Biochem. 1976. v. 15. p. 4980-4987.

121. Vorderwulbecke T., Kieslich K., Erdmann H. Comparison of lipases by different assays. //Enzyme. Microb. Technol. 1992. v. 14. p. 631-639.

122. Mosmuller E.W.J., van Heemst J.D.H., van Delden C.J., Franssen M.C.R., Engbersen J.F.J. A new spectrophotometric method for the detection of lipase activity using 2,4-dinitrophenyl butirate as a substrate.//Biocatalysis. 1992. v. 5. p. 279-278.

123. Whitaker J. A rapid and specific method for the determination of pancreatic lipase in serum and urine.//Clin. Chim. Acta. 1973. v. 44. p. 133-138.

124. Rogel A.M., Stone W.L., Adebonojo P.O. A novel spectrometric assay for lipase activity utilizing cis-parinaric acid. // Lipids. 1989. v. 24. p. 518-524.

125. Biesson F., Ferte N., Nari J., Noat G., Arondel V., Verger R. Use of naturally fluorescent triacylglicerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. //J. Lipid Res. 1999. v. 40. p. 2313-2321.

126. Wolf C., Sagaert L., Bereziat G. A sensitive assay of phospholipase using the fluorescent probe 2-parinaroellecitin. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1981. v. 99. v. 275-283.

127. Hendrickson H.S., Rauk P.N. Continuous assay of phospholipase A2 with pyrene-labelled lecithin as a substrate. //Anal. Biochem. 1981. v. 116. p. 553-558.

128. Thuren T., Virtanen J.A., Verger R., Kinnunen P.KJ. Hydrolysis of l-palmitoyl-26-(pyren-l-yl)]-hexanoyl-sn-glycerol-3-phospholipids by phospholipase A2: Effect of the polar head-group. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. v. 917. p. 411-417.

129. Negre A., Salvayre R.S., Dagan A., Gatt S. New fluorometric assay of lysosomal acid and its application to the diagnosis of Wolman and cholesteryl ester storage diseases. // Clin. Chim. Acta. 1985. v. 149. p. 81-88.

130. Negre A., Salvayre R.S., Dagan A., Gatt S. Pyrenemethel laurate, a new fluorescent substrate for continuous kinetic determination of lipase activity. // Biochim. Biophys. Acta. 1989.v. 1006. p. 84-88.

131. Fleisher M., Schwartz M. An automated, fluorometric procedure for determining serum lipase. // Clim. Chem. 1971. v. 17. p. 417-422.

132. Wilton D.C. A continuous fluorescence-displacement assay for triacylglycerol lipase and phospholipase C that also allows the measurement of acyglycerols. // Biochem. J. 1991. v.219. p. 129-260.

133. Mangold H. Lipids. Zweig G., Sherma J. (Eds.), CRC press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984.

134. Kates M. Techniques of lipidology: isolation, analysis and identification of lipids. Burdon R.H., van Knippenberg P.H. (Eds.), Elsevier, Amsterdam, New York, 1986.

135. Maurich V., Moneghini M., Zacchigna M., Pitotti A., Lencioni E. High-perfomance liquid chromatographic assay of pancreatic lipase activity. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1991. v. 9. p. 427-431.

136. Maurich V., Zacchigna M., Pitotti A. p-Nitrophenyllaurate: a subsrate for the high-performance liquid chromatographic assay of pancreatic lipase activity. // J. Chromatogr. 1991. v. 566. p. 453-459.

137. Ruiz L., Rodriguez-Fernandez C. Kinetic study of hepatic triglyceride lipase from rat liver soluble fraction. // Enzyme. 1982. v. 27. p. 215-219.

138. Ulitzur S., Heller M. Bioluminescent assay for lipase, phospholipase A2, and phospholipase C. //Methods. Enzymol. 1981. v. 72. p. 338-346.

139. Proelss F., Wright B.W. Lipoxygenic micromethod for specific determination of lipase activity in serum and duodenal fluid. // Clin. Chem. 1977. v. 23. p. 522-531.

140. Griebel R.J., Knoblocj E.G., Koch T.R. Measurement of serum lipase activity with the oxygen electrode. // Clin. Chem. 1981. v. 27. p. 163-167.

141. Shimizu S., Tani Y., Yamada H., Tabata M., Murachi T. Enzymatic determination of serum-free acids: a colorimetric method. // Anal. Biochem. 1980. v. 107. p. 193-198.

142. Bjoerkhem I., Sandelin K., Thore A. A simple, fully enzymic bioluminescent assay for triglycerides in serum. // Clin. Chem. 1982. v. 28. p. 1742-1744.

143. Imamura S., Hirayama T., Arai T., Takao K., Misaki H. An enzymatic method using 1,2-diglyceride for pancreatic lipase test in serum. // Clin. Chem. 1989. v. 35. p. 1126-1129.

144. Fariha Hasan, Aamer Ali Shah, Abdul Hameed. Industrial applications of microbial lipases. // Enzyme and Microbial Technology. 2006. v. 39. p 235-251.

145. Song Xin. Biotransformation. Pekin, Chemical Industry Press. 2004.

146. Mensink R.P., Katan M.B. Effect of dietary trans fatty acids on the high-density andlow-density lipoprotein cholesterol levels in healthy subjects. // Eng. J. Med. 1990. v. 323. p. 439-345.

147. Mukheijee K.D. Lipase catalyzed reactions for modification of fats and other lipids. // Biocatalysis. 1990. v. 3. p. 277-293.

148. Forssell P., Kervinen R., Lappi M., Linko P., Suortii T., Poutanen K. Effect of enzymatic interesterification on the melting point of tallow-rapeseed oil (LEAR) mixture. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1992. v. 69. p. 126-129.

149. Zeitoun M.A.M., Neff W.E., List G.R., Mounts T.L. Physical properties of interesterified fat blends. //J. Am. Oil. Chem. Soc. 1993. v. 70. p. 467-471.

150. Rouseau D., Marangoni A.G. Tailoring the textural attributes of butter fat/canola oil blends via Rhizopus arrhizus lipase-catajyzed interesterification. 1. Compositional modification. //J. Agric. Food. Chem. 1998. v. 46. p. 2368-2374.

151. Rouseau D., Marangoni A.G. Tailoring the textural attributes of butter fat/canola oil blends via Rhizopus arrhizus lipase-catalyzed interesterification. 2. Modifications of physical properties.//! Agric. Food. Chem. 1998. v. 46. p. 2375-2381.

152. Bloomer S., Adlercreutz P., Mattiasson B. Triglyceride interesterification by lipases. I. Cocoa butter equivalents from a fraction of palm oil. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1990. v. 67. p. 519-524.

153. Mohamed H.M.A., Bloomer S., Hammadi K. Modification of fats by lipase interesterification. I. Changes in triglyceride structure. // Fat. Sci. Technol. 1993. v. 95. p. 428-431.

154. Basheer S., Mogi K., Nakajima M. Interesterification kinetics of triglycerides and fatty acids with modified lipase in n-hexane. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1995. v. 72. p. 511-518.

155. Bracco U. Effect of triglyceride structure on fat absorption. // J.Am. Clin. Nutr. 1994. v.60. p. 1002-1009.

156. Kennedy J.P. Srtructured lipids: fats for the future. // Food Technol. 1991. v. 45. p. 76-83.

157. Schmid U. Highly selective synthesis of l,3-oleoyl-2-palmitoylglycerol by lipase catalysis. // Bio technol. Bioeng. 1999. v. 64. p. 678-684.

158. Quilan P., Moore S. Modification of triglycerides by lipases: process technology and its application to the production of nutritionally improved fats. // INFORM 1990. v. 4. p. 580-585.

159. Haraldsson G.G. Using biotechnology to modify marine lipids. // INFORM. 1992. v. 3.p. 626-629.

160. Sridhar R., Lakshminarayana G. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into groundnut oil by lipase-catalyzed ester interchange. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1992. v. 69. p. 1041-1044.

161. Diks R.M.M., Lee MJ. Production of a very low saturate oil based on the specificity of Geotrichum candidum lipase. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1999. v. 76. p. 455-462.

162. Vulfson E.N. Lipases: their structure, biochemistry and application. Wooley P., Petersen S.B (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge. 1994. p. 271-286.

163. Hoshimo T., Yamane T., Shimizu S. Selective hydrolysis of fish oil by lipase to concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids. //Agric. Biol. Chem. 1990. v. 54. p. 1459-1467.

164. Tanaka Y., Hirano J., Funada T. Concentration of docosahexaenoic acid by gliceride by hydrolysis offish oil with Candida cylindracea lipase. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1992. v. 69.p. 1210-1214.

165. Akoh C.C. Lipase-catalyzed synthesis of partial glyceride. // Biotechnol. Lett. 1993. v. 15. p. 949-954.

166. McNiell G.P., Shimizu S., Yamane T. High-yield glycerolysis of oils and fats. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1991. v. 68. p. 1-5.

167. Berger M, Schneider M.P. Enzymatic esterification of glycerol. II. Lipase-catalyzed synthesis of regioisometrically pure l(3)-rac-monoacyl glycerols. // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1992. v. 69. p. 961-965.

168. Bornscheuer U., Stamatis H., Xenakis A.T., Yamane T., Kolisis F.N. A comparison of different strategies for lipase-catalyzed synthesis of partial glycerides. // Biotechnol. Lett. 1994. v. 16. p. 679-702.

169. Millqvist A., Adlercreutz P., Mattiasson B. Lipase-catalyzed alcoholysis of triglycerides for the preparation of 2-monoglycerides. // Enzyme Microb. Technol. 1994. v. 16. p. 1042-1047.

170. Bellot J.C., Choisnard L., Castillo E., Marty A. Combining solvent engineering andthermodynamic modeling to enhance selectivity during monoglyceride synthesis bylipase-catalyzed esterification. // Enzyme. Microb. Technol. 2001. v. 28. p. 362-369.

171. Monteiro J.B., Nascimento M.G., Ninow J.L. Lipase-catalyzed synthesis ofmonoacylglycerol in homogeneous system. // Biotechnol. Lett. 2003. v. 25. p. 641-644.

172. In-Hwan Kim., Hakryul Kim., Ki-Teak Leee., Soo-Hyun Chung., Soon-Nam Ko. Lipase-Catalyzed Acidolysis of Perilla oil with Caprylic Acid to Produce Structured Lipids. // JAOCS. 2002. v . 79. №. 4. p. 363-367.

173. Boel E., Christensen T., Woldike H. (Novo Nordisk AS), US-A 5536661, 1996 // Chem. Abstr. 1996. v. 125. p. 160364.

174. Fujita Y., Awaji H., Matsukura M., Hata K., Shimoto H., Sharyo M., Skaguchi H., Gibson.K. Recent advances in enzymic pitch control. // Tappi J. 1992. v. 75. p. 117-122.

175. Benicourt C., Blanchard C., Carruere F., Verger R., Junien J.L. Clinical ecology in cystic fibrosis. Escobar H., Baquero C.F., Suarez L. (Eds.), Elsevier, Amsterdam. 1993. p. 291-295.

176. Lankisch P.O. Enzyme treatment of exocrine pancreatic insufficiency in chronic pancreatitis. // Digestion. 1993. v. 54. p. 21-29.

177. Wickler-Planquart C., Canaan S., Riviere M., Dupuis L., Verger R. Expression in insect cells and purification of a catalytically active recombinant human gastric lipase. // Protein Eng.1996. v. 9. p. 1225-1232.

178. Suzuki A., Mizumoto A., Sarr M.G., Dimagno E.P. Bacterial lipase and high-fat diets in canine exocrine pancreatic insufficiency: a new therapy of steatorrhea. // Gastroenterology.1997. v.112. p. 2048-2055.

179. Bennet W. Dietary treatments of obesity. // Ann. N.Y. Acad Sci. 1987. v. 499. p. 250-263.

180. Zhi J., Melia G., Kosstwardy S.G., Min B., Guerciolini R., Freundlich N.L., Milla G., Patel I.H. The influence of orlistat on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of glyburide in healthy volunteers. //J. Clin. Pharmacol. 1995. v. 35. p. 521-525.

181. Schwizer W., Asal K., Kreiss C., Mettraux C., Boroviclka J., Remy B., Guzelhan C., Hartmann D., fried M. Role of lipase in the regulation of upper gastrointestinal function inhumans. //Am. J. Physiol. 1997. v. 273. G612-G620.

182. Hildebrand P., Petrig C., Burckhardt B., Ketterer S., Lengsfeld H., Fleury A., Hadvary P., Beglinger C. Hydrolysis of dietary fat by pancreatic lipase stimulates cholecystokinin release. // Gastroenterology. 1998. v. 114. p. 123-129.

183. Borgstrom B. Mode of action of tetrahydrolipstatin: a derivative of the naturally occurring lipase inhibitor Iipstatin. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. v. 962. p. 308-316.

184. Hadvary p., Lengsfeld H., Wolfer H. Inhibition of pancreatic lipase in vitro by the covalent inhibitor tetrahydrolipstatin. // Biochem. J. 1988. v. 256. p. 357-361.

185. Gargouri Y., Chahinian H., MoreauH., Ransac S., Verger R. Inactivation of pancreatic and gastric Upases by THL and C12:0-TNB: a kinetic study with emulsified tributyrin. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. v. 1085. p. 322-328.

186. Ransac S., Gargouri Y., MoreauH., Verger R. Inactivation of pancreatic and gastric lipases by THL and akyl-dithio-5-(2-nitrobenzoic acid). A kinetic study with 1,2-didecanoyl-sn-glycerol monolayers. //Eur. J. Biochem. 1991. v. 202. p. 395-400.

187. Bjorkling F., Godfredsen S.E., Kirk O. A highly selective enzyme catalyzed esterification of simple glucosides. //J. Chem. Soc. Commun. 1989. v. 14. p. 934-935.

188. Adelhorst K., Bjorling F., Godtfredsen S.E., Kirk O. Enzyme catalyzed preparation of 6-0-acylglucopyranosides. // Synthesis. 1990. v. 5. p. 112-115.

189. Mutua L.N., Akoh C.G. Synthesis of alkyl glycoside fatty acid esters in nonaqueous media by Candida sp. lipase. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1993. v. 70. p. 43-46.

190. Scheckermann 'C., Schlotterbeck A., Schmid M., Wray V., Lang S. Enzymatic monoacylation of fructose by two procedures. // Enzym. Microb. Technol. 1995. v. 17. p. 157-162.

191. Janssen A.E.M., Lefferts A.G., van Riet K. Enzymatic synthesis of carbohydrate esters in aqueous media. // Biotechnol. Lett. 1996. v. 12. p. 711-716.

192. Lay L., Panza L., Riva S., Khitri M., Tirendi S. Regioselective acylation of disaccharides by enzymatic transesterification. // Carbohydrate Res. 1996. v. 291. p. 197-204.

193. Gao C., Whitcombe M.J., Vulfson E.N. Enzymatic synthesis of dimeric and trimeric sugar-fatty acid esters. // Enzym. Microb. Technol. 1999. v. 25. p. 264-270.

194. Riva S. Enzymatic modification of sugar moieties of natural glycosides. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002. v. 19. p. 43-54.

195. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Taino I.M., Marinone F., Toma L. Optically pure 10- and 3-O-p-D-glucosyI- and gactosyl-sn-glycerols through Iipase-catalyzed transformations. // Tetrahedron Lett. 1995. v. 36. p. 4865-4868.

196. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Taino I.M., Toma L. A facile lipase catalyzed access to fatty acid monoesters of 2-0-(3-glucosylglycerol. // Tetrahedron: Asymmetry. 1996. v. 7. p. 771-777.

197. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Toma L. Bioactive glycoglycerolipid analogues: an expeditious enzymatic approach to mono- and diesters of 2-O-p-D-galactosylglycerol. // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. v. 9. p. 2113-2119.

198. Nishino H., Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Toma L., Tokuda H., Compostella F. Chemoenzymatic synthesis and antitumor promoting activity of 6 and 3-esters of 2-0-b-D-glucosylglycerol.//Bioorg. Med. Chem. 1999. v. 7. p. 1867-1871.

199. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P., Boures E. Enzymatic synthesis of AHA derivatives for cosmetic application. // J. Mol. Cat. B: Enz. 1998. v. 5. p. 49-53.

200. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P. Boures E. Lipase-catalyzed a-butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermo-cosmetic application. // J. Biotechnol. 1999. v. 68. p. 61-69.

201. Manjon A., Iborra J.L., Arocas A. Short chain flavour ester synthesis by ommobilized lipase in organic media.//Biotechnol. Lett 1991. v. 13. p. 339-344.

202. Chulalaksananukul W., Condoret J.S., Combes D. Kinetics of geranyl acetate synthesisby lipase-catalyzed transesterification in n-hexane. // Enzyme Microb. Tecnol. 1.992. v. 14. p. 293-298.

203. Claon P.A., Akoh C.C. Effect of reaction parameters on sp435 lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in organic solvent. // Enzyme Microb. Technol. 1994. v. 16. p. 835-838.

204. Crosby J. Synthesis of optically active compounds: a large scale perspective. // Tetrahedron. 1991. v. 47. p. 4789-4846.

205. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. The biocatalytic approach to the preparation of enatiomerically pure chiral building blocks. // Chem. Rev. 1992. v. 92. p. 1071-1140.

206. Margolin A.L. Enzymes in the synthesis of chiral drugs. // Enzyme Microb. Technol. 1993. v. 15. p. 266-280.

207. Buchalska E., Plenkiewicz J. Synthesis of optically active aminooxy alcohols. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2001. v. 11. p. 255-263.

208. Ghanem A., Aboul-Enein H.Y. Application of lipase in kinetic resolution of racemates. //

209. Chirality. 2005. v. 17. p. 1-15.

210. Dordick J.S. Enzymatic and chemoenzymatic approaches to polymer synthesis. // Trends. Biotechnol. 1992. v. 10. p. 287-293.

211. Martin B.D., Ampofo S.A., Linhardt R.J., Dordick F.S. Biocatalytic synthesis of sugar cantaining poly (aery late)-based hydrogeles. // Macromolecules. 1992. v. 25. p. 7081-7085.

212. Sun Jun-she, Jiang ZHeng-qiang, Liu Ping. Enzymes and enzyme engineering and its applications. Pekin, Chemical Industry Press. 2006.

213. Тютюнников Б.Н., Гладкий Ф.Ф., Бухштаб З.И., Мельник А.П., Бутенев В.П., Демидов И.Н., Тимченко В.К., Перевалов Л.И. Химия жиров : Москва: Колос, 1992, С. 632.

214. А.Е.Степанов, Ю.М.Краснопольский. «физиологически активные липиды», Наука 1991.

215. Б.Албертс, Д.Брей, Дж.Лыоис. «Молекуляная биология клетки», «Мир» 1994г.

216. Р.П.Евстигнеева, Е.Н.Звонкова «Химия липидов», Москва химия 1983. 237] Л.П. Беззубов «Химия жиров», Москва, «Пищевая промышленность» 1975.

217. Poulos A. Very long chain fatty acids in higher animals- a review // Lipids. 1995. v.30. p. 1-14.

218. М.Г.Сергеева, A.T. Варфоломеева. Каскад арахидоновой кислоты. Москва, «Народное образование» 2006.

219. Dyerberg J., Bang Н.О., Stoffersen E. Eicosapentaenoic acid and prevention of thrombosis and atherosclerosis? //Lancet. 1978. v. 2. № 8081. p.117-119.

220. Kondo Т., Ogawa K., Stake T. Plasma-free eicosapentaenoic acid/arachidonic acid ratio: a possible new coronary risk factor // Clin.Cardiol. 1986. v. 9. № 9. p. 413-416.

221. Punnonen R., Jocela H., Kudo R. Serium lipids in Finnish and Japanese postmenopausal women // atherosclerosis. 1987. v. 68. № 3. p. 241-247.

222. Nordoy A., Lyingmo V., Vartun A., Svensson B. Docosapolyenoic fatty acids and human endothelial cells // Biochim. Biophys. Acta. 1986. v. 877. № 1. p. 31-36.

223. Rastogi В. K., Nordoy A. Lipid composition of cultured human endothelial cells // Thromb. Res. 1980. v. 18. № 5. p. 629-641.

224. Мевх A.T., Юськович A.K., Дуженко B.C. Полиненасыщенные жирные кислоты плазмы крови больных ишемической болезнью сердца до и после применения пищевой добавки, обогащенной кислотами класса омега-3 // Вестник. Моск. Ун-та. 1998.Т.39. № 1. с. 36-39.

225. Mevkh А.Т., Yuskovich А.К., Duzhenko V.S. Ratios of substrates and inhibitors ofprostaglandin synthesis in blood plasma of patients with heart ischemia I I Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. v. 61. № 1-2. p. 199-204.

226. Lands W.E. Biochemistry and physiology of n-3 fatty acids // FASEB J. 1992. v. 6. № 8. p. 2530-2536.

227. Bernardi G., Ed. New comprehensive biochemistry. Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes. / Ed. G. Bernardi. Amsterdam: Elsevier, 1996. v.31. p. 141-152.

228. Garcia M.C., Ward G., Ma Y.C. Effect of docosahexaenoic acid on the synthesis of phosphatidylserine in rat brain in microsomes and C6 glioma cells // J.Neurochem. 1998. v.70. № 1. p. 24-30.

229. Farooqui A.A., Horrocks L.A., Farooqui T. Glycerophospholipids in brain: their metabolism, incorporation into membranes, functions, and involvement in neurological disorders // CHem. Phys. Lipids. 2000. v. 106. № 1. p. 1-29.

230. Jump D.B. The biochemistry of n-3 polyunsaturated fatty acids //J. Biol. CHem. 2002. v. 277. № 11. p. 8755-8758.

231. Kim H.Y., Akbar M., Kimt K.Y. Inhibition of neuronal apoptosis by polyunsaturated fatty acid //J. Mol. Neurosci. 2001. v. 16. № 2-3. p. 223-227; 279-284.

232. Lauretzin I., Blondeau N., Heurteaux C. Polyunsaturated fatty acids are protent neuroprotectors // EMBO. J. 2000. v. 19. № 8. p. 1784-1793.

233. Innis S.M. Essential fatty acids in growth and development // Prog. Lipid Res. 1991. v. 30. № 1. p. 39-103.

234. Sprecher H. Metabolisim of highly unsaturated n-3 and n-6 fatty acids // Biochem. Biophys. Acta. 2000. v. 1486. № 2-3. p. 219-231.

235. Igal R.A., Mandon E.C., de Gomez Dumm I.N. Abnormal metabolisim of polyunsaturated fatty acids in adrenal glands of diabetic rats // Mol. Cell Endocrinol. 1991. v. 77. № 1-3. p. 217-227.

236. CHo H.P., Nakamura M., Clarke S.D. Cloning, expression, and fatty acid regulation of the human delta-5 desaturase//J. Biol. CHem. 1999. v. 274. № 52. p. 37335-37339.

237. Pan D.A., Lillioja S., Milner M.R. Sceletal muscle membrane lipid composition is related to adiposity and insulin action //J. Clin. Invest. 1995. v. 96. № 6. p. 2802-2808.

238. Moore S.A., Yoder E., Murphy S. Astrocytes, not neurons, produce docosahexaenoic acid (22:6, omega-3) and arachidonic acid (22:4 omega-6) // J. Neurochem. 1991. v. 56. № 2. p. 518-524.

239. Ziboh V.A., Miller C.C., CHo Y. Metabolism of polyunsaturated fatty acids by skin epidermal enzymes: generation of anti-inflammatory and antiprolifetativemetabolites // Am.J.Clin. Nutr. 2000. v. 71. № 1 Suppl. p. 361S-366S.

240. Cunnane S.C. Problems with essential fatty acids: time for a new paradigm? // Prog. Lipid Res. 2003. v. 42. № 6. p. 544-568.

241. Simopoulos A.P. Essential fatty acids in health and chronic disease // Am. J. Clin. Nutr. 1999. v. 70. № 3 Suppl. p. 560S-569S.

242. Burr M.L., Fehily A. M., Gilbert J.F. et al. Effects of changes in fat, fish, and fibre intakes on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART) // Lancet. 1989. v. 2. № 8666. p. 757-761.

243. De Lorgeril M., Renaud S., Mamelle N. et al. Mediterranean alpha-linolenic acid-rich diet in secondary prevention of coronary heart disease //Lancet. 1994. v. 343. № 8911. p.1454-1459.

244. Appel L .J., Miller E.R., Sedler A.J., Whelton P. C. Does supplementation of diet with 'fish oil' reduce blood pressure? A meta-analysis of controlled clinical trials // Arch. Intern. Med. 1993. v. 153. № 12. p. 1429-1438.

245. Raheja B.S., Sadikot S.M., Phatak R.B., Rao M.B. Significance of the N-6/N-3 ratio for insulin action in diabetes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. v. 683. p. 258-271.

246. Connor W.E., Prince M.J., Ullmann D. The hypotriglyceridemic effect of fish oil in adult-onset diabetes without adverse glucose control // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. v. 683. p. 337-340.

247. Kremer J.M. Effects of modulation of inflammatory and immune parameters in patients with chronic glomerular disease receiving dietary supplementation of n-3 and n-6 fatty acids // Lipids. 1996. v. 31 Suppl. p. S243-247

248. Donadio J.V., Bergstralh E.J., Offord K.P. A controlled trial of fish oil in IgA nephropathy. Mayo Nephrology Collaborative Group // N. Engl. J. Med. 1994. v. 331. № 18. p. 1194-1199.

249. Belluzzi A., Brignola C., Campieri M. Effect of an enteric-coated fish-oil preparation on relapses in Crohn's disease //N. Engl. J. Med. 1996. v. 334. № 24. p. 1557-1560.

250. SHahar E., Folsom A.R., Melnick S.L. Dietary n-3 polyunsaturated fatty acids and smoking-related chronic obstructive pulmonary disease. Atherosclerosis Risk in Communities Study Investigators //N. Engl. J. Med. 1994. v. 331. № 4. p. 228-233.

251. Simopoulos A.P. The traditional diet of Gree and cancer // Eur.J. Cancer Prev. 2004. v. 13. № 3. p. 219-230.

252. Watkins B.A., Li Y., Allen K.G. Dietary ratio of (n-6)/ (n-3) polyunsaturated fatty acids alters the fatty acid composition of bone compartments and biomarkers of bone formation in rats //J. Nutr. 2000. v. 130. №9.p. 2274-2284.

253. Raisz L.G. Prostaglandins and bone : physiology and pathophysiology // Osteoarthritis

254. Cartilage. 1999. v. 7. № 4. p. 419-421.

255. Yehuda S., Rabinovitz S., Carasso R.L., Mostofsky D.I. The role of polyunsaturated fatty acids in restoring the aging neuronal membrane // Neurobiol. Aging. 2002. v. 23. № 5. p. 843-853.

256. Yehuda S. Omega-6/omega-3 ratio and brain-related functions // World Rev. Nutr. Diet. 2003. v. 92. p. 37-56.

257. Surette M.E., Koumenis I.L., Edens M.B. Inhibition of leukotriene synthesis, pharmacokinetics, and tolerability of a novel dietary fatty acid formulation in healthy adult subjects // Clin. Ther. 2003. v. 25. № 3. p. 948-971.

258. Surette M.E., Edens M.B., Chilton F.H., Tramposch K.M. Dietary echium oil increases plasma and neutrophil long-chain (n-3) fatty acids and lowers serum triacylglycerols in hypertriglyceridemic humans //J. Nutr. 2004. v. 134. № 6. p. 1406-1411.

259. Bjerve K.S. Omega 3 fatty acid deficiency in man: implications for the requirement of alpha-linolenic acid and long chain omega 3 fatty acids // World Rev. Nutr. Diet. 1991. v. 66. p. 133-142.

260. Youdim K.A., Martin A., Joseph J.A. Essential fatty acids and the brain: possible health implications // Int. J. Dev.Neurosci. 2000. v. 18. p. № 4-5. p. 383-399.

261. Chen Hao., Jin Hua- li. Oil Chemistry: .Pekin: Chemical Industry Press, 2004.

262. Ye Jian-quan. Application of fatty acids and market analysis // The use of chemicals, science (China). 2005. v. 28. № 5. p. 2-7.

263. Wang Duo-ren. Fatty acid production and application // Industrial surfactants (China). 2000. v. 1. p. 10-12.

264. Zhu Pei-ji. Fatty Acid Production Technology Development // Food and grease (China). 2000. v. 1. p. 7-8.

265. Zeng Guang-su. China's production of fatty acid status and development proposals // Fine Chemicals. 1997. v. 14. № 6. p. 3-7.

266. Chang ZHi-cheng. Oil and chemical industry in the microbiological development and use of the new progress // Hebei Industry. 1994. v. 1. p. 36-39.

267. Xu Jia-li. Lipase and oil processing // Food and grease. 1994. v. 2. p. 3-7.

268. Su SHen-hao. Multi-fatty acids from the distillation. // Daily Chemical Industry. 1996. v. 6. p. 19-22.

269. Han Xi-jiang., Xu Ping., Meng Xiang-Ii. Preparation of High-Purity Linolenic Acid from oil of Lithospermum Erythrorhizon by Urea Inclusion and Column Chromatography // Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 2004. v. 13. p. 53-57.

270. Xiao Wei-hong., Gao Yu. Urea legal separation packages of rubber seed oil price of more than unsaturated fatty acids // Fine Chemicals. 2002. v.19. p. 12-15.

271. Huang Hui-qin., Bao Shi-xiang. More unsaturated fatty acids at separation and purification technology progress // Oil China. 1999. v. 24 p 32-34.

272. Domart C., Miyauchi D., Summerwed W. N. The Fractionation of Marine-oil Fatty acids with Urea. // JAOCS. 1955. v. 32. p. 481.

273. Shao Rong., Qian Ren-yuan., Qin Jin-ping., Yun Zhi., Shi Mei-ren. Supercritical carbon dioxide extraction technology in the of oil and fatty acid separation // Oil China. 2001. v. 26. p. 9-12.

274. Wang Jun-wu., Xu Song-lin., Xu Shi-min., Yu Ai-hua. The application of molecular distillation Status // Chemical progress. 2002. v. 21. p. 499-502.

275. Tianwei Tan., Fang Wang., Hua Zhang. Preparation of PVA/chitosan lipase membrane reactor and its application in synthesis of monoglyceride, // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2002. v. 18. Issues 4-6. p. 325-331.

276. XU Pei-yuan., ZHOU Xiao-wei., WANG Jun. Progress in field of catalyst used for preparation of monoglycerides. // China Surfactant Detergent & Cosmetics. 2007. v. 37. №. 4. p. 255-263.

277. CHAMGUI H. Production of mono-olein by immobilized Staphylococcus simulans in a solvent-free system: Optimization by response surface methodology. // J. Enzyme and Microbial Technology. 2006. v. 39. p. 717-723.

278. Yan Y., Bornscheuer UT., Schmid R.D. Applicationof crystallization technique for the lipase-catalyzed solid phase synthesisof sugar fatty acid monoesters. // J. Am.Oil.Chem.Soc. Press. 2001. v. 15. p. 168-175.

279. Yamaguchi S., Mase T. Ferment. Bioeng. 1991. v. 72. p. 162-167

280. Regine Haftendorn., Renate Ulbrich-Hofmann. Synthesis of 2-modified 1,3-diacylgliycerols. //Tetrahedron. 1995. v. 51. №. 23. p. 1177-1186.

281. Arnar Halldorsson., Carlos D. Magnusson., Gudmundur G. Haraldsson. Chemoenzymatic synthesis of structured triacylglycerols. // Tetrahedron Letters. 2001. v. 42. Issue 43. p. 7675-7677.

282. K.R. Kiran., S. Divakar. Lipase catalyzed synthesis of organic acid esters of lactic acid in non-aqueous media. // Journal of Biotechnology 2001. v. 87. p. 109-121.

283. Yomi Watanabe., Yuji Shimada., Yohie Yamauchi-Sato., Masaaki Kasai., Takaya Yamamoto., Kentaro Tsutsumi., Yoshio Tominaga., Akio Sugihara. Synthesis of MAG of CLA with Penicillium camembertii Lippase. //JAOCS. 2002. v. 79. №. 9. p. 891-896.

284. Yu-Yen Linko., Merja Liimsa., Xiaoyan Wu., Esa Uosukainen., Jukka Seppiila., Pekka Linko. Biodegradable products by lipase biocatalysis. // Journal of Biotechnology. 1998. v. 66.1351.sue 1. p. 41-50.

285. R Sengupta., D K Bhattacharyya. A comparative study between biorefining combined with other processes and physical refining of high acid mohua oil. // J. Am.Oil Chem Soc. 1992. v. 69. №. 11. p. 1146-1149.

286. Ganapati D.Yadav., Piyush S. Lathi. Lipase catalyzed transesterification of methyl acetoacetate with n-butanol. //Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005. v. 32. p. 107-113.

287. Mohamed M.Soumanou., Uwe T.Bornscheuer. Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil. // Enzyme and Microbial Technology. 2003. v. 33. p 97-103.

288. E. Pomier., J. Galy., D. Paulucci-Jeanjean., M. Pina., S. Sarrade., G.M. Rios. A new reactor design combining enzyme, membrane and SC C02: application to castor oil modification. // Journal of Membrane Science. 2005. v. 249. p. 127-132.

289. Mari'a E. Carri'n *, Guillermo H. Crapiste. Enzymatic acidolysis of sunflower oil with a palmitic-stearic acid mixture. // Journal of Food Engineering 2008, v. 84. p. 243-249.

290. Victor M.Balcao., F. Xavier Malcata. Lipase catalyzed modification of milkfat. // Biotechnology Advances. 1998. v. 16. Issue 2. p. 309-341.

291. K.G. Harding., von Blottnitz., S.T.L. Harrison. A life-cycle comparison between inorganic and biological catalysis for the production of biodiesel. // Journal of Cleaner Production. 2008. Science Direct. http://65.55.140.121/att/GetAttachment.asp

292. Neena N.Gandish. Applications of Lipase. // JAOCS. 1997. v. 74. №. 6. p. 621-633.

293. Stirton, A.J., Fat Splitting. Esterification and Interesterification, in Bailey's Industrial Oil and Fat Products, edited by A.E. Bailey and D. Swern, John Wiley & Sons, New York. 1964. p. 931-972.

294. Sonntag, N.O.V., Fat Splitting. //J. Am. Oil Chem. Soc. 1979. v. 56. p. 729A-732A.

295. Mukherjee, K.-D. Plant Lipases and Their Application in Lipid Biotransformations. // Prog. Lipid Res. 1994. v. 33. p. 165-174.

296. Kaufman, V.R., N. Garti. Organic Reactions in Emulsions—Preparation of Glycerol and Polyglycerol Esters of Fatty Acids by Transesterification Reaction. // J. Am. Oil Chem. Soc. 1982. v. 59. p. 471-474.

297. Park, Y.K., G.M. Pastore., M.M. DeAlmeida. Hydrolysis of Soyabean Oil by a Combined Lipase System. // Ibid. 1988. v. 65. p. 252-254.

298. C. Albasi., J.P. Riba., I. Sokolovska, V. Bales. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1997. v. 69. p. 329.

299. P. Villeneuve., J.M. Muderhwa., J. Graille., M.J. Haas. //J. Mol. Catal. B Enzym. 2000. v. 9. p. 113.

300. I-Son Ng., SHau-Wei Tsai. Investigation of lipases from various Carica papaya varieties for hydrolysis of olive oil and kinetic resolution of (R,S)-profen2,2,2-trifluoroethyl thioesters. // Process Biochemistry. 2006. v. 41. Issue3. p. 540-546.

301. Kong Ming., Yang Bo., Yao Ru Hua., Progress of Lipase-catalyzed Synthesis of Monoglyceride. // Oil China. 2003. v. 28. №. 7 p. 11-14.

302. Shimada Y., Sugihara A. Purification of y-Linolenic Acid from Borage oil by a two-step Enzymatic Method. // J Am oil CHem Soc. 1997. v. 11. p. 1465-1469.

303. Yemul O., Imae T. for an example of the successful application of an. immobilized enzyme in synthesis. // Biomacromolecules. 2005. v. 6. p. 2809.

304. Gao G., Zheng L-yu., Zhang Z-m., Han S-p., Gao S-g. Monitoring the hydrolysis of olive oil catalyzed by lipase via acid value detection. // Chem.Res. Chinese U. 2007. v. 23. p. 196-199.

305. Bilyk A, Bistline RG. Lipase-catalyzed triglyceride hydrolysis in organic solvent. // J Am Oil Chem Soc 1991. v. 68. p. 320-323.

306. Bistline RG. Lipase catalyzed formation of fatty amides. // J Am Oil Chem Soc 1991. v.68. p. 95-98.

307. Desnuelle P. Pancreatic lipase. // Adv Enzymol 1961. v. 23. p. 129-161.

308. Kawano Y, Kawasaki M, Shiomori K, Baba Y, Hano T. Hydrolysis kinetics of olive oil with lipase in a transfer cell. // J. Ferment Bioeng 1994. v. 77. p. 283-287.

309. Kierkels JGT, Vleugels LFW, Gelade ETF, Vermeulen DP, Kamphuis J, Wandrey C, van den Tweel WJJ. Pseudomonas flourescens lipase adsorption and the kinetics of hydrolysis in a dynamic emulsion system. // Enzyme Microb Technol 1994. v. 16. p. 513-521.

310. Tanigaki M, Sakata M, Wada H. Hydrolysis of soybean oil by lipase with a bioreactor having two different membranes. // J. Ferment Bioeng 1993. v. 75. p. 53-57.

311. Tanigaki., M., M. Sakata., H. Wada. Hydrolysis of Soybean Oil by Lipase with a Bioreactor Having Two Different Membranes. // J. Ferment. Bioeng. 1993 v. 75. p. 53-57.

312. Hedstrom G., M. Bucklund., J.P. Slotte. Enantioselective Synthesis of Ibuprofen Esters in AOT/Isooctane Microemulsions by Candida cylindracea Lipase. // Biotechnol. Bioeng. 1993. v. 42. p. 618-624.

313. Yang, D., J.S. Rhee. Continuous Hydrolysis of Olive Oil by Immobilized Lipase in Organic Solvent. // Ibid. 1992. v. 40. p. 748-752.

314. Garcia, H.S., F.X. Malcata., C.G. Hill Jr., C.H. Amundson. Use of Candida rugosa Immobilized in a Spiral Wound Membrane Reactor for the Hydrolysis of Milk Fat. I I Enzyme Microb. Technol. 1992. v. 14. p. 535-545.

315. Malcata, F.X., C.G. Hill Jr., and C.H. Amundson, Use of a Lipase Immobilized in a Membrane Reactor to Hydrolyze the Glycerides of Butteroil. // Biotechnol. Bioeng. 1991. v. 38. p. 853-868.

316. Tanaka, Y., T. Funada, J. Hirano, and R. Hashizume, Triglyceride Specificity of Candida cylindracea Lipase: Effect of Docosahexaenoic Acid on Resistance of Triglyceride to Lipase. // J. Am. Oil. Chem.Soc. 1993. v. 70. p. 1031-1034.

317. Tsai, S.-W., G.-H. Wu, and C.-L. Chiang, Kinetics of Enzymatic Hydrolysis of Olive Oil in Biphasic Organic-Aqueous Systems // Biotechnol. Bioeng. 1991. v. 38. p.761-766.

318. Chen, J.P., and K.-C. Chang, Lipase-Catalyzed Hydrolysis of Milk Fat in Lecithin Reverse Micelles. // J. Ferment. Bioeng. 1993. v. 76. p. 98-104.

319. Martinez, O., A.-M. Wilhelm, and J.-P. Riba, Kinetic Study of an Enzymatic Liquid-Liquid Reaction: The Hydrolysis of Tributyrin by Candida cylindracea Lipase. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1992. v. 53. p. 373-378.

320. Hayes, D.G., and R. Kleiman, 1,3-Specific Lipolysis of Lesquerella fendleri Oil by Immobilized and Reverse-Micellar Encapsulated Enzymes. // Ibid. 1993. v. 70. p. 1121-1127

321. Junker, B.H., M. Bhupathy, and B.C. Buckland, Development of a Recovery and Recycle Process for a Pseudomonas Lipase Used for Large-Scale Enzymatic Synthesis. // Ibid. 1993. v. 42. p. 487-493.

322. Prazeres, D.M.F., F. Lemos, F.A.P. Garcia, and J.M.S. Cabral, Modelling Lipolysis in a Reversed Micellar System: Part I. Conventional Batch Reactor. // Biotechnol. Bioeng. 1993. v. 42. p. 759-764.

323. Virto, M.D., J.M. Lascaray, R. Solozabal, and M. De Renobales, Enzymic Hydrolysis of Animal Fats in Organic Solvents at Temperatures Below Their Melting Points. // Ibid. 1991. v. 68. p. 324-326.

324. Yadwad, V.B., O.P. Ward., L.C. Noronha. Application of Lipase to Concentrate the Docosahexaenoic Acid (DHA) Fraction of Fish Oil. // Biotechnol.Bioeng. 1991. v. 38. p. 956-959.

325. Guit, R.P.M., M. Kloosterman., G.W. Meindersma., M. Mayer., E.M. Meijer. Lipase Kinetics: Hydrolysis of Triacetin by Lipase from Candida cylindracea in a Hollow-Fibre Membrane Reactor. // Ibid. 1991. v. 38. p. 727-732.

326. Rostrup-Nielsen, T., L.S. Pedersen., J. Villadsen. Thermodynamics and Kinetics of Lipase Catalyzed Hydrolysis of Oleyl Oleate. // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1990. v. 48. p. 467-482.

327. I.M. Noor, M., Hasan, K.B. Ramachandran. Effect of operating variables on the hydrolysis rate of palm oil by Lipase. // Process Biochemistry 2003. v. 39. p. 13-20.

328. Sulaiman Al-Zuhair., Masitah Hasan., K.B. Ramachandran. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of palm oil by lipase. // Process Biochemistry. 2003. v. 38 p. 1155-1163.

329. Sulaiman Al-Zuhair., K.B. Ramachandran., Masitah Hasan. High enzyme concentration model for the kinetics of hydrolysis of oils by lipase. // Chemical Engineering Journal 2004. v. 103. p. 7-11.

330. W.J. Ting., K.Y. Tung., R. Giridhar., W.T. Wu. Application of binary immobilized Candida rugosa lipase for hydrolysis of soybean oil. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2006. v. 42. p. 32-38.

331. Zhang Yu-Xia., Zhao Ji-Hua., Du Zhong-Yu. Enzymatic Activity of Candida rugosa Lipase in an AOT/TritonX-lOO Mixed Reverse Micellar System. // Acta phys.-Chim. Sin. 2007. v. 23(9). p. 1483-1486.

332. Tomoko Okada., Michael T, Morrissey. Production of n 3 polyunsaturated fatty acid concentrate from sardine oil by lipase-catalyzed hydrolysis. // Food Chemistry 2007. v. 103. p. 1411-1419.

333. ZAKS A., Klibanov A M. Enzymes catalysis in organic media at 100 °C. //J. Science. 1984. v. 224(4654). P. 1249-1253.

334. Мартинек К., Левашов A.B., Клячко H.JI., Хмельницкий Ю.Л., Березин И.В. Мицеллярная энзимология. // Биологические Мембраны. 1985. том. 2. №. 7. ст. 669-695.

335. GOTO М, KAMIYA N, NAKASHIO F. Enzymatic interesterification of triglyceride weth surfactant-coated lipase in organic media. // J]. Biotechnol Bioeng. 1995. v. 45(1). p. 27—32.

336. DORDICK J S. Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents.// J]. Enzyme Microb Technol. 1989. v. 11. p. 194—211.

337. GOTO M., KAMEYAMA H. Design of surfactants suitable for surfactant—coated enzymes as catalysts in organic media. // J] Chem Eng Jpn. 1993. v. 26 (1). P. 109—111.

338. OKHATA Y. FUJIMOTO Y. IJIRO К A. A lipid — coated lipase as an enantioselective ester syn—thesis catalyst in homogeneous organic solvents. // J Org Chem, 1995. v. 6o. p. 2244—2250.

339. H. Sovova., M. Zarevucka. Lipase-catalysed hydrolysis of blackcurrant oil in supercritical carbon dioxide // Chem. Eng. Sci. 2003. v. 58. p. 2339-2350.

340. Erbeldinger M., Ni X., Hailing P.J. Enzymatic synthesis with mainly undissolved substrates at very high concentrations from analytical to preparative scale // J] Enzyme and Microbial Technology. 1998. v. 23. p. 141—148

341. HAILING P J. Biocatalysis in low-water media: understanding effects of reaction conditions . // J]. Curr Opin Chem Biol. 2000. v. 4. p. 74-80.

342. Valerie Dossat, Didier Combes, Alain Marty. Lipase-catalysed transesterification of high oleic sunflower oil. // J] Enzyme and Microbial Technology, 2002. v. 30. p. 90-94.

343. К Martinek., A V Levashov., N L Klyachko., I V Berezin. Catalysis by watersoluble enzymes against denaturation (inactivation) during their inclusion in inverted miclles of a surfactant. // Dokl Akad Nauk SSSR. 1977. 236: 920.

344. Frank S.G., Zografi GJ. Solubilization of water by dialkyl sodiumsulfosuccinates in hydrocarbon solutions. // J. Colloid and Interface Sci. 1969.v. 29. p. 27-35.

345. Левашов A.B., Клячко Н.Л. Мицеллярная энзимология: методы и техника. // Известия АН. Серия химическая. 2001. 10: ст. 1638-1651.

346. Levashov A.V., Klyachko N.L. Interfacial catalysis. A. Volkov (Ed.), Basel: Marcel Deccer, New York, 2002. p. 355-376.

347. И.М. Павленко., Н.Л. Клячко., А.Влевашов. Влияние химической модификации липазы на регуляцию липолитической активности в системе обращенных мицелл. // Биоорганическая химия. 2005. Т. 31. стр. 518-524.

348. И.М. Павленко., Н.Л. Клячко., А.Влевашов. Биферментная система «липаза/липоксигеназа» в обращенных мицеллах АОТ в октане. // Биоорганическая химия. 2002. Т. 28. стр. 50-55.

349. К. Холмберг., Б. Йёнссон., Б. Кронберг., Б. Линдман. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах. Москва, БИНОМ. Лаборотория знаний 2007.

350. Sulaiman Al-Zuhair., К.В. Ramachandran., Masitah Hasan. Unsteady-state kinetics of lipolytic hydrolysis of palm oil in a stirred bioreactor. // Biochemical Engineering Journal 2004. v. 19. p. 81-86.

351. Treves C., Vincenzine M.T., Eavilli F., Vanni P., Baccari V. Can. //J. Biochem. 1984. v. 62. p. 55-59.

352. Schoor W.P., Melius P. The influence of sodium taurocholate on the pancreatic lipase substrate adsorbtion and activity // Biochim. Biophys. Acta. 1970. v. 212. p. 173-175.

353. Shimon G., Tamas B. Rate equation curves for enzymatic reactions which utilise lipids as substrates-II. Effect of adsorption of the substrate or enzyme on the steady-state kinetics. // Biochim Biophys Acta 1977. v. 488. p. 13-24.

354. Bilyk A., Bistline RG. Lipase-catalyzed triglyceride hydrolysis in organic solvent. // J Am Oil Chem Soc 1991. v. 68. p. 320-323.

355. Tsai SW., Chang CS. Kinetics of lipase-catalyzed hydrolysis of lipid in biphasic organic -aqueous systems. // J Chem Technol Biotechnol. 1993. v 57. p. 147 -154.

356. Khor HT., Tan NH., Chua CL. Lipase catalysed hydrolysis of palm oil. // J Am Oil Chem141

357. Soc 1986. v. 63. p. 538-540.

358. Kim T., Chung K. Some characteristics of palm oil kernel olein hydrolysis by Rhizopus arrhizus lipase in reversed micelle of AOT in iso -octane and additive effects. // Enzyme Microb Technol. 1989. v. 11. p. 528-531.

359. Knezevic ZD., Siler-Marinkovic SS., Mojovic LV. Kinetics of lipase-catalysed hydrolysis of palm oil in lecithin/isooctane reversed micelles. // Appl Micrbiol Biotechnol. 1998. v. 49. p. 267-271.

360. Gan Q., Rahmat H., Weatherley LR. Simultaneous reaction and separation in enzymatic hydrolysis of high oleate sunflower oilevaluation of ultrafiltration performance and process energy. // Chem Eng J 1998. v. 71. p.87-96.

361. Rooney D., Weatherly LR. The effect of reaction conditions uponlipase catalysed hydrolysis of high oleate sunflower oil in a stirred liquid/liquid reactor. // Process Biochem. 2001. v. 36. p. 947-953.

362. Murray M., Rooney D., Van Neikerk M., Montenegro A., Weatherley1.. Immobilization of lipase onto lipophilic polymer particles and application to oil hydrolysis. // Process Biochem. 1997. v. 32. p. 479-486.

363. Gandhi NN., Vijayalakshmi V., Sawant BS., Joshi JB. Immobilization of Mucor miehei lipase on ion exchange resins. // Biochem Eng

364. J 1996. v. 61. p. 149-156.

365. I.M. Noor., M. Hasan., K.B. Ramachandran. Effect of operating variableson the hydrolysis of palm oil by lipase. // Proc. Biochem. 2003. v. 39. p. 13-20. ~

366. S. Al-Zuhair., M. Hasan., K.B. Ramachandran. Kinetic hydrolysis of palm oil using lipase. // Proc. Biochem. 2003. v. 38. p. 1155-1163.

367. S. Al-Zuhair., M. Hasan., K.B. Ramachandran. Unsteady-state kinetics of lipolytic hydrolysis of palm oil in a stirred bioreactor // Biochem. Eng. J. 2004. v. 19. p. 81-86.

368. S. Al-Zuhair., M. Hasan., K.B. Ramachandran. High enzyme concentration model for the kinetics of hydrolysis of oils by lipase. // Chem. Eng. J.2004. v. 103. p. 7-11.

369. S.W. Tsai., C.S. Chang. Kinetics of lipase-catalysed hydrolysis of lipidsin biphasic organic-aqueous systems. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1993. v. 57. p. 147-154.

370. R. Verger., C.E.M. Maria., H.D. Gerard. Action of phospholipase A at interfaces. // J. Biol. Chem. 1973. v. 248 (11) p. 4023^034.

371. S. Al-Zuhair., K.B. Ramachandran., M. Hasan. Investigation of the specific interfacial area of a palm oil-water system. // J. Chem. Technol. Biotecnol.2004. v. 79. p. 706-710.

372. M.M. Shamel., К.В. Ramachandran., M. Hasan. Operational stability oflipase enzyme: effect of temperature and shear. // Dev. Chem. Eng. Min. Process. 2005. v. 13 (5/6). p. 599-604.

373. H. Campbell., C.A. Long. Emulsification by ultrasonics. // Pharm. J. 1949. v. 163 (8). p. 127-128.

374. C. Bondy., K. Sollner. On the mechanism of emulsification by ultrasonic waves // Faraday Soc. 1935. v. 31. p. 843-846.

375. O. Behrend., К. Ax, H. Schubert, Influence of continuous phase viscosity on emulsification by ultrasound // Ultrasonics Sonochem. 2000. v. 7.p. 77-85.

376. O. Behrend, H. Schubert, Influence of hydrostatic pressure and gas content on continuous ultrasound emulsification. // Ultrasonics Sonochem. 2001. v. 8. p. 271-276.

377. R. Chanamai., J.N. Coupland., D.J. McClements. Effect of temperature on the ultrasonic properties of oil-in-water emulsions. // Colloids Surf. A: Physiochem. Eng. Aspects 1998. v. 139. p. 241-250.

378. C. Li, M. Yoshimoto., N. Tsukuda, K. Fukunaga, K. Nakao. A kineticstudy on enzymatic hydrolysis of a variety of pulps for its enhancement with continuous ultrasonic Irradiation. // Biochem. Eng. J. 2004. v. 16. p. 155-164.

379. S. Freitus., G. Hielscher., H.P. Merkle. Continuous contact- and contamination-free ultrasonic emulsification—a useful tool for pharmaceutical development and production. // Ultrasonics Sonochem. 2005. v. 13 p. 76-85.

380. ТРИВЕНЫ. Иммобилизованные ферменты: «Мир» 1983г.

381. Pan Tao-Jiang The development and utilization of seeds Safflower // Oil China. 2001. v.26. No 2. p 57-58.