Исследование механизмов реакций S-центрированных радикалов и нуклеофилов с нитронными спиновыми ловушками методами ЯМР и ЭПР тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

На правах рукописи

Потапенко Дмитрий Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕАКЦИЙ S-ЦЕНТРИРОВАННЫХ РАДИКАЛОВ И НУКЛЕОФИЛОВ С НИТРОННЫМИ СПИНОВЫМИ ЛОВУШКАМИ МЕТОДАМИ ЯМР И ЭПР

01.04.17 - Химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Международном томографическом центре Сибирского отделения Российской академии наук

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор физико-математических наук, профессор Е.Г. Багрянская

доктор химических наук, В.В. Храмиов

доктор химических наук, профессор В.Ф. Плюснин

доктор биологических наук, профессор А.Ф. Ванин

Новосибирский институт органической химии им НН Ворожцова СО РАН

Защита состоится.

20

октября_ 2004 г в ' ^часов

г в г в

зо

на заседании диссертационного совета К 003 014 01

в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения Российской академии наук по адресу. 630090, Новосибирск 90, ул Институтская 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Института Химической Кинетики и Горения СО РАН и Международного томографического центра СО РАН

Автореферат разослан

_сентября_ 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук, профессор

1111 Грицаи

2005-4 13496

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При детектировании короткоживущих радикалов, в том числе in vivo, в большинстве работ применялся метод спиновых ловушек. В основе данного метода лежит реакция короткоживущих радикалов со специально подобранными химическими соединениями - спиновыми ловушками. Образующийся в результате реакции радикальный аддукт обычно представляет собой устойчивый нитроксильный радикал, спектр ЭПР которого несет информацию о котороткоживущем предшественнике. К настоящему моменту в литературе присутствует большое количество публикаций о регистрации радикальных аддуктов спиновых ловушек с S-центрированными короткоживущими радикалами, в том числе in vivo. Образование последних часто рассматривают в качестве одного из доказательств присутствия короткоживущих радикалов in vivo и токсичности сульфита. К сожалению, большинство публикуемых работ обладают существенным недостатком - образование радикальных аддуктов однозначно интерпретируется как присутствие короткоживущего радикала в системе и мало внимания уделяется рассмотрению других возможных механизмов образования данных аддуктов.

SH-содержащие соединения играют важную роль в организме: структурная функция, центр множества ферментов, окислительно-восстановительный буфер клеточной среды, основной барьер защиты от окислительного стресса и т.д. Все существующие к настоящему времени методы измерения концентраций данных соединений так или иначе основываются на их выделении, что не позволяет применять данные методики непосредственно in vivo. Недавно в Новосибирске был предложен метод определения концентраций SH-соединений, основанный на использовании дисульфид-бирадикалов и ЭПР спектроскопии. Детектирование нитроксильных монорадикальных компонентов, образующихся по механизму реакции тиол-дисульфидного обмена, позволяет сделать вывод о концентрации тиола. Однако высокая скорость восстановления нитроксильных радикалов, присутствующими в плазме клеток агентами, является главным фактором, сдерживающим его применение in vivo.

Основными целями работы являются:

• Исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками;

• разработка метода регистрации SH-содержащих соединений с использованием фторированных дисульфидов и ЯМР I9 F спектроскопии.

Научная новизна работы. Показано существование реакции нуклеофильного присоединения S-центрированных нуклеофилов к двойной связи нитронных спиновых ловушек 5,5-диметилпиролин-М-оксида (ДМПО) и 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-лиррол-^оксида (ДЭФМПО) и установлены структуры образующихся продуктов. На основании полученных экспериментальных данных предложен механизм данной реакции и определены константы скорости и равновесия соответствующих стадий. Показано участие механизма Форрестера-Хэпбурна (образование гидроксиламиновых производных спиновых ловушек в реакции нуклеофильного присоединения с последующим их окислением в радикальные аддукты) в формировании радикальных аддуктов сульфитного радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. На основании этого сделан вывод о необходимости более тщательного анализа экспериментальных данных по детектированию сульфитного радикала методом спиновых ловушек.

Исследован механизм гибели радикальных аддуктов S-центрированных радикалов со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-центрированного глутатионового радикала (GS*) нитронными спиновыми ловушками является обратимой. Определены константы скорости мономолекулярного распада радикальных аддуктов GS* с ДМПО и ДЭФМПО на глутатионовый радикал и спиновую ловушку.

Исследован механизм реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркалтобензойной кислоты (BSSB) с SH содержащими соединениями: глутатионом, альбумином и гемоглобином. На основе полученных экспериментальных данных предложена схема реакции. Для реакции с глутатионом определены соответствующие константы равновесия Проведенные исследования позволили впервые применить метод ЯМР спектроскопии для определения содержания SH соединений в крови.

Практическая ценность. В данной работе впервые проведено детальное исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов и нитронных спиновых ловушек. Полученные данные могут быть применены при анализе результатов экспериментов по детектированию S-центрированных радикалов

Результаты, полученные при исследовании механизма реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркапто-бензойной кислоты с SH содержащими соединениями могут бьпь использованы при разработке методов регистрации SH групп на основе 19F-ЯМР спектроскопии.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: 9-я международная встреча «ЭПР в живых системах» (Нью Хэмпшир, США, 2001); XIII, XV и XVI симпозиум "Современная химическая физика" (Туапсе, Россия, 2001, 2003, 2004); 10 и 11 Амперовская школа по ЯМР (Закопаны, Польша, 2002, 2003); 31 Амперовский конгресс (Познань, Польша, 2002), VI Международная конференция имени Воеводского «Физика и химия элементарных химических процессов» (Новосибирск, Россия, 2002); Российская молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (Казань, Россия, 2002); Вторая международная конференция по биомедицинской спектроскопии (Лондон, Великобритания, 2003); 8-й международный симпозиум по спиновым и магнитным эффектам в химии (Чапл Хилл, США, 2003); 37-я ежегодная международная встреча «Новые технологии и применения ЭПР» (Варвик, Великобритания, 2004).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, а также в 13 тезисах докладов на международных и российских симпозиумах и конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, двух приложений и списка цитируемой литературы, включающего 299 наименований. Работа изложена на 150 страницах, содержит 9 таблиц, 30 рисунков и 14 схем.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении аргументирована актуальность проблемы, решению которой посвящена диссертация, сформулирована основная цель работы и дано описание структуры и содержания диссертации.

В первой главе представляемой работы проведен обзор литературы по исследованию роли короткоживущих интермедиатов in vivo и применения метода спиновых ловушек для их регистрации. В первой части кратко описывается история вопроса о роли короткоживущих радикалов in vivo, отдельный подраздел специально посвящен путям образования и химическим свойствам О-,С- и S- центрированных радикалов. Во второй части приводятся данные о путях метаболизма сульфита в организме и о предполагаем радикальном механизме его токсического действия. Подробно рассмотрена роль SH-содержаших соединений в организме и их вовлеченность в процессы защиты от окислительного стресса и поддержания Ox-Red статуса. Описаны методы детектирования SH-содержащих соединений, включая методику, основанную на использовании дисульфид-бирадикальных меток. Рассматриваются преимущества методов и их и недостатки.

В третьей части главы большое внимание уделено рассмотрению химии метода спиновых ловушек и механизмам образования и гибели радикальных аддуктов. Подробно рассмотрены возможные побочные пути их образования (обратный спиновый захват, механизм Форрестера-Хэпбурна, реакции циклоприсоединения и др ). Приводится большое количество справочного материала, необходимого при анализе экспериментальных данных по спиновому захвату. Много места уделено вопросу применения метода спиновых ловушек для регистрации короткоживущих радикалов in vivo. Описываются условия экспериментов и интерпретация полученных данных.

В четвертой части главы рассматривается недавно предложенный метод ЯМР спиновых ловушек и его применение для регистрации короткоживущих радикалов. Описываются преимущества и недостатки данного метода в сравнении с традиционным методом ЭПР спиновых ловушек.

Глава дополнена приложением, содержащем спектральные данные ЭПР наиболее распространенных радикальных аддуктов и условия их наблюдения.

Во второй главе представлены материалы исследования реакции нитронных спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО с сульфитом и тиолами (глутатионом, меркаптоуксусной кислотой и цистеином). В ходе проведенных исследований было впервые установлено, что данные S-центрированные нуклеофилы способны присоединяться к двойной связи нитронных спиновых ловушек с образованием соответствующих гидроксиламиновых

производных. На рисунке 2.1 представлен спектр ЯМР 31Р и кинетическая зависимость, зарегистрированные после добавления сульфита к раствору ДЭФМПО. Па основании полученных спектров ЯМР 1Н, |3С и 31Р, а также выполненных квантовохимических расчетов, структуры образующихся продуктов Р\ и P2 отнесены к двум энантиомерным

гидроксиламинам, соответвующим транс- и цис-присоединению сульфита к С=М связи (схема 2.1).

н/:-сн2

насн2со>

9 7 "^ч НзСНгСО

ч

10 I Н1СН2СО

Ч/4

° О 1р.

Схема 2.1.Структура спиновой ловушки ДЭФМПО и струхтуры продуктов Р, и Р2

ч

«1'

Образование гидроксиламиновых производных зафиксировано также при добавлении тиолов к ДЭФМПО и в случае реакции спиновой ловушки ДМПО с сульфитом (продукт Рз). Концентрации

образующихся продуктов оказываются пропорциональны концентрациям

исходных спиновой ловушки и сульфита (рис.2.2) и уменьшаются с ростом значения рН среды. Обратимость наблюдаемых реакций с сульфитом подтверждена экспериментами с добавлением бензальдегида к

реакционной смеси. способен

реагировать с что приводит к

смещению равновесия в сторону

образования исходного нитрона (рис. 2.3). Полученные экспериментальные данные позволили определить механизм данных реакций и константы равновесия соответствующих стадий. В случае реакции ДЭФМПО с сульфитом измерены

константы

скорости

присоединения

анионов в транс положение

ДЭФМПО по отношению к фосфорильной группе.

В работе показано, что суммарная схема реакции спиновых ловушек с 8-центрированным нуклеофилами имеет вид:

5Т + М <-^->577//и/Я

(2.1)

где 8Т,ЫиН и 5Т1Ыи1Н - спиновая ловушка, нуклеофил и образующийся гидроксиламин, соответственно. Экспериментально измеренные значения констант равновесия ^ приведены в табл. 2.1.

Было показано, что окисление образующихся гидроксиламинов 8Т/№/Н (реакции 2.1 и 2.2) приводит к образованию точно таких же радикальных аддуктов БТ/Мы, что и при реакции спинового захвата радикала М/ спиновой ловушкой БТ (реакции 2.3 и 2.4).

(2.2)

¡¡Т+ --!£->¡Т/М' (2.4)

Данный механизм (р-ии 2.1-2.2)

Таблица 2.1. Измеренные значения констант образования спиновых аддуктов известен в К для реакции (2.1). литературе как механизм Форрестера-Хэпбурна, однако его участие в образовании аддуктов 8-центрированных радикалов до сих пор не обсуждалось. В представляемой работе показано, что неучет данного механизма, может привести к ложной трактовке результатов экспериментов по детектированию сульфитного радикала. транс-присоединение ( К), 6цис- (К').

На рисунке 2.2 представлены спектры ЭПР, полученные после добавления дихромата натрия к смеси ДЭФМПО и сульфита. Спектр на рисунке (а) относится к описанному

ловушка Нуклеофил к,м-1

ДМПО Н80,- 18

ДЭФМПО Шо3- 132", 257'

ДЭФМПО Н8СН2С00- 0.14

ДЭФМПО Су8Н =0.03

08Н < 0.003

ДЭФМПО

Рис 2.2 Спектры ЭПР, полученные после добавления Ыа2СггС>7 к смеси ДЭФМПО и Иа^Оз (я) все компоненты смешаны одновременно, (б) дихромат добавлен к смеси ДЭФМПО и сульфита через 12 часов.

в литературе транс-радикальному аддукту ДЭФМПО/БОз. ЭПР спектр второго соединения

следует отнести к спектру нитроксильного радикала,

образованного путем окисления соответствующего ему цис-гидроксиламиново/о

производного.

Проведенные эксперименты

позволили количественно установить вклад механизма Форрестера -Хэпбурна в формирование радикальных аддуктов. На рисунке 2.3 приведена кинетическая зависимость концентрации Kj[Fe(CN)6] в присутствии и отсутствии сульфита и спиновой ловушки ДМПО, измеренная методом УФ-спектроскопии по линии адсорбции ферроцианида (420нм). Как видно из рисунка добавление ДМПО (о) приводит к значительному уменьшению характерного времени кинетической зависимости. Это свидетельствует о появлении дополнительного канала реакции ферроцианида с образующимся гидроксиламином дмполюэ'/н, что приводит к образованию радикального аддукта дмп0/803"". В результате численных оценок показано, что при используемых концентрациях ДМПО и сульфита (50мМ и 1 мМ) отношение вкладов механизма Форрестера-Хэпбурна и спинового захвата составляет В случае спиновой ловушки ДЭФМПО данное отношение еще

более увеличивается из-за более высокого значения константы равновесия К, и, как следствие, более высокой концентрации образующихся гидроксиламинов. Таким образом, обратимое нуклеофильное присоединение S-центрированных нуклеофилов к нитронам может влиять не только на количественный анализ результатов, но даже на вывод о механизме формирования радикального аддукта. На основании полученных данных сделан вывод о необходимости пересмотра и реинтерпретации результатов некоторых описанных в литературе экспериментов по детектированию сульфитного радикала, в том числе in vivo.

В третьей главе представлены результаты исследования механизма деградации радикальных аддуктов тиильных радикалов с нитронными спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-центрированных радикалов является обратимой и одним из путей гибели радикальных аддуктов является мономолекулярная деградация на исходную ловушку и короткоживущий радикал.

Спиновые аддукты генерировались фотолизом соответствующих S-нитрозосоединений RSNO в присутствии спиновых ловушек ST.

(3 1)

K3[Fe(CN)6] в присутствии/отсутствии сульфита и ДМПО, рН=7 0. (□) - 0.71 мМ Kj[Fe(CN)(ll я 14.3 мМ ДМПО; <Д) - 0.7) мМ K3[Fe(CN)6] и 4.84 мМ Na2S03; (о) - 0.71 мМ KjpFiKCN)«], 4.84 мМ Na¡SOj и 14.3 мМ ДМПО

(3.2)

На рисунке 3.1 показан спектр ЯМР31Р, зарегистрированный после облучения смеси ДЭФМПО и нитрозоглутатиона (С8МО) светом № УЛО лазера (532 нм). Хорошо видно появление двух новых диамагнитных продуктов с общей концентрацией 2.2+1 мМ.

Одним из механизмов гибели радикальных аддуктов является реакция диспропорционирования на соответствующие гидроксиламин ИЛ-йЯ и нитрон N-8^

А'

к2

N

I

ОН

(3.3)

С 5тжп' на б 1а-<;к. „ ИЛ „

Согласно полученным в главе 2 результатам, образующийся ИЛ-йК неустойчив и должен обратимо распадаться на спиновую ловушку и тиол. Принимая во внимание, что глутатион имеет несколько хиральных центров,

образовавшиеся продукты отнесены к различным эпимерам нитрона N-80. Фотолиз подобного раствора с меньшей интенсивностью 15 мВт/см2 светом УФ лампы в диапазоне 500-600 нм к видимым изменениям в спектре ЯМР 31Р не привел. хотя степень разложения GSNO составила 90%. Проведенный анализ показал, что реакция диспропорционирования вносит существенный вклад (>20%) в гибель радикального аддукта только при его концентрации >0.2 мМ.

О JO

яя'>

24,6 24,4 24,2 24.0 23,в 23,6 23,4

Ii ррш

Рис 3.1. ЯМР Р спектр смеси 42 5 мМ ДЭФМПО . и 10 мМ GSNO в 0 1 М фосфатном буфере с pH 7.0, зарегистрированный после облучения смеси светом Nd YAG лазера 532 нм с интенсивностью облучения 30 мДж/см2 на импульс. Частота вспышек лазера 25 Гц, время облучения 30 мин.

Рнс. 3.2. Кинетические зависимости гибели радикальных адаукшв, измереные методом 0Г1Р после I, 2, 3 и 4 импульсов лазерного облучения раствора, солержатего 5 мМ GSNO и 88 5 мМ ДМПО (а) или 85 мМ ДЭФМПО (б) в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7 0.

На рисунке 3.2 приведены измеренные методом ЭПР кинетические зависимости деградации радикальных аддуктов спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО с глугатионовым радикалом. Данные зависимости хорошо описываются уравнением

///

[3.1]

В работе показано, что процесс второго порядка объясняется бимолекулярным диспропорционированием радикального аддукта с константой реакции к. В то же время природа реакции первого порядка кроется в обратимости реакции присоединения тиильного радикала к спиновой ловушке:

+ $Т < > 5Г / ОТ (3 4)

Образующийся вновь 08* радикал гибнет в реакции с исходным 08М0. С5-+05Ш~^053С + Ж)- (3.5)

Проведенные дополнительные эксперименты и расчеты показали, что вклад других процессов, кроме реакций (3.4)-(3.5), в гибель 08* радикала, при использованных в работе экспериментальных условиях, несущественен.

Факт обратимости реакции спинового захвата подтвержден в экспериментах добавлением другой спиновой ловушки и проведением фотолиза в присутствии формиата натрия. В первом случае (рис. 3.3) радикальный аддукт ДМПО и 08* радикала предварительно генерировался фотолизом окисленного глутатиона 0880 в присутствии спиновой ловушки. Сразу после прекращения облучения, к раствору был добавлен ДЭФМПО и зарегистрирован ЭПР спектр смеси. Формирование ДЭФМПО/08' (рис 3.36 и в) после добавления ДЭФМПО к ДМПО/08* указывает на присутствие в растворе радикала 08*, несмотря на то, что все образовавшиеся в результате фотолиза 08*

Рис 3.3. (а). Спектр ЭПР, полученный в процессе лазерного фотолиза раствора, содержащею О I М С880 и 88 5 мМ ДМПО в О I М фосфатном буфере (б). 2 мл такого же раствора как и в случае (а) помешались в кварцевую фотокювету (1 см) и облучались светом лазера (20 сек, 10 Гц, 30 мДж/имп) После прекращения облучения добавлено 85мМ ДЭФМПО и раствор перенесен в кювету (в). Расчетный спектр ЭПР а =45 81 Гс, а=14 14 Гс и а„=14 94 Гс

полностью реагируют с 88.5 мМ ДМЛО (к» =2.6x108 М~'с"') за время, меньшее чем 100 не

При проведении фотолиза 08М0 в присутствии спиновой ловушки и формиата возможны следующие процессы:

бЭ* + НСОг" —^-»ОБН + СО/" (3.6)

ДМП0 + С02"->ДМПО!СОг" (3.7)

Таким образом, проведение фотолиза в присутствие формиата должно приводить к накоплению относительно стабильного радикального аддукта ДМП0/С02*". Данное положение полностью подтверждается экспериментальными данными (рис.3.4). Образующиеся при фотолизе 08М0 глутатионовые радикалы полностью реагируют с ДМПО (к,=2.6х10,М'1с"1). Реакция с формиатом, на этом этапе, маловероятна

образом, причину

Рис 3.4. Кинетические зависимости спиновых аддуктов ДМПО [8Л], измеренные после облучения смеси 2 М ЫС02№, 5 мМ СКЫО и 88 5 мМ в фосфатном буфере рН 7 0 светом лазера (1с, 4 Гц)

Таким

формирования ДМПО/С2 прекращения облучения, следует отнести к мономолекулярному распаду ДМП0/08* с последующим участием 08* в реакциях (3.6-3.7).

Полученное из анализа кинетической схемы (3 3)-(3.5) уравнение гибели радикального аддукта при фотолизе 08М0 в присутствии ДМПО имеет вид:

= -к-

к8[05ШЗ

-[8Т/С8']-2к,[8Т/С8*]!

[3.2]

Л кб [БТ] + к 8 [ОЭЫО]

На рисунке 3.5 приведена зависимость экспериментально измеренной константы мономолекулярной гибели к1 радикального аддукта ДМП0/08* от параметра

Наблюдаемая зависимость служит подтверждением предполагаемого распада радикального аддукта на исходные ловушку и 08 радикал. Измеренные таким образом константы мономолекулярной деградации к.6 радикальных аддуктов ДМП0/08 и ДЭФМП0/08 составляют (0.30+ 0.01) с'1 и (2.1±0 1)х10г с1, соответственно.

Концентрационная зависимость константы псевдопервого порядка к1, позволяет понять причину различия во временах жизни аддуктов приведенных в опубликованных работах В работе также показано, что 8-центрированные радикалы, образующиеся из-за

распада радикальных аддухтов, могут приводить к вторичным химическим процессам и образованию Сцентрированных радикальных аддуктов. Это объясняет некоторые приведенные в литературе данные о присутствии углерод-центрированных радикальных аддуктов при детектировании глутатионового радикала. В главе также обсуждается возможное участие данного мономолекулярного механизма в деградации радикальных аддуктов О-центрированных радикалов.

j-p—------,---,---,---

0,0 0,1 0,2 0,3 0.4 0,5

Рис. 3.2. Зависимость величины А/ от параметра [С5КО]/(к6,рМРО]+к,[СЗЫО]). Кинетические

зависимости регистрировались после облучения раствора €$N0 и ДМПО в фосфатном буфере рН 7.0 ящером 308нм. Полученные зависимости фитировались уравнением [З.Л] при варьируемых параметрах к| и к((. (о)— измевевие [ОБКО] при [ДМПО]= 88.5мМ; (Д)-изменение [ДМПО] при [С51МО]=5 мМ.

В четвертой главе представлены результаты исследования механизма реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркаптобензойной кислоты (Б88Б, см схему 4.1).

Схема 4.1 Структуры дисульфида (BSSB) и мономера (BSH) 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркалтобензойной

с SH-содержащими соединениями (глутатионом, альбумином и гемоглобином) и исследована возможность применения данного соединения для определения концентраций тиолов в крови ex vivo.

На рисунке 4.1 показан спектр ЯМР 19 F, зарегистрированный после добавления GSH к раствору BSSB в насыщенном аргоном фосфатном буфере рН 7.0. Было установлено, что в результате

25 20 15 10 ррт

Рисунок 4.1. Спектр ЯМР "К,

обменной реакции происходит образование

глутатиона к 5 мМ раствору В^В в 0 I М

мономера BSH и смешанного дисульфида BSSG.

фосфатном буфере рН 7.0.

ВБЗВ + СЭН + ВЭН

ВЗЭО + ОЭН безо + ВБН

На рисунке 4.3 показаны экспериментально измеренные зависимости концентраций фторированных компонентов раствора от количества добавленного глутатиона. Данные были получены в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.0, исходя из интегральной интенсивности ЯМР "Б сигналов веществ. Из рисунка видно, что концентрация образующегося Б8И равна концентрации добавленного глутатиона. Анализ данных зависимостей концентраций образующихся продуктов от количества

сдан), I

Рисунок 4.2 Зависимость концентраций образующихся компонентов от количества добавленного глутатиона при добавлении 08И к 5 мМ раствору Б88Б в 0 1 М фосфатном буфере с рН 7.0. о - Б88Б. А - Б8И. о - Б880.

добавленного С8И позволил оценить значения К? и Квкак К?/К8=11.6 при К7,К|>103.

Было установлено, что ширины индивидуальных линий спектра ЯМР "Б соединений Б88Б и Б8И линейно зависят от концентраций друг друга. Это отражается в уширении линий спектров данных компонентов при добавлении тиолов к Б88Б (рис. 4.1). На рисунке 4.3 приведены зависимости ширин

индивидуальных линий ЯМР "Б Б88Б и Б8И, полученные при добавлении одного компонента к другому. Значения получены из фитирования экспериментальных

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3.5 4,0 С. ИМ

Рисунок 4.3 Зависимость ширины на полувысате индивидуальной линии ЛМР "Б спектра Б88Б (о) и Б8И (Д) от концентрации Б8И я Б88Б соответственно • - зависимость ширины линии мультиплета Б88Б от конценграцни Б$И

спектров при варьируемом параметре ширины линии на полувысоте. Полученные зависимости объясняются наличием обменной реакции между этими соединениями.

(4.3)

В случае промежуточного обмена ширины индивидуальных линий спею ров Б88Б и ВвН ) на полувысоте определяются выражениями:

ЬЛУв^^^и^+ЦВЗН] [4.1]

LWBSH = LWobsh + 2k[BSSB] [4.2]

где LfVBBSSS и ¿Wjssh - начальные ширины линий спектров BSSB и BSH соответственно. Экспериментально полученные зависимости ширин линий спектров при добавлении BSH к BSSB полностью соответствуют данным выражениям (рисунок 4.3). Анализ полученных данных позволяет установить значение константы

При добавлении SH-содержащих соединений к BSSB, наблюдаемая ширина спектральных линий последнего линейно зависит от концентрации добавленного тиола. Кроме того, в случае GSH и гемоглобина наклон получаемых зависимостей совпадает с ожидаемым согласно реакции (4.3) (рисунок 4.4). Наклон зависимости для альбумина в семь раз больше ожидаемого и объяснение данного факта представляет собой предмет для дальнейших исследований.

Полученные данные позволяют применить метод для определения количества -SH содержащих соединений в крови. При этом могут быть использованы не только интегральные интенсивности линий ЯМР 19F образующихся продуктов реакции с BSSB, но и уширение линий спектра BSSB. Результаты проведенных измерений в крови крыс линии Wistar приведены в табл. 4.1

Таблица 4.1. Измеренные и литературные данные концентрации GSH и гемоглобина в крови крыс линии Wlstar По интегралу По ширине линии Литературные

_BSSB_данные_

[GSH] в эритроцитах, мМ 1.86 ± 0.26 1.74 ±0.28 1.9 ±0.3

[GSH] в крови*, мМ_0.93±0.23_0.87±0.14_0.95±0 2_

Полученные в работе результаты показывают возможность применения данною метода при определении концентраций тиолов ex vivo.

Использованные в работе приборы, методики и аббревиатура описаны в экспериментальной части (глава 5). В главе также представлены детали компьютерных

квантово-механических расчетов, выполненных проф. Н.П. Грицан, и указан вклад соавторов опубликованных работ в выполнение части экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Показано существование реакции нуклеофильного присоединения 8-центрированных нуклеофилов к двойной связи нитронных спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО и установлены структуры образующихся продуктов. На основании полученных экспериментальных данных предложен механизм данной реакции и определены константы скорости и равновесия соответствующих стадий.

2. Показано участие механизма Форрестера-Хэпбурна в формировании радикальных аддуктов сульфитного радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. На основании этого сделан вывод о необходимости пересмотра результатов большого числа описанных в литературе экспериментов по детектированию сульфитного радикала.

3. Исследован механизм гибели радикальных аддуктов 8-центрированных радикалов со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. Впервые показано, что реакция спинового захвата 8-центрированного глутатионового радикала 08С нитронными спиновьши ловушками является обратимой. Определены константы скорости мономолекулярного распада радикальных аддуктов 08* с ДМПО и ДЭФМПО на глутатионовый радикал и спиновую ловушку.

4. Исследован механизм реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркаптобензойной кислоты (Б88Б) с 8Н содержащими соединениями: глутатионом, альбумином и гемоглобином. На основе полученных экспериментальных данных предложена схема реакции. Для реакции с глутатионом определены соответствующие константы равновесия.

5. Установлен факт уширения линий спектра 19Б ЯМР для дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркаптобензойной кислоты (Б88Б) и ее мономера (Б8Н) из-за реакции тиол-дисульфидного обмена между ними. Определена константа скорости данной реакции при р1 I 7.0.

6. Метод "Б ЯМР спектроскопии впервые применен для определения содержания 8Н соединений в крови.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1 Dmitni I Potapenko, Thomas L Clanton, Elena G Bagryanskaya, Nina P Gntsan, Vladimir R Reznikov, Valery V Khramtsov Nonradical Mechanism of (Bi)Sulfite Reaction with DfcPMPO Cautionary Note For SO3 Radical Spin Trapping //Free Radical Biology & Medicine, 2003, V 32 (2), pp 196-206

2 Dmitni I Potapenko, Elena G Bagryanskaya, Vladimir R Reznikov, Thomas L Clanton, Valery V Khramtsov Reversible Nucleophilic Addition of (Bi)sulfite to the Nitrone Spin Trap DMPO //Magn Reson Chem 2003, v 41, pp 603-608

3 Д И Потапенко, £ Г Багрянская, В В Храмцов, Н П Грицан и В А Резников Исследование реакции спинового захвата S-центрированных радикалов методами ЯМР и ЭПР //Материалы Российской молодежной научной школы «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений», т 1, Казань, 20-22 ноября, 2002, стр 90-94

4 Dmitni I Potapenko, Elena G Bagryanskaya, Yun P Tsentalovich, Vladimir A Reznikov, Thomas L Clanton, and Valery V Khramtsov Reversible Reactions of Thiols and Th)>l Radicals with Nitione Spin Traps //Journal of Physical Chemistry В 2004, v 108(26), pp 9315-9324

5 Д И Потапенко, Е Г Багрянская, Ю П Центалович, В А Резников, Т Л Клантон, и В В Храмцов, Исследование механизмов реакций S-центрированных радикалов и нуклеофичов с нитронными спиновыми ловушками и дисульфидами методами ЛМР и ЭПР //Тезисы докладов XVI симпозиума «Современная химическая физика», 20 сентября - 1 октября 2004, Туапсе, стр 105

6 D I Potapenko, E G Bagryanskaya, V A Reznikov, T L Clanton and V V Khramtsov EPR spin trapping of Sulfur-Centered Radicals with Nitrone Spin Traps Cautionary Notes //Book of abstracts of Second International Conference on Biomedical Spectroscopy, 5-8 July, 2003, London, United Kingdom, p 190

7 Dmitni I Potapenko, Elena G Bagryanskaya, Yun P Tsentalovich, Vladimir A Reznikov, Thomas L Clanton, and Valery V Khramtsov Reversible reaction of thiols and thiyl radicals with nitrone spin traps //Book of abstracts of 37th Annual International Meeting "Advanced Techniques and Applications of EPR", 28th March-1' April 2004, University of Warwick, United Kingdom, p 96

8 D I Potapenko, V V Khramtsov, E G Bagryanskaya, N P Gntsan, V A Reznikov, T L Clanton Nonradical Mechanism of (Bi)Sulfite Reaction with DEPMPO and DMPO Cautionary Note For SO3 Radical Spin Trapping //Book of abstracts of VI Voevodsky conference "Physics and chemistry of Elementary Chemical Processes", Novosibirsk, Russia, July 21-25, 2002,p 92

9 V V Khramtsov, £ G Bagryanskaya, D1 Potapenko, A A Bobko, V A Reznikov, N G Kolosova, TL Clanton P-31 and F-19 NMR spin trapping of short-lived intermedidtes 48th Annual Meeting ofthe Biophysical Society, Baltimore (USA), February 14 18, 2004 //Biophysical Journal 86(1) 191A-191APart 2 Suppl S Jan 2004

10. V.V. Khramtsov, D.I. Potapenko, E.G. Bagryanskaya, Y.P. Tsentalovich, V.A. Reznikov, T.L. Clanton. Reversible reactions of thiols and thiyl radicals with nitrone spin traps. XII Biennial Meeting of the Society for Free Radical Research International, Buenos Aires (Argentina), May 5-7, 2004. //Free Radical Biology&Medicine 36: S145-S146 Suppl 1 2004.

11. V.V. Khramtsov, D.I. Potapenko, E.G. Bagryanskaya, T.L. Clanton, Detection of DEPMPO adducts with sulfur trioxide anion free radical in vitro by NMR-spin trapping. //Book of abstracts of 9-th International Meeting "EPR Viable Systems", Dartmouth Medical School, Hanover, New Hampshire, September 8-14,2001, p. M-5.

12. D.I. Potapenko, V.V. Khramtsov, E.G. Bagryanskaya, N.P. Gritsan, V.A, Reznikov, T.L. Clanton, NMR Study of (Bi)Sulfite Reaction with DEPMPO. Evidence of Nonradical Mechanism. //Book of abstracts of Ampere X NMR School, Zakopane, Poland, June 2-7, 2002, p. 38.

13. D.I. Potapenko, V.V. Khramtsov, E.G. Bagryanskaya, N.P. Gritsan, V.A. Reznikov, T.L., Nonradical Machanism of (Bi)Sulfite Reaction with DEPMPO: Cautionary Note For SO3" Radical Spin Trapping. //BOOK of abstracts of 31-st Congress Ampere, Poznan, Poland, July 14-19, 2002, p. 84.

14. E.Bagryanskaya, D.I.Potapenko, A.Bobko, V.Rezmkov, N.G.Kolosova, V.Khramtsov, T.Clanton. 31P and 19F Spin-Trapping of Short-Lived Intermediates. //Book of abstracts of 8th International Symposium of Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, September 21-26,2003, Chapel Hill, North Carolina, p. 45.

15. E.Bagryanskaya, D.I.Potapenko, AJBobko, D.P.Zubenko, N.V.Lebedeva, V.Reznikov, V.Khramtsov. NMR and TR CIDNP Investigations of Short-Lived Intermediates in Chemical Reactions. //Book of abstracts of Ampere XI NMR School, Zacopane, Poland, June 1-6, 2003. p. 1.

16. Потапенко Д.И., Храмцов В.В., Багрянская Е.Г., //Исследование механизма реакции спинового захвата сульфитного радикала 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-N-оксидом (DEPMPO) методами ЯМР и ЭПР". //Тезисы докладов XIII симпозиума "Современная химическая физика, Туапсе, 25 сентября - 6 октября, 2001, стр. J90.

17. Потапенко ДИ., Багрянская Е.Г., Резников В А., Храмцов В.В. Исследование механизма образования и гибели радикального аддукта спиновой ловушки ДМПО и глутатионового радикала методами ЯМР и ЭПР. //Тезисы докладов XV симпозиума «Современная химическая физика», 18-29 сентября 2003, Туапсе. Стр. 120-121 ..,

Подписано к печати "13" сентября 2004г. Формат бумаги 60x84 1/16. Объём 2 печ. л.

Тираж 120 экз. Заказ № 1303. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

№17444

РНБ Русский фонд

2005-4 13496

Введение.

Глава 1. Литературный обзор. S-центрированные радикалы и 7 нуклеофилы in vivo и in vitro.

§1.1. Короткоживущие реакционные радикалы и интермедиаты в 7 биологии.

Краткая историческая справка.

О-, С- и S- центрированные радикалы in vivo.

§1.2. SH-соединения и сульфиты.

Тиолы и SH-содержащие белки.

Сульфиты.

Ox-Red статус.

Методы регистрации тиолов.

§1.3. Метод спиновых ловушек.

Суть метода.

Применение метода спиновых ловушек для регистрации 30 короткоживущих радикалов in vivo.

Фармакологические свойства спиновых ловушек.

Артефакты в методе спиновых ловушек.

Окисление примесей в спиновых ловушках

Обратный спиновый захват

Механизм Форрестера-Хэпбурна.

Реакция циклоприсоединения.

Реакции с участием ионов переходных металлов.

Механизмы гибели радикальных аддуктов.

§1.4. Метод ЯМР спиновых ловушек.

Глава 2. Исследование механизма реакции S-центрированных 54 нуклеофилов с нитронными спиновыми ловушками.

§2.1. Результаты.

Исследование механизма реакции ДЭФМПО с сульфитом.

Исследование механизма реакции ДМПО с сульфитом.

Исследование механизма реакции спиновых ловушек с тиолами.

Science is a wonderful thing if one does not have to earn one's living at it.

A. Einstein.

SH группы выполняют в организме несколько важных функций, такие как структурная функция, каталитический центр во множестве ферментов, функция защиты от действия свободных радикалов и т.д. 1 Основным SH содержащим компонентом внутриклеточной среды является трипептид глутатион, концентрация которого может достигать в некоторых клетках до 10 мМ 2. Кроме того, достаточно большое количество белков содержит в своем составе SH группы, которые вместе с глутатионом играют роль окислительно-восстановительного буфера среды 3'4'5'6. Другим S-центрированным нуклеофилом, присутствующим в организме в достаточно больших количествах является сульфит, который вместе с оксидом серы IV в течение нескольких веков применяется в качестве консерванта, дезинфицирующего агента и раскислителя 7'8'9. В настоящее время данное соединение широко используется в пищевой промышленности, так, за один прием пиши в организм человека попадает до 150 мг сульфита 10. Показано, что окисление рассматриваемых SH -соединений и сульфитов приводит к образованию соответствующих S-центрированных тиильных и сульфитного радикала, токсичность которых в последнее время активно обсуждается 1,'12-13«14-15

В большинстве исследований по исследованию влияния данных радикалов в качестве метода их детектирования применялся метод спиновых ловушек 16'17'18,19,20'21. В основе данного метода лежит реакция короткоживущих радикалов со специально подобранными химическими соединениями -спиновыми ловушками. Образующихся в результате реакции радикальный аддукт обычно представляет собой устойчивый нитроксильный радикал, спектр ЭПР которого несет информацию о котороткоживущем предшественнике22.

К настоящему моменту в литературе присутствует достаточное большое количество публикаций о регистрации радикальных адцуктов спиновых ловушек с S-центрированными короткоживущими радикалами, в том числе in vivo 2023 24. Последние часто рассматривают в качестве одного из доказательств присутствия короткоживущих радикалов in vivo и их токсичности. К сожалению большинство публикуемых работ обладают одним недостатком - образование радикальных аддуктов прямо интерпретируется как присутствие короткоживущего радикала в системе, и мало внимания уделяется рассмотрению других возможных механизмов образования данных аддуктов. Между тем, в настоящее время уже известен широких спектр побочных реакций, приводящих к образованию данных соединений 25'26'27-28'29'30'31.

Метод спиновых ловушек в большинстве своих приложений был и остается качественным методом, используемым лишь для ответа на вопрос есть ли короткоживущие радикалы в системе или нет и какие если есть. В ряде случаев оказывается также возможным качественное наблюдение роста или убыли скорости продуцирования радикальных частиц. Однако количественное сравнение результатов независимых экспериментов в общем случае не представляется невозможным. Причина такого положения дел кроется в нестабильности радикальных аддуктов, что особенно ярко проявляется при использовании метода спиновых ловушек in vivo. Радикальные аддукты, по своей сути нитроксильные радикалы, достаточно легко восстанавливаются клеточными восстановителями, например аскорбиновой кислотой и/или SH-соединениями. Традиционно проблему пытаются решить подбором структуры спиновой ловушки, которая бы минимизировала скорости реакций с восстанавливающими агентами. Однако существенного успеха до сих пор достигнуто не было.

Одним из недавно предложенных подходов в решении данной проблемы состоит в изменении схемы метода - а именно в детектировании не самих радикальных аддуктов, а диамагнитных продуктов их дальнейшей деградации. Относительная устойчивость диамагнитных соединений в восстановительной среде организма делает возможным накопление данный продуктов вплоть до концентраций, достаточных для детектирования методом ЯМР. Применение в данном случае спиновых ловушек, содержащих ядра 31Р, 19F и спектроскопии магнитного резонанса на частоте соответствующих гетероядер (метод ЯМР Спиновых Ловушек, ЯМР-СЛ) позволяет существенно повысить чувствительность метода ' . Кроме того, использование в перспективе метода ЯМР томографии позволило бы визуализацию областей продуцирования свободных радикалов in vivo35.

Развитие метода ЯМР спиновых ловушек требует новых знаний о структуре образующихся диамагнитных соединений и о механизмах деградации радикальных аддуктов. Следует отметить, что данной области знания до настоящего момента уделялось крайне мало внимания. Накопленные к настоящему моменту знания в этой области в основном касаются лишь нескольких радикальных аддуктов и основываются скорее на качественных чем лг "уо ng 1/г ii 10 на количественных результатах ' ' ' • ' . Более того, до сих пор даже не найдено объяснения приводимым в литературе разным характеристическим временам жизни аддуктов довольно популярных гидроксильного и супероксидного радикалов 39'40. Таким образом, установление механизма деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов представляет большой научный и практический интерес.

Как уже упоминалось, SH-содержащие соединения играют важную роль в организме и соотношение концентраций их окисленных и восстановленных форм является одним из показателей окислительного стресса 3'4'5'6. Все существующие к настоящему времени методы измерения концентраций данных соединений так или иначе основываются на их выделении, что не позволяет

13 41 42 43 44 45 ,, применять данные методики непосредственно in vivo ' ' ' п . Недавно предложенный метод определения концентраций SH-соединений, основанный на использовании дисульфид-бирадикалов, реагирующих с тиолами по механизму реакции тиол-дисульфидного обмена 46'47-48, позволяет снять данную проблему. Метод основан на детектировании образования монорадикальных компонентов, из анализа которой можно сделать вывод о концентрации тиола. Однако высокая скорость восстановления радикалов присутствующими в плазме клеток агентами, является главным фактором, сдерживающим его применение in vivo. Применение l9F меченных диамагнитных дисульфидов при их регистрации методом ,9F ЯМР спектроскопии позволило бы снять последнюю проблему. Химический сдвиг ядер фтора очень чувствителен к ядрам ближнего и дальнего окружения, что проявляется в значительном отличии спектров ЯМР 19F фторированных дисульфидов и их SH-мономеров. Кроме того, применение в перспективе 19F ЯМР томографии позволило бы визуализацию картины распределения глутатиона и SH-соединений в целом внутри организма.

Целью данной работы было исследование механизмов образования и деградации радикальных аддуктов S-центрированных радикалов с нитронными спиновыми ловушками и разработка метода регистрации SH-содержащих соединений с использованием фторированных дисульфидов и ЯМР 19F спектроскопии.

В первой главе представляемой работы проведен обзор литературы по исследованию роли короткоживущих интермедиатов in vivo и применения метода спиновых ловушек для их регистрации. Кроме того подробно рассмотрена роль SH-содержащих соединений в организме и их вовлеченность в процессы защиты от окислительного стресса и поддержания Ox-Red статуса. Большое внимание уделено рассмотрению химии метода спиновых ловушек и механизмам образования радикальных аддуктов. В конце главы рассматривается метод ЯМР спиновых ловушек и его применение для регистрации короткоживущих радикалов.

Во второй главе представлены материалы исследования реакции нитронных спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО с сульфитом и некоторыми низкомолекулярными тиолами. В ходе проведенных исследований было впервые установлено, что данные S-центрированные нуклеофилы способны присоединяться к двойной связи нитронных спиновых ловушек с образованием соответствующих гидроксиламиновых производных. Полученные экспериментальные данные позволили определить механизм данной реакции, константы равновесия и скорости его соответствующих стадий. Было показано, что окисление образующихся гидроксиламинов приводит к образованию точно таких же радикальных аддуктов, что и при реакции спинового захвата. Данный механизм образования спиновых аддуктов известен в литературе как механизм Форрестера-Хэпбурна 30. В представляемой работе было показано, что неучет данного механизма реакции может привести к ложной трактовке результатов экспериментов по детектированию сульфитного радикала. Так, приведенные оценки некоторых литературных данных, свидетельствующих по мнению авторов о присутствии сульфитного радикала (в частности in vivo), ставят под сомнение данное утверждение.

В третьей главе представлены результаты исследования механизма деградации радикальных аддуктов тиильных радикалов с нитронными спиновыми ловушками. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-центрированных радикалов является обратимой и одним из путей гибели радикальных аддуктов является мономолекулярная деградация на исходную ловушку и короткоживущий радикал. Количественный анализ механизма деградации радикальных аддуктов глутатионового радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО позволил установить соответствующие константы скорости деградации и объяснить различные времена жизни радикальных аддуктов в зависимости от используемых концентраций реагентов. Также показано, что S-центрированные радикалы, образующиеся из-за распада радикальных аддуктов могут приводить к вторичным химическим процессам и образованию С-центрированных радикальных аддуктов, что объясняет некоторые приведенные в литературе экспериментальные данные о присутствии углерод-центрированных радикальных аддуктов при детектировании глутатионового радикала 49. В главе также обсуждается возможное участие данного мономолекулярного механизма в деградации радикальных аддуктов О-центрированных радикалов.

В четвертой главе представлены результаты исследования механизма реакции дисульфида 2,3,5,6-тетрафтор-парамеркаптобензойной кислоты (BSSB) с различными SH-содержащими соединениями и применения данного соединения для определения тиолов ex vivo в крови. Установлено, что BSSB реагирует с достаточно высокой константой равновесия с алифатическими тиолами по реакции тиол-дисульфидного обмена. Образующийся в результате реакции мономер BSH вступает в аналогичную обменную реакцию с BSSB что приводит к уширению спектральных линий ЯМР данных компонентов. Количественный анализ экспериментальных данных позволил определить соответствующие константы равновесия и скорости отдельный стадий. В данной главе метод спектроскопии ЯМР 19F впервые применен для определения содержания SH-соединений в крови и показано, что получаемые результаты очень хорошо согласуются с данными других методов. В конце главы проведено обсуждение перспектив развития метода и определены требования к структуре фторированных дисульфидов.

Использованные в работе приборы, методики и аббревиатура описаны в экспериментальной части (глава 5). Также в главе представлены детали компьютерных квантово-механических расчетов выполненных проф. Н.П. Грицан и указан вклад соавторов в выполнение части экспериментов. Параметры спектров ЯМР некоторых полученных соединений приведены в Приложении 2.

Автор выражает признательность свои научным руководителям д.ф.-м.н. Елене Григорьевне Багрянской и д.х.н. Валерию Владимировичу Храмцову за осуществляемое руководство и постоянную заботу и всем кто это будет читать за их долготерпение.

1. Показано существование реакции нуклеофильного присоединения S-

центрированных нуклеофилов к двойной связи нитронных спиновых ловушек ДМПО и ДЭФМПО и установлены структуры образующихся продуктов. На основании полученных экспериментальных данных предложен механизм данной реакции и определены константы скорости и равновесия соответствующих стадий.2. Показано участие механизма Форрестера-Хэпбурна в формировании радикальных аддуктов сульфитного радикала со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. На основании этого сделан вывод о необходимости пересмотра результатов большого числа описанных в литературе экспериментов по детектированию сульфитного радикала.3. Исследован механизм гибели радикальных аддуктов S-центрированных радикалов со спиновыми ловушками ДМПО и ДЭФМПО. Впервые показано, что реакция спинового захвата S-центрированного глутатионового радикала нитронными спиновыми ловушками является обратимой. Определены константы скорости мономолекулярного распада радикальных аддуктов GS* с ДМПО и ДЭФМПО на глутатионовый радикал и спиновую ловушку.4. Исследован механизм реакции BSSB с SH содержащими соединениями глутатионом, альбумином и гемоглобином. На основе полученных экспериментальных предложена схема реакции. Для реакции с глутатионом определены соответствующие константы равновесия.5. Установлен факт уширения линий спектра '^F ЯМР для =BSSB и BSH из-за реакции тиол-дисульфидного обмена между ними. Определена константа скорости данной реакции при рН 7.0.6. Метод '^F ЯМР спектроскопии впервые применен для определения содержания SH соединений в крови.Приложение 1. Параметры спектров ЭПР некоторых радикальных аддуктов.Радикальный аддукт ФБН/'ОН ФБН/'ССЬ ФБН/*'^ СС1з ФБН/'CN

4-П0БН/*0Н'

4-ПОБНЛООН F-ДМПО/'ОН " F-ДМПО/'СНз Р-ДМПО/'СНгОН дмпо/'он дмпо/"'^ он ДМПО/'ОМе ДМПО/'ОСНзСНз дмпо/'оон ДМПО/'СНз ДМПО/'СНгСНз ДМПО/*СН(ОН)СНЗ ДМПО/'СОг" ДМПО/'СРз ДМПО/'ЗОз' ДМПО/GS' ДМПО/CyS* ДЭФМПО/'ОН ДЭФМПО/'ОСНз АМС^О)

1.89(уН) Растворитель

0.05М фосфатный буфер рН 7.4

0.05М фосфатный буфер рН 7.4 фосфатный буфер рН 7.8 фосфатный буфер рН 7.8

0.1М фосфатный буфер рН 7.0

0.1М фосфатный буфер рН 7.0

0.1М фосфатный буфер рН 7.0

5% МеОН фосфатный буфер рН 7.8 буфер MOPS Боратный буфер буфер NOPS Н,0/МеОН(1Л) фосфатный буфер рН 7.0 толуол источник Радикальный аддукт ДЭФМПО/'ООН "' ДЭФМПО/'ООН '^ ДЭФМПО/'СНгОН ДЭФМПО/'СОг' ДЭФМПО/'ЗОз" ДЭФМПО/'GS Растворитель фосфатный буфер рН 7.0 фосфатный буфер рН 7.0 фосфатный буфер рН 7.0

0.2М фосфатный буфер рН 7.4

0.2М фосфатный буфер рН 7.4 источник

1:4-ПОБН: альфа-(4-пиридил-1-оксил)-М-третбутилнитрон II: F-ДМПО: 4-гидрокси-5,5-диметил-трифторметилпирролин-1-оксид III и IV: конформеры ДЭФМПО/'ООН Приложение 2. Параметры спектров ЯМР.

5-(диэтoкcифocфopил)-5-мeтил-пиppoл-N-oкcид (ДЭФМПО): ЯМР &^:С^ д, 144.08 ppm, JC-H=190 Гц, Jc.p=8.8 Гц; С^т, 25.72 ppm, JC.H=140 Гц, Jc.p=2.0 Гц; С^^ t, 29.293 ppm, JC-H=138 Гц; С^ д, 74.35ppm, Jc.p=159 Гц; С*' к, 18.87 ppm, Jc-H=I30 Гц, Jc.p=1.2 Гц; С ' т, 64.64 ppm, JC-H-151 ГЦ, Jc-p=7.6 Гц; С^ т,

64.58ррт, Jc-H=151 Гц, JC.P=7.4 Гц; С^ к, 15.11 ppm, JC.H=128 Гц, JC.P=5.6 Гц; С"' к, 15.17 ppm, Jc-H=128 Гц, Jc-p=5.5 Гц.ЯМР Н^ С^Н т, 7.34 ppm, JH-H=2.6 Гц; С^Нг м 2.16-2.44 ppm, м 2.66-2.91 ppm; С Н з м, 2.75-2.90 ppm; С^Нз д, 1.69 ppm, Jp.H=15.6 Гц; C H i , С^Нг м, 4.19-4.37

Р=0.6 Гц.Транс-5-(диэтоксифосфорил)-1-гидрокси-5-метил-риррол-2-сульфоновая кислота (Pi): ЯМР с " : d д, 83.03 ppm, 125 Гц<Тс-н=180 Гц; С Ч , 25.52 ppm, JC-H=140 ГЦ; С^ Т,

33.17 ppm, 138 r4<Jc.H=150 Гц, 1 Гц<ас-р<2 Гц; С^ д, 71.60ppm, JC.P=132.9 ГЦ; С^ к, 23.17 ррш, Jc-H=145 ГЦ, Jc-p=9.4 Гц; С' т, 66.16ppm, 130 Гц<1с-н<145 Гц, Jc- н=128 Гц.NMR-H*:C^H,C^H2,C'*H2, m, 1.8-2.6ppm; С^Нз d, 1.47ppm, Jp.H=14.4 Гц; С'Н2,С^Н2 m, 4.1-4.4ppm; C % t, 1.36ppm, JH-H=7.0 Гц, JH-P=0.3 Гц; C ' % t, 1.37ppm, JH.H=7.0 Гц, JH.P=0.3 ГЦ.

Цис-5-(диэтоксифосфорил)-1-гидрокси-5-метил-риррол-2-сульфоновая

кислота (Рз): ЯМР с " : & д, 82.97ррт, 125 Гц<ас-н=180 Гц, JC.P=19.8 ГЦ; С^ Т, 24.31 ppm, Jc.н=136 Гц, Jc.p=11.6 Гц; С* т, З1.908ррт, 130 Гц<Гс.н=145 Гц; С^ д, 68.63ррт, Ь Р=175.3 Гц; С^ к, 15.09ppm, JC-H=128 Гц, JC-P=6.3 ГЦ; С Ч , 66.29ррш, 142 Гц<1с.н<164 Гц, Jc-p=7.6 Гц; С т, 66.49ррт, 142 Гц<Гс.н<164 Гц, JC-P=7.4 Гц; С^С'" к,

17.66ррт, Jc.H=128 Гц.ЯМР Н*:С^Н,С^Н2,С''Н2, м, 1.8-2.6ррт; С^Нз д, 1.41ррт, JP.H=17.1 ГЦ; С 'Н2,С^Н2 м, 4.1-4.4ррт; С^Нз т, 1.35ppm, JH-H=7.0 ГЦ, JH-P=0.5 ГЦ; С '^НЗ Т, 1.36ppm, JH-

н=7.0 ГЦ, JH-P=0.5 ГЦ.

1-гидрокси-5,5-диметилпирролидин-2-сульфоновая кислота (Рз): ЯМР С^^: С^: д, 79.35ppm, 1с.н=149Гц; С^: 21.65ppm, 134Гц<;с.н<136 Гц; СЛ т.32.90ррт, 132 Гц <JC-H<138 ГЦ; С ^ 73.76ррт; С^ к, 24.63ppm, 127 Гц <JC.H<125 Гц; С : к, 17.06ppm, 125 Гц <JC-H<127 Гц.ЯМР Н' : С^Н: д-д, 4.05ррт; С^Н2,С^Н2: м, 1.5-2.5ррт; С^Нз, С^Нз: 1.21ppm, Благодарности Хочется выразить огромную признательность своим замечательным научным руководителям д.ф.-м.н., профессору Елене Григорьевне Багрянской и д.х.н. Валерию Владимировичу Храмцову за осуществляемое руководство и постоянную заботу.Большое спасибо хочется сказать всем сотрудникам Международного Томографического Центра, где была вьшолнена работа. В частности директору МТЦ СО РАН академику РАН Ринату Зинуровичу Сагдееву, заместителю директора член-корреспонденту РАН Виктору Ивановичу Овчаренко, д.х.н.Юрию Павловичу Центаловичу, к.ф.-м.н. Виталию Романовичу Горелику, к.ф.-

м.н. Матвею Владимировичу Федину, Станиславу Рудольфовичу Шакирову, к.х.н. Наталье Викторовне Лебедевой, Дмитрию Павловичу Зубенко, Сергею Леонидовичу Веберу, к.ф.-м.н. Константину Львовичу Иванову, к.х.н. Евгению Викторовичу Третьякову и др.Огромная помощь при обсуждении результатов и выработке подходов была оказана сотрудниками Сибирского отделения Академии Наук д.х.н., профессором Владимиром Анатольевичем Резниковым, к.х.н. Игорем Анатольевичем Кирилюком, д.х.н. и профессором Ниной Павловной Грицан.Хочется сказать большое спасибо к.х.н. Николаю Ивановичу Сорокину за привитый им интерес к научному многообразию.Также хочется поблагодарить академика РАН Валентина Николаевича Пармона и заместителя директора Института Катализа СО РАН Сергея Евгеньевича Глазнева за оказанную поддержку в трудный жизненный период.Особую благодарность автор выражает Dr. Margaret Foster и Кафедре Биомедицинской физики университета г. Абердина (Шотландия) за создание идеальных условий для написания данной работы.Отдельные слова благодарности автор еще раз должен сказать заместителю директора МТЦ СО РАН член-корреспонденту РАН Виктору Ивановичу Овчаренко за постоянные поддержку, помощь и участие.И конечно самые теплые слова хочется сказать своим родителям, роль которых на всех этапах данной работы переоценить невозможно.Искренне благодарю всех остальных людей, так или иначе принявших участие в этой работе и неупомянутых вьппе за недостатком места.Дмитрий Потапенко, б августа 2004 года

1.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б. " Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты". МАИК «Наука/Интерпериодика» 2001, 343 стр.

2. A. Meister. "Glutathione metabolism and its selective modification". J. Biol. Chem. 1988, 263, 17205-17208.

3. Campo G.M., Squadrito F., Altavilla D. "Protection of ischemic and reperfused rat myocardium by the nonglucocorticoid 21-aminosteroid U-74389G, a new inhibitor of lipid peroxidation". J. Phannacol. Exp. Ther. 1996, 277, 333-340.

4. Freya Q., Schafer and Buettner Garrry R. "Redox enviroment of the cell as viewed through the redox state of the glutatione disulfide/glutathione couple". Free Radical Biology&Medicine, 2001, 30 (11), 1191-1212.

5. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, 72, 3666-3670.

6. Taylor S.L., Higley N.A., Bush R.K. "Sulfites in foods: uses, analytical methods, residues, fate, exposure assessment, metabolism, toxicity, and hypersensitivity". Adv. Food Res. 1986,30, 1-76.

7. Bryson P.D. "Comprehensive Review in Toxicology for Emergency Clinicians. Taylor & Francis: Washington, D.C., 1996; 697.

8. Bush R., Taylor S., Busse W. "A critical evaluation of clinical trials in reactions to sulfites". J.Allergy Clin Immunol, 1986, 78: 191-202.

9. Baker G., Collett P., Allen D., "Bronchospasm induced by metabisulfite-containing foods and drugs". Med. J. Aust. 1981,2, 614-616.

10. Mottley C. and Mason R.P. "Sulfite anion free radical formation by peroxidation of (bi)sulfite and its reaction with hydroxyl radical scavengers". Arch.Biochem.Biophys., 1988,267, 681.

11. Faure P. and Lafond J.-L. "Measurements of plasma sulfhydryl and carbonyl groups as possible indicator of protein oxidation". In Analysis of free radicals in biological systems. A.E. Favier et al (ads), Birkhauser Verlag Basel/Switzerland, 1995.

12. Burke S.E., Wright C.D., Potoczak R.E. "Reduction of canine myocardial infarct size by CI-959, an inhibitor of inflammatory cell activation". J. Cardiovasc.• Phannacol. 1992, 20, 619-629.

13. Huss A., and Eckert C.A. "Equilibria and ion activities in aqueous sulfur dioxide solutions". J.Phys.Chem. 1977, 81,2268-2270.

14. Chamulitrat W. "Desulfonation of a colitis inducer 2,4,6-trinitrobenzene sulfonicacid produces sulfite radical". Biochim.Biophys. Acta., 1999, 1472, 368-375.

15. Зубарев B.E. "Метод спиновых ловушек". Изд. Московского Университета, 1984, 186 с.

16. Jinjie Jiang, Ke Jian Liu, Xianglin Shi and Harold M. Swartz. "Detection of shortlived free radicals by low-frequency electron paramagnetic resonance spin trapping in whole living animals". 1995, 319 (2), 570-573.

17. Forrester A.R. and Hepburn S.P. "Spin-traps. A cautionary note". Journal of the Chemcical Society (C). 1971, 701-703.

18. Selinsky B.S., Levy L.A., Motten A.G. and Robert London. "Development of Fluorinated, NMR-Active Spin-traps for studies of free radical chemistry". Journal of Magnetic Resonance. 1989, 81, 57-67.

19. Khramtsov V.V., Berliner L.J. and Clanton T.L. "NMR spin trapping: Detection of free radical reactions using a phosphorus-containing nitrone spin trap". Magn.Reson.Med. 1999, 42, 228-234.

20. Khramtsov V.V., Reznikov V.A., Berliner L.J., Litkin A.K., Grigor'ev I.A., Clanton T.L. NMR spin trapping: detection of free radical reactions using a new fluorinated DMPO analog, Free Radical Biol, and Medicine, 2001, 30 (10): 1099-1107.

21. Berliner L.J., Khramtsov V., Fujii H., Clanton T.L. "Unique In Vivo Applications of Spin Traps". Free Rad.Biol.Med. 2001, 30(5), 489-499.

22. Finkelstein E., Rosen G.M. and Rauckman E.J. "Spin trapping of superoxide". Molecular Pharmacology. 1979, 16,676-685.

23. Finkelstein E. Rosen G.M. and Rauckman E.J. "Production of hydroxyl radical by decomposition of superoxide spin adducts". Molecular Pharmacology, 1982, 21, 262265.

24. Tuccio В., Lauricella R., Frejaville C., Bouteiller J.C. and Tordo P. "Decay of the hydroperoxyl spin adduct of 5-diethoyphosphoryl-5-methyl-l-pyrroline N-oxide: an EPR kinetic study". JChem Soc, Perkin Trans 2,1995,295-298.

25. Villamena F.A. and Zweier J.L. "Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbony 1-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis". JChem Soc, Perkin Trans 2, 2002,1340-1344.

26. Freedman M. "The chemistry and biochemistry of the sulfhydryl group in amino acids, peptides and proteins". Pergamon Press, New York. 1973.

27. Jocelyn, P.C. "Biochemistry of the SH group". Academic press, London, New York, 1972.

28. Jocelyn P.C. "Spectrophotometric assay of thiols". Methods Enzymol. 1987, 143, 4467.

29. Барсель B.A., Корочкин И.М., Архипова Г.В. "Коррекция некоторых биохимических нарушений липидного обмена у больных атеросклерозом с помощью антиоксиданта дибунола". Изв. АН СССР. Сер. биол., 1988,1, 75-85.

30. Вольский Н.Н., Кашлакова Н.В., Козлов В.А. "Влияние супероксидного радикала напролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном". Цитология. 1988, 30 (7), 898-902.

31. Grierson L., Hildenbrand К. and Bothe Е. "Intramolecular transformation reaction of the glutathione thiyl radical into a non-sulphur-centred radical: a pulse-radiolysis and EPR study". Int. J. Radiat. Biol. 1992, 62,265-277.

32. Curzio M., Esterbauer H„ Di Mauro C. "Chemotactic activity of the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal and homologous hydroxyalkenals". Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1986, 367, 321-329.

33. Скулачёв В.П. "В своем межмембранном пространстве митохондрия таит "белок самоубийства", который, выйдя в цитозоль, вызывает апоптоз". Биохимия. 1997,61 (И), 2060-2063.

34. Weiner L., Kreimer D., Roth E. and Siliman I. "Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a motlen-globule-like state". Biochem. Biophys. Res. Comms., 1994, 198 (3), 915-922.

35. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. "Перикисное окисление липидов в биологических мембранах". Наука, Москва, 1972,151с.

36. Berlin V. and Haselkine W.A. "Reduction of adriamycin to semiquinone-free radical by NADPH cytochrome P-450 reductase produces DNA cleavage in a reaction mediated by molecular oxygen". J.Biol.Chem., 1981, 256, 4747-4756.

37. Lin L., Hwang P.L. "Antiproliferative effects of oxygenated sterols: positive correlation with binding affinities for the antiestrogen-binding sites". Biochim. Et BiophysActa. 1991, 1082, 177-184.

38. Дикалов С.И. "Изучение восстановления хинонов и образования кислородных радикалов в биологических системах". Диссертация кандидата химических наук. Новосибирск 1994.

39. Cardillo С., De Sole P., Savi L., Mores N. "Effects of induced hypercholesterolemia on circulating rabbit polymorphonuclear leukocyte activation studied by chemiluminescence". Acta Med Romana, 1987, 25,447-454.

40. Fridovich I. "Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas". J. Biological Chemistry. 1989, 264 (14), 7761-7764.

41. Brunori M. and Rotilio G. "Biochemistry of oxygen radical species". Methods in enzymology. Academic Press, Inc. London, Ed. Parker L., 1984,105, 22-35.

42. Powis G., "Free radical formation by antitumor quinones". Free Radical Biol. Med., 1989,6,63-101.

43. Halliwell B. and Gutterige J.M.C. "Role of iron in oxygen radicalreaction". Methods in Enzymology. Academic Press, Inc. London, Ed. Parker L., 1984, 105,47-56.

44. Gelvan D., Moreno V., Gassmann W., Hegenauer J. and Saltman H. "Metal-ion-directed site-specificity of hydroxyl radical detection". Biochem. Biophys. Acta, 1992, 1116,183-191.

45. Halliwell B. and Gutterige J.M.C. "Hydroxyl radical assayed by aromatic hydroxylation and deoxyribose degradation". CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research (Ed. Greenwald) CRC Press, 1986,177-180.

46. Sies H. and Cadenas E. "Oxidative stress: damage to intact cells and organs". Phil. Trans. R. Soc. Lond, 1985, В 311, 617-631.

47. Suzuki Y.J., Tsuchiya M. and Packer L. "Thioctic acid and dihydrolipoic acid are novel antioxidants which intereract with reactive oxigen species". Free Radical Res. Comm., 1991, 15 (5), 255-163.

48. Suzuki Y.J., Tsuchiya M., Packer L. "Antioxidant activities of dihydrolipoic acid and its structural homologues". Free Radical Res. Comm., 1993, 18 (2), 115-222.

49. Козлов A.B., Азизова О. А. И Владимиров Ю.А. "Радиоспектроскопический анализ белков крови и возможности его использования в диагностике". Биофизические методы диагностики, 2-ой МОЛГМИ, Москва, Ред. Лопухин Ю.М. и Владимиров Ю.А., 1989, 40-63.

50. Engler R., Gilpin Е. "Can superoxide dismutase alter infarct size?" Circulation. 1989, 79, 277-285.

51. Akhlaq M.S., Schuchmann H.P., von Sonntag C. "The reverse of the 'repair' reaction of thiols: H-abstraction at carbon by thiyl radicals". Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys., Chem. Med. 1987, 51,91-102.

52. Schoneich C., Bonifacic M., Asmus K.D. "ReversibleH-atom abstraction from alcohols by thiyl radicals: determinationof absolute rate constants by pulse radiolysis". Free Radic. Res. Commun., 1989, 6, 393-405.

53. Schoneich C., Bonifacic M., Dillinger U. and Asmus K.-D. In "Sulfur-centered Reactive Intermediates in Chemistry and Biology" (C. Chatgilialoglu and K.-D. Asmus, eds.), Plenum, New York, 1990, p.367.

54. Schoneich C., Asmus K.D. "Reaction of thiyl radicals with alcohols, ethers and polyunsaturated fatty acids: a possible role of thiyl free radicals in thiol mutagenesis?" Radiat. Environ. Biophys. 1990, 29, 263-271.

55. Wardman P. "Reduction Potentials of One-Electron Couples Involving Free Radicals in Aqueous Solution". J. Phys. Chem. Ref. Data 1989, 18, 1637-1755.

56. Панин JI.E., Останина Л.С., Колпаков A.P. "К механизму контринсулярного эффекта апопротеина В". Вопросы мед. химии. 1995,41, вып. 6, 12-16.

57. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. "Активированные кислородные метаболиты в биологических системах". Успехи соврем, биологии. 1993,113, вып. 3, 286- 296.

58. Chisolm G.M., Ma G.P., Irwin К.С. "7p-hydroperoxycholest-5-en-3p-ol, а component of human atherosclerotic lesions, is the primary cytotoxin of oxidized human low density lipoprotein". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91, 11452-11456.

59. Held K.D. and Hopcia K.L. "Role of protein thiols in intrinsic radiation protection of DNA and cells" Mutation Research 1993,299 (3-4), 261-9.

60. Di Simplico P., Cheeseman K.H. and Slater T.F. "The reactivity of SH group of bovine serum albumin with free radicals". Free Rad. Res. Comms. 1991, 14, 253-262.

61. Brucekeller A.J., Begley J.G., Fu W.M. "Bcl-2 protects isolated plasma and mitochondrial membranes against lipid peroxidation induced by hydrogen peroxide and amyloid p-peptide". J.ofNeurochem. 1998, 70, 31-39.

62. Jongejan R.C., Dejongste J.C., Raatgeep R.C. "Effects of zymosan-activated human granulocytes on isolated human airways". Amer. Rev. Respir. Dis. 1991,143, 553-360.

63. Geriach H., Rossaint R., Pappert D., Faike K.J. "Time-course and dose-response of nitric oxide inhalation for systemic oxygenation and pulmonary hypertension inpatients with adult respiratory distress syndrome". Eur. J. Clin. Invest. 1993, 20, 499505.

64. Bielski B.H.J., Arudi R.L., Sutherland M.W. "A study of the reactivity of HO with unsaturated fatty acids"./. Biol. Chem. 1983, 258,4759-4761.

65. Bize I.B., Oberley L.W., Moms H.P. "Superoxide dismutase and superoxide radical in moms hepatomas". Cancer Res. 1980,40, 3686-3693.

66. Harrison R., Benboubetra M., Bryson S. "Antibodies to xanthine oxidase: Elevated levels in patients with acute myocardial infarction". Cardiosci. 1990, 1, 183-190.

67. Heinecke J.W., Kawamura M., Suzuki L., Chait A. "Oxidation of low-density lipoprotein by thiols: superoxide-dependent and independent mechanisms". J. Lipid Res. 1993,34, 2051-2061.

68. Маянский Д.Н. "Хроническое воспаление". M.: Медицина, 1991,272 с.

69. Genaro A.M., Hortelano S., Alvares A. "Splenic В lymphocyte programmed cell death is prevented by nitric oxide release through mechanisms involving bcl-2 levels". J. Clin. Invest. 1995, 95, 1884-1890.

70. Heinecke J.W. "Free radical modification of low-density lipoprotein: Mechanism and biological consequences". Free Radical Biol, and Medicine. 1987, 3, 65-73.

71. Beyer R.E. "The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation". Free Radical Biology&Medicine. 1990, 8, 545-565.

72. Теплова B.B., Кудрин А.П., Евтодиенко Ю.В. "Действиекумолгидропероксида на Са^+ индуцированный выход Са^+ из митохондрий и выживаемость клеток асцитной гепатомы". Биол. мембраны. 1997, 14, 520-528.

73. Закирова A.H. "Клинико-диагностическое значение показателей перекисного окисления липидов при ишемической болезни сердца". Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. ВКНЦ АМН СССР, 1981.

74. Hazell L.J., Arnold L., Flowers D. "Presence of hypochlorite-modified proteins in human atherosclerotic lesions". J. Clin. Invest. 1996, 97, 1535-1544.

75. Душкин М.И., Зенков H.K., Меньшикова Е.Б. "Влияние ингибиторов цитохрома Р-450 на окислительный метаболизм липопротеинов низкой плотности макрофагами". Вопросы мед. химии. 1996, 42, вып.1, 23-30.

76. Albina J.E., Cui S., Mateo R.B., Reichner J.S. "Nitric oxide- medicated apoptosis in murine peritoneal macrophages". J. Immunol. 1993, Vol. 150, 5080-5085.

77. Kim Y.M., Talanian R.V., Billiar T.R. "Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms". J. Biol. Chem. 1997,31138-31148.

78. Bose M., Farnia P. "Proinflammatory cytokines can significantly induce human mononuclear phagocytes to produce nitric oxide by a cell maturation-dependent process". Immunol. Lett. 1995, 48, 59-64.

79. Hibbs Jr.J.B. "Cytokine induced synthesis of nitric oxide from L-arginine: a cytotoxic mechanism that targets intracellular iron. Iron in Central Nervous System Disorders". Vienna: Springer-Verlag, 1993, p. 155-171.

80. Barclay L.R.C. "The cooperative antioxidant role of glutathione with a lipid-soluble and water soluble antioxidant during peroxidation of liposomes in the aqueous phase and in the lipid phase". J.Biol.Chem. 1998,263, 16138-16142.

81. Reddy C.C., Scholz R.W., Thomas C.E. and Massaro E.J. "Vitamin E dependent redused glutathione inhibition of rat microsomal lipid peroxidation" Life Sci. 1982, 571-576.

82. Haenen G.R.M.M. and A. Bast. "Protection against lipid peroxidation by a microsomal glutathione-dependent heat labile factor". FEBS Lett., 1983, 159, 24-28.

83. Соодаева C.K., Коркина Л.Г., Величковский Б.Т. Клегерис A.M. "Образование активных форм кислорода перитонеальными макрофагами крыс под влиянием цитотоксических пылей". Бюл. эксперим. Биологии и медицины. 1991,9,252-254.

84. Сыркин А.Л., Азизова О.А., Коган А.Х. "Влияние антиоксиданта коэкзима Q10 на окисляемость липопротеинов в плазме и антиперекисную резистентность плазмы у больных ишемической болезнью сердца". Кардиология, 1998, 10, 44-46.

85. Jain S.K., McVie R., Duett J., Herbst J.J. "Erythrocyte membrane lipid peroxidation and glycosylated haemoglobin in diabetes". Diabetes. 1989, 38, 1539-1543.

86. Garthwaite J. "Glutamate, nitric oxide, and cell-cell signalling in the nervous system". Trends Neurosci. 1991,14,60-67.

87. Jialal I., Vega G.L., Grundy S.M. "Physiologic levels of ascorbate inhibit the oxidative modification of low density lipoprotein". Atherosclerosis. 1990, Vol. 82, 185-191.

88. Cerutti P.A., Trump B.F. "Inflammation and oxidative stress in carcinogenesis". Cancer Cells. 1991,3, 1-7.

89. Зайковский Ю.Я., Ивченко В.Н. "Респираторный дистресс-синдром у взрослых". Киев: Здоров'я, 1987,184с.

90. Aviram М. "Oxidative modification of low dencity lipoprotein and its relation atherosclerosis". Israel. J.MedSci. 1995, 31,241-249.

91. Cohen H.J. and Fridovich I. "Hepatic sulfite oxidase. Purification and properties". J. Biol. Chem. 1971, 246, 359-366.

92. Petering D.H. "Sulfur dioxide: a view of its reactions with biomolecules". In: Biochemical Effects of Environmental Pollutants (S.D.Lee, Ed.). Ann Arbor Science, AnnArbor, MI, 1977, pp. 293-306.

93. Chantry G.W., Horsfield A., Morton J.R., Rowlands J.R. and Whiffen D.H. "The optical and electron spin resonance spectra of SO3*". Mol.Phys. 1962, 5,233-239.

94. Mottley C., Trice T.B. and Mason R.P. "Direct detection of the sulfur trioxide anion during the horseradish peroxidase-hydrogen peroxide oxidation of sulfite (aqueous sulfur dioxide)". Mol.Pharmacol. 1982, 22, 732-737.

95. Mottley C, Harman LS, Mason RP. "Microsomal reduction of bisulfite (aqueous sulfur dioxide)-sulfur dioxide anion free radical formation by cytochrome P-450". Biochem Pharmacol, 1985; 34(16), 3005-3008.

96. Sun X., Shi X. and Dalai N.S. "Xanthine oxidase/hydrogen peroxide generate sulfur trioxide anion radical (S03"') from sulfite (SO32")". FEBSLett., 1992, 303, 213-216.

97. Shi X. "Generation of SO3" and OH radicals in S03(2-) reactions with inorganic environmental pollutants and its implications to S03(2-) toxicity". J.Inorg. Biochemistry, 1994, 56(3), 155-165.

98. Graham A., Hogg N., Kalyanaraman B. "Peroxynitrite modification of low-density lipoprotein leads to recognition by the macrophage scavenger receptor". FEBS Lett. 1993,330, 181-185.

99. Frank S., Zacharowski K., Wray G.M. "Identification of copper/zinc superoxide dismutase as a novel nitric oxide-regulated gene in rat glomerular mesangial cells and kidneys of endotoxemic rats". FASEB J. 1999,13, 869-882.

100. Matthews J.R., Wakasugi N., Virelizier J.L., Yodoi J., Hay R.T. "Thioredoxin regulates the DNA binding activity of NF-kappaB by reduction of a disulfide bond involving cysteine 62". Nucleic Acid Res. 1992,20, 3821-3830.

101. Brune В., Gotz С., Mebmer U.K. "Superoxide formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis". J. of Biol.Chem. 1997, 272, 7253-7258.

102. Gilbert H.F. "Molecular and cellular aspects of thiol-disulfide exchange". Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1990, 63, 69-172.

103. Kirilin W. G., Gai, J., Thompson, S.A., Diaz, D., Kavanagh, T.J.; Jones, D.P. "Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers". Free Radical Biol, and Medicine.1999, 27, 1208-1218.

104. Church D.F., Pryor W.A. "Free-radical chemistry of cigarette smoke and its lexicological implications". Environ. Health Perspect. 1985, 64, 111-126.

105. Katsura M., Forster L.A., Ferns G.A.A., Anggard E.E. "Oxidative modification of low-density lipoprotein by human polymorphonuclear leucocytes to a form recognized by the lipoprotein scavenger pathway". Biocim. et Вiophys. Acta. 1994, 1213, 231-237.

106. Klebanoff S.J. "Oxygen metabolites from phagocytes". Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. N.Y.: Raven Press, 1992, p. 541-588.

107. Di Monte, D., Bellomo G., Thor H., Nicotera P. and Orrenius S. "Menadione-induced cytotoxicity is associared with protein thiol oxidation and alteration in intracellular Ca++ homeostasis". Arch.Biochem.Biophys. 1984, 235, 343-350.

108. Arrigo A.P. "Gene expression and the thiol redox state." Free Radical Biology&Medicine. 1999, 27, 936-944.

109. Suzuki Y.J., Forman H.J., Sevanian A. "Oxidants as stimulators of signal transduction". Free Radical Biology&Medicine. 1997,22,269-285.

110. Okamoto К., Tanaka H., Ogawa H., Makino Y., Eguchi H., Hayashi S., Yoshikawa N., Poellinger L., Umesono K., Makino I. "Redox-dependent regulation of nuclear import of the glucocorticoid receptor". J.Biol.Chem. 1999, 274, 10363-10371.

111. Broome J.D., Jeng M.W. "Promotion of replication in lymphoid cells by specific thiols and disulfides in vitro". J. Exp. Med. 1973, 138, 574-592.

112. Kim H.S., Lee J.H., Kim I.K. "Intracelular glutathione level modulates the induction of apoptosis by delta 12-prostaglandin J2". Prostaglandins. 1996, 51, 413425.

113. Aoshima H., Satoh Т., Sakai N., Yamada M., Enokido Y., Ikeuchi Т., Hatanaka H. "Generation of free radicals during lipid hydroperoxide-triggered apoptosis inPC12h cells". Biochim.-Bio-phys. Acta. 1997,1345, 35-42.

114. Hamilton R. F., Li L., Feldcr Т. В., Holian O.A. "Bleomycin induces apoptosis in human alveolar macrophages". Am. J. Physiol. 1995,269, L318-L325.

115. Okado A., Kawasaki Y., Hasuike Y., Takahashi M., Teshima Т., Fujii J., Taniguchi N. "Induction ofapoptotic cell death by methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in macrophage-derived cell lines". Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996,225,219-224.

116. Gabby M., Tauber M., Porat S., Simantov R. "Selective role of glutathione in protecting human neuronal cells from dopamine-induced apoptosis". Neuropharmacology. 1996,35,571-578.

117. Walmsley T.A., Abernethy M.H. and Fitzgerald H.P. "Effect of daylight on the reaction of thiols with Ellman's reagent.5,5Dithiobis(2-Nitrobenzoic acid)". Clin.Chem. 1987, 33,10,1928-1931.

118. Suzuki Y., Lyall V., Biber T.U.L. and Ford G.D. "A modified technique for the measurement of sulfhydryl groups oxidized by reactive oxygen intermediates". FreeRadical Biology&Medicine. 1990, 9,479-484.

119. Berson G. and Marquet A. "Dosage des groupes sulfhydryles des proteins myofibrillaires cardiaques: effet des radicaux libres oxygenes in vitro". C. R. Soc. Biol. 1990,184,31-36.

120. Пескин A.B. "Взаимодействие активного кислорода с ДНК". Биохимия. 62, вып. 12,1571-1578.

121. Уманский С.Р. "Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы". Мол. биология. 1996, 30,487-502.

122. R.P. Szaewski and G.M. Whitesides "Rate constants and equilibrium constants for thiol-disulphide interchange reactions involving oxidized glutathione". J. Am. Chem. Soc. 1980, 102,2011-2026.

123. Briehl M.M., Cotgreave I. A., Powis G. "Downregulation of the antioxidant defense during glucocorticoid-mediated apoptosis". Cell Death and Differentiation. 1995, 2, 41-46.

124. Albina J.E. "On the expression of nitric oxide synthase by human macrophages. Why no NO?" J. Leukocyte Biol. 1995, Vol.58,643-649.

125. Candido A., Rossi P.L., Lippa S. "Granulocyte activity in leukemias and other hemopathies"Acta Med. Rom. 1984,22,217-224.

126. Cenci E., Romani L., Mencacci A. "Interleukin-4 and interleukin-10 inhibit nitric oxide-dependent macrophage killing of Candida albicans". Eur. J. Immunol. 1993, 23, 1034-1038.

127. Janzen E.G. and Hare D.L. "Two decades of spin trapping". Advances in Radical Chemistry, 1990, 1,235-295.

128. Toxicology of the human environment: the critical role of free radicals, ed. C.J. Rhodes. New York, Taylor&Francis Inc., 2000.

129. Lai E.K., McGay P.B., Noguchi Т., and Fong K.-L. "In vivo spin-trapping of trichloromethyl radicals formed from ССЦ". Biochem. Pharmacol. 1979, 28, 22312235.

130. Knecht К.Т., and Mason R.P. "In vivo radical trappingand bilary secretion of radical adducts of carbon tetracloride-derived free radical metabolites". Drug. Metab. Disposit. 1988,16,813-817.

131. Kadiiska M.B., Xiang Q.H. and Mason R.P. "In vivo free radical generation by cromium (VI): an electron spin resonance spin-trapping investigation". Chem. Res. Toxicol., 1994, 7, 800-805.

132. Janzen E.G., Towner R.A. and Haire D.L. "Detection of free radicals generated from the in vitrometabolism of carbon tetracloride using improved ESR spin trapping techniques". Free Rad. Res. Comms, 1987, 3, 357-364.

133. Knecht K.T., DeGray J.A., and Mason R.P. "Free radical metabolosm oh halothane in vivo: Radical adducts detected in bile". Mol. Pharmacol. 1992, 41, 943-949.

134. Chamulitrat W., Jordan S.J., and Mason R.P. "Fatty acid radical formation in rats administered oxidized fatty acids: In vivo spin trapping investigation". Arch. Biochem. Biophys. 1992,299,361-367.

135. Di Luzio N. R. "Prevention of the acute ethanol-induced fatty liver by antioxidants". Physiologist 1963, 6,169.

136. Slater T.F. "Free radical mechanisms in tissue injury", Pion Limited, London. 1972.

137. Knecht K.T., Bradford B.U., Mason R.P. and Thuriman R.G. "In vivo formation of a free radical metabolite of ethanol". Mol.Pharmacol. 1990, 38, 26-30.

138. Reinke L.A., Lai E.K., DuBose C.M. and McGay P.B. "Reactive free radical generation in vivo in heart and liver of ethanol-fed rats: Corelation with radical formation in vitro". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987, 84, 9223-9227.

139. Laurindo F.R., Pedro M.dA., Barbeiro H.V., Carvalho M.H., Augusto O. and da Luz P.L. "Vascular free radical release. Ex vivo and in vivo evidence for a flow-dependent endothelial mechanism". Circ. Res. 1994, 74, 700-709.

140. Tang X.L., McCay P.B., Sun J.Z., Hartley C.J., Schleman M. and Bolli R. "Inhibitory effect of a hydrophilic alpha-tocopherol analogue, MDL 74,405, on a generation of free radicals in stunned myocardium in dogs". Free Rad. Res. 1995, 22, 293-302.

141. Miyajima Т. and Kotake Y. "Spin-crapping agent, phenyl N-tert-butyl nitrone, inhibits induction of nitric oxide synthase in endotoxin-induced shock in mice." Biochem Biophys Res. Commun. 1995,215, 114-121.

142. Novelli G.P., Angiolini R., Tani G., Consales L. and Bordi. "Phenyl-t-butyl-nitrone is active against traumatic shock in rats". Free Rad. Res. Comms. 1985,1, 321-327.

143. De Santis G. and Pinelli M. "Microsurgical model of ishemia reperfusion in rat muscle: evidence of free radical formation by spin trapping". Microsurgery, 1994, 15, 655-759.

144. Kadiiska M.B., Hanna P.M., Hernandez L., and Mason R.P. "In vivo evidence of hydroxy 1 radical formation after acute copper and ascorbic asid intake: Electron spin resonance spin-trappin investigation". Mol. Pharmacol. 1992,42, 723-729.

145. Quine R.W., Rinard G.A., Ghim B.T., Eaton S.A. and Earon G.R. "1-2 GHz pulsed and continuous wave electron paramagnetic resonance spectrometer". Rev. Sci. Instrum. 1996, 67, 2514-2527.

146. Carney J.M. and Floyd R.A. "Protection against oxidative damage to CNS by alpha-phenyl-tert-bntyl nitrone (PBN) and other spin-trapping agents a novel series of nonlipid free radical scavengers"./ Mol Neurosci 1991, 3, 47-57.

147. Inanami O. and Kuwabara M. "Alpha-phenyl n-tert-butyl nitrone (PBN) increases the cortical cerebral blood flow by inhibiting the breakdown of nitric oxide in anesthetised rats". Free Rad Res. 1995, 23, 33-39.

148. Thomas C.E., Camey J.M., Bemotaa R-C., Hay D.A. and Carr A.A. "In vitro and in vivo activity of a novel series of radical trapping agents in model systems of CNS oxidative damage". Ann. NYAcadSci. 1994, 738,243-249.

149. Lancelot E., Revaud MI., Boulu R.G., Plotkine M., and Callebert J. "Alpha-phenyl N-rert-butylnitrone attenuates excitotoxicity in rat striatum by preventing hydroxyi radical accumulation". Free Radical Biol, and Medicine. 1997,23, 1031-1034.

150. Thomas C.E., Huber E.W. and Ontweiler D.P. "Hydroxyi and peroxyl radical trapping by the monoamine oxidase-B inhibitors deprenyl and MDL 72,974A: implications for protection of biological substrates". Free Radical Biology&Medicine. 1997, 22, 733-737.

151. Piccinini F., Bradamante S., Monti E., Zhang Y.K. and Janzen E.G. "Pharmacological action of a new spin-trapping compound, 2-phenyl DMPO, in the adriamycin-induced cardiotoxicity". Free Rad Res. 1995, 23, 81-87.

152. Andersen K.A., Diaz P.T., Wright V.P., Clanton T.L. "N-tert-butyl-alpha-phenylnitrone: a free radical trap with unanticipatedeffects on diapharm function". J. Appl. Physiol. 1996, 80, 862-868.

153. Janzen E.G., Poyer J.L., Schaefer C.F., Downs P.E., DuBose C.M. "Biological spin-trapping II. Toxicity of nitrone spin trasps: dose-ranging in the rat". J.Biochem.Biophys Methods. 1995,30,239-247.

154. Merrier A., Berchadsky Y., Badrudin Y., Pietri S., Tordo P. "Phosphorylated 5-membered ring nitroxides, a new class of stable nitroxides. 1. Synthesis by reaction of dialkylphosphites with 1-pyrroline-N-oxides". Tet. Lett. 1995, 32,2125-2128.

155. Mclntire G.L., Blount H.N., Stronks H.J., Shetty R.V. and Janzen E.G. "Spin-trapping in electrochemistry. 2. Aqueous and nonaqueous electrochemical characterization of spin-traps". Journal of Physical Chemistry. 1980, 84, 916-921.

156. Sosonkin I.M., Belevskii V.N., Strogov G.N., Domarev A.N. and Yarkov S.P. "Selectivity of spin-traps. Oxidation-reduction reactions", Journal of Organic Chemistry of USSR, English Translation, 1982,18,1313-1320.

157. Pearson R.G. "Ionization potentials and electron affinities in aqueous solutions". Journal of American Chemical Society, 1986, 108, 6109-6114.

158. Eberson L. Electron Transfer Reactions in Organic Chemistry, Heidelberg: Springer-Verlag, 1987.

159. Ononye A.I., Mcintosh A.R. and Bolton J.R. "Mechanism of the photochemistry of p-benzoquinone in aqueous solution. 1. Spin-trapping and flash photolysis electron paramagnetic resonance studies". Journal of Physical Chemistry, 1986, 90, 6266-6270.

160. Monroe S. and Eaton S.S. "Photo-enhanced production of the spin adduct 5,5,-dimethyl-l-pyrroline-N-oxide/'OH in aqueous menadione solutions". Archives of Biochemistry and Biophysics, 1996, 329, 221-227.

161. Eberson L. "Formation of hydroxyl and hydroperoxyl spin adducts via nucleophilic addition-oxidation to 5,5-dimethyl-l-pyrroline N-oxide (DMPO)". Acta Chemica Scandinavica, 1999, 53, 584-93.

162. Alegria A.E., Ferrer A. and Sepiilveda E. "Photochemistry of water-soluble quinones. Production of a water-derived spin adduct". Photochemistry and Photobiology. 1997, 66, 436-442.

163. Janzen E.G. and Blackburn B.J. "Detection and identification of short-lived free radicalsby an electron spin resonance trapping technique". Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 5909-5910.

164. Bonnet R., Brown R.F.C., Clark V.M., Sutherland I.O. and Todd A. "Experiments towards the synthesis of corrins. Part II. The preparation and reactions of deltal-Pyrroline 1 -oxides". J Chem Soc, 1959, 2094-2102.

165. Keisuke Makino, Takuya Hagiwara, Akifumi Hagi, Masatoshi Nishi and Akira Murakami. "Cautionary note for DMPO spin trapping in the presence of iron ion". Biochemical and Biophysical research communications. 1990, 172 (3), 1073-1080.

166. Hanna P.M., Chamulitrat W. and Mason R.P. "When are metal ion-dependent hydroxyl and alkoxyl radical adducts of 5,5-dimethyl-l-pyrroline N-oxide artefacts?". Archives of Biochemistry and Biophysics, 1992, 296, 640-644.

167. Janzen E.G., Wang Y.Y. and Shetty R.V. "Spin-trapping with oc-pyridyl 1-oxide N-tert-butyf nitrones in aqueous solutions. A unique electron spin resonance spectrum for the hydroxyl adduct". Journal of American Chemical Society, 1978, 100, 29232925.

168. Hassan A., Wazeer M.I.M. and Ali Sk.A. "Oxidation of N-benzyl-N-methylhydroxylamines to nitrones. A mechanistic study". Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998,393-399.

169. Володарский Л.Б., И.А. Григорьев, C.A. Диканов, B.A. Резников, Г.И. Щукин. "Имидазолиновые нитроксильные радикалы". Новосибирск, Наука, Сибирское отделение. 1988.

170. Eberson L. and McCullough J.J. "Generation of triacyanomethyl spin adducts of alpha-phenyl-N-terf-butylnitrone (PBN) via non-conventional mechanisms". J Chem Soc, Perkin Trans 2, 1998,49-58.

171. Sang H., Janzen E.G. and Lewis B.H. "Mass spectrometry and electron paramagnetic resonance study of free radicals spontaneously formed in nitrone-peracid reactions". J Org Chem, 1996,61,2358-2363.

172. Eberson L. "Spin trapping and electron transfer". Advances in Physical Organic Chemistry, 1998,31,91-141.

173. Janzen E.G. "A critical review of spin trapping in biological systems" In Free Radicals in Biology (W.A. Pryor, Ed.), vol IV, pp. 115-154. Academic Press, New York, 1980.

174. Moreno S.N .J., Stoize K., Janzen E.G. and Mason R.P. "Oxidation of cyanide to the cyanyl radical by peroxidase/H202 systems as determined by spin-trapping". Archives of Biochemistry and Biophysics, 1988, 265, 267-271.

175. Eberson, L. and Persson, "Spin adduct from the reaction between N-phenyl-a-tert-butylnitrone (PBN) and activated olefins. A facile pathway converting PBN into 2-methyl-2-nitrosopropane (MNP)". Acta Chemica Scandinavica, 1998, 52, 1081-1095.

176. Chamulitrat W., Jordan, SJ., Mason R.P., Saito K. and Willson R. "Nitric oxide formation during light-induced decomposition of phenyl N-tert-butylnitrone". Journal of Biological Chemistry, 1993, 268,11520-11527.

177. Farhataziz and Ross A.B. "Selected specific rates of reactions of transients from water in aqueous solution. III. Hydroxyl radical and perhydroxyl radical and their radical ions". Natl. Stand. Ref. Data Ser. (U. S., Natl. Bur. Stand.) 1997, 59, 1-113.

178. Volodarsky L.B., Reznikov V.A., Ovcharenko V.I. "Synthesic Chemistry of Stable Nitroxides". CRC Press, Inc, Boca Raton, Florida 33431,1994.

179. Roubaud V., Sankarapandi S., Kuppusamy P., Tordo P. and Zweier J.L. "Quantitative measurement of superoxide generationusing the spin trap 5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-l-pyeeoline-N-oxide". Analyt Biochem, 1997, 247, 404-411.

180. Haire D.L. and Janzen E.G. "Synthesis and spin-trapping kinetics of new а1куд substituted nitrones". Canadian Journal of Chemistry, 1982, 60, 1514-1522.

181. Kotake Y. and Janzen E.G. "Decay and fate of the hydroxyl radical adduct of a-phenyl-N-terf-butylnitrone in aqueous media". Journal of American Chemical Society, 1991, 113,9503-9506.

182. Janzen E.G., Hinton R.D. and Kotake Y. "Substituent effects on the stability of the hydroxyl adduct of a-phenyl-N-tert-butylnitrone (PBN)". Tetrahedron Letters, 1992, 33, 1257-1260.

183. Pietri S., Liebgott Т., Frejaville C., Tordo P., Culcasi M. "Nitrone spin traps and their pyrrolidine analogs in myocardial reperfusion injury: hemodynamic and ESR implications". Eur. J.Biochem., 1998, 254, 256-265.

184. Bordwell FG & Liu W.Z. "Equilibrium acidities and homolytic bond dissociation energies of N-H and/or O-H bonds in N-phenylhydroxylamine and its derivatives". J Am Chem Soc, 2003, 118, 8777-8781.

185. Hayon E., Treinin A. and Wilf J. "Electronic spectra, photochemistry, and autoxidation mechanism of the sulfite-bisulfite-pyrosulflte systems, the SO2"*, SO3", S04"*, and S05" radicals". J.Am.Chem.Soc., 1972,94,47-57.

186. Glasoe P.K., Long F.A. "Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide". J.Phys.Chem., 1960, 64,188-190.

187. Huie R.E. and Neta P. "Chemical behavior of S03- and S05- radicals in aqueous solutions". J. Phys. Chem., 1984, 88, 5665-5669.

188. Potapenko D.I., Bagryanskaya E.G., Reznikov V.A., Clanton T.L. and Khramtsov V.V. "NMR and ESR studoies of the reaction of nucleophilic addition of (bi)sulfite to the nitrone spin trap DMPO". Magnetic Resonance in Chemistry, 2003,41, 603-608.

189. Floyd R.A., Hensley K., Forster M.J., Kelleher-Andersson J.A. and Wood P.L. "Nitrones, their value as therapeutics and probes to understand aging". Mech Ageing Dev, 2002, 123, 1021-1031.

190. Kotake Y. "Pharmacologic properties of phenyl N-tert-butylnitrone". Antioxid Redox Signal., 1999, 1,481 -499.

191. Iversen P.E. and Lund H. "Electroorganic preparations. XVIII. Preparations and polarographic determination of some N-alkylhydroxylamines". Acta Chemica Scandinavica, 1965,19, 2303-2308.

192. Sayo H., Ozaki S. Masui M. "Oxidation of N-alkylhydroxylamines. IV. Anodic oxidation of N-alkylhydroxylamines". Chemical Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 1973,21, 1988-1995.

193. Wood P.D. Mutus B. and Redmond R.D. "The mechanism of photochemical release of nitric oxide from S-nitrosoglutathione". Photochemistry and Photobiology. 1996, 64,518-524.

194. Barrett J., Debenham D.F., & Glauser J. "The electronic spectrum and photolysis of S-nitrosotoluene-alpha-thiol". Chem. Commun., 1965, 248-249.

195. Pou S. and Rosen G.M. "Generation of thiyl radicals by nitric oxide: a spin trapping study". J Chem Soc, Perkin Trans 2,1998, 1507-1512.

196. Xianglin Shi, Zigang Dong, Nar S.Dalal, Peter M. Gannet. "Chromate-mediated free radical generation from cysteine, penicillamine, hydrogen peroxide, and lipid hydroperoxides". Biochemica et Biophysica Acta. 1994, 1226, 65-72.

197. Davies M.J., Forni L.G. and Shuter S.L. "Electron spin resonance and pulse radiolysis studies on the spin trapping of sulfur-centered radicals". Chem.-Biol. Interact., 1987,61, 177-188.

198. Wardman P. "Reactions of Thiyl Radicals"; In Biothiols in Health and Disease; Packer L, Cadenas E, eds. Marcel Dekker: New York, Basel, Hong Kong, 1995; pp 119.

199. Tamba M., Simone G. and Quintiliani M. "Interactions of thiyl free radicals with oxygen: pulse radiolysis study". J Radiat Biol, 1986,150, 595-600.

200. Khramtsov V.V., Weiner L.M., Gogolev A.Z., Grigor'ev I.A., Starichenko V.F., Volodarsky L.B. Magn.Reson.Chem. 1986,24, 199-207.

201. Grigor'ev I.A., Shchukin G.I., Khramtsov V.V., Vainer L.M., Starichenko V.F. and Volodarsky L.B. "Conversion of 3-imidazolin-3-oxide nitroxyl radicals into nitronylnitroxyl radicals". J. Organic Chem. of USSR, English Translation, 1986, 2169-2177.

202. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. «Магнитный резонанс и его применение в химии». Москва, Мир, 1970,448 стр.

203. Ленинджер А. «Основы биохимии». т1. Москва, Мир, 1985.

204. Nohl H, Stolze К, Weiner L.M. "Noninvaisive measurement of thiol levels in cells and isolated organs". Methods Enzymol. 1995,251,191-205.

205. Hart T.W. "Some observations concerning S-nitroso and phenylsulphonyl derivatives of L-cysteine and glutathione". Tetrahedron Lett, 1985, 26, 2013-2016.

206. Molokov I.F., Tsentalovich Yu.P., Yurkovskaya A.V., Sagdeev R.Z. "Investigation of the photo-Fries rearrangement reactions of 1- and 2-naphthyl acetates". Photochem.Photobiol.A: Chem. 1997, 110(2), 159-165.

207. Tsentalovich Yu.P., Kulik L.V., Gritsan N.P., Yurkovskaya A.V. J.Phys.Chem.A. 1998, 102, 7975-7980.

208. Becke A.D., "A new mixing of Hartree-Fock and Local Density-Functional Theories". J. Chem. Phys., 1993, 98, 1372-1377.

209. Hariharan P. C., Pople J. A. "The influence of polarization functions on molecular orbital hydrogenation energies". Theor. Chim. Acta. 1973, 28, 213-222.

210. Miertus S., Scrocco E., Tomasi J. "Electrostatic interection of a solute with a continuum. A direct utilization of ab initio molecular potentials for prevision of solvent effects". Chem. Phys. 1981, 55,117.

211. Miertus S., Tomasi J. "Approximate evaluations of the electrostatic free energy and internal energy changes in solution processes". Chem. Phys. 1982, 65, 239-245.

212. Cossi M., Barone V., Cammi R., Tomasi J. "Ab initio study of solvated molecules: A new implementation of the polarizable continuum model". Chem Phys Lett, 1996, 255, 327-335.

213. Keith T.A., Bader R.F.W. "Calculation of magnetic response properties using atoms in molecules". Chem. Phys. Lett., 1992,194, 1-8.

214. Keith T.A., Bader R.F.W. "Calculation of magnetic response properties using a continuous set of gauge transformations". Chem. Phys. Lett., 1993,210,223.

215. Cheeseman J.R., Frisch M.J., Trucks G.W., Keith T.A. «А comparison of models for calculations nuclear magnetic resonance shielding tensors" J. Chem. Phys., 1996. 104, 5497.

216. Janzen E.G., Liu J. "Radical addition reactions of 5,5-dimethyl-lpyrroline-1-oxide. ESR spin trapping with a cyclic nitrone." Journal of Magnetic Resonance, 1973, 9, 513-516.

217. Bilski P., Chignell C.F., Szychlinski J., Borkowski A., Oleksy E., Reszka K. "Photooxidation of organic and inorganic substrates during UV photolysis of nitrite anion in aqueous solution". Journal of American Chemical Society, 1992. 114, 549556.

218. Josephy P.D., Rehorek D., Janzen E.G. "Electron spin resonance spin trapping of thiyl radicals from the decomposition of thionitrites". Tetrahedron Letters, 1984, 25, 16, 1685-1688.

219. Stolze K., Udilova N., Nohl H. "Spin trapping of lipid radicals with DEPMPO-derived spin traps: detection of superoxide, alkyl and alkoxyl radicals in aqueous and lipid phase". Free Radical Biology&Medicine, 2000,29, 10, 1005-1014.