Комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов в биологических объектах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ
|
Рябова, Анастасия Владимировна
АВТОР
|
||||
|
кандидата физико-математических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2006
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.21
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи УДК 615.831
Рябова Анастасия Владимировна
Комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов в биологических объектах
Специальность 01.04.21 - лазерная физика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва 2006
Работа выполнена в Лаборатории лазерной биоспектроскопии Центра естественно-научных исследований Института общей физики им. A.M. Прохорова РАН
Научный руководитель:
кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник
Официальные оппоненты:
д. ф.-м. н., профессор к. ф.-м. н., зав. лаб. Ведущая организация:
Стратоняиков Александр Аркадиевич
Тимошенко Виктор Юрьевич Савранский Валерий Васильевич ФГУП ГНЦ НИОПИК
Защита диссертации состоится 19 июня 2006 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.063.03 в Институте общей физики им. А.М. Прохорова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.38, корп. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОФ РАН.
Автореферат разослан 19 мая 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук ' ^ Воляк Т.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы
В применении лазерной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии особую роль играют фотосенсибилизаторы, позволяющие избирательно и интенсивно воздействовать светом на пораженные ткани1. До сих пор не найдено идеального фотосенсибилизатора, сочетающего в себе высокую эффективность взаимодействия с лазерным излучением, безопасность в применении и отсутствие побочных эффектов2. В настоящее время используются несколько различных схем для оценки эффективности фотосенсибилизаторов. В общих чертах их можно разделить на биохимические и физические. В первой группе методов используют животных, а также культуры живых клеток в среде, приближенной к физиологическим условиям, и оценивают фототоксичность препаратов, места их внутриклеточного накопления, фармакокинетику3"5. В группе физических следует выделить методы измерения времени жизни и скорости тушения синглетного кислорода при лазерном излучении для оценки возможного окислительного эффекта в биологической ткани6"8. Эта методы, дополняя друг друга, требуют больших временных затрат, но все равно не дают окончательного ответа об эффективности изучаемого соединения в качестве фотосенсибилизатора.
Совокупность лазерно-спектроскопических методов оценки взаимодействия лазерного излучения с фотосенсибилизаторами позволит проводить многосторонний анализ работы фотосенсибилизаторов. Значимость создания такого высокоинформативного метода для определения эффективности фотосенсибилизаторов неоспорима. В основу комбинированного спектроскопического метода анализа для оценки эффективности фотосенсибилизаторов лег разработанный ранее в Лаборатории лазерной
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ* БИБЛИОТЕКА С.-Петербург
ОЭ 200
биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ им. A.M. Прохорова РАН метод измерения степени оксигенации гемоглобина9. Комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно в реальном масштабе времени измерять и анализировать изменение степени оксигенации биологического объекта по спектрам поглощения, изменение концентрации активного вещества по спектрам флуоресценции и измерение оптических свойств исследуемой ткани по спектрам рассеяния лазерного излучения. Одновременное определение всех этих параметров во время лазерного облучения в режиме мониторинга делает возможным сразу вычислять квантовый выход генерации синглетного кислорода, склонность фотосенсибилизатора к фотобличингу и уровень его взаимодействия с биомолекулами, что позволяет определить уровень фотодинамической активности фотосенсибилизатора и установить механизм фотодинамической реакции. Поэтому перспективность использования комбинированного спектроскопического метода для продуктивного скрининга больших объемов новых химических соединений несомненна, а его разработка является своевременной и актуальной задачей.
Цель работы
Разработка комбинированного спектроскопического метода анализа эффективности сенсибилизаторов различного механизма действия при воздействии лазерного излучения на модельные биологические среды, клеточные суспензии и живые ткани.
Спектроскопические исследования эффективности новых перспективных для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии фотосенсибилизаторов.
Решаемые задачи
1. Разработать экспериментальную установку, позволяющую одновременно в режиме мониторинга при лазерном воздействии измерять спектры поглощения, флуоресценции, а также интенсивность обратного рассеяния лазерного излучения исследуемого биологического объекта, содержащего фотосенсибилизатор.
2. Разработать комбинированный спектроскопический метод по одновременному измерению спектров лазерной индуцированной флуоресценции (для определения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора), спектров поглощения (для определения концентрации гемоглобина и степени его оксигенации) и спектров рассеяния биологических образцов (для определения уровня разрушений эритроцитов), содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга.
3. Выявить спектроскопические критерии оценки эффективности генерации син!летного кислорода и его дезактивации в биологических средах при лазерном воздействии в зависимости от концентрации взаимодействующих веществ.
4. Разработать математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах.
5. Провести комбинированные спектроскопические и лазерно-флуоресцентные исследования фотосенсибилизаторов (сульфированный фталоцианин алюминия (Фотосенс), Фталосенс, Хлорин Е6, индоцианин-грин (Кардиогрин)) в биологических средах при лазерном воздействии с различной длиной волны и мощностью облучения. Произвести сравнительную оценку этих соединений в качестве фотосенсибилизаторов при сопоставлении четырех одновременно измеряемых в режиме мониторинга для каждого фотосенсибилизатора
параметрах (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов).
6. Разработать лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции.
7. Использовать разработанный лазерно-спектроскипический метод для количественного определения перекиси водорода, образующейся при фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами in vitro и при темновой каталитической терапии с использованием сульфированного фталоцианина кобальта (Терафтал).
8. Разработать спектроскопическую лазерно-флуоресцентную методику определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур при приготовлении липосомальных лекарственных форм на основе принципа статического тушения флуоресценции свободного фотосенсибилизатора при комплексообразовании.
Научная новизна исследования
1. Впервые разработан комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов с использованием одновременного измерения и математической обработки спектров флуоресценции, поглощения и рассеяния при лазерном облучении в режиме мониторинга.
2. С помощью разработанного комбинированного спектроскопического метода одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга
предложен механизм, объясняющий нелинейную зависимость интенсивности флуоресценции Фотосенса от концентрации кислорода.
3. Доказано усиление каталитической активности нефлуоресцирующего сульфированного фталоцианина кобальта при лазерном воздействии с помощью разработанного спектроскопического метода с использованием флуоресцирующей сенсорной системы 0Ч-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин -пероксидаза).
4. Разработана новая спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика для количественного определения включения сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) внутрь липосомальных наноструктур.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанный комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно измерять спектры лазерной индуцированной флуореспенции в диапазоне длин волн 690-900 нм, спектры поглощения в диапазоне длин волн 450-630 нм и спектры рассеянного назад лазерного излучения от биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в диапазоне длин волн 660-680 нм в режиме мониторинга,
2. Разработанные спектрально-флуоресцентный комплекс и методы обработки спектров биологических объектов обеспечивают необходимую точность и чувствительность оценки эффективности фотосенсибилизаторов, действующих по механизму передачи электронного возбуждения от фотосенсибилизатора к молекулярному кислороду.
3. Разработанный комбинированный метод позволяет эффективно проводить исследования взаимодействия лазерного излучения с биологическими
объектами, содержащими фотосенсибилизаторы, в диапазоне лазерного излучения от 10 до 800 мВт/см2, с длиной волны от 532 нм до 810 нм.
4. Разработанный математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах, содержащих фотосенсибилизаторы, позволяет делать точные дозиметрические расчеты для тестируемого фотосенсибилизатора.
5. Лазерное воздействие длины волны 680 нм в дозах порядка 200 мВт/см2 в течение временного интервала до 20 минут оказывает индуцирующее действие на каталитическую систему сульфированный фталоцианин кобальта (Терафтал) - аскорбиновая кислота.
6. Анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов позволяет определять количество анионного фотосенсибилизатора сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) внутри липосомапьных наноструктур и в окружающем их растворе.
Практическая значимость
С помощью разработанного комбинированного спектроскопического лазерно-флуоресцентного метода был исследован ряд новых фотосенсибилизаторов, наиболее перспективные из которых были включены в программу внедрения фотосенсибилизаторов в клиническую практику, выполняемую в соответствии с научно-технической программой Правительства Москвы и РАН "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.
Найденные критерии эффективности фотосенсибилизаторов используются для сравнительной оценки фотосенсибилизаторов в зависимости от типа фотосенсибилизатора и предполагаемой области его применения.
Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика количественного определения включения сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенс) в липосомальные наноструктуры в настоящее время внедрена в технологию производства липосомальных форм Фотосенса.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ряде научных конференций: на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты (Москва, 2004-2006 г.г.); на конференции SPIE International Symposium BiOS, Biomedical Optics (San Tose, California, USA, 2005); на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); на International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics Saratov Fall Meeting (Saratov, 2005), на 11 -th Congress of the European Society for Photobiology (Aix-les-Bains, France, 2005), на Днях экономики Москвы в Баварии (Мюнхен, Германия, 2005), на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 19 печатных работ, из них 4 в российских реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 7 публикаций в материалах российских конференций и 8 публикации в материалах зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации. Доклад состоит из введения, четырех глав и заключения. Содержание диссертации изложено на 120 страницах, иллюстрировано 42 рисунками, включает 2 таблицы. Список цитируемых статей в
обзоре литературы включает 74 публикации без участия автора, 19 публикаций с участием автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, ее новизна и практическая значимость, определена цель работы, представлены основные результаты, полученные в ходе выполнения работы, и рассматривается краткое содержание диссертации. В главе 1 приведен обзор литературы по существующим методам определения эффективности работы сенсибилизаторов. Показана значимость и своевременность проведенного в работе исследования.
Глава 2 посвящена комбинированному спектроскопическому методу одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресоенции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга.
Для измерения спектров поглощения и флуоресценции исследуемых образцов использовался волоконно-оптический спектрометр ЛЭСА-01 (Биоспек), спектральное разрешение 8 нм при входной щели 200 мкм. Схема экспериментальной установки приведена на рисунке 1. Необработанные спектральные данные, получаемые в ходе эксперимента через различные промежутки времени после начала облучения, приведены на рисунке 2 сверху.
В области 450Н550 нм данные представляют собой спектр диффузного пропускания без нормировки на источник белого света, острый пик на длине волны 675 нм представляет собой рассеянное назад лазерное излучение, а широкий пик в области 690^850 - спектр излучения флуоресценции, скорректированного в коротковолновой области подавляющим фильтром. Уменьшение интенсивности флуоресценции в процессе лазерного облучения,
наблюдаемое на рисунке 2, связано с выгоранием фотосенсибилизаторов, а изменения в области диффузного пропускания (45СИ-650 нм) с изменением степени оксигенации гемоглобина.
от лазера
к спектрометру
10-150 мкм
~7
биологический образец
рассеяние назад лазерного излучения и флуоресценция
диффузное пропускание
от галогеновои лампы
Рисунок 1. Схема
экспериментальной установки для определения эффективности
взаимодействия лазерного излучения с биологическими средами,
содержащими фотосенсибилизаторы
рассеянное назад I диффузно лазерное излучение
область флуоресценции
Рисунок 2. Спектр излучения от образца, собранного принимающим волокном С помощью специального программного обеспечения спектр делится на ряд областей для вычисления концентрации и степени оксигенации гемоглобина, обратного рассеяния лазерной линии, флуоресценции фотосенсибилизатора
Для количественного определения степени оксигенации гемоглобина спектры диффузного пропускания пересчитывались в спектры поглощения, которые приведены на рисунке 2 внизу.
Относительная ошибка при вычислении степени оксигенации составила не более 3%, а абсолютная - не более 10%. Величины обратного рассеяния лазерного излучения для образца в тонком слое, флуоресценции ФС и их динамика также отображаются на дисплее (рис. 3). Для систем, содержащих эритроциты, по величине пика рассеяния судили об их целостности, поскольку вклад эритроцитов в суммарное рассеяние системы был доминирующим, в этом случае при гемолизе эритроцитов рассеяние лазерного излучения резко падало.
Рисунок 3. Мониторинг основных параметров, характеризующих эффективность
взаимодействия лазерного излучения с ФС в тонком слое эритроцитарной массы (40%) в физиочогическом растворе Концентрация Фотосенса в образце составила 10 мг/литр, плотность мощности облучения - 400 мВт/см2 1 - концентрация гемоглобина, 2 — интенсивность флуоресценции, 3 -интенсивность обратного рассеяния лазерного света, 4 ~ степень оксигенации гемоглобина. Данные каждого измеряемого параметра нормированы на свое начальное значение
Дезактивация синглетного кислорода может происходить двумя путями: посредством физического и химического тушения. При физическом тушении энергия возбужденного состояния молекулы кислорода переходит в тепло, а при химическом - окисляются биологические молекулы, что приводит к нарушениям клеточных процессов. При измерении дезоксигенации (кривая 4 на рис. 3) фактически измеряется падение концентрации кислорода вследствие необратимого химического тушения синглетного кислорода. Скорость потребления кислорода из экспериментальных данных вычисляется по формуле:
Гюг=-4[НЬТ]^, (1)
где [НЬТ] - концентрация гемоглобина в образце, а Бог - величина насыщения кислородом гемоглобина. В то же время:
= ач>сН[С]Р, (2)
где [С] - концентрация фотосенсибилизатора, Р - плотность мощности излучения, а - коэффициент эффективности генерации синглетного кислорода, фсь -квантовый выход химического тушения синглетного кислорода. Вычисление величина афс|, позволяет оценивать способность фотосенсибилизатора к биодеструкциям.
360 300 250 200 скорость потребления кислорода [мкмоль/литр«с] . 120 100 -80 скорость потребления кислорода [мкмоль/литр«с]
150 100 50 [мВт/см2] плотность мощности излучения 40 20 ■ { концентрация ФС (мг/питр]
0 600 1000 1500 5 10
Рисунок 4. Зависимости скорости потребления кислорода от плотности мощности и концентрации фотосенсибилизатора от
На рисунке 4 приведены зависимости скорости потребления кислорода от плотности мощности излучения и от концентрации фотосенсибилизатора. Нелинейность второй зависимости объясняется образованием димеров фотосенсибилизатора при больших концентрациях.
С помощью разработанной экспериментальной спектроскопической методики были проведены сравнительные исследования препаратов для фотодинамической терапии, уже применяемых для лечения или находящиеся на стадии лабораторных исследований. Рассмотрим несколько примеров (рис. 5). Из рисунка видно, что каждый препарат имеет свою скорость потребления кислорода,
фотобличинг флуоресценции и по-разному разрушает эритроциты. Анализ этих данных позволяет наиболее точно оценить эффективность фотосенсибилизатора и выбрать наиболее оптимальную область его применения.
отнЕд
500 время (сек) 1000 Фотосенс
Рисунок 5.
Мониторинг основных параметров, характеризующих эффективность фотосенсибилизаторов (Фотосенс, Фтапосенс, Хлорин Е6) в растворе эритроцитарной массы (40%) в физ. р-ре. Облучение лазером с плотностью мощности 400 мВт/см2 Данные каждого измеряемого параметра нормированы на свое начальное
■отнЕд
концентрация гемоглобина
1000 1600 Фталосенс
О 100 200 300 400 600
цми(с«|у>#0
Хлорин Е6
В главе 3 представлен лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции.
Основным механизмом разрушающего действия фотосенсибилизаторов, является реакция II типа генерации синглетного кислорода. Часто в результате химического тушения синглетного кислорода образуется перекись водорода, -
И
активный радикал, также способный вызывать необратимые изменения биомолекул, но, в отличие от синглетного кислорода, обладающий большим временем жизни и, соответственно, большим радиусом разрушающего действия. Недостаточная эффективность фотодинамической терапии часто обусловлена плохим накоплением ФС непосредственно в опухолевых клетках, в то время как в подводящем сосудистом русле концентрация ФС может быть высокой. Проникновение перекиси водорода вглубь опухоли может решить эту проблему, однако, до сих пор вопрос количественного образования перекиси водорода при лазерном облучении с ФС не был изучен. Нами предложен лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в биологических системах in vitro при лазерном воздействии. В ходе экспериментов с флуоресцентным сенсором были отработаны условия наиболее точного количественного определения скорости генерации перекиси водорода.
Энергия [Вт/см2]
Рисунок 6. Образование перекиси водорода во время лазерного облучения (680 нм, 225 мВт/см2) в присутствии фотосенсибилизатора (Фотосенс, 4 мг/литр) в разных средах.
Было показано, что количество образовавшейся перекиси водорода при
лазерном облучении биологических структур в присутствии ФС зависит
концентрации запасенного изначально в образце молекулярного кислорода и от
концентрации химических тушителей синглетного кислорода (рис. 6). Так, в плазме образуется до 3,5 мкМ/литр перекиси водорода за 10 минут облучения лазером с плотностью мощности 225 мВт/см2 в присутствии ФС Фотосенса в концентрации 4 мг/литр.
В главе 4 описана разработанная спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика количественного определения содержания сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенс) в липосомальиых наноструктурах в модельных растворах с использованием катионных производных фталоцианинов.
Важным направлением повышения эффективности ФДТ, снижения токсичности и побочных эффектов метода является совершенствование избирательности действия ФС путем создания субмикронных липосомальных сферических частиц (липосом) лекарственной формы. Эффективность липосомальной формы Фотосенса зависит от степени включения Фотосенса внутрь липосом, что делает актуальной задачу контроля этого параметра.
Водные растворы Фотосенса и некоторых катионных производных фталоцианинов, имеют значительную флуоресценцию. Однако если Фотосенс и катионное производное фталоцианина (противоион) находятся в растворе, их молекулы образуют комплекс, что приводит к тушению флуоресценции (рис. 7).
При титровании исследуемого раствора противоионом концентрация Фотосенса будет эквимолярно равна количеству противоиона, необходимому для полного тушения флуоресценции Фотосенса. Причем в случае флуоресцирующего противоиона, его концентрацию для полного связывания Фотосенса при комплексообразовании следует определять из минимума на кривой интегральной флуоресценции при титровании липосомальной дисперсии этим флуоресцирующим противоионом. Из четырех противоионов (катионные
производные фталоцианина кобальта, меди, цинка и алюминия) только катионное производное фталоцианина алюминия не вызывало нарушения нативности липосом.
Рисунок 7. Схематическое изображение раствора липосомальной формы Фотосенса при титровании противоионом
Как видно из рисунка 8, область минимума интегральной флуоресценции довольно растянута. Дополнительной опорной точкой в этом анализе является различие между максимумами флуоресценции Фотосенса и противоиона.
Положения максимумов флуоресценции Фотосенса и противоиона отличаются (при используемой конфигурации фильтров для Фотосенса - около 690 нм в зависимости от концентрации, для катионного производного фталоцианина алюмини - 696 нм). То есть при комплексообразовании максимум суммарной флуоресценции будет сначала постоянен, так как флуоресцировать будет лишь Фотосенс, а затем, когда в растворе появится несвязанный противоион будет постепенно смещаться от 690 нм в сторону увеличения длины волны. Момент появления свободного противоиона на кривой максимума флуоресценции визуально очень хорошо заметен и совпадает с половинной концентрацией
противоиона, необходимой для полного тушения флуоресценции свободного Фотосенса в дисперсии (рис. 9).
10
Рисунок 8. Зависимость интенсивности интегральной флуоресценции при титровании растворов Фотосенса (1) и липосомалъной дисперсии Фотосенса (2) катионным производным фталоцианина алюминия._
Рисунок 9. Зависимость интенсивности интегральной флуоресценции при титровании липосомалъной дисперсии Фотосенса (1) противоиона и максимума интегральной флуоресценции полученной смеси (2)._
Основные результаты и выводы
1. Разработана экспериментальная установка, позволяющая одновременно в режиме мониторинга при лазерном воздействии измерять спектры поглощения, флуоресценции, а также интенсивность обратного рассеяния лазерного излучения исследуемого биологического объекта, содержащего фотосенсибилизатор. Спектры поглощения измерялись в диапазоне 450-'-650 нм в области интенсивного поглощения гемоглобина, что позволяло определять концентрацию гемоглобина и степень его оксигенации. Спектры флуоресценции измерялись тем же спектрометром в диапазоне 690+850 нм, в области интенсивной флуоресценции многих фотосенсибилизаторов второго поколения. Обратное рассеяние, обусловленное эритроцитами, измерялось на длине волны лазерного излучения
(680 нм), что позволяло судить о степени разрушения эритроцитов в процессе лазерного излучения.
Одновременный мониторинг этих четырех параметров во время лазерного излучения (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов (гемолиз)) позволил определить уровень фотодинамической активности различных фотосенсибилизаторов (в диссертации отмечены четыре наиболее перспективные) и установить механизм фотодинамической реакции.
2. Одновременный анализ четырех параметров (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов), измеряемых с помощью комбинированного метода при лазерном облучении в режиме мониторинга, был применен для исследования более 20 новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для клинических испытаний.
2.1. Исследование сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосечс) в етзе 10 мг/литр при плотности мощности 400 мВт/см2 лазерного излучения с длиной волны 680 нм показало, что достаточно 200 секунд для полной дезоксигенации образца (40% эритроцитарной массы в физиологическом растворе) (400мВт/см2 х 200 сек = 80 Дж). При этом интенсивность флуоресценции уменьшается на 60%, гемоглобин остается не разрушенным, начинается гемолиз эритроцитов.
2.2. Разработанный метод оказался очень чувствительным к определению квантового выхода синглетного кислорода. Так, для индоцианина-грина (Кардиогрин), механизм действия которого до сих пор дискутируется, было выяснено, что квантовый выход синглетного кислорода составляет порядка 1%. Концентрация гемоглобина не изменяется в процессе облучения
(свидетельствует об отсутствии перегрева образца). Выявлена способность индоцианина к фотобличингу: за первые 200 секунд флуоресценция индоцианина уменьшилась на 90%. Гемолиз эритроцитов начинался в течение первых 100 секунд облучения лазером на длине волны 800 нм (в области поглощения индоцианина) с плотностью мощности 800 мВт/см2, что показывает перспективность его использования в качестве фотосенсибилизатора, поглощающего в ближнем ИК-диапазоне. 2.3. При проведении исследований фотосенсибилизаторов в плазме с 40% содержанием эритроцитов выявлено увеличение в 2-3 раза скорости химического тушения кислорода и повышение стабильности эритроцитов вплоть до отсутствия гемолиза. На основании данных о скорости дезоксигенации гемоглобина в плазме сделаны дозиметрические расчеты для препаратов, находящихся в кровеносном русле.
3. Разработан лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции. Данный метод был использован для количественного определения перекиси водорода, образующейся при фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами in vitro и при темновой каталитической терапии с использованием сульфированного фталоцианина кобальта (Терафтал). Показано, что:
3.1. при фотодинамической терапии даже в отсутствие химических акцепторов синглетного кислорода происходит образование перекиси водорода, что является важным для механизма повреждения клеточных мишеней, находящихся на значительном расстоянии от места локализации фотосенсибилизатора;
3.2. лазерное воздействие приводит к повышению каталитической активности Терафтала, при этом воздействие лазерным излучением с длиной волны в области поглощения препарата, увеличивает каталитическую активность в 2,53 раза.
4. Разработана спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур при приготовлении липосомальных лекарственных форм. В основе методики лежит принцип статического тушения флуоресценции свободного фотосенсибилизатора при комплексообразовании. С помощью этой методики:
4.1. детально исследована динамика изменения флуоресценции при добавлении различных тушителей флуоресценции к растворам Фотосенса и Фотосенса в липосомальной форме. Для Фотосенса был подобран оптимальный тушитель флуоресценции - катионная производная фталоцианина алюминия;
4.2. проведен анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов, что позволило определять концентрацию Фотосенса вне липосомальных наноструктур;
4.3. построена математическая модель, описывающая динамику изменения флуоресценции раствора Фотосенса в липосомальной форме. С ее применением оценены константы связывания для Фотосенса и катионных производных.
Список публикаций с участием A.B. Рябовой
1. A.B. Рябова, М.А. Кортава, В.М. Негримовский и др. Определение степени включения Фотосенса внутри липосом с помощью метода тушения
флюоресценции при комплексообразовании. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С.42-43.
2. A. Ryabova, A. Stratonnikov, Е.А. Lukyanets, V. Loschenov. Application of N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine as singlet oxygen and hydrogen peroxide sensor in photodynamic reactions. //11th Congress of the European Society for Photobiology. Aix-les-Bains, France, 3-8 September 2005. [РП34-142].
3. A. Stratonnikov, A. Ryabova, V. Loschenov. Selective accumulation and photobleaching of indocyanine green in tumors measured by fluorescence and absorption spectroscopy. // 11th Congress of the European Society for Photobiology. Aix-les-Bains, France, 3-8 September 2005. [РП59-149].
4. A. Ryabova, A. Stratonnikov, V. Loschenov. Screening of photodynamic activity of sensitizers in samples of blood. // Saratov Fall Meeting. September 27-30, 2005, Saratov, Russia.
5. Ryabova A.V., Negreemovski V.M., Stratonnikov A.A., et al. Application of a method fluorescence suppression at complexation for the control of Photosence inclusion inside of liposomes. // Saratov Fall Meeting. September 27-30, 2005, Saratov, Russia.
6. A.B. Рябова, A.A. Стратонников, Е.А. Лукьянец, В.Б. Лощенов. Детектирование синглетного кислорода и перекиси водорода при фотодинамической терапии с помощью флуоресцентного сенсора. // IV Съезд Фотобиологов России. Саратов, 26-28 сентября 2005г.
7. Рябова А.В., Стратонников А.А., Лощенов В.Б., Лукьянец Е.А. Использование сенсорной системы «'Ы-ацетил-ЗЛ-дигидроксифеноксазин -пероксидаза» для детектирования молекул синглетного кислорода и перекиси водорода, образовавшихся при фотодинамической терапии. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
8. Рябова А.В., Конов В.И., Адамян Л.В., Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Разработка системы флуоресцентной визуализации клеточных культур. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
9. М.А. Кортава, А.В. Рябова и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С.36-37.
10. Рябова A.B., Стратонников A.A., Лощенов В.Б. Лазерно-спектроскопический метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов в биологических средах. // Квантовая электроника. 2006. Т. 36. № 6. С. 583-590.
11. Васильченко С.Ю., Рябова A.B., Стратонников A.A., Лощенов В.Б. Метод и аппаратура для неинвазивного мониторинга содержания кислорода в биологических тканях. // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина». Москва, Россия, 14-17 марта 2006 г. с.246.
12. A.B. Рябова, А.А.Стратонников и др. Особенности фармакокинетики гидрофобных фотосенсибилизаторов. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
13. Меерович И.Г., Стратонников A.A., Рябова A.B. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов in vivo. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2005. № 8. С. 25-30.
14. Meerovich I.G., Stratonnikov A.A., Ryabova A.V. et al. In vivo evaluation of accumulation of sensitizers fcr oncological diagnostics and therapy using the method of diffuse reflectance spectroscopy. // Laser Use in Oncology: CIS Selected Paper?. Proceedings of SPIE, v.5973,p. 132-141. (2005)
15. Меерович И.Г., Стратонников A.A., Рябова A.B. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях. // Российский биотерапевтический журнал. 2004. Т. 3. № 3. С. 37-42.
16. Меерович И.Г., Стратонников A.A., Рябова A.B. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях in vivo. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Отечественный противоопухолевые препараты", Москва, 17-19 марта 2004 г., Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, №2, с.54-55.(2004).
17. Meerovich I., Stratonnikov A., Ryabova A. et al. Investigation of optical absorption of sensitizers in vivo. // SPIE International Symposium BiOS 2005. Biomedical Optics. San Jose, California, USA. [5695-06]
18. Stratonnikov A.A., Ryabova A., Loschenov V. Indocyanine green as a photosensitizer for tumor therapy: photodynamic or photothermolysis agent? // SPIE International Symposium BiOS 2005. Biomedical Optics. San Jose, California, USA. [5689-28]
19. M.A. Кортава, A.B. Рябова и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С. 36-37.
Цитируемая литература
1. Loschenov V.B., Konov V.l., Prokhorov A.M. Photodynamic Therapy and Fluorescence Diagnostics. // Laser Physics. 2000. V. 10. No.6. P. 1188-1207.
2. Dougherty T.J., Gomer С J., et al. Photodynamic therapy. // J. Natl.Cancer Inst. 1998. V. 90. P. 889-905.
3. Spielmann H., Maurer T., et al. In vitro phototoxicity testing. // ATLA. 1994. V. 22. P. 314348.
4. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. //J. Photochem. Photobiol. 1996. V. 64. № 3. P. 469-485.
5. Keyse S.M Stress response methods and protocols. // 2000. P. 35-47.
6. Baker A., Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 leukemia cells. // J. Photochem. Photobiol. 1992. V. 55. № 4. P. 523-528.
7. Ricchelli F. Photophysical properties of porphirins in biological membranes. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1995. V. 29. P. 109-118.
8. Niedre M., Peterson M.S., Wilson B.C. Direct near-infrared luminescence detection of singlet oxygen generated by photodynamic therapy in cells in vitro and tissues in vivo. // J. Photochem.Photobiol. 2002. V. 75, No.4. P. 382-391.
9. Stratonnikov A.A., Douplik A.Yu., et al. Oxygen consumption and photobleaching in whole blood incubated with photosensitizer induced by laser irradiation. // Laser Physics. 2003. V. 13. No. l.P. 1-21.
»11377
Введение
Глава 1. Краткий обзор научной литературы по теме работы.
1.1. Взаимодействие лазерного излучения с биологическими объектами.
1.2. Основные характеристики фотосенсибилизаторов, определяющие область их применения в биологии и медицине.
1.3. Существующие методы оценки эффективности взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими фотосенсибилизаторы.
1.3.1. Биохимические методы оценки эффективности взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими фотосенсибилизаторы.
1.3.1.1. Определение цитотоксичности фотосенсибилизаторов.
1.3.1.2. Определение противоопухолевой активности фотосенсибилизаторов.
1.3.1.3. Определение типа фотохимической реакции.
1.3.1.4. Определение накопления и распределения фотосенсибилизаторов в опухолевых клетках.
1.3.2. Физические методы оценки эффективности взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими фотосенсибилизаторы.
1.3.2.1. Метод определение концентрации молекулярного кислорода посредством тушения им фосфоресценции.
1.3.2.2. Определение интенсивности физического воздействия с использованием модели гемолиза эритроцитов.
1.3.3. Лазерно-спектроскопические методы оценки эффективности взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими фотосенсибилизаторы.
1.3.3.1. Спектроскопический метод определения концентрации молекулярного кислорода по степени оксигенации гемоглобина.
1.3.3.2. Методы оценки концентрации фотосенсибилизаторов в биологическом образце с помощью флуоресцентной спектроскопии и спектроскопии поглощения.
1.3.3.3. Метод спектроскопического мониторинга за процессами, вызываемыми ФДТ.
1.4. Выводы.
Глава 2. Комбинированный спектроскопический метод одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме непрерывного мониторинга.
2.1. Разработка экспериментальной спектроскопической методики по одновременному измерению спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы.
2.2. Оценка инструментальных и методических погрешностей для измеряемых спектроскопических характеристик с помощью разработанной установки.
2.3. Методика подготовки биологических образцов и фотосенсибилизаторов.
2.4. Метод определения концентрации кислорода в системах, содержащих гемоглобин, по спектрам прямого и обратного рассеяния.
2.4.1. Сравнение методов определения концентрации молекулярного кислорода: спектроскопического метода определения концентрации молекулярного кислорода по степени оксигенации гемоглобина и физического метода по интенсивности тушения фосфоресценции красителя.
2.4.2. Метод определения концентрации кислорода в биологических объектах, содержащих гемоглобин, по спектрам прямого и обратного рассеяния при лазерном воздействии в присутствии фотосенсибилизатора.
2.5. Анализ динамики изменения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизаторов при облучении.
2.6. Спектроскопические и лазерно-флуоресцентные сравнительные исследования фотосенсибилизаторов (сульфированный фталоцианин алюминия (Фотосенс), Фотосенс в липосомальных формах, безметальный сульфированный фталоцианин (Фталосенс), хлорин Е6, индоцианин (Кардиогрин)) в биологических средах при лазерном воздействии с различной длиной волны и мощностью лазерного облучения.
2.7. Анализ рассеянного от биологического объекта лазерного излучения.
2.7.1. Сравнение воздействия лазерного излучения на цельную кровь и на суспензии эритроцитарной массы в плазме, содержащие фотосенсибилизатор.
2.7.2. Сравнение воздействия лазерного излучения на суспензии эритроцитарной массы в плазме и физиологическом растворе.
2.8. Выводы.
Глава 3. Лазерно-спектроскопнческий метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции.
3.1. Флуоресцентный метод количественного определения образования перекиси водорода с помощью сенсорной системы.
3.2. Особенности количественного определения образования перекиси водорода с помощью сенсорной системы.
3.3. Использование сенсорной системы в присутствии лазерного излучения и фотосенсибилизатора для оценки образования генерации синглетного кислорода.
3.4. Использование сенсорной системы в присутствии лазерного излучения и фотосенсибилизатора для оценки образования перекиси водорода.
3.5. Использование сенсорной системы для оценки образования перекиси водорода в результате каталитических реакций нефлуоресцирующих сенсибилизаторов.
3.6. Использование сенсорной системы для определения усиления каталитической активности нефлуоресцирующих сенсибилизаторов лазерным излучением.
3.7. Выводы.
Глава 4. Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур.
4.1. Материалы, оборудование и методы.
4.2. Определение степени включения фталоцианина алюминия в липосомальные наноструктуры с помощью спектроскопической лазерно-флуоресцентной методики.
4.3. Математическая модель для описания интенсивности интегральной флуоресценции липосомальной дисперсии Фотосенса при комплексообразовании с катионными производными фталоцианина.
4.4. Выводы.
В применении лазерной флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии особую роль играют фотосенсибилизаторы, позволяющие избирательно и интенсивно воздействовать светом на пораженные ткани. До сих пор не найдено идеального фотосенсибилизатора, сочетающего в себе высокую эффективность взаимодействия с лазерным излучением, безопасность в применении и отсутствие побочных эффектов. В настоящее время используются несколько различных схем для оценки эффективности фотосенсибилизаторов. В общих чертах их можно разделить на биохимические и физические методы. В первой группе методов используют животных, а также культуры живых клеток в среде, приближенной к физиологическим условиям, и оценивают фототоксичность препаратов, места их внутриклеточного накопления, фармакокинетику. В группе физических следует выделить методы измерения времени жизни и скорости тушения синглетного кислорода при лазерном излучении для оценки возможного окислительного эффекта в биологической ткани. Эти методы, дополняя друг друга, требуют больших временных затрат, но все равно не дают окончательного ответа об эффективности изучаемого соединения в качестве фотосенсибилизатора.
Совокупность лазерно-спектроскопических методов оценки взаимодействия лазерного излучения с фотосенсибилизаторами позволит проводить многосторонний анализ работы фотосенсибилизаторов. Значимость создания такого высокоинформативного метода для определения эффективности фотосенсибилизаторов неоспорима. В основу комбинированного спектроскопического метода анализа для оценки эффективности фотосенсибилизаторов предлагается разработанный ранее в Лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ им. A.M. Прохорова РАН метод измерения степени оксигенации гемоглобина. Комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно в реальном масштабе времени измерять и анализировать изменение степени оксигенации биологического объекта по спектрам поглощения, изменение концентрации активного вещества по спектрам флуоресценции и измерение оптических свойств исследуемой ткани по спектрам рассеяния лазерного излучения. Одновременное определение всех этих параметров во время лазерного облучения в режиме мониторинга делает возможным сразу вычислять квантовый выход генерации синглетного кислорода, склонность фотосенсибилизатора к фотобличингу и уровень его взаимодействия с биомолекулами, что позволяет определить уровень фотодинамической активности фотосенсибилизатора и установить механизм фотодинамической реакции. Поэтому перспективность использования комбинированного спектроскопического метода для продуктивного скрининга больших объемов новых химических соединений несомненна, а его разработка является своевременной и актуальной задачей.
Цель работы
Разработка комбинированного спектроскопического метода анализа эффективности сенсибилизаторов различного механизма действия при воздействии лазерного излучения на модельные биологические среды, клеточные суспензии и живые ткани.
Спектроскопические исследования эффективности новых перспективных для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии фотосенсибилизаторов.
Решаемые задачи
1. Разработать экспериментальную установку, позволяющую одновременно в режиме мониторинга при лазерном воздействии измерять спектры поглощения, флуоресценции, а также интенсивность обратного рассеяния лазерного излучения исследуемого биологического объекта, содержащего фотосенсибилизатор.
2. Разработать комбинированный спектроскопический метод по одновременному измерению спектров лазерной индуцированной флуоресценции (для определения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора), спектров поглощения (для определения концентрации гемоглобина и степени его оксигенации) и спектров рассеяния биологических образцов (для определения уровня разрушений эритроцитов), содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга.
3. Выявить спектроскопические критерии оценки эффективности генерации синглетного кислорода и его дезактивации в биологических средах при лазерном воздействии в зависимости от концентрации взаимодействующих веществ.
4. Разработать математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах.
5. Провести комбинированные спектроскопические и лазерно-флуоресцентные исследования фотосенсибилизаторов (сульфированный фталоцианин алюминия (Фотосенс), Фталосенс, Хлорин Е6, индоцианин-грин (Кардиогрин)) в биологических средах при лазерном воздействии с различной длиной волны и мощностью облучения. Произвести сравнительную оценку этих соединений в качестве фотосенсибилизаторов при сопоставлении четырех одновременно измеряемых в режиме мониторинга для каждого фотосенсибилизатора параметрах (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов).
6. Разработать лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции.
7. Использовать разработанный лазерно-спектроскипический метод для количественного определения перекиси водорода, образующейся при фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами in vitro и при темновой каталитической терапии с использованием сульфированного фталоцианина кобальта (Терафтал).
8. Разработать спектроскопическую лазерно-флуоресцентную методику определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур при приготовлении липосомальных лекарственных форм на основе принципа статического тушения флуоресценции свободного фотосенсибилизатора при комплексообразовании.
Научная новизна исследования
1. Впервые разработан комбинированный спектроскопический метод анализа эффективности сенсибилизаторов с использованием одновременного измерения и математической обработки спектров флуоресценции, поглощения и рассеяния при лазерном облучении в режиме мониторинга.
2. С помощью разработанного комбинированного спектроскопического метода одновременного измерения спектров лазерной индуцированной флуоресценции, спектров поглощения и спектров рассеяния биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в режиме мониторинга предложен механизм, объясняющий нелинейную зависимость интенсивности флуоресценции Фотосенса от концентрации кислорода.
3. Доказано усиление каталитической активности нефлуоресцирующего сульфированного фталоцианина кобальта при лазерном воздействии с помощью разработанного спектроскопического метода с использованием флуоресцирующей сенсорной системы (К-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин -пероксидаза).
4. Разработана новая спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика для количественного определения включения сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) внутрь липосомальных наноструктур.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанный комбинированный спектроскопический метод позволяет одновременно измерять спектры лазерной индуцированной флуоресценции в диапазоне длин волн 690-ИЮ0 нм, спектры поглощения в диапазоне длин волн 45(Н630 нм и спектры рассеянного назад лазерного излучения от биологических образцов, содержащих фотосенсибилизаторы, в диапазоне длин волн 660-^-680 нм в режиме мониторинга.
2. Разработанные спектрально-флуоресцентный комплекс и методы обработки спектров биологических объектов обеспечивают необходимую точность и чувствительность оценки эффективности фотосенсибилизаторов, действующих по механизму передачи электронного возбуждения' от фотосенсибилизатора к молекулярному кислороду.
3. Разработанный комбинированный метод позволяет эффективно проводить исследования взаимодействия лазерного излучения с биологическими объектами, содержащими фотосенсибилизаторы, в диапазоне лазерного
•у излучения от 10 до 800 мВт/см , с длиной волны от 532 нм до 810 нм.
4. Разработанный математический алгоритм лазерно-индуцированной генерации и тушения синглетного кислорода в биологических средах, содержащих фотосенсибилизаторы, позволяет делать точные дозиметрические расчеты для тестируемого фотосенсибилизатора.
5. Лазерное воздействие длины волны 680 нм в дозах порядка 200 мВт/см2 в течение временного интервала до 20 минут оказывает индуцирующее действие на каталитическую систему сульфированный фталоцианин кобальта (Терафтал) - аскорбиновая кислота.
6. Анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов позволяет определять количество анионного фотосенсибилизатора сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) внутри липосомальных наноструктур и в окружающем их растворе.
Практическая значимость
С помощью разработанного комбинированного спектроскопического лазерно-флуоресцентного метода был исследован ряд новых фотосенсибилизаторов, наиболее перспективные из которых были включены в программу внедрения фотосенсибилизаторов в клиническую практику, выполняемую в соответствии с научно-технической программой Правительства Москвы и РАН "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.
Найденные критерии эффективности фотосенсибилизаторов используются для сравнительной оценки фотосенсибилизаторов в зависимости от типа фотосенсибилизатора и предполагаемой области его применения.
Спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика количественного определения включения сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенс) в липосомальные наноструктуры в настоящее время внедрена в технологию производства липосомальных форм Фотосенса.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на ряде научных конференций: на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты (Москва, 2004-2006 г.г.); на конференции SPIE International Symposium BiOS, Biomedical Optics (San Jose, California, USA, 2005); на IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); на International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics Saratov Fall Meeting (Saratov, 2005), на 11-th Congress of the European Society for Photobiology (Aix-les-Bains, France, 2005), на Днях экономики Москвы в Баварии (Мюнхен, Германия, 2005), на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 19 печатных работ, из них 4 в российских реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 7 публикаций в материалах российских конференций и 8 публикации в материалах зарубежных конференций.
4.4. Выводы.
Разработана спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения концентрации сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенса) в липосомальных наноструктурах в модельных растворах с использованием катионных производных фталоцианинов.
Установлено, что катионные производные фталоцианина цинка и кобальта приводят к разрушению липосомальных структур и не пригодны для разрабатываемой методики, а добавление катионных производных фталоцианина алюминия приводит к тушению флуоресценции Фотосенса, находящегося только вне липосомальных наноструктур.
Анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов позволяет определять количество Фотосенса внутри и вне липосомальных наноструктур.
На основе эффекта тушения флуоресценции Фотосенса при добавлении катионных производных фталоцианина алюминия удается устанавливать степень включения Фотосенса внутрь липосом с точностью до 5%. Было проанализировано несколько разных пробных экспериментальных партий препарата липосомального Фотосенса и установлено в них включение Фотосенса внутрь липосом от 15% до 85%. Проведенные комплексные исследования по стандартизации серий липосомальной дисперсии Фотосенса, позволили разработать методы контроля качества создаваемых лекарственных формы липосомального Фотосенса.
Заключение.
Ниже приведены основные результаты и выводы работы:
1. Разработана экспериментальная установка, позволяющая одновременно в режиме мониторинга при лазерном воздействии измерять спектры поглощения, флуоресценции, а так же интенсивность обратного рассеяния лазерного излучения исследуемого биологического объекта, содержащего фотосенсибилизатор. Спектры поглощения измерялись в диапазоне 450+650 нм в области интенсивного поглощения гемоглобина, что позволяло определять концентрацию гемоглобина и степень его оксигенации. Спектры флуоресценции измерялись тем же самым спектрометром в диапазоне 690+850 нм, - в области интенсивной флуоресценции многих фотосенсибилизаторов второго поколения. Обратное рассеяние, обусловленное эритроцитами, измерялось на длине волны лазерного излучения (680 нм), что позволяло судить о степени разрушения эритроцитов в процессе лазерного излучения.
Одновременный мониторинг этих четырех параметров во время лазерного излучения (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов (гемолиз)) позволял определить уровень фотодинамической активности различных фотосенсибилизаторов (в диссертации отмечены четыре наиболее перспективные) и установить механизм фотодинамической реакции.
2. Одновременный анализ четырех параметров (концентрация гемоглобина, степень оксигенации гемоглобина, флуоресценция фотосенсибилизатора, уровень разрушения эритроцитов), измеряемых с помощью комбинированного метода при лазерном облучении в режиме мониторинга, был применен для исследования более 20 новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для клинических испытаний.
2.1. Исследование сульфированного фталоцианина алюминия (Фотосенс) в дозе Л
10 мг/литр при плотности мощности 400 мВт/см лазерного излучения с длиной волны 680 нм показало, что достаточно 200 секунд для полной дезоксигенации образца (40% эритроцитарной массы в физиологическом растворе) (400МВТ/СМ2 х 200 сек = 80 Дж). При этом интенсивность флуоресценции уменьшается на 60%, гемоглобин остается не разрушенным, начинается гемолиз эритроцитов. Следует использовать фракционный режим лазерного воздействия для восстановления оксигенации.
2.2. Разработанный метод оказался очень чувствительным к определению квантового выхода синглетного кислорода. Так, для индоцианина-грина (Кардиогрйн), механизм действия которого до сих пор дискутируется, было выяснено, что квантовый выход синглетного кислорода составляет порядка 1%. Концентрация гемоглобина не изменяется в процессе облучения (свидетельствует об отсутствии перегрева образца). Выявлена способность индоцианина к фотобличингу: за первые 200 секунд флуоресценция индоцианина уменьшилась на 90%. Гемолиз эритроцитов начинался в течение первых 100 секунд облучения лазером длины волны 800 нм (в области поглощения индоцианина) с плотностью мощности 800 мВт/см2, что показывает перспективность его использования в качестве фотосенсибилизатора, поглощающего в ближнем ИК-диапазоне.
2.3. При проведении исследований фотосенсибилизаторов в плазме с 40% содержанием эритроцитов выявлено увеличение в 2-3 раза скорости химического тушения кислорода и повышение стабильности эритроцитов вплоть до отсутствия гемолиза. Знание о скорости дезоксигенации гемоглобина в плазме позволяло делать дозиметрические расчеты для препаратов, находящихся в кровеносном русле.
3. Разработан лазерно-спектроскопический метод детектирования перекиси водорода в сверхмалых количествах при различных процессах, включая фотодинамические и каталитические реакции. Данный метод был использован для количественного определения перекиси водорода, образующейся при фотодинамической терапии с различными фотосенсибилизаторами in vitro и при темновой каталитической терапии с использованием сульфированного фталоцианина кобальта (Терафтал). Показано, что:
3.1. Впервые было показано, что при фотодинамической терапии даже в отсутствии химических акцепторов синглетного кислорода происходит образование перекиси водорода, что является важным для - механизма повреждения клеточных мишеней, находящихся на значительном расстоянии от места локализации фотосенсибилизатора. »
3.2. Лазерное воздействие приводит к повышению каталитической активности Терафтала, при этом воздействие лазерным излучением с длиной волны в области поглощения препарата, увеличивает каталитическую активность в 2,53 раза.
4. Разработана спектроскопическая лазерно-флуоресцентная методика определения степени включения фотосенсибилизаторов внутрь липосомальных наноструктур при приготовлении липосомальных лекарственных форм. В основе методики лежит принцип статического тушения флуоресценции свободного фотосенсибилизатора при комплексообразовании.
4.1. Была детально исследована динамика изменения флуоресценции при добавлении различных тушителей флуоресценции к растворам Фотосенса и
Фотосенса в липосомальной форме. Для Фотосенса был подобран оптимальный тушитель флуоресценции - катионная производная фталоцианина алюминия.
4.2. Проведен анализ форм спектров флуоресценции и интенсивности флуоресценции анионных и катионных производных фталоцианинов, что позволило определять концентрацию Фотосенса вне липосомальных наноструктур.
4.3. Была построена математическая модель, описывающая динамику изменения флуоресценции раствора Фотосенса в липосомальной форме. С ее применением оценены константы связывания для Фотосенса и катионных производных.
Список публикаций с участием А.В. Рябовой
1. А.В. Рябова, М.А. Кортава, В.М. Негримовский и др. Определение степени включения Фотосенса внутри липосом с помощью метода тушения флюоресценции при комплексообразовании. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С.42-43.
2. A. Ryabova, A. Stratonnikov, Е.А. Lukyanets, V. Loschenov. Application of N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine as singlet oxygen and hydrogen peroxide sensor in photodynamic reactions. // 11th Congress of the European Society for Photobiology. Aix-les-Bains, France, 3-8 September 2005. [РП34-142].
3. A. Stratonnikov, A. Ryabova, V. Loschenov. Selective accumulation and photobleaching of indocyanine green in tumors measured by fluorescence and absorption spectroscopy. // 11th Congress of the European Society for Photobiology. Aix-les-Bains, France, 3-8 September 2005. [РП59-149].
4. A. Ryabova, A. Stratonnikov, V. Loschenov. Screening of photodynamic activity of sensitizers in samples of blood. // Saratov Fall Meeting. September 27-30, 2005, Saratov, Russia.
5. Ryabova A.V., Negreemovski V.M., Stratonnikov A.A., et al. Application of a method fluorescence suppression at complexation for the control of Photosence inclusion inside of liposomes. // Saratov Fall Meeting. September 27-30, 2005, Saratov, Russia.
6. А.В. Рябова, А.А. Стратонников, Е.А. Лукьянец, В.Б. Лощенов. Детектирование синглетного кислорода и перекиси водорода при фотодинамической терапии с помощью флуоресцентного сенсора. // IV Съезд Фотобиологов России. Саратов, 26-28 сентября 2005г.
7. Рябова А.В., Стратонников А.А., Лощенов В.Б., Лукьянец Е.А. Использование сенсорной системы «>Т-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин -пероксидаза» для детектирования молекул синглетного кислорода и перекиси водорода, образовавшихся при фотодинамической терапии. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
8. Рябова А.В., Конов В.И., Адамян Л.В., Беляева Л.А., Лощенов В.Б. Разработка системы флуоресцентной визуализации клеточных культур. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
9. М.А. Кортава, А.В. Рябова и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С.36-37.
10. Рябова А.В., Стратонников А.А., Лощенов В.Б. Лазерно-спектроскопический метод оценки эффективности фотосенсибилизаторов в биологических средах. // Квантовая электроника. 2006. Т. 36. № 6. С. 583-590.
11. Васильченко С.Ю., Рябова А.В., Стратонников А.А., Лощенов В.Б. Метод и аппаратура для неинвазивного мониторинга содержания кислорода в биологических тканях. // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина». Москва, Россия, 14-17 марта 2006 г. с.246.
12. А.В. Рябова, А.А.Стратонников и др. Особенности фармакокинетики гидрофобных фотосенсибилизаторов. // V Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 21-24 марта 2006 г.
13. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Рябова А.В. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов in vivo. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2005. № 8. С. 25-30.
14. Meerovich I.G., Stratonnikov А.А., Ryabova A.V. et al. In vivo evaluation of accumulation of sensitizers for oncological diagnostics and therapy using the method of diffuse reflectance spectroscopy. // Laser Use in Oncology: CIS Selected Papers, Proceedings of SPIE, v.5973, p. 132-141. (2005)
15. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Рябова А.В. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях. // Российский биотерапевтический журнал. 2004. Т. 3. № 3. С. 37-42.
16. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Рябова А.В. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях in vivo. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Отечественный противоопухолевые препараты", Москва, 17-19 марта 2004 г., Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, №2, с.54-55.(2004).
17. Meerovich I., Stratonnikov A., Ryabova A. et al. Investigation of optical absorption of sensitizers in vivo. // SPIE International Symposium BiOS 2005. Biomedical Optics. San Jose, California, USA. [5695-06]
18. Stratonnikov A.A., Ryabova A., Loschenov V. Indocyanine green as a photosensitizer for tumor therapy: photodynamic or photothermolysis agent? // SPIE International Symposium BiOS 2005. Biomedical Optics. San Jose, California, USA. [5689-28]
19. M.A. Кортава, А.В. Рябова и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса. Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С. 36-37.
1. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. //Издательство Саратовского университета. 1998.
2. Учебное и справочное пособие. Под редакцией Х.-П.Берлиена, Г.Й. Мюллера. Прикладная лазерная медицина. // Интерэксперт. Москва. 1997.
3. Wilson B.C., Patterson M.S., Lilge L. Implicit and explicit Dosimetry in Photodynamic Terapy: a New Paradigm. // Lasers in Medical Science. 1997. V. 12.182-199.
4. Jacques. Simple optical theory for light dosimetry during PDT. Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy. //Proc. SPIE. 1992. Y. 1645. P. 155-165.
5. Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic Therapy and Fluorescence Diagnostics. // Laser Physics. 2000. V. 10. No.6. P. 1188-1207.
6. Moan J., Berg K. The photodegradation of porfhyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. // J. Photochem. Photobiol. 1991. V.53. P. 549-553.
7. Potter W.R., Mang T.S., Dougherty TJ. The theory of photodynamic therapy dosimetry: Consequences of photo-destruction of sensitizer. // J. Photochem. Photobiol. 1987. V. 46. P. 97-101.
8. Boyle D.G., Potter W.R. Photobleaching of Photofrin II as a means of eliminating skin photosensitivity. // J. Photochem. Photobiol. 1987. V. 46. P. 997-1001.
9. Spielmann H., Maurer Т., et al. In vitro phototoxicity testing. // ATLA. 1994. V. 22. P. 314-348.
10. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. // J. Photochem. Photobiol. 1996. V. 64. № 3. P. 469485.
11. Keyse S.M. Stress response methods and protocols. // 2000. P. 35-47.
12. Tapia G., Galetovic A., et al. Singlet oxygen-mediated photobleaching of the prosthetic group in hemoglobins and C-Phycocyanin. // J. Photochem. Photobiol. 1999. V. 70. № 4. P. 499-504.
13. Захаров С.Д., Иванов А.В. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей. // Квантовая электроника. 1999. Т. 29. №3. С. 192-214.
14. Baker A., Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 leukemia cells. //J. Photochem. Photobiol. 1992. V. 55. № 4. P. 523-528.
15. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human red cell ghosts. // J. Photochem. Photobiol. 1991. V. 53. P. 93-96.
16. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human plasma. // J. Photochem. Photobiol. 1990. V. 51. P. 299-303.
17. Ricchelli F. Photophysical properties of porphirins in biological membranes. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1995. V. 29. P. 109-118.
18. Zavodnik I.B., Zavodnik L.B. et al. The mechanism of Zn-phthalocyanine photosensitized lysis of human erythrocytes. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2002. V. 67. P. 1-10.
19. Niedre M., Peterson M.S., Wilson B.C. Direct near-infrared luminescence detection of singlet oxygen generated by photodynamic therapy in cells in vitro and tissues in vivo. // J. Photochem.Photobiol. 2002. V. 75, No.4. P. 382-391.
20. Bors W., Saran M., Lengfelder E., Michel C., Fuchs C., Frenzel C. Detection of oxygen radicals in biological reactions. // J. Photochem.Photobiol. 1978. V. 28. P. 629-638.
21. Feofanov A.V., Grichine A.I., at all. Near-infrared photosensitizer on the basis of cycloimide derivative of chlorin p6: 13,15-N-(3'-hydroxypropyl)cycloimide chlorin p6. // J. Photochem.Photobiol. 2002. V. 75. No. 6. P. 633-643. '
22. Dougherty T.J., Gomer C.J., at all. Photodynamic therapy. // J. Natl.Cancer Inst. 1998. V. 90. P. 889-905.
23. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. // J. Photochem.Photobiol. 1996. V. 64. No. 3. P. 469485.
24. Лёвшин Л.В., Салецкий A.M. Люминесценция и ее измерения: молекулярная люминесценция. //Москва. Издательство МГУ. 1989.
25. Gijzeman, Kaufman F., Porter G. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1973. V. 69. No. 56. P. 708.
26. Garner A., Wilkinson F. // Chem. Phys. Lett. 1977. V. 45. No. 3. P. 432.
27. Grossweiner L.I., Fernandez J.M., Bilgin M.D. Photosensitisation of red blood cell haemolysis by photodynamic agents. // Lasers Med. Sci. 1998. V. 13. P. 4254.
28. Valenzeno D.P., Pooler J.P. The concentration and fluence dependence of delayed photohemolysis. // J. Photochem. Photobiol. 1982. V. 35. P. 427-429.
29. Williams M., Lagerberg J.W.M., Van Steveninck J., Van der Zee J. The effect of protoporphyrin on the susceptibility of human erythrocytes to oxidative stress:exposure to hydrogen peroxide. // J. Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1236. P. 81-88.
30. Pooler J.P. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. П. Photohemolysis. // J. Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 812. P. 199-205.
31. Pooler J.P. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. I. Nystatin-induced lysis. // J. Biochim. Biophys. Acta. 1985 V. 812. P. 193-198.
32. Cook J.S., Blum H.F. Dose relationships and oxygen dependence in ultraviolet and photodynamic hemolysis. // J. Cell. Сотр. Physiol. 1959. V. 53. P. 41-60.
33. РП № 2169590 (2001.06.27) Спектральное устройство для контроля и мониторинга процесса фотодинамической терапии.
34. РП № 2185103 (2002.07.20) Способ определения фотодинамической активности in vitro.
35. Stratonnikov А.А., Douplik A.Yu., et al. Oxygen consumption and photobleaching in whole blood incubated with photosensitizer induced by laser irradiation. //J. Laser Physic. 2003. V. 13. No. 1. P. 1-21.
36. Stratonnikov A.A., Edinak N.E., Klimov D.V., at all. // Proc. SPIE. Int. Soc. Opt. Eng. 1996. V. 49. P. 2924.
37. Fernandez J.M., Bilgin M.D., Grossweiner L.I. Singlet oxygen generation by photodynamic agents. // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. V. 37. 1997. P. 131-140.
38. Fournier R.L. Basic Concepts of Biomedical Engineering. // Greyden Press. Columbus. 1995.
39. Schimidt R.F., Thews G. Human Physiology. // Springer-Verlag. Berlin. 1989.
40. Feins R.H., Hilf R., Ross H., and Gibson S.L. Photodynamic therapy for human mesothelioma in the nude mouse. // J. Surg. Res. 1990. V. 49. P. 311-314.
41. Foster Т.Н., Hartley D.F., Nichols M.G., Hilf R. Fluence rate effects in photodynamic therapy of multicell tumor spheroids. // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 1249-1254.
42. Nichols M.G., Foster Т.Н. Oxygen diffusion and reaction kinetics in the photodynamic therapy of multicell tumor spheroids. // Phys. Med. Biol. 1994. V. 39. P. 2161-81.
43. Georgakoudi I., Foster Т.Н. Singlet oxygen- versus nonsinglet oxygen-mediated mechanisms of sensitizer photobleaching and their effects on photodynamic dosimetry. //J. Photochem. Photobiol. 1998. V. 67. P. 612-625.
44. Georgakoudi I., Nichols M.G. Foster Т.Н. The mechanism of Photofrin photobleaching and its consequences for photodynamic dosimetry. // J. Photochem. Photobiol. 1997. V. 65. P. 135-144.
45. Стратонников A.A., Ермишова H.B., Лощенов В.Б. Диагностика реакции капиллярного русла тканей на лазерное излучение. // Квантовая Электроника. 2002. Т. 32. №10. С. 917-922.
46. Stratonnikov A. A., Loschenov V.B. Evaluation of blood oxygen saturation in vivo from diffuse reflectance spectra. // J. Biomed. Optics. 2001. V. 6. P. 457-467.
47. Stewart F., Baas P., Star W. What does photodynamic therapy have to offer radiation oncologists (or their cancer patients)? // Radiother. Oncol. 1998. V. 48. P. 233-248.
48. Oleinick N.L., Morris R.L., Belichenko I. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why and how. // J. Photochem. Photobiol. Sci. 2002. V. l.P. 1-21.
49. Sun L., Chen H., et al. Photodissociation of Human Oxy-Hemoglobin Studied by Time-resolved Photoacoustic Calorimetiy. // Fifteenth Symposium on Thermophysical Properties. 2003. Boulder.
50. Butorina D.N., Bashtanov M.E., Krasnovsky A.A., Jr., Prieszev A.V. Effect of blood plasma on laser-excited singlet oxygen phosphorescence in aqueous buffer solutions of water-soluble porphyrins. // SPIE Proceedings. 2000. V. 4001. P. 385-389.
51. Butorina D.N., Krasnovsky A.A., Jr., Bashtanov M.E., Egorov S.Yu., Priezzev A.V. Kinetics of laser-induced phosphorescence of singlet molecular oxygen in aqueous porphyrin solutions. // SPIE Proceedings. 2001. V. 4241. P. 317-323.
52. Буторина Д.Н., Красновский A.A. мл., Приезжев А.В. Исследование кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в водных растворах порфиринов. Влияние детергентов и тушителя — азида натрия. // Биофизика. 2003. Т. 48. № 2. С. 201-209.
53. Bonnett R., Martinez G. Photobleaching of -sensitizers used in photodynamic therapy.//Tetrahedron. 2001. V. 57. P. 9513-9547. ' j
54. Mcllroy В., Mann Т., Dysart J., Wilson B. The effects of oxygenation and photosensitizer substrate binding on the use of fluorescence photobleaching as a dose metric for photodynamic therapy. // Vibrational Spectroscopy. 2002. V. 28. P. 25-35.
55. Moor A.C. Signaling pathways in cell death and survival after photodynamic therapy. // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2000. V. 57. P. 1-13.
56. Schmidt-Erfurth U.M, Michels S. Changes in confocal indocyanine green angiography through two years after photodynamic therapy with verteporfin. // Ophthalmology. 2003. V. 110. No. 7. P. 1306-14.
57. Wentworth P. Jr., Jones L.H., at al. Antibody catalysis of the oxidation of water. // Science. 2001. V. 7. No. 293(5536). P. 1806-1811.
58. Nieva J., Wentworth P.Jr. The antibody-catalyzed water oxidation pathway a new chemical arm to immune defense? // Trends Biochem Science. 2004. V. 29. No. 5. P. 274-278.
59. Parren P.W.H.I., Leusen J.H.W., Van de Winkel J.G.J. Antibody-catalyzed water oxidation: state-of-the-art immunity or ancient history? // TRENDS in Immunology. 2003. V. 24. No. 9. P. 467-469.
60. Moor A.C., Van der Veen A., et al. Shelf-life of photodynamically sterilized red cell concentrates with various numbers of white cells. // Transfusion. 1997. V. 37. No. 6. P. 592-600.
61. Frank B.J. Regulation volume decrease in carp red blood cells: mechanisms and oxygenation-dependency of volume-activated potassium and amino acid transport. //J. Experimental Biology. 1995. V. 198. P. 155-165.
62. Sato Y., Sato K. et al. Mechanism of free radical-induced hemolysis of human erythrocytes: comparison of calculated rate constants for hemolysis with experimental rate constants. // Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 366. No. 1. P. 61-69.
63. Mohanty J.G., Jafife J.S., Schulman E.S., Raible D.G. A highly sensitive fluorescent micro-assay of H202 release from activated human leukocytes using a dihydroxyphenoxazine derivative. //J. Immunol. Meth. 1997. V. 202. P. 133-41.
64. Mueller S., Riedel H.D., Stremmel W. Determination of catalase activity at physiological hydrogen peroxide concentrations. // Anal. Biochem. 1997. V. 245. P. 55-60.
65. Krasnovsky A.A. Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies. //Membr. Cell Biol. 1998. V. 12 No. 5. P. 665—90.
66. Гусев M.B., Минеева JI.А. Микробиология. // Издательство МГУ. 1992. Гл. 15.
67. Michal G., Mollering H., Siedel J., Methods of enzymatic analysis. // VCH Publishers. Weinheim. 1983. V. 1. P. 197—232.
68. Борисеикова C.A., Гиренко Е.Г., Калия О.Л. Механизмы окисления аскорбиновой кислоты и проблемы каталитической (темновой) терапии рака. // Российский химический журнал. 1998. T.XLII. №5. С. 111-116.
69. Сыркин А.Б., Жукова О.С. и др. Терафтал — новый препарат для бинарной каталитической терапии злокачественных опухолей. // Российский химический журнал. 1998. T.XLII. №5. С. 140-146.
70. Кортава М.А., Рябова А.В., Полозкова А.П. и др. Совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса. // Российский биотерапевтический журнал. 2005. №1. Том 4. С. 36-37.
