Катализ несферическими ферментами в агрегатах ПАВ: подбор матрицы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени М.ВЛомоносова

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.15.02 + 541.182

ВАКУЛА СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

КАТАЛИЗ НЕСФЕРИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ В АГРЕГАТАХ ПАВ: ПОДБОР МАТРИЦЫ

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М-ВЛомоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, завлабораторией А.В-Левашов

Научный консультант: Официальные оппоненты:

доктор химических наук НЛ.Клячко

доктор химических наук, профессор В.Н.Измайлова

доктор химических наук, завлабораторией Л.И.Валуев

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н.Баха АН СССР

Защита состоится " 10 " сентября 1991 года в 17 часов 30 минут на заседании специализированного совета Л 053.05.76 в Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^ " августа 1991 года

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

ОА.Кост

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. В настоящее время очевидно, что варьирование надмолекулярной организации ферментов играет исключительно важную роль в регуляции их каталитической активности. Известно, что изменения надмолекулярных состава и структуры олигомерных ферментов могут сопровождаться их активацией (инактивацией), изменением параметров связывания субстратов. Кроме того, процессы изменения структурной организации окружающих фермент мебран, известные под названием лнпидного полиморфизма, также могут приводить к изменениям в организации ферментных комплексов и их активности. Изучение этих процессов в экспериментах от vivo затруднено из-за сложности организации живой клетки и одновременного протекания в ней множества взаимосвязанных процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой цели различные модельные системы. Одними из наиболее перспективных систем, моделирующих липидный полиморфизм биомембран, являются тройные системы поверхностно-активное вещество (ПАВ)-вода-органический растворитель. В таких системах при различных соотношениях концентраций компонентов могут образовываться агрегаты различной структуры , как бислойные (ламеллярные), так и небислойные (мицеллярные, гексагональные, кубические).

Размер внутренней полости агрегатов ПАВ можно варьировать в широком диапазоне (от десятка до сотен и более А), изменяя степень гидратации ПАВ wQ - молярное отношение [Н20]/[ПАВ] в системе. В гидратированных ассоциатах ПАВ при различных степенях гидратации могут помещаться молекулы белков и белковые комплексы различных размеров.

Иными словами, тройные системы ПАВ-вода-органический растворитель могут служить матрицами регулируемого размера для сборки белковых комплексов различного состава и моделирования влияния процессов липидного полиморфизма на надмолекулярную организацию и каталитическую активность ферментов.

í/ель работы. При выполнении работы были поставлены следующие основные задачи. Во-первых, исследовать возможность регуляции надмолекулярной структуры несферических субъединичных ферментов (алкогольдегидрогеиазы из печени лошади и бактериальной формиатдегидрогеиазы) в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель. Во-вторых, исследовать взаимосвязь надмолекулярной структуры этих ферментов и их каталитической активности в различных структурных типах агрегатов ПАВ в подобных тройных системах.

Научная новизна работы. На примере алкогольдегидрогеназы из печени лошади (ААГ) и формиатдегидрогеиазы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 (ФАГ) показана принципиальная возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов несферической формы в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель при изменении степени гидратации ПАВ.

Установлено, что зависимость каталитической активности этих ферментов от степени гидратации обращенных мицелл имеет вид кривой с несколькими максимумами, причем различные максимумы соответствуют функционированию различных надмолекулярных структур. Впервые установлено, что отдельные субьединицы бактериальной формиатдегидрогеиазы обладают каталитической активностью во всех фазах системы Аэрозоль ОТ1 -вода-октан. Показано, что в агрегатах ПАВ с ламеллярной и обращенной гексагональной структурой, также как и в обращенных мицеллах, молекулы ФАГ диссоциируют на субьединицы. На примере алкогольдегидрогеназы в обращенных мицеллах при оптимальной по каталитической активности фермента w0 обнаружено, что фермент претерпевает конформационные изменения, аналогичные тем, которые вызывает образование фермент-коферментного комплекса.

Научная и практическая значимость. Установленная в работе возможность использования агрегатов ПАВ различной структуры в качестве матрицы регулируемого размера для целенаправленного изменения надмолекулярной структуры олигомерных ферментов может быть положена в основу новой стратегии исследования взаимосвязи структуры и функции олигомерных ферментов, полиферментных систем и надмолекулярных комплексов других биополимеров.

Полученные результаты представляют практический интерес для моделирования природного окружения гидрофильных белков и понимания влияния структурной организации агрегатов ПАВ и липидов на каталитическую активность ферментов. Установленный факт диссоциации формиатдегидрогеиазы на субьединицы может дать новую информацию о механизмах функционирования фермента в клетках.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах, читаемых на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ.

1. Аэрозоль ОТ (АОТ, натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты).

Апробаиия работы. Основные результаты работы были представлены на 6 п 7 Международных конференциях молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехине, ЧСФР, 1989; Варна, НРБ, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (по структурным типам агрегатов ПАВ, свойствам ферментов в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель, краткой характеристике использовавшихся ферментов), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (из 153 наименований). Работа изложена на страницах и включает 2. таблицы и рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Регуляция каталитической активности ферментов изменением содержания води в системе ПАВ-вода-органический растворитель

Фазовые диаграммы тройных систем ПА В-вода-органический растворитель приведены на рис.1. Границы фазовых областей уточнены для использовавшихся в работе буферных растворов.

Рис.1. Фазовая диаграмма тронных систем АОТ-вода-октан (Л) и Вгу 56-вода-ииклогексан (Б). - обращенные мицеллы, Г) - ламеллярная фаза, И - обращенная гексагональная фаза, 12 - обращенная кубическая фаза. Сечения а-с отражают составы тройных систем, в которых проводилось измерение каталитической активности ферментов.

Известно, что в агрегаты ПАВ с различной структурой могут включаться ферменты, причем для более чем 10 из них, имеющих сферическую форму, было показано, что зависимости каталитической активности от степени гидратации ПАВ (\у0), как правило, имеют

колоколообразный вид. Максимум каталитической активности при этом наблюдается при степени гидратации, когда радиус внутренней полости мицелл равен радиусу белковой глобулы. В случае олигомерных белков на зависимости каталитической активности от степени гидратации обнаруживается несколько оптимумов, каждый из которых соответствует функционированию одной из надмолекулярных форм фермента. Подобная колоколообразная зависимость с двумя 01ттимумами (при wQ=35 и 48, см. рис2) наблюдается и для алкогольдегидрогеназы из печени лошади в системе обращенных мицелл ЛОТ-вода-октан.2

Рис.2. Зависимость каталитической активности АДГ в системе обращенных мицелл АОТ в октане от степени гидратации (0,1 М АОТ; 20 мМ фосфатный буфер, pH 8). Пунктиром обозначено значение каталитической активности фермента в водном растворе. Для сравнения приведена шкала средних диаметров (d) внутренней полости обращенных мицелл. Стрелкой отмечено значение длины наибольшей оси аппроксимирующего эллипсоида молекулы АДГ и диаметр внутренней полости мицелл при w0=48.

Молекула алкогольдегидрогеназы имеет вытянутую форму и аппроксимируется эллипсоидом с соотношением осей 45x55x110 А. При wQ=35 диаметр внутренней полости мицелл равен длине наибольшей оси молекулы фермента (М=80 kDa). В оптимуме при степени гидратации 48 -он приблизительно равен диаметру ассоциата из четырех молекул фермента. В этой связи разумно предположить, что наблюдаемые максимумы обусловлены функционированием соответственно димерной и октамерной форм АДГ. Методом скоростной седиментации проведено изучение системы обращенных мицелл, содержащей АДГ. Коэффициенты

2. В настоящей работе в качестве модельной нами была выбрана

катализируемая алкогольдегидрогеназой реакция окисления

этилового спирта до уксусного альдегида: С2Н5ОН + NAD+ - СН3СОН + NADH + Н+

V/И.с4

Ii-

/

АI

V/

_1_1_

—' 1 1 I 1 I г .

TS SO IS 100 HS d,R

I I I

lo го so <ш

0

седиментации мицелл, содержащих белок, определяли как описано ранее (ЬеуавЬоу А.У. е1 а1„ 1981).

Как видно из данных, приведенных на рисЗ, при изменении степени гидратации происходит изменение надмолекулярного состава ферментного ассоцната. При степенях гидратации больших 39, заполненные белком мицеллы содержат исключительно молекулярный тетрамер АДГ (М=320 к ), а при «'0=35 - исключительно отдельную молекулу АДГ (М=80 кОа).

ТО 60 50 ко Зо 20 Ю

О

SS

-V

г

Рис.3. Коэффициенты седиментации белок-содержащих мипелл (Б) при разных степенях гидратации. Пунктиром показаны теоретические кривые для субьединичного димера(1) и октамера(2), соответственно. Точками экспериментальные данные.

Ю 20 Зо чо v/o

Зависимости каталитической активности ААГ от степени гидратации агрегатов ПАВ с ламеллярной и обращенной гексагональной структурами имеют аналогичный колоколообразный характер (см. рис. 4, 5).

2

1

Рис.4. Зависимость каталитической активиости АДГ от степени гидратации агрегатов АОТ с ламеллярной структурой (сечение с фазовой диаграммы на рис. 1а). Приведена шкала средних расстояний между слоями АОТ. Стрелкой обозначена длина наименьшей оси молекулы АДГ.

О Ю !о Зо <(о 50 60 7о

Оптимум каталитической активности АДГ в ламеллярной фазе наблюдается при степени гидратации близкой к 65, что сооответствует расстоянию между ламеллами ПАВ в 45 А. Это расстояние равно длине наименьшей оси фермента.

Для АДГ, включенной в ассоциаты с обращенной гексагональной структурой, максимум на зависимости каталитической активности от степени гидратации наблюдается при степени гидратации «/0=27. В этой

1о

20

У>

Но

d.R

1 ■

/

/

А,

Рис.5. Зависимость активности АДГ гидратации обращенной структурой

, 55"

Зо <ю So бо то а.й

О

<о

го

so

w.

каталитическом от степе™ агрегатов АОТ с гексагональной (сечение Ь фазовой диаграммы на рис.1а). Приведена шкала среди!« диаметров внутренних полостей цилиндров из молекул АОТ. Стрелкой обозначена длина средней оси молекулы АДГ.

точке средний диаметр внутренней полости цилиндров АОТ составляет 55 А, что совпадает с длиной средней оси аппроксимирующего эллипсоида. Следует отметить, что АДГ проявляет наибольшую каталитическую активность именно в агрегатах с обращенной гексагональной структурой. Можно полагать, что в этих условиях молекула фермента, имеющая эллипсоидальную форму, ориентируется вдоль цилиндров агрегатов ПАВ обращенной гексагональной фазы.

Для формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 в системе обращенных мицелл АОТ в октане на зависимости каталитической активности от степени гидратации наблюдаются три оптимума - при w0=14, 33 и 48 (см. рис.6)3. Размеры молекулы ФДГ, состоящей из двух идентичных субьединиц, аппроксимируются эллипсоидом с соотношением осей 60x66x100 А. При wQ=14 диаметр внутренней полости мицелл равен диаметру субьединицы ФДГ (М =44 kDa)1*. В оптимуме при степени гидратации 33 -приблизительно равен длине наибольшей оси молекулы ФДГ, а при w()=48 - диаметру ассоциата из четырех молекул фермента. Так же как и в случае АДГ можно предположить, что наблюдаемые максимумы обусловлены функционированием различных форм фермента - мономерной, димерной и октамерной, соответственно.

3

г

3. В настоящей работе в качестве модельной нами была выбрана катализируемая формиатдегидрогеназой реакция окисления иона формиата до углекислого газа:

НСОО"+ЫАО+ == ССЬ+ЫАБН

4. Диаметр субьединииы ФДГ (М=44 кЭа) рассчитывали по формуле <1=2г=2*0. 7 (М) ' (см. А.ВЛевашов (1988) В кн.: Химические и ферментативные реакции в растворах ПАВ. Ред. И.В.Березин. Из-во ВИНИТИ: М. с. 112).

Г'\

Л

г

I

I

\

.Во

\

4

N

1°7

I

Рис.6. Зависимость каталитической активности ФДГ в системе обращенных мицелл АОТ в октане от степени гидратации (0,1 М АОТ; 20 мМ фосфатный буфер, рН 8). Пунктиром обозначено значение каталитической активности фермента в водном растворе. Для сравнения приведена шкала средних диаметров ((1) внутренней полости обращенных мицелл. Стрелками отмечены значения диаметра субъеднницы фермента, длины наибольшей оси аппроксимирующего эллипсоида молекулы ФДГ и диаметр внутренней полости мицелл при ы0=48. Методом скоростной седиментации проведено изучение системы обращенных мицелл, содержащей ФДГ. Коэффициенты седиментации белок-содержащих мицелл приведены на рис.7.

.1«

2У Го 15 \оо «г

<а

2>о 40

то

6о 5в-

•«И 2«

Л* 1

«. *

Рис.7. Коэффициенты седиментации белок-содержащих мицелл (Б) при разных степенях гидратации. Пунктиром показаны теоретические кривые для субъединицы( 1), субьединнчного димера(2) и октамера(З), соответственно. Точками - экспериме1ггальные данные.

АО

2о "У> <ш Яо

Как видно из данных рис.7, при изменении степени гидратации (\у0) происходит изменение надмолекулярной организации ФДГ в системе обращенных мицелл. При степенях гидратации меньше 23, заполненные белком мицеллы содержат исключительно мономерную форму ФДГ (М =44 кОа), а при w0=33 - ФДГ в димерной форме (М=88 кРа). При степенях гидратации больших 40 внутрь обращенных мицелл встраивается октамер из субьединнц ФДГ.

Зависимости активности ФДГ от степени гидратации ПАВ в ассоциатах с ламеллярной и гексагональной структурой имеют характерный колоколообразный вид, как и в случае АДГ (рис.8, 9).

А

V

/

4-

4А

и

го зо V) 5о бо а.Л

30 *Ю 50 60 То 8о 30 ■*/,

Рис.8. Зависимость каталитической активности ФАГ от степени гидратации агрегатов АОТ с ламеллярной структурой (сечение с фазовой диаграммы на рис.1а). Приведена шкала средних

расстояний между слоями АОТ. Стрелками обозначены длины наименьшей и средней оси молекулы ФАГ и диаметр субъеднницы.

Как видно из рнс.8, положение оптимума каталитической активности при w0=74 не совпадает с ожидаемым значением, соответствующим малой оси молекулы ФАГ. Расстояние между ламеллами в оптимуме равно приблизительно 50 А, что совпадает с диаметром субъеднницы, аппроксимируемой сферой равной массы.

На рисунке 9 представлены аналогичные данные для ФАГ, солюбнлизованной в цилиндрах ПАВ с гексагональной упаковкой. В этом случае оптимум каталитической активности приходится на степень гидратации 24, когда диаметр водных полостей также не соответствует ни одной из осей молекулы фермента, но приблизительно равен диаметру субъеднницы ФАГ. При этом величина каталитической активности фермента значительно ниже уровня ферментативной активности димерной формы ФАГ в системе обращенных мицелл.

Рис.9. Зависимость каталитической У/[е] , с"1 активности ФАГ от степени гидра-

/•ч^ тации агрегатов АОТ с обращенной

гексагональной структурой (сечение Ь фазовой диаграммы на рис.1а). Аля сравнения дана шкала средних диаметров полостей внутри цилиндров из молекул АОТ. Стрелками обозначены длины средней и наименьшей оси молекулы

/

V

у

Л-

4-С

30 Чо £ГО бо 7о а.Й ФАГ, а также диаметр субъеднницы,

—Г" 10

20

ЧО

ум^ аппроксимируемой сферой.

2

1

Так как обращенные мицеллы ЛОТ способны фиксировать при различны* степенях гидратации различные олигомерные состояния диссоциирующих ферментов, можно предположить, что мезофазы с другой структурой будут оказывать такое же влияние на надмолекулярную организацию фермента.

Аля того, чтобы показать наличие или отсутствие диссоциации молекул ФАГ и связанного с этим изменения каталитической активности фермента, использовали метод ковалентной "фиксации" димерного состояния каталитически активной формы фермента. Аля получения ковалентно-сшитого димера из субьединиц формиатдегидрогеназы использовали бифункциональный сшивающий агент - диметиловый эфир имидата суберовой кислоты (Ра1ай 1975). Методом ЗОв-электрофореза в работе показано, что в результате модификации получен препарат ФАГ, содержащий не менее 87 % сшитого димера ФАГ (М =88 кРа).

При включении сшитого фермента в обращенные мицеллы наблюдается резкое качественное изменение зависимости его каталитической активности от степени гидратации (рис. 10) по сравнению с зависимостью для исходного препарата.

Л'

V

.'Г

Рис.10. Зависимость каталитической активности ковалентно-сшитого I димера ФАГ в системе обращенных

¡1 мицелл ЛОТ в октане. Пунктиром

показан профиль активности для * исходного препарата фермента.

О 20 ю <|0 у/„

Как видно из рис.10, в случае ковалентно-сшитого димера оптимум при малых степенях гидратации, предположительно соответствующий функционированию субъединицы ФАГ, исчезает. Таким образом, первый оптимум на профиле активности исходного препарата ФАГ в системе обращенных мицелл (пунктир на рис.10) действительно соответствует проявлению активности одной субьедииицы ФАГ. Ковалеитно-сшитый димер проявляет при w0=33 активность равную активности исходного препарата формиатдегидрогеназы.

Наибольший интерес представляет случай обращенной гексагональной фазы. Как уже говорилось выше, для ФАГ в этой фазе характерно мам** (по сравнению с димером в мицелле) значение

Ч

активности и положение оптимума в точке, где внутренний диаметр равен 50 А и не соответствует ни одной из осей молекулы фермента. Максимум каталитической активности наблюдается при степени гидратации агрегатов ПАВ равной 34 (см.рис.Па), когда диаметр внутренних полостей цилиндров равен приблизительно 65 А, то есть молекула ковалентно-сшитого димера формиатдегндрогеназы располагается внутри цилиндров вдоль своей большой оси. Скорость ферментативной реакции в этой области значительно выше величины, полученной для нативной ФАГ в обоих оптимумах активности в системе обращенных мицелл, и сопоставима со значением каталитической константы ФДГ в водном растворе. В ламеллярной фазе (рис.116), хотя зависимость скорости ферментативной реакции от степени гидратации и имеет слабо выраженный характер, можно с достоверностью сказать, что происходит сдвиг оптимума в область более высоких степеней гидратации, то есть в область увеличения межплоскостных расстояний между ламелламн поверхностно-активного вещества. Все это говорит в пользу гипотезы о необходимости полного геометрического соответствия матрицы ПАВ и эллипсоидальной молекулы ФАГ для проявления оптимальной каталитической активности.

А

/

/

//

4_и

66

зо ад 50 во

а.»

б

\

»0

20

30

К,

ЧЬ

Зо

чо

4-

дД

50 6о

30 <10 50 60 7о 8о 9о

Рис.11. Зависимость каталитической активности ковалентно-сшитого димера ФАГ' в обращенной гексагональной (а) и ламеллярной (б) фазах тройной системы АОТ-вода-октан. Пунктиром показан профиль активности для исходного препарата фермента. Стрелками отмечены длины наименьшей и средней оси ФДГ и диаметр субъединицы.

3

г

ф

1

/

2. Взаимосвязь конформаицонного состояния ферментов и каталитической активности.

Включение белков в систему обращенных мицелл может приводить к значительному изменению конформации, прослеживаемому по изменению спектров КА (Walde et al, 1988). В настоящей работе спектры кругового дихроизма белок-содержащих жидкокристаллических структур исследовали при различных степенях гидратации агрегатов ПАВ. В случае ФАГ, в первом оптимуме в обращенных мицеллах (рис.12а) наблюдалн лишь незначительное изменение характера спектра, сопровождающееся, однако, увеличением эллиптичности субьединицы, что свидетельствует о более конформационно жесткой структуре белка. Незначительное изменение спектра при 230 нм обычно соотносят с увеличением содержания спиральной структуры в белке. В области второго оптимума разницы в характере спектра в водном и мицеллярном растворе (рис.126), как это было найдено ранее для других белков, практически не наблюдалось, за исключением заметного увеличения эллиптичности белковой молекулы без изменения вторичной структуры.

Изменение спектров КА алкогольдегидрогеназы, по-видимому, отражает конформационные изменения молекулы, а не является следствием возмущений в хромофорной системе, о чем свидетельствует отсутствие значительных различий в УФ спектрах АДГ при разных степенях гидратации. В точках до и после оптимума каталитической активности димера (см.рис.2) по форме они не отличаются от спектров КА ферме!гта в буферном растворе. Как видно из рис. 13а, они имеют форму, характерную для /¡-структуры белков. При включении АДГ в обращенные мицеллы, размер внутренней полости которых равен большой оси эллипсоида, то есть в оптимуме по каталитической активности, как видно из рис.136, наблюдается незначительное увеличение молярной эллиптичности фермента, но существенно увеличивается интенсивность в

210 220 Но 2Ао 2SO

-S-

[в] ю'-

нм Рис.12. Спектры кругового оптического дихроизма ФДГ в ^ системе обращенных мицелл АО'Г в октане (50 мМ АОТ, фосфатный > буфер рН 75). а) ш0=14; б) \«0=33. Пунктиром показан спектр КД формиатдегидрогеназы в . водном растворе.

области 220-230 им. Подобное изменение интенсивности соотносят обычно с увеличением спирализации структур. Приведенные данные подтверждают предположение, что в точке оптимума каталитической активности фермент не только приобретает более жесткую конформацию, но и претерпевает изменения во вторичной структуре. Результатом этих изменений становится увеличение доли а-спиралыюй структуры. 2(0 lio izo 2Uo ISO

Рис.13. Спектры кругового оптического дихроизма АДГ в системе обращенных мицелл АОТ в октане (50 мМ АОТ, фосфатный буфер рН 7.5). а) «-„=18, 25, 30, 40, 45; б) ш0=35. Пунктиром показан спектр КА алкогольдегидрогеназы в водном растворе.

СИ 1С5 грлА-т'дмоЛь'1

В функционировании ИАО-зависимых дегидрогеназ исключительно важную роль играют конформационные изменения, происходящие при связывании субстратов. Роль этих перестроек, как считается, заключается в формировании субсгратсвязывающего участка активного центра, экранировании полости активного центра от влияния растворителя и регуляции активности фермента.

По этой причине следующим шагом было сопоставление характера изменения спектров КД при включении АДГ в оптимальную мицеллу и при связывании кофермеига. Из данных, представленных на рис.14 видно, что связывание ЫАО+ с образованием фермент-косубстратного комплекса приводит к изменениям конформации пептидного остова, аналогичным эффекту, вызываемому мицеллярной матрицей при \у0=35. Для изучения изменения спектров КД при образовании фермент-косубстратного комплекса в водном растворе был использован непродуктивный комплекс алкогольдегидрогеназы с коферментом и аналогом субстрата азидом натрия, так как константа диссоциации комплекса очень мала и составляет всего 10-7 М.

2 ¡о 22о 2 го iko _1-.-■ , ■

им

Рис.14. Спектры кругового оптического дихроизма АДГ. Комплекс АЛГ-ЫАО+-азиА в системе обращенных мицелл АОТ в

WMo"1 ГРАД CM'wwaь '

октане, №„=18, 25, 30, 40, 45 (50 мМ АОТ, фосфатный буфер рН 7.5). Пунктиром показан спектр К Л алкогольдегидрогеказы. в водном растворе без кофермента и азида.

Данные, представленные на рис.15 свидетельствуют о том, что в водном растворе для непродуктивного комплекса фермента происходят аналогичные изменения в форме и характере спектров, хотя и выраженные в меньшей степени.

Ч1П 14 О llj .л ЧГЛ

Таким образом, матрица обращенной мицеллы может вызывать в молекуле фермента как увеличение общей жесткости структуры, так и конформационые изменения, аналогичные по характеру тем, которые происходят при образовании фермент-коферментного комплекса.

1. Показана принципиальная возможность функционирования ферментов несферической формы в различных типах жидкокристаллических структур тройных систем поверхностно-активное вещество-вода-органический растворитель (обращенная мицеллярная, ламеллярная, обращенные гексагональная и кубическая). Найдено, что фактором регуляции каталитической активности ферментов служит изменение соотношения

СФ1 to'1 cvft 1

Рис.15. Спектры кругового оптического дихроизма комплекса ААГ^АО+-азид. а) в соответствующем буферном растворе; б) в системе обращенных мицелл АОТ в октане, иг0=35 (50 мМ АОТ, фосфатный буфер рН 7.5). Пунктиром показан спектр КД алкогольдегидрогеназы в водном растворе без кофермента и азида.

ВЫВОДЫ

геометрических параметров матрицы ПАВ и молекулы фермента. В области оптимума каталитической активности выполняется принцип геометрического соответствия (комплементарное™) матрицы ПАВ и молекулы белка.

2. Изучена регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы из печени лошади в различных фазах тройных систем ПЛ Ввода-органический растворитель. Обнаружено, что конформационное состояние белковой молекулы модулируется матрицей ПАВ. Так, в частности, найдено, что алкогольдегидрогеназа из печени лошади, солюбилизованная в обращенных мицеллах АОТ, приобретает в области оптимума каталитической активности конформацию, характерную для ее комплекса с коферментом в активном центре.

3. Показано, что в жидкокристаллических мезофазах, образующихся в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель, также как и в системах обращенных мицелл, можно регулировать каталитическую активность диссоциирующих олигомерньи ферментов путем изменения состава белковых комплексов.

4. Изучена регуляция каталитической активности формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.lOl в различных фазах тронных систем ПАВ-вода-органический растворитель. Установлено, что отдельная субъединица формиатдегидрогеназы обладает каталитической активностью в различных фазах системы на основе Аэрозоля ОТ. При использовании ковалентно-сшитого димера показано, что наибольшей каталитической активностью обладает именно димерная форма фермента, причем ее активность максимальна в гексагональной фазе.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Клячко ПЛ., Меркер Ш, Вакула С.В, Иванов М.В., Березин И.В., Мартинек К., Левашов A.B. Регуляция каталитической активности олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл поверхностно-активных веществ // Аокл. АН СССР. 1988. Т.298. С. 1479-1481.

2. Клячко ПЛ., Пшежецкий A.B., Кабанов A.B., Вакула C.B., Мартинек К., Левашов A.B. Катализ ферментами в агрегатах ПАВ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ. //Биол.мембраны. 1990. Т.7. С.467-472.

3. Vakula S.V. Horse Liver Alcohol Dehydrogenase and Formate Dehydrogenase in Ternary System AOT-water-octane. Regulation of

Catalytic Activity. //Proc.6th Int.Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry. Bechyne, CSSR, 1989. P.95-96. 4. Vakula S.V, Klyachko N.L. Catalytic Activity and Structural Ordering of Alcohol Dehydrogenase in Surfactant Aggregates Modeling Lipid Polymorphism of Biomembranes. //Proc.7th Int.Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry. Varna, Bulgaria, 1990.

P.ll-13.

Подписано в печать 24.07.91

ниитэхим.

Заказ № 1023. Тираж 100 экз.