Исследование аминокислот и сывороточного альбумина человека с помощью спектроскопических методов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

РГ5 ОД

„,->, / -.---ИНСТИТУТ ФИЗИКИ ЯМ Б. И. СТЕПАНОВА

На правах рукописи

ИВАНОВ Александр Аркадьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ И СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЖЬЮ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

01.04.05. - оптика

А г т о о р е V а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических тук

/

и

Млнск-1993

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физики АНБ.

Научные руководители: член-корреспондент Инженерной академии РБ, доктор физико-математических наук, профессор Жбаыков Р. Г. ; кандидат физико-математических наук, доцент Ильич Г. К.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Пикулик Л. Г. ; кандидат химических наук, старший научный сотрудник Гарбуз Н. И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт прикладных физических проблем Белоруского государственного университета

Защита состоится "23 года в ^ часов на засе-

дании специализированного совета К 006.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте физики Академии наук Беларуси С220602, г.Минск, пр.Ф.Скорины,70, Институт физики АНБ).

С диссертацией мокло ознакомиться в библиотеке Института физики АНБ.

Автореферат разослан " " 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат физ.-иат. каук % У Кунцевич Б. Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.М;ту5Льностъ тег-i - Известно, что химические и биологические свойства белка определяются прежде всего его аминокислотным составом и последовательностью остатков в цепи. При различных заболеваниях белковые молекулы претерпевают структурные изменения. Однако so сих пер недостаточно выяснены, происходящие при этой, процессы. Лля этого необходимо привлечение высокочувствительных физических и физико-химических методов. 3 исследовании молекулярной структуры белка, его конфермационных состояния, системы мег- и внутримолекулярных водородных связей перспективно использований методов молекулярной спектроскопии. КХ спектроскопия, например, широко используется для решения задач тонкого структурного анализа сложных молекул. Принципиально новые возмо:г.ност;; - повышения чувствительности и избирательности метода открывается, капрнмгр, при использовании низких температур. Изучение колебательных спектрсэ биологических объектов при температуре жидкого гелия позволяет получить более полную спектроскопическую информации об исследуемых молекулах, которая необходима для углубления фундаментальных представлений о строении этих соединений. Наряду с Ж спектроскопией для исследования биологических объектов широко применяется лвмянесцентныЯ анализ. Объясняется зто прежде ftcero его высокой чувствительностью, зкспресностыэ. Ко главное его достоинство заключается в тем, что сн позволяет сяед:-;ть за состоянием живых систем, нэ лоЕрехдая их, т.е. является методом нераэрушзедего контроля.

Цель ¿стоЗ у agora -- детальная интерпретация ИК спектров ряда аминокислот; установление, на примере главного транспортного белка плазмы крови — ензороточкого альбумина чэловекаССАЧ) .конкретных спектроструктурньгх корреляций белковых молекул; выявление специфики структурных изменений САЧ при патологии и разработка па этой основе высокочувствительных спектральных методов анализа.

йучная новизна голчашкх кУ.'Дтатов.

Вперзые проведена систематизация ИК спектров аюшскислот при температуре 1SK; обнаружено существование в кристаллах аминокислот молекул с менее устойчивой конфигурацией структурных элементов; уточнена область частот торсионных колебаний групп NH*. в

аминокислотах; показано, что в образовании межмолекулярных водородных связей в сывороточном альбумине человека участвуют главным образом группы . а внутримолекулярные водородные связи образуются группами NN и С 0 ; обнаружено, что при патологических процессах происходят коуформационные изменения молекулы альбумина; на основании экспериментальных данных, полученных с помощью метода флуоресцентного зондирования установлено, что включение гемосорбции в комплекс лечебных мероприятий у больных с гнойно-септической патологией приводит к восстановлению связывающей емкости альбумина плазмы крови.

Практическая! значимость работы. Применение низкотемпературной ИК спектроскопии в сочетании с данными теоретических расчетов кристаллических структур позволило расширить представление о физическом строении аминокислот, находящих широкое применение в биологии и медицине. Установленные спектральные законо?^ерности, характерные для низкотемпературных спектров, могут быть использованы в научных и практических целях при изучении строения и свойств аминокислот, различных пептидов и белков. С помощью метода флуоресцентного зондирования может быть проведена оценка степени делигандиэации альбумина в процессе гемосорбции. Полученные в диссертации данные о строении аминокислот и связывающей способности альбумина используются для решения практических задач в плане НИР Института биоорганической химии АН Беларуси, Института переливания крови МЗ Республики Беларусь, Института кровезаменителей и гормональных препаратов МЗ Российской Федерации Сг. Москва), лабораториях гемо- и лимфо-сорбции клиник Республики Беларусь, НПО "Белмедпрепараты" С г. Минск).

Ка зают вцндсятся:

— систематизация колебательных спектров ряда важнейших типов аминокислот при температуре 18К, интерпретация полос поглощения, выявленных в ИК спектрах аминокислот при Т = 18К с учетом присутствия в образцах молекул с менее устойчивой конформацией структурных элементов;

— результаты экспериментальных и теоретических исследований тонкой структуры полос валентных колебаний группы ЦН . включенных в

водородную связь в кристаллах - аланина и [_ ~ пролина, и отнесение компонентов этих полос к определенным типам водородных связей;

— исследования системы внутри- и мекгалекулярных водородных связей сывороточного альбумина человека С САЧ ) с помощью низкотемпературной ИК спектроскопии;

— результаты исследования методом ИК спектроскопии структурных и конформационных переходов молекулы альбумина при различных патологиях;

— исследование механизма нарушения связывающей способности альбумина плазмы крови у больных с гнойно-септической патологией методом флуоресцентного зондирования.

Ашробашм работа. Результаты исследований обсуждались на семинарах лаборатории молекулярного спектрального анализа Института физики АН Беларуси и кафедры медицинской и биологической физики Минского государственного медицинского института. Материалы диссертации докладывались на Республиканских школах-семинарах "Спектроскопия молекул и кристаллов" СПолтава, 1987; Тернополь, 1989); V и VI Координационных совещаниях по спектроскопии полимеров СЗелено-горек, 1988; Минск, 1989); ||| Конференции научно-учебного центра Университета Дружбы народоз "Применение физико-химических методов исследования в науке и технике" (Москва, 1990); Первой всесоюзной конференций До теоретической и органической химии СВолгоград, 1991); Vil Конференции по спектроскопии биополимеров С Харьков, 1991); IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992).

Публисацщ. Основные результаты работы опубликованы в двенадцати печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Обьем й структура дкссбртэши. Материал диссертации изложен на 131 страницах, включая 34 рисунка, 2 таблицы, библиографию из 172 Названий, й состоит Из введения, пяти глав и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИЙ

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы, указана ее цель, изложены решаемые в работе задачи, выделены защищаемые Положения, научная новизна, практическая значимость по-

лученных результатов, апробация работы, охарактеризовано содержание диссертации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Рассматриваются некоторые общие сведения о строении аминокислот и САЧ, а также спектроскопические методы исследования их структуры. Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о .том, что в последние годы повысился интерес к исследованию ИХ спектров сложных органических соединении при температуре жидкого гелия. Это соответствует современным тенденциям молекулярной спектроскопии к улучшению качества спектров, получению дополнительной информации о структурных свойствах вещества. Литературные данные свидетельствуют, что при понижении температуры в ИК спектрах аминокислот происходят следующие изменения: снятие теплового фона, сужение полос поглощения, увеличение интенсивности, расцепление и сдвиг отдельных полос поглощения. Однако, до сих пор здесь отсутствуют систематические исследования. Известные работы носят отрывочный, случайный характер, практически без интерпретации наблюдаемых спектральных изменений. Присутствие большого числа полярных групп, участвующих в образовании сложной системы меж- и внутримолекулярных водородных СЕязей, определяет высокую чувствительность аминокислот, а следовательно, и их спектров к температурным изменениям. Лля правильной интерпретации изменений в ИК спектрах белковых молекул при различных патологиях достаточно широко в настоящее время применяется наряду с методом инфракрасной спектроскопии и метод денонволвции, обеспечивающий лучшее разрешение сильно перекрывающихся полос поглощения и тем самым позволяющий изучать особенности Еторичной структуры белковых молекул, а также проследить за изменениями их конформации при различных воздействиях. Метод флуоресцентного зондирования рассматривается как один из наиболее перспективных для изучения процессов функционирования белков плазмы в живых системах, для выяснения молекулярных механизмов патогенеза различных заболеваний, а также использования его в качестве диагностического теста. Именно эти обстоятельства и определяют перспективность применения спектроскопических методов (низкотемпературной ИК спектроскопии и метода флуоресцентного зондирования) в исследовании структуры ами-

нокислот и белков.

2.МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Для получения низкотемпературного спектра был использован оптический гелиевый крисстат с КВг окнами. Небольшие размеры и малый вес криостата дают возможность легко и быстро приспособить его для работы на любом спектральной приборе. Исследуемый образец, запрессованный в таблетку из КЗг, крепился в вакуумной камере на медном хладопроводе. Откачка крисстата производилась с помо'дьв вакуумного поста до 1С"4 мм рт.ст. Предварительное охлаждение осуществлялось азотом. Через определенное время после заливки гелия достигалось постоянная температура образца 9,8 К. Температурный контроль осуществлялся с помоцьв термопары медь-золото. Во время записи спектра на спектрофотометре 1!р.-20 температура объекта исследований повышалась до 13 К за счет поггореяая образцом теплового излучения источника.

В качестве объектов исследований был вкс'рзн ряд аминокислот и сывороточный альбумин человека. Вмбор объектов исследований определялся необходимостью установления специфики спектралмнте изменений при понижении температуры гминскиелот, раеличзсцпнсч строением молекул и прострлистг.о!:!""-! распсчоътнк?« групп атомов. Яристалличес-кие {-{-дейтериссЕант'е образцы аминскислст е;.;пн прчготспленч путем получения ипа.чскэтп? в смеси С И,СО и ¡л О при нпгрегмпии г.

занаянних ампула:: ^ кристзглчзгчцк''» при

Степень дейторирсг'ання ссст.-'эляла 7У/, САЧ вилелял.-~ :?сто-».:.": поли-зтиленглихольнсго раьи::о«црсгз:гд':, пгетпргп'того -злоктро^рчза и аффинной хром.атогр?.;;':' •.::> г.г.гмт крогн здсрсь:-::-: доносов и белый« с ендогенней интоксикацией з??тгиогг

2. и 3 гонкой реют;- ;гп ■^узресиоНмг'и регистрировались На с.'ч.сгреу'гуурпм-тре "Пся-Г.З". 3 качестве олектс-й исследований ис-польесдался волн;.:' раствор гтле.змы кро":Н С 1:Е03. Понц-нтрациснный контроль ссу^естл.:я,:ся по спектрам пеглс^еги.т на спектрофотометр.;;; "Йресога-и\гУ18" л "Бескт;:1л-1Ло270". В качестве гётуорссцентасго зонда был кегхи-зопя 1 -авцяивотфгаяян -5-сульЗонат САНС").который в плазме кроЕи в присутствии остальных белков флуоресцирует з основном при сэязкезяив с альбуминс.ч (более чем на 50 У, 3. Рабочая ксч-

центрация зонда ЛНС была определена экспериментально. Для снятия спектров флуоресценции использованы растворы смеси плазмы крови и АНС в соотношении 1:1. Была получена временная зависимость интенсивности флуоресценции, необходимая для определения времени инкубации растворов флуоресцентного зонда и плазмы крови. Установлено, что относительная интенсивность флуоресценции в плазме не зависит от времени инкубации растворов С по крайней мере, в течение суток).

3. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ ИНФРАКРАСНЫЕ СПЕКТРЫ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ АМИНОКИСЛОТ По химическому строению аминокислоты представляют собой амфо-терные соединения, содержащие одновременно амино- (КНг) 11 карбоксильную (С О О Н) группы у а-атома углерода. В соответствии со своей амфотерной природой молекулы аминокислот в зависимости от кислотности среды могут иметь разную ионную форму. В кристаллическом состоянии молекулы аминокислот обычно имеют цвиттерионную форму NN'0 НСЮС 0 0"- Специфичность каждой из них определяется строением группы К (радикала). Для объяснения свойств аминокислот, а также выявления общих структурных закономерностей, характерных для аминокислот и их полимеров - белков, важно знание строения отдельных молекул аминокислот, а также их возможных межмолекулярных взаимодействий. При построении кристаллических структур аминокислот определяющую роль играют водородные связи. Получение спектров кристаллических аминокислот при температуре 18 К позволило выделить составляющие компоненты и провести анализ тонкой структуры этих полос поглощения. Наиболее заметные изменения при понижении температурь; образца происходят в тех спектральных интервалах, где расположены частоты колебаний групп атомов, участвующих в образовании водородных связей. Причем полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями групп КН*. МН* , 0 Н сдвигаются в сторону низких частот, а деформационными и торсионными колебаниями этих групп в сторону высоких частот. При этом также наблюдается увеличение их интегральной интенсивности. Указанные спектральные изменения свидетельствуют о возрастании энергии водородных связей в кристаллах аминокислот при охлаждении. Причем чем сильнее водородная связь, тем больше сдвиг максимума соответствующей полосы поглощения. Дополнительным

подтверждением отнесения полос поглощения к колебаниям водородно-связанных ЦН групп может служить заметнее уменьшение интенсивности соответствующих полос поглощения в спектрах N-дейтерированных аналогов.

3.1. Были изучены ИК спектры алифатических аминокислот (а -глицина, L ~ аланина, 1_ - треонина, 1_ - глутамина и !_ - глутамино-вой кислоты ) при комнатной С Т = 300К ) и при гелиевой С Т = 1SK ) температурах в области частот 400-3600 см"1.

Гдцгн - простейшая аминокислота. Для уточнения интерпретации полос поглощения, обусловленных валентными, деформационными и торсионными колебаниями групп f,'¡-|* был получен ИК спектр Ц-дейтерированного а-глицина. Комплексное использование методов низкотемпературной ИХ спектроскопии и дейтерообмена позволила сделать следующие отнесения полос поглощения в ИК спектре а -глицина. Полосы поглощения при 2730, 2875, 2940, 3190 см"' обусловлены валентными колебаниями NH в группах NH* ; при 2985 и 3017 см"' — валентными симметричными и ассиметричнкми колебаниями групп С Нг; при 895, 915, 1115, 1135, 1505, 1517, 1531 , 1615 см*1— деформационными колебаниями групп МН^ ; при 520 см"' — торсионными колебаниями NH* : при 1540 см "'— деформационными колебаниями группы С Hz-

Алкжд. На основании исследований ИК спектров L-аланнна ПРИ Т=300, 91 и 18 К и его дейтерированного аналога полосы поглощения при 3005, 2932, 2942 см"' были отнесены к валентным колебаниям СаН. С Н3. при 3085, 3075, 3030, 2315, 2732, 2612 см"1— к валентным колебаниям групп NH¡ . а при S55 см"1 — к торсионным колебаниям групп • Установлено, что полоса поглощения при 3085 см"' не чувствительна к понижения температуры. Учитывая известный из литературы факт, что одна из водородных связей, формирующих трехмерную структуру кристалла аланина, ориентированная вдоль оси "С", не чувствительна к понижению температуры, высказано предположение, что полоса поглощения при 3085 см"' обусловлена валентными колебаниями групп NH, включенных в водородные связи, образующие линейную цепь молекул аланина вдоль оси "С" кристалла. Проявления валентных колебаний групп NH3 в различных частотных интервалах позволяет предположить существование в кристаллах аланина молекул с различной простран-

ственной ориентацией этих групп. Для уточнения этого предположения методом теоретического информационного анализа было проведено исследование молекулы аланина. В результате проведенных расчетов было установлено, что в кристалле аланина реализуется несколько конфор-иаций, причем и при глубоком охлаждении сохраняется конформациснное разнообразие молекулярных структур. В ИК спектре Ь-аланина присутствуют широкие интенсивные полосы в интервалах частот 1550-1830 см"' и 1-490-1540 см"1 . Сопоставление спектров численного дифференцирования и ^-дейтерированного образца в рассматриваемых областях позволило отнести полосы поглощения при 1539 и 1520 см"1 к деформационным колебаниям групп ^Н* , а полосы поглощения при 1621 и 1589 см"1— к валентным колебаниям группы С 0 0"- Отметим также, что в ИК спектре [_-аланина наблюдается полоса поглощения с основным максимумом при 3420 см"' слабой интенсивности. При понижении температуры до 18К ата полоса расщепляется на две компоненты: 3425 и 3370 см"' , которые обусловлены ассиметричными и симметричными валентными колебаниями группы МН2 • Кроме того, в низкотемпературном спектре СТ = 18 КЗ присутствует слабая полоса поглощения при 1735 см"' , обусловленная валентными колебаниями С = 0 неионизированной карбоксильной группы. Присутствие этих полос поглощения свидетельствует о существовании!! небольшого количества молекул аланина в исследуемом образце в неиокизированкой форме.

Щснщ - аминокислота, радикал которой содержит гидроксильную группу. Было проведено сравнение ИК спектров (_-аланика и [_-треонина при Т=300 и 18 К, которое показало, что присутствие группы 0 Н в структуре [.-треонина приводит к появлению полос поглощения при 3178, 1052 и 770 см"' обусловленных, соответственно, валентными, деформационными и торсионными колебаниями групп 0 Н

Глтета. Отличительной особенностью молекулы |_-глутамина является присутствие в ее структуре как группы ^Н* - так и групп КН . Понижение температуры образца приводит к увеличению интенсивности и сдвигу ряда полос поглощения, расположенных в интервалах, где проявляются полосы поглощения обусловленные валентными колебаниями как группы МНг (3500-3000 см" 3, так и группы ИН* (2800-2500 см"'), а также торсионными колебаниями групп (400-800 см"').

Анализ низкотемпературного ИК спектра [_-глутамина показал, что в кристалле глутамина все группы участвует в образовании водородных связей. Последнее согласуется с данными рентгеноструктурного анализа.

Глуткмовая кислота. Характерная особенность ИК спектров |_-глутаминовой кислоты, по сравнению с рассмотренными выше аминокислотами - высокая температурная чувствительность полосы поглощения с максимумом при 2610 см"1 . Сопоставление данных ИК спектроскопии с данными рентгеноструктурного анализа показало, что указанная полоса поглощения обусловлена колебаниями групп 0 Н. участвующих в образовании межмолекулярных водородных связей, которые объединяет молекулы |_-глутам:гаовсй кислоты з бесконечные цепочки, параллельные оси "в" кристалла. Сравнительный анализ ИК спектра [.-глутаминовой кислоты с ИК спектрами [_~аланина и |_-треонина позволил отнести полосы поглощения при 685 и 725 см"' к торсионным колебаниям групп О Н. а полосы поглощения при 415 и 457 см"'— к торсионным колебаниям групп [у'Н* . Отсутствие поглощения в области частот 3500-3600 см"' свидетельствует о том, что все группы 0 Н включены в Еодородные связи.

3. 2. Были изучены также ИК спектры гетероциклической аминокислоты С|_"-триптофанаЗ и имннохислоты (|_-пролина) при Т=300 и 18 К.

ИК спектр [.-триптофана зарегистрирован в области частот валентных колебаний групп-С Н 'А КН*С2000-3500 см"'). При понижении температуры полоса поглощения при 3410 см"' смещается на 7 см*' и расщепляется на две компоненты. Это позволяет предположить, что в кристалле [.-триптофана реализуется дна конформационных состояния группы индольного кольца о ¡энергетически неравноценными водородными связями. Действительно, проведенный конформационный анализ показал, что в кристалле молекулы [."Триптофана могут существовать в двух наиболее стабильных конформациях. Охлаждение образца приводит также к значительному увеличений интенсивности и сдвигу максимума полосы поглощения при 3040 см"1 в сторону низких частот. Подобные изменения наблюдаются и для полос поглощения в области частот 2400-2550 см"1 .Здесь проявляются валентные колебания ^ групп, участвующих в образовании водородных озяэай. Различно в час-

тотах валентных колебаний групп NH* можно объяснить существованием в кристаллах триптофана молекул с различной пространственной ориентацией этих групп. Полосы поглощения при 308S и 2970 см"1 не чувствительны к понижений температуры. Это позволило отнести их к валентным колебаниям групп С Н. С Нг-

Пролин. Характерной особенностью пролина, содержащего пирроли-диновое кольцо, является наличие лишь одного угла внутреннего вращения. Специфическое строение его молекулы обуславливает особую роль пролина при образовании вторичной структуры белковых молекул. Были исследованы ИК спектры [.-пролина при Т=300 и 18 К в области частот 400-3700 см"1 . В рассматриваемом диапазоне при пониженинии температуры до 18 К наблюдаются существенные изменения спектра. Анализ этих изменений позволил полосы поглощения при 3060, 2505, 2475 см"1 отнести к валентным колебаниям групп; полосы поглощения при 3015, 2990, 2965, 2880 см"' — к валентным колебаниям С Н. С Нг групп; полосы поглощения при 1735 и 1625 см"1— к валентным С 0 0"и деформационным NH колебаниям групп соотвественно; полосы поглощения при 1450, 1378, 1292, 1038, 850, 790 см"'— к деформационным колебаниям групп С Нг- Проявление валентных колебаний групп в различных частотных интервалах можно объяснить существованием в кристаллах |_-пролина молекул с различной пространственной ориентацией этих групп. Для уточнения этого предположения методом теоретического конформационного анализа проведено исследование молекулы пролина. На основании конформационных расчетов был сделан вывод о возможности существования молекул пролина с различной пространственной ориентацией NH* групп. Сопоставление экспериментальных данных низкотемпературной ИК спектроскопии и теоретических расчетов свидетельствует, что и при глубоком охлаждении в кристалле [„-пролина реализуется два конформера. Отметим также, что при понижении температуры до 18 К полоса поглощения при 3435 рм"1 слабой интенсивности расщепляется на две компоненты: 3380 и 3430 см"1, которые обусловлены ассимметричными и симметричными колебаниями группы NHj. Кроме того, в низкотемпературном спектре присутствует слабая полоса поглощения при 1740 см"1, обусловленная валентными колебаниями С я 0 неонизированной карбоксильной группы. Присутствие

этих полос поглощения свидетельствует о существовании небольшого количества молекул пролина в исследуемом образце в неонизированной форме.

4. ИНФРАКРАСНЫЕ СПЕКТРЫ И СТРУКТУРА САЧ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

Один из наиболее интересных представителей глобулярных белков

- альбумин, на долю которого приходится более 50% общего содержания белка в сыворотке крови. Основные функции сывороточного альбумина

— осмотическая и транспортная. Для понимания биологической активности белковых молекул необходимо иметь отчетливое представление об их структуре, так как весьма незначительные изменения последней приводят к утрате их функциональной активности.

4.1. В ИХ спектре САЧ, как и других белков, наибольший интерес

*

представляют исследования в областях, где расположены полосы колебаний пептидной группы - это так называемые полосы Амид 1,11, III, Y, а также полосы валентных колебаний ^Ц-групп. Были изучены ИК спектры САЧ при Т = 300 и 18 К в области частот 1300 - 3500 см''. При комнатной температуре в ПК спектре САЧ в области частот валентных колебаний групп МН (3000 - 3500 см"') присутствует ряд полос поглощения. Чувствительной к понижению температуры сказалась полоса поглощения при 3320 см"'. Низкочастотное (относительно частоты свободных колебаний) смещение полосы валентных колебаний групп fJH является спектральной характеристикой водородной связи. Сдвиг максимума полосы 3320 см"1 свидетельствует об увеличении энергии водородной связи, а величина этого сдвига (порядка 40 см"' ) указывает на межмолекулярный характер этих связей. Отсутствие температурного сдвига полос поглощения при 3530, 3430, 33S0 и 3200 см"' указывает на то, что большинство групп fJH участвует в образовании водородных связей внутри молекулы САЧ и, наряду с прочными химическими S~S связями, обуславливают жесткость каркаса молекулы альбумина и препятствует ее температурной деформации. В области частот 1450 - 1750 см"' присутствуют сильные сложные полосы с основными максимумами при 1660 см'1 САмид1) и при 1545 см'1 АмидШ. Первая обусловлена валентными колебаниям групп С 0 пептидной связи, вторая деформационными колебаниями МН в плоскости пептидной группы. Отсутствие

температурного сдвига компонент полосы Амид I свидетельствует о том, что группы С 0 пептидной связи образуют водородные связи внутри молекулы альбумина и не участвуют в образовании мекмолекулярных водородных связей. К понижению температуры оказалась чувствительной компонента полосы Амид II с максимумом при 1548 см"1, которая сдвигается на 4 см"1 в сторону высоких частот, при отом еэ относительная интенсивность возрастает. Низкотемпературный сдвиг максимума полосы поглощения при 1548 см"1, увеличение ее относительной интенсивности подтверждает сделанный вше вывод об участии в образовании мекмолекулярных водородных связей в основном групп ^Н пептидной связи.

4.2. При различных заболевания молекулы САЧ претерпевают информационные изменения. В работе изучены особенности структуры САЧ при патологии по данным ¡Ж спектроскопии и кругового дихроизма СКД). Были сопоставлены Ж спектры САЧ здорового человека к больных сепсисом, хроническим гепатитом, хронической почечной недостаточностью в области частот 700-1700 см"1. При всех изученных заболеваниях в ИК спектрах САЧ наблюдается изменение относительных интен-сиЕностей отдельных компонент полос поглощения Амид I, II, III, что свидетельствует об изменениях во вторичной структуре белка. Полученные данные согласуются с результатами по исследованию спектров КД. Наиболее заметные изменения в ПК спгктрах "патологического " альбумина происходят в спектральном интервале 1000 - 1140 см":. В КК спектре САЧ здорового донора присутствуют слабо иктелг.пвные полосы поглощения с максимумами при 1085, 1120 см"1 и выступом при 1055 см"1. При всех рассмотренных патологиях в КК спектрах САЧ в этой области наблюдается значительное увеличение интенсивности указанных вк^е полос поглощения, При патологии происходит нефермепта-тивкое гликолизирование белков крови, в том числе и САЧ. Сделано предположение, что увеличение поглощения в области 10Э0 - 1100 см"1 обусловлено присутствием связанных с альбумином са.'.'ароь, так как в этой области углеводы имеют сильные полосы поглощения.

■5. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТНОЙ ФУНКЦИИ САЧ 3 НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

Поскольку САЧ является главным транспортным белком плазмы кро-

jjvi, то в работе помимо исследования его молекулярной структуры методами ¡К спектроскопии было изучено изменение связывающей способности альбумина при введении лекарственных препаратов в организм и проведена оценка эффективности гэмосорбции С ГС) при гнойно-септических заболеваниях методом флуоресцентного зондирования.

5.1. САЧ отличается универсальными комплексообразующими свойствами. Его молекулы способны обратимо фиксировать вещества самого различного строения. Как указывалось выше, в плазме крови в присут-свии остальных белков анион 1-анилинонафталин-8-сульфанат САНС" ) флуоресцеирует в основном при связывании с САЧ.. В работе была изучена зависимость интенсивности зонда АНС в плазме крови кроликов от времени после введения в организм животного лекарственного препарата - периферического миорелаксанта СФЭП-278). Установлено, что интенсивность зондовой флуоэесценции монотонно уменьшается, достигая минимального значения на 20 минуте. Поскольку интенсивность флуоресценции АНС в плазме крс.ви определяется количеством связанного зонда с САЧ, то наблюдаемое изменение может быть обусловлено тем, что либо сам препарат, либо его метаболиты связываются с молекулами альбумина и блокируют активные центры. Для выяснения характера взаимодействия лекарственного препарата с молекулами САЧ был исследован спектр поглощения его водного раствора. В спектре поглощения ФЭП-278 присутствуют три полосы с максимумами при Х^ = 269,5 нм, X = 251,8 нм и = 255,5 нм. При возбуждении этими длинами волн собственного излучения самого препарата не наблюдается. Следовательно, в водной среде ФЭП-278 не обладает собственной флуоресценцией. Спектр собственной флуоресценции альбумина имеет максимум при X = 330 нм. Наблюдаемая флуоресценция обусловлена присутствием тритофа-нового остатка в молекуле САЧ. В работе был зарегистрирован спектр флуоресценции смеси растворов альбумина (с = 4,5 х 10*' М) и ФЭП-278 (с = 5,SxlO"1 М), в котором присутствуют две полосы флуоресценции X = 330 нм и X. = 412 нм. Следует отметить, что при

r maxi тахг

этом наблюдается уменьшение интенсивности флуоресценции триптофано-всго остатка СХ = 330 нм) и появления в спектре полосы флуоресценции с максимумом X = 412 нм. Это позволяет предположить, что моле-

кулы исследуемого препарата при связывывании с молекулами альбумина становятся флуоресцентными центрами, возбуждение которых осуществляется в результате переноса энергии в комплексе. Альбумин выступает здесь в роли донора, а ФЭП-278 - акцептора. Наблюдаемое тушение флуоресценции альбумина при введении ФЭП-278 свидетельствует о присоединении молекул препарата вблизи триптофанового остатка. Таким образом, проведенные модельные исследования показали возможность связывания препарата ФЭП-278 с альбумином плазмы крови. В работе было также проведено исследование собственной флуоресценции белков плазмы крови кроликов после введения им препарата ФЭП-278. Результаты исследования показали, что интенсивность собственной флуоресценции белков плазмы крови в течение 20 минут после введения препарата монотонно уменьшается. Аналогичная завиоимость наблюдалась и для интенсивности флуоресценции АНС в плазме крови. Это свидетельствует о том, что в плазме крови ФЭП-278 взаимодействует с белками, изменяя микроокружение триптофановых остатков и нарушая транспортную функцию альбумина. Однако этот процесс обратим. Анализ временной зависимости интенсивности собственной флуоресценции белков плазмы крови в присутствии ФЭП-278 показал, что за время 60 минут после его введения интенсивность триптофановой флуоресценции практически полностью восстанавливается.

5.2. Проведено исследование связывыющей способности САЧ методом флуоресцентного зондирования у больных перитонитом, в комплекс лечебных мероприятий у которых была включена гемосорбция. ГС - это пропускание крови через колонки с сорбентом с целью удаления из крови метаболитов эндогенной и экзогенной природы. В процессе проведения ГС количественный состав белков не претерпевает существенных изменений. Однако, было отмечено изменение интенсивности флуоресценции зонда АНС в плазме крови после проведения ГС, происходит увеличение интенсивности флуоресценции АНС в плазме крови. Таким образом, в процессе ГС происходит увеличении связывающей способности САЧ за счет его делигандизации. Наиболее информативным способом оценки эффективности ГС является определение изменения уровня так называемых "средних молекул" ССЮ в плазме крови больных. СМ - токсины пептидной природы, величина молекулярной массы которых состав-

ляет 300-1500 дальтон. СМ способны образовывать прочные комплексы с САЧ, их накопление вызывает нарушение жизнедеятельности различных органов человека. Определение этих веществ в жидких средах позволяет оценить степень интоксикации, а также контролировать эффективность детоксикационных процедур. Поэтому был проведен сравнительный анализ уровня СМ и интенсивности флуоресценции АНС в плазме крови до и после ГС. Однократное включение ГС в комплекс лечебных мероприятий у 20 больных привело к значительному уменьшению уровня СМ, что свидетельствует об удалении токсинов из плазмы крови, и увеличении интенсивности флуоресценции АНС в плазме. Последнее указывает на повышении связывающей способности САЧ по окончании проведения ГС. После снижения интоксикации в постсорбционном периоде отмечено ее постепенное нарастание. Это потребовало многократных ГС. Во всех опытах установлена обратная зависимость уровня СМ и интенсивности флуоресценции АНС в плазмч крови. Степень изменения этих показателей имела прямую связь с выраженностью детоксикационного эффекта ГС. Следовательно, метод флуоресцентного зондирования дает возможность проводить оценку эффективности ГС.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые получены и систематизированы ИК-спектры ряда аминокислот при Т = 18К. Выявлена тонкая структура полос валентных колебаний МН в группах ^Н* , 11 обнаружены значительные низкочастотные сдвиги компонент полосы ь>т), зависящие от структуры исследуемых соединений.

2. На основе комплексного использования методов низкотемпературной ИК спектроскопии и дейтерообмена определены интервалы частот валентных, деформационных и торсионных колебаний групп КН3 Б ИК спектрах а-гЛицина и |_~аланина.

3. Установлено существование в кристаллах [,-аланина и 1_-пролина молекул с различной пространственной ориентацией групп МН+ 11 Показано, что конформационное разнообразие молекулярных структур сохраняется и при Т = 18К. Экспериментально установлено, что в кристалле |_~аланина и [.-пролина часть молекул существует в неионизированной форме.

4. Показано, что в образовании межмолекулярных водородных свя-

зей в сывороточном альбумине человека ССАЧ) участвуют главным образом группы NH полипептидной цепи. Внутримолекулярные водородные связи образуются группами NH и С О Доказано, что при патологии идет процесс гликолизирования САЧ, а также происходят некоторые конфор-мационные переходы, не затрагивающие спиральные участки молекул альбумина.

5. Обнаружено с помощью метода флуоресцентного анализа, что новый лекарственный препарат — ФЭП-278 взаимодействует с белками плазмы крови с изменением микроокружения триптофанового остатка и нарушением транспортной функции альбумина.

. 6. С помощью метода флуоресцентного зондирования, установлено, что включение гемосорбции в комплекс лечебных мероприятий у больных гнойно-септической патологией приводит к делигандизации транспортных белков крови.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО'В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Иванов A.A., Филипчик В. И., Кирковский В. D. и др. Исследование структуры сывороточного альбумина человека с помощью ПК спектроскопии. // ЖПС. - 1989. - Т.51, К 1. - С.135-138.

2. Иванов A.A., Королик Е.В. , Инсарова Н. И. и др. Низкотемпературные колебательные спектры и молекулярная структура |_-аланина. // ЖПС. -1990. - Т. 53, N 2. - С. 265-270.

3. Иванов A.A., Лещенко В. Г., Ильич Г. К. и др. Применение низкотемпературной ИК спектроскопии к анализу молекулярной структуры глицина. // ЖПС. - 1991. - Т.54, N3. - С.464-458.

4.Иванов А.И., Иванов A.A., Голубович В.П. и др. Исследование структуры сывороточного альбумина при патологии методом ИК спектроскопии. // ЖПС. - 1991. - Т. 54, N3. - С. 445-448.

5. Ф1Л1пчык В. I. , 1ваноу А. А. , KaponiK A.B. i iHti. Даследаванне лхгандзвязвальнай здольнасцх бялкоу плазмы крыв! метадам флуарэс-центнага зандз1ровання. // Весц1 АН БССР "сер.б1ял.". - 1991. - N1. - С.53г56.

6. Иванов A.A., Королик Е.В. , Игьич Г. К. и др. Исследование структуры L-пролина с помощью методов низкотемпературной ИК спектроскопии и конформационного анализа. // ЖПС. - 1991. - Т.55, N2.

С. 217-220.

7.Иванов A.A., Иванов А. И. Спектроскопическое исследование особенностей структуры сывороточного альбумина человека при патологии. // В кн. ; Тез. докл. YI Всесоюзного совещения по спектроскопии полимеров. Минск. 1989. С. 48.

8. Иванов A.A. , Корояик Е.В. , Инсарова Н. И. и др. К вопросу о структуре САЧ при патологии. // В кн: Тез.докл. III конференции научно-учеоного центра УДН "Применение физико-химических методов исследования в науке и технике". М. 1990. С.128.

9. Иванов А.А., Филипчик В.И., Кирковский В. В. и др. Оценка выраженности эндотоксикоза и детоксикационного эффекта гемосорбции у больных с гнойно-септической патологией. // В кн: Тез.докл. III конференции научно-учебного центра УДН "Применение физико -химических методов исследования в науке и технике". М. 1990. С. 133.

10. Голубович В. П. Доролик Е.В. , Иванов A.A. и др. Исследование молекулярной структуры |_-аланина с помощью методов криоспектрсскопии и теоретического конформационного анализа. // В кн. : Тез. докл. I Всесоюзной конференции по теоретической органической химии. Волгоград. 1991. С. 429.

11. Иванов A.A., Королик Е.В. Анализ молекулярной структуры аминокислот с помощью низкотемпературной ИК спектроскопии и конформаци-онного анализа. // В кн.: Тез.докл. I Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. 1991. С.122.

12. Королик Е. В. Кирковский В. В. , Иванов А. А. и др. - Оценка эффективности гемосорбции у больных с гнойно-септической патологией. // В кн.: Тез.докл. IY Всесоюзного совещения "Люминесцентный анализ в медицине и биологии.и его аппаратурное обеспечение". М. 1932. С.36.

X X

X

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в соавторстве с научными руководителями, которые принимали участие в постановке задачи и обсуждении полученных результатов. В работе используются теоретические расчеты конфсрмаций молекул ряда аминокислот в кристаллическом состоянии, выполненные доктором биологических наук В. П. Голубовичем.

19