Исследование процессов разделения моноклональных ...глобулинов методами электрофореза и ..обменной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ

Российская Академия Наук Институт Сизической л!г«'и;1

' " о ' i ,,

па прзплк рукописи

Стояка» Александр •■„.'.¿ръуьп

КССЯЕЙОВИПП». !ÍT0![i"r0r. Р/аДЕШШ ЮКОКДОЯАЛЬПйЛ »П^Т.ОГГСБМЯЕШ ННТОДПИ! ЭЛЕЭТИКОРЕЗЛ V-UTTm ЯГШХТСГРШП!

02.00.30 Хрсматогргфия

Анторйфррат диссертации на списка»))» учпноя стрпени кандидата кчммческик наук

Носкра 1993

Работа выполнена п лаборатории иммунохимии Научно-Производственного Центра Медицинской Биотехнологии ИЗ РФ.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

С.Н. Курочкин.

Официальны? оппонента: доктор химических наук

А.И. На-шничея,

кандиг.'.т физико-математических наук Д.Л. Зворькин.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Ч.Баха РАН

Защита состоится "--" декабря 193.4 г. в - часов

на заседании специализированного совета Д 002.95.02 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте ФнэичесхоП Химии РАН по адресу: 117915 Москва, В-312, Ленинский .троегтект, 31, ИФХ.

С диссертацией мог.ко ознакомиться в библиотеке Института Оиэм1" ?схои Химии РАН.

Автореферат разослан "-" декабря 1993 г.

Ученья секретарь сггттлиэировянкпгс совета кангиват химических наук

Л.Н. Коломиш

ОБ'ГЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА "ЛНОТТ.? АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Современная биохимии предлагает ряд пнсокс ^фективннч технологий для очистка белкой чзинчайно больсгое значение имеют хроматогра^кческио г

электрофоретнияслиг» кнтодь, при з ом накоплен огромна' Фактический материал, пспученный в каяп.ом конкретном случче в результате трудоемких экспериментов. Кслзльзоплк»*!» такого роде эхсперимрнтэльикх данных ч п. огэпсльио»; случае достаточно затруднительно, что делает актуальны»* исследование теоретически* аспектов процессов, происходящих при разделении белков.

Среди других мокко выделить группу катодов, ;*спольяуюгл*'• зависимость поверхностного заряда молекулы от параметров-водной среды. К таким методам относятся ионоСченная хроматография и изоэлехтрическое фокусирование. Эти меюдк обладают больной универсальностью. -высокой тотеиииэльнов разрешающей способностью к вксокой про'/явоципгльностью.

Теоретическому исследованию процессов раздялвячя бглкон к етодами, использующими зависимость подпек •> ст:г от р!т, посвяцеип оскоянзя часть настояцеС работа-. Больги^гтгг; теоретически палучат:чх пыбодоп д лч ^ опт :";;!;зан1:и лрочл саг г; Фракционирования бито проиллюстрировано г, дачной ргботе ка практике. Осчоеньм экспериментальны» объектом исследований являлись моноклональчня иммуноглобулины (акти ;еМ) ?Р7, 2ПЯ ПК5, специфичные к простаглаидюпм серии

• Дос!ихенив высокой степени разрекенкп возможно тавь при наличии ииоорнаци о свопстзах раэделяених объектов. Теоретическое моделирование зависимости подвижности моле/ули от рН среди дает возможность иегосредстчекно оптимизировать выбор условии хроматограцгического разделения; полученные результаты, также, могут быть использованы для моделирование процессов, происходящих при ряектрофоретиче^кок разделения белков. 'Применение последовательной схему диссоциации для теоретического -описании процесса формирования заряда белковой молекулы (Ргия!1:, ХаяАска, 1984) нельзя признать адекяатнкч. йс пользование экспериментальных зависимостей подвижности от рН (РЪагпасЗа Арр"! 1саЬ1оп Мо£е 1 93Тг Остермгк г Л.А. 1Ч8зРдля вь'бора оптимальных условий разделен!'?, требу--т учета дополнительных: фг.хторог (наличие в какого трп'и.';

ОЙ'ЛАР ХАРАКТЕРИСТИКА РАКОТ.Ы АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ; Современная биохимия предлагает ряд внеокоз.гФактивкнх гехиологиЯ для очистки 6йЛ'"ор, чрезвычайно большой значение имеют хроматограФическиа и

злектрофорети^ескио методы, при этом накоплен огромный фактическая материал, полученный в каждом конкретном случае в результата трудоемких экспепиментог.. Исколг.зопаниа такого рода окспери~*9!»та льв их данных л прэезнэлмюк случае достаточно затруднительно» что делает актуальном исследований теоретических аспектоя процессов, проискодящи:-; при разделении белков.

Среди других notHo оыделить группу методов. используощшс зависимость поверкност«:ого заряда молекулы от параметров водной среды. К так»:« методам относятся конобмонна!. хроматография и кзозлоктркческое сокусггроаанив. Эти метод; обладают большая универсальностью, яысоко« гтотекщакы;<-ч, разрезающей способностью и високос прокзподительнастьи.

Теорьтичрсксму исследованию процсссоп разделения белков и стодами, мспэгьэуааими зависимость подвижности от рН, 4 посопдена оскоакаи часть насюяц^е работы. Больииистпа теоретически получзни ге выводов для оптимизации процесс««. Фракционирования было проиоюстрироваио п данной работе гг. практике. Оснояньк зкеперииентадьнш объектом ксслс/.оиаш;.: являлись ►'оноклоьйп.ные иммуноглобулины (антитела) 2F7, 2К2 ?G5, спецк?к,п»ыз к прастагяандинал ссрш. г .

Достшгелко lucokoя стапени par;. • д.-«:. . josmosho якзд пр;; наличии шооручцк о свойствах разделяемых объектов. Теоретическое- моделирование зависимости подпихкости молекул;.: от рН среды дает козмогнасть кепосрсдствсяио оттамззфогг.ть выбор условий кромагографггчьс.чего разделения; погучепкь-к-результаты, такае, когут бить использованы для кодолкрогмшиг пр "цос: с о г., праисподяздх при л;; к г р а о р с- т и ч е с к с I, г i>...r;v~: .ni.A.

балкон. npiMf-HtiHHL- ПОСЛСДОИаТ iT'JibHO il СХЕМЫ ДПССОЦИ.'! для

теоретического еттсяния npcuacca формирования ^г.рядс белковой молекулы (Prusik, KasicUa, '.984) нельзя признать арекьаткыч. Кспояьзоиаикр з л сперумсятальш»х ч-истоайи подышкостн от р!-* {Pfccroacio Azp} icatton Note i?32; Qcrc-i-azu Л.A. 13855 ддк i;«5opa onVKM-uuur.: условий рагдёЛипИД трьОует учетл поиллкйтопьккч фа*торов (наличие ькэхого трьиил;

групп, ИМСКгГ.ИСЯ п неходко? молекуло.

- Предложена лодеяь для чиг„темного расчета динамики процесса изоэлектроОокусировгишя, 'дозволяющая учесть

ЗаИИС/МОСТЬ ПОДЧЮККОСТИ ОТ рЧ И НЯЛИНРЙНОСТЬ

злектропроьодности.

- В экспериментах' по очистке ГаЬ-Орагмечтов при помочи ионообменной кроматограсши достигнуты результаты, превосходящие по степени разремения известный ранее ,ия покойных объектов. Впервыа бияи поручены р1-гомоген?.КР составляющие спектротипа нонокганальннх антител.

- Впервые теоретически описан специфический тип микрогетерогенности, надетектируемш при помощи метода

при которой отдельные молекулы различаются только местоположением односменных ■заряженных групп.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Развитый в работе метод расчета кривых титрования, в»чючающмй способ числечого расчета для произрольноа Селкогой молекулы с известноя первичной сгуктурои (или аминокислотным составом), мочет быть использован для выбора оптимальной схемп! очистки какого-либо белка из произвольных исходных белковых с.Аеспй.

СформуаироваиНпК подход к теоретическому описании проблемы микрогетерогенности белков, не только дает возможность описать часто встречающиеся на практике явления, но и, в ряде случаев, получить практические рекомендации по выделению исследуемых белков. Открытие микрогетерогенности, недетектируемой методом изоэлектрического фокусирования, также, имеет важное практическое значение, например, для кристаллизации белков.

Предложенный схемн очистки моноклональных антител и КаЬ-фрагментов могут применятся в иммунокимии в тех случаях, когда требуется оченп высокая степень чистоты конрчных продуктов.

ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

.1. Разработан метод теоретического моделирования зависимости подвижности белковой мохекулн от рН среды. Создана программа, позволяющая рассчитать даннуч зависимость для любой молекулы с известной перпичноя структурой. Результаты теории исполь?онзны д/я выбера услзвил разделения

ct'wfob Md годами ко но обмин ноя хрома то гравии и преларгтквчого и за э п с- •< тр ичк с: ко го io к у с про ва н и к.

2. Предложен метод оценки, агияиис вариации в первичной пцухтуге белковой молекулы на значение аэоэлектричэскеи ¡очгц. Нолучьнь. иор.-уяи для всех вогыокнну частник случаев.

сравнении с опытными данными, известными из лск-ратуры. Теоретически проанализирован тип

кикрог'^тйроггкности. при которой имеется очень незначительное различие и суммарном электрическом заряде мовркул, соотгетстпуюцих отдельным компонентам ИЗФ-гпектра. Пткалзно, что специ^ичйскии. тип микрогетерогенности при котором отдельные» молекулы различаются только местопололнием односменных гаря;/;;ннш групп очень часто ньлнытс/ черазрешаемым для метода »ОФ.

.3. Предложена модель для описания процесса пзозлектрофокусироваиия, на основе которой випегкен hiijjifehhhii расчет. Результата расчета позволили описать поведение фокусируемого вещества в среде с переменной электропроводностью и оптимизировать условия разделения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты работы докладывались на IV Всесоюзном совещании но таорич и практике электрофореза в 1987г, на III Биотехнологическом симпозиуме' (Майами, США) в ЮЗог, на Всесоюзно)/ совещании "Научные и практические аспекты электрофореза" в 199СГ, на XVI научной конференции молодых ученых и специалистов МФТИ е 1991 г на VI Всероссийском симпозиуме по' молекулярной жидкостной хроматографии в 1993г. По результатам диссертации опубликована 4 статьи.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЙ. Диссертационная работа состой! из впадения, обзора (1гл.), пяти глчп оригинального содержания, приложения к биилиографик. Общий объем диссертации составляет 139 страниц, из которых 34 занимают рисунки и схьмы, 9 список лепояьзуемой литературы.

СОДЕРКАШЕ РАБОТУ.

В обзора <Дгл.) описаии оскэвние принципа некоторых методов разделения белков, которые испольэут различия в нодвмшостях разделяемых паществ в зависимости от рН срады: кгл-погНйнкой хроматографии, изозлектрсЬокусирования к хр-чато.гокугиропаьин. Приводятся способы повышений

раэрена'сг;еи способности. Характерияурто: .теток*-".'» трт^тг^: трг.рйтк«гс«-огя модельрочачия аавтг-'зст/ тойчихногти белке-зоа телекулн от кислотности среди гиндунк/

иэоэлектро^окусирояаник. Применительно г рассмотрений1 методам, анализируются особенности очистки мококлональнкх ачтитьл и их антигеноэязываюших фрагм птоя.

Наличие информации о поьедении зависимости -¡арляд белковой молекулы от рЬГ среды имеет чрезвычайно большое значение при выборе условий разделения при помоги ионообменной хроматографии, а также, при помощи различных эяектрофоретических методов.

Известен подход к моделирования кривых титрования, при хотором было предложено рассматривать диссоциацию белковой ...элекулы в водном растворе как диссоциацию полиамфолита -многоступенчатой кислоты и основания (Калька, Рг'иг1к (1934), Бабскии и Жуков (1990)):

И1* 411 Н1"1!* + Р,"1-1 З1 К"1 + Н*

3.-1 -

г-1-..м

где положительно заряженный пои, Ьг -константа

диссоциации, ^-"--"-отрицательно заряженный иок, аа. -константа диссоциации, н к м - количества кислотных и основных групп. При этом заряд белковой молекулы рассчитнвался как среднее значение заряда всех-существующих в растворе форм.

Такой подход можно объяснить механическим перенесением механизма ступенчатой диссоциации (справедливой для многоосновньх кислот и оснований ) на молекулу белка без учета природы объекта, где пыпеупом.чнутая схема несправедлива в принципе, и существует боль ¡сое количество групп, способных к диссоциации, значения рК которых могут быть одинаковыми (достаточно близкими). Данный подход является не только неправильным с точки зрэния формальной кинетики, но и внутренне противоречивым: первоначально делается предположение об одновременном существовании в растворе мнокества различных изоформ (различающихся значением заряда), после чего среднее значение (единственное) приписывается молекуле белка. Кроме этого, возникает проблема неоднозначности априорного (в отсутствии информации Оо примерном значении изо-электрической точки)

viuSopa нулевого состсяниг. - (H°R) . Полученные таким образом зависимости могут иметь какое-либо сходство с действительностью лишь для аминокислот и олигопептидов, имеющие всего несколько групп, способных к диссоциации, - в этом случае среднее значение распределения состояний по величине- заряда практически совпадает со значением концентрации доминирующей формы.

3 настоящей работе предлагается способ моделирования кривых титрования на основе схемы параллельной диссоциации ионогенныг групп молекулы. Такой подход свободен от вышеперечисленных недостатков и позволяет рассчитивать зависимости заряда от рН среди для белковых молекул с самым различным количеством ионогеньых групп.

Необходимость теоретического моделирования процесса разделения белков при помощи изозлектрического фокусирования в каибольпеп мере ощущается при проведении препаративно"о варианта этого метода в жидкой среде.

При разработке уникальных установок с большой производительностью, # универсальностью в используемых" амфолитах- носителях, а также, имеющих особенности в режиме работы, необходимо точно представлять ход всего процесса разделения, с тем чтобы добиться максимальной степени разрешения, исходи из технических возможностей аппаратуры.

В работе (Бабский и др., 19Я7) для упрощенного решения уравнения, описывающего динамику фокусирования белка в одномерном случае -

ct -.„сxx+fmcx*fxwc - о,

где С- концентрация фокусируемого вещества, т- коэффициент диффузии, f(x)-скорость переноса вещества в электрическом поле, было предложено считать процесс происходящим в две стадии: на первой стадии идет процесс переноса в отсутствии диффузии, который описывается линейным уравнением первого порядка, лег:ю решаемым методом парактеристик; на второй стадии конечная ширина зоны устанавливается в результате взаимчого уравновешивания сил электрофоретического переноса и диффузии.

Такой подход удовлетворительно описывает качественный ход процесса, в то же время, таким образом невозможно

адекватно зпиг.'ать поведение фокусируемого яещестпа вблизи ироэязктрическоП -очки. Длд некоторых идеализированных случаев '' возможно точное -Аналитическое решение рассматриваемого уравнения; решение получается в виде бесконечных рядоя и переход к конкретным параметрам требует приближенных выччслннип. При численном методе решения задача может быть решена, в принципа, с любой необходимой точностью, кроме того, при этом не требуется идеализации задачи и возможен учет дополнительных факторов (в т.ч., представленных в неаналитичегкоЯ форме).

Очистка ионогяонагыгш: антител (иммуноглобулинов) и их антиген-свяэыв&ю'якх фрагментов расмотренными выше методами имеет некоторые особенности. Нококлональные антитела представляют собой продукт секреции гибридом - гибридных клеток, полученных в результате слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломчнх штаммов (Köhler и Milstein, 1975). Слившиеся гибридные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенное антитело' и от миеломного партнера прсобретают свойство бесконечно размножаться In vitro. Секретируемне одним клоном моноклональные антитела могут быть размножены в неограниченном количестве. По всем параметрам они идентичны-по классу молекулы, ее типу, специфичности и анидности. Они взаимодействуют с ■ одним антигеном, одной антигенной детерминантой.

В зависимости от требований к чистоте конечного продукта, природы моноклональннх зктиТел и источника, их выделения, выбирается стратегия очистки^ В случае, когда рост секретирующих антитела клеток происходит в брюшной полости мыши, асцитная жидкость содержит значительное количество примесных белков: альбумин, трансфегрин, собственные иммуноглобулины мши, при этом концентрация альбумина превосходит концентрации других примесных белков.

В ряде случаев бывает необходимо получить антиген-срязывалддие фрагменты антител. Помимо чисто исследовательских задач, использование таких фрагментов может быть более предпочтительным в иммуноферменгном анализе, в терапии. Стандартными процедурами являются

гпособь получения ,?нгягеи-спйзываоагих Фрагментов при иомоци обработки антител следУЗДиыя ййрмйнтами: папаанои, и трипсином. Для отметки Fab-фрлгментив можно использовать ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию в гочеган"и с гель-фильтрацией. В тех случаях, когда необходимо освободиться от микрогнтерогенкости

РаЬ-фрагментов (раздел 2.3 ), используют методы,

обладающие очень высоким разрешением: хроматофокуснрсвание и мзоэле,-.тро(;>окус»:рс>вание. Если разница в кзоэлектрических точках образовавшихся ГаЬ-фрагмектов не слишком мала, можно воспользоваться ионообменной хроматографией.

Монэклональниа антитела при анализе метдом МЭФ почти всегда обнаруживают целый спектр полос. Такая картина может, н какой-то мере, служить своего рода пасг.ортом для данных моноклональных аьтител. Общее число полос и соотношение их интенсивностой различны дль различных изотипов. Также, различии общий интервал и расстояние между соседними полосами.

Вопрос микрогетерогенкости моноктональных антител широко обсуждался в литературе (Awdeh et al (1970), WJ1 liomsoii (3973), Hoffman (1977)). Среди ьоз;южннх причин чаще всего упоминаются следующие причини: различная степень глнкозп/гиронания заряженными сахарлми и деамидирование аминокислот асгарагина и глютамина.

Подвидя итог работам, посвященным экспериментальному .изучению мькрогетерогенности моноклональных антител, можно сказать, что единственным достоверным их результатом может быть только следующий вывод: процессы дг-амидирования и утрата заряженных сахарных групп способна приводить к видимым изменениям в ИЗФ-картине.

Антиген-связывающие фрагмеьты моноклональных антител

также проянляют микрогетерггенность. В этом случае среди

возможных причин микрогетерогенности необходимо . » рассматривать неравномерный псотеолиз.

Таким образом, к настоящему моменту не существует работ, в которых было бы установлено точное различие . а строении изофори. С другой стороны, представляется достаточно очевидным, что вследствии того, что различные антитела значительно различаются сак строением белковых цепей, так и

строением угяеподного компонента, наблюг.аечл i:

микрогпгерогсчность может быть обуслоп Jisva в различны): случаях различными причинами.Поэтому одной из основных задач работы являлось теоретическое.- рассмотрения во-зможг.п!"

процессов, вызывающих явление мжрогетепогсниости и создание модели, позволившей бн оценить ппияни,: любого из возможных-процессов на изменение изсзлнк-тричесгпП то'-кп белка. Ч экспериментальном плане в данной работе, также, ставилась задача исследования корреляции между м»;крогетерогенностые моноклональных анги-PG антител и их Р'йЪ фрагментов. DУО.Ч1 я слава посвящена вопросам Теоретического иодрдкрокания зависимости заряда молекулы белка от рН. Рассмотри'-"' гог->осн влияния модификаций белковой молпхулк из зча»'ркир ее изоэлектрическоя точки. Также, обсуждаются проблемы соответствия зкеверикентальных и теоретически полученных зависимостей. При зтом делается практически ватный вывод о небходиности учета зависимости силы вязкого треннк от размеров молекулы в случай использования экспериментальных зависимостей подвижности компонентов смеси белков с сильно различаюяимисч молекулярными весами.

Образование заряда бслколоР молекулы в растворе можно рассматривать как ррзулътат диссоциации определенных групп аминокислот, способных к образованию заряда. Ими могут быть свободные концевые группы всех аминокислот (карбоксильные и амино- группы), а также, боковые группы лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновоя и глатаминояей кчедот, тирозина и цистерна.

Для .молекулы белка, имеющей И + № групп, способных к образованию заряда, схема образования заряда имеет вид:

bi? ЬБ + Н+ ю =1.......Н

it + П+ и-.'.......Я

где и ай - состояния ионогенннх групп в незаряженном виде, Ьт и ай - состояния ионогенннх труп-' а заряженном виде; КЙ и Km - константы диссоциации.

Для зависимости заряда от рН получаем следудее выражение:

TiWr (1>

В качестве значения констант диссоциации можно использовать значения Д£>" свободных аминокислот. Как показало сравнение с

Я

эксперимент*щ.инми д.шн»;ч1; (разд. к 2."-, г. та»-хе, 2.5), создай.«;; теория махо/стса п хорогг'-; соответстпки с эксп^ри^енталыи/ми пепулытата^:;; пуя это4: получается весьма сходные с экспериментальными теоретические кривые титрования и достаточно близкие зилчениг изоэгзхтркчясккх точек.

Оценка влияния единичного ;смйнен;тя количества шногекных групп в белковой молекул» на сдпиг ;:гюзлектричоско2 точки, к раикак даиксИ .¡одел;:, оскгг.лка на учет« того обстоятельства,что ьаиболс? существенные вклад п компенсаций привнесенного заряда ¡ь результате модификации) внесут тс ;:о:гагеН!и.;: групп», рК .;огор};к рГч--]д К ) находятся вблизи р1 носачу,.ъ. Используя о:отиз:.-ш:г (следствие ур-я !1)):

^ ~ 7Га~> С > " (2> '

где я и и - количества ионогеггаьл групп разных, видов, измаияпчих сьао -лапаии диссоциации (образующих полодителышй отрицательны!! с-:.рм.гь, соответственно), Ь* - количеств.-. *(о;;огйннкк групп каждого вида, ьд -прквнасеяный заряд, и ппедрнь обозначения - ^

а4-кг/[¡По, е«[и+]4лн*]ол< -1о в).

мом;о получить выражения длг изменения значения .ззоэлактрьческой точки 1? яаном вкдп при п, что дает возможность описать практически яоЗиг ситуации, ногувие иметь место при кодификациях белка-.

Далее подробно рассматрипаптс г. частные случаи: целочисленный и цецелочкеяенкпй привнесенные заряди, различнее количества к тип г.оногекшс; групп, {¡змандояи:: своа степень диссоциации. Так иапру.мар, учат •;а; 4 о д с 1; с т с;:п дпуч разлячнь-д садов поногенпик групп пр;:лог.пт :: ураьиенкл итогов степени относительно о . Е иг см случае искомое-

значение о определяетсг. по .юрмулегО ~{-П-1-/В)/2А,

где *., В, С - сооткдеству&зсс козС-знциснту уравкшшс

л +с »о, полученного путей редуцирование кскодкого

урабчрнчк (2). К02*5йиг.«кти к, 5 5! С пыгдяг.кт сясдус-ш:

образом, если прйг.неск:К!ЫК зардд ккос? целочасгскпое .-ьач, .-»-.о ( Л0--Ч :

г.. ^-ц1)

о •.Ч'Ы-.'х-<■..(>'•,+1) «Н^ь+П <а,-И)] (3.3)

Здэсь ^ и •- количества каногекиих. групп каждого из дну" раэл».чтдс типоп, и _ пнлчйния « или Р для

ииногенннх т'рупп данного типа. Так, например, если п инряленаи (2) «-0 и „«2, тс ^»Ь*, Ил»Ьа и <^»(¡1., так что ког»гйГ:Ц!1';!!ты имеют »ид:

л- ЬхР1(С»+1) +ЬаЗэ(31.+1) +а(?а.+1) (Р=+и (3.1*)

Ьа.За(132-1)+ЬаЭа.!Ра-1) + (З^ч) (?:,. + }) (3.2*)

Учет действия ионогеннлх групп только какого-либо одного вида, дает для б следующие выражения: (4)- для случ.чя иочоганных групп, ооразуюцю? положительный заряд, (5)--отрицательный (р!.с.1) .

6 = а (а-(2(1+а))/(аан<1(1+а)) (4)

в - Р (ь-а(1+р))/(ь0+а(1+и)) (5)

Рис. 1. Зависимость величины сдвига изоэлектричпско.? точки белка при модификации, сопровождающейся привнесениен единичного заряди, от количества содержащихся в молекуле ¡юногенных групп, изменяющих свою степень диссоциации. (В молекуле существуют ноногенные группы, изменяющие свою степень диссоциации, только одного типа.)

На рис 2а представлены теоретически расчитаннне кривые -итрования цепей гемоглобина. Картины кривых титрования для х- и. Э-цегей гемоглобина, очень похожие на изображенные на зис 2а, были получены экспериментально в работе !иаЬеЬ11( ;1апагга (1980) -рис 2в.

а ¿)

Рис. 2а. Теоретическая зависимость заряда молахулы от а»11 сред* для а. и &-цепей гемоглобина.

Л/1.. 2з. Экспериментальные кривив подвижности (крапив тчтраыании) а и Р-пеггеи гемоглобина.

Сраинение расчетных величин сдвига изозлектричоскон точки при единичных модификациях аминокислот для балков с известными различиями в химическом строении с экспериментальными значениями, также демонстрирует достаточно хорошее совпадение.

При сопоставлении экспериментальных кривы?; подвижности различных белков (имеющих разные молекулярные массы), полученных методом двумерного электрофореза (н егтастнеином рН-градиекте). _ с истиными кривыми титрования (как экспериментальными, так и теоретическими) следует принимать во внимание наличие явления вязкого трения. Использование •лопра вечного коэффициента - К~1/л (и* М-1'3) позволяет привести в хорошее соответствие картины, •.•--яуиаемке двумя этими методами (И- подвижность. М- масса i,- ;улы) .

Третья глава посвящена ьопросам очистк.: моноклональных антител методам:: ионообменной хроматографии и препаративного изоэлектрофокусирования в жидкой спеде.

Показано, как па основе результатов теоретического моделирования зависимости!! подвижноет и от рН ерьды для компонентов, входящих в состав исходное смеси (полученной добавлением сульфата аммония к асцигиой »идкости) ¡¿огио осуществить выбор условий для очистки моноклоиальшк антител при помощи ионообменной хроматографчи.

Результату моделирования пргведенн на рис 3. Из риг 3 видно, что иоано выбрать следуйте возможны« способы раяделеягя: при испольточьчии сильно» о анионоабменннла можно попытаться поочередно ■.»дюироьать с ко.тснкч п градиенте концентрации соли последовательно антитела и примесные белки п диапазоне " "'.5-8.5, либо собрать антитела в проскоке при рЧ старгопого буфера меньше семи (но Долгие примерно шести). Второй способ кучае не использовать при одноступенчатой очистке, так как при сборе нужного белка п проскоке можно, также, собрать вместе с ним некоторое количество примесных белков (каждый из которых может быть в очень небольшой концентрации), имающих изозлвктрнческиэ точки в широком диапазоне рН.

й____

Рис. 3. Теоретически рассчитанные зависимости заряда молекул от рН среды (кривые титрования) для основных примесных ■компонентов и примерное , расположение кривой титрования моноклональньн антител.

При работе с сильным катионообменником в данной ситуации представляется наиболее целесообразным выбрать рН стартового буфера так, чтобы основной компонент примеси оказался в проскоке и затем элюировать • антитела в плавном градиенте соли. .

Эксперименты проводились с антителами 2Р7 и 2Н2. После высаливания сульфатом аммония <40 и 33% насыщения), иммуноглобулины диализовались в течение 10-12 часов при 4С против стартового буфера. Перед нанесением на колонку

йЯразцн цоктр^угиросллись в течения 10 мин при iOOaCg. Использовались кодо.ш; fcotio Q к Mono Г. {(5x20) к (5x3).) . Поведение раэдеджык о'плков ь экспериментах горошо согласовывалось с теоретическими предсказания.:!:-;; были получены препара;ы иммуноглобулинов, свободные от примасеа (по паччым SDS-электрофореза) .

Для описания дыиа/икн иаазгектгю4лкусираз4т.-й белка использовалось одномерное уравнение диффузии с переносом

0, .

где С-концектрацик фокусируемого вощсства, „,_ коэффициент дчфйуэии, /(х)-скорость переноса вещества в электрическом поле. Начальное распределение концентрации предполагается известным - С(х,0)=С0(х).

Краевые условия отвечают отсутствию потока вещества на концах колонки. -«.C^+f(х)ОО ■ {x=0,L ) ( L- длина

электрофоретической колонки. ) Скорость переноса f(x) определился соотношением - f(x)= I • у(х)/гт(х), где у(х)-подвижность белковой молекулы, о(к(-проводимость среды, I --электрический ток. •

Для численного ремения задачи использовалась неявная четырехточечная разностная схема с аппроксимацией конвективного члена центральными разностями. Для случая линейной зависимости профиля скорости разностная схема выглядела следующим образом:,

а Ф3"1* b 1с f

)cic-i.4)c )с k-^а. )с

а "-n/L3^-(B-ALh(it-i') /21.Ь

К .

Ь =2„/I.2ha-A + 1/т

1С

с -=-т/ЬгЬа+(В-АЫ1(^-1)) /2Lh

К

t =*Ф*/т

К К

.Фк - значения концентрации в точка KK=h-k в момент времени t3-*s-i, 1 и h представляат собой шаги сетки по прекз .: и координате. Константы А и В представляют собой соответствующие коэффициенты при линейное интерполяции гривой титрования.

Численные расчеты пргводились для различных балков Как

для •.¡деолитфояаниш: молг'л'л'ик пр:«*в$:он, ток и г,и;; усксни;:, рг-ч:гь::п скллдквг-гаихсл а .'доносе:; разделении. Лля расчетов, так"л(., брались различные качллыс. ■ раа.т-'Делення концентрации фокусируемы;: белков.

Учат неоднородности электропроводности пг-^.тил объяснить ндбшдлеиоя на прахт»хя явление а-л»- .л!-гГ'>-о утирт'ия глин (о-:, рис. 4). При начальном распределении белка п \олонкр, соответствующем локализации ботъие'! части пнооикчго препарата в одно0 ччойке, а оду »по перлниок^рнг-^ электропроводности (со значительно пыражгиь.^у м1.ьмиумо!' п центральной части градиента) , ^можко клбл.сдатс. сильное учкрение зон:» на начальном этапе фокусипоиания, ттк как передний фронт движется быстрее чем зад»"-, :то и пкячпл^г размытие. Па основе результатов численн'« расчетов были знбрапы диапазон рН-градиентл к времппг. р-чэделгиия.

-Й

за

'.О

Рис. 4. Ия ■ значив профиля гстйентрпцт: балка и ходе численного эксперимента по нпьвлщютзянип линанихи пзоэяехтрофокускроваюгя (эавкаоюсть скорости переноса от ксорлпчатч - пзяиивКная, начальное ртспгелелпчпп хопцр-гтпацкч показано щихтпро-'О; 1-ю, II-"о, 111-30, IV-.fi? (касса} .

Г» rz.zs.ii 1 огмсьйаотся получнчн.г рХ-гоногенньх

7<лЪ-»!г5-:Г!'лнтоп , ■".?!■; !ЛТ'л при номо-ш ;:;)• т р.»!г. " ч р-лрепзратиького

... ..... ... Гу. .... ,,

Особенность решения подобный задач состоит р том, что следует работать в тзхих цианаг.онач рН и ионнэл силы буферов, чтобы различия в степени связывания разделяемых компонентов было бы достаточно существенными при довольно м;1лых изменениях градиента концентрации (соли или буфера) , т. е., при значениях рН буферов, не слишком далеких от значении изозлектрических точек разделяемых веществ. Эксперименты по фракционированию г аЬ-ф;>агментов 2F7 и 2К2 на сильном катионобмеияике Mono S проводилось в диапазонах рН 5.5-6.5, использовались На-ацетатныя и Ха-фосфатный буфера (25 гсМ) ?люция осуществлялась градиентами концентрации соли (KaCL или KCI, - 0-0 2 М) или градиентом концентрации буфера. Нагрузка белком составляла 0.5—2 n(j. Приближение значения рН буфера к. значению изоэлектрической точки способствовало улучшению разрешения.

При препаративном изозлактрофокусировании использовал! ь амфолиты -носители следуюцих диапазонов 6-8 (Ampii.) 7-9 (Serv.). Время фокусирования составляло 20-2С часов. До 20мг Fab-фрагментов вносилось во всем объема геяя. Для работы использовался прибор Multiphor и стандартная кювета для геля ( размером 9x12). Концентрация амфолитов-носителей

составляла 1.5 Для разделения Fab-фрагментов антител 2F7 методом хроматофокусирования истльзовался рН -градиент 7-й. В ка .зстбр элюента использовался как полибуфер РВ 45 так и РВ <34; б первом случае степень разведения составляла 1/10, во втором- 1/13.

В первом ра деле ■ пятой главы расмотре.чы теоретические аспакть! миксогетерогенности белков. Проведен анализ влияния возможных различия я строении аьтител и их Fab-фрагментов на поведение кривых титрования и на сдвиг изоэлектрической точки. На основании полученных

результатов, модно сделать вывод, что причиной микрогетерогечности Fab фрагментов мояет быть различие не обязательно и некотором количестве ионсгенных аминокислот (что может быть следствием неравномерного протеолиза), а для получения каб.,тодае>-'ьх сдвигов, к принципе, достаточно единично:» модификации. Анализ экспериментальных кривых титрования позволил прецполохить, что микрогетерогённость исследуемых антител вызвана, если не единичной модификацией.

То, по крайней мере, модификациями одного типа. Эти обстолтельстна позволили выбрать- следуаую стратегию: попытаться выделить рТ-гомогенные фрагчии Mab и подвергнуть их иротролиэу с целью определения места локализации источника гетерогенности.

Получение отдельных, рТ-гсмогенных, компонентой антител представляло более сложную задачу по сравнению с аналогичной для для Ff.b-фрагмйнтов (гл. i), вследствие более низкой разницы и лр1 ("0.1ед.). Зта задача решалась дпу-ля способами: при помощи метода препаратипного

иэоэлектрофокусирования в гонком слоа геля, а также, методом хроматофокусирования.

Для фракционирования антител • с понощьв. препаративного изозлектрофокусировакия использовались градиенты 5-8, 7-Э и 7-8 (Serv.). В качестве электродных растворов использовались как рекомендуемые для этих диапазонов электролиты, так и специально рассчитанные концентрации электролитов (ЫаОН и НэРО„ ), с целью добиться получения более узкого градиента (что дало некоторое улучатенир разрешения).

Также, с цель» достичь наибольшего разрешения, разделение проводилось в болэе тонком слое геля, чем зто обычно рекомендуется ( 2 г сухого сефадекса Ult.rocla;; на . на 5С мл раствора- при использовании стандартной кшеты 240x90 ). Образец вносился в весь обьем геля. Концентрация амфолитов составляла. 1.3-2.0- %. (При конструировании более узких градиентов исходная концентрация выбиралась несколько большей -2.5* (с течением времени происходило падение общей концентрации амфолитов в " геле и возрастание ее в призлектродной области ). ) Время фокусирования составляло 24-26 часов для диапазона 7-8 и 18-20 часов для диапазонов в 2 ед. pH (32 ■ часа для более узких градиентов) при максимальном напряжении 1500в. Стабилизация по мощности осуществлялась на уровне 4Вт. Для сбора искомых лракций использовался метод реплики.

В результате экспериментов удалось добиться выделения одного основного компонента моноклональчых антител 21-7 в почти гомогенном состоянии и получения двух других фракция, содержащих второй мажорный и один минорнья компоненты' в преобладающем количестве.

Хроматофокусиропанио моноклокахъных антител

осуществлялось в свирхуэких рН-градиантах (0.7 - С.5 ед рН). При конструировании таких градиентов проводилось более сильное разбавление попибуфер? в элюепте по сравнение со стандартным ( до 1/15 -1/17). Иногда, при работе с узкими градиентами, использовались полибуферк широких диапазонов (при этом для ик разведения делался оценочные перерасчет содержания амфолитов-носителей необходимого диапазона). Контроль рН-градиенга осуществлялся при помощи проточного рН-метра. Эксперименты проводились на колонках Mono Р 5x5 и 5x20 с антителами 2F7, 2Н2 и lrfl.

При помоци хроматофокусирования в узких диапазонах рН удалось впервые получить в pi-гомогенном состоянии отдельные компоненты спектра моноклональньк антител.

Рис.5. Схеь*а протеолиза препаратов шнюклоилльиих антител, содержащих отдельные компоненты ЮФ-спектра в различных соотношениях.

о) Ь)

1 3 Э 4

i а з

Fab

Hab

Fe

5а. Последовательно собрание фракции, содержащие основные компоненты ИЭФ-спектра ионоклональных антител 2F7, в эксперименте по получению pl-гомогенных Mab при помощи хрома тофокусирования. •

5в. Результат протеолиза отдельных фракция

моноклональных ннтктел, изображенных на рис 5а.

С целью определения причин микрогетерогенности, очищенные антитела были подверг 1уты протеолизу з стандартных условиях. Обраэць концентрировались при помощи концентраторов

Centricor.(30) до 3 мг/мл, одновременно про исход и.га скрк-буфера. ГТротеолиэ осуществлялся в течений 5 часоч гр" соотношения экзим/субстрат- 1:100, в ЮС гсМ натрий-фосфатноу буфере при 17 *С. Полненный результат с=г.*г,р ,-=;;ьстяупТ том, что шпсрогеторогенность ?аЬ-фрагмектоа мт:ок.гока.гьгГы< антител 2F7 связана с микрогет рогвучсстьч иечодккч моноклональчых аититад, а не является следствием неравномерного протеолиэа. Поскольку существует взаимно однозначное соответствие для двух осчончы.. компонентов Mab и Fab, можно сделать вывод о том, что источник гетегогекности мсноклоначьних антител расположен в сбласти Fab- Opa"veviTa (рис. 5).

Ofстая глава посвящена анализу микрогетярогенчосп; белков, недетехтируемоЯ методом изоэлектрического

фокусирования. ' 3 главе 2 был теоретически исследован вопрос о влиянии различий в электрическом заряде у различных изоформ одного белка на значения изоэлектрических точек этих изоформ. Были получены соотношения, позволяющие определить звличиьу сдвига изэзлектричаской точки при изменэнии числа ионогенных групп п молекула, которые, как показало сравнение с опытными данными, достаточно хороио описывают различные модификации белков. ' При этом, как указывалось, ке рассматривались случаи, связанные с различиями в числе аминокислот, не являющихся лоногенными, или с различиями только в местоположении у одноименных аминокислот - такие изоформы имеют очень близкие значения заряда. Представляется очевидным, что на практике малые вариации б электрическом эаряде у отдельных изоформ должны приводить к малым, порой неразличимым сдвигам в рТ.

Приняв дополнительное предположение о том, что привнесенная группа может несколько изменять степень диссоциации соседних групп, а также, может иметь несколько другу» константу диссоциации при другом местоположении, можно количественно описывать модификации подобного типа. Согласно предварительным оценкам <на основе данных Кантора и Виммела(1980)), ожидаемые значения гонстант диссоциации одноименных ионогянных групп в белках различаются на 0.2-0.3 ед. pH (до 0.5 для гистидкна), что соответствует максикальнйсу изменению нв,более нескольких десятых (для

<*рХ=0.5 — ^атвл-О.З). Кроме того, разница в степени иониз: ции для исногеных групп, имеющих достаточно близкие значения рК, коже т бпть существенной только внутри сравнительного узкого диапазона рН, что также говорит в пользу того, что различие только в мессоположении одноименных иокогенных групп чаще, по-в-лдимоиу, доляно приводить к небольшим различиям в электрическом заряде отдельных изотерм белковой молекулч.

Й в

Рис. 6а. Зависимость величины сдвига и?оэлектрической точки бзчха от величины привнесенного заряда при различной числе ¡юногенных групп, изменяющик свою степэнь диссоциации. Рис.бв. Соотношение между возмпжныин значениями а и а при фикг.хрованныу. значениях с и в (Т:^р1»0.04. П:Др1»0.02) .

На рис 6 представлена зависимость величины сдвига иэозлектрическоя точки белка от величины привнесенного заряда при различном числе иокоганных групп, изменяющих свою степень диссоциации (значение параметра а равно десяти для всех трех кривых); -оснащение между возможными значениями а и а, при 0икс1тюванньсх значениях п и показано на рис.бв (О-ла 4). Видно, что величина сдвига лрТ почти линеяно

уменьшается г уменьшением величины привнесеного заряда, компоненты, незначительно отлмчашшесч по зарлду, могут разрешаться лишь для достаточно vaлих йелксп {малые значения '¡(или Ь)) ; "более пнсокип абсолютны» значенич логарифма параметра -л, также, способствуют возможности проявления небольших различи« ¿с;.

Подробно рассмотрен случай одноименных ионогрнныч групп, различающихся местоположением, представляющий наибольший интерес, вследствие возможности наличия значительного количества изомеров (при фиксированном количестве модифицированных групп). Дана формула для расчета числа изомеров.

При наличии множественных однотипных постсинтетгтчег.тих модификации, части, для сравнительно крупная белкоч, на представляется во'зможнлм детектировать разницу между компонентами, имеющими равное число колнфвдиропанных групп но различающимися их местоположением. Если ИЭФ-картина такого белка, имеющего И групп, подвергающихся модификации, дает количество полос, соответствующее количеству всех возможных состояний с числом модифициропаннных групп," различающихся последовательно на единиду {!!+! i, то это обстоятельство можно считать косвенным доказательством наличия кедетектируемой микрогетерогенности, к есть все основания предполагать, что некоторые из наблюдаемых полос могут, в свою очередь, представлять суперпозицию вплоть до Ш / (п!(К-п)!) белков (рис. 7).

Известно, что некоторые белки при изоэлектрофокусирозании дают аномально широкие полосы (независимо от концентрации) При этом ширина эсны Может превышать "нормальную ширину зоны" в десятки раз. Это обстоятельство может объясняться наличием микрогетерогенности, связанной с существованием незначительно структурно различающихся белкоь. (Как правило, белки, обладающие широким ИЗО-спйктром содердаг' сравнительно размытые зоны.)

Таким образом, видно, что очистка белка до получения одной единственной полосы на ИЭФ-картине может не приводить к устранению микрогетерогенности. Наличие микрогетерлгенности такого типа может представлять определенные трудности п тех случаях, тогда к гомогенности получаемого пящества

пре;<,ъявл>тотея очень высокие требования (например, при кристаллизации).

К- олнчесгЕп групп, способных модифицироваться и- число модифицированных групп

t- число различнее возможных состояния при фиксированном количестве модифицированных групп

П-0 П»1

п-0 п»1 п = 2 п*<3

П«0

п«1

п-3

п»4

N-2

И-5

+■— ++-

■М-+

т---+■

++— +-

Н-4

——-+ +-+- -++- +—+ —

{

(1) (2) (1)

(1) (3)

(3) (1)

(1)

(4) (6) (45 (1)

+

—4-

Рис 7. Возможные состояния изомеров, имеющих идинаковое количество одноимрнчм: модифицирования групп, . но различающихся своим местоположением. Символы "+" и "-" использованы для обозначении кодифицированного и неиодифицированного состояния, соответственно. Общие

число иоэмохнш изо.черов ({), при заданной п, быстро рястет с ростом Ы; Ы1!/(п1 (М-п) !) . ,

В заключении сформулированы основные результаты работы

Приложение содвраит тексты программ расчетов изменения профчяя концентрации белка по длине колонки в процессе изозлоктрофокусироьания (ГСЖТЯА!!) и зависимостей заряда молекул разяячнык оялксв от рИ среды (ВАБГС).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТА РЛБОГ.К.

1. Предложена модель длл описания процесс.' изсэлектрофокусиропанпя, на основе гсторои выполнен числеК1?!:!Й рл17':£?т. Рпг-ультати расчета пополняй отшслг • поведение фокусщуекоп? рапвстча п среде с переменное электропроводность» я опг.упяиреж-гть условии разделения.

2. Предложена модель для тпорег.Г.'еского расчета криви-; титрования белков в приблп-знпи независим""'.'? диссоциации. Произведено теоретическое моделирование кривых титрования для различных балков. Результата находятся в хорошем" соответстзии с действктелыгастьтГ'как по обв.-гоу виду крмгкх титрояания, так и по значения1? изаэлечтрических точе".

3. Получпры сооткош'чпгя, пээвол<ал:.::е оценить вег-.гиау сдвига изоэлектрктс-'соя точчк балкон при единичных |.'оди5икациях аминокислот. Произведена теоретическая оценка сдвига изоэлектрической точки белкой для случаев, когда и?чостнк экспер1л»яптл гчач«?чия р~ и • структура.

4. Разработана технология очистки моно-г ^чаль.«;? антител, 2?7, У-:?., 2С5 5ГГ7 специфт'чных к грэстйг.-андингч ?.. Разработана технология гчтчггки ГеЬ-фрагментов :: иодучркпр р1-гомэгеннкх Фракции.

Г> "парено получен;.- р1-'-пиог-"-ннл составляйте спектротипл коноклоналы'нк дпт.'тр;:. Установлено, что

причиной 1П1крогет(?г,ог,я!чости -аЬ-Фрапгчнтов является никюгетрро! вкноегь ислодш« кэьоклональных антител ;;;.>:;: антител 2?7) . Показало, что источник иикрогйтерогонностп ПлЬ 2Г7 находится п области КяЬ-$рагкснта.

б. Тяоретггч.ес:::; .проанализирован тип

микрогетерогеиности, пр-л которое имеется . очень незначительное различи- п суммарной электрическом заряде молекул, соответствуйотдельном гсскпонрнтзн ИЗФ-спектра. Приведены соотнопения, плэтоягот:* оце.чи-ь рогнояность разрешения для двух солгоп, исходя и,- примерного амккокислетиого состава. Гопаздко, что <п*рч;'г.гпрск:<п тип мтткрлгетерог енностя, при готлро»? йтп-».-»-ч!;« но.-екуль-различаются то;ь;:о н~с7сп::.'с-:ч"!гч одгои-'-•."■?>.'.? групп, очрчь 'пс:о рйл'лэтсг: ч.-ралгс'-п:-».".''.' "г'-^да УЭЗ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТБИЕ Л"ССЕРТАЦИИ

1. Стоянов А. В. /Теоретические аспекты микрогетерогенности белков: Влияние модификаций на значение изззлактрическсй точки и оценка возможности разрешения отдельных шофери при помощи метода изозлег.трического фокусировании / Коек, физ.-техн. ик-т.-М., 1993. -17с.: -Деп. н ЗИШГТ.И 07.07.53, Н187П-В93.

2. Kurochkir, 5.К., Perfilyeva Е.А., Saieznyova L.A- , Stoysnov A.V. /Characterisation of monoclonal antibody «Gainst prostaglandin £ family. ICSU short reports, vol. 1С, Advances in gene tp.chnolo'jy: The molecular biology of immune diseases and the Imauae response. IRI, Press, Oxford, -1990. -pp. 25<?-2?S.

3. Стоянов A. R. /Исследование причин кикрогетерогениссти Fab-фрлп'ентов мококлональных антител it прос гаглаидина*' семейства Е / Научные и практические аспекты электрофореза Материалы всесоюзного рабочего совещания секции лл злекгрофорезу при Научном совете чо хроматографии АН СССР

- Алиа-Атл, -1990. -стр. 26-27.

4. Бабский В.Г, "уков М.С, Сазонов Л.П., Столпов к. В. / Теоретический анализ процесса изозлектрофокусировакш-балков на установке ."Камтан"/ "Косчичэскач наука и техника"

- 1989г. zun 4." 1:3-19.