Исследование кинетики и механизма катализа окисления полиненасыщенных жирных кислот липоксигеназой в водных и органических средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ч ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ АН УКРАЇНИ

РГ5

0.1 .

, На правах рукопису

, МОГІЛЕВИЧ

Тетяна Василівна

ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИКИ ТА МЕХАНІЗМУ КАТАЛІЗУ ОКИСЛЕННЯ ПОЛІНЕНАСИЧЕНИХ ЖИРНИХ КИСЛОТ ЛІПОКСИГЕНАЗОЮ У ВОДНИХ ТА ОРГАНІЧНИХ СЕРЕДОВИЩАХ

02.00.10 — біоорганічна хімія, хімія природних та фізіологічно активних речовин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ — 1994

Дисертацією є рукопис.

, ■ Робота виконана .в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії . ЛН України

Наукові керівники:

академік АН України, доктор хімічках наук В. П. Кухар

кандидат хімічних наук І. А. Бутович

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Р. П. Виноградова доктор біологічних наук, професор В. К. Кібірєв .

Провідна організація: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна АН Україні'

■ Захист відбудеться «•1994 р. на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 016.65.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії ЛН України (253094 Київ, пул. Мурманська, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії АН України (253094 Київ, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 1994 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Д. М. Федоряк

Актуальність роботи. Дослідження ферментів, що беруть часть у оюсинтезі біологічно активних сполук, має ваяливе наченкя для розуміння тонких регуляторних процесів у організмах ослин, тварин та людини, створення нових лікарських засобів та ільськогосподарських препаратів. Ліпоксигенази (КФ І.ІЗ.ІІ.І2) аталізують окислення поліненасичених парних кислот (ПНЖК) до ідропероксидів, а такоа подальшу їх трансформацію до оксо-, ідрокси-, епокси- та інших похідних. Продукти цих реакцій є нтермедіатами біосинтезу лейкотриєнів, простагландинів, .іпоксинів, гєпоксилінів - взкливих біологічних регуляторів з їіроким спектром дії, та, як стало відомо в останні роки, мають ласну біологічну активність. Тому, механізм ліпоксигеназноі ©акції, а також біологічна роль похідних ПНлК є темоа нтєнсиених досліджень у нашій країні та за кордоном. Безперечно цкавим є застосування водорозчинних та іммобілізованнкх форм ішоксигеназ для препаративного одержання біологічно активних ігодук.

Прк дослідженні ліпоксигеназного каталізу та розробці «рментатквних методів синтезу похідних ПКНК за участи ііпоксигеназ ефективним мене - бути використання гетерофазішх ¡одних та водпо-отзганічких систем, які дозволяють вирі піти Фоблеми, ео пов"яз£Кі з обмеженою розчинні ста субстратів та іестаоїльністю продуктів реакції у водному еєредовиш.

Таким чином, вивчення кінетичних та каталітичних властк-іостєй ліпоксигеназ у різних системах та водно-органічних суш-зах, розроока методів їх іммобілізації та вивчення фергентатив-юго синтезу похідних жирних кислот за участю препаратів ¡ііпоксигоназ с актуальнім завданням біоорганічної хімії.

Мата роботи. Метою робота Суло порівняльне дослідження кінетичних закономірностей окислення лінолевої кислоти (ЛК), яке ізталізує ліпоксигенЕза-І з сосвих бобів (ЛО), у водному роз-иті. У водно-міцелярні Я системі детергенту та з обернених кі-делах поверхнево-активної речоьіпіи (ПАР) в органі чи ому розчиннику- В роботі планувалось вивчите кінетику окислення лінолевої {ислоти та її метилового ефіру (!.ЕЛК) з к-’.етов з'ясування рол: «врбокскльноі групи субстрату у зз"язувакш з {крмекточ. одесга-гт: препзсати і*^об:лізо5іакс.і л;локспгенази та ветчнта *х кета зі-

тичні властивості, а такок дослідити ферментативний сипте похідних ГКЖК с іх участю.

Наукова новизна. У роботі проведено порівняльне вивчені кінетичних параметрів окислення лінолевої кислоти ліпоксигс-назс у водному середовищі, у водно-міцелярній системі та з обернеш міцелах аерозоло ОТ (діігооктхисудьфосукциаату натрію) у октані а також кінаткни окислення ліпоксятоаазою лінолевої кислоти л її метилового ефіру (М2ДК). Досліджені кислотно-основні власті бос ті ЛК у водно-міцелярній системі дзтергента та запране нована фізнко-хімічна модель реакційної системи. Вперше отрикаї препарати ліпоксигенази, яку іммобілізовано на модифіковано? ксегліеземх, та дослідагані їх каталітичні зластизості. Bnspc розроблено спосіб одержання ІЗід-гідропероксиду лінолєві кислоти з використанням іммобілізованноі ліпоксигенази. Дослі, хено перетворення гідропзрокекда ЛК у водному та водн; органічному середовісдах під діез імг.шбілізозаноі ліпоксигенази

Практична значимість роботи. Отримані препарати формен’ можуть бути використані у сгарбосвлектквзому синтезі біологічз активних. похідних ¡хирних кислот. Дані по закономірностям раакц: окислоння ПйгК та їх похідних і каталітичним властивостям феї менту мокуть бути КОрИСНИМИ для більз глибокого розуглк механізму ліпоксигеназного каталізу і ролі ліпоксигеназ в орг; ні змах рослин, тварин та людини. ,

Апробація роботи. За темою дисертації опубліковано 5 дру» ваних робіт, одну статтю прийнято до друку- За матеріалами роб' ти було зроблено доповіді на всесоюзних та мі ¡¡¡народній кокф-ронціях.

Структура роботи. Дисертаційна робота складається з вступ двох' глав огляду літератури,, опису матеріалів та методі результатів та обговорення, висновків, списку цитованої літ ратури та списку публікацій автора за темо» дисортаці Дисертацію викладено на 125 сторінках друкованого тексту ілюстровано 4 таблицями, 3 схемами та 33 малюнками.

ЕКСПЕРЖЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

У роботі використано ліпоксигеназу-І з соєвих бобів фі Fluka та Олайне (обернені міцели), лінолзву кислоту 89%, лубї РХ фірми Sigma, аерозоль ОТ (Piuka), пористі кремнеземні нос

Іірог 030, (ЧСФР), сплогрсм АСХ 1.5, {Рэгасім, СРС?) з розміром сткнок 0,125-0,ІБ та 0,25-0,5 ізл зідповідчо, асросЕЛ-175 эах:м). Для ікиобШзваії Арменту яовзршо носія обробляли АЛТЕС для введення аміногруп, які потім актавувакп глутаровкм

ЬДОГІДОМ.

Активність розчинної та іктобілізоваклсї лшокскгензз:: сначала спвктрофотокетрячко за кбільхеїгояа оптичного поглкнан-реакційноі суміш прі доксзі хв?*лі 235 им, со відповідає КСИМУМУ поглшієиія спряденого дієноесго хромогіору в молекулі одуі:ту - идроперокогаа лінолевоі кислоти, а таксу, за змгншзн-

ч концентрації клени у сіютємі в дсді фгруззтагсівкої рзакції допомогою :с:сі;сівого електроду Клерка.

Обернеш ш цвет ПАР у октгні, с;о містять фзрмэнт, р:»»увази за методо;.: ї/зртишка К. та слівр. (1977). '

Математичну обробку ехепаркме-нталт-ло»: даних здійснк?2-та па ОМ за програмою ЛгліііЬ^г.

. РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

І. Кінєтігкз дії ліполслгенази у водному мредовгаї.

К-ззвалаїтці на порігнкно _бэ.,32-п^1. обсяг ексгерц^ентальніз:

зшх. накогсгчпшіх для ліг:окспгеназй-І з соєвих бобі з, механізм

і форманту остаточно не з"ясозано, п;о обуговязз актуальність

зетігїнкх дослідхєеь. ЛО каталізує окнелегал дгнодевоі к;;слогл

і ІЗ-гідропзтокскда:

" ’ . - сон

Р н сосн

1 ТІ»

І 2 3 1 3 Я ~С Н

2 і 3.1

роботі було визначено кіпатотні параметри цієї реакції Ззлех-сть стаціонарної ниїдкссп реакції (?зі) від велгппги pH гаг ігллд крізоі, Ер виходить нз плато при pH Э-!І (Узл. І). Сглеж-сть V 4 від концентрації субстрату описується рівнянням Міхае-са-Ис-нтен у діппазош концентратЯ 0,003-0,100 кМ. Прп збіль-ікні концентрації субстрату спостерігається інгібування субгратом. Значенім рК„, константи Шхаеліса та ¡гзкетаально; ееяд->сті реакції подано у тгблігці І. Отрігмзні результата дослідзйн-! кзкетцкц складення ЛК ліпоксигоназогі с б.-ізілсг:.’. ‘ до :лзеД5НИ£ у лггературізіг джерелах (2таоп<1 М.К., 1972).

Л-ге*

З

Мал. І. Залежність стаціонарної швидкості ' реакції від pH: І(*,

—) - розчинна форма ЛО, субстрат --ЛК; 2(+,

—) - розчинна форма ЛО, субстрат - ЛК, .

0,02% луброл РХ; 3(о,--) - розчинна ЛО, субстрат - МЕЛК, 0,02%

луброл РХ; 4(в,......) - ■

іммобілізована. лі-покспгеназа, ЛК. Значення Y t нормовані.

За одиниця прийняті 1 значення швидкості реакції при pH 9,5-10. Концентрація субстрату - 0,1 мМ.

У роботі було Проведено порівняльне ДОСЛІДК0ННЯ КІК9ТЯЧНИ закономірностей окислення ферментом лінолевоi кислоти та її ке "тилового)ефіру. МЕЛК, який не іонізується, в практично нарозчин ним у воді за будь яких значень pH, що ускладнює спектрофотс метричну реєстрацію кінетичних кривих. Тому Зерментативя реакцію проводили в присутності міцелоутворшчої концентраці детергента луброла РХ, що дозволяє солюбілізувати жирнокислота субстрати шляхом утворення мішаних міцел Ж(або МЕЛК)/Ш (Шенфельд Н., 1982), внаслідок чого мутність реакційної суміп зменшується. '

Вбудовування жирної кислоти у міцелу могло викликати змії її властивостей, насамперед, кислотно-основних. Тому у робот було визначено залежність ступеню іонізації лінолевої кислоти 0,02% розчині лубролу РХ від pH. Розрахунки параметрів одержане кривої двома незалежними' математичними методами - сплайн-апрої симацією з наступним чисельним диференціюванням та за рівняння!

а = 2 ai*I0pH-pKai/(І+І0Р pKa^) І,

(де а - ступінь іонізації кислоти, і - кількість форм кислоті що відрізняються значеннями рКа, а^ - мольна, доля і-го кої поненту), дозволили достовірно визначити присутність у систеї двох основних форм лінолевої кислоти, з різними мольними доляї та ріі , ¡до дорівнюють 6,5+0,1 та 8,5+0,1. Обидва значення ві,

різняться від. значень рК^ водорозчинних карбонових кислот -4,5-5,0. Зміни кислотно-основних властивостей лінолевої кислоти при її вбудовуванні у міцелу можуть бути пов"ягані з існуванням між поверхнею міцел та об'ємом розчину різниці потенціалів та зміною pH біля поверхні внаслідок перерозподілу розчинених

іонів. При використанні луброла РХ, конденсата олігоетилен-гліколя та жирного спирту, у прилеглому шарі розчину концентруються протони, і локальне значення pH став більш "кислим"

порівняно з pH в об"емі розчині'. • ■ ■

Ця гіпотеза підтверджується при дос-

лідженні . іонізації гідрофобного кислотноосновного індикатора бромтимолового синього (БТС), криві титрування якого . у водно-міцелярній системі

зміщені на 2 одиниці pH у більш лужну область порівняно з водним розчином (Мал. 2).

Величина 'та напрям ефекту, що спостерігається, однакові для ЛК та БТС.

Друге значення

рКа, ио дорівнює 8,5+

0,1, можна віднести до титрування дилерів ЛІнолебої кислоти у вуглеводневому ядрі міцели. Таким чином, кислотно-основні властивості лінолевої кислоти у водно-міцелярній системі відрізняються від таких у водному розчині, ¡до необхідно враховувати при дослідженні окислення жирнокислотних субстратів (ЛК та !.!ЕЛК) ліпоксигеназою в присутності лубролу РХ.

Ліпоксигеназа-І здатна каталізувати окислення ІЇЗЛК, хоча значення v t у цьому випадку у ю разів нижче, ніж при окисленні неетерифікованого субстрату. Залежність vsi від pH як для ЛН, так і для »JEJIK мають вигляд кривої, що виходить на плато Пізл.

Мал. 2. Іонізація рН-індикатора бромтимолового синього у еоді (+,- -) та у 0,02:» розчині лубролу РХ (о.—).

2-і р*

І). Але для метильованого субстрату спостерігається зміщення початку плато у більш лухну область порівняно в кривою для Ж. Злачення рК& ферменту були розраховані за модифікованою /“'-функцією Кіхазліса .

ї0І- = Тор(/( 1+10^-/1 орн) + с 2,

Д9 С - et.cnркчна константа, що відбиває кеферкентативний процес (таблиця І). 5 малюнка видно, що ефект зміщення кривої подібний до наведеного для лінолєбоі кислоти та БТС, вбудованих чи сортованих на міцелі детергенту.

. Таблиця І

Кінетичні параметри окислення лінолєеої кислоти (ЛК) та і і «етилового ефіру (ШШК) ліпоксіїгеназою-І з соєвих бобів. •

Субстрат Залакність Значейня параметрів

ЛК Рівняння . ■ 1-Ц=0,015+0,002мМ '

ї.,і хаеді са-Ментен V =16,6+0,7 мкмоль/ХБ

/^-функція Шхаел іса рК„=7,22+0,05

ЛК Ріьняння ‘ ^,=0,149+0,015 мМ

(0,02" Мі хаеліса-Мзнтен ^га„=8,09±0,30 ККМОЛЬ/ХВ

луброл РХ) ^„=0,054

Рівняння 2 . рКа=6,8±0,І -

КЕЛК РіЕКЯПНЯ с Кп=0,060+0,005 мМ

(0,02 а. Ніхаеліса-Ментен Ута2і_0’32і0,03 МКМ0ЛЬ/'ХВ

луброл РХ) . ^ах^0’015

Рі вняпня 2 рКа=3,4їО,І

Різниця рН-залежностей езкдкості реакції для МЕЛК та Ж відбиває, можливо, різну локалізацій ферментативного процесу у гетерофазній міцелярній системі. Метиловий ефір, якій не іонізується, при розчиненні у системі з лубродом повністю вбудовується у міцелі: детергенту (Бутович і.А., 1992), тоді як ліеолєей кислота розподіляється міх; міцелами та оС'єком розчину. Таким чином, окислення метильованого субстрату відбувається поблизу поверхні міцели, б яку вбудований М2ЛК, а у випадку з Ж ліг.окскгеназа діє на субстрат, що знаходиться в об"ємі розчину.

Зелєїність V ^ бід концентрації субстрату як для лінодевої

кислота, так і для і і метилового ефіру з присутності дуброду описусться рівнянням .’.іїхполїс-'-'/єнтєіі у діапазоні рК С,С25-0,ІС0 Nil та 0,0125-0,5000 у}/,, відповідпо.

Значення кінетичних .параметрів представлені б таблиці І. Відношення 7 /к,{, 'зо хзргктвразув специфічність ферменту до

того чи іншого субстрату (Сьсрщт Е., І9ЄО.), для ЛН У 3,5 р.іги в:иде. ні:х для !ЛЕЛК, тобто ліпскситеназа більш специфічна до кеметильованої, іонізованої .icpv.ii субстрату. Відмінність значень s.j за д шолэвою кислото» та і і ефіром можна пояснити на основі припущення про різну локалізацію ферментативного процесу у гетеро£озніі1 системі. Уятага збільшення константи у випадку з ЛК пов"язанз, мо-іл:.ібо. з внклвчонням чзстізи субстрату із сфери реакції за рахунок вбудовування у міцелії ПАР.

2. Каталітичні властивості діпоксигенази. до включена до обернених міел аерозоль ОТ у октані.

Дослідження • кінетичних закономірностей ліпоксигеназного окислення ГШЗК, а такок використання ліпоксигеназ для одержання природних їктгболітіз "зірки: кислот ускладнені низькою розчкп-ністю субсттзгтів та нестабільністю деяких продуктів реакції у водному середовищ. Мої-ТІІЕЄ Еііршоїшя цієї проблеми полягає у перенесенні ферментативної реакції з годного розчину У водно-орггнічні системи. Одним із способів збереження каталітичної активності ферментів в органічних розчинниках в включення їх до обернених міцел ПАР. Гему нотою роботи було дослідження каталітичних властивостей ліпоксигеназп-І з соєвих бобів у обернених міцелах ПАР в органічному розчиннику.

При виборі системі обернених міцел для включення ферменту було досліджено вплив різних детергентів на його активність. Встановлено, ідо катіонні (цетилтрнматплзмоніЛ бромистій, трикзп-ридметиламоіий хлористий), аніонний (аерозоль ОТ) та не іонні (ТВІН 20, тритон ХІОО, луброл РХ) інгібують фермент З ІС50 0,5-I мМ, 4 мМ, 6-3 мМ, відповідно. 0

Зало.'кність V t реакції, яку каталізує: ЛО, що включена до обернених міцел аерозолю ОТ в октані, від pH має вигляд кривої, що виходить на плато при лужній-: значеннях pH, однак, порівняю з тією н залежністю для реакції у водному середовищі спостерігається зміщення початку плато у бідьд лужну область, котре т.^л

сильніше, чим нижче ступінь гідратації, ї?0. Уявні значення рКа, що були розраховані за /^"-функцією Міхаеліса, складали 8,5±0,] для «о=20 та 8,87+0,06 для її0, що на 1,3-І,7 одиниць вище, ніз для Л0 у водному середовищі. Цей ефект пов"язаний з аніонної природою детергенту та концентруванням протонів біля заряджено: поверхні міцел. При збільшенні у міцелах з"являється ВІЛЬНІ вода, яка не. бере участі у гідратації полярних груп ПАР, ; локальне значення .pH водно! порожнини міцел наближається до р! солюбілізованного водного розчину. .Тому крива залежност: шеидкості реакції від pH зменшується у меншій мірі. .

Мал. 3. Залежність стаціонарної швидкості окислення ЛК лі-поксигеназою, що включена до обернених міцел, від концантра-ці 1 субстрату: крива І - апроксимація за рівнянням Міхаеліса-Ментен, крива 2 - апроксимація за рівнян-

ням Хіла.

*23,

20,0 16,0 12,0 ■ 8,0 • 4,0

0,2

Залежність шбїїд—■ 0,0

кості реакції від концентрації субстрату була дослідаена в інтервалі значень Б0 від 0,025 до 1,33 м!.І при значенні ступеню гідратації 23. Значення константи Міхааліс та максимальної швидкості реакції складали 0,437+0,037 мМ т 0,693і0,02б мкмоль/хв, відповідно. Однак, при малих значеннях и спостерігається, відхилення від гіперболічної кривої. Пр розрахунку цієї залежності за рівнянням Хіла коефіцієнт Хіла» її дорівнював 1,22+0,03 . Таким чином, можна стверджувати, що лі поксигеназа в обернених міцелах вияеляє позитивну кооперг тішШсть за субстратом.

Значення ступеню гідратації обернених мі.цел, за яким аі тивність включеної ліпоксигенази максимальна, виявлено такім, п дорівнює 20-23. Радіус внутрішньої порожніти міцел при певно.

значенні wQ можна оцінити за рівнянням 3 (Левашов A.B., 1988):

, • гм(км) = 0,4 + 0,I5WQ З

Для оцішш радіусів молекул ферментів використовують дані по їх молекулярним масам. Для найпростіпої моделі - куля з густиною 1,2 г/см3 - радіус молекули білку, гб, зв"язаннй з його молекулярною масою, м , співвідношення;« 4 (те а джерело): гб(нм) = 0,07(мб)1/3 . ’ 4

Розраховані за рівняннями 3 та 4 значення радіусів внутрішньої порожнини міцели та молекули ліпоксигонази дорівняють 3,4-3,85 та 3,25 нм відповідно, тобто максимальна активність ферменту виявляється в умовах, коли розміри внутрішньої порожнини міцели близькі до розмірів глобули білку. ■

Активність ліпоксигенази у системі обернених міцел залежить від концентраці і детергенту - аерозолю О'Г та максимальна при ії значенні 0,03 мМ.

3. Каталітичні властивості ліпоксигенази, що іммобілізована на модифікованому кремнеземі

Унікальні каталітичні властивості ферментів (висока питома активність, специфічність, функціонування при кімнатній температурі та нормальному тиску) дозволяють використовувати іх для одержання різноманітних природних сполук у лабораторних та промислових масштабах. Ферментативний каталіз мав особливі переваги у синтезі малих кількостей речовин, що мають високу біологічну активність. Це в повній мірі відноситься до продуктів лі-поксигеназного окислення ПИЯК. В тонкому органічному синтезі всз найчастіше використовують іммобілізовані ферменти. Тому метою роботи було одержання препаратів іммобілізованої ліпоксигенази, дослідження їх каталітичних властивостей та використання у синтезі похідних ПКНК..

Носієм для іммобілізації було обрано пористий кремнезем, • який має достатня хімічну та механічну стійкість, не набрякає, не підлягає мікробіологічній деструкції та зручний у використанні з проточних роакторах завдяки його нестисливості.

В роботі була досліджена кінетика окислення Ж ліпоксигена-зою, що іммобілізована на амІносиліпорі-030, активованому глу-таровим альдегідом (ГА-гм;носиліпорі). Залежність 7 ^ від pH приведена на мялижу І. Загальний вигляд кривої та оптимальна

Э

значеная pH співпадають з даними, одер^аіБг.ії для неішобіліоо-взного форменту. Зшг.сеїінл активності і мобілізованої ліпокслге-КЭЗИ при pH 10,5 І В1ПД6 МОЖЭ бути П0В"ЯЗаНЗ 3 ВІДСІЛОЮ деструкціє» ярвкнзззмноі матриці у лузному середовищі. Для цієї фор;,и форманту, ка відміну від рсзчігчної фор?,и ліпоксигеназн, ктг.іез рК-залекності ивздасості реакції описується рівнянням 2. Розрахована значення рК С«ркеіггу, 7,50;0,І6, є близьким до такого для розчинної фор;,и (7,22±0,С5). Мабуть, іммобілізація ліпоксигонази не спричиняє змін кислотно-основних властивостей амінокислотних залишків ферменту, ¡до відповідають за каталіз.

Залежність y t від 'концантраціі субстрату описується рівнянням Міхзеліоа-Ментвн у діапазоні концентрацій 0,02-0,10 Величина Кы дорівнює 0,102+0,020 мМ. При іммобілізації ліііок-сигеназа зберігає від 4 до 14% вихідної активності. За цих умов зі збільшенням кількості зв"язаного ферменту питома активність ■препарату (з розрахунку на І г іммобілізованого білку) знижувалась. Це яеищє моиз бути наслідком впливу дифузії субстрату чи продукту в порах носія на процес каталізу (Еерезін І.В., IS35). Ка користь останнього ствердження свідчить той факт, ідо для лі' поксигенази, - яка і;,~;обілізована тіш же способом на модифікованому кремнеземі, ідо не має пор, - ааросплі, ступінь зберігання активності становив 16-20%.

Для дослідження впливу способу зв"язування ферменту з носієм на активність препарату в роботі було визначено актив-•ність препаратів іммобілізованої ЛО, цо відрізняються типом зв*язку білок-носій (таблиця 2). Найбільш високу активність виявили препарати форкенту, що-І) ссрбований на амінокремнеземі,

2)іммобілізований на ГА-амінокремнеземі, 3) іммобілізований на карбоксикромнеземі, активованому N-гідроксисукцинімідом.

4. Одзраання1гідропероксиду лінолевої кислоти з використанням іммобілізованої ліпоксигенази.

Препарат лі поксигенази з соєвих бобів, ідо іммобілізована на ГА-аміносіліпорі, було використано для одержання ІЗЬд-гідро-пероксиду лінолевої кислоти (Бутович I.A., Авт. св. N I631036, CPCP, IS38). Еихід продукту склав 96-98% (до 50 мг продукту/І г кремнезему/ день). Препарат лизався стабільним на протязі тижня гтри безперервній роботі на протязі 12 годин на день.

ТО

- Таблиця 2.

ікткенїсть препаратів іг.иобілізованоі ліпсксигєнасп

5 рІЗНИМ типом зв"ягху білок-носій.

Зпссіб 35"язування Ступікь ял і .ЇВі*іі о ть,

:а косій зв"лзувакня, % од./г носія

іСХ-1,5, активований глутзровим

ільдегідсм ■ 100 1,11

іСХ-1,5. актга?ова?л:й хлористим

цанурси ICO 0,05

іСХ-1,5, обробленій янтарши .

:нгідридо7 та активований

г-ІІІ ТрСф-ЗНОЛОМ О О Ы 0,03

.0Y.-I, Б, оброблений янтарілял

інидридом' то активований

г-гі дроксксукцкніш дом 92 1,47

.СХ-1,5 ' 100 0,70

.СХ-1,5, оброблений янтарним

нгі дридом 100 0,СЗ

Silipcr 030", обрсблзіптЛ

-АПТЕС . 100 2,13

Silipor 030", обооблзккй

-ТПТЗС :оо і'єіікт.

Одэретккй прбпьрзт Суп достатньо чистим за де;~ж КЗС

ТИ&стаНЯ Кісс<*І£ЄІ 60 ?2,-4> (Merck), CKCT-JVa ГОКСШПДІЄ'ПЇ.ЮЕіД фір= Є5:25) та 0Ї< ЗЕРХ (колонка Liehr-cscrb ?? 18, £50x4, елюент етаіюл:ЕОДз:оцтова к:їслот2=70:2С:0,0і ). Час вигод? продукту до а після відновлення Сорпдрздсм ньтрів оСо тр:-:-ї*н:лфсоїіном кладаз Є9,9 та Є2.7 хв відповідно.

Присутність гідроперохсидкої групи у молекулі продукту бу^;о г.значено за спеціїфі’-Пїоїт реакцією з Н,ії-дікгтал-гнїйшл9ндігкі-ОМ. Максимум пріт 235 К>,1 Б УО-С7І5КТРІ поглинання одсркзттого ГІД-оперокскду (розчішкик - метанол) свідчить про утзэр-кнл спряпда-сго дісяоього хромофору. У ІК-спектрі поглинання прод.-кту CCI, ) = ЗБ60 см-1 відповідав валентні™ чолэакяям ЗЕ"яэку 0-Н

■4 ...

ідроперокс’Шіоі групи.

Одергзгпйі пдрсп'фоксіід відновили бсрпдркдсч нзтріп.

етерифікувалк діазометаном та аналізували методом 1Н~ЯМР (300 МГц, CDCij, ТМС як внутрішній стандарт). Фрагмент спектру С 2,18 м.д:,дт, (ІН, J=7,5 Гц, ,J=7,Б Гц), Є 5,43 м.д., м, (ІН, J=7,8 Гц, J=IO,B Гц), Ô 5,97 м.д., т, (ІН, J=II,I Гц), Є 6,48 м.д., м, (ІН, J=I0,8 Гц,' J=I5 Гц), Б-5,66 м.д., дд, (ІН, J=6,9 Гц, J=I5,3 Гц), б 4,17 м.д., дд, (ІН,- J=6,6 Гц, J=I3,5 Гц), 6 1,35 м.д., м, 6 1,75 м.д., с. співпадає з даними літератури (Van Os O.P.A., 1980) та підтверджує структуру сполуки.

Одержаний продукт виявляє оптичну активність, [а]“=-8°, що е близьким до значення, визначеного для ІЗІ^-гідропероксида дінолевоі кислоти у роботі laoazio G. (1990).

5. Дослідження перетворення гідроперокисду лінолевої кислоти під дією іммобілізованої ліпоксйгенази. .

Актуальність дослідження біосинтезу та біологічної ролі продуктів перетворення гідропероксидів ПНЖК під дією ліпокси-геназ з різних джерел зумовлена виявленою різноманітною біологічною активністю цих сполук. Обмежена розчинність субстратів та нестійкість деяких продуктів реакції у водному, розчині потребують застосування нетрадиційних середовищ для проведення реакції, таких, як, наприклад, водно-органічні суміші. Тому у роботі була досліджена трансформація ТТШК б присутності Ж під дією ліпоксигбнззн, що іммобілізована на ГА-амінокремнеземі, у водному та водно-органічному середовищі.

Продуктами анаеробного пербтворення ГПЛК в присутності ЛК під дією ЛО-І з соєвих бобів у водному розчині.є ІЗ-оксооктаде-кадієнова та ІЗ-оксотридекадієнова кислоти, пентан, епоксіїгід-рокскпохідні та їзірнокислотні димери (Garseen G.J., 1972.).

Для проведення реакції були використані так; системи: І) водний розчин; ЛК, концентрація якої значно перевищує концентрацію кисню, або ЛК та ГПЛК в анаеробних умовах; розчинна форма ліпоксигенази; 2) водний розчин; ЛК, концентрація якої значно шревицує концентрацію кисню, або ЛК та ГПЛК в анаеробних умовах; іммобілізована ліпоксигеназа; 3) октан; ЛК, концентрат я якоі значно перевищує концентрацію кисню е системі, або ЛК та ГПЛК е анаеробних умовах; іммобілізована лшоксигеназа.

Про хід ферментативної роакції свідчить зростання оптичної густини при Я =230 нм в У£-спектрі поглинання реакційної суміш,

що відповідає поглинанню оксопохідних лінолевої кислоти (Мал. 4).

Мял. 4. Зміни оптичного поглинання реакційної суміші у ході ферментативної реакції. Склад суміші:

0,1 М натрій-боратний буферний розчин, ЛК (0,5 ММ), ЛІП0КСИГ9-наза (0,016 мг/мл).

Ді=2,5 хв.

При Еикористан-ні термоінактквовано-го іммобілізованого ферменту продукти

реакції утворюються у кількостях, зо відповідають процесам зутоокислання та не-ферментатіїЕИОго перегрупування ПШ. Це 200 220 240 260 280 А, им

дозволяв виключити

можливість каталізу

носієм. ■

У роботі було досліджено якісний склад продуктів реакції в описаних системах. На малюнку 5 привалено розділення суміші продуктів реакції у.системах, що були використані УегЬа^еп 3. (1980) та сіаеиз 3. (1985) - системи А та Б, відповідно. Визначені значення Нг основних компонентів -' димарів лінолевої кислоти, . оксокислот, гідроксиду, гідрспароксиду, епоксигідрокси- та тригідроксипохідних лінолевої кислоти - в близькими до значень, визначених авторами цих робіт. Крім того, сполука II поглинав в УФ-області спектру, \тг>у. (МеОН)=23І нм. і водночас е наймеш полярною з одержаних продуктів, що дсззолило відноста її до димеріз ЛК та і і похідних. Компонента III та VI, що ідентифіковані як ' ІЗ-оксосктадекадієнова та ЇЗ-оксотридекадіє-

новз кислоти відаовідно,. також мають погашання в УФ-області

ІЗ

лггах III- (ИсСН)- ’ ' mar VI (ІіеОН)^'0’^ і1іЛ'

даать характерно забарвлення з дінітрофзнілгідразкко;-;. Останній, як відомо, реагує з альдогідамк та кетонами.

Мал. 5. Хроматограма сррсж? І

суміш продуктів фер- s ІІ

ментативної реакції на ■ т

пластинах Kiuselgal 60 ■

Г254 (Msrck) у системах А - гексан: ді етиловій ефі р=Є0:40 . Т І «і-р ! іет^ 1 ¿7-1 - ^ fV •л ‘-'a u»

та Б - етилацетат: ізооктан:оцтова кисло-та:ЕОда=І0:Є:2:10. г * * S{ • "K.J *п> І «£S> j ' С ! & Í >

Склад реакційної сумі — сі: І> водний розчин, • Су ts» I ЦО <►'•> J ‘ «йм. 1 cc*>

ЛК (ЛК+ГПЛК), розчинна сгхрг 1

форма ЛО, 2) октан, ЛК t'j t г ¡r¿x ш i j ¿7 5

(ЛК+ГПЯК), ЛО, со іммобілізована на ГА-силіпорі, 3) водній розчин, ЛК(ЛК+ИІЛК), лі-поксжгоназа, цо іммобілізовано на сфорокі 300. .

Uíüiwyiúi поглинання в ІК-спзктраї компонентів НІ та ті -т>ТТІ=ІЄ54. га.Г1 та г’ут=ІБ80 сг.Г1 - свідчать про присутність оксо-(-5=0) та альдегідної (-Н0=-0) груп, відповідно. Сполуки ти та VIII не поглинають в ультрафіолетовій області спектру.

Якісні склади продуктів раакції з іимобілізсванлоа ліпоксигеназоз у водно.\:у середовищі та у водно-органічній сумші ідзнтичні і, в основному, схокі з таким для реакції з нетло-білізованозо ліпоксіггеназоз у водному розчині. Відсутність серед продуктів реакції з іммобілізованою ЛО ІЗ-оксотрпд&кадісновоі кислоти та Екрнокнслотнлх дилерів мске бути пов"язанз з особливостям; носія. У цьому 5Б"язку показовім с той факт, що.при проведенні цієї г. р&аісції за участю ЛО, цо іммобілізована на органічно:.^ носії сфарош 300, названі сполуки утвориться і склад продуктів повністю співпадає з такім для реакції з розчинна:) формо» ферменту у водному серодовті.

висновки

1. Пра порівняльному досліхгянн* кхнеткхл оккзлення ЛПЮЛЭ-

EOÍ кислоті; та «егалового ефіру лінслевоі кзслоти лшокслгона-3023—1 з соєвих бобі з еияел-зно, що фзржшт білка специфічний до неетогг'фіі'ОЕ-лнсі, іонізованої форми субстрату, з такс:? ™тлстосо-E8HJÄ до окислсзня гаїрноі іетслоти, яка ноіитвгроЕгна нхцехярнї Структурі!. •

2. Виявлені зміни гсіслотао-оскстглх злаотпвостэЗ субстрпту

- ЛХНОЛ9ЕОЇ кислоти - внаслідок її вбудовування у ШЦР.П; детергенту, а таксл присутність іі у цій с;:с?в:л у двох основних г5орках - v.OHCi.repKitî та діолернтй.

3. їїри дослідївгс-п впливу різних дотерголтіз нп активність лі~скс:їг8іїози зстзноелзко, цо лайбільп інгібуп’гь фзр?:іііт каті сліп ПАР. Визначені оптігдальш угивн прсгэдэкня psaxnii с:-"іслгння лінол-зеоі кислоти ліпоісст-тгопааоо з сосепх бобів з еберкзнпх міцелах аерозолю О? з октант. Сзртант у цій спстетл глязхяз позитивну неоперативність за ліполоеоз ісгслотсз. За сигнального ступеню пдратаціі розміри внутрішньої псрохяіпкл гйцэд s б.’птзь-кп.сі до розмірів колегу лі фзрмонту.

■і. Одоркап ксталі нічно а.чт::пні препарата лшоксягзназп, г,о ім.ісбілізсБГ-їіа на модифікованому кремнеземі. НаГ-більлу активність їловть препарати Фер-глеиту, лкгй сор'ованкй па слінскрз’-гно-зо?4І, а такса хімі’Піо тжобілізов.іш.й нз смпісхрз:с:впєкї, гктх:-всзазому глутароні".’ альдегіде:-'. та :арбокс-,:їр:к!їе:?5;лі. гт.тазепа-::ому и-гі дрскс-лсуіаизі m дом.

5. Розроблено спосіб с'гэр-зоселэктлвпсгэ еингезу ІЗХід-п.зро-сероксвду лінолєеоі кислотл з ваг'.ор'лстащпм ік'.збіліаозаноі ліпоксіїгекази.

S. Проведена трансформація ГПЛК під дів» іммобілізованої ліпоксі'генази у зодноиу та нодно-органі-пому саседовндзх. Склад продуктів, що утьорюзться, s подібним до такого для реакції під дією розчинної фзргяі ферменту у водному розчині, до вказуч на перспективність, використання ії.о.іобілізовакої ліпснснгекази лля синтозу різноманітних тлзтаболітів 1КЯ.

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ПКлл - П0ліП6нес:пєні мірні га’.слотії; ЛО - ліпоксдгеназа-І з соє-

вігх бобів; ЛК - лінолева кислота; ЫЕЛК - метиловий ефір лінолєеоі кислоти; V t - стаціонарна швидкість реакції; АСХ-1,5 - амі-носилсхром-1,5; ПАР - поверхнево-активна речовина; wQ - ступінь гідратації; ГА-аміносішпор - аміноскліпор, активований гдутаровнм альдегідом; аерозоль ОТ СЛОТ) - діізооктилсульфо-сукцинат натрію; 7-АІЇТЕС - 7-ашнопропзлтриетоксисилан; ГПЛК -пдропероксид лінолевоі кислоти; БТС - бромткмоловий синій, 7-ТПГЕС - 7-тіопропі лтриетоксксилан , І! є ОН - метанол.

. СІШСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЇМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ .

1. Бутович И.А., Могелєвич Т.В., Кухарь В.П. Активность липоксигеназы, включенной в обращенные мицеллы аэрозоля ОТ б октане// Укр. биоым. журз. 1989. Т. 61. к 2. С. 54-53.

2. Бутович И.А., Цысь Е.В., Могилевич Т.В., Кухарь В.П. Влияние физико-химических факторов на липокснгеназное окисление линолєеоЯ кислоты// Биоорган.- химия. 1991. Т. 17. fi 9. С. 1273-1280.■

3. Еутович К.А., Цысь Е.В., Могилевич Т.В. Окисление линэлевой кислоты к мэтиллкнолеата липоксигенгзші из картофеля и сойеых бобов// Биохимия. 1992. Т. 57, вып. 10. С. 1472- 1480.

4. Бутович И.А., Могилэвич Т.В., О гий С. А.Кутняя Ы.Ю., Кухарь В.П. Каталитические свойства липоксигенази из соевых бобов, иммобилизованной на модифицированном кремнеземе// Бкоорган. химия. - ъ печати. .

5. Бутович И.А., Кухарь В.П., Цысь Е.В., Бридня В.П., !.!огилавич Ї.В. ферментативное регио- и стереос&локтивное окисление полкненасыгекныл гирных кислот - альтернативный подход к синтезу лейкотриенов// Тез. докл. ті Всес. сига, по кнж. энзимологии. Вильнюс. 1983. с. 114.

6. Бутович К.А., Ыогклевич Т.В., Цысь E-В., Кухарь В.П. Препаративный ферментативный синтез вйкозаноидов и их аналогов с помоаью лппоксигеназ// Тез. 'докл. Гі Всес. конф. "Синтез и исследование простагландинов". Шшск. 1939. с. 108.

?. Igor A. Butovioh, Tatyana V. Vogilevich, Sergey A. Ohiy. Synthesis of 13 (S )-hydroperoxylinoleio acid by і.-тооЬі2 Ised soybean lipozyg enase./ 3rd internatiorial conference or, lipid raediatoro in health & disease (XiQiD). Jerusalens, Icrael. Oct. 31 - Nov. 4, 1933. P. 1.20.

S' J 1___

. ■ r-C, _

/ 1-Ю1