Липазы в системе обращенных мицелл тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

Павленко Иванна Михайловна

ЛИПАЗЫ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ: РОЛЬ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В РЕГУЛЯЦИИ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Левашов А.В.

доктор химических наук, профессор Клячко Н.Л.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямс ков И.А.

кандидат химических наук РотановаТ.В.

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « 20 » сентября 2005 г. в 1600 ч на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан « » августа 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

j-tfrptfp

Л0Ч1С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Липазы (гидролазы триглицеридов) играют ключевую роль в обмене и трансформации липидов всех живых организмов, а также участвуют в процессах отложения и утилизации жира, используемою в качестве энергетического резерва клетки. Липазы не только гидролизуют триглицериды до ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот, но также способны катализировать с высокой стереоспецифичностью ацилирование и деацилирование большого числа субстратов, отличных от глицеридов В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез В результате, в последнее время особое внимание уделяется оптимизации биокаталитических характеристик этого фермента.

Исключительной особенностью липазы, отличающей ее от других эстераз, является свойство поверхностной активации фермента в присутствии агрегированных жировых капель, что обусловлено формированием активной конформации фермента в результате его адсорбции на поверхности липида. В литературе имеются указания на то, что адсорбция липазы на межфазной поверхности является определяющим фактором катализа липазой, предшествуя образованию фермент-субстратного комплекса Очевидно, что эффективность взаимодействия липазы с поверхностью липида будет зависеть как от свойств межфазной поверхности (заряда, плотности, поверхностного натяжения и т.д.), так и от свойств самого фермента, в том числе от наличия на его поверхности функциональных групп углеводной и липиднои природы. Вопрос о роли взаимодействия липазы с межфазной поверхностью в регуляции активности фермента представляет, с одной стороны, фундаментальный интерес для понимания закономерностей механизма катализа липазами разной природы, а с другой стороны, имеет прикладное значение, заключающееся в возможности контролировать липолитический процесс in vitro и направленно регулировать катализ липазами при решении биотехнологических задач В связи с этим, для решения данного вопроса представляется весьма удобной система обращенных мицелл, используемая для моделирования мембранного окружения ферментов и проведения биокаталитических процессов.

На сегодняшний день определение активности липаз по-прежнему остается непростой

задачей, а существующие высокочувствительные методы имеют ряд недостатков, связанных либо

с использованием синтетических субстратов, к которым липазы проявляют низкую активность,

либо с неприменимостью методов в природных средах или системах, содержащих амфифильные

соединения, способные связывать субстраты и продукты липолитических реакций В связи с этим

весьма актуальной стоит задача разработки простого и непрерывного метода слежения за

липолитической активностью по отношению к природным шш лицеридам.

«>с. илцион/uf / '

БИБЛИОТЕКА

1 s*srzfft\

Цель работы. Одной из целей работы явилось выявление регуляции липолитической и синтетической активности липаз разной природы (панкреатической липазы свиньи и липаз из Мисог тгекег и СкготоЬааепит \44cosum) в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане путем варьирования параметров системы (числа и размера мицелл) и химической модификации поверхности фермента (дополнительной гидрофилизации и гидрофобизации) Другой задачей работы явилась разработка непрерывного метода определения активности липазы с помощью биферментной системы "липаза / соевая липоксигеназа-Г', а также установление принципиальной возможности использования данной биферментной системы в качестве тест-системы для оценки содержания биологически важных полиненасыщенных жирных кислот в составе пищевых триглицеридов

Научная новизна. В работе впервые обнаружена регуляция активности липаз разного происхождения и природы в системе обращенных мицелл в результате изменения концентрации ПАВ при фиксированном значении степени гидратации Показано что эффективность взаимодействия липазы с межфазной поверхностью мицелл, приводящая к поверхностной активации фермента, зависит от природы липазы, определяемой наличием на поверхности фермента функциональных групп углеводной или липидной природы В ходе работы впервые получены препараты липазы из М тгеИег, модифицированные остатками целлобиозы и пальмитиновой кислоты, и установлено влияние химической модификации поверхности липазы на тип регуляции активности фермента изменением концентрации ПАВ в мицеллярной системе Изучена синтетическая активность липаз разного происхождения на примере реакции ацилирования ацикловира в системе обращенных мицелл и показано, что характер регуляции выхода продукта реакции изменением концентрации ПАВ зависит от природы используемого фермента. Установлено, что присутствие углеводной оболочки или липидных остатков на поверхности липаз вносит значительный вклад в стабильность ферментов в системе обращенных мицелл. Разработан непрерывный метод определения активности липаз с помощью биферментной системы "липаза / соевая липоксигеназа-Г' Предлагаемый метод отработан на примере липаз разной природы с использованием трилинолеина и ненасыщенных триглицеридов пищевых масел Показана принципиальная возможность использования биферментной системы для оценки биологического качества пищевых масел по содержанию в них биологически важных цис-изомеров полиненасыщенных жирных кислот.

Практическая значимость работы. В работе показано, что взаимодействие липаз с межфазной поверхностью обращенных мицелл играет важную роль в регуляции каталитической активности ферментов, характер которой сильно зависит от наличия на поверхности липаз функциональных групп углеводной или липидной природы. Как показано в данной работе, эффективность взаимодействия липазы с мицеллярной поверхностью и, как следствие, каталитическую активность фермента можно регулировать дополнитетельной гидрофилизацией и

гидрофобизацией липазы и варьированием концентрации воды и ПАВ в мицеллярной системе. Полученные результаты представляются важными для понимания принципов катализа липазами разной природы и возможности направленной регуляции катализируемых липазами реакций, используемых для решения биотехнологических задач в пищевой промышленности и тонком органическом синтезе.

В данной работе разработан простой непрерывный метод определения активности липазы по отношению к природному триглицериду с помощью биферментной системы "липаза / соевая липоксигеназа-t", включающий лшюлитическое высвобождение полиненасыщеннои жирной кислоты из триглицерида и последующее липоксигеназное окисление полиненасызденной жирной кислоты до ее гидропероксида, регистрируемого спектрофотометрически.

На сегодняшний день одной из важных практических задач в медицине и пищевой промышленности стоит проблема переработки жиров и получения триглицеридов, содержащих биологически важные полиненасыщенные жирные кислоты. Конечные продукты метаболического превращения полиненасыщенных жирных кислот, содержащих 1,4-цис,цис-пентадиенильный фрагмент и являющихся субстратами липоксигеназ, представляют собой биологически важные вещества (лейкотриены, тромбоксаны, простагландины и др.), выполняющие регуляторную функцию и вовлеченные в иммунную систему организма человека В свете данной проблемы, предлагаемая нами биферментная система "липаза / соевая липоксигеназа-1" может оказаться удобной тест-системой для оценки биологического качества пищевых масел и жиров, заключающегося в содержании в них биологически важных полиненасыщенных жирных кислот Предлагаемая тест-система может быть также полезной для определения степени окисления пищевых масел при их хранении.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах' международная конференция "Biocatalysis-2000: Fundamentals and application" (Москва, Россия, 2000); 6-ая международная сессия "Gordon Research Conference on Biocatalysis" (Menden, USA, 2000), 5-ый международный симпозиум "BioTrans-2001" (Darmstadt, Germany, 2001); международная конференция EURESCO "Reactivity in Organized Microstructures" (Aquafredda di Maratea, Italy, 2002), конференция молодых ученых "Инженерная энзимология" (Москва, Россия, 2003); 2-ая международная конференция "Highly Organized Catalytic Systems" (Москва, Россия, 2004); 12-ый международный симпозиум "Bioencapsulation" (Vitoria-Gasteiz, Spain, 2004).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 450 ссылок. Работа изложена на 184 страницах, содержит 75 рисунков и 17 таблиц

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объекты исследования. В качестве объектов исследования выбраны широко используемые на практике липазы: панкреатическая липаза свиньи (PPL, L3126, Sigma, США), грибная липаза из Mucor miehei (MmL, L0931, Sigma, США) и бактериальная липаза из Chromobactenum viscosum (CvL, L0763, Sigma, США), а также соевая липоксигеназа-1 (LOX-1, L7395, Sigma, США)

PPL (50 кДа) очищали от примесных белков (ниже 30 кДа) с помощью гель-фильтрации (Sephadex G50) или методом ультрафильтрации Данный препарат PPL не содержит колипазу (10 кДа) Согласно литературным данным, PPL является гликозилированным ферментом на 1 моль PPI. приходится 3 8 моль маннозы, 2 9 моль Л'-ацетилг люкозамина, 0 5-1 моль фукозы и до 1 моль глюкозы и галактозы Используемый препарат MmL (33 кДа) не содержит примесные белки, липидные и углеводные группы. С помощью аффинной хроматографии (ConA Sepharose) выделены гликозилированная форма CvLA (120 кДа) и негликозилированная форма CvLB (30 кДа) В литературе имеются данные, что CvLA представляет собой тетрамер CvLB, стабилизированный липополисахаридами На 1 моль Cvl А приходится 4 моль глюкозы, 1 моль N-ацетилглюкозамина и 0 2 моль длинноцепочечной жирной кислоты. Анализируемый препарат LOX-1 (100 кДа) не содержит примесные белки

Методы исследования. Активность липаз в водных растворах и в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане определяли по начальной скорости накопления л-нитрофенола (NP) в результате ферментативного гидролиза n-нитрофенилпальмитата (NPP) при непрерывной фотометрической регистрации при 400 нм и 35°С Коэффициенты экстинкции NP в водных и мицеллярных растворах при разных значениях рН и w„ определены экспериментально

Активность LOX-1 в водных растворах и в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане определяли по начальной скорости накопления гидропероксида линолевой кислоты (LAHP) в результате ферментативного окисления линолевой кислоты (LA) при непрерывной фотометрической регистрации при 245 нм и 25°С. Коэффициенты экстинкции LAHP в водных растворах и в обращенных мицеллах не зависят от рН и и>(|

Химическую модификацию МН2-групп I ys на поверхности молекулы MmL целлобиозой и Л'-гидроксисукцинимидом пальмитиновой кислоты проводили в водном растворе при 4°С в течение 12 часов. Модифицированные препараты липазы очищали с помощью гель-фильтрации (Sephadex G25) Степень модификации липазы определяли титрованием свободных Lys трининробензолсульфокислотой (TNBS)

Седиментационный анализ липаз, солюбилизованных в системе обращенных мицелл, проводили по стандартной методике

За собственной флуоресценцией липаз в водном растворе и в системе обращенных мицелл следили в диапазоне длин волн 320-450 нм при длине волны возбуждения, равной 295 нм Спектры флуоресценции липаз получали, вычитая фон, создаваемый растворителем

Реакцию ацилирования ацикловира (2-амино-9-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,9-дигидропурин-6-он) линолевой кислотой, катализируемую липазами в системе обращенных мицелл, проводили при 35°С. Через 15 и 25 часов реакционную систему разделяли на водный и органический слой. Органическую фазу, содержащую модифицированный ацикловир, очищали от АОТ на колонке с силикагелем и проводили ВЭЖХ анализ на колонке Диасфер 110-С18.

Кинетические параметры биферментного процесса в водных растворах и в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане определяли по начальной скорости накопления LAHP в результате последовательного липолиза трилинолеина (TL) и липоксигеназного окисления высвобожденной LA при непрерывной фотометрической регистрации при 245 пм и 35°С

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кинетические характеристики липолиза в водном растворе и в системе

обращенных мицелл.

Из литературных данных известно, что катализ липазой на границе раздела фаз "липид / вода" включает обратимую стадию адсорбции фермента на поверхности липида, предшествующую образованию фермент-субстратного комплекса и при определенных условиях являющуюся скорость лимитирующей стадией Очевидно, что продолжигельносгь лаг-периода, включающего времена сорбции фермента и образования фермент-субстратного комплекса, будет зависеть от эффективности взаимодействия фермента с поверхностью липида, определяемой многими факторами и, в первую очередь, свойствами межфазной поверхности и поверхности самого фермента

Согласно полученным в работе данным (Рис 1), для катализа MmL и CvLB, не содержащих углеводные группы, лаг-фаза отсутствует в водном растворе и весьма незначительна в системе обращенных мицелл В то же время, липолиз i ликозилированными липазами, PPL и CvLA, характеризуется достаточно продолжительной лаг-фазой как в водном растворе, так и в системе обращенных мицелл По-видимому, наличие углеводных групп вблизи каталитического центра фермента затрудняет контакт липазы с межфазной поверхностью (липида или мицеллы) и препятствует активации липазы на границе раздела фаз .

Установлено, что для катализа липазами в системе обращенных мицелл не требуются такие активаторы, как ионы Са2+ и соли желчных кислот, способные значительно ускорять липолиз в

*В водном растворе липаза находится r конформации, при которой активный центр фермента закрыт амфифильной петлей и недоступен субстрату. В результате адсорбции липазы на поверхности жировой капли происходит конформационное изменение положения петли, открывающее активный центр фермента и способствующее формированию протяженной гидрофобной поверхности, облегчающей связывание субстрата.

Рис. 1. Кинетические кривые реакции гидролиза №Р, катализируемой СЧ-ГА и СМ,В в водной среде (А) и в системе обращенных мицелл (Б)- (А) 50 шМ Трис (рН 8 0), [СМ А] 0 06 цМ, [СуЬВ] 0.2 цМ, [ЫРР] 3 тМ, 35°С, (Б) 50 шМ АОТ / 50тМ Трис (рН 8 0), [СуЬА] 0 1 цМ, [СуЬВ] 0.4 цМ, [ЫРР] 1.3 тМ, 35°С

водном растворе (Рис.2,3) Так, увеличение ионов Са2г в водном растворе приводит к росту начальной скорости липолиза для всех анализируемых липаз, при этом активность РРЬ, МтЬ, СуЬА и СуЬВ увеличивается в 3, 5, 5 и 10 раз при достижении 0.5, 3 5, 2 6 и 0 5 тМ Са2+, соответственно. В системе обращенных мицелл максимальная активация РРЬ, МгпЬ, СуЬА и СуЬВ составляет 1.2, 1.2, 1.5 и 2 раза при введении 0 016, 0 06, 0.5 и 0.4 тМ Са2+, соответственно. Поскольку жирные кислоты, высвобожденные в результате гидролиза ЫРР, в системе обращенных мицелл локализованы на межфазной границе, они не оказывают значительного ингибирующего действия на фермент, солюбилизованный во внутренней (водной) полости мицеллы Таким образом, основная задача ионов Са2*, заключающаяся в отводе жирных кислот от фермента путем образования солей, не имеет большого значения в системе обращенных мицелл. Несмотря на слабый эффект активации липаз ионами Са2, в мицеллярной системе, присутствие это: о

1 2 з

[Са2*], тМ

0 05 0 1 0 16

[Са2*], тМ

Рис. 2. Зависимость начальной скорости гидролиза NPP, катализируемого PPL в водной среде (А) и в системе обращенных мицелл (Б), от концентрации Са2+: (А) 50 тМ Трис (рН 8 5), [PPL] 1.6 цМ, [NPP] 0.4 тМ, 35°С; (Б) 100 тМ АОТ (w„ 15) / 50тМ Трис (рН 8 5), [PPL] 2 цМ, [NPP] 0.6 тМ, 35°С;

02 03

[ТОС], тМ

02

[ТОС], тМ

Рис. 3. Зависимость начальной скорости гидролиза ЫРР, катализируемого МтЬ в водной среде (А) и в системе обращенных мицелл (Б), от концентрации ТБС (А) 50 шМ Трис (рН 7 5), [МтЬ] 1 цМ, [№Р] 0.2 тМ, 35°С: (Б) 50 тМ АОТ (и'0 16) / 50шМ Трис (рН 7 5), [МтЬ] 1 цМ. [ЫРР] 0 15 тМ, 35°С;

активатора значительно уменьшает лаг-период липолиза NPP. Возможно, при небольшой концентрации ионы Са2+ взаимодействуют с сульфогруппами молекул АОТ, снижая заряд на межфазной поверхности, что способствует улучшению взаимодействия липаз с поверхностью и образованию фермент-субстратно! о комплекса.

Согласно полученным данным, начальная скорость гидролиза КРР, катализируемого РРЬ и МтЬ в водном растворе, увеличивается в 2 и 3 раза при введении 25 и 100 цМ тауродезоксихолата натрия (ТОС), соответственно В системе обращенных мицелл увеличение начальной скорости липолиза для РРЬ и МтЬ составляет 1.5 и 1.7 раза при концентрации ТТ)С, равной 1 и 50 цМ, соответственно Поскольку в системе обращенных мицелл роль межфазной поверхности играет мицеллярная матрица, а субстрат растворим в органической фазе, то роль холатов в мицеллярной системе также незначительна, как и влияние ионов Са2+ Присутствие даже весьма низких

ОВ 12

[ЫРР], тМ

[№Р], тМ

Рис. 4. Зависимость начальной скорости гидролиза ОТР, катализируемого СМ.А и СуЬВ в водной среде (А) и в системе обращенных мицелл (Б), от концешрации субстрата (А) 50 тМ Трис (рН 8 0) / 0.1% ТОС, [СуЬА] 0.06 цМ, [СуЬВ] 0.2 цМ, 35°С, (Б) 50 тМ АОТ 12) / 50 тМ Трис (рН 8.0), [СуЬА] 0.12 цМ, [СуЬВ] 0.2 цМ, 35°С;

концентраций TDC в водном растворе и в системе обращенных мицелл способствует увеличению лаг-периода липолитической реакции, что может быть связано с образованием смешанных мицелл субстрата с TDC в водном растворе, а также с изменением свойств мицеллярной поверхности в результате формирования смешанных мицелл АОТ с TDC

В системе обращенных мицелл, в отличие от водного раствора не наблюдается эффект ингибирования анализируемых липаз субстратом даже при его высоких концентрациях (Рис 4) По-видимому, концентрирование субстрата в органической фазе мицеллярной системы способствует уменьшению локальной концентрации субстрата вблизи фермента, что приводит к снятию эффекхаингибирования фермены субстратом.

2. Регуляция олигомерного состава липаз в системе обращенных мицелл. Зависимости каталитической активности всех анализируемых липаз от степени гидратации мицелл (w0 = [Н2О] / [ПАВ]) имеют вид кривых с двумя четко выраженными максимумами при w015 и 30 для PPL, w0 16 и 30 для MmL и», 12 и 30 для CvL А и CvL В, соответственно (Рис.5) Известно, что оптимальная каталитическая активное! ь ферментов, солюбилизованных в мицеллы, наблюдается в условиях геометрического соответствия размеров белка и мицеллярной матрицы По-видимому, условия тесного контакта фермента с мицеллярной оболочкой позволяют поддерживать каталитически активную конформацию фермента

Сопоставляя значения наибольшей полуоси молекул липаз с радиусом внутренней полости мицеллы, приведенных в Табл.1, можно предположить функционирование MmL, CvLA и CvLB в форме мономера в условиях первого оптимума каталитической активности этих липаз Учитывая вытянутую, эллипсоидную форму молекулы PPL, наибольшая полуось которой равна 48 А, можно было бы предположить проявление этой липазой максимальной активности при w„ 30, при которой радиус внутренней полости мицеллы равен 48 А. Однако, обнаружение оптимума активности PPL при меньшей степени гидратации (w0 15) может быть вызвано частичным

0 050

Рис. 5. Зависимость k^t гидролиза NPP, катализируемого PPL, MmL (А) и CvLA, CvLB (Б), от степени гидратации мицелл (wa). (А) 50тМ АОТ / 50тМ Трис (рН 8.5 для PPL и рН 7.5 для MmL), (Б) 0.1М АОТ / 50шМ Трис (рН 8.0), 35°С

Таблица 1. Значения размеров молекул липаз и внутренней полости мицеллы при оптимальной степени гидратации, соответствующей максимальной активности ферментов

Липаза a*b*c, А размер главных осей молекулы белка гр,А 'Л наибольшей оси молекулы белка Н*« опт 'm* А радиус внутренней полости мицеллы, рассчитанный по формуле- гт = 1.5w„+4

MmL 38*25*50 25 16 28

CvL мономер 45*50*45 25 12 22

PPL 96*45*38 48 15 27

N-домен 58*47*41 29 - -

С-домен 25*28*48 24 - -

погружением фермента в мицеллярную матрицу гидрофобным С-концевым доменом (Рис 6), отвечающим за связывание фермента с колипазой и гидрофобной поверхностью липида. В этом случае, каталитический N-концевой домен PPL, содержащий углеводную часть, очевидно, будет локализован в водной полости мицеллы В пользу данного предположения свидетельствует размер главной полуоси N-концевого домена PPL (29 А), соизмеримый с внутренним радиусом мицеллы при w0 15 (27 А), а также установленный сдвиг максимума собственной флуоресценции PPL в коротковолновую область на 7 нм при переходе от водного раствора к системе обращенных мицелл (Рис 8А) При погружении С-концевого домена в мицеллярную матрицу остаток Тгр 339, принадлежащий С-концевому домену и расположенный на границе между С- и N-доменами (Рис б), оказывается погруженным в гидрофобную часть мицеллярной оболочки, что приводит к сдвигу максимума интенсивности флуоресценции в коротковолновую область

Наличие второго оптимума каталитической активности каждой из липаз при и<„ 30 свидетельствует о способности анализируемых ферментов образовывать высокомолекулярные агрегаты с более высокой каталитической активностью, чем у мономера.

9

N-концевой домен С-концевои домен

каталитический центр: Ser153-His264-Asp177

Рис. 6. Структура молекулы PPL' N-концевой домен (синий) содержит каталитический центр фермента и участок гликозилирования, С-концевой домен (красный) отвечает за связывание липазы с колипазой и гидрофобной поверхностью субстрата.

Таблица 2. Молекулярная масса олигомерных форм липаз (Мр), функционирующих в системе обращенных мицелл при разных значениях н>0

Липаза Л/р,кДа

мономер (w„ 10-25) димер К 25-30) тетрамер К 25-40)

PPL 52.4 ±38 105.6 ±2.7 207 4 ±2.8

MmL 33.2 ±2.5 68.8 ±2.5 134.7 ± 2.4

CvLA 32.1 ± 1.6 - 126 3 ±2.1

CvLB 30 1 ± 1.4 - 120 8 ±2.1

Методом седиментационного анализа было установлено существование каждой из липаз в виде нескольких олигомерных форм (Табл 2), образование которых контролируется степенью гидратации мицелл (их размером) Полученные данные седиментационного анализа подтверждают существование активных мономеров и тетрамеров липаз в условиях первого и второго оптимумов на зависимостях активности ферментов от степени гидратации мицелл Формирование димерных форм PPL и MmL наблюдается в достаточно узком диапазоне значений w0 и не отражается в виде отдельных пиков активности, что, по-видимому, является промежуточной стадией образования более активных тетрамеров этих липаз

Константа Михаэлиса (Кт) гидролиза NPP, катализируемого исследуемыми липазами, практически не зависит от степени гидратации мицелл В связи с этим, значение константы эффективности (kcal/Km) для каждой липазы также максимально при ранее установленных оптимальных значениях w„ 3. Регуляция каталитической активности липаз изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл. Ферменты, функционирующие в системе обращенных мицелл, можно разделить на две группы' способные и неспособные взаимодействовать с мицеллярной матрицей Тестом на мембраноактивность ферментов является зависимость их каталитической активности от концентрации ПАВ в мицеллярной системе при фиксированном значении w0 (от числа мицелл) Полученные зависимости активности липаз от концентрации АОТ системе обращенных мицелл свидетельствуют о том, что все анализируемые липазы контактируют с мицеллярной оболочкой (Рис 7) Однако характер регуляции активности ферментов изменением концентрации АОТ сильно различается для липаз разной природы (гидрофобных и гликозилированных ферментов) Так, увеличение концентрации АОТ (при u>0=const) приводит к росту каталитической активности мономерной и тетрамерной форм MmL и CvLB и мономера CvLA (Рис 7 Б-Г) Напротив, каталитическая активность мономера и тетрамера PPL, а также тетрамера CvLA резко падает при увеличении концентрации АОТ в системе обращенных мицелл (Рис 7 А, В)

10

тетрамер MmL

мономер MmL

О 01 02 03 04 05 Об [АОТ], М

тетрамер CvLA В

мономер CvLA

мономер CvLB

02 03 04

[АОТ], М

0-2 03 04 [АОТ], М

Рис. 7. Зависимость kcat от концентрации АОТ для катализа мономерной (•) и тетрамерной ( ) формами PPL (A), MmL (Б), CvLA (В) и CvLB (Г)

Увеличение концентрации АОТ в системе обращенных мицелл при фиксированном значении w0 приводит к увеличению числа идентичных по размеру мицелл и, как следствие этого, к увеличению поверхности раздела фаз Таким образом, увеличение активности обеих олигомерных форм MmL и CvLB, а также мономера CvLA с увеличением концентрации АОТ в системе обращенных мицелл может быть вызвано активацией фермента на границе раздела фаз Полученные результаты хорошо согласуются с фактом поверхностной активации липаз в присутствии агрегатов молекул субстрата (жировых капель) Способность липаз к активации объясняется особенной структурой фермента, отличающей липазу от обычных эстераз, катализирующих гидролиз растворимых в воде субстратов В водном растворе липаза находится в конформации, при которой активный центр фермента закрыт амфифильной петлей и недоступен субстрату В результате адсорбции фермента на поверхности жировой капли происходит переход липазы в активную конформацию, обусловленный изменением положения петли и открытием активного центра фермента По-видимому, наличие большой поверхности раздела фаз мицеллярной системы заменяет гидрофобную поверхность жировой капли, взаимодействие с которой приводит к конформационному изменению структуры белка и формированию открытой для субстрата активной формы фермента

Гликозилированные липазы, PPL и CvLA, также обладают свойством поверхностной активации, обусловленной конформационным изменением структуры этих липаз и формированием каталитически активных форм ферментов Однако, формирование "сахарной прослойки" между ферментом и внутренней поверхностью мицеллы препятствует эффективному взаимодействию липаз с мицеллярной матрицей Углеводные группы на поверхности липаз могут выступать в качестве якорных групп, взаимодействие которых с мицеллярной оболочкой может приводить к отводу каталитического участка липазы с внутренней поверхности мицеллы, что также затруднит активацию фермента на границе раздела фаз

Установленный сдвиг максимума собственной флуоресценции MmL в длинноволновую область на 5 нм при переходе от водного раствора к системе обращенных мицелл (Рис 8Б) свидетельствует о формировании более полярного окружения флуорофоров липазы, что возможно в результате контакта фермента с внутренней поверхностью мицеллы, образованной сульфогруппами молекул АОТ Интенсивность собственной флуоресценции MmL заметно понижается при увеличении концентрации АОТ, что указывает на чувствительность остатков Тгр на поверхности липазы к числу столкновений мицелл Увеличение концентрации АОТ не оказывает существенного влияния на интенсивность флуоресценции гликозилированной липазы, PPL (Рис 8А), предполагая минимальный контакт остатков Тгр с мицеллярной оболочкой в результате локализации N-концевого домена PPL в водной полости мицеллы

300 3S0 400 4Я> 300 350 400 460

X., нм \ , нм

Рис. 8. Спектры собственной флуоресценции PPL (А) и Мт1. (Б) в водном растворе (1) и в системе обращенных мицелл (2-5) (1) - липаза в 50 шМ Трис, (2/4) - мономер липазы в 50 / 300 шМ АОТ, (3/5) - тетрамер липазы в 50 / 300 шМ АОТ [Е]„ 2 цМ, >.гх 295 нм, ширина щели ех / ет 5 / 2 5 нм

® о

К-домен С-домен углеводная молекула

РРЬ РРЬ каг Центр группа АОТ

Анализ кинетических данных в координатах Лайнуивера-Берка (1 /V от 1/[5]) свидетельствует о

смешанном типе активации обеих олигомерных форм МпЛ и С^В и мономера С^А молекулами

АОТ (кса(, Кт и кс/Кт увеличиваются при увеличении концентрации АОТ, Рис 9А) и о

12

Рис. 9. Зависимость начальной скорости гидролиза NPP от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка для катализа мономерными формами MmL (А) и PPL (Б) в системе обращенных мицелл при разной концентрации АОТ: 50мМ ('" ), ЮОмМ (•), ЗООмМ (~) и 500мМ (■)

бесконкурентном типе ингибирования ими тетрамера CvLA и обеих олигомерных форм PPL (kçat и Кга уменьшаются, kcat,/Km практически не меняется при увеличении концентрации АОТ, Рис 9Б) Согласно смешанному типу активации, взаимодействие гидрофобных липаз с мицеллярной поверхностью возможно как для свободного фермента, так и для фермент-субстратного комплекса Бесконкурентный тип ингибирования предполагает, что взаимодействие гликозилированных липаз с мицеллярной матрицей возможно только в случае образования фермент-субстратного комплекса

4. Химическая модификация липазы.

Для установления возможного влияния гидрофильно-липофильного баланса поверхности липаз на их взаимодействие с мицеллярной матрицей и, как следствие, на регуляцию активности ферментов варьированием концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл, была проведена химическая модификация MmL, нативная форма которой не содержит ни липидные, ни углеводные группы В результате химической модификации NHî-rpynn Lys целлобиозой и Л'-гидроксисукцинимидом пальмитиновой кислоты были получены гидрофилизованная (CB-MmL) и гидрофоби-зованная (Ci6-MmL) формы липазы со степенью модификации 4 Полученный результат

Asp 203-His 257-Ser 144 каталитического центра

N X

Lys 73

lys 50

Рис. 10. Расположение остатков Lys на поверхности молекулы MmL

согласуется со структурными данными молекулы МпЛ, согласно которым на поверхности

фермента имеются 7 остатков Lys (Рис 10), и только 4 из них обладают наибольшей площадью, доступной растворителю (Lys50, Lys73, Lys 106 и Lysl31). Остатки Lys50, Lys73 и Lys 131 расположены на одном участке молекулы белка, отдаленном от каталитического центра фермента, а остаток Lys 106 - вблизи него

Несмотря на изменение свойств поверхности липазы, феномен регуляции олигомерного состава фермента в мицеллярной системе остался прежним (Рис 11) Для каждой из модифицированных форм липазы установлено функционирование высокоактивных мономерных и тетрамерных форм аналогично нативному ферменту

В то же время, изменение гидрофильно-липофильного баланса поверхности липазы оказало существенное влияние на характер регуляции каталитической активности фермента изменением концентрации АОТ в системе обращенных мицелл (Рис 12) Так, гидрофобизация MmL привела к меньшему эффекту активации липазы с ростом концентрации АОТ по сравнению с нативным ферментом (Табл 3), в то время как, гидрофилизация липазы привела к резкому уменьшению каталитической активности тетрамера фермента с увеличением концентрации АОТ Каталитическая активность мономера CB-MmL слабо увеличивается при увеличении концентрации ПАВ в мицеллярной системе

Наблюдаемое различие в проявлении активации фермента в мицеллярной системе в результате изменения свойств поверхности липазы должно быть обусловлено различной природой s

б

'о

- 4 ?

ж

2 0

0 01 02 03 04 05 06 0 01 02 03 04 05 06

[АОТ], M [АОТ], M

Рис. 12. Зависимость к«, от концентрации АОТ для катализа мономерной (•) и тетрамерной С" ) формами Cie-MmL (А) и CB-MmL (Б)

о -1-1-1-1-

0 10 20 30 40 50

Рис. 11. Зависимость кем от степени гидратации мицелл для катализа МтЬ (1), СВ-МтЬ (2) и С^-МтЬ (3) 50тМ АОТ / 50тМ Трис (рН 7 5), 35°С

тетрамер Cle-MmL д

мономер Cie-MmL

Таблица 3. Величина возрастания кс, катализа взаимодействия модифицированных

липазами в результате изменения концентрации ЛОТ от 50 до 500 тМ.

Липаза кс« ( 800 тМ АОТ ) ! ксл ( 50 тМ АОТ )

мономер тетрамер

МтЬ 44 2.6

С]б-МтЬ 28 2.6

форм липазы с мицеллярной оболочкой В случае увеличения гидрофобности липазы (С1б-МтЬ) возможно усиление контакта фермента с мицеллой за счет дополнительных гидрофобных взаимодействий остатков пальмитиновой кислоты на поверхности белковой глобулы с гидрофобной частью молекул АОТ, способствующих фиксации фермента на внутренней поверхности мицеллы Образование более жесткого комплекса фермента с мицеллой делает липазу менее чувствительной к числу столкновений с пустыми мицеллами, возрастающему при увеличении концентрации ПАВ, что также подтверждает постоянство интенсивности флуоресценции С^-МшЬ при увеличении концентрации АОТ (Рис 13А) Меньший эффект активации гидрофобизованного фермента с увеличением числа мицелл также может бьггь обусловлен стабилизацией открытой конформашш липазы остатком пальмитиновой кислоты, расположенного вблизи каталитического центра фермента.

Гидрофилизация липазы приводит к локализации фермента в водной полости мицеллы, а ее контакту с мицеллярной матрицей мешают объемные углеводные группы на поверхности фермента Интенсивность флуоресценции СВ-МшЬ оказывается менее чувствительной к увеличению числа столкновений мицелл при увеличении концентрации АОТ по сравнению с нативной липазой, расположенной на межфазной поверхности мицеллы (Рис 8Б и 13Б)

Рис. 13. Спектры собственной флуоресценции С^-МшЬ (А) и СВ-МгпЬ (Б) в водном растворе (1) и в системе обращенных мицелл (2-5) (1) - липаза в 50 тМ Трис, (2/4) - мономер липазы в 50 / 300 тМ АОТ, (3/5) - тетрамер липазы в 50 / 300 тМ АОТ [Е]0 2 цМ, X« 295 нм, ширина щели ех / ет 5 / 2.5 нм.

углеводная остаток жирной молекула группа киолоты дот

\IrnL

Рис. 14. Зависимость начальной скорости гидролиза ЫРР от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка для катализа мономерными формами С^-МтЬ (А) и СВ-МтЬ (Б) в системе обращенных мицелл при разной концентрации АОТ 50мМ ( ), ЮОмМ (•), ЗООмМ (и) и 500мМ (■)

Анализ кинетических данных в координатах Лайнуивера-Берка (М\ от 1/[Я]) демонстрирует смешанный тип активации обеих олигомерных форм С^-МтТ. молекулами АОТ (к^, Кт и ксм,/Кт увеличиваются при увеличении концентрации АОТ, Рис 14А), бесконкурентный тип активации ими мономера СВ-МтЬ (кса, и Кт увеличиваются, кса[УКт практически не меняется при увеличении концентрации АОТ) и бесконкурентный тип ингибирования ими тетрамера СВ-МтЬ (км, и Кт уменьшаются, к^/Кт практически не меняется при увеличении концентрации АОТ, Рис 14Б) Таким образом, гидрофобные липазы способны взаимодействовать с мицеллярной поверхностью как в виде свободного фермента, так и в виде фермент-субстратного комплекса В то же время, взаимодействие гликозилированных липаз с мицеллярной оболочкой возможно только в случае образования фермент-субстратного комплекса

Стабильность липаз в водном растворе и системе обращенных мицелл.

Стабильность липаз, функционирующих на границе раздела фаз, может оказаться

чувствительной к свойствам межфазной поверхности и гидрофильно-липофильному балансу

поверхности фермента Для выявления этого факта была изучена стабильность нативных и

химически модифицированных липаз в водном растворе и в системе обращенных мицелл при

варьировании концентрации АОТ и и>0 Установлено, что зависимость натурального логарифма

остаточной активности липаз от времени инкубирования ферментов при 35°С в водном растворе и

в системе обращенных мицелл имеет линейный вид, предполагающий инактивацию

анализируемых липаз по первому порядку Значения полученных констант инактивации липаз

(к„н) приведены в Табл 4 Обнаружено, что стабильность всех анализируемых липаз выше в

водном растворе, чем в системе обращенных мицелл Полученный результат обусловлен

агрегацией липаз в водном растворе (даже при их низкой концентрации) с образованием димерных

форм ферментов, проявляющих меньшую активность, но обладающих более высокой

стабильностью по сравнению с мономерами липаз

16

Липаза ккн j мин

50 mM Трис 100 шМ (50 шМ) ЛОТ 100 mM (50 шМ) АОТ

мономер тетрамер

PPL 0 9*10'3 1 9*10"3 (1 5*10"3) 2 7*10"3 (2 0*10"3)

MmL 0 6*10"3 1 7*10"3 (1 5*10"3) 1 З*10"3(1 1*Ю'3)

CvLA 0 5*10"3 1 5*10'3 1 0*10"3

CvLB 0 5*10'3 1 3*10'3 0 9*10'3

CB-MmL 0 8*10"3 2 0*10"3 2 6*10'3

Cis-MmL 0 5* Ю-3 1 4*103 1 i*io-3

Установлено, что стабильность липаз в водном растворе и системе обращенных мицелл зависит от свойств поверхности фермента Так, меньшая стабильность PPL в водном растворе и мицеллярной системе по сравнению с более гидрофобными липазами (MmL и CvLB) и гликозилированной CvLA, которая также содержит на поверхности белковой глобулы остатки жирной кислоты, может быть вызвана высоким содержанием углеводных групп на поверхности молекулы PPL, "растворение" которых в воде способствует разворачиванию ферментативной глобулы и потере каталитически активной конформации фермента Объемные углеводные группы на поверхности ферментов могут препятствовать прочному контакту между субъединицами тетрамеров липаз или способствовать образованию более рыхлой мицеллы, в которой фермент более подвержен денатурации В отличие от высокогликозилированной PPL, тетрамерные формы MmL, CvLA и CvLB обладают большей стабильностью, чем их мономеры, что, по-видимому, обусловлено реализацией более прочных взаимодействий между молекулами липаз, приводящих к образованию прочного и менее чувствительного к окружению тетрамера Стабильность мономерных и тетрамерных форм CvLA и CvLB оказалась соизмеримой и в водном растворе, и в системе обращенных мицелл, что возможно связано с содержанием у CvLA (наряду с углеводными группами) остатков длинноцепочечной жирной кислоты, стабилизирующих активную конформацию липазы и ее тетрамерную форму

Гидрофилизация MmL целлобиозой привела к заметному уменьшению стабильности фермента в водном растворе и системе обращенных мицелл, при этом тетрамер CB-MmL оказался менее стабильным, чем ее мономер В то же время, гидрофобизация MmL остатками пальмитиновой кислоты способствовала увеличению стабильности фермента в водной и мицеллярной средах, при этом наблюдалось более существенное увеличение стабильности мономерной формы фермента Таким образом, изменение гидрофильно-липофильного баланса поверхности фермента введением углеводных групп способствует его "растворению" в водной

фазе, облегчая переход полипептидной цепи фермента в развернутое состояние Наличие остатков жирной кислоты на поверхности фермента затрудняет разворачивание полипептидной цепи и, тем самым приводит к стабилизации активной конформации фермента в водном растворе и системе обращенных мицелл Дополнительные гидрофобные взаимодействия остатков жирной кислоты упрочняют тетрамерную форму липазы, делая ее более стабильной в мицеллярной системе по сравнению с мономером.

Увеличение концентрации АОТ в системе обращенных мицелл приводит к уменьшению стабильности всех форм липаз, что, по-видимому, связано с дестабилизацией липаз в результате увеличения столкновений между мицеллами

6. Регуляция синтетической активности липаз в системе обращенных мицелл.

Согласно полученным в работе данным, взаимодействие липаз с межфазной поверхностью обращенных мицелл является ключевым фактором для липолиза Очевидно, что катализ липазами реакции ацилирования будет зависеть от тех же факторов и регулироваться изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл В данной работе показана возможность регуляции синтетической активности липаз разной природы (PPL и MmL) на примере этерификации ацикловира (2-амино-9-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,9-дагидропурин-6-он) линолевой кислотой путем варьирования концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл

В настоящее время ацикловир является одним из наиболее эффективных антигерпесных препаратов, действие которого заключается в конкурентном ингибировании ДНК-полимеразы вируса Однако, несмотря на высокую антивирусную активность, ацикловир имеет существенный недостаток, связанный с затрудненной доставкой лекарственного препарата в зараженные вирусом клетки и, вследствие этого, выведением из организма в неизменном виде почти до 90% препарата Этерификация ОН-группы ацикловира жирной кислотой (Рис 15) могла бы послужить решением данной проблемы и возможно облегчит прохождение препарата через клеточную мембрану, а возможное включение модифицированного ацикловира в комплексы с липидами и белками могло бы способствовать его пролонгированному действию, а также транспорту лекарственного препарата в потоке лимфы В свою очередь, наличие в организме липаз позволит гидролизовать эфирную связь ацилированного ацикловира и получить исходный препарат, обладающий высокой антивирусной активностью

Рис. 15. Схема реакции этерификации ацикловира жирной кислотой, катализируемая липазой

Таблица 5. Выход продукта реакции этерификации ацикловира линолевой кислотой, катализируемой мономерами PPL и MmL, в зависимости от концентрации АОТ в системе обращенных мицелл

[АОТ], тМ Время реакции, час Выход продукта, %

мономер PPL мономер MmL

50 15 25 17 4 202 11.9 15 6

15 10 6 18.4

100

25 12 5 23 4

Для катализа реакции ацилирования были выбраны PPL и MmL, для которых установлен принципиально разный характер регуляции липолиза изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл, вызванный различием свойств поверхности ферментов (наличием сахарной композиции у PPL и ее отсутствием у MmL) и контакта ферментов с внутренней поверхностью мицеллы

Для реакции этерификации, катализируемой липазой, необходимо низкое содержание воды в системе, поэтому синтетическую реакцию в системе обращенных мицелл проводили при степени гидратации, соответствующей функционированию мономеров липаз w0 15 и 16 для PPL и MmL, соответственно Значения выхода продукта реакции (ацилированного ацикловира) в зависимости от концентрации АОТ в системе обращенных мицелл приведены в Табл 5 Согласно полученным данным, увеличение концентрации АОТ в системе обращенных мицелл от 50 до 100 тМ приводит к росту выхода продукта реакции, катализируемой мономером MmL, в 1 5 раза Напротив, для катализа мономером PPL, увеличение выхода продукта реакции в 1 6 раза было установлено при уменьшении концентрации АОТ от 100 до 50 тМ Небольшое увеличение образования продукта при увеличении продолжительности синтеза в одних и тех же условиях от 15 до 25 часов свидетельствует о приближении скорости реакции этерификации к "плато" на полной кинетической кривой

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перспективности развития данного биотехнологического направления

7. Биферментная система "липаза /липоксигеназа".

В данной работе предлагается простой и непрерывный метод слежения за активностью липазы с помощью биферментной системы "липаза / соевая липоксигеназа-1", включающий липолитическое высвобождение полиненасыщенной жирной кислоты из триглицерида и последующее липоксигеназное окисление полиненасыщенной жирной кислоты до ее гидропероксида, регистрируемого спектрофотометрически (Рис 16) Выбор соевой LOX-1 обусловлен тем, что данный фермент в отличие от других 15-липоксигеназ окисляет

19

НгС-ООС^

НгС-ООС

трилинолеин

н,о

линолевая кислота

ЛИПАЗА ЛИПОКСИГЕНАЗА

гидропероксид линолевой кислоты

OD 245 НМ

искточетельно свободные полиненасыщенные жирные кислоты и не способен окислять полиненасыщенные триглицериды.

Для изучения кинетики биферментного процесса в качестве субстрата липазы использовали трилинолеин (TL), ацильный фрагмент которого во всех трех src-положениях триглицерида представлен линолевой кислотой (LA) В качестве липаз, катализирующих первую стадию

Рис. 16. Последовательность реакций превращения биферментного превращения трилино-трилинолеина, катализируемого биферментной леина, использовали PPL и MmL,

системеой "липаза/липоксигеназа" , , „

обладающие 5п-1,3-специфичностью по

отношению к триглицеридам

Установлено, что присутствие липаз в системе "LA/LOX-1" и LOX-1 в системе

"NPP/липаза" не оказывает влияния на каталитическую активность каждого из ферментов'

активность одного фермента при его постоянной концентрации не меняется при варьировании

концентрации другого фермента

В работе показано, что кинетика биферментного процесса характеризуется лаг-фазой, равной

10-30 мин в водном растворе и 20-40 мин в системе обращенных мицелл и определяемой

константами LOX-1

02 03 OS 08

[LOX-1], цМ

Рис. 17 Зависимость начальной скорости биферментного превращения трилинолеина, катализируемого системой "PPL/LOX-Г' в системе обращенных мицелл, от концентрации PPL (А) и LOX-1 (Б) 50шМ АОТ (wD 15) / 50 шМ Трис (рН 8 5), [TL] 0 2 mM, [LOX-1] 0 6 рМ (А), [PPL] 2 рМ (Б), 35°С

1

Для определения лимитирующей стадии процесса превращения трилинолеина, катализируемого системами "РРЬ/ЬОХ-1" и "МтЬ/ЬОХ-1", получены зависимости начальной скорости биферментной реакции от концентрации каждого из ферментов (Рис 17) Установлено, что начальная скорость биферментного процесса для каждой биферментной системы практически не зависит от концентрации второго фермента, ЬОХ-1 Напротив, зависимость начальной скорости биферментной реакции от концентрации липазы (первого фермента) имеет линейный характер для обеих биферментных систем Полученные зависимости свидетельствуют о том, что катализируемая липазой реакция гидролиза трилинолеина с высвобождением линолевой кислоты является лимитирующей стадией всего сложного процесса В этом случае об активности липазы

__можно судить по накоплению конечного

продукта реакции, катализируемой ЬОХ-1.

Методика определения активности липаз в водном растворе и в системе обращенных мицелл отработана в данной работе на примере липаз разной природы с использованием различных природных триглицеридов, в том числе пищевых масел

Кинетические константы биферментного превращения триглицеридов, катализируемого системами "РРЬ / 1.0Х-1" и "МтЬ/ЬОХ-1", изучали при варьировании степени гидратации и концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл

Полученные ЗаВИСИМОСТИ кса! биферментного процесса от степени гидратации мицелл имеют оптимум при 30 для каждой биферментной системы и небольшое "плечо" при и>„ 15 и 16 для систем "РРЬ/ЬОХ-Г и "МтЬ/ЬОХ-1", соответственно (Рис.18). Поскольку

Рис.19. Зависимость к« реакции окисления зависимость каталитической активности

линолевой кислоты, катализируемой ШХ-1 в [Х>Х-1 от степени гидратации мицелл системе обращенных мицелл, от и»„ 50 тМ АОТ /

50тМ Трис (рН 8.0), 25°С не имеет ЯРК0 выраженного

максимума (Рис 19), а на зависимостях

Рис. 18. Зависимость к^, превращения трилинолеина, катализируемого биферментной системой "РРЬ / ЬОХ-1 "в системе обращенных мицелл, от 50 тМ АОТ / 50 тМ Трис (рН 8.0), 35°С. Прямая линия соответствует уровеню кс« в водном растворе (50 тМ Трис (рН 8 0), 35°С)

каталитической активности РРЬ и Мш1, установлено два оптимума при и<„ 15,30 и »'0 16,30, соответственно (Рис.5), можно предположить, что оптимумы к,*, биферментой реакции при тл>0 30 отвечают функционированию тетрамеров РРЬ и МтЬ, а небольшое "плечо" при 15 и 16 -функционированию мономерных форм этих липаз.

Установлено, что значение ксщ биферментного превращения трилинолеина, катализируемого системами "РРЬ/ЬОХ-Г' и "МтЬ / ЬОХ-Г' в мицеллярной среде, во всем анализируемом диапазоне превышает кС11, наблюдаемую для этих биферментных систем в водном растворе. Значение Кт биферментного процесса увеличивается при увеличении значения м>0, что приводит к уменьшению константы эффективности (к^/К,,,) биферментного процесса при увеличении значения и-0.

Важно отметить, что для биферментной реакции, катализируемой в системе обращенных мицелл, как и для катализа липазой в мицеллярной системе, не наблюдается эффект ингибирования липазы субтратом, установленный в водной средс

Зависимость кинетических констант биферментного превращения трилинолеина, катализируемого системами "РРЬ / ЬОХ-1" и "МтЬ ■' ЬОХ-1", от концентрации АОТ в системе обращенных мицелл имеет слабо выраженный характер (Рис 20). Так, для катализа системой "РРЬ/ЬОХ-Г' наблюдается небольшое уменьшение кИ1 и Кт биферментной реакции при увеличении концентрации АОТ, тогда как для системы "МтЬ/ЬОХ-1" - небольшое увеличение кем и Кт при увеличении концентрации АОТ в системе обращенных мицелл. По-видимому, слабый эффект влияния изменения концешрации ПАВ на к^ биферментного процесса обусловлен изменением свойств межфазной поверхности в результате образования смешанных мицелл АОТ с гиброфобным триглицеридом

002 0 03 0 04

[АОТ], М

002 003 004

[АОТ], М

Рис.20. Зависимость кса1 (А) и ксм / Кт (Б) превращения трилинолеина, катализируемого биферментными системами "РРЬ / ЬОХ-1" (1) и "МтЬ / ЬОХ-1" (2) в системе обращенных мицелл, от концентрации АОТ: (1) - "РРЬ/ЬОХ-1", 50тМ АОТ 30) / 50тМ Трис (рН 8.0), 35°С, (2) - "МтЬ / ЬОХ-1", 50тМ АОТ (\у0 30) / 50тМ Грис (рН 7 5), 35°С

8. Тестирование пищевых масел.

Полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие 1,4-цис,цис-пентадиенильный фрагмент и являющиеся субстратами липоксигеназ, представляют собой предшественники биологически активных соединений (лейкотриенов, простагландинов, тромбоксанов и др), выполняющих важные регуляторные функции и вовлеченных в иммунную систему организма человека. Известно, что утилизация именно этих жирных кислот снижает риск многих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака и воспалительных процессов различной этиологии В связи с этим, биферментная система "липаза /' липоксш еназа'" может оказаться удобной тест-системой и позволит оценивать "биологическое" качество пищевых масел и жиров, заключающееся в содержании в них важных полиненасыщенных жирных кислот

На примере кукурузного, оливкового и рапсового масел опробована возможность использования предлагаемой биферментной системы для тестирования пищевых масел При использовании биферментной системы "РРЬ / ШХ-1" наибольшее значение максимальной скорости биферментной реакции установлено в случае кукурузного масла, за которым следуют оливковое и рапсовое масла (Табл.6). Такое распределение масел в порядке уменьшения максимальной скорости биферментной реакции их превращения должно свидетельствовать об уменьшении содержания ненасыщенных жирных кислот в 5л-1,3-положениях трииицеридов этих масел, согласно позиционной специфичности используемой липазы.

Методом ГЖХ, позволяющим определять полное содержание жирных кислот в триглицеридах, установлено, что все анализируемые масла содержат в составе триглицеридов большое количество ненасыщенных жирных кисло г по сравнению с насыщенными кислотами. Среди ненасыщенных жирных кислот были обнаружены жирные кислоты, содержащие одну (олеиновая кислота), две (линолевая кислота) и три (линоленовая кислота) двойные связи в углеводородной цепи. Однако, из всех ненасыщенных жирных кислот, обнаруженных в данных маслах, только линолевая (С 18 2) и леноленовая (С 18 3) кислоты являются субстратами липоксигеназы.

Таблица 6. Содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в пищевых маслах, оцененное с помощью биферментной системы "PPL / LOX-1" и методом ГЖХ

Масло Би<| »ерментная система ГЖХ анализ

^тах ? отн.ед. Содержание ПНЖК в 1 или 3 положении триглицерида, % Содержание ПНЖК в масле, %

линолевая кислота (С 18-2) линоленовая кислота (С 18 3)

Кукурузное 7.9* Ю-2 4.7 59.8 22

Оливковое 1.9*10"2 1 7 13.3 1 9

Рапсовое 1.2*10"2 1 5 22.9 88

50 mM АОТ (w0 25) / 50 mM Трис (рН 8 0) при 35°С

Согласно данным ГЖХ анализа, наибольшее количество этих кислот, действительно, содержится в кукурузном масле. Рапсовое и оливковое масла характеризуются весьма низким содержанием данных кислот. Таким образом, результаты тестирования масел с помощью биферментной системы вполне сопоставимы с результатами анализа масел методом ГЖХ Заниженное значение максимальной скорости при тестировании рапсового масла с помощью биферментной системы "PPL/LOX-1" можно объяснить яг-1,3-позиционной специфичностью липазы, способной гидролизовать сложноэфирную связь только в 1 и 3 положениях триглицерида Анализ масел методом ГЖХ позволяет установить общее содержание жирных кислот во всех трех положениях триглицерида По-видимому, в рапсовом масле линолевая и линоленовая кислоты в большей степени занимают второе положение в триглицериде. В связи с этим, в качестве оптимальной тест-системы необходимо использовать полиферментную систему, включающую липазы разной позиционной специфичности

Анализ масел с помощью биферментной системы "липаза/ липоксигепаза" может быть удобным для контроля степени окисления ненасыщенных жиров и масел при их хранении. В этом случае, содержание ненасыщенных жирных кислот может бьггь оценено относительно линолевой кислоты с помощью калибровочной кривой, представленной зависимостью начальной скорости

биферментного превращения трилинолеина от концентрации линолевой кислоты в одном из ¿и-положений трилинолеина Сопоставляя значения начальных скоростей превращения масел с данными калибровочной кривой ("Рис 21), полученными для катализа биферментной системой "PPL / LOX-1" в тех же условиях, было установлено, что наибольшее количество ненасыщенных жирных кислот в 1 или 3 положении триглицерида содержится в кукурузном масле (Табл.6). Оливковое и рапсовое масла характеризуются примерно одинаковым количеством ненасыщенных жирных кислот в 1 или 3 положениях триглицерида

Предлагаемая биферментная система может быть удобной для изучения позиционной специфичности липаз, если использовать в качестве субстратов триглицериды, содержащие полиненасыщенный ацильный фрагмент в строго определенном положении триглицерида.

О 01 02 03 04

[LA] tl . mM

Рис. 21. Зависимость начальной скорости превращения трилинолеина, катализируемого биферментной системой "PPL/LOX-1" в системе обращенных мицелл при w0 25, от концентрации линолевой кислоты в одном из положений трилинолеина [PPL] 2 uM, [LOX-1] 0 5 цМ, 50 mM АОТ, 50 шМ Трис (рН 8.0), 35°С

Универсальность данной биферментной системы также заключается в том, что замена липазы на фосфолипазу позволит расширить круг изучаемых липолитических ферментов и определять их активность по отношению к природным субстратам, содержащим полиненасьпценные жирные кислоты

ВЫВОДЫ

1. На примере панкреатической липазы свиньи (PPL), грибной линаш из Mucor miehei (MmL) и двух форм бактериальной липазы из Chromobacterium vucosum (CvL А и CvL В) показано, чго ключевым моментом в регуляции каталитической активности липаз в системе обращенных мицелл является взаимодействие ферментов с межфазной поверхностью, определяемое свойствами поверхности ферментов и регулируемое физико-химическими параметрами системы обращенных мицелл

2. Установлено, что в системе обращенных мицелл, как и в водном растворе, липолигический процесс имеет лаг-период, определяемый стадией адсорбции тапаз на межфазной поверхности, продолжительность которого зависит от эффективности взаимодействия ферментов с межфазной поверхностью и наиболее значительна для гликозилированных липаз (PPI и CvLA) по сравнению с более гидрофобными ферментами (MmL и CvLB).

3 Показано, что для катализа липазами в системе обращенных мицелл не требуются такие активаторы липолиза, как ионы кальция и соли желчных кислот, необходимые для катализа в водном растворе В системе обращенных мицелл по сравнению с водным раствором не наблюдается эффект ингибирования фермента субстратом, а также установлено уменьшение эффекта необратимого ингибирования липазы продуктом реакции (свободной жирной кислотой) при увеличении концентрации ПАВ

4 В системе обращенных мицелл анализируемые липазы функционируют в виде высокоактивных мономерных и терамерных форм, образование которых контролируется степенью гидратации мицелл (их размером)

5. Обнаружено, что все анализируемые липазы взаимодействуют с мицеллярной матрицей, однако, характер регуляции каталитической активности липаз изменением концентрации ПАВ (числа мицелл) зависит от свойств поверхности ферментов и характеризуется бесконкурентным типом ингибирования молекулами АОТ гликозилированных липаз (PPL и тетрамера CvL А) и смешанным типом активации ими гидрофобных липаз (MmL и CvL В)

6. Показано, что характер зависимости каталитической активности липазы от концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл можно регулировать химической модификацией (гидрофилизацией и гидрофобизацией) поверхности фермента Гилрофобизация Mml остатками пальмитиновой кислоты приводит к уменьшению эффекта активации фермента молекулами АОТ (смешанный тип активации Ci6-MmL), тогда как гидрофилизация MmL целлобиозой способствует

реализации бесконкурентного типа активации и ингибирования молекулами ЛОТ мономера и тетрамера этой формы липазы (CB-MmL), соответственно.

7. Обнаружено, что химическая модификация поверхности MmL не приводит к изменению характера регуляции олигомерного состава фермента в системе обращенных мицелл, но способствует небольшому увеличению каталитической активности липазы.

8. Стабильность липаз в системе обращенных мицелл зависит от свойств поверхности фермента и его олигомерного состава, при этом липазы, содержащие углеводные группы (PPL и CB-MmL), наиболее стабильны в виде мономеров, а негликозилированные липазы (MmL и Cvl В) и липазы, на поверхности которых имеются остатки жирной кислоты (CvLA и Ci6-MmL), наиболее стабильны в виде тетрамеров. Дополнительная гидрофилизация MmL целлобиозой приводит к ухудшению стабильности липазы, в то время как ее гидрофобизация остатками пальмитиновой кислоты - к стабилизации фермента

9. На примере этерификации ацикловира линолевой кислотой, катализируемой липазами в системе обращенных мицелл, показана возможность регуляции выхода продукта реакции (ацилированного ацикловира) увеличением концентрации АОТ для катализа гиброфобной липазой (MmL) и уменьшением концентрации АОТ для катализа гликозилированной липазой (PPL)

10. Разработан метод определения активности липаз по отношению к природным триглицеридам с помощью биферментной системы «липаза / липоксигеназа». С помощью данного метода изучена регуляция каталитической активности липаз разной природы изменением степени гидратации и концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл

11 Показана возможность использования биферментной системы «липаза / липоксигеназа» в качестве простой и экспрессной тест-системы для оценки содержания биологически важных полиненасыщенных жирных кислот в составе пищевых триглицеридов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. I.M. Pavlenko, N L Klyachko, А V. Levashov Bienzymic system containing lipase and lipoxygenase in reversed micelles International Conference "Biocatalysis 2000. Fundamentals and application", Moscow, Russia, 2000, June 10-15, p 140

2. I.M. Pavlenko, N L. Klyachko, A.V. Levashov. Continuous assay of lipids biotransformation using lipase and lipoxygenase in reverse micelles The 5th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformation "BioTrans 2001", Darmstadt, Germany, 2001, September 2-7, p. 417.

3. И.М. Павленко, O.C. Купцова, Н.Л. Клячко, A.B Левашов. Биферментная система "липаза/липоксигеназа" в системе обращенных мицелл АОТ в октане Биоорг. Химия, 2002, т. 28, стр. 50-55.

4 I.M. Pavlenko, N L Klyachko, A V Levashov Increased reactivity of the lipase/lipoxygenase bienzyme system in reverse micelles International EURESCO Conference "2002-Reactivity in Organized Microstnictures", Aquafredda di Maratea, Italy 2002, June 22-27, p 87

5. И.М. Павленко, H.JI. Клячко, A.B. Левашов Регуляция каталитической активности и олигомерного состава липазы из Mucor miehei в системе обращенных мицелл Конференция молодых ученых "Инженерная энзимология", Москва, Россия, 2003, Октябрь "50-31, стр 24

6. IМ. Pavlenko, N.L Klyachko, А V. Levashov Improvement of the lipase activity in reverse micelles. The 2nd International Conference "Highly Organized Catalytic Systems", Mos cow, Russia,

2004, June 14-17, p 97

7. I.M. Pavlenko, N.L. Klyachko, A.V Levashov Encapsulation of lipases in reverse micelles The XII International Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spam, 2004, September 24-26, p 299302.

8. И.М. Павленко, H Л. Клячко, А В Левашов Влияние химической модификации липазы на регуляцию липолитической активности в системе обращенных мицелл // Биоорг. Химия,

2005, т 31, стр.518-524

Принято к исполнению 11/08/2005 Исполнено 12/08/2005

Заказ № 975 Тираж-100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» НИИ 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2006-4 10415

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА.

1.1. Общая характеристика липаз из разных источников.

1.2. Аминокислотный и углеводный состав.

1.3. Структура активного центра и поверхностная активация липазы.

1.4. Механизм катализа и кинетические модели действия липаз.

1.5. Факторы, влияющие на липолиз.

1.6. Субстратная специфичность липаз.

1.7. Методы определения активности липаз.

1.8. Применение липаз.

II СИСТЕМЫ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ, ИХ ДОСТОИНСТВА.

2.1 Системы обращенных мицелл, общие характеристики.

2.2. Ферменты в системах обращенных мицелл: регуляция их активности и олигомерного состава.

2.3. Катализ липазой в системах обращенных мицелл.

III. ЛИПОКСИГЕНАЗА: СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА.

3.1. Нахождение в природе, катализируемые реакции и биологическая важность липоксигеназ.

3.2. Структура активного центра и механизм катализа липоксигеназ.

IV. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. МАТЕРИАЛЫ.

II. МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика препаратов ферментов.

2.2. Определение каталитической активности ферментов.

2.3. Химическая модификация ферментов.

2.4. Седиментационный анализ.

2.5. Изучение собственной флуоресценции липаз.

2.6. Изучение стабильности липаз.

2.7. Синтез ацилированного ацикловира, катализируемый липазой в системе обращенных мицелл.

2.8. Изучение биферментной системы «липаза / липоксигеназа».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ.

1.1. Панкреатическая липаза свиньи.

1.2. Липаза из Mucor miehei.

1.3. Липаза из Chromobacterium viscosum.

II. РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.

2.1. Оптимизация условий катализа.

2.1.1. Зависимость каталитической активности липаз от рН среды, температуры реакции и концентрации фермента.

2.1.2. Кинетические характеристики реакций, катализируемых липазами в водной среде и в системе обращенных мицелл.

2.1.3. Влияние ионов кальция и желчных солей на липолиз в водном растворе и в системе обращенных мицелл.

2.2. Регуляция олигомерного состава липаз в системе обращенных мицелл.

2.3. Регуляция активности лппаз изменением концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл.

2.4. Химическая модификация липазы.

2.5. Собственная флуоресценция липаз.

2.6. Предполагаемая локализация липаз в системе обращенных мицелл.

III. СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПАЗ.

IV. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ.

V. БИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА «ЛИПАЗА / ЛИПОКСИГЕНАЗА».

5.1. Катализ соевой липоксигеназой-1 в системе обращенных мицелл.

5.2. Кинетические характеристики биферментной реакции: определение скорость лимитирующей стадии.

5.3. Зависимости кинетических констант биферментного процесса от степени гидратации и концентрации АОТ в системе обращенных мицелл.

5.4. Тестирование масел с помощью биферментной системы «липаза/ липоксигеназа».

ВЫВОДЫ.

Липазы (гидролазы высших триглицеридов) играют ключевую роль в обмене липидов всех живых организмов, а также участвуют в процессах отложения и утилизации жира, используемого в качестве энергетического резерва клетки. Липазы не только гидролизуют триглицериды в пищеварительном тракте до ди-, моноглицеридов и свободных жирных кислот, но также способны катализировать с высокой стереоспецифичностью ацилирование и деацилирование большого числа субстратов, отличных от глицеридов. Липазы стабильны в водных и органических средах и могут быть получены с хорошим выходом из растений, животных, а также из природных и рекомбинантаых микроорганизмов. В настоящее время липазы находят широкое применение во многих областях, включая лечебную и диагностическую медицину, пищевую, косметическую и бумажную промышленности, производство детергентов и органический синтез. В результате, в последнее время особое внимание уделяется оптимизации биокаталитических характеристик этого фермента.

Исключительной особенностью липазы, отличающей ее от других эстераз, является свойство поверхностной активации фермента в присутствии агрегированных молекул субстрата (жировых капель), что обусловлено формированием активной конформации фермента в результате его адсорбции на поверхности липида. В литературе имеются указания на то, что адсорбция липазы на липидном монослое является определяющим фактором катализа липазой, предшествуя образованию фермент-субстратного комплекса. Очевидно, что эффективность взаимодействия липазы с поверхностью липида будет зависеть как от свойств межфазной поверхности (заряда, плотности, поверхностного натяжения и т.д.), так и от свойств самого фермента, в том числе от наличия на его поверхности функциональных групп углеводной и липидной природы. Вопрос о роли взаимодействия липазы с межфазной поверхностью в регуляции активности фермента представляет, с одной стороны, фундаментальный интерес для понимания закономерностей механизма катализа липазами разной природы, а с другой стороны, имеет важное прикладное значение, заключающееся в контролировании ферментативного процесса in vitro и в направленной регуляции катализа липазами при решении различных биотехнологических задач. Для решения данного вопроса представляется весьма удобной система обращенных мицелл, которая, в отличие от липидного монослоя, может быть использована как для моделирования мембранного окружения ферментов, так и для проведения биокаталитических процессов. В случае системы этого типа эффективность взаимодействия фермента с межфазной поверхностью (слоем ПАВ) может регулироваться как путем изменения параметров системы, а именно, размера и числа мицелл, так и путем химической модификации (дополнительной гидрофилизации и гидрофобизации) поверхности фермента. Таким образом, основной целью работы явилось выявление регуляции липолитической и синтетической активности липаз раной природы в системе обращенных мицелл АОТ в изооктане изменением параметров системы (числа и размера мицелл) и свойств поверхности фермента. В качестве объектов исследования были выбраны широко используемые на практике липазы: панкреатическая липаза свиньи и липазы из Mucor miehei и Chromobacterium viscosum.

На сегодняшний день определение липолитической активности по-прежнему является непростой задачей, а существующие высокочувствительные методы обладают рядом недостатков, включающих: 1) дороговизну оборудования и реагентов; 2) неприменимость во многих природных средах и системах, содержащих амфифильные соединения, связывающие субстраты и продукты липолитических реакций; 3) применение синтетических субстратов, по отношению к которым липазы проявляют низкую активность. В связи с этим, другой важной задачей работы являлась разработка простого непрерывного метода определения активности липазы по отношению к природному субстрату (триглицериду) с помощью биферментной системы «липаза / липоксигеиаза», включающего липолитическое высвобождение полнненасыщенной жирной кислоты из триглицерида и последующее липоксигеназное окисление полиненасыщенной жирной кислоты до ее гидропероксида, регистрируемого спектрофотометрически.

Предлагаемая биферментная система «липаза / липоксигеназа» может быть удобной для изучения позиционной специфичности липаз из разных источников, если использовать в качестве субстрата триглицериды, содержащие полиненасыщенный ацильный фрагмент в строго опреленном s/i-положении триглицерида. Универсальность данной биферментной системы также заключается в том, что замена липазы на фосфолипазу позволяет расширить круг изучаемых липолитических ферментов и определять их активность по отношению к природным субстратам, содержащим полиненасыщенные жирные кислоты.

В настоящий момент одной из важных практических задач в медицине и пищевой промышленности стоит проблема переработки жиров и получения триглицеридов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты. Полиненасыщенные жирные кислоты, содержащие 1,4-цис,цис-пентадиенильный фрагмент и являющиеся субстратами липоксигеназ, представляют собой предшественники биологически активных соединений (лейкотриенов, простагландинов, тромбоксанов и др.), выполняющих важные регуляторные функции и вовлеченных в иммунную систему организма человека. Известно, что утилизация именно этих жирных кислот снижает риск многих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака и воспалительных процессов различной этиологии.

Поэтому предлагаемая нами биферментная система «липаза / липоксигеназа» может оказаться удобной тест-системой и позволит оценивать качество пищевых масел и жиров, заключающееся в содержании в них биологически важных полиненасыщенных жирных кислот.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ЛИПАЗА: СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КАТАЛИЗА

1.1.0бщая характеристика липаз из разных источников

Липаза (гидролаза триациглицеридов, К.Ф. 3.1.1.3) представляет собой фермент, катализирующий in vivo гидролиз триглицеридов до моноглицеридов и жирных кислот [1]. Липолитический процесс в пищеварительном тракте животных и человека контролируется желудочными липазами, гидролизующими около 10% пищевых триглицеридов до жирных кислот и .м-1,2-диглицеридов, и далее панкреатическими липазами, осуществляющими превращение триглицеридов и sw-1,2-диглицеридов в жирные кислоты и .уи-2-моноглицериды, которые лете усваиваются организмом.

Липазы также способны катализировать при определенных условиях обратную реакцию ацилирования жирной кислотой глицерина, моно- и диглицеридов, а также переэтерификацию триглицеридов (Рис.1). Несмотря на предпочтение к триглицеридам, липазы гидролизуют большое разнообразие отличных от триглицеридов субстратов, таких как алифатические, ациклические, бициклические и ароматические эфиры и даже эфиры на основе органометаллических сендвнч соединений [2]. По отношению к рацемическим эфирам или субстратам с разными гидроксильными группами, липазы реагируют с высокой энантио- и региоселективностью.

Липаза является широко распространенным ферментом, обнаруженным у животных [3-5], растениий [6,7] и микроорганизмов [8-10]. Коммерчески доступные липазы обычно производят из микроорганизмов, а с появлением генной инженерии увеличилось число липаз, производимых из рекомбинантных бактерий и дрожжей [3].

Обычно липазы являются одним из составляющих «гидролитического ферментативного коктейля», наработанного организмом с целью поддержания его роста. Процедура очистки липаз от эстераз и протеаз весьма трудоемка, так как аффинность липаз высока не только к границе вода / масло, но и к другим поверхностям с меньшей полярностью (вода / органический растворитель, стекло, пластик, воздушные пузыри), на которых липаза может обратимо адсорбироваться и денатурировать [II]. г и д р о л и 3

OR or э т

Е Р

И ф и к

А Ц

И Я r or триглнцерид r он диглицерид глицерин 4r-c00h

Н он моноглицерид r or триглкцеркд

Н ОН глицерин

Рис. 1. Реакции, катализируемые липазой.

Многие организмы производят смеси липазных изоформ, имеющие небольшое отличие, например, в содержании углеводов или степени гликозилирования фермента. Однако, изоформы липаз способны проявлять разную ферментативную активность или субстратную специфичность, а также различаться по стабильности (Табл. 1).

В настоящее время выделены и охарактеризованы липазы различных организмов, однако наиболее и ранее изученным представителем липаз является панкреатическая липаза [1].

Оптимум действия большинства липаз лежит в области рН 7-9. Исключение составляют языковые и желудочные липазы позвоночных, тканевые липазы липосомного происхождения и липазы некоторых микроорганизмов, которые наиболее активны и стабильны при кислых рН [1]. рН-оптимум желудочных липаз равен рН 5.4 [12] в отличие от рН 8-9 для панкреатических липаз [13]. Липаза из клещевины наиболее активна при рН 4.2, а липазы из микроорганизма Mucorpusillus проявляют максимальную активность в области рН 5-6 [1].

Липолитические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур. Например, некоторые липазы микроорганизмов активны при -20°С [1], а фермент из семян Vernonia anthclm'mthica — при 65°С. Температурный оптимум большинства липаз лежит в районе 30-37 °С.

Липаза нуждается в ионах Na+, улучшающих се связывание с поверхностью липида, а также в ионах подавляющих ингибирование фермента свободными жирными кислотами.

Таблица 1. Характеристика некоторых коммерческих препаратов липаз [2].

Источник липазы Характеристика

Candida rugosa формально Candida cylindracea, очистка и клонирование фермента дает 5 родственных изоформ липазы, отличающихся степенью гликозилирования и проявляющих разную специфичность по отношению к коротко- и длинноцепочечным триглицеридам.

Geotrtchum candidum содержит 2 изоформы, отличающиеся по специфичности по отношению к цис-Д9- ПНЖК.

Rhizopus sp. липазы R. arrhizus, R, oryzae, R. delemar и R. niveus имееют высокую степень идентичнсти аминокислотной последовательности, однако проявляют разную субстратную специфичность и стабильность.

Peniciltium camembertii формально P. cyclopium, содержит 4 липазных изоформы, различающиеся углеводным составом гликозилированного домена.

Pseudomonas glumae липаза из этого источника имеет 100% идентичность с липазой из Chromobacterium viscosum.

выводы

1. На примере панкреатической липазы свиньи (PPL), грибной липазы из Мисог miehei (MmL) и двух форм бактериальной липазы из Chromobacterium viscosum (CvL А и CvL В) показано, что ключевым моментом в регуляции каталитической активности липаз в системе обращенных мицелл является взаимодействие ферментов с межфазной поверхностью, определяемое свойствами поверхности ферментов и регулируемое физико-химическими параметрами системы обращенных мицелл.

2. Установлено, что в системе обращенных мицелл, как и в водном растворе, липолитический процесс имеет лаг-период, определяемый стадией адсорбции липаз на межфазной поверхности, продолжительность которого зависит от эффективности взаимодействия ферментов с межфазной поверхностью и наиболее значительна для гликозилированных липаз (PPL и CvLA) по сравнению с более гидрофобными ферментами (MmL и CvLB).

3. Показано, что для катализа липазами в системе обращенных мицелл не требуются такие активаторы липолиза, как ионы кальция и соли желчных кислот, необходимые для катализа в водном растворе. В системе обращенных мицелл по сравнению с водным раствором не наблюдается эффект ингибирования фермента субстратом, а также установлено уменьшение эффекта необратимого ингибирования липазы продуктом реакции (свободной жирной кислотой) при увеличении концентрации ПАВ.

4. В системе обращенных мицелл анализируемые липазы функционируют в виде высокоактивных мономерных и терамерных форм, образование которых контролируется степенью гидратации мицелл (их размером).

5. Обнаружено, что все анализируемые липазы взаимодействуют с мицеллярной матрицей, однако, характер регуляции каталитической активности липаз изменением концентрации ПАВ (числа мицелл) зависит от свойств поверхности ферментов и характеризуется бесконкурентным типом ингибирования молекулами АОТ гликозилированных липаз (PPL и тетрамера CvL А) и смешанным типом активации ими гидрофобных липаз (MmL и CvL В).

6. Показано, что характер зависимости каталитической активности липазы от концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл можно регулировать химической модификацией (гидрофилизацией и гидрофобизацией) поверхности фермента. Гидрофобизация MmL остатками пальмитиновой кислоты приводит к уменьшению эффекта активации фермента молекулами АОТ (смешанный тип активации Ci6-MmL), тогда как гидрофилизация MmL целлобиозой способствует реализации бесконкурентного типа активации и ингибирования молекулами АОТ мономера и тетрамера этой формы липазы (CB-MmL), соответственно.

7. Обнаружено, что химическая модификация поверхности MmL не приводит к изменению характера регуляции олигомерного состава фермента в системе обращенных мицелл, но способствует небольшому увеличению каталитической активности липазы.

8. Стабильность липаз в системе обращенных мицелл зависит от свойств поверхности фермента и его олигомерного состава, при этом липазы, содержащие углеводные группы (PPL и CB-MmL), наиболее стабильны в виде мономеров, а негликозилированные липазы (MmL и CvLB) и липазы, на поверхности которых имеются остатки жирной кислоты (CvLA и C]6-MmL), наиболее стабильны в виде тетрамеров. Дополнительная гидрофилизация MmL целлобиозой приводит к ухудшению стабильности липазы, в то время как ее гидрофобизация остатками пальмитиновой кислоты - к стабилизации фермента.

9. На примере этерификации ацикловира линолевой кислотой, катализируемой липазами в системе обращенных мицелл, показана возможность регуляции выхода продукта реакции (ацилировапного ацикловира) увеличением концентрации АОТ для катализа гиброфобной липазой (MmL) и уменьшением концентрации АОТ для катализа гликозилированной липазой (PPL).

10. Разработан метод определения активности липаз по отношению к природным триглицеридам с помощью биферментной системы «липаза / липоксигеназа». С помощью данного метода изучена регуляция каталитической активности липаз разной природы изменением степени гидратации и концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл.

11. Показана возможность использования биферментной системы «липаза / липоксигеназа» в качестве простой и экспрессной тест-системы для оценки содержания биологически важных полиненасыщенных жирных кислот в составе пищевых триглицеридов.

1. Брокерхоф X., Джексен Р. Липолитические ферменты. Москва, Мир, 1978.

2. Schmid R., Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications. // Angew. Chem. Int. Ed. (1998) 37: 1608-1633.

3. Wooley P., Petersen S.B. Lipases: Their structure, biochemistry and application. Cambridge University Press, Cambridge, 1994.

4. Miled N., Canaan S., Dupuis L., Roussel A., Riviere M., Carriere F., de Саго A., Cambillau C., Verger R. Digestive lipases: From three-dimensional structure to physiology. // Biochimie. (2000) 82: 973-986.

5. Carriere F., Bezzine S., Verger R. Molecular evolution of the pancreatic lipase and two related enzymes towards different substrate selectivities. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic, (1997) 3: 55-64.

6. Borgstrom B, Brockman H.L. Lipases. Elsevier, Amsterdam, 1984.

7. Mukheijee K.D., Hills M.J. Lipolytic Enzymes. Brockerhoff H., Jensen R.G. (Eds.), Academic Press, New York, 1974, v. 21,49-76.

8. Jaeger K.E., Ransas S., Dijkstra B.W., Colson C., van Heuvel M., Misset O. Bacterial lipases. //FEMS Microbiol. Rev. (1994) 15: 29-63.

9. Gilbert E.J. Pseudomonas lipases: biochemical properties and molecular cloning. It Enzyme Microb. Technol. (1993) 15: 634-645.

10. Wohlfahrt S., Jaeger K.E. Bacterial lipases: biochemistry, molecular genetics and application in biotechnology. // Bioengineering. (1993) 9:39-46.

11. Aires-Barros M.R., Taipa M.A., Cabral J.M.S. Isolation and purification of lipases. Wooley P., Petersen S.B. (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge, 1994,243-270.

12. Carriere F., Barrowman J.A., Verger R., Laugier R. Secretion and contribution to Iipolysis of gastric and pancreatic lipases during a test meal in humans. II Gastroenterology. (1993) 105:876-888.

13. Verger R. Lipases. Borgstrom В., Brockman H.L. (Eds.), Elsevier, Amsterdam (1984) 83-150.

14. Garner C.W., Smith L.C. Porcine pancreatic lipase: A glycoprotein. // J.Biol. Chem. (1972)247:561-565.

15. Verger R., de Haas G.H., Sarda L., Dcsnuelle P. Purification from porcine pancreas of two molecular species with lipase activity. // Biochim. Biophys. Acta. (1969) 188:272 282.

16. Plummer Т.Н., Sarda L. Isolation and characterization of the glycopeptides of porcine pancreatic lipase LA and LB. // J. Biol. Chem. (1973) 248: 7865-7869.

17. Isobe M., Sugiura M. Studies on the lipase of Chromobacterium viscosum. V. Physical and chemical properties of the lipases. // Chem. Pharm. Bull. (1977) 25: 1980- 1986.

18. Taipa M.A., Liebeton K., Costa J.V., Cabral J.M., Jaeger K.E. Lipase from Chromobacterium viscosum: biochemical characterization indicating homology to the lipase from Pseudomonas glumae. // Biochim. Biophys. Acta. (1995) 1256: 396 402.

19. Lotti M., Tramontano A., Longhi S., Fusetti F., Brocca S., Pizzi E., Alberghina L. Variability within the Candida rugosa lipases family. // Protein Eng. (1994) 7: 531-535.

20. Huge-Jensen В., Galluzzo D.R., Jensen R.G. Partial purification and characterization of free and immobilized lipase from Mucor miehei. Л Lipids. (1978) 22: 559-565.

21. Nagato Т., Shimada Y., Sugihara A., Tominaga Y. Cloning and sequencing of two chromosomal lipase genes from Geotrichum candidum. И J. Biochem. (1993) 113: 776-780.

22. Veeraragavan K., Colpitts Т., Gibbs B.F. Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum. // Biochim. Biophys. Acta. (1990) 1044: 26-33.

23. Sugihara A., Shimada Y., Tomonaga Y. Separation and characterization of two molecular forms of Geotrichum candidum lipase. // J. Biochem. (1990) 107: 426-430.

24. Semeriva M., Benzonana G., Desnuelle P. Some properties of a lipase from Rhizopus arrhizus: Separation of a glycopeptide bound to the enzyme. // Biochim. Biophys. Acta. (1969) 191:598-610.

25. Sarda L., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on emulsified esters. // Biochim. Biophys. Acta. (1998) 37:1608-1633.

26. Winkler F.K., D'Arcy A., Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase // Nature. (1990)343:771-774.

27. Grochulski P., Li J., Schrag J.D., Bouthillien F., Smith P., Harrisn D., Rubin В., Cygler M. Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase. // J. Biol. Chem. (1993) 268: 12843-2847.

28. Schrag J.D., Cygler M. 1.8 A refined structure of the lipase from Geotrichum candidum. //J. Mol. Biol. (1993)230: 575-591.

29. Bourne Y., Martinez C., Kerfelec В., Lombardo D., Chapus C., Cambillau C. Horse pancreatic lipase. The crystal structure refined at 2.3 A resolution. // J. Mol. Biol. (1994) 238: 709-732.

30. Derevenda U., Swenson L., Green R., Wei Y., Dodson G.G., Yamaguchi S., Haas M.J., Derevenda Z.S. An unusual buried polar cluster in a family of fungal lipases. // Nat. Struct. Biol. (1994) 1:36-47.

31. Noble M.E.M., Cleasby A., Johnson L.N., Frenken L.G.J., Egmond M.R. The crystal structure of triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate.//FEBS Lett. (1993)331: 123-128.

32. Uppenberg J, Patkar S, Bergfors T, Jones ТА. Crystallization and preliminary X-ray studies of lipase В from Candida antarctica //J Mol Biol. (1994) 235:790-792.

33. Jaeger K.E., Ransac S., Koch H.B., Ferrato F., Dijkstra B.W. Topological characterization and modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa. II FEBS Lett. (1993) 332:143-149.

34. Nardini M., Lang D.A., Liebeton K., Jaeger K.-E., Dijkstr B.W. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation. // J. Biol. Chem. (2000) 275: 3121931225.

35. Hjorth A., Carri ere F., Cudrey C., Woldike H., Boel E., Lawson D.M., Verger R. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospho)lipase. // Biochemistry. (1993) 32: 4702-4707.

36. Jennens M.L., Lowe M.E. A surface loop covering the active site of human pancreatic lipase influences interfacial activation and lipid binding. // J. Biol. Chem. (1994) 269: 2547025474.

37. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B.D., Frolow F., Franken S., Harel M., Remington S.J., Silman J. The alpha / beta hydrolase fold. // Protein Eng. (1992) 5: 197-211.

38. De Caro J.D., Boundouard M., Bonicel J.J., Guidoni A., Desnuelle P., Rovery M. Porcine pancreatic lipase: completion of the primary structure. // Biochim. Biophys. Acta. (1981) 671: 129-138.

39. Benkouka F., Guidoni A., De Caro J.D., Bonicel J.J., Desnuelle P., Rovery M. Porcine pancreatic lipase. The disulfide bridges and the sulfhydryl groups. // Eur. J. Biochem. (1982) 128:331-341.

40. Fournet В., Leroy Y., Montreuil J., De Caro J., Rovery M., van Kuik J.A., Vliegenthart J.F.G. Primary structure of the glycans of porcine pancreatic lipase. // Eur. J. Biochem. (1987) 170:369-371.

41. Egloff M.P., Marguet F., Buono G., Verger R., Cambillau C., van Tilbeurgh H. The 2.46A resolution structure of the pancreatic lipase-colipase complex inhibited by a CI 1 alkyl phosphonate. // Biochemistry. (1995) 34:2751-2762.

42. Derewenda Z.S., Derevvenda U. The crystal and molecular structure of the Rhizomucor miehei triacylglyceride lipase at 1.9 A resolution. // J. Mol. Biol. (1992) 227: 818-839.

43. Lang D., Hofmann В., Haalck L., Hecht H.-J., Spener F., Schmid R.D., Schomburg D. Crystal structure of bacterial lipase from Chromobacterium viscosum ATCC 6918 refined at 1.6A resolution. //J. Mol. Biol. (1996) 259:704-717.

44. Derevvenda U., Derewenda Z.S. Relationships among serine hydrolases: evidence for a common structural motif in triacylglyceride lipases and esterases. // Biochem. Cell. Biol. (1991) 169: 842-851.

45. Derewenda Z.S., Sharp A.M. News from the interface: the molecular structures of triacylglyceride lipases.//TIBS. (1993) 18:20-25.

46. Blow D. Lipases reach the surface. //Nature. (1991) 351:444-445.

47. Verger R., Mieras M.C.E., Haas G.H. Action of phospholipase A at interfaces. // J. Biol. Chem. (1973) 248: 4023-4045.

48. Verger R. Enzyme kinetics of lipolysis. // Methods Enzymol. (1980) 64: 340-392.

49. Jain M.K., Berg O.G. The kinetics of interfacial catalysis by phospholipase Аг and regulation of interfacial activation: hopping versus scooting. // Biochim. Biophys. Acta. (1989) 1002: 127-156.

50. Bengtsson G., Olivecrona T. Lipoprotein lipase moves rapidly between lipid droplets. // FEBS Lett. (1983) 154:211-213.

51. Benzonana G., Desnuelle P. Action of some effectors on the hydrolysis of long-chain triglycerides by pancreatic lipase. // Biochim Biophys Acta. (1968) 164 (1): 47-58.

52. Entressangles В., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on aggregated glyceride molecules in an isotropic system. // Biochim. Biophys. Acta. (1968) 159 (2): 285-295.

53. Borgstrom B. Effect of taurocholic acid on the pH / activity curve of rat pancreatic lipase. //Biochim Biophys Acta. (1954) 13 (1): 149-150.

54. Han D., Rhee J.S. Characteristics of lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT-isooctane reversed micelles // Biotechnol. Bioeng. (1986) 28: 1250-1255.

55. Hofmann A.F., Borgstrom B. The intraluminal phase of fat digestion in man: the lipid content of the micellar and oil phases of intestinal content obtained during fat digestion and absorption.//J. Clin. Invest. (1964) 43:247-257.

56. Hofmann A.F., Small D.M. Detergent properties of bile salts: correlation with physiological function. // Annu Rev Med. (1967) 18:333-376.

57. Schoor W.P., Melius P. The influence of sodium taurocholate on the pancreatic lipase-substrate adsorption and activity // Biochim. Biophys. Acta. (1970) 212: 173-175.

58. Alvarez F.J., Stella V.J. The role of calcium ions and bile salts on the pancreatic lipase-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin. // Pharm. Research. (1989) 6 (6): 449-457.

59. Patton J.S., Carey M.C. Inhibition of human pancreatic lipase-colipase activity by mixed bilesalt-phospholipidmicelles.//Am. J. Physiol. (1981)241: G328-G336.

60. Lairon D., Nalbone G., Lafont H., Leonardi J., Domingo N, Hauton J.C., Verger R. Possible roles of bile lipids and colipase in lipase adsorption. // Biochemistry. (1978) 17: 52635269.

61. Lairon D., Nalbone G., Lafont H., Leonardi J., Domingo N, Hauton J.C. Protective effect of biliary lipids on rat pancreatic lipase and colipase. // Lipids. (1978) 13:211-216.

62. Masoro E.J. Lipids and lipid metabolism. // Annu. Rev. Physiol. (1977) 39: 301-321.

63. Borgstrom B. Importance of phospholipids, pancreatic phospholipase A2 and fatty acid for the digestion of dietary fat: in vitro experiments with the porcine enzymes. // Gastroenterology. (1980) 78: 954-962.

64. Nalbone G., Charbonnier-Augeire M., lafont H., Grataroli R., Vigne J.L., Lairon D., Chabert C., Leonardi J., Hauton C., Verger R. Adsorption of pancreatic (pro)phospholipase A2 to various physiological substrates. // J. Lipid Res. (1983) 24: 1441-1450.

65. Pignol D., Ayvazian L., Kerfelec В., Timmins P., Crenon I., Hermoso J., Fontecilla-Camps J.C., Chapus C. Critical role of micelles in pancreatic lipase activation revealed by angle neutron scattering. //J.Biol. Chem. (2000) 275 (6): 4220-4224.

66. Pedersen J.S., Egelhaaf S., Schurtenberger P. Critical role of micelles in pancreatic lipase activation revealed by small angle neutron scattering// J. Physiol. Chem. (1995) 99:1299-1305.

67. Tso P., Scobey M. Fat Absorption. A. Kuis (Ed.), CRC Press, Boca Raton, Fla., 1986, v. 1, 177-196.

68. Hauser H., Guyer w., Howell K. Lateral distribution of negatively charged lipids in lecithin membranes. Clustering of fatty acids. // Biochemistry. (1979) 18:3285-3291

69. Neuman R.D. Calcium binding in stearic acid monomolecular films. // J. Colloid. Interface Sci. (1975) 53: 161-171

70. Wieloch Т., Borgstrom В., Pieroni G., Pattus F., Verger R. Product activation of pancreatic lipase. Lipolytic enzymes as probes for lipid/water interfaces. // J. Biol. Chem. (1982) 257(19): 11523-11528

71. Ramsey H.A., Wise G.H.,Tove S.B. Fat digestion.//J. Dairy Sci. (1956) 10: 1319-1322.

72. Borgstrom В., Dahlquist A., Ludh G., Sjovall J. Studies of intestinal digestion and absorption in the human. //J. Clin. Invest. (1957) 36:1521-1536.

73. Hamosh M., Scow R.O. Lingual lipase and its role in the digestion of dietary lipid. // J.Clin. Invest. (1973) 52: 88-95.

74. Plucinski T.M., Hamosh M., Hamosh P. Fat digestion in rat: role of lingual lipase. //Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. (1979) 237: 541-547.

75. Willstatter R., Waldschmitz Leitz E., Memmen F. Lipase studies. // Physiol. Chem. (1923) 125: 93-95.

76. Gargouri Y., Pieroni G., Riviere C., Sugihara A., Sarda L., Verger R. Inhibition of lipases by proteins: a kinetic study with dicaprin monolayers. // J. Biol. Chem. (1985) 260:2268-2273.

77. Canioni P., Julien R., Rathelot J., Sarda L. Pancreatic and microbial lipases: comparison of inreaction of pancreatic colipase with lipases of various origins. // Lipids (1977) 12: 393-397.

78. Figarella C., Negri G.A., Sarles H. Presence of colipase in a congenital pancreatic lipase deficiency. // Biochim. Biophys. Acta. (1972) 280:205-207.

79. Kason C.M., Pavamani I.V.P., Nakai S. Physiological importance of mammalian colipase in fat digestion. // J. Dairy Sci. (1972) 55: 1420-1425.

80. Momsen W.E., Brockman H.L. Inhibition of pancreatic lipase В activity by taurudeoxycholate and its reversal by colipase. // J. Biol. Chem. (1976) 251:384-388.

81. Brockerhoff H. Substrate specificity of pancreatic lipase: influence of the structure of fatty acids on the reactivity of esters. // Biochim. Biophys. Acta. (1970) 212: 92-101.

82. Larsson A., Erlanson-AIbertsson C. The importance of bile salt for the reactivation of pancreatic lipase by colipase. // Biochim. Biophys. Acta. (1983) 750: 171-177.

83. Brockerhoff H. A model of pancreatic lipase and the orientation of enzymes at interfaces. //Chem. Phys. Lipids. (1973) 10: 215-222.

84. Borgstrom В., Erlanson C. Pancreatic juice colipase: physiological importance. // Biochim Biophys Acta. (1971) 242: 509-513.

85. Morgan R.G.H., Hoffman N.E. The interacion of lipase, lipase cofactor and bile salts in triglyceride hydrolysis. // Biochim. Biophys. Acta. (1971) 248: 143-147.

86. Lowe M.E., Rosenblum J.L., McEvven P., Strausss A.W Cloning and characterization of the human colipase cDNA. // Biochemistry. (1990) 29: 823-828.

87. Charles M., Erlanson C., Biachetta J., Joffre J., Guidoni A., Rovery M. The primary structure of porcine colipase. I. The amino acid sequence. // Biochim. Biophys. Acta. (1974) 359:186-197.

88. Erlanson C., Charles M.A., Desnuelle P. The primary structure of colipase. // Biochim. Biophys. Acta. (1974) 359: 198-203.

89. Erlanson C., Borgstrom B. Purification and futher characterization of colipase from porcine pancrease. // Biochim. Biophys. Acta. (1972) 271:400-412.

90. Borgstrom В., Wieloch Т., Erlanson-AIbertsson C. Evidence for a pancreatic pro-colipase and its activation by trypsin. // FEBS Lett. (1979) 108:407-410.

91. Erlanson-AIbertsson C. The existence of pro-colipase in pancreatic juice. // Biochim. Biophys. Acta. (1981) 666:299-300.

92. Larsson A., Erlanson-AIbertsson C. The effect of pancreatic procolipase and colipase on pancreatic lipase activation. // Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1983:283-288.

93. Erlanson-Albertsson С. Enterostatin: the pancreatic procolipase activation peptide a signal for regulation of fat intake. // Nutr. Rev. (1992) 50: 307-310.procolipase complex. //Nature. (1992) 359: 159-162.

94. Chaillan C., Rogalska E., Chapus C., Lombardo D. A cross-linked complex between horse pancreatic lipase and colipase. // FEBS Lett. (1989) 257:443-446.

95. Chaillan C., Kerfelec В., Foglizzo E., Chapus C. Direct involvement of the C-terminal extremity of pancreatic lipase (403-449) in colipase binding. // Biochim. Biophys. Acta. (1992) 184:206-211.

96. Mahe-Gouhier N., Leger CL. Immobilized colipase affinities for lipase В, А, С and their terminal peptide (336-449): the lipase recognition site lysine residues are located in the C-terminal region. II Biochim. Biophys. Acta. (1988) 962: 91-97.

97. Abousalhan A., Chaillan C., Kerfelec В., Foglizzo E., Chapus C. Uncoupling of catalysis and colipase binding in pancreatic lipase by limited proteolysis. // Protein Eng. (1992) 5: 105111.

98. Patton J.S., Albertsson P.A., Erlanson C., Borgstrom B. Binding of porcine pancreatic lipase and colipase in the absence of substrate studied by two-phase partition and affinity chromatography. //J. Biol. Chem. (1978) 253:4195-4202.

99. Larsson A., Erlanson-Albertsson C. The identity and properties of two forms of activated colipase from porcine pancreas. // Biochim. Biophys. Acta. (1981) 664: 538-548.

100. Wieloch Т., Borgstrom В., Falk K-E., Forsen S. High-resolution proton magnetic resonance study of porcine colipase and its interactions with taurodeoxycholate. // Biochemistry. (1979) 18: 1622-1628.

101. De Caro J.D., Behnke W.D., Bonicel J.J., Desnuelle P.A., Rovery M. Nitration of the tyrosine residues of porcine pancreatic colipase with tetranitromethane, and properties of the nitrated derivatives. // Biochim. Biophys. Acta. (1983) 747:253-262,

102. Granon S. Spectrofluorimetric study of the bile salt micelle binding site of pig and horse colipase. // Biochim. Biophys. Acta. (1986) 874: 54-60.

103. Jennens M.L., Lowe M.E. The C-terminal domain of human pancreatic lipase is required for stability and maximal activity but not colipase reactivation. // J. Lipid. Res. (1995) 36: 10291036.

104. Kaambre Т., Tougu V., Kaambre P., Vija H., Sikk P. Hydrolysis of emulsified mixtures of triacylglycerols by pancreatic lipase. //Biochim. Biophys. Acta. (1999) 1431:97-106.

105. Mattson F.H., Beck L.W. The digestion in vitro of triglycerides by pancreatic lipase. // J. Biol. Chem. (1955) 214: 115-125.

106. Mattson F.H., Beck L.W. The specificity of pancreatic lipase for the primary hydroxyl groups of glycerides. // J. Biol. Chem. (1956) 219: 735-740.

107. Savary P., Desnuelle P. Specific elements of enzymatic hydrolysis of triglycerides // Biochim. Biophys. Acta. (1956) 21: 349-360.

108. Leger C. Lipase purification trial of trout intercaecal tissue. // Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys. (1972) 12:341-345.

109. Brockerhoff H., Hoyleee R.J. Hydrolysis of triglycerides by the pancreatic lipase of a skate. // Biochim. Biophys. Acta. (1965) 98:435-436.

110. Berner D., Hammand E.G. Phylogeny of lipase specificity. // Lipids. (1970) 5: 558-562.

111. Coutts J.R.T., Stansfield D.A. Pancreatic cholesterol esterases: a comparative study. // Biochemistry. (1967) 104: 27-32.

112. Pleis J., Fischer M., Schmid R.D. Anatomy of lipase binding sites: the scissile fatty acid binding site. II Chem. Phys. Lip. (1998) 93:67-80.

113. Tattrie N.H., Bailey R.A., Kates M. The action of pancreatic lipase on stereoisomeric triglycerides.//Arch. Biochem. Biophys. (1958) 78: 319-327.

114. Jensen R.G., Pitas R.E., Quinn J.G., Sampugna J. Pancreatic lipolysis of enantiomeric triglycerides.//Lipids.(1970) 5: 580-581.

115. Rogalska E.,Cudrey C., Ferrato F., Verger R. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases. // Chirality. (1993) 5: 24-30.

116. Rogalska E.,Ransac S., Verger R. Stereoselectivity of lipases. II. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by gastric and pancreatic lipases. // J. Biol. Chem. (1990) 265:2027120276.

117. Chandler I.C., Quinlan P.T., Mcneill G.P. Lipase-catalyzed synthesis of chiral triglycerides. //J. Am. Oil. Chem. Soc. (1998) 75:1513-1518.

118. Alford J.A., Pierce D.A., Suggs F.G. Activity of microbial lipases on natural fats and synthetic triglycerides. //J. Lipid Res. (1964) 5:390-394.

119. Ory R.L., St. Angelo A.J., Altshul A.M. Castor bean lipase: action on its endogenous substrate. //J. Lipid Res. (1960) 1:208-213.

120. Berner D.L., Hammond E.G. Specificity of lipase from several seeds and Leptospira pomona. //Lipids. (1970) 5: 572-573.

121. Shastry B.S., Rao M.R. Studies on rice bran lipase. // J. Biochem. Biophys. (1971) 8: 327-332.

122. Entressangles В., Pasero L., Savary P., Sarda L., Desnuelle P. Influence of the nature of the chains on the rate of their hydrolysis by pancreatic lipase. // Bull. Soc. Chim. Biol. (1961) 43: 581-591.

123. Mani V.V.S., lakshminarayana G. Comparative rate of lipolysis of different fatty acids in pancreatic lipase hydrolysis of ethylene glycol mixed diesters. // Biochim. Biophys. Acta. (1970) 202: 547-549.

124. Hellyer S.A., Chandler I.C., Bosley J.A. Can the fatty acid selectivity of plant lipases be predicted from the composition of the seed triglyceride? // Biochim. Biophys. Acta. (1999) 1440: 215-224.

125. Jensen R.G., Sampugna J., Quinn J.G., Carpenter D.L., Marks T.A. Specificity of a lipase from Geotrichum candidum for cis-octadecenoic acid. // J. Amer. Oil. Chem. Soc. (1965) 42: 1029-1032.

126. Jensen R.G., Gordon D.T., Scholfield E.R. Specificity of Geotrichum candidum lipase with respect to double bond position in triglycerides containng cis-octadecenoic acids. // Lipids. (1972) 7:738-741.

127. Charton E., Macrae A.R. Specificities of immobilized Geotrichum candidum CMICC335426 lipase A and В in hydrolysis and ester synthesis in organic solvents. // Enz. Microbiol. Technol. (1993) 15: 489-493.

128. Charton E., Macrae A.R. Substrate specificities of lipases A and В from Geotrichum candidum CMICC335426. // Biochim. Biophys. Acta. (1992) 1123: 59-64.

129. Lie O., Lambertsen O.G. Fatty acid specificity of Candida cylindracea lipase. // Fett. Siefen. Ansstrichm. (1986) 88:365-367.

130. Kleiman R., Earle F.R., Tallcnt W.H., Wolff I.A. Retarded hydrolysis by pancreatic lipase of seed oils with trans-3 unsaturation. // Lipids. (1970) 5:513 -518.

131. Brockerhoff H. Substrate specificity of pancreatic lipase. Influence of the structure of fatty acids on the reactivity of esters. // Biochim. Biophys. Acta. (1970) 212:92-101.

132. Heimermann W.H., Holman R.T., Gordon D.T., Kowalyshyn D.E., Jensen R.G. Effect of double bond position in octadecenoates upon hydrolysis by pancreatic lipase. // Lipids. (1973) 8: 45-47.

133. Macrae A.R., Visicchio J.E., Lanot A. Application of potato lipid acyl hydrolase for the synthesis ofmonoacylglycerols. //J. Am. Oil. Chem. Soc. (1998) 75: 1489-1494.

134. Yamaguchi S., Mase T. High yield synthesis of monoglyceride by mono- and diacylglycerol lipase from Penicillium camembertii U-150. // J. Ferm. Bioeng. (1991) 72: 162167.

135. Ferrato F., Cam ere F., Sarda L., Verger R. A critical reevaluation of the phenomenon of interfacial activation. // Methods Enzymol. (1997) 286:327-347.

136. Beisson F„ Tiss A., Riviere C., Verger R. Methods for lipase detection and assay: a critical review. // Eur. J. Lipid. Sci. Technol. (2000) 133-153.

137. Verger R., de Haas G.H. Enzyme reaction in a membrane model. 1: A new technique to study enzyme reactions in monolaters. // Chem. Phys. Lipids. (1973) 10: 127-136.

138. Aoubala M., Ivanova M., Douchet I., De Caro A., Verger R. Interfacial binding of human gastric lipase to lipid monolayers, measured with an ELISA. // Biochem. (1995) 34: 1078610793.

139. Momsen W.E., Brockman H.L. Recovery of monomolecular films in studies of lipolysis. // Methods Enzymol. (1997) 286:292-305.

140. Rietsch J., Pattus F., Desnuelle P., Verger R. Enzyme reactions in a membrane model. III. Futher studies of mode of action of lipolytic enzymes. //J. Biol. Chem. (1977) 252: 4313-4318.

141. Momsen W.E., Brockman H.L. The adsorption to and hydrolysis of 1,3-didecanoyl glycerol monolayers by pancreatic lipase. Effect of substrate packing density. // J. Biol. Chem. (1981)256: 6913-6916.

142. Nielsen L., Risbo J., Callisen Т., Bjornholm T. Lag-burst kinetics in phospholipase A2 hydrolysis of DPPC bilayers visualized by atomic force microscopy. // Biochim. Biophys. Acta. (1999) 1420:266-271.

143. Walde P., Luisi P.L. A continuous assay for lipases in reverse micelles based on Fourier transform infrared spectroscopy. H Biochem. (1989) 28: 3353-3360.

144. Brockman H.L. Triglyceride lipase from porcine pancreas. // Methods Enzymol. (1981) 71:619-627.

145. Entressangles В., Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on aggregated glyceride molecules in an isotopic system. // Biochim. Biophys. Acta. (1968) 159:285-295.

146. Hoppe A., Theimer R.R. Titrimetric test for lipase activity using stabilized triolein emulsion. // Phytochem. (1996) 42: 973-978.

147. Ceriotti F., Bonin P.A., Murone M., Barenghi L., Luzzana M., Mosca A., Ripamonti M. Measurement of lipase activity by differential pH technique. // Clin. Chem. (1985) 31:257-260.

148. Tietz N.W., Astles J.R., Shuey D.F. Lipase activity measured in serum by a continuous-monitoring pH-stat technique: an update. // Clin. Chem. (1989) 35: 1688-1693.

149. Ravvyler A., Siegenthaler P.A. A single and continuous spectrophotometry assay for various lipolytic enzymes, using natural, non-labelled lipid substrates. // Biochim. Biophys. Acta. (1989) 1004: 337-344.

150. Duncombe W.G. The colorimetric determination of long-chain fatty acids in the 0.05-0.5 jimole range. // Biochem. J. (1963) 88: 7.

151. Mahadevan S., Dillard C.J., Tappel A.L. A modified colorimetric micro method for long-chain fatty acids and its application for assay of lipolytic enzymes. // Anal. Biochem. (1969) 27: 387-396.

152. Kwon D.Y., Rhee J.S. A simple and rapid colorimetric method for determination of free fatty acids for lipase assay. // J. Am. Oil. Chem. Soc. (1986) 63: 89-92.

153. Kouker G., Jaeger K.E. Specific and sensitive plate assay or bacterial lipases. // Appl. Environ. Microbial. (1987) 53:211-213.

154. Chapus C., Semeriva M., Bovier-Lapierre C., Desnuelle P. Mechanism of pancreatic lipase action. 1. Interfacial activation of pancreatic lipase. // Biochem. (1976) 15:4980-4987.

155. Vorderwulbecke Т., Kieslich K., Erdmann H. Comparison of lipases by different assays. // Enzyme. Microb. Technol. (1992) 14: 631-639.

156. Mosmuller E.W.J., van Heemst J.D.H., van Delden C.J., Franssen M.C.R., Engbersen J.F.J. A new spectrophotometric method for the detection of lipase activity using 2,4-dinitrophenyl butirate as a substrate. // Biocatalysis. (1992) 5:279-278.

157. Whitaker J. A rapid and specific method for the determination of pancreatic lipase in serum and urine. // Clin. Chim. Acta. (1973) 44: 133-138.

158. Rogel A.M., Stone W.L., Adebonojo F.O. A novel spectrometry assay for lipase activity utilizing cis-parinaric acid. // Lipids. (1989) 24:518-524.

159. Biesson F., Ferte N., Nari J., Noat G., Arondel V., Verger R. Use of naturally fluorescent triacylglicerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. // J. Lipid Res. (1999) 40:2313-2321.

160. WolfC., Sagaert L., Bereziat G. A sensitive assay of phospholipase using the fluorescent probe 2-parinaroellecitin. // Biochem. Biophys. Res. Comm. (1981) 99:275-283.

161. Hendrickson H.S., Rauk P.N. Continuous assay of phospholipase A2 with pyrene-labelled lecithin as a substrate. // Anal. Biochem. (1981) 116: 553-558.

162. Thuren Т., Virtanen J.A., Verger R., Kinnunen P.K.J. Hydrolysis of l-palmitoyl-26-(pyren-l-yl)]-hexanoyl-sn-glycerol-3-phospholipids by phospholipase Аг*. Effect of the polar head-group. // Biochim. Biophys. Acta. (1987) 917:411-417.

163. Negre A., Salvayre R.S., Dagan A., Gatt S. New fluorometric assay of lysosomal acid and its application to the diagnosis of Wolman and cholesteryl ester storage diseases. // Clin. Chim. Acta. (1985) 149:81-88.

164. Negre A., Salvayre R.S., Dagan A., Gatt S. Pyrenemethel laurate, a new fluorescent substrate for continuous kinetic determination of lipase activity. // Biochim. Biophys. Acta. (1989) 1006: 84-88.

165. Fleisher M., Schwartz M. An automated, fluorometric procedure for determining serum lipase. // Clim. Chem. (1971) 17:417-422.

166. Wilton D.C. A continuous fluorescence-displacement assay for triacylglycerol lipase and phospholipase С that also allows the measurement of acyglycerols. // Biochem. J. (1991) 219: 129-260.

167. Mangold H. Lipids. Zweig G., Sherma J. (Eds.), CRC press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984.

168. Kates M. Techniques of lipidology: isolation, analysis and identification of lipids. Burdon R.H., van Knippenberg P.H. (Eds.), Elsevier, Amsterdam, New York, 1986.

169. Maurich V., Moneghini M., Zacchigna M., Pitotti A., Lencioni E. High-perfomance liquid chromatographic assay of pancreatic lipase activity. // J. Pharm. Biomed. Anal. (1991) 9: 427-431.

170. Maurich V., Zacchigna M., Pitotti A. p-Nitrophenyllaurate: a subsrate for the high-performance liquid chromatographic assay of pancreatic lipase activity. // J. Chromatogr. (1991) 566:453-459.

171. Ruiz L., Rodriguez-Fernandez C. Kinetic study of hepatic triglyceride lipase from rat liver soluble fraction. II Enzyme. (1982) 27:215-219.

172. Ulitzur S., Heller M. Bioluminescent assay for lipase, phospholipase A2, and phospholipase C. // Methods. Enzymol. (1981) 72: 338-346.

173. Proelss F., Wright B.W. Lipoxygenic micromethod for specific determination of lipase activity in serum and duodenal fluid. // Clin. Chem. (1977) 23: 522-531.

174. Griebel R.J., Knoblocj E.C., Koch T.R. Measurement of serum lipase activity with the oxygen electrode. // Clin. Chem. (1981) 27: 163-167.

175. Shimizu S., Tani Y., Yamada H., Tabata M., Murachi T. Enzymatic determination of serum-free acids: a colorimetric method. // Anal. Biochem. (1980) 107: 193-198.

176. Bjoerkhem I., Sandelin K., Thore A. A simple, fully enzymic bioluminescent assay for triglycerides in serum. // Clin. Chem. (1982) 28: 1742-1744.

177. Imamura S., Hirayama Т., Arai Т., Takao K., Misaki H. An enzymatic method using 1,2-diglyceride for pancreatic lipase test in serum. // Clin. Chem. (1989) 35: 1126-1129.

178. Mensink R.P., Katan M.B. Effect of dietary trans fatty acids on the high-density and low-density lipoprotein cholesterol levels in healthy subjects. // Eng. J. Med. (1990) 323:439-345.

179. Mukheijee K.D. Lipase catalyzed reactions for modification of fats and other lipids. // Biocatalysis. (1990) 3:277-293.

180. Forssell P., Kervinen R., Lappi M., Linko P., Suortii Т., Poutanen K. Effect of enzymatic interesterification on the melting point of tallow-rapeseed oil (LEAR) mixture. // J. Am. Oil. Chem. Soc. (1992) 69: 126-129.

181. Zeitoun M.A.M., Neff W.E., List G.R., Mounts T.L. Physical properties of interesterified fat blends. //J. Am. Oil. Chem. Soc. (1993) 70:467-471.

182. Rouseau D., Marangoni A.G. Tailoring the textural attributes of butter fat/canola oil blends via Rhizopus arrhizus lipase-catalyzed interesterification. 1. Compositional modification. // J. Agric. Food. Chem. (1998) 46:2368-2374.

183. Rouseau D., Marangoni A.G. Tailoring the textural attributes of butter fat/canola oil blends via Rhizopus arrhizus lipase-catalyzed interesterification. 2. Modifications of physical properties.//J. Agric. Food. Chem. (1998) 46:2375-2381.

184. Bloomer S., Adlercreutz P., Mattiasson B. Triglyceride interesterification by lipases. I. Cocoa butter equivalents from a fraction of palm oil. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1990) 67: 519524.

185. Mohamed H.M.A., Bloomer S., Hammadi K. Modification of fats by lipase interesterification. I. Changes in triglyceride structure. // Fat. Sci. Technol. (1993) 95:428-431.

186. Basheer S., Mogi K., Nakajima M. Interesterification kinetics of triglycerides and fatty acids with modified lipase in n-hexane.//J.Am. Oil. Chem. Soc. (1995) 72: 511-518.

187. Bracco U. Effect of triglyceride structure on fat absorption. // J.Am. Clin. Nutr. (1994) 60: 1002-1009.201 . Kennedy J.P. Srtructured lipids: fats for the future. // Food Technol. (1991) 45: 76-83.

188. Schmid U. Highly selective synthesis of l,3-oleoyl-2-palmitoy!glycerol by lipase catalysis. //Biotechnol. Bioeng. (1999) 64: 678-684.

189. Quilan P., Moore S. Modification of triglycerides by lipases: process technology and its application to the production of nutritionally improved fats. // INFORM (1990) 4: 580-585.

190. Haraldsson G.G. Using biotechnology to modify marine lipids. // INFORM. (1992) 3: 626-629.

191. Sridhar R., Lakshminarayana G. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into groundnut oil by lipase-catalyzed ester interchange. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1992) 69: 1041-1044.

192. Diks R.M.M., Lee M.J. Production of a very low saturate oil based on the specificity of Geotrichum candidum lipase. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1999) 76: 455-462.

193. Vulfson E.N. Lipases: their structure, biochemistry and application. Wooley P., Petersen S.B (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge, 1994,271-286.

194. Hoshimo Т., Yamane Т., Shimizu S. Selective hydrolysis of fish oil by lipase to concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids. // Agric. Biol. Chem. (1990) 54: 1459-1467.

195. Tanaka Y., Hirano J., Funada T. Concentration of docosahexaenoic acid by gliceride by hydrolysis of fish oil with Candida cylindracea lipase. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1992) 69: 12101214.

196. Shimada Y., Sugihara A., Nakano H., Kuramoto Т., Nagao Т., Gemba M., Tomonaga Y. Purification of docosahexaenoic acid by selective esterification of fatty acids from tuna oil with Rhizopus delemar lipase. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1997) 74:97-101.

197. McNeill G.P., Ackhman R.G., Moore S.R. Lipase-catalyzed enrichment of long-chain polyunsaturated fatty acids. //J.Am. Oil. Chem. Soc. (1996) 73: 1403-1407.

198. Akoh C.C. Lipase-catalyzed synthesis of partial glyceride. // Biotechnol. Lett. (1993) 15: 949-954.

199. McNiell G.P., Shimizu S., Yamane T. High-yield glycerolysis of oils and fats. // J. Am. Oil. Chem. Soc. (1991) 68: 1-5.

200. Berger M., Schneider M.P. Enzymatic esteriflcation of glycerol. II. Lipase-catalyzed synthesis of regioisometrically pure l(3)-rac-monoacyl glycerols. // J.Am. Oil. Chem. Soc. (1992) 69: 961-965.

201. Bornscheuer U., Stamatis H., Xenakis A.T., Yamane Т., Kolisis F.N. A comparison of different strategies for lipase-catalyzed synthesis of partial glycerides. // Biotechnol. Lett. (1994) 16:679-702.

202. Millqvist A., Adlercreutz P., Mattiasson B. Lipase-catalyzed alcoholysis of triglycerides for the preparation of 2-monoglycerides. // Enzyme Microb. Technol. (1994) 16:1042-1047.

203. Bellot J.C., Choisnard L., Castillo E., Marty A. Combining solvent engineering and thermodynamic modeling to enhance selectivity during monoglyceride synthesis by lipase-catalyzed esteriflcation. // Enzyme. Microb. Technol. (2001) 28:362-369.

204. Boel E., Christensen Т., Woldike H. (Novo Nordisk AS), US-A 5536661, 1996 // Chem. Abstr. (1996) 125: 160364.

205. Fujita Y., Awaji H., Matsukura M., Hata K., Shimoto H., Sharyo M., Skaguchi H., Gibson K. Recent advances in enzymic pitch control. // Tappi J. (1992) 75:117-122.

206. Benicourt C., Blanchard C,, Carruere F., Verger R., Junien J.L. Clinical ecology in cystic fibrosis. Escobar H., Baquero C.F., Suarez L. (Eds.), Elsevier, Amsterdam, 1993,291-295.

207. Lankisch P.G. Enzyme treatment of exocrine pancreatic insufficiency in chronic pancreatitis. // Digestion. (1993) 54:21-29.

208. Wickler-Planquart C., Canaan S., Riviere M., Dupuis L., Verger R. Expression in insect cells and purification of a catalytically active recombinant human gastric lipase. // Protein Eng.1996)9: 1225-1232.

209. Suzuki A., Mizumoto A., Sarr M.G., Dimagno E.P. Bacterial lipase and high-fat diets in canine exocrine pancreatic insufficiency: a new therapy of steatorrhea. II Gastroenterology.1997) 112:2048-2055.

210. Bennet W. Dietary treatments of obesity. // Ann. N.Y. Acad Sci. (1987) 499: 250-263.

211. Zhi J., Melia G„ Kosstwardy S.G., Min В., Guerciolini R., Freundlich N.L., Milla G., Patel I.H. The influence of orlistat on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of glyburide in healthy volunteers. // J. Clin. Pharmacol. (1995) 35: 521-525.

212. Schwizer W., Asal K., Kreiss C., Mettraux C., Borovicl\ka J., Remy В., Guzelhan C., Hartmann D., fried M. Role of lipase in the regulation of upper gastrointestinal function in humans. // Am. J. Physiol. (1997) 273: G612-G620.

213. Hildebrand P., Petrig C., Burckhardt В., Ketterer S., Lengsfeld H., Fleury A., Hadvary P., Beglinger C. Hydrolysis of dietary fat by pancreatic lipase stimulates cholecystokinin release. // Gastroenterology. (1998) 114:123-129.

214. Borgstrom B. Mode of action of tetrahydrolipstatin: a derivative of the naturally occurring lipase inhibitor lipstatin. // Biochim. Biophys. Acta. (1988) 962: 308-316.

215. Hadvary p., Lengsfeld H., Wolfer H. Inhibition of pancreatic lipase in vitro by the covalent inhibitor tetrahydrolipstatin. // Biochem. J. (1988) 256: 357-361.

216. Gargouri Y., Chahinian H., Moreaull., Ransac S., Verger R. Inactivation of pancreatic and gastric lipases by THL and C12:0-TNB: a kinetic study with emulsified tributyrin. // Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1085: 322-328.

217. Ransac S., Gargouri Y., MoreauH., Verger R. Inactivation of pancreatic and gastric lipases by THL and akyl-dithio-5-(2-nitrobenzoic acid). A kinetic study with 1,2-didecanoyl-sn-glycerol monolayers. // Eur. J. Biochem. (1991) 202: 395-400.

218. Bjorkling F., Godfredsen S.E., Kirk O. A highly selective enzyme catalyzed esterification of simple glucosides. //J. Chem. Soc. Commun. (1989) 14: 934-935.

219. Adelhorst K., Bjorling F., Godtfredsen S.E., Kirk O. Enzyme catalyzed preparation of 6-O-acylglucopyranosides. H Synthesis. (1990) 5: 112-115.

220. Mutua L.N., Akoh C.C. Synthesis of alkyl glycoside fatty acid esters in nonaqueous media by Candida sp. lipase. // J. Am. Oil. Chem. Soc. (1993) 70:43-46.

221. Scheckermann C., Schlotterbeck A., Schmid M., Wray V., Lang S. Enzymatic monoacylation of fructose by two procedures. // Enzym. Microb. Technol. (1995) 17: 157-162.

222. Janssen A.E.M., Lefferts A.G., van Riet K. Enzymatic synthesis of carbohydrate esters in aqueous media. // Biotechnol. Lett. (1996) 12: 711-716.

223. Lay L., Panza L., Riva S., Khitri M., Tirendi S. Regioselective acylation of disaccharides by enzymatic transesterification. // Carbohydrate Res. (1996) 291: 197-204.

224. Gao C., Whitcombe M.J., Vulfson E.N. Enzymatic synthesis of dimeric and trimeric sugar-fatty acid esters. // Enzym. Microb. Technol. (1999) 25: 264-270.

225. Riva S. Enzymatic modification of sugar moieties of natural glycosides. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. (2002) 19:43-54.

226. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Taino I.M., Marinone F., Toma L. Optically pure 1-O- and 3-O-p-D-gIucosyl- and gactosyl-sn-glycerols through lipase-catalyzed transformations. // Tetrahedron Lett. (1995) 36: 4865-4868.

227. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Taino I.M., Toma L. A facile lipase catalyzed access to fatty acid monoesters of 2-O-P-glucosylglycerol. // Tetrahedron: Asymmetry. (1996) 7: 771777.

228. Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Toma L. Bioactive glycoglycerolipid analogues: an expeditious enzymatic approach to mono- and diesters of 2-O-p-D-galactosylglycerol. // Tetrahedron: Asymmetry. (1998) 9:2113-2119.

229. Nishino H., Colombo D., Ronchetti F., Scala A., Toma L., Tokuda H., Compostella F. Chemoenzymatic synthesis and antitumor promoting activity of 6 and 3-esters of 2-O-b-D-glucosylglycerol. // Bioorg. Med. Chem. (1999) 7: 1867-1871.

230. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P., Boures E. Enzymatic synthesis of AHA derivatives for cosmetic application. //J. Mol. Cat. B: Enz. (1998) 5:49-53.

231. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P., Boures E. Lipase-catalyzed a-butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermo-cosmetic application. // J. Biotcchnol. (1999) 68: 61-69.

232. Manjon A., Iborra J.L., Arocas A. Short chain flavour ester synthesis by ommobilized lipase in organic media. // Biotechnol. Lett (1991) 13:339-344.

233. Chulalaksananukul W., Condoret J.S., Combes D. Kinetics of geranyl acetate synthesis by lipase-catalyzed transesterification in n-hexane. // Enzyme Microb. Tecnol. (1992) 14: 293298.

234. Claon P.A., Akoh C.C. Effect of reaction parameters on sp435 lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in organic solvent. // Enzyme Microb. Technol. (1994) 16: 835-838.

235. Crosby J. Synthesis of optically active compounds: a large scale perspective. // Tetrahedron. (1991) 47: 4789-4846.

236. Santaniello E., Ferraboschi P., Grisenti P., Manzocchi A. The biocatalytic approach to the preparation of enatiomerically pure chiral building blocks. // Chem. Rev. (1992) 92: 1071-1140.

237. Margolin A.L. Enzymes in the synthesis of chiral drugs. // Enzyme Microb. Technol. (1993) 15:266-280.

238. Buchalska E., Plenkiewicz J. Synthesis of optically active aminooxy alcohols. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. (2001) 11:255-263.

239. Ghanem A., Aboul-Enein H.Y. Application of lipase in kinetic resolution of racemates. // Chirality. (2005) 17: 1-15.

240. Dordick J.S. Enzymatic and chemoenzymatic approaches to polymer synthesis. // Trends. Biotechnol. (1992) 10: 287-293.

241. Martin B.D., Ampofo S.A., Linhardt R.J., Dordick F.S. Biocatalytic synthesis of sugar cantaining poly(acrylate)-based hydrogeles. // Macromolecules. (1992) 25: 7081-7085.

242. Frank S.G., Zografi G.J. Solubilization of water by dialkyl sodiumsulfosuccinates in hydrocarbon solutions. // J. Colloid and Interface Sci. (1969) 29:27-35.

243. Ekwall P., Mandell L., Fontell K. Some observation on binary and ternary Aerosol ОТ systems. //J. Colloid and Interface Sci. (1970) 33:215-235.

244. Eicke H.-F. Surfactants in nonpolar solvents: Agregation and micellization. // Top. Curr. Chem. (1980) 87: 85-145.

245. Eicke H.-F., Kubick R. The optical matching phenomenon in water/oil-microemulsion. // Phys. Chem. (1980) 84: 36-41.

246. Eicke H.F. Surfactants in nonpolar solvents: aggregation and micellization. // Top. Curr.Chem. (1980) 87: 85-145.

247. Левашов A.B. Катализ ферментами в системах обращенных мицелл. Дис. докт. хим. наук. М., МГУ, 1987.

248. Zinsli Р.Е. Inhomogeneous interior of Aerosol ОТ microemulsion, probed by fluorescence and polarization decay. //J. Phys. Chem. (1979) 33:3223-3231.

249. Zulauf M., Eicke H.-F. Inverted micelles and microemulsions in the ternary system

250. НгО/aerosol OT/isooctane as studied by photon correlation spectroscopy. // J. Phys. Chem. (1979) 83: 480-486.

251. Martinek K., Klyachko N.L., Kabanov A.V., Khmelnitsky Yu.L., Levashov A.V. Micellar enzymology: its relation to membranology. //Biochim. Biophys. Acta. (1989) 981: 161172.

252. Martinek К., Levashov A.V., Klyachko N.L., Khmelnitsky Y.L., Berezin I.V. Micellar enzymology. // Eur. J. Biochem. (1986) 155:453-468.

253. Luisi P.L., Giomini M., Pileni M.P., Robinson B.H. Reverse micelles as hosts for proteins and small molecules. // Biochim. Biophys. Acta. (1988) 947: 209-246.

254. Oldfleld C. Ezymes in vvater-in-oil microemulsions ('reversed micelles'): principles and applications. II Biotechnol. Genetic. Eng. Rev. (1994) 12: 255-327.

255. Левашов A.B., Клячко Н.Л. Мицеллярная энзимология: методы и техника. // Известия АН. Серия химическая. (2001) 10: 1638-1651.

256. Levashov A.V., Klyachko N.L. Interfacial catalysis. A. Volkov (Ed.), Basel: Marcel Dekker, New York, (2002) 355-376.

257. Nicot C., Waks M. Proteins as invited guests of reverse micelles: conformational effects, significance, applications.//Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (1996) 13:267-314.

258. A.V. Kabanov, S.N. Nametkin, A.V. Levashov. The principal difference in regulation of the catalytic activity of water-soluble and membrane forms of enzymes in reversed micelles. FEBS Lett. (1990) 267:236-238.

259. Клячко Н.Л., Пшежецкий A.B., Кабанов A.B., Вакула С.В., Мартинек К. Катализ ферментами в агрегатах ПАВ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ. // Биол. Мембраны. (1990) 7:467-472.

260. Левашов А.В., Пантин В.И., Мартинек К., Березин И.В. Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизироваиными в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ. // Докл. АН СССР (1980) 252: 133-136.

261. Bru R., Sanchez-Ferrc, A., Garcia-Carmona F. Kinetics models in reverse micelles. // Biochem. J. (1995) 310:721-739.

262. Aguilar L.F., Abuin E., Lissi E. A procedure for the joint evaluation of substrate partitioning and kinetic parameters for reactions catalysed by enzymes in reverse micellar solutions.// Arch. Biochem. Biophys. (2001) 338: 231-236.

263. Huang T.-M., Huang H.-C., Chang T.-C., Chang G.-G. Solvent kinetic isotope effects of human placental alkaline phosphatase in reverse micelles. // Biochem. J. (1998) 330: 267-275.

264. Левашов A.B. Катализ ферментами в микрогетерогенных системах агрегатов ПАВ. И Биотехнология: Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР. (1987) 4: 112-158.

265. Пшежецкий А.В. Ферменты в агрегатах поверхностно-активных веществ: регуляция каталитической активности структурной матрицы. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ, 1987.

266. Клячко Н.Л., Меркер Ш., Вакула С.В., Иванов М.В., Березин И.В., Мартинек К., Левашов А.В. Регуляция каталитической активности олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл ПАВ. Лактатдегидрогеназа. // Докл. АН СССР (1988) 298: 1479-1481.

267. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. High resolution structure of holo and apo formate dehydrogenase. // J. Mol. Biol. (1994) 236:759-785.

268. Клячко Н.Л., Вакула C.B., Гладышев B.H., Тишков В.И., Левашов А.В. Формиатдегидрогеназа в системе обращенных мицелл: регуляция каталитической активности и олигомерного состава фермента. // Биохимия. (1997) 62: 1683-1687.

269. Kamyshny A., Trofimova D., Magdassi S., Levashov A.V. Native and modified glucose oxidase in reversed micelles. // Colloids Surf. B: Biointerfaces. (2001) 23:45-49.

270. Chebotareva N.A., Kurganov B.I., Burlakova A.A. Sedimentation velocity analysis of oligomeric enzymes in hydrated reversed micelles of surfactants in organic solvents. // Progr. Colloid. Polym. Sci. (1999) 113: 129-134.

271. Fletcher P.D.I., Rees G.D., Robinson B.H., Freedman R.B. Kinetic properties of crchymotrypsin in water-in-oil microemulsions: studies with a variety of substrates and microemulsion systems. // Biochim. Biophys. Acta. (1985) 832:204-214.

272. Левашов A.B., Пантин В.И., Мартинек К., Березин И.В. Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизированными в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ. // Докл. АН СССР. (1980) 252: 133-136

273. Клячко H.J1., Левашов A.B., Мартинек К. Катализ ферментами, включенными в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Пероксидаза в системе Аэрозоль ОТ-вода-октан. // Мол. Биол. (1984) 18: 1019-1031.

274. Мевх А.Т., Судьина Г.Ф., Лагутина И.О., Левашов А.В. Каталитические свойства мембранного фермента простагландии Н-синтазы в системе обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в октане. // Биохимия. (1985) 5: 1719-1723.

275. Kost О.А., Ort Т.А., Nikolskaia I.I., Nametkin S.N., Levashov A.V. Angiotensin-converting enzyme in an AOT-oktane reversed micelle system: interaction with the matrix. // Bioorg. Khim. (1995) 21:403-407.

276. Kabanov A.V., Levashov A.V., Alakhov V.Y. Lipid modification of proteins and their membrane transport. H Protein Eng. (1989) 3: 39-42.

277. Kabanov A.V., Klibanov A.L., Torchilin V.P., Martinek K., Levashov A.V. Effectivenes of acylation of protein amino groups with fatty acid chlorides in a system of reversed micelles Aerosol ОТ in octane.//Bioorg. Khim. (1987) 13: 1321-1324.

278. Трофимова, Д.Н., Левашов, A.B. 2002. Гидрофобная формиатдегидрогеназа из Pseudomonas sp. 101 в системе обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане. Биоорг. химия, т. 28, стр. 434-439.

279. Stamatis Н., Xenakis A., Kolisis F.N. Bioorganic reactions in microemulsions: the case of lipases. // Biotechnol. Adv. (1999) 17: 293 318.

280. Carvalho C.M.L., Cabral J.M.S. Reverse micelles as reaction media for lipases (review). // Biochimie. (2000) 82: 1063 1085.

281. Manoj K.M., Swaminathan T. Ester synthesis in reverse micelles using lipase. // Bioproc. Eng. (1997) 17: 185-188.

282. Otero C., Rua M.L., Robledo L. Influence of the hydrophobicity of lipase isoenzymes from Candida rugosa on its hydrolytic activity in reverse micelles. // FEBS Lett. (1995) 360: 202-206.

283. Rao A.M., Murray M.A., John V.T. Characteristics of lipase catalysis during ester synthesis in reversed micellar systems. // Biocatalysis. (1991) 4:253-264.

284. Han D., Walde P., Luisi P.L. Dependence of lipase activity on water content and enzyme concentration in reverse micelles. // Biocatalysis. (1990) 4: 153-161.

285. Tsai S.W., Chiang C.L. Kinetics, mechanism, and time course analysis of lipase-catalyzed hydrolysis of high concentration olive oil in AOT-isooctane reverse micelles. // Biotechnol. Bioeng. (1991) 38: 206-211.

286. Hedstrom G., Backlund M., Slotte J.P. Enantioselective synthesis of ibuprofen esters in AOT/isooctane microemulsions by Candida cylindracea lipase. // Biotechnol. Bioeng. (1993) 42:618-624.

287. Rees G.D., Robinson B.H., Stephenson G.R. Macrocyclic lactone synthesis by lipase in water-in-oil microemulsions. // Biochim. Biophys. Acta. (1995) 1257:239-248.

288. Chen J.P., Chang K.C. Lipase catalyzed hydrolysis of milk fat in lecithin reverse micelles.//J. Ferment. Bioeng. (1993) 76: 98-104.

289. Prazeres D.M.F., Garcia F.A.P., Cabral J.M.S. Kinetics and stability of Chromobacterium viscosum lipase in reversed micellar and aqueous media. // J. Chem. Techn. Biotechnol. (1992) 53:159-164.

290. Prazeres D.M.F., Garcia F.A.P., Cabral J.M.S. An ultrafiltration membrane bioreactor for the lipolysis of olive oil in reversed micellar media. // Biotechnol. Bioeng. (1993) 41: 761-770.

291. Chang P.S., Rhee J.S. Characteristics of lipase-catalyzed glycerolysis of triglyceride in AOT-isooctane reversed micelles. // Biocatalysis. (1990) 3: 343-355.

292. Yamada Y., Kuboi R., Komasawa I. Increased activity of Chromobacteriun viscosum lipase in Aerosol ОТ reverse micelles in the presence of nonionic surfactants. // Biotechnol. Prog. (1993) 9:468-472.

293. Rees G.D., Robinson B.H. Esterification reactions catalyzed by Chromobacterium viscosum lipase in CTAB-based microemulsion systems. // Biotechnol. Bioeng. (1995) 45: 344355.

294. Carlile K., Rees G., Robinson B.H., Steer T.D., Svensson M. Lipase-catalyzed interfacial reactions in reverse micellar systems. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. (1996) 92:4701-4708.

295. Stamatis H., Xenakis A., Dimitriadis E., Kolisis F.N. Catalytic behavior of Pseudomonas cepacia lipase in w/o microemulsions. // Biotechnol. Bioeng. (1995) 45:33-41.

296. Avramiotis S., Stamatis H., Kolisis F.N., Lianos P., Xenakis A. Structural studies of lecithin- and AOT-based water-in-oil microemulsions, in the presence of lipase. // Langmuir. (1996) 2:6320-6328.

297. Schlatmann J., Aires-Barros M.R., Cabral J.M.S. Esterification of short chain organic acids with alcohols by a lipase microencapsulated in reverse micelles. // Biocatalysis. (1991) 5: 137-144.

298. Skargelind P., Jansson M. Surfactant interface on lipase catalyzed reactions in microemulsions.//J. Chem. Techn. Biotechnol. (1992) 54: 277-282.

299. Kim Т., Chung К. Some characteristics of palm kernel olein hydrolysis by Rhizopus arrhizus lipase in reversed micelle of AOT in isooctane, and additive effects. // Enzyme Microb. Technol. (1989) 11:528-532.

300. Walde P., Han D., Luisi P.L. Spectroscopic and kinetic studiesof lipase solubilized in reverse micelles. // Biochemistry. (1993) 32:4029-4034.

301. Nagayama K., Matsu-ura S.I., Doi Т., Imai M. Kinetic characterization of esterifiaction catalyzed by Rhizopus delemar lipase in lecithin-AOT microemulsion systems. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. (1998) 4: 25-32.

302. Mojovic L., Siler-Marinkovic S., Kukic N., Vunjal-Novakovic G. Rhizopus arrhizus lipase-catalyzed interesterification of the mid-fraction of palm oil to a cocoa butter equivalent fat. // Enzyme Microb. Technol. (1993) 15:438-443.

303. Schmidli P.K., Luisi P.L. Lipase-catalyzed reactions in reverse micelles formed by soybean lecithin. // Biocatalysis. (1990) 3: 367-376.

304. Marangoni A.G. Effects of the interaction of porcine pancreatic lipase with AOT/isooctane reversed micelles on the enzyme structure and function follow predictable patterns. // Enzyme Microb. Technol. (1993) 15: 944-949.

305. Gupte A., Nagarajan R., Kilara A. Food Flavours: Generation, analysis and process influence. Charalambous G. (Eds.), Elsevier, Amsterdam, 1995, 1-74.

306. Stamatis H., Xenakis A., Provelegiou M., Kolisis F.N. Esterification reactions catalyzed by lipases in microemulsions. The role of enzyme localization in relation to its selectivity. // Biotexhnol. Bioeng. (1993) 42: 103-110.

307. Han D., Ree J.S. Batchwise hydrolysis of olive oil by lipase in AOT / isooctane reverse micelles. // Biotechnol. Lett. (1985) 7:651-656.

308. Han D., Ree J.S. Characteristics of lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT-isooctane reversed micelles. // Biotechnol. Bioeng. (1986) 28: 1250-1255.

309. Fletcher P.D.I., Freedman R.B., Oldfield C. Activity of lipase in water-in-oil microemulsions. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. I. (1985) 81:2667-2679.

310. Valis T.P., Xenakis A., Kolisis F.N. Comparative studies of lipase from Rhizopus delemar in various microemulsion systems. // Biocatalysis (1992) 6:267-279.

311. Fukumoto J., Iwai M., Tsujisaka Y. Studies on lipase. IV. Purification and properties of a lipase secreted by Rhizopus delemar. II J. Gen. Appl. Microbiol. (1964) 10: 257-265.

312. Stark M., Scargelind P., Holmberg K., Carlfors J. Dependence of the activity of Rhizopus lipase on microemulsion composition. // Colloid. Polymer Sci. (1990) 268: 384-388.

313. Holmberg K. Organic and bioorganic reactions in microemulsions. // Adv. Colloid. Interface Sci. (1994) 51: 137-174.

314. Holmberg K., Osterrberg E. Enzymatic preparation of monoglycerides in microemulsion. //J. Am. Oil Chem. Soc. (1988) 65: 1544-1548.

315. Tsai S.W., Lee K.P., Chiang C.L. Surfactant effects on lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in AOT/isooctane reverse micelles. // Biocatal. Biotrans. (1995) 13: 89-98.

316. Talukder M.M., Hayashi J.C., Takeyama Т., Zamam N., Kawasaki Т., Shimizu N. Activity and stability of Chromobacterium viscosum lipase in modified AOT reverse micelles. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. (2003) 22:203-209.

317. Lee S.S., Kiserow D.J., McGown L.B. Enzyme solubilization in reversed micellar microreactor with a bile salt cosurfactant. // J. Colloid Interface Sci. (1997) 193: 32-40.

318. O'Connor C.J., Cleverly D.R. Fourier-transform infrared assay of bile salt-stimulated lipase activity in reverse micelles. //J. Chem. Technol. Biotechnol. (1994) 61:209-214.

319. Fletcher P.D.I., Freedman R.B., Robinson B.H., Rees G.D., Schomacker R. Lipase-catalysed ester synthesis in oil-continuos microemulsions. // Biochim. Biophys. Acta. (1987) 912:278-282.

320. Hayes D.G., Gulari E. l-Monoglyceride production from lipase-catalyzed esterification of glycerol and fatty acid in reverse micelles. // Biotechnol. Bioeng. (1991) 38:507-517.

321. Singh C.P., Shah D.O., Holmberg K. Synthesis of mono- and diglycerides in water-in-oil microemulsions. //J. Am. Oil. Chem. Soc. (1994) 71: 583-587.

322. Hayes D.G., Gulari E. formation of polyol-fatty acid esters by lipases in reverse micellar media. // Biotechnol. Bioeng. (1992) 40: 110-118.

323. Macris J.B., Stamatis H., Kolisis F.N. Microemulsions as a tool for the regioselective lipase-catalyzed esterification of aliphatic diols. // Appl. Microb. Biotechnol. (1996) 46: 521523.

324. Stamatis H., Xenakis A., Kolisis F.N., Malliaris A. Lipase localization in w/o microemulsions studied by flyorescence energy transfer. // Progr. Colloid. Polym. Sci. (1994) 97: 253-255.

325. Stamatis H., Xenakis A., Malliaris A., Kolisis F.N. Effect of alcohols on the structure of AOT reverse micelles with respect to different enzyme activity. // Progr. Colloid. Polym. Sci. (1993)93:373-376.

326. Stamatis H., Kolisis F.N. Xenakis A., Bornscheuer U., Scheper Т., Menge U. Pseudomonas cepacia lipase: Esterification reactions in AOT microemulsion systems. // Biotechnol. Lett. (1993) 15: 703-708.

327. Shiomori K., Ishimura M., Baba Y., Kawano Y., Kuboi R., Komasawa I. Characteristics and kinetics on lipase-catalyzed hydrolysis of olive oil in a reverse micellar system. // J. Ferment. Bioeng. (1996) 81: 143-147.

328. Ayyagari M.S., Jahn V.T. Substrate-induced stability of the lipase from Candida cylindracea in reversed micelles. H Biotechnol. Lett. (1995) 17: 177-182.

329. Brash A. Lipoxygenases: Occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate. I I J. Biol. Chem. (1999) 274: 23679-23682.

330. Grechkin A. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. // Prog. Lipid. Res. (1998) 37:317-352.

331. Gerwick W.H. Structure and biosynthesis of marine algal oxylipins.// Biochim. Biophys. Acta. (1994) 1211:243-255.

332. Funk C.D. The molecular biology of mammalian lipoxygenases and the quest for eicosanoid functions using lipoxygenase-dificient mice. // Biochim. Biophys. Acta. (1996) 1304: 65-84.

333. Yamamoto S., Suzuki H., Ueda N. Arachidonate 12-lipoxygenases. // Prog. Lipid. Res. (1997)36:23-41.

334. Marks F., Heidt M., Krieg P., Kinzig A., Furstenberger G. cDNA cloning of a 8-lipoxygenase and a novel epidermis-type lipoxygenase from phorbol ester-treated mouse skin. // Biochim. Biophys. Acta. (1998) 1391: 7-12.

335. Boeglin W.E., Kim R.B., Brash A.R. A 12R-lipoxygenase in human skin: mechanistic evidence, molecular cloning, and expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1998) 95: 67446749.

336. Sun D., Elsea S.H., Patel P.I., Funk C.D. Cloning of a human "epidermal-type" 12-lipoxygenase-related gene and chromosomal localization to 17pl3. // Cytogenet. Cell. Genet. (1998)81:79-82.

337. Stephenson L.C., Bunker T.W., Dubbs W.E., Grimes H.D. Specific soybean lipoxygenases localize to discrete subcellular compartments and their mRNAs are differentially regulated by source-sink status. // Plant Physiol. (1998) 116: 923-933.

338. Jisaka M., Kim R.B., Nanney L.B., Boeglin W.E., Brash A.R. Molecular cloning and functional expression of a phorbol ester-inducible 8S-lipoxygenase from mouse skin. // J. Biol. Chem. (1997) 272: 24410-24416.

339. Nugteren D.H. Arachidonate lipoxygenase in blood platelets. // Biochim. Biophys. Acta. (1975)380:299-307.

340. Ho P.P., Walters C.P., Sullivan H.R. A particulate arachidonate lipoxygenase in human blood platelets. // Biochem. Biophys. Res. Commun. (1976) 76: 398-405.

341. Borgeat P., Hamberg M., Samuellsson B. Transformation of arachidonic acid and homo-gamma-linolenic acid by rabbit polymorphonuclear leukocytes. Monohydroxy acids from novel lipoxygenases. //J. Biol. Chem. (1976) 251: 7816-7820.

342. Schewe Т., Halangk W., Hiebsch C., Rapoport S.M. A lipoxygenase in rabbit reticulocytes which attacks phospholipids and intact mitochondria. // FEBS Lett. (1975) 60: 149152.

343. Gerwick W.H., Bernart M.W. Marine BioTechnology. I: Pharmaceutical and bioactive natural products. Attawau D.H., Zaborsky O.R. (Eds.), Plenum Publishing Corp., New York, 1993,101-152.

344. Watanabe K., Ishikawa C., Ohtsuka I., Kamata M., Tomita M., Yazawa K., Muramatsu H. Lipid and fatty acid compositions of a novel docosahexaenoic acid-producing marine bacterium.// Lipids. (1997) 32: 975-978.

345. Malle E., Leis H.J., Karadi I., Kostner G.M. Lipoxygenases and hydroperoxy / hydroxyl-eicosatetraenoic acid formation. // Int. J. Biochem. (1987) 19: 1013-1022.

346. Kuhn H. Mammalian 15-lipoxygenases: enzymatic properties and biological implications. // Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 447: 5-28.

347. Feussner I., Kuhn H., Wasternack C. Do specific linoleate 13-lipoxygenases initiate beta-oxidation? // FEBS Lett. (1997) 406: 1-5.

348. Hawkins D.J., Brash A.R. Eggs of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus, contain a prominent (11R) and (12R) lipoxygenase activity. // J.Biol. Chem. (1987) 262: 7629-7634.

349. Drazen J.M., Israel E., O'Byrne P.M. Treatment of asthma with drugs modifying the leukotriene pathway. // N. Engl. J. Med. (1999) 340: 197-206.

350. Tang D.G., Honn K.V. 12-(S)-HETE in cancer metastasis. // Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 447: 181-191.

351. Nagy L., Tontonoz P., Alvarez J.G.A., Chen H., Evans R.M. Oxidized LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARgamma. // Cell. (1998) 93: 229240.

352. Jira W., Spiteller G., Carson W., Schramm A. Strong increase in hydroxy fatty acids derived from linoleic acid in human low density lipoproteins of atherosclerotic patients. // Chem. Phys. Lipids. (1998)91: 1-11.

353. Shureiqi I., Lippman S.M. lipoxygenase modulation to reverse carcinogenesis. // Cancer Res. (2001) 61: 6307-6312.

354. Rappoport S.M., Schewe T. The maturational breakdown of mitochondria in reticulocytes. // Biochim. Biophys. Acta. (1986) 864:471-495.

355. Schewe Т., Kuhn H. Do 15-lipoxygenases have a common biological role? // Trends. Biochem. Sci. (1991) 16:369-373.

356. Spiteller G. Linoleic acid peroxydation the dominant lipid peroxidation process in low density lipoprotein and its relationship to chronic diseases. // Chem. Phys. Lipids. (1998) 95: 105-162.

357. Chisolm G.M., Hazen S.L., Cathcart M.K. The oxidation of lipoproteins by monocytes-macrophages: biochemical and biological mechanisms. // J. Biol. Chem. (1999) 274: 2595925962.

358. Kulkarni A.P. Lipoxygenase a versatile biocatalyst for biotransformation of endobiotics and exobiotics. // Cell. Mol. Life. Sci. (2001) 58: 1805-1825.

359. Lagocki J.W., Emken E.A., Law J.H., Kezdy F.J. Kinetic analysis of the action of soybean lipoxygenase on linolenic acid. // J. Biol. Chem. (1976) 251: 6001-6006.

360. Borgeat P., Picard S., Battistini В., Sirois P. Measurements of arachidonic acid metabolites derived from the lipoxygenase pathway by high-pressure liquid chromatography. // Methods. Mol. Biol. (1998) 105: 209-216.

361. Schewe Т., Rapoport S.M., Kuhn H. Enzymology and physiology of reticulocyte lipoxygenase: comparison with other lipoxygenases. // Adv Enzymol Rel Areas Mol Biol. (1986) 58:191-272.

362. Denis D., Falguieyrct J.-P., Riendean D., Abramovitz M. Characterization of the activity of purified recombinant human 15-lipoxygenase in the absence and presence of leukocyte factors.//J. Biol. Chem. (1991) 266:5072-5079.

363. Noguchi M., Matsumoto T. Physicochemical characterization of ATP binding to human 5-lipoxygenase. // Lipids. (1996) 31: 367-371.

364. Puustinen Т., SchefTer M.M., Samuelsson B. Regulation of the human leukocyte 5-lipoxygenase: stimulation by micromolar Ca levels and phosphatidylcholine vesicles. // Biochim. Biophys. Acta. (1988) 960: 261-267.

365. Rouger C.A., Samuelsson B. Reversible, calcium-dependent membrane association of human leukocyte lipoxygenase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1987) 84: 7393-7397.

366. Wong A., Hwang S.M., Cook M.N., Hogaboom K.G., Crooke S.T. Interactions of 5-lipoxygenase with membrane: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alteration in enzyme activity. // Biochemistru. (1988) 27: 6763-6769.

367. Egan R.W., Gale P.H. Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase by aromatic disulfides. // J. Biol. Chem. (1985) 260: 11554-11559.

368. Kemal С., Louis-Flamberg p., krupinsli-Olsen R., Sharter A.L. reductive inactivation of soybean lipoxygenase-1 by catechols: a possible mechanism for regulation of lipoxygenase activity. // Biochemistry. (1987) 26: 7064-7072.

369. Payne A.N., garland L.G., Less I.W., Salmon J.A. Selective inhibition of arachidonate 5-lipoxygenase by novel acetohydroxamic acids: effects on bronchial anaphylaxis in anaesthetized guinea-pigs. // J. Pharmacol. (1988) 94: 540-546.

370. Cucurou C., Battioni J.P., Thag D.C., Nam N.H., Mansuy D. Mechanisms of inactivation of lipoxygenases by phenidone and BW755C. // Biochemistry. (1991) 30: 8964-8970.

371. Puerta R., Gutierrez V.R., Hoult J.R.S. Inhibition of leucocyte 5-lipoxygenase by phenolics from virgin olive oil. // Biochem. Pharmacol. (1999) 57:445-449.

372. Rao K.C.S., Divakar S., Rao A.G.A., Karanth N.G., Sattur A.P. lipoxygenase inhibition from Lactobacillus easel // Biotechnol. Lett. (2002) 24: 511-513.

373. Boyington J.C., Gafhey B.J., Amzel L.M. The three-dimensional structure of an arachidonic acid 15-lipoxygenase. // Science. (1993) 260: 1482-1486.

374. Stezcko J., Donoho G.P., Clemens J.C., Dixon J.E., Axelrod B. Conserved histidine residues in soybean lipoxygenase: functional consequences of their replacement. // Biochemistry. (1992)31:4053-4057.

375. Minor W., Steczko J., Stec В., Otwinowski Z., Bolin J. Т., Walter R., Axelrod B. Crystal structure of soybean lipoxygenase L-l at 1.4 A resolution. // Biochemistry. (1996) 35: 1068710701.

376. Sudharshan E., Rao A.G. Involvement of cysteine residues and domain interactions in the reversible unfolding of lipoxygenase-1. // J. Biol. Chem. (1999) 274: 35351-35358.

377. Gillmor S.A., Villasenor A., Fletterick R., Sigal E., Browner M.F. The structure of mammalian 15-lipoxygenase reveals similarity to the lipases and the determinants of substrate specificity.//Nat. Struct. Biol. (1997)4: 1003-1009.

378. Chen X.S., Funk C.D. The N-terminal "beta-barrel" domain of 5-lipoxygenase is essential for nuclear membrane translocation. // J. Biol. Chem. (2001) 276: 811-818.

379. Jones S.M., Luo M., Healy A.M., Peters-Golden M., Brock T.G. Structural and functional criteria reveal a new nuclear import sequence on the 5-lipoxygenase protein. // J. Biol. Chem. (2002) 277: 38550-38556.

380. Walther M., Anton M., Wiedmann M., Fletterick R., Kuhn H. The N-terminal domain of the reticulocyte-type 15-lipoxygenase is not essencial for enzymatic activity but contains determinants for membrane binding. // J. Biol. Chem. (2002) 277: 27360-27366.

381. Dunham W.R., Carrol R.T., Thomson J.E., Sands R.H., Funk M.O. The initial characterization of the iron environment in lipoxygenase by Mossbauer spectroscopy. // Eur. J. Biochem. (1990) 190:611-617.

382. Gaffney B.J., Navrophilipos D.V., Doctor K.S. Access of ligands to the ferric center in lipoxygenase-1. H Biophys J. (1993) 64:773-783.

383. Ivanov I., Schwarz K., Holzhutter H.G., Myagkova G., Kulm H. Omega-oxidation impairs oxidizability of polyenoic fatty acids by 15-lipoxygenases: consequences for substrate orientation at the active site. // Biochemistry. (1998) 336: 345-352.

384. Gardner H.W. Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants. // Biochim Biophys Acta. (1991) 1084:221-239.

385. Wang Z.-X., Killilea S.D., Srivastava D.K. Kinetic evaluation of substrate-dependent origin of the lag phase in soybean lipoxygenase-1 catalyzed reactions. U Biochemistry. (1993) 32: 1500-1509.

386. Jones G.D., Russel L., Darley-Usman V.M., Stone D., Wilson M.T. Role of lipid hydroperoxides in the activation of 15-lipoxygenase. // Biochemistry. (1996) 35: 7197-7203.

387. Schilstra M.Y., Veldink G.A., Vliegenthart F.G. The dioxygenation rate in lipoxygenase catalysis is determined by the amount of iron (HI) lipoxygenase in solution. // Biochemistry. (1994) 33: 3674-3979.

388. Smith W.L., Lands W.E.M. Oxygenation of unsaturated fatty acids by soybean lipoxygenase. // J. Biol. Chem. (1972) 247:1038-1047.

389. Gibian M.J., Galaway R.A. Steady-state kinetics of lipoxygenase oxygenation of unsaturated fatty acids. // Biochemistry. (1976) 15:4209-4214.

390. Lagocki J.W., Emken E.A., Law J.H., Kezdy F.J. Kinetic analysis of the action of soybean lipoxygenase on linoleic acid. // J. Biol. Chem. (1976) 251: 6001-6006.

391. Rodakiewicz-Nowak J., Maslakiewicz P., Haber J. The effect of linoleic acid on pH inside sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate reverse micelles in isooctane and on the enzymic activity of soybean lipoxygenase. // Eur. J. Biochem. (1996) 238: 549-553.

392. Kurganov B.I., Shkarina T.N., Malalhova E.A., Davydov D.R., Chebotarena N.A. Kinetics of soybean lipoxygenase reaction in hydrated reversed micelles. // Biochimie. (1989) 71:573-578.

393. Raabe E, Kroh L, Vogel J. Glucoseoxidase from Aspergillus niger in reverse micelles: pH and wo dependence. // J Biochem Biophys Methods. (1994) 29:207-216.

394. Orlich B, Schomaecker R. Enzymatic reduction of a less water-soluble ketone in reverse micelles with NADH regeneration. // Biotechnol Bioeng. (1999) 65: 357-362.

395. Jacobs N.J., Vandemark P.J. The purification and properties of the alpha-glycerophosphate-oxidizing enzyme of Streptococcus faecalis 10C1. // Arch Biochem Biophys. (1960)88:250-255.

396. Koditschek L.K., Umbreff W.W. Alpha-glycerophosphate oxidase in Streptococcus faecium F 24. // J. Bacterid. (1969) 98: 1063-1068.

397. Fields R. The measurement of amino groups in proteins and peptides. // J. Biochem. (1971) 124:581-590.

398. Levashov A.V., Khmelnitsky Yu. L., Klyachko N.L., Chernyak V.Ya., Martinek K. Formation and properties of dimeric recombinant horseradish peroxidase in a system of reversed micelles. //J. Colloid Interface Sci. (1982) 88:444-457.

399. Stamatis H., Xenakis A., Kolisis F.N. Studies on enzyme reuse and product recovery in lipase-catalyzed reactions in microemulsions. // Ann. NY Acad. Sci. (1995) 750:237-241.

400. Larsson K.M., Adlercreutz P., Mattiasson B. Enzymatic catalysis in microemulsions: Enzyme reuse and product recovery. // Biotechnol. Bioeng. (1990) 36: 135-141.

401. Palomo J.M., Fuentes M., Fernandez-Lorente G., Mateo C., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality. // Biomacromolecules. (2003) 4: 1-6.

402. Lacowicz J.R. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press, New York, 1991.1. БЛАГОДАРНОСТИ

403. Автор выражает огромную благодарность и признательность своим научным руководителям, профессору Андрею Вадимовичу Левашову и профессору Наталье Львовне Клячко за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах исследования.

404. Большую признательность автор выражает коллективу лаборатории мицеллярной энзимологии Химического ф-та МГУ.