Исследование динамики состояния тканей сердца методом лазерно-индуцированной флуоресценции тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

Маслов Николай Анатольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ СЕРДЦА МЕТОДОМ ЛАЗЕРНО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

01.04.05 «Оптика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Иституте теоретической и прикладной механики Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель

доктор физико-математических наук, профессор Оришич Анатолий Митрофанович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, старший научный сотрудник Потатуркин Олег Иосифович

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Бойко Виктор Михайлович

Ведущая организация

Институт лазерной физики СО РАН

Защита состоится «_»_2004 г. в_час._мин на

заседании диссертационного совета К 003.005.01 в Институте автоматики и электрометрии СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, просп. Акад. Коптюга, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института автоматики и электрометрии СО РАН

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.т.н Косых В.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) широко используется в медико-биологических исследованиях. В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминес-цировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения. Люминесцентный метод исследования белков позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики и др. Лазерно-индуцированная флуоресценция может быть использована в диагностике большого числа заболеваний. Использование в качестве источника возбуждения ультрафиолетового излучения позволяет изучать люминесценцию в широком спектральном интервале, наблюдать перестройку спектров ЛИФ при развитии патологических изменений. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком, отличать нормальную аорту от больной атеросклерозом. В большинстве работ для возбуждения ЛИФ использовались лазеры с длиной волны больше 280 нм. Флуоресценция, индуцированная излучением с меньшей длиной волны, изучена мало, хотя использование коротковолновых источников света потенциально позволяет наблюдать флуоресценцию от большего числа компонентов.

Источником УФ излучения, возбуждающего люминесценцию, могут быть эксимерные лазеры. Перспективным направлением применения ЛИФ является разработка контролирующих систем, которые во время операции по лазерной абляции тканей с высокой плотностью энергии должны дифференцировать по спектрам ЛИФ патологически измененные и здоровые структуры и предотвращать повреждение тканей, не являющихся предметом оперативного вмешательства.

Одним из достоинств лазерных методов диагностики является их скорость. Возможность проводить экспресс-диагностику особенно актуальна в трансплантологии. Важным фактором, влияющим на успех трансплантации, является оценка жизнеспособности донорских тканей или органов, используемых для пересадки. Исходное неудовлетворительное состояние тканей донорского сердца является причиной 15-20% смертей при выполнении операции трансплантации. К сожалению, системы оценки качества трансплантатов до настоящего времени нет. Сегодня для оценки жизнеспособности трансплантата в эксперименте используется биопсия и исследование образца различными гистологическими и гистохимическими методами. Так, с помощью флуоресцентных зондов проводится оценка ре-докс потенциала, уровня свободных радикалов в клетках, уровня АТФ, фрагментации ДНК, свидетельствующей о гибели клеток. Однако все перечисленные методы иивазивны для трансплантата и их проведение требует множества дополнительных и часто длительных процедур, что делает эти методы малопривлекательными для; ьней-л^зкта^д^^^и этим

3 Р0 БИБЛИОТЕКА |

3 СЯЫ^ЛЦЖ I

ОЭ

разработка новых методов объективной оценки состояния донорских тканей является актуальной и необходимой.

Кроме качества аллографта, не меньшее значение имеет и состояние тканей реципиента. Известно, что многие патологические процессы в сердце сочетаются с минерализацией (кальцинозом) тканей, что особенно актуально для больных пороками сердца. Проведение любых хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженного кальцинозом, может сопровождаться фрагментированием тканей и послеоперационными осложнениями. Быстрая и своевременная интраоперационная диагностика фрагментов кальцинированных тканей в полости сердца может способствовать профилактике этих осложнений.

В свете изложенного, перспективным представляется разработка метода быстрой и точной диагностики состояния тканей сердца с использованием методов, основанных на применении лазерного излучения.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было исследование возможностей лазерной флуоресцентной спектроскопии для определения состояния тканей сердца. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследование спектров флуоресценции аминокислот, составляющих животные белки, различных биологических субстанций и здоровых тканей (аорты, клапанов сердца, и т.д.) при возбуждении ультрафиолетовым излучением эксимерного лазера с X = 248 нм. Определение характеристических спектральных полос этих веществ и тканей для данной длины волны возбуждения.

2. Исследование влияния лазерного облучения = 248 нм на биологические ткани по динамике изменения их спектров ЛИФ в зависимости от дозы облучения. Определение параметров лазерного излучения, не повреждающего клетки и ткани, но позволяющего судить об их состоянии.

3. Исследование ЛИФ здоровых и кальцинированных тканей сердца человека для определения потенциала метода применительно к диагностике степени минерализации тканей, а также для выяснения вклада органических и минеральных компонент в спектр.

4. Исследование зависимости спектральных характеристик тканей сердца от степени их жизнеспособности, обусловленной сроками и условиями хранения. Сравнение результатов, полученных методом ЛИФ, с данными рутинной клинической гистологии и гистохимии.

Научная новизна полученныхрезультатов - Показано, что под воздействием УФ излучения с длиной волны меньше 280 нм, а именно излучения эксимерного лазера с А, = 248 нм, у широкого набора биологических веществ наблюдается флуоресценция.

Причем спектры флуоресценции специфичны для каждого вида тканей и веществ. Определены основные флуорофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения. Приведенные данные доказывают перспективность применения ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для идентификации состава биологических тканей, регистрации их состояния и наличия изменений.

- Показаны тканеспецифические изменения спектра ЛИФ под воздействием УФ излучения X = 248 нм, используемого для возбуждения ЛИФ. Исследована зависимость скорости происходящих изменений от энергии возбуждающего излучения. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана. Установлена доза, при которой изменения спектра ЛИФ, происходящие в ткани под воздействием лазерного излучения, не превышают разброса данных при измерении.

- Обнаружено, что спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцинозом, и макроскопических кальцинозных образований, добытых из резецированных клапанов сердца, отличаются от спектров здоровых тканей. Показано, что изменение спектра ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, обусловлено появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксилапатита.

- Обнаружено, что в процессе хранения миокарда свиньи в физиологическом растворе при различных температурах его спектры ЛИФ, возбуждаемые эксимерным лазером с X = 248 нм и азотным с Я = 337 нм, претерпевают изменения. Скорость спектральных изменений ЛИФ зависит от температуры хранения ткани. Сравнение результатов ЛИФ измерений с данными гистологического анализа с использованием флуоресцентных красителей показало, что наблюдаемые изменения ЛИФ связаны с жизнеспособностью ткани.

Практическая значимость полученных результатов

Достаточно большое отличие спектров минерализованного и нормального клапанов, характеризуемое отношением интенсивности ЛИФ на длинах волн 330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценций на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца. Изменение спектров ЛИФ в процессе хранения тканей может использоваться для малоинвазивного быстрого контроля жизнеспособности трансплантатов непосредственно перед операцией, а также в ее процессе.

На защиту выносятся:

- Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ различных биологических субстанций и тканей, показывающие перспективность применения лазера с = 248 нм для определения их состояния.

- Результаты измерения и анализа влияния УФ излучения Я = 248 нм на биологические ткани, показывающие малую инвазивность метода ЛИФ при определенных параметрах.

- Методика диагностики степени поражения клапана сердца кальци-нозом, которая может быть использована при операциях на открытом сердце, например, при лазерной абляции кальцификатов. Преимуществами ЛИФ метода являются скорость и возможность использования в качестве обратной связи при пластической хирургии.

- Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ миокарда свиньи в процессе хранения. Обнаружено, что снижение жизнеспособности миокарда вызывает изменения его спектров ЛИФ, что может быть использовано для определения пригодности трансплантатов.

Достоверность результатов

Полученные с использованием лазера с = 248 нм спектры вписываются в общую картину формирования спектров ЛИФ, наблюдаемую другими исследователями при использовании других длин волн возбуждающего излучения. Частные случаи спектров ЛИФ при возбуждении X = 337 нм, совпадающие по условиям измерений, совпадают с результатами других авторов.

Апробация работы

Основные результаты докладывались на международных конференциях: по методам аэрофизических исследований ICMAR-96, атомным и молекулярным импульсным лазерам AMPL-99, лазерным технологиям LAT-2002, лазерной метрологии LM-2002, лазерной оптике LO-2003, биотехнологии Progress in the biotechnology and neurobiology - integrative medicine- 2004.

Публикации

Основные результаты опубликованы в трудах международных конференций [1,6,10,11], рецензируемых журналах [2-4,7-9], патенте [5].

Личный вклад

В процессе работы соискатель подготовил экспериментальные установки, написал соответствующее программное обеспечение для автоматизации, участвовал во всех экспериментах, лично обрабатывал результаты, участвовал в написании публикаций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, пяти глав, выводов и списка литературы. Диссертация занимает 134 страницы, содержит 54 иллюстрации и список из 105 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении описывается текущее состояние проблемы и перспективы развития ЛИФ диагностики.

В общей характеристике работы сформулированы цели работы, кратко представлены основные результаты, выносимые на защиту.

Первая глава содержит литературный обзор основных работ, посвященных ЛИФ диагностике. Описаны физические принципы, положенные в основу метода. Рассмотрены известные флуорорфоры, вносящие вклад в спектры флуоресценции биологических тканей. Представлены модели, описывающие влияние реабсорбции флуоресценции на спектры. Описан эффект фотовыцветания флуоресценции в результате воздействия УФ излучения. Проанализированы направления развития ЛИФ диагностики.

Вторая глава содержит описание использовавшихся в работе разработанных экспериментальных установок и методик исследования. Для исследований спектров флуоресценции биологических тканей были созданы два измерительных комплекса.

В первом измерение спектров ЛИФ осуществлялось путем сканирования (рис. 1). Излучение лазера подавали на предметный столик из сла-бофлуоресцирующего материала, на котором помещали исследуемые ткани. Размер исследуемой области ~10 мм. Для измерения спектров использовали двойной зеркальный призменный монохроматор ДМР-4 с дисперсией на длине волны 400 нм порядка 4нм/мм, на выходе которого был установлен фотоэлектронный умножитель ФЭУ-71 с областью спектральной чувствительности 170-650 нм. С помощью светоделительной пластины часть излучения лазера подавалась на опорный приемник. Величину сигнала с фотоумножителя делили на величину опорного сигнала, чтобы убрать зависимость результата измерения от пульсаций мощности лазера. Данная установка обладала чувствительностью, достаточной для измерения ЛИФ спектров биологических тканей, однако, характеризовалась недостаточным соотношением сигнал/шум (~ 10) и приходилось подвергать образец большому количеству импульсов лазерного излучения, которое при многократных измерениях не может не влиять на ткань.

Впоследствии была создана более совершенная многоканальная система (рис. 2). Для измерения спектров ЛИФ в ней использовали спектрограф и ПЗС камеру. Поскольку доступные ПЗС матрицы нечувствительны в УФ области, для увеличения чувствительности системы и расширения в УФ область до 300 нм измеряемого диапазона перед камерой установили электронно-оптический преобразователь (микроканальный усилитель яркости) с фотокатодом на увиолевой подложке. Данная система позволила измерять спектр за 1 импульс излучения лазера вместо 300, необходимых для сканирующей системы. Это позволило уменьшить время измерения и снизить влияния лазерного излучения на ткань при многократных измере-

ниях. За счет усреднения интенсивности по 100 строкам изображения и 10 измерениям удалось добиться точности измерения лучше 1%. Полученная уникальная система отвечала всем требованиям ЛИФ спектроскопии биотканей: высокая чувствительность, точность, компактность, малое время измерения, низкое влияние излучения на ткань; что позволило регистрировать даже малейшие отличия спектров.

В данной главе также описаны рутинные гистохимические методы, использовавшиеся для контроля и анализа состояния биологических тканей и установка для измерения глубины проникновения лазерного излучения в ткань.

В третьей главе представлены результаты исследований спектральных особенностей ЛИФ различных биологических веществ и тканей при возбуждении лазерами с длинами волн 248, 308 и 337 нм.

Были исследованы различные вещества и ткани при возбуждении ультрафиолетовым излучением эксимерного лазера с X = 248 нм: чистые наиболее люминесцирующие ароматические аминокислоты - триптофан и тирозин, набор здоровых однородных биологических субстанций и тканей - белок куриного яйца и его скорлупа, поперечно-полосатая мышца, мышечная фасция, хрящ и костная ткань коровы, аорта и сердечная мышца свиньи. Полученные спектры ЛИФ биологических веществ, возбуждаемой излучением с длиной волны 248 нм, можно разделить по характерным признакам на три класса.

Первый класс веществ составляют спектры, в которых присутствует преимущественно люминесценция белка в виде составляющих его аминокислот - триптофана и тирозина. Спектры ЛИФ этой группы (рис. 3) отличаются тем, что вне основной области свечения интенсивность ЛИФ не превышает 10% от максимума на 330 нм.

Ко второму классу относятся спектры, у которых также присутствует полоса с максимумом вблизи 330 нм, однако кроме ЛИФ аминокислот присутствуют и другие полосы флуоресценции (рис. 4). У всех этих тканей флуоресценция в области 370-400 нм заметно интенсивнее по сравнению с веществами первого класса. Кроме того, присутствует длинноволновая полоса 430-550 нм. Подобное поведение спектра обусловлено, в основном, наличием в этих тканях волокнистых белковых структур, коллагена и эластина.

К третьему классу (рис. 5) относятся спектры ЛИФ кости и хряща, в которых не присутствует явно полоса люминесценции белка. Можно предположить, что у данного класса биологических веществ наблюдаются четыре независимые полосы ЛИФ: 270-300 нм, 300-350 им, 370-400 нм, 430-550 нм. Однако, принадлежность каждой из этих полос еще до конца не изучена. В спектре кости максимум ЛИФ полосы 300-350 нм с точностью примерно до 1 нм близок к максимуму ЛИФ тирозина. В настоящей работе показана возможность независимого возбуждения второй и третьей

полос веществ третьего класса: результаты опытов при возбуждении ХеС1 лазером Я = 308 нм показали, что в спектре кости не возбуждается вторая полоса (рис. 6).

Изучено влияние лазерного излучения на исследуемые ткани. При проведении измерений ЛИФ интенсивность лазерного излучения, как правило, на порядок ниже порога фотоабляции, так что макроскопических изменений оно не вызывает. Однако энергия кванта излучения, —5 эВ для Я = 248 нм, является достаточно высокой для разрыва связей в молекулах исследуемого вещества и может вызывать изменения в химическом составе ткани и, соответственно, в спектре ЛИФ. Рис. 7 иллюстрирует изменения спектра ЛИФ поперечнополосатой мышцы свиньи под воздействием УФ света Я = 248 нм. На нем изображены спектры до и после облучения образца дозой 20 Дж/см2 (2000 импульсов излучения). Под воздействием излучения ослабляется пик с максимумом 330 нм, вызванный флуоресценцией триптофана, то есть происходит фотоинактивация триптофана. Такие же результаты были получены на образцах миокарда и аорты. Спектр кости меняется более сложным образом, происходит также ослабление полосы 380 нм. Кроме того, основной пик в спектре ЛИФ сдвинут в УФ область по сравнению с остальными образцами. Это говорит о том, что в данном случае наблюдается инактивация не триптофана, а других веществ, скорее всего тирозина и коллагена. Также для этих тканей было исследовано развитие флуоресценции на длине волны максимума (например 330 нм для мышцы, 310 нм для кости) в зависимости от числа импульсов лазерного излучения (рис. 7). Видно, что интенсивность спадает с числом импульсов, причем при меньшей энергии импульса возбуждающего излучения она спадает медленнее. Это значит что изменения связаны именно с влиянием лазера, а не с естественным развитием флуоресценции во времени. В случае кости отличная от триптофановой скорость фотовыцветания также подтверждает тирозиновую природу полосы 300-350 нм. На основании экспериментальной зависимости (рис. 8) было определено сечение инактивации триптофана: см2 и доза, равная приблизительно 200 мДж/см , которая не вызывает значительных ( -10%) изменений спектра и может быть использована для диагностики.

Представлены результаты ЛИФ измерений, сделанных с помощью многоканальной системы регистрации спектров. Показано, что за счет усреднения по строкам изображения она обладает гораздо меньшим уровнем шума, чем сканирующая, и меньшим влиянием на ткань за счет сокращения количества импульсов лазерного облучения.

Измерена средняя глубина проникновения лазерного излучения в ткань миокарда. Для Я.= 248 нм она составляет 39±2 мкм, Х= 337 нм глубина проникновения составляет 173±2 мкм. На основании полученных результатов и литературных данных оценен вклад реабсорбции в спектр

ЛИФ: для X = 337 нм он существенен, для X = 248 нм им можно пренебречь.

В четвертой главе приведены результаты исследований минерализованных тканей сердца. На рис. 9 представлены нормированные на максимум спектры здоровой и минерализованных тканей. Приведены спектры, характерные для двух типов кальзиноза: кристаллического (на поверхности клапана образуются отдельные кристаллы) и протекающего по типу пропитывания (кристаллы пропитывают ткань клапана). В области 400-600 нм спектры минерализованных тканей значительно отличаются от спектров здоровых. При кальцификации отношение интенсивности ЛИФ на длине волны 450 нм к интенсивности на длине волны 330 нм увеличивается в три раза. Для определения причин подобных изменений резецированные кристаллы были отожжены при температурах 500°С и 700°С (в ОИГГиМ СО РАН). При 700°С вся органика испаряется и остается только минеральный компонент. Результаты измерений спектров ЛИФ кристаллов до и после термической обработки приведены на рис. 10. Видно, что гидроксилапатит флуоресцирует в области, имеющей различия в спектрах здоровых и больных тканей. Таким образом, отличие спектров обусловлено присутствием в пораженной кальцинозом ткани нового флуоресцирующего компонента - гидроксилапатита. Стоит подчеркнуть, что именно использование коротковолнового источника для возбуждения ЛИФ позволило впервые наблюдать подобные изменения спектров. При использовании источников с большей длиной волны (больше 300 нм в работах других авторов) гидроксилапатит не флуоресцирует. При использовании КгБ лазера, достаточно большая величина изменения спектра, характеризуемого отношением интенсивности ЛИФ на Х=330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценции на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца.

Глава пять посвящена ЛИФ биологических тканей различного уровня жизнеспособности. Исследования аорты и миокарда различных животных - наиболее интересных с точки зрения трансплантологии тканей, показали, что ткань аорты сильно неоднородна, и спектры ЛИФ могут значительно отличаться от образца к образцу. Поэтому возможные изменения спектра при потере жизнеспособности не заметны на фоне изначальной неоднородности, а для детальных исследований наиболее перспективной представляется ткань миокарда. Ее спектры ЛИФ достаточно повторяемы, изменения в процессе хранения прослеживаются четче всего.

На рис. 11 представлены спектры ЛИФ миокарда свиньи с различным уровнем жизнеспособности - в процессе хранения ткани в физиологическом растворе при различных температурах. Возбуждение ЛИФ проводилось эксимерным лазером с = 248 нм и азотным с = 337 нм. В обоих случаях наблюдались спектральные изменения ЛИФ в процессе

хранения. При возбуждении ЛИФ лазером с X = 248 нм имело место изменение интенсивности флуоресценции в полосе 450 нм по сравнению с основным пиком на 330 нм (рис. 11). На рис.12 показана зависимость от времени средней интенсивности данной полосы. Дисперсионный анализ показал, что с высокой достоверностью 7.62, р<0.001) фактор времени влияет на интенсивность ЛИФ полосы 420-500 нм. Из графика видно, что уже в течение первого часа под воздействием необратимых процессов в ткани происходит резкое изменение относительной интенсивности ЛИФ этой полосы. Впоследствии интенсивность приблизительно сохраняется.

Результаты ЛИФ измерений сравнили с данными исследований, проведенных традиционными гистохимическими методами (в НИИПК МЗ РФ), с использованием зондов на флуоресцентных красителях. Так, рис. 13 демонстрирует динамику уровня ионов кальция, редокс потенциала и фрагментации ДНК тканей в процессе хранения. Видно, что характерные гистохимические изменения по времени близки к изменениям спектров ЛИФ. При этом стоит отметить, что для проведения ЛИФ измерения достаточно несколько десятков секунд, а гистологические методы состоят из множества процедур, которые требуют для выполнения больше суток.

На фоне мощного триптофанового пика наблюдение упомянутой полосы 450 нм затруднено, поэтому целесообразно было исследовать флуоресценцию в данной области, вызванную излучением, не возбуждающим триптофан, то есть с длиной волны больше 310 нм. При возбуждении ЛИФ лазером с Я, = 337 нм изменялась абсолютная интенсивность пика с максимумом в районе 470 нм (рис. 14). Причем характер этих изменений зависел от температуры хранения ткани (рис. 15). Таким образом, пик с максимумом в области 470 нм, по-видимому, напрямую связан с жизнеспособностью ткани.

В заключении перечислены основные полученные результаты.

Сформулированы выводы:

1.Под воздействием УФ излучения эксимерного лазера с X =248 нм, у широкого набора биологических веществ наблюдается флуоресценция. Спектры ЛИФ различны и зависят от природы веществ, что может послужить основой для их идентификации. Определены основные флуо-рофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения. Приведенные данные доказывают перспективность применения ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для идентификации состава биологических тканей, регистрации их состояния и наличия изменений.

2. Под воздействием лазерного излучения длины волны 248нм в биологических тканях постепенно происходят необратимые изменения: ослабляется полоса ЛИФ триптофана. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана <Т = 3,2x10~1У см2. Определена полная доза = 200 мДж/см2 облучения эксимерным лазером на длине

волны 248 нм, превышение которой приводит к заметному (около 10%) изменению спектра ЛИФ. При дозе, меньшей критической Q^r, ЛИФ может быть эффективно использована для диагностики состояния и патологических изменений в биологических тканях.

3. Спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцино-зом, и макроскопических кальцинозных образований, добытых из резецированных клапанов сердца, отличаются от спектров здоровых тканей. Спектр ЛИФ кальцинированной ткани определяется флуоресцен-ций триптофана, коллагена, эластина и минерального компонента (гид-роксилапатита). Изменение спектра ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, обусловлено появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксилапатита. Достаточно большая величина изменения спектра, характеризуемого отношением интенсивности ЛИФ на длинах волн 330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценции на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца.

4. Снижение жизнеспособности различных тканей сердечно-сосудистой системы, обусловленной сроками и условиями хранения, приводят к перестройке их спектров ЛИФ. Наиболее достоверно эта перестройка обнаруживается у ткани миокарда - в процессе хранения миокарда свиньи в физиологическом растворе при различных температурах его спектры ЛИФ, возбуждаемые эксимерным лазером с X = 248 нм и азотным с X = 337 нм, претерпевают изменения. В обоих случаях спектральные изменения ЛИФ зависят от температуры хранения ткани и коррелируют с данными гистологических методов, что позволяет связывать их с жизнеспособностью. Этот феномен может использоваться для малоинвазивного быстрого контроля жизнеспособности трансплантатов непосредственно перед операцией, а также в ее процессе.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Malov A.N., Maslov N.A., Orishich A.M. LIF excited by excimer KrF and XeCl lasers for the study of biological tissues // Inern. Conf. on the Methods ofAerophys. Research: Proc. Pt 3. Novosibirsk, 1996. P. 201-205.

2. Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслоа НА, Оришич A.M., Титов А.Т., Щукин B.C. Влияние минерального компонента на спектр лазерно-индуцированной флуоресценции биотканей, пораженных кальцино-зом //Жури, прикл. спектроскопии. 1999. Т. 66,№ 6. С. 846-849.

3. Larionov P.M., Malov A.N., Maslov NA, Orishich, A.M., Titov, A.T., and Shchukin, V.S. Influence of mineral components on laser-induced fluorescence spectra of calcified human heart-valve tissues // Applied Optics. 2000. Vol. 39, No 22. P. 4031-4036.

4. Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов Н.А., Оришич А.М. Применение

метода ЛИФ для исследования влияния УФ-излучения на биологические ткани // Оптика атмосферы и океана. 2000. Т. 13, № 3. С. 305-308.

5. Патент № 2181486. Способ определения жизнеспособности тканей сердца / Литасова Е.Е., Караськов A.M., Ларионов П.М., Горбатых Ю.Н., Чащин О.В., Малов А.Н., Оришич А.М., Щукин B.C., Касаткин А.С., Бакарев А.Е., Горшенина К.А., Маслов Н.А. // Изобретения, полезные модели. 2002. № 11. С. 342.

6. Kushnir A.V., Larionov P.M., Litasova E.E., Malov A.N., Mandrik M.M., Maslov N.A., Orishich A.M., Vasilieva M.B. The study of heart tissue viability using fluorescent probes and native laser-induced fluorescence // Proceedings of SPIE. 2002. Vol. 4900. P. 1039-1044.

7. Ларионов П.М., Литасова Е.Е., Малов А.Н., Мандрик М.М., Маслов

НА, Оришич А.М, Седюк ЮА Исследование жизнеспособности тканей сердца методами лазерно-индуцированной флуоресценции и флуоресцентных зондов // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2002. №2. С. 61-66.

8. Ларионов П.М., Малов А.Н., Мандрик М.М:,Маслов Н.А., Оришич A.M. Исследование изменения спектра лазерно-индуцированной флуоресценции ткани миокарда по мере снижения ее жизнеспособности // Журн. прикл. спектроскопии. 2003. Т. 70, № 1. С. 38-42.

9. Фомин В.М., Караськов А.М., Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов Н.А., Оришич A.M. Определение жизнеспособности миокарда по его спектру лазерно-индуцированной флуоресценции // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 391. С. 296-298.

Ю.Оришич А.М, Колокольцева Т.Д., Кушнир А.В., Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов НА, Маслова Л.Н., Титов А.Т. Разработка методов диагностики биологических объектов с использованием ЛИФ, возбуждаемой импульсными УФ лазерами // Прогресс в биотехнологии и нейро-биологии - интегративная медицина: Труды Международного междисциплинарного семинара. М., 2004. С. 119-121.

П.Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов Н.А., Оришич А.М, Титов А.Т Диагностика минерализации биотканей методом ЛИФ, возбуждаемой излучением импульсного УФ-лазера // Там же. С. 100-102.

11

Рис.1. Схема сканирующей системы измерения спектров. - лазер, 2 - диафрагма, 3 - фильтр, 4 - линза, 5 - полупрозрачное

зеркало, 6 - зеркало, 7 - образец, 8 - зеркало, 9,10 - линзы, монохроматор, 12 - ФЭУ, 13 - ФЭК, 14 - интегрирующие емкости, 15 - АЦП (КАМАК), 16 - компьютер.

Рис.2. Схема многоканальной системы регистрации спектров. 1 - лазер, 2 - диафрагма, 3 - фильтр, 4 - линза, 5 - полупрозрачное зеркало, 6 - зеркало, 7 - образец, 8 - собирающее зеркало, 9 - спектрометр, 10 - ФЭК, 11 - компьютер.

1

Рис.3. Вещества первого класса. Длина волны возбуждения 248нм.

Длина волны, нм

Рис.5. Вещества третьего класса. Длина волны возбуждения 248нм.

Длина юлны, нм

Рис.4. Вещества второго класса. Длина волны возбуждения 248нм.

и • i

0.1 •■

Ь6 li,..

0.2

О -230

Длина аолны. км

Рис.6. Длина волны возбуждения 308нм.

Рис.7. Спектры ЛИФ до и после 2000 импульсов лазерного излучения.

Рис.8. Интенсивность ЛИФ на длине волны 330нм в зависимости от номера импульса лазерного излучения.

Рис.9. Спектры ЛИФ здорового клапана кристаллического кальциноза и ткани с пропитывающим кальцинозом (монолитного с пропитывающей его тканью).

Рис.10. Спектры ЛИФ кристаллического кальциноза после термической обработки.

Рис.11. Спектр ЛИФ миокарда после хранения в течение 30 мин, 2,5 и 48 ч. (б - увеличенный фрагмент области 400-600 нм)

Рис.12. Интенсивность ЛИФ миокарда в полосе 450 нм (указана ошибка среднего).

Рис.13. Интенсивности флуоресценции различных флуоресцентных зондов (указана ошибка среднего).

Рис. 14. Спектры ЛИФ миокарда при возбуждении излучением с = 337нм после хранения в течение 30 мин и 6 ч.

Рис. 15. Интенсивность ЛИФ миокарда в полосе 470 нм при возбуждении излучением с = 337нм в зависимости от времени хранения образца.

р 10 8 2 О

Ответственный за выпуск Н.А. Маслов

Подписано в печать 12 05 2004 Формат бумаги 60 х 84/16, Усл. печ. л. 1.0, Уч.-изд. л. 1.0, Тираж 100 экз., Заказ №5

Отпечатано на ризографе ЗАО "ИНТЕРТЕК" 630090, Новосибирск, Институтская, 4/1

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Флуоресцентная диагностика (физические принципы).

1.2. Основные хромофоры.

7.2.7. Триптофан.

1.2.2. Тирозин.

1.2.3. Фенилаланин.

1.2.4. Вклад различных аминокислот в флуоресценцию белка.

1.2.5. Коллаген и эластин.

1.2.6. Пиридоксин и липопигменты.

1.2.7. NADH и FAD.

1.3. Влияние оптических свойств ткани на спектры ЛИФ.

1.3.1. Поглощение.

1.3.2. Рассеяние.

1.4. Фотовыцветание.

1.5. Применение ЛИФ для идентификации состояния различных биологических тканей. Известные спектры ЛИФ.

1.5. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1. Измерение спектров путем сканирования.

2.2. Многоканальная система регистрации спектров.

2.3. Измерение глубины проникновения лазерного излучения в образцы биотканей.

2.4. Исследование жизнеспособности миокарда с помощью ф флуоресцентных красителей.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИФ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩСТВ И ТКАНЕЙ ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ ЛАЗЕРАМИ С ДЛИНАМИ ВОЛН 248,308 И 337 НМ.

3.1. ЛИФ биологических тканей и веществ. ф 3.2. Влияние лазерного излучения на исследуемое вещество.

3.3. Измерение спектров ЛИФ с помощью многоканальной системы регистрации. Влияние лазерного излучения.

3.4. Исследование глубины проникновения лазерного излучения в ткань миокарда.

3.5. Обсуждение.

ГЛАВА 4. ЛИФ КАЛЬЦИНИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ СЕРДЦА.

4.1. Исследуемые образцы.

4.2 Экспериментальные результаты.

4.3 Обсуждение.

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ЛИФ.

5.1. Исследуемые образцы.

5.2. Сравнение различных методик постановки экспериментов по определению жизнеспособности биологических тканей с помощью ЛИФ.

5.2.1. Исследования спектров ЛИФ тканей различной жизнеспособности с помощью сканирующей системы.:.

5.2.2 Исследования спектров ЛИФ тканей различной жизнеспособности с помощью многоканальной системы.

5.2.3. Ткани кролика.

5.2.4. Ткани свиньи.

5.2.5. Обсуждение.

5.3. Исследование ЛИФ ткани миокарда по мере снижения ее жизнеспособности.

5.3.1. Возбуждение эксимерным KrF лазером Х-248 нм.

5.3.2. Контроль жизнеспособности с помощью флуоресцентных зондов.

• 5.3.3. Возбуждение азотным лазером \-337 нм.

5.3.4. Обсуждение.

Развитие фундаментальных исследований в области создания лазерных источников, изучение их влияния на биологические объекты открывает новые широкие перспективы использования лазеров в биологии, в экспериментальной и практической медицине. Лазерные технологии уже нашли свое применение в клинической практике. Они используются в хирургии для проведения ангиопластики [3, 45, 55, 56, 60, 64 73], хирургического лечения аритмии [73], операций на суставах [34]. Общеизвестно применение лазерных технологий в офтальмологии [52]. Опыт работы исследователей в последние годы показал, что лазер может быть использован для терапевтического лечения сложных заболеваний, таких как ревматоидный артрит [7, 31], и в онкологии [9, 29, 61]. Лазерные методы диагностики перспективны для определения наличия степени склероза и кальциноза сосудов [8, 17, 22], диагностики новообразований в желудочно-кишечном тракте [74] и дыхательных путях [87].

Метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) широко используется в медико-биологических исследованиях. В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминесцировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения [90, 92, 93, 104, 105]. Люминесцентный метод исследования белков позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики и др. [92]. Лазерно-индуцированная флуоресценция может быть использована в диагностике большого числа заболеваний. [104, 105]. Использование в качестве источника возбуждения ультрафиолетового излучения позволяет изучать люминесценцию в широком спектральном интервале, наблюдать перестройку спектров ЛИФ при развитии патологических изменений. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком [16, 21, 28, 33, 40, 48, 50, 62, 66, 81, 83, 89], отличать нормальную аорту от больной атеросклерозом [3, 8, 15, 17, 18, 19, 23, 24,45,47, 55, 56, 59, 60, 64]. В большинстве работ для возбуждения ЛИФ использовались лазеры с длиной волны больше 280 нм. Флуоресценция, индуцированная излучением с меньшей длиной волны, изучена мало, хотя использование коротковолновых источников света потенциально позволяет наблюдать флуоресценцию от большего числа компонентов. Например в работе [97] была продемонстрирована возможность использования ЛИФ возбуждаемой Д»=248нм для идентификации тканей клапанов сердца, пораженных кальцинозом.

Источником излучения, возбуждающего люминесценцию, могут быть эксимерные лазеры. Применение метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой излучением эксимерных лазеров, для исследования биологических тканей началось в конце 80-х годов, что соответствует этапу клинического внедрения этих систем в кардиологическую и офтальмологическую практику. Основное направление применения ЛИФ связано с созданием контролирующих систем, которые во время операции по лазерной абляции тканей с высокой плотностью энергии должны дифференцировать по спектрам ЛИФ патологически измененные и здоровые структуры и предотвращать повреждение тканей, не являющихся предметом оперативного вмешательства [45, 55, 56, 60, 64, 73]. В ряде исследований показано, что ЛИФ может вызываться при световом воздействии на ткани с невысокой плотностью энергии, что практически не вызывает какого-либо существенного повреждения тканей [36].

Одним из достоинств лазерных методов диагностики является их скорость. Возможность проводить экспресс-диагностику особенно актуальна в трансплантологии. Важным фактором, влияющим на успех трансплантации, является оценка жизнеспособности донорских тканей или органов, используемых для пересадки. Исходное неудовлетворительное состояние тканей донорского сердца является причиной 15-20% смертей при выполнении операции трансплантации [32]. Кроме того, в мире ежедневно проводится около 100 кардиохирургических операций с использованием криосохраненных сердечных структур (аллографтов), банки хранения которых постоянно увеличиваются. Это обусловлено, прежде всего, ^ расширением показаний для их использования при лечении больных с пороками сердца и сосудов. Указанная тенденция требует проведения контроля жизнеспособности сохраненных и восстановленных тканей перед операцией. К сожалению, системы оценки качества аллографтов до настоящего времени нет. Сегодня для оценки жизнеспособности графта в эксперименте используется биопсия и исследование образца различными гистологическими и гистохимическими методами. Так с помощью флуоресцентных зондов проводится оценка редокс потенциала, уровня свободных радикалов в клетках, уровня АТФ, фрагментации ДНК, свидетельствующей о гибели клеток. Однако все перечисленные методы инвазивны для * графта и их проведение требует множества дополнительных и часто длительных процедур, что делает эти методы малопривлекательными для реальной практики. В связи с этим разработка новых методов объективной оценки состояния донорских тканей является актуальной и необходимой.

Кроме качества аллографта, не меньшее значение имеет и состояние тканей реципиента. Известно, что многие патологические процессы в сердце различного генеза, сочетаются с минерализацией (кальцинозом) тканей, что особенно актуально для больных пороками сердца. Проведение любых хирургических манипуляций на клапанном аппарате сердца, пораженного кальцинозом, может сопровождаться фрагментированием тканей, что, в свою очередь, является предпосылкой такого грозного послеоперационного осложнения, как материальная эмболия. Процесс минерализации клапанов сердца является лимитирующим фактором пластической кардиохирургии. Именно степень минерализации клапанного эндокарда и параклапанных структур во многом определяет прогноз для лечения и жизни пациентов. Поэтому быстрая и своевременная интраоперационная диагностика фрагментов кальцинированных тканей в полости сердца может способствовать профилактике этого осложнения.

В свете изложенного, перспективным представляется разработка метода быстрой и точной диагностики состояния тканей сердца с использованием методов, основанных на применении лазерного излучения.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы диссертации.

Диагностика наличия патологий и жизнеспособности тканей сердца, используемых для пересадки, является очень актуальной проблемой в трансплантологии. К сожалению, в настоящее время нет системы оценки качества трансплантатов. Использование ЛИФ может быть перспективным для разработки методов, которые позволят быстро и надежно определять состояние множества типов биологических тканей, однако для решения данной проблемы в кардиологии он практически не применялся.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было исследование возможностей лазерной флуоресцентной спектроскопии для определения состояния щ тканей сердца. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследование спектров флуоресценции аминокислот, составляющих животные белки, различных биологических субстанций и здоровых тканей (аорты, клапанов сердца, и.т.д.) при возбуждении ультрафиолетовым излучением эксимерного лазера с А.=248 нм, определение характеристических спектральных полос этих веществ и тканей для данной длины волны возбуждения.

2. Исследование влияния лазерного облучения Л=248 нм на биологические ткани по динамике изменения их спектров ЛИФ в зависимости от дозы облучения. Определение параметров лазерного излучения, не повреждающего клетки и ткани, но позволяющего судить об их состоянии.

3. Исследование ЛИФ здоровых и кальцинированных тканей сердца человека для определения потенциала метода применительно к диагностике степени минерализации тканей, а также для выяснения вклада органических и минеральных компонент в спектр.

4. Исследование зависимости спектральных характеристик тканей сердца от степени их жизнеспособности, обусловленной сроками и условиями хранения. Сравнение результатов, полученных методом ЛИФ с данными рутинной клинической гистологии и гистохимии.

Научная новизна полученных результатов.

Были получены следующие новые научные результаты:

• Показано, что под воздействием УФ излучения с длиной волны меньше 280 нм, а именно излучения эксимерного лазера с ?1=248 нм, у широкого набора биологических веществ наблюдается флуоресценция. Причем спектры флуоресценции специфичны для каждого вида тканей и веществ. Определены основные флуорофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения. Приведенные данные доказывают перспективность применения ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для идентификации состава биологических тканей, регистрации их состояния и наличия изменений.

• Показаны тканеспецифические изменения спектра ЛИФ под воздействием УФ излучения Х=248 нм, используемого для возбуждения ЛИФ. Исследована зависимость скорости происходящих изменений от энергии возбуждающего излучения. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана. Установлена доза, при которой изменения спектра ЛИФ, происходящие в ткани под воздействием лазерного излучения, не превышают разброса данных при измерении.

• Обнаружено, что спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцинозом, и макроскопических кальцинозных образований, добытых из резецированных клапанов сердца, отличаются от спектров здоровых тканей. Показано, что изменение спектра ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, обусловлено появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксилапатита.

• Обнаружено, что в процессе хранения миокарда свиньи в физиологическом растворе при различных температурах его спектры ЛИФ, возбуждаемые эксимерным лазером с Х= 248 нм и азотным с Х= 337 нм, претерпевают изменения. Скорость спектральных изменений ЛИФ зависит от температуры хранения ткани. Сравнение результатов ЛИФ измерений с данными гистологического анализа с использованием флуоресцентных красителей показало, что наблюдаемые изменения ЛИФ связаны с жизнеспособностью ткани.

Практическая значимость полученных результатов.

Достаточно большое отличие спектров минерализованного и нормального клапанов, характеризуемое отношением интенсивности ЛИФ на длинах волн 330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценций на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца. Изменение спектров ЛИФ в процессе хранения тканей может использоваться для малоинвазивного быстрого контроля жизнеспособности трансплантатов непосредственно перед операцией, а также в ее процессе.

На защиту выносятся:

• Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ различных биологических субстанций и тканей, показывающие перспективность применения лазера с А,=248 нм для определения их состояния.

• Результаты измерения и анализа влияния УФ излучения А,=248 нм на биологические ткани, показывающие малую инвазивность метода ЛИФ при определенных параметрах.

• Методика диагностики степени поражения клапана сердца кальцинозом, которая может быть использована при операциях на открытом сердце, например, при лазерной абляции кальцификатов. Преимуществами ЛИФ метода являются скорость и возможность использования в качестве обратной связи при пластической хирургии.

• Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ миокарда свиньи в процессе хранения. Обнаружено, что снижение жизнеспособности миокарда вызывает изменения его спектров ЛИФ, что может быть использовано для определения пригодности трансплантатов.

Достоверность результатов.

Полученные с использованием лазера с Х=248 нм спектры вписываются в общую картину формирования спектров ЛИФ наблюдаемую другими исследователями при использовании других длин волн возбуждающего излучения. Частные случаи спектров ЛИФ при возбуждении Х=337 нм, совпадающие по условиям измерений, совпадают с результатами других авторов.

Апробация работы.

Основные результаты докладывались на международных конференциях: по методам аэрофизических исследований ICMAR-96, атомным и молекулярным импульсным лазерам AMPL-99, лазерным технологиям LAT-2002, лазерной метрологии LM-2002, лазерной оптики L0-2003, биотехнологии Progress in the biotechnology and neurobiology - integrative medicine- 2004.

Публикации.

Основные результаты опубликованы в трудах международных конференций [42, 49, 100, 103], рецензируемых журналах [44, 94, 95, 96, 97, 98], патенте [101].

Личный вклад.

Работа выполнена в Институте теоретической и прикладной механики СО РАН в 1996-2003 гг. В процессе работы соискатель подготовил экспериментальные установки, написал соответствующее программное обеспечение для автоматизации, участвовал во всех экспериментах, лично обрабатывал результаты, участвовал в написании публикаций.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, пяти глав, выводов и списка литературы. Диссертация занимает 134 страницы, содержит 54 иллюстрации и список из 105 литературных источников.

Выводы

1. Под воздействием УФ излучения эксимерного лазера с Х=248 нм, у широкого набора биологических веществ наблюдается флуоресценция. Спектры ЛИФ различны и зависят от природы веществ, что может послужить основой для их идентификации. Определены основные флуорофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения. Приведенные данные доказывают перспективность применения ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для идентификации состава биологических тканей, регистрации их состояния и наличия изменений.

2. Под воздействием лазерного излучения длины волны 248нм в биологических тканях постепенно происходят необратимые изменения: ослабляется полоса ЛИФ триптофана. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана ст = 3,2х10"19 см2. Определена полная доза (2крит. = 200 мДж/см2 облучения эксимерным лазером на длине волны 248 нм, превышение которой приводит к заметному (около 10%) изменению спектра ЛИФ. При дозе, меньшей критической Окрит, ЛИФ может быть эффективно использована для диагностики состояния и патологических изменений в биологических тканях.

3. Спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцинозом, и макроскопических кальцинозных образований, добытых из резецированных клапанов сердца, отличаются от спектров здоровых тканей. Спектр ЛИФ кальцинированной ткани определяется флуоресценций триптофана, коллагена, эластина и минерального компонента (гидроксилапатита). Изменение спектра

ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, обусловлено появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксилапатита. Достаточно большая величина изменения спектра, характеризуемого отношением интенсивности ЛИФ на длинах волн 330 и 450 нм, открывает возможность использования измерения относительной интенсивности флуоресценций на этих длинах волн для контроля степени кальцинирования ткани сердца.

4. Снижение жизнеспособности различных тканей сердечнососудистой системы, обусловленной сроками и условиями хранения, приводят к перестройке их спектров ЛИФ. Наиболее достоверно эта перестройка обнаруживается у ткани миокарда - в процессе хранения миокарда свиньи в физиологическом растворе при различных температурах его спектры ЛИФ, возбуждаемые эксимерным лазером с Х= 248 нм и азотным с 337 нм, претерпевают изменения. В обоих случаях спектральные изменения ЛИФ зависят от температуры хранения ткани, что позволяет связывать их с жизнеспособностью. Этот феномен может использоваться для малоинвазивного быстрого контроля жизнеспособности трансплантатов непосредственно перед операцией, а также в ее процессе.

Заключение

Созданы две автоматизированные системы регистрации спектров лазерно-индуцированной флуоресценции. Изучены спектры ЛИФ множества образцов биологических тканей, при возбуждении УФ излучением с длиной волны меньше 280 нм - излучением эксимерного лазера с Л=248 нм. Определены основные флуорофоры, вносящие вклад в ЛИФ для данной длины волны возбуждающего излучения.

Обнаружены тканеспецифические изменения спектра ЛИФ под воздействием УФ излучения, используемого для возбуждения ЛИФ. Исследована зависимость скорости происходящих изменений от энергии возбуждающего излучения. Получена количественная информация о сечении инактивации триптофана.

Исследованы спектры ЛИФ тканей клапана сердца человека, пораженных кальцинозом, найдено их отличие от спектров здоровых тканей. Исследован вклад минерального компонента гидроксилапатита, в спектр флуоресценции пораженной ткани.

Исследованы спектры ЛИФ тканей различных животных в процессе хранения в физиологическом растворе при различных температурах. Обнаружено, что снижение жизнеспособности миокарда свиньи приводит к изменениям его спектра ЛИФ.

Данное исследование показало перспективность использования УФ лазера с Х=248 нм для диагностики состояния биологических тканей, в частности для определения степени минерализации клапанов сердца и жизнеспособности миокарда при трансплантации.

1. Alfano R.R., Das В.В., Cleary J., Prudente R., Celmer E.J. Light sheds light on cancer—distinguishing malignant tumors from benign tissues and tumors. // Bulletin of the New York Academy of Medicine, 1991, 67.2, P.143-150.

2. Baraga J.J. et al. Laser induced fluorescence spectroscopy of normal and atherosclerotic human aorta using 306-3lOnm exitation. // Lasers Surg. Med., 1990, 10, P.245.

3. Barberis G., Gamron S., Acevedo G., Cadile I., Juri H., Сатрапа V., Castel A., Onetti C.M., Palma J.A. In vitro synthesis of prostaglandin

4. E2 by synovial tissue after helium-neon laser radiation in rheumatoid arthritis. // J.Clin. Laser Med.Surg., 1996, Vol.14, P.175-177.

5. Campagnutta E., Parin A., Piero G.D., Giorda G., Gallo A., Scarabelli C. Treatment of vaginal intraaepithelial neoplasia (VAIN) with the carbon dioxide laser. // Clin. Exp. Obstet. Gynecol., 1999, Vol.26, P.127-130.

6. Chaudhry H.W., Richards-Kortum R., Kolubayev T., Kittrell C., Partovi

7. F., Kramer J.R., Feld M.S. Alteration of spectral characteristics of human artery wall caused by 476-nm laser irradiation. // Lasers Surg. Med., 1989, Vol. 9, P.572-580.

8. Cheong W.F., Prahl S.A., Welch A.J. A review of the optical properties of biological tissues. // IEEE Journal of Quantum Electronics, 1990, Vol.26, P.2166-2185.

9. Christov A., Dai E., Drangova M., Liu L., Abela G.S., Nash P., McFadden G., Lucas A. Optical detection of triggered atherosclerotic plaque disruption by fluorescence emission analysis. // Photochemistry and Photobiology, 2000, 72.2, P.242-252.

10. Christov A., Dai E., Liu L., Miller L.W., Nash P., Lalani A., McFadden

11. G., Nation P.N., Tulip J., and Lucas A. Detection of transplant vasculopathy in a rat aortic allograft model by fluorescence spectroscopic optical analysis. // Lasers in Surgery and Medicine, 1999, 24.5, 1999, P.346-359.

12. Clarke R.H., Isner J.M., Gauthier T., Nakagawa K., Cerio F., Hanlon E., Gaffney E., Rouse E., and DeJesus S. Spectroscopic characterization of cardiovascular tissue. Lasers in Surgery and Medicine, 1988, 8.1, P.45-59.

13. Cutruzzola F.W., Stetz M.L., O'Brien K.M., Gindi G.R., Laifer L.I., Garrand T.J., Deckelbaum L.I. Change in laser-induced arterial fluorescence during ablation of atherosclerotic plaque. Laser Surg. Med., 1989, Vol.9, p.109-116.

14. Deckelbaum, LI, Desai, SP, Kim, C, and Scott, JJ. Evaluation of a fluorescence feedback system for guidance of laser angioplasty. // Lasers in Surgery and Medicine, 1995,16.3, P.226-234.

15. Deckelbaum, LI, Stetz, ML, O'Brien, KM, Cutruzzola, FW, Gmitro, AF, Laifer, LI, and Gindi, GR. Fluorescence spectroscopy guidance of laser ablation of atherosclerotic plague. // Lasers in Surgery and Medicine, 1989, 9.3, P.205-214.

16. Gaffney E.J., Clarke R.H., Lucas A.R., Isner J.M. Correlation of fluorescence emission with plaque content and intimai thickness of athrosclerotic coronary arteries. // Lasers Surg. Med., 1989, Vol.9, P.215-228.

17. Garrand T.J., Stetz M.L., O'Brien K.M., Gindi G.R., Laifer L.I., Deckelbaum L.I. Characterization of the site dependency of normal canine arterial fluorescence. // Lasers in Surgery and Medicine, 1990, 10.4, P.375-383.

18. Geschwind H.J., Aptecar E., Boussignac G., Dubois-Rande J.L., Zelinsky R., Poirot G., and Tomaru T. Results and follow-up after percutaneous pulsed laser-assisted balloon angioplasty guided by spectroscopy. // Circulation, 1991, 83.3, P.787-796.

19. Ghadially, F.N. Red fluorescence of experimentally induced and human tumors. // Journal of pathology and bacteriology, 1960, 80, P.345-361.

20. Ghadially F.N., Neish W.J.P., Dawkins H.C. Mechanisms involved in the production of red fluorescence of human and experimental tumors. // Journal of pathology and bacteriology, 1963, 85, P.77-92.

21. Gott J. P., Pan-Chih, L. M. Dorsey, J. L. Jay, G. K. Jett, F. J. Schoen, J. M. Girardot, R. A. Guyton , Calcification of porcine valves: a successful new method of antimineralization, Ann. Thorac. Surg. 53(2), 207-215 (1992).

22. Hainz H., Hainz J., Nguena N., Frohnert O. Prostate laser operation -the cheapest therapy? 872 cases. // Acta urol. Belg., 1998, Vol.66, P.3-5.

23. Harris DM, Werkhaven J. Endogenous porphyrin fluorescence in tumors. // Lasers in Surgery and Medicine, 1987, 7.6, P.467-472.

24. Hendrich C., Huttmann G., Lehnert C., Diddens H., Siebert W.E. potodynamic therapy for rheumatoid arthritis. Cell culture studies and animal experiments. // Knee Surg. Sports traumatol Arthrose., 1997, Vol.5, P.58-63.

25. Hyde J. A. J., S J. Rooney, M.P.I. Pitt, I.C. Wilson, Howie A. J., Bonser R.S. Immunohistochemical identification of complement membraneattack complex and subclinical iscemia in donor hearts. // 12^ Annual Meetting of the EACTS (1998).

26. Hung J., Lam S., LeRiche J.C., Palcic B. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue. // Lasers in Surgery and Medicine, 1991, 11.2, P.99-105.

27. Jahn R., Dressel M., Neu W., Jungbluth K.H. Ablation of hard biological tissue with the excimer laser. // Unfallchirurgie, 1992, Vol.18, P.261-265.

28. Kapadia C.R., Cutruzzola F.W., O'Brien K.M., Stetz M.L., Enriquez R., Deckelbaum L.I. // Laser-induced fluorescence spectroscopy of human colonic mucosa. Detection of adenomatous transformation. Gastroenterology, 1990, 99.1, P. 150-157.

29. Kochevar I.E. Cytotoxicity and mutagenicity of excimer laser radiationn. //Lasers Surg. Med., 1989, Vol.9, P.440-445.

30. Koenig F., McGovern F.J., Althausen A.F., Deutsch T.F., Schomacker K.T. Laser induced autofluorescence diagnosis of bladder cancer see comments. //Journal of Urology, 1996,156.5, P.1597-1601.

31. Koenig F., Larne R., Enquist H., McGovern F.J., Schomacker K.T., Kollias N., Deutsch T.F. Spectroscopic measurement of diffuse reflectance for enhanced detection of bladder carcinoma. // Urology, 1998,51.2, P.342-345.

32. Kolli V.R., Savage H.E., Yao T.J., Schantz S.P. Native cellular fluorescence of neoplastic upper aerodigestive mucosa. // Archives of Otolaryngology Head and Neck Surgery, 1995, 121.11, P.1287-1292.

33. Kroemer G., Dallaporta B., Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. // Ann. Rev. Physiol., 1998, 60, P.619-642.

34. Laifer, LI, O'Brien, KM, Stetz, ML, Gindi, GR, Garrand, TJ, and Deckelbaum, LI. Biochemical basis for the difference between normal and atherosclerotic arterial fluorescence. // Circulation, 1989, 80.6, P.1893-1901.

35. Larionov P.M., Malov A.N., Maslov N.A., Orishich, A.M., Titov, A.T., and Shchukin, V.S. Influence of mineral components on laser-inducedfluorescence spectra of calcified human heart-valve tissues. Applied Optics, Vol. 39, No 22, 2000, 4031-4036.

36. Laufer G, Wollenek G., Hohla K. et al. Eximer alaser-indused simultaneous ablation and spectral identification of normal and atherosclerotic arterial tissue lauers. // Circulation, 1988, Vol. 78, P. 1031-1039.

37. Mahadevan A., Mitchell M.F., Silva E., Thomsen S., Richards-Kortum R.R. Study of the fluorescence properties of normal and neoplastic human cervical tissue. // Lasers in Surgery and Medicine, 1993, 13.6, P.647-655.

38. Malov A.N., Maslov N.A., Orishich A.M. LÖ7 excited by excimer KrF and XeCl lasers for the study of biological tissues. ICMAR-96, Proceedings Part 3, 1996, c.201-205.

39. Marshall J. et al. Photoablative reprofiling of the cornea using an excimer laser photorefractive keratotomy. // Lasers Ophthalmol., 1986, 1, c.21.

40. Mayevsky A., et al. Real time monitoring of intraoperative allograft vitality. //Transplantation Proceedings, 2000, Vol.32, P.684-685.

41. Morgan D.C., et al. New method for detection of "heart allograft rejection: validation of sensitivity and reliability in a rat heterotopic allograft model. // Circulation, 1999, Vol.100, P.1236-1241.

42. Morguet A. J., B. Korber, H. Hippler, V. Wiegand, H. Kreuzer, Autofluorescence spectroscopy using a XeCl excimer laser system for simultaneous plaque ablation and fluorescence excitation. Lasers Surg. Med. 14, 238-248 (1994).

43. Panjehpour M., Overholt B.F., Schmidhammer J.L., Farris C., Buckley P.F., Vo-Dinh T. Spectroscopic diagnosis of esophageal cancer: new classification model, improved measurement system. // Gastrointestinal Endoscopy, 1995, 41.2, P.577-581.

44. Panou-Diamandi O., Uzunoglu N.K., Zacharakis G., Filippidis G., Papazoglou T., Koutsouris D. A one layer tissue fluorescence model based on electromagnetic theory. // Journal of Electromagnetic Waves and Applications, 1998, Vol.12, P.1101-1121.

45. Papazoglou, T.G., Papaioannou, T., Arakawa, K., Fishbein, M., Marmarelis, V.Z., and Grundgest, W.S. Control of excimer laser aided tissue ablation via laser-induced fluorescence monitoring. // Applied Optics, 1990, 29.33, P.4950-4955.

46. Perk M., Flynn G.J., Smith C., Bathgate B., Tulip J., Yue W., and Lucas A. Laser-induced fluorescence emission: I. The spectroscopic identification of fibrotic endocardium and myocardium. // Lasers in Surgery and Medicine, 1991,11.6, P.523-534.

47. Richards-Kortum R. et al. A model for extraction of diagnostic information from laser induced fluorescence spectra of human artery wall. // Spectrochim. Acta, 1989, Vol.45 A, P.87.

48. Richards-Kortum R., Mehta A., Hayes G., Cothren R., Kolubayev T., Kittrell C., Ratliff N.B., Kramer J.R., Feld M.S. Spectral diagnosis of atherosclerosis using an optical fiber laser catheter. // American Heart Journal, 1989, 118.2, P.381-391.

49. Richards-Kortum R., Rava R.P., Fitzmaurice M., Kramer J.R., Feld M.S. 476 nm excited laser-induced fluorescence spectroscopy of human coronary arteries: applications in cardiology. // American Heart Journal, 1991, 122.4 Pt 1, P.1141-1150.

50. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. // Ann. Rev. Phys. Chem., 1996, Vol.47, P. 555-606.

51. Sartori M., Weilbaecher D., Valderrama G.L., Kubodera S., Chin R.C., Berry M.J., Tittel F.K., Sauerbrey R., Henry P.D. Laser-induced autofluorescence of human arteries. // Circulation Research, 1988, 63.6, P.1053-1059.

52. Schaldach M. Cardiovascular laser application- // Artif. Organs, 1990, Vol.14, P.28-40.

53. Schomcker K.T., Frisoli J.K., Compton C.C., Flotte T.J., Richter J.M., Nishioka N.S., Deutsch T.F. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonic tissue: basic biology and diagnostic potential. // Laser Surg. Med., 1992, Vol.12, P.63-78.

54. Setlow R., Doyle B. The action of monochromatic ultaviolet light on proteins. // Biochim. Biophys. Acta., 1957, 24, P.27-41.

55. Steenbergen С., E. Murphy J.A. Watts R.E. Correlation between cytosolic free calcium, contracture, ATP, and irreversible ishemic injury in perfuseg rat heart. // Circ. Res., 1990, 66, P.135-146.

56. Strebel R.T., Utzinger U., Peltola M., Schneider J., Niederer P.F., and Hess O.M. Excimer laser spectroscopy: Influence of tissue ablation on vessel wall fluorescence. // Journal of Laser Applications, 1998, 10.1, P.34-40.

57. Tani M., Nelly J.R. Role of intracellular Na+ in Ca2+ overload and depressed recovery of ventricular function of reperfused ishemic rat heart. Possible involvement of H+-Na+ and Na+-Ca2+ excnange. // Circ. Res., 1989, 65, P.1045-1056.

58. Tang G.C., Pradhan A., Alfano R.R. Spectroscopic differences between human cancer and normal lung and breast tissues. // Lasers in Surgery and Medicine, 1989,9.3, P.290-295.

59. Tang G.C., Pradhan A., Wenling Sha, Chen J., Liu C.H., Wahl S.J., Alfano R.R. Pulsed and CW laser fluorescence spectra from cancerous, normal, and chemically treated normal human breast and lung tissues. // Applied Optics, 1989, 28.12, P.2337-2342.

60. Vo-Dinh Т., Panjehpour M., Overholt B.F., Farris C., Buckley F.P. 3rd, Sneed R. In vivo cancer diagnosis of the esophagus using differentialnormalized fluorescence (DNF) indices. // Lasers in Surgery and Medicine, 1995, 16.1, P.41-47.

61. Wagnieres G.A., Star W.M., Wilson B.C. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications // Photochem. and Photobiol., 1998, Vol.68, P.603-632.

62. Walsh G.L. Lasers for the early detection of lung cancer. // Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery, 1993, 5.3, P. 194-200.

63. Welch A.J., Gardner C., Richards-Kortum R., Chan E., Criswell G., Pfefer J., Warren S. Propagation of fluorescent light. // Lasers Surg. Med., 1997, Vol.21, P.166-178.

64. Wang C.Y., Chiang H.K., Chen C.T., Chiang C.P., Kuo Y.S., Chow S.N. Diagnosis of oral cancer by light-induced autofluorescence spectroscopy using double excitation wavelengths. // Oral Oncology, 1999, 35.2, P.144-150.

65. Yan W.D., Perk M., Chagpar A., Wen Y., Stratoff S., Schneider W.J., Jugdutt B.I., Tulip J., and Lucas A. Laser-induced fluorescence: III. Quantitative analysis of atherosclerotic plaque content. // Lasers in Surgery and Medicine, 1995, 16.2, P.164-178.

66. Zagdi M., Smid L., Fajdiga I., Bubnic B., Lenarcic J., Oblak P. Laser induced fluorescence in diagnostics of laringeal cancer. // Acta Otolaryngoll Suppl. (Stokh)., 1997, Vol.527, P.125-127.

67. Zeng H., MacAulay C., McLean D.I., Palcic B., Lui H. The dynamics of laser-induced changes in human skin autofluorescence—experimental measurements and theoretical modeling. // Photochemistry and Photobiology, 1998, Vol.68, P.227-236.

68. Zonios G., Cothren R., Crawford J.M., Fitzmaurice M., Manoharan R., Van Dam J., Feld M.S. Spectral pathology. // Annals of the New York Academy of Sciences, 1998, 838, P. 108-115.

69. Бурштейн Э.И. Люминесценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники. Сер. Молекулярная биология, ТЗ, М.:ВИНИТИ, 1973, с.126.

70. Гиллет Дж. Фотофизика и фотохимия полимеров. М.: Мир, 1988.

71. Демченко П. Люминесценция и динамическая структура белков, Киев (1988)

72. Конев C.B., И.Д. Волотовский. Введение в молекулярную фотобиологию, Минск (1971).

73. Ларионов П.М., Малов A.H., Мандрик М.М.,Маслов H.A., Оришич A.M. Исследование изменения спектра лазерно-индуцированной флуоресценции ткани миокарда по мере снижения ее жизнеспособности. // Журнал Прикладной Спектроскопии, Т.70, №1, 2003.

74. Фомин В.М., Караськов A.M., Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов H.A., Оришич A.M. Определение жизнеспособности миокарда по его спектру лазерно-индуцированной флуоресценции. // Доклады Академии Наук, 2003, Т.391, с.296-298.

75. Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов H.A., Оришич A.M. Применение метода ЛИФ для исследования влияния УФ-излучения на биологические ткани. // Оптика Атмосферы и Океана, №, 2000, с.305-308.

76. Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов H.A., Оришич A.M., Титов А.Т., Щукин B.C. Влияние минерального компонента на спектрлазерно-индуцированной флуоресценции биотканей, пораженных кальцинозом. // Журнал Прикладной Спектроскопии, Т.66, №, 1999, с.846-849.

77. Ларионов П.М., Малов А.Н., Оришич A.M., Щукин B.C. Лазерно-индуцированная флуоресценция сердечных тканей при поражении кальцинозом. // Журнал Прикладной Спектроскопии, 1997, Т.64, с.539-544.

78. Литасова E.E., Караськов A.M., Ларионов П.М., Горбатых Ю.Н., Чащин О.В., Малов А.Н., Оришич A.M., Щукин B.C., Касаткин

79. A.C., Бакарев А.Е., Горшенина К.А., Маслов H.A. Способ определения жизнеспособности тканей сердца. // Патент на изобретение № 2181486 (20.04.2002). Приоритет от 02.12.1999.

80. Онищенко H.A. Трансплантология. Руководство. Под редакцией

81. B.И. Шумакова, Москва, Медицина (1995), с.75-91.

82. Приезжаев Ф.В., Тучин В.В., Шубочкин А.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. Москва, 1986.

83. Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине. Минск, 1989.