Регуляция каталитической активности ферментов изменением их надмолекулярной организации в системах обращенных мицелл тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

п ч 9 О

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имена М.В.Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.15.02 + 541.182

наметкин сергеи николаевич

• регуляция каталитически! активности ©ершггов изменении! их надмолекулярной организации в системах оврапщшх мицелл

(сп.со. 15 - лшйпзскзл киквхши) и катализ)

Авхореферэт диссертации па соискание учепоИ степени кандидата химических наук

1Г0СКЗА - 1530

/ /

Работа выполнена на кафедре химической знзимологии Химического факультета Московского государствешого университета игл. М.В.Ломоносова

Научшй руководитель: доктор химических наук, доцент Л.Б.Левашов

Научшй консультант: кандидат химических наук А.В.Кабанов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

доктор химических наук, профессор 0.1.1. Полтора«

Ведущая оргашиация: рнститут химической .физики АН СССР

Защита состоится "2^" 1990 года в часов

на заседании специализированного совета Д 053,05.76 в Московском государственном университете им. М.В.Ломонос по адресу: 119 899,-ГСП, Москва, Ленинские горн, МГУ. Химический факультет, кафедра химической энзшологш

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан СреДрСХ-ИХ1950 года

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук ^^ Р.Б.Айсина

——---- 1

1 J¡ ' i'

"Г " ~ *') ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. В настоящее время очевидно, что варьировании нэя.оттекулярной организации ферментов играет исключительно важную роль в регуляции их каталитической активности. Известно, что изменения надмолекулярных состава и структуры олигомерных ферментов может сопровождаться их активацией (инактивацией), изменением субстратной специфичности и т.д. Многие ферменты в процессе метаболизма, например, в результате присоединения к белковой глобуле (или отщепления от нее) гидрофобных якорных групп переходят из растворимой формы в мембрано-связанную (либо наоборот). Такое изменение надмолекулярной организации ферментов также монет сопровождаться существенным изменением га каталитической активности.

Изучение этих процессов в экспериментах in vivo затруднено сложностью организации живой клетки и одновременным протеканием в ней множества взаимосвязанных процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой цели различные модельные системы. С^ной из наиболее перспективных модельных систем является система обращенных мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. При солюбилизации в таких системах ферменты включаются во внутреннюю полярную полость мицелл, приобретая оболочку из монослоя гидратированных молекул ПаВ. В 1977 году в работах К.Картинека п сотр. (Докл. Ali СССР, 236, 920 (1977)) было установлено, что включенные в такие системы ферменты проявляй? каталитическую активность. Эти работы положили начало "мицеллярной энзимологин" - научному направлению, изучающему катализ ферментами в системах обращенных мицелл.

Размер внутренней полости шщелл можно в широком диапазоне варьировать (от десятка до сотен и более А), изменяя степень гидратации ПАВ - н - молярное отнопенне ['н о]/[ПАВ] в системе. Таким образом, в обращенной мицелле при различных степенях гидратации может помещаться как одйа молекула белка, так п крупные белковые комплексы как целое. Иными слова?я-1, обращенные мпцеллц могут служить матрицам! регулируемого размера для сборки белковых комплексов различного состава. С другой стороны, использование мицеллярной система в качестве реакционной среды позволяет исследовать свойства ферментов различной природы (как гидрофобных мембранных, так и водорастворимых немембранных) в стандартных условиях.

Цель работы. При выполнении работы были поставлены следующие основные задачи. Во-первых, исследовать возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов (щелочной фосфатазы и г-глутамилтрансферазы) в системе обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях (Аэрозоля ОТ* в октане). Во-вторых, исследовать взаимосвязь надмолекулярной структуры этих ферментов и их каталитической активности в системе обращенных мицелл. В-третьих, провести сравнительное изучение кинетических закономерностей функционирования мембранных и растворимых Форм ферментов (щелочная фосфатаза, у-глутамилтрансфераза, ашшопептидаза) в системе обращенных мицелл.

Научная новизна работы. На примере щелочной фосфатазы и зг-глута-милтрансферазы, показана принципиальная возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях при изменении степени гидратации ПАВ. Установлено, что зависимость каталитической активности этих ферментов от степени гидратации тлеет вид кривой с несколькими максимумами -различные максимумы соответствуют функционированию, различных надмолекулярных структур. Впервые установлено, что отдельные субъедшшцы 7-глутамилтррчсферазы и щелочной фосфатазы обладают каталитической активностью. Предложен метод разделения субъединиц гетеродимерных ферментов в неденатурирувдих условиях, основанный на скоростной седиментации содержащих эти ферменты систем обращенных мицелл. На примере г-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы п аминопептидэзы установлены различия в закономерностях регуляции активности мембранной и Iзствори-мой фэрм ферментов в системе обращенных мицелл: каталитическая активность мембранных форм зависит от концентрации ПАВ при постоянной сте-пеш! гидратации, для растворимых форм такая зависимость не обнаруживается. Зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ может служить тестом на мембраноактивность ферментов.

Практическое значение работы. Установленная в работе возможность использования обращенных мицелл в качестве матрицы регулируемого размера для целенаправленного изменения надмолекулярной структуры олигомерных ферментов может быть положена в основу новой стратегии исследо-

1. Аэрозоль ОТ (АОТ, натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфэянтарной кислоты)

вания взаимосвязи структуры и функции олигомерных ферментов, полифер ментных систем и надмолекулярных комплексов других биополимеров

Полученные результаты представляют практический интерес для моделирования природного окружения мембранных ферментов и изучения регуляции каталитической активности ферментов при их обратимом переходе из мембранной в растворимую форму.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах, читаемых на кафедре химической энзимолопш Химического факультета МГУ.

Апробация работы. Основные результаты работы были изложены на у Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), V Всесоюзной конференции "Физико-химические основы ферментативного катализа" (Москва, 1987), xix Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987), У1 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимолопш (Вильнюс, 1988), Международной конференции "Химическая физика ферментативного катализа" (Таллин, 1987), XIу Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), У1 Конференции молодых ученых по органической химии (Бехин, ЧССР, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовало II печатных работ. .

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (по организации белков ня биологических мембранах и свойствам ферментов в системах обращенных мицелл), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов л списка цитируемой литературы (из 191 наименования).Работа изложена на 132 страницах и вклачает I таблицу п 57 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Регуляция надмолекулярной структуры и каталитической активности ферментов в системах обращенных мицелл.

А. Щелочная фосфатаза.

Зависимости каталитической активности от степени гидратации ПАВ (и ) для различных ферментов, как правило, имеют колоколообразшй вид, причем максимум каталитической активности обнаруживается при той степени гидратации, когда радиус внутренней полости мицелл равен радиусу белковой глобулы. Подобная зависимость характерна и для щелочной фос-фатазы ДО), солюбилизованнсй в системе обращенных мицелл АОТ в окта-

не. Однако в этом случае на зависимости каталитической активности от степени гидратации обнаруживается не один, а два максимума (при ыо=17 и 25, см. рис.1).

Рис.1. Зависимость каталитической активности ПИ> в системе обращенных мицелл АОТ в октане от степени гидратации (0,1 М АОТ; 0,05 М карбонатный буфер, рН 10,5). Пунктиром обозначено значение каталитической активности фермента в водном растворе, измеренное в условиях рН-оп-тимума реакции. Для сравнения приведена шкала средних радиусов (г) внутренней полости обращенных мицелл. Стрелками отмечены значения радиусов мономерной (М) и димерной (о) форм фермента.

При ио= 17 радиус внутренней полости мицелл равен радиусу субъединицы щел< ¡ной фосфатазы (Мг= 73 ООО), при ио= 25 - приблизительно равен радиусу их димера1. Б этой связи разумно предположить, что. наблюдаемые максимумы обусловлены функционированием соответственно мономерной и димерной форм ЩФ. Методом скоростной седиментации проведено изучение системы обращенных мицелл, содержащей ЩФ. Коэффициенты седи-метации мицелл, содержащих белок, определяли так, как эти описанс ранее. Молекулярные массы молекул белка (Ыг), включенных во внутренних полость мицелл рассчитывали из уравнения:

Б,

(1 - V5) <-§-с-

1)

(1),

где II

молекулярная масса белка, М0,?0и Босоответственно молекулярная масса, парциальный удельный объем и коэффициент седиментации пусты) мицелл, зос - коэффициент седиментации мицелл, содержащих белок, а (

-плотность растворителя (ЬеуаБЬоу А.У.

118, 42).

еЬ_а1. (1981) Апа1. Б1осЬет.,

I. Радиусы суоъедитщы ЩФ (Мг= 73 ООО) и их димера (М = 146 ООО) рас-

считывали по формуле г= 0,73/МГ (см. А.В.Левашов (1988) В кн.:

Химические и ферментативные реакции в растворах ПАВ. Ред

И.В.Березик. Из-во ВИНИТИ, М., с Л12 )

м

м

Как видно из данных, приведенных на рис.2, при изменении степени гидратации (ио) происходит изменение надмолекулярного состава солюби-лизовэнного фермента. При степенях гидратации больших 22 заполненные белком мицеллы содержат исключительно димерную форму (М = 146 ООО), а при ио 22 - исключительно мономерную форму ЩФ (М = 73 ООО).

Щ п

Ф9—0-0— ( 9

«и- м

-.»•».» Рис.2. Мицеллы, содержащие мономер (М) или димер

сп - (э) щелочной фосфатазы, регистрируются

" методом скоростной седиментации при различных

степенях гидратации и0„

20 4о К

Следует подчеркнуть, что в литературе сложилось мнение о том, что Щ5 может функционировать только в виде димера. Попытки разделения субъедшшц ЩФ традиционным! методами (например, в 1-рисутствии 6 М гуанидин хлорида) приводили к полной ее инактивации. Полученные нами дзппые свидетельствуют о том, что Щ5 может функционировать в вида мспсморп.

Б. у-Глутзммтрзнсфзрзза1. г-Глутамилтрансфераза (у-ГТ) катализирует реакции переноса г-глутамилыюго остатка от молекулы донора (глутатион или другие у-глутамилсодержащпе соединения, например, у-(3-кар0окси-4-питрэ) анилид глутаминовой кислоты (Иисмд)) нэ молекулу акцептора. В зависимости от природы акцептора рассматривают три типа катализируемых реакций:

(а) 'Грансфзразную (перенос 'у-глутамильного остатка на аминокислоты или пептиды):

сПиСИА + С1уС1у -> а1г!С1уС1у + сил

I. Пр"ведены данные для растворимой формы у-ГТ (см. ниже), выделенной из перевивной низкодийвреицироввнной гепатомы Г-27 по методике, включающей солюбилизацив фермента папашом.

(0) Аутотрансферазную (перенос *-глутамильного остатка на вторую

молекулу субстрата):

2 GluCNA -> GluGluCNA + CNA

(в) Гидролазную:

GluCNA + II20 -> Glu + СНА ,

где GiyGiy - глицил-глиция, cna - (З-карбокси-4-нитро)анилин, Glu -глутаминовая кислота.

Катализируемые ферментом реакции стереоспецифичш: в качестве донора могут выступать как l, так и d r-глутаыилсодержащие соединения, в то время как акцепторами в реакциях (а) и (б) могут быть только ь-изомеры аминокислот и пептидов.

Следует, очевидно, допустить, что в первых двух случаях (трансфз-разная и аутотрансферазная реакции) наблюдаемая скорость образования cna может складываться из скоростей двух процессов: гидролиза l-giucna и переноса г-глутамильного остатка на аминогруппу акцептора.

При использовании в качестве субстратов l- и d-изомеров giucna и GiyGiy исследованы гидролазная, аутотрансферазная и транс$еразная реакции, катализируемые т-ГТ, солюбилизованной в системе обращенных мицелл АОТ р октане. Для всех типов реакций зависимости каталитической активности »-ГТ от степени гидратации имеют вид кривых с тремя оптиму-17 и 26 (см. рис.3).

мами при wq= II,

го

х

¿0 Г;А

Ь H WL .

il rvJVa ni

\ л

Л

/

Рис.3. Зависимость каталитической активности г-ГГ в системе обращенных мицелл АОТ в октане от степени гидратации: а - трансферазная; б - аутотрансферазная; в - гидролазная реакции. Пунктиром показаны значения каталитическог активности фермента в водном растворе, измеренные в условиях рн-оптимумов реакций. Для сравнения приведена шкал; средних радиусов (г) внутренней полост; обращенных мицелл. Стрелками отмечет значения радиусов легкой (ь) и тяжело! (н) субъединиц, а также их сумма (ь+н)

20

за

Ч,

При оптимальных степенях гидратации 11,17 и 26 радиусы внутренней полости мицелл равны соответственно размерам легкой (М = 21 ООО), тяжелой (Мг= 54 ООО) субъедшшц г-ГТ и их дилера (М = 75 ООО). Мы убедились, что также как и в случае щелочной фосфатазы, при варьировании степени гидратации в системе обращенных мицелл происходит изменение олигомерного состава г-ГТ, а наблюдаемые на зависимости каталитической активности от степени гидратации оптимумы обусловлены функционированием различных надмолекулярных форм фермента.

Данные седиментационного анализа (см, рис.4) свидетельствуют о том, что при и 20, г-ГТ существует в системе обращенных мицелл только в форме димера, а при и 2 о на седиментограмме обнаруживаются два типа содержащих белок мицелл: мицрплы с легкой (Ю и тяжелой (н) субъединицами .

Мг

«Л • 60

40 го

I.♦«

Рис.4. Мицеллы, содержащие легкую (ь), тя-галуп (я) субъедшшш или димер (ы-и). регистрируются методом скоростной седиментации при различных степенях гидратации и .

и

«О 20

ч

Значительное, различие .в коэффициентах -седиментации этих двух типов мицелл позволяет' провести разделение легкой и тяжелой субъедшшц 7-ГГ. При скоростной седиментации мицеллы, содержащие тяжелую субъеди-1шцу, могут бить осаддену, в то время как мицеллы с легкой субъединицей остаются в растворе.

Зависимости каталитической активности полученных таким образом легкой и тяжелой субъедшшц от степени гидратации для всех катализируемых -г-ГТ типов реакций ямзпт вид кривых с одним максимумом (см. рис.5). В случае легкой суОьедшшца (рис.5,з) оптимум каталитической активности обнаруживается при степени гидратации II; в случае тяжелой (рис.5,б) - при степени гидратации 17. При смешении те мицеллярных растворов, содержащих легкуп и тягалую субъедшшци, ка зависимости каталитической активности от степени гидратации появляется третий максимум при ио= 26, соотвзтствугций дилеру.

4 го

2

а^о.Со-с^а-1

/ п

с/ с.п е, 3 /О -о-"-«)—о-

<5

V

10 20 30

V/.

Рис.5. Зависимость от степени гидратации каталитической активности легкой (а), тяжелой (0) субьединиц у-ГТ и их смеси (в) для трансферазной (I), гидролазной (2) и аутотрансферазюй (3) реакций.

Из литературных данных известно, что активный центр ?-ГТ содержи: по крайней мере три различных участка: донорный и два акцепторных. I донорном участке осуществляется связывание и каталитическое превращение ь и и г-глутамилсодернащих молекул доноров. С акцепторными участками (глициновым и цистешювым) связываются ь-изомеры соответствуют!; акцепторов. В частности, трансферазная реакция в присутствии глицил глицина (а) протекает с участием глицинового участка, а аутотрансфе разная (б) - цистеинового. Локализация этих участков не до кощ ясна. Считают однако, что донорный участок расположен на легкой субъ единице фермента, а в формировании акцепторных участвуют как легкая так и тяжелая субъедилицы.

Полученные нами данные не согласуются с такой точкой зрения. То факт, что обе субъедшшпы обладают каталитической активностью, в част ности, в гидролазной реакции (рис.3 в; рис.5э,б), заставляет предполо .шть наличие и.о) »-глутэмилсзязывающю: участков как на легкой ,так

на тяжелой субъединице. Обе субъединицы обнаруживают трансферазную активность (рис.3 а; рис.5 а,б), что, возможно, указывает на наличие у них и глициновых акцепторных участков. В то же время аутотрансферазная реакция в значительной степени более выражена для тяжелой субъединицы (рис.2,0). (В случае легкой субъединицы скорость аутотрансферазной реакции не превышает скорость гидролазной). Не исключено, тагам образом, что связывающий вторую молекулу ь-сысна акцепторный участок расположен именно на тяжелой субъединице.

Мы провели исследование активных центров *-ГТ с помощью ее необратимого ингибитора - АТ-125 (ь-(аз, 5з)-а-амино-3-хлор- 4,5-ди-гидро-5-изоксазолуксусная кислота):

Известно, что инкубирование г-ГТ с АТ-125 в водном растворе приводит к необратимой потере ее каталитической активности. После солюбилизации обработанной таким образом 7-ГТ в системе обращенных мицелл в условиях (ио= 17), когда происходит диссоциация фзрмента на субъединицы (см. рис.4), наблюдается частичное восстановление ее активности (до 40 у. от исходного уровня). Мы провели разделение субъединиц предварительно обработанной АТ-125 г-ГТ методом скоростной селименташш в системе обращенных мицелл (как это было описано выше). Каталитической активностью обладает именно тяжелая субъедишщэ, тогда как легкая субъедининз активностью ке обладает. Обработка ингибитором изолированной тяжелой субъедшшци приводит к полной потере се каталитической активности. Полученные данные указывают на наличие у молекулы г-ГТ, гго крайней мере, двух активных центров, один из которых (расположенный на легкой субъедишщз) доступен действию ингибитора в дкмзрной форме фермента. Второй центр (расположенный на тяжелой субьединице) в этих условиях "экранирован" - в нем не присходит каталитическое превращение молекул;! субстрата; оп не доступен действию ингибитора. При диссоциации фермента на' субъедтшцн з системе обращенных мицелл происходит "разэкраштровашга" этого центра, сопровождающееся проявлением каталитической активности тяжелой субъедигашей т-ГТ. То обстоятельство, что обработка тяжелой субъединицы АТ-125 приводит к ее необратимой инактивации, может указывать на сходство в строении активных центров, расположенных на легкой п тяжелой субъединицах.

соон

I

н,м—с—н

не—а н2с—

с1

В. Сравнение закономерностей регуляции каталитической активности мономерной и искусственно полученной гексамерной фэ\:

мы а-химотрипсина в системе обращенных мицелл.

Надмолекулярные комплексы ферментов различного состава характеризуются различными положениями максимумов на зависимости каталитической активности от степени гидратации - максимум наблюдается при той степени гидратации, когда размеры внутренней полости мицелл и соответствующего надмолекулярного комплекса совпадают. В качестве примера недиссо-циирукхцего олигомерного фермента нами был исследован искусственно полученный ковал-нтно сшитый а-химотрипсин (ХТ).

С помощью СПДП (сукцинимидил-3-(2-пиридилтиопропионат)) была проведена ковалентная сшивка молекул мономерного фермента - ХТ (Мг= 25 ООО). По данным БЕз-электрофореза и гельфильтрации Мг полученного конъюгата составляет 150 ООО *кД, что соответствует гексамеру ХТ.

Как видно из рисунка.6 нативный ХТ проявляет максимальную активность в системе обращенных мицелл при «о=10. В этих условиях радиус внутренней полости мицелл равен радиусу глобулы ХТ. Для гексамера ХТ оптимум обнаруживается при ио=45, в условиях, когда радиус внутренней полости мицелл (г= 68 А) приблизительно равен радиусу сферы, описывающей правильный октаэдр из шести мономерных молекул ХТ (г= 61 X). (Небольшие различия в значениях этих радиусов, вероятно, связаны с тем, что упаковка глобул в полученном' гексамере несколько отличается от идеальной октаэдрической, а также "тем, что молекулы ХТ в полученном гексамере не контактируют непосредственно друг с другом, а соединены через ковалентные сшивки).

Таким образом, можно заранее конструировать соответствующие оли-гомерные структуры с тем, чтобы они проявляли оптимальную каталитическую активность в заданной области степеней гидратации.

20 АО 60 80 Г.&

■йо

50

.1 и! с

100 50

■ ¿ N. -----, < 1 1 а

» 6

1\ ,

«"ЧЛе-

Рис.6. Зависимость каталитической активности для нативного (а) и олигомерного (сшитого)(б) ХТ от степени гидратации е системе обращенных мицелл АОТ в октане. Пунктиром показаны значения каталитической активности ферментов в водном растворе, измеренные в условиях рН-оптимумов реакций. Для сравнения приведена шкала средних радиусов (г) внутренней полости обращенных мицелл. Стрелками отмечены радиусы глобулы XI (I) и радиус сферы, описывающей октаэдр из шести молекул ХТ (2).

ДО со

и. Регуляции каталитической активности мембранной и растворимой форм ферментов в системах обращенных мицелл-.

Известно, что в процессе метаболизма многие ферменты изменяют свою локализацию, переходя из растворимой формы в связанную с биомембранами н наоборот. Такой переход во многих случаях обусловлен присоединением к белковой глобуле или отщеплением от нее гидрофобного якоря, который может быть образован как пептидом, так и группой небелковой природы - липидом или жирной кислотой.

Ранее было обнаружено принципиальное различие в закономерностях регуляции каталитической активности ХТ и его искусственно полученной мембранной Форш - с те а ро ¡тированного ХТ, в системе обращенных мицелл. Каталитическая активность стеароилированного ХТ зависит от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации, в то время как, для нзтив-ного ХТ такая зависимость не обнаруживалась. Высказано предположение (А.В. Кабанов (1986) Дисс. ... канд. хим. наук, МГУ, 131с.), что такая зависимость может служить "тестом" на мембраноактивность ферментов. Для проверки этого предположения ш сравнили закономерности регуляции каталитической активности природных растворимых и мембранных форм ряда ферментов (»-глутамилтрансферазн, щелочной фосфатазы и йякюпсптздози) в системах обращенных мицелл.

' А. 7-Глутамилтрансфераза.

Тяжелая субъединица мембранной Форш »-ГТ содержит гидрофобный пептидный якорь, обеспечивающий связывание фермента с клеточной мембраной. Под действием протеаз происходит отщепление этого якоря, сопровождающееся переходом 'фермента в растворимую форму. Также как и для стеароилированного ХТ для мембранной Форш у-ГТ в системе обращенных мицелл наблюдается зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ при постоянной степе;-! гидратации. После обработки препарата мембранной формы фермента папашюм и перевода ее, таким образом, ь растворимую форму, зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ исчезает (см. рис.7).

Рис.?. Зависимость от концентрации ЛОТ каталитической активности т-ГТ (в ауто-трансферазной реакции) в системе обращенных мицелл АОТ в октане (и = 17)

о '

для мембранной (2) и растворимой (I) форм фермента в полугиперСолических координатах. Пунктиром (3) обозначен уровень активности в водном растворе, одинаковый для обеих форм фермента.

0,1

0,2 0,3

ШТ],М

' Б. Щелочная фосфатзза.

Методом гидрофобной хроматографии было проведено фракционирование щелочной фосфатазы (1Щ>) из юшечника теленка1. 'Как видно из данных, приведенных на рис.8 исходный препарат фермента содерзздт несколько изоформ (фракции 1-4).

Рис.8. Хроматографическое разделение препарата фермента ЩФ на гидрофобном носителе октил-силохром. Закрашенными прямоугольниками показаны значения каталитической активности фермента в различных фракциях (в усл. ед.).

о (НхО)

06 ЕЙ змвцич

!. ШХ' производства фирмы "319113" (США) была предварительно очищена гель-фмльтрэцией на носителе тоуореаг! тек 45

Для наименее гидрофобной (растворимой) изоформы ЩФ (фракция I) зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл не проявляется (см. рис.Эа). Тогда как для остальных (гидрофобных) изоформ фермента (фракции 2-4) обнаруживается зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ при постоягаюм значении и (рис.90).

•Рис.9. Зависимости каталитической активности (а) гидрофобной (фракция 4) и (б) растворимой (фракция I) изоформ ЩФ от степени гидратации и концентрации ПАВ. 0,05 И карбонатный буфер,-рН 11,75.

Отличием наблюдаемых зависимостей от обнаруженных ранее для других мембраноактиЕних ферментов является то, что на их проявление существенно влияет рН среды (рис.10). Как видно из рис.10 даже для гидрофобной изоформы ЩФ существуют условия (рН 10,50), когда отсутствует зависимость от концентрации ПАВ, как и в случае растворимой Фэр?м фермента.

Рис.10. Влияние рН среды на зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации в системе обращенных мицелл ЛОТ в октане для гидрофобной изоформы ЩФ (фракция 4). и =25; 0,05

М карбонатный буфер. I. II ,00; 3. рН=П,75; в координатах.

рН= 10,50; 2. рН= полугиперболиче ских

0,1 о,г [дст],м

о.з

Не исключено, что при изменении рН происходят изменения конфор-моции белковой молекулы, сопровождающиеся экранированием или экспонированием наружу якоршх участков, обеспечивающих взаимодействие ЩФ с ницеллярной матрицей.

.Кс.с известно, мембранную форму ЩФ можно перевести в растворимую мягкой обработкой протеазами (например, папаином), в результате которой происходит отщепление гидрофобных якорных участков белковой глобулы. После обработки гидрофобной изоформы ЩФ папаином зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ пропадает (см. рис.11), что, как мы полагаем, указывает на переход ЩФ в растворимую форму.

0.05 ол

1МЭТ],М

Рис.11. Зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации (и =25)

для гидрофобной изоформы ЩФ (фракция 4) до(1) и после(2) обработки ее папаином. 0,05 II карбонатный буфер,- рН 11,75; в полугиперболических координатах.

В. Аминопептидаза.

Как видно из рисунка 12 каталитическая активность мембранной Форш аминопептидазы (АП) в системе обращенных мицелл зависит от концентрации ПАВ, причем вид этой зависимости , также как и в описанных выше случаях г-ГТ и Щ5,совпадает с видом зависимости, обнаруженной ранее, для стеароилированного ХТ. Обработка мембрашюй формы АП паппи-ном, сопровождающаяся отщеплением гидрофобного пептидного якоря от белковой глобулы, приводит к исчезновению зависимости каталитической активности фермента от концентрации ПАВ (рис.12).

,, УСА.ед.

Рис.12. Зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации (чо= 19,5)

в системе обращенных мицелл вгу а б в циклогексане для мембранной формы АП до(2) и после(I) обработки ее папашгсм; в гюлчгипепболических координатах.

0,1

1Вгц94], М

С целью придания растворимой форме АП мембраноактивных свойств мы провели ее модификацию хлорангидридом стеариновой кислоты. Трансформация растворимой форш АП в мембранную путем ковалентного присоединения к белковой глобуле гидрофобных якорных групп приводит к появлению зависимости каталитической активности этого фермента от концентрации ПАВ в системе обращенных мицелл, аналогичной представленной на рис.П' для мембранной форш.

выводы

1. На примерах щелочной фосфатазы и г-глутамилтрансферазы показана возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов, солюбилизованных в обращенных мицеллах АОТ в октане, путем изменения степени гидратации ПАВ, определяющей размеры мицеллярной матрицы.

2. Изучена регуляция каталитической активности щелочной фосфатазы в системе обращенных мицелл АОТ в октане. Показано, что зависимость каталитической активности щелочной фосфатазы от степени гидратации (и ) имеет вид кривой с двумя максимумами, наблюдаемыми, соответственно, при но= 17 и 25, и отвечающим функционированию различных олигомерных форм фермента: по данным скоростной седиментации при ио= 17 фермент находится исключительно в форме мономера, при ио= 25 - исключительно в форме димера.

3. Изучена регуляция каталитической активности гетеродимерного фермента - т-глутамилтрансферазы в системе обращенных • мицелл АОТ в океане. Показано, что для всех типов катализируемых ферментом реакций (гидролэзнаг, аутотрансферазная и трансферазная) зависимости каталитической активности т-глутамилтрансферазы от степени гидратации имеют вид кривых с тремя максимумами (при ио= II, 17 и 26). Установлено, что эти оптимума соответствуют функционированию различных олигомерных форм фермента: при и = II функционирует легкая субъединица фермента, при но= 17 - тяжелая субъединица, а при ио= 26 - их димер.

4. Предложен метод разделения субъединиц гетеродимерных ферментов в неденатурирующих условиях, основанный на скоростной седиментации содержащих эти ферменты систем обращенных мицелл. Проведено разделение субъединиц т-глутамилтрансферазы. Показано, что обе субъединицы обладают способностью катализировать гидролазную и трансферазную реакции аутотрансферазная реакция обнаруживается только в случае тяжелой субъединицы. Установлено, что разделение субъединиц т-глутамилтрансферазы в системе обращенных мицелл приводит к "раскрытию" на тяжелой субъеди-

активного центра, который в составе димерной Формы фермента не Фучкипогагрует к оказывав.ся недоступным действию необратимого ингибитора .

На примере г-глутамилтрапсферззы, щелочной фосфатазы и змино-г.сг: ':.ц установлены различия в закономерностях регуляют актИЕНОся V :.•.':■ и т тлтрж-'Л флрм ферментов в системе обращенных мицелл

Каталитическая активность мембранных форм этих ферментов зависит от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратащш,- Такая зависимость не обнаруживается для растворимых форм, получаемых при Обработке мембранной форш или содержащей ее суспензии мембран папаином, в результате которой происходит отщепление гидрофобных якорных групп.

На примере аминопептидазы проведена трансформация растворимой формы фермента в мембранную.путем ковалептного присоединения к белковой глобуле гидрофобных якорных групп (остатков стеариновой кислоты). Показано, что каталитическая активность модифицированного фермента зависит от концентрации ПАВ, как и в случае природной мембрашюй формы этого фермента.

На примере щелочной фосфатазы показано, что наблюдаемая в системе обращенных мицелл зависимость каталитической активности фермента от концентрации ПАВ может модулироваться изменением рН среды, которое, возможно, сопровождается обратимым изменением конформации этого ц^р-мента, приводящим к экспонированию или экранированию якорных групп, обеспечивающих его взаимодействие с мембраной.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Кабанов A.B., Клячхо Н.Л., Пшекецкий A.B., Наметкин С.Н., Мартинек К., Левашов A.B. Кинетические закономерности катализа ферментами в системах обращенных мицелл поверхностно-активных веществ в органических растворителях. - Молек. биология, 1987, т.21, вып.1, с.275-286.

2. Наметкин C.H.-, Кабанов A.B., Левашов A.B., Евтушенко Г.Н., Чернов H.H. Регуляция мембранной активности ферментов путем присоединения к ним или отщепления гидрофобных якорных групп. - Тезисы XII Всесоюзного совещания по траспортным АТФазам, Иркутск, 1987. с.27-28.

3. Кабанов A.B., Наметкин С.П., Хруцкая М.М., Клинский Е.Ю., Алахов В.Ю., Левашов A.B. Биохимический дизайн макромолекул. Транспорт белков и их регуляция. - Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Вильнюс, 1988, чЛ, с.24.

4. Наметкин С.Н., Евтушенко Г.Н., Чернов H.H., Кабпно» A.B., Левашов A.B. Регуляция каталитической активности олигемерных и i/.эмаранных ферментов на примере г-глутамллтрзисф'сазы, щелочи •>!! фооЗ^тг.м; и «-хЕШтрипсияа в систем обращенных пше >.л. - Тпзисн У1

с .мпозиума по инженерной энзимологии, Вильнюс, 1988, ч.1, с.33.

5. Наметкин С.Н., Евтушенко Г.Н., Кабанов А.В., Левашов А.В., Чернов Н.Н. Регуляция мембранной активности ферментов путем присоединения к ним или отщепления гидрофобных якорных групп. - Сборник тезисов - "Химия физиологически-активных веществ", Кабардино-Балкарский университет, Нальчик, 1988, с.86-87.

6. Кабанов А.В., Наметкин С.Н., Евтушенко Г.Н., Чернов Н.Н., Керезов Т.Г., Щеголев А.А., Рыжова В.В., Клячко Н.Л., Мартинек К., Левашов А,В. Регуляция надмолекулярной структуры и каталитической активности г-глутамилтрансферазы в системе обращенных мицелл. -Биоорган, химия, 1989, т. 15, № I, С. 70-77.

7. Kabanov A.V., Hanetkin S.N., Levashov A.V. Regulation of membrane activity of enzymes by their cheraical nodi f i ..ation. Abstracts of International symposium "Chemical physics of enzyme catalysis", Tallinn, 1907, p.119.

8. Kabanov A.V., Narsetkin S.H., Levashov A.V. Diocbenical engineering of macromolecules. Protein transport and regulation. -Abstracts of 14 International congress of biochemistry, Prague, 198b, v.l, p.251.

9. Kabanov A.V. , Levashov A.V., Klyachko 1J.L., Naraetkin S.H., Pshezhetsky A.V., Martinek K. Enzynes entrapped in reversed nicclles of surfactant in organic solvents: a theoretical treatment of the catalytic activity regulation. - J. theor. Biol., 1988, v.133, p.327-34 3 .

10. Kabanov A.V.,Nametkin S.M., Evtushenko G.H., Chsrnov H.tl., Klyachko H.L., Levashov A.V., Martinek K. A new strategy for the study of oligoiaeric enzymes: y-glutamyltransferase in reversed micelles of surfactants in organic solvents. Biochin. Biophys. Acta, 1909, V.99S, p. 147-152.

11. Uametkin S.N. Regulation of supranolecular structure and catalytic activity of y-glutanyltransferase in reversed nicelles. -Abstracts of Gth conference of young scientists on organic and bio-organic chemistry, Bechyne, CSSR, p.146-147,1989.