Исследование состава и структуры реальных биологических объектов при помощи масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Российская академия наук Институт энергетических проблем химической физики

На правах рукописи УДК 543.51

КОНОНИХИН АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

Исследование состава и структуры реальных биологических объектов при помощи масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье.

1

01.04 17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

автореферат диссертации на соискание степени кандидата физико-математических наук

Москва, 2007г.

003175270

003175270

Работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук

Научный руководитель. Доктор физико-математических наук, профессор

Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты- Доктор физико-математических наук, профессор,

Барашев Петр Петрович

Ведущая организация:

Московский инженерно-физический институт (Государственный университет)

Защита состоится « 14 » ноября 2007г в 14 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 002 112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу. 119334, г. Москва, Ленинский проспект, д. 38, корп.2, ИНЭП ХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н Н. Семенова Российской академии наук

Автореферат разослан « 13 » октября 2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор физико-математических наук, Морозов Игорь Иллиодорович

Кандидат химических наук

М И. Николаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Введение. Актуальность проблемы.

Отмеченные в 2002 году Нобелевской премией новые методы ионизации вещества, метод электроспрей и метод лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ), позволили ввести в область масс-спектрометрии большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды

Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами масс-спектрометрии Главными достоинствами данной методики являются сверхвысокая разрешающая способность, рекордная точность в измерении масс, высокая чувствительность и большой динамический диапазон измеряемых масс. Современный масс-спектрометр ИЦР ПФ способен ионизовать биомакромолекулы практически любого размера, не разрушая их, и измерять их массы с точностью 1 миллионной доли и, таким образом, идентифицировать их однозначно Это выводит масс-спектрометрию ИЦР ПФ на передовые позиции в решении задач современной химии и биологии

При анализе сложных биологических объектов при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ необходимо использовать современными аналитические методы разделения, такие как хроматография, электрофорез Сложность обработки и интерпретации полученной информации существенно затрудняет ход исследовательской работы Актуальным является развитие новых методов обработки и интерпретации данных полученных при помощи масс-спектрометрии ИЦРПФ

В процессе развития и оптимизации методов использующих масс-спектрометрию ИЦР ПФ автор работал со следующими объектами. (1) моча человека, (2) конденсаты выдыхаемого воздуха (КВВ) человека, (3) гумусовые кислоты

Цели и задачи: (1) исследование влияния точности измерения масс и разрешения на достоверность идентификации биомакромолекул при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ, (2) сравнение эффективности ионизации разными методами, а также сравнение эффективности фрагментации биомакромолекул разными методами, (3) изучение механизмов ионизации биомакромолекул методом МАЛДИ, с целью увеличения выхода многозарядных ионов, (4) разработка хромато-масс-спектрометрической методики с использованием масс-спектрометрии ИЦР ПФ для анализа биологических жидкостей, (5) реализация метода точной массово-временной метки для анализа протеома мочи человека, (6) создание базы данных точных массово-временных меток для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека, (7) разработка подхода для определение элементного состава гумусовых кислот при помощи масс-спеткрометрии ИЦР ПФ.

Научная новизна работы.

1 Впервые разработаны методы на основе точного измерения масс для анализа сложных смесей биологического происхождения

2 При помощи разработанных методов, впервые исследован белковый состав конденсатов выдыхаемого воздуха человека.

3. Впервые предложен способ увеличения выхода многозарядных ионов биомакромолекул при использовании метода МАЛДИ.

4 Впервые реализована новая процедура для поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека, использующая подход точных массово-временных меток

5 Впервые создана новая база данных точных массово-временных меток, по протеому мочи человека.

6. Впервые предложен новый статистический подход для анализа данных, полученных при помощи масс-спеткрометрии ИЦР ПФ, основанный на расчете и

построении дифференциальных масс-спектров для определения элементного состава сложных смесей, в частности, гумусовых кислот.

Практическая значимость работы.

Предложенный способ получения многозарядных ионов в МАЛДИ, может быть использован, как метод пробоподготовки для МАЛДИ масс-спектрометров с ограниченным диапазаном m/z (тяг-масса и заряд молекулярного иона).

Методы на основе точного измерения масс могут быть использованы для анализа биологических жидкостей человека с целью изучения полиморфизма и, диагностики

Новый подход для анализа гумусовых кислот может использоваться для элементного и сравнительного анализа сложных смесей, различного БиоГео происхождения.

Разработанный метод анализа конденсатов выдыхаемого воздуха человека в дальнейшем можно будет пользоваться для мониторинга состояния легких.

Личный вклад автора. Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участи автора, как в постановке, так и при проведении исследований, выполнении экспериментов Программа для обработки и анализа ИЦР масс-спектром гумусовых кислот была разработаны автором совместно с Э.В Куненковым (Химический факультет МГУ) База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН) и И А. Агроном (ГУ НИИ БМХ РАМН) Пробы мочи были приготовлены С А Мошковсим (ГУ НИИ БМХ РАМН) Пробы конденсатов выдыхаемого воздуха были приготовлены В С Куровой (ИБХФ РАН) Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ одновременно выполнялась автором в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля Российской академии наук в период с 2004 по 2007 год

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих Российских и международных конференциях: 1-й Международный симпозиум по масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения для анализа на молекулярном уровне сложных (БиоГео) систем, 6-7 Ноября, Германия, 2006, Конференция по программе фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки- медицине», Москва, 2006 г, Третья международная конференция-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007, 55-я конференция Американского масс-спектрометрического общества, Индианаполис, США, 2007, 8-я Европейская конференция по ИЦР масс-спектрометрии и Российско-Немецкий семинар, Август 27- Сентябрь 1, Москва, Россия, 2007, Третий съезд ВМСО, 2-ая Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», 3-7 сентября 2007 г, Москва

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке РФФИ, INTAS, CRDF, в рамках программ Президиума РАН, ОХНМ РАН

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 105 страницах, содержит 30 рисунков и 4 таблицы Диссертация состоит из четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Первая глава является литературным обзором, в котором дается краткое описание объектов исследуемых в работе (гумусовые кислоты, моча и конденсаты выдыхаемого воздуха человека), обсуждаются трудности и ограничения традиционных методов исследования данных объектов, обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) для исследования данных объектов, в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, в комбинации с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР

Точная и однозназначная идентификация, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей напрямую связана с точностью измерения масс и разрешающей способностью масс-спектрометра ИЦР ПФ, поэтому основное внимание в обзоре уделено исследованию данных характеристик Точность измерения и разрешающая способность в масс-спектрометрии ИЦР ПФ Измеряемой величиной в масс-спектрометрии ИЦР ПФ является частота, по значению которой можно рассчитать массу молекулярного иона используя калибровочное выражение.

- = - + 4. (!)

где т и г - масса и заряд молекулярного иона соответственно, - измеряемая частота. Коэфиценты А и В являются постоянными величинами и расчитываются при калибровке масс-спектрометра по двум или более известным массам Выражение (1) получается в приближении одного иона и не учитывает эффекты объемного заряда и кулон-кулоновские взаимодействия между молекулярными ионами На практике выражение (1) можно использовать для калибровки масс-спектрометра ИЦР ПФ при измерении малого числа ионов, поскольку эффекты кулон-кулоновские взаимодействия при этом малы, и более того ионы калибранта,

вместе с ионами исследуемого вещества, подвержены одинаковым эффектам Для более точных измерений лучше использовать внутреннюю калибровку масс-спектрометра (в образце содержаться одновременно исследуемое вещество и калибрант), а не внешнюю калибровку (калибрант запускается отдельно от исследуемого вещества), при этом калибровочное выражение (1) так же хорошо работает и в случае большого количества ионов.

Таким образом, точность измерения масс в масс-спектрометре ИЦР ПФ напрямую связана с точностью его калибровки, которая в свою очередь зависит главным образом от числа ионов удерживаемых в ИЦР ячейке и воспроизводимости данного числа ионов при снятии разных масс-спектров Разрешающей способностью в масс-спекгрометрии принято называть отношение m/z пика к его полуширине (ширине на середине высоты)'

* = -г*-, (2)

Д«50%

где Дт5М- полуширина пика в масс-спектре, соответствующая молекулярному иону с массой т и зарядовым состоянием z В случае масс-спектрометра ИЦР ПФ данное выражение можно переписать следующим образом

R = =——— = —iHsEs— ((в СИ) (3)

Лт5т Д®5о% тАа>„л

где Во- величина магнитного поля в ИЦР ячейке, qo — элементарный заряд

Либо в приближении низкого давления в ИЦР ячейке

AM т

где Т - время детектирования частотного сигнала, наводимого ионом на детектирующие пластины ячейки ИЦР.

Из выражения (4) следует, при постоянном значении магнитного поля и значения m/z, разрешение пика растет с увеличением времени детектирования сигнала. Во время хромато-масс-спектрометрического анализа смеси биологического происхождения, время детектирование сигнала в ячейке ИЦР

ограничено из-за необходимости быстрого последовательного измерения масс нескольких молекулярных ионов.

В данной работе все измерения производились на гибридном масс-спектрометре Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия), который состоит из масс-спектрометра ИЦР ПФ, со сверхпроводящим магнитом 7 Тесла, и высокочувствительной линейной квадрупольной ионной ловушки.

Данный гибридный масс-спектрометр является самым современным прибором в своем классе и позволяет проводить измерения в режиме ИЦР ПФ с максимальным разрешением 500000 для m/z 400 и точностью измерения масс 2ррт, при использовании внешней калибровки. Главными достоинствами прибора являются автоматический контроль числа ионов в масс-анализаторе и возможность использовать современных методов фрагментации биомакромолекул: в линейной квадрупольной ионной ловушке реализована столкновительно активированная фрагментация, в ячейке ИЦР - инфракрасная мультифотонная диссоциация и диссоциация, происходящая при захвате медленных электронов. Во второй главе предлагается способ для увеличения выхода многозарядных ионов в методе МАЛДИ.

Для метода МАЛДИ характерно образование преимущественно однозарядных ионов - это приводит к простоте понимания полученных масс-спектров. В то же время, выход многозарядных ионов мог бы значительно расширить возможности при исследовании тяжелых биополимеров и их нековалентно связанных комплексов. Для увеличения выхода многозарядных ионов в методе МАЛДИ был разработан специальный способ приготовления образца. Способ заключается в электро-напылении образца на различные по кристаллической структуре слои МАЛДИ матрицы. Была разработана и собрана специальная установка для электро-напыления обазца, показанная на рисунке 2.

увеличительная камера

толкатель шприца 1 мкл/мин

Рис. 2. Схема установки для электро-напыления образца на слой МАЛДИ матрицы.

При приготовлении слоя матрицы водно-ацетонитрильный раствора с концентрацией матрицы 5-15г/л наносились на металлическую подложку (зона нанесения ~5мм) и быстро высушивались в вакуумной камере. Структура и однородность слоя матрицы анализировались при помощи оптического микроскопа. Для измерения масс-спектров образец помещался во времяпролетный масс-спектрометр с вакуумным источником МАЛДИ (АХ1МА МАЬОЬТОР, ЭЫгтаёги).

Новый способ приготовления МАЛДИ образца (электро-напыления на слой матрицы), позволил существенно увеличить выход многозарядных ионов. В масс-спектре образца (insulin-bovine, М=5733Да) приготовленного новым методом, видны преимущественно многозарядные ионы, как в методе электроспрей (см. рис.За). В то же время при использовании стандартного метода пробоподготовки образца (метод высушенной капли) в масс-спектрах наблюдались преимущественно однозарядные ионы (см. рис.Зв). Выход многозарядных ионов, при использовании нового способа пробоподготовки, можно объяснить если рассматривать процесс ионообразования, как просто десорбцию готовых ионов. Структура слоя матрицы существенно влияла на выход многозарядных ионов. Заметный выход многозарядных ионов наблюдался в случае слоя, состоящего из плотно упакованных макрокристалликов (» 50 микрон).

1008060 40 20 о

(а)

4+

2+

ШкЦиц

100 80 6040 20 0

(в)

2+

3+

±

1000 2000 3000 4000 5000 6000 m/z

................

500 1500 2500 3500 4500 5500 m/z

Рис. 3. Масс-спектры полученные для образца, приготовленного методом электронапыления на слой матрицы (а) и методом высушенной капли (в).

В третьей главе описывается подход для исследования элементного состава гумусовых кислот при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ.

Высокая гетерогенность гумусовых кислот (фульво- и гуминовые кислоты) приводит к тому, что получаемые масс-спектры высокого разрешения содержат тысячи близких к друг другу по интенсивности пиков в относительно узком диапазоне масс, за счет чего происходит перекрывание изотопных кластеров (рис.

4). Интерпретация спектров гумусовых кислот требует применения статистической обработки, поэтому был развит метод обобщенной статистики разности масс (ОСРМ).

Рис. 4. ИЦР масс-спектр речных фульвокислот в режиме отрицательных ионов.

Идентификация ионов и анализ спектров методом обобщенной статистики разности масс осуществлялись с помощью разработанного программного обеспечения FIRAN. Модульное программное обеспечение FIRAN выполняет следующие операции: 1) определение заряда ионов, основанное на симуляции распределения изотопов; 2) фильтрация входных данных на основе результатов определения заряда ионов; 3) вычисление обобщенной статистики разности масс; 4) вычисление дефектов масс Кендрика; 5) определение стехиометрических формул для фрагментов, полученных в спектре обобщенных разностей масс, и ионов в исходном масс-спектре; 6) вычисление элементного состава анализируемого образца; и 7) построение диаграмм ван Кревелена.

Процедура вычисление обобщенной статистики разности масс (ОСРМ) состоит из следующих шагов: 1) нахождение всех разностей масс между всеми возможными парами пиков в спектре; 2) вычисление частот встречаемости всех наблюдаемых в спектре разностей масс; 3) фильтрация для исключения разностей масс, обусловленных случайными факторами.

В 1

1 0,9

I 0,8

I 0,7

ей

Й 0,6

I 0,5

I 0,3

я 0,2

о

| 0,1 б п

в ФК ■ ГК

20 30

Разность масс, Да

40

50

Рис. 5. ОСРМ спектры для речных (ФК) фульво- и (ГК) гуминовых кислот.

На рисунке 5 показаны ОСРМ спектры, полученные для речных препаратов фульво- и гуминовых кислот. Множество повторяющихся фрагментов, соответствующих интенсивным пикам в спектре обобщенной статистики разности масс, позволяет проводить определение молекулярных формул тяжелых ионов путем их соотнесения с легкими ионами, с известными молекулярными формулами. Данный подход также может быть использован для предварительного определения элементов, входящих в состав тяжелых фрагментов или ионов, и устранения возможной неопределенности в определении формул в случае неизвестного элементного состава. Наиболее часто встречающиеся разности обычно указывают на процессы, протекавшие в ходе формирования образца (см. рис.6).

■л

\У' гГО > .СУ -О,4-

Рис. 6. Список наиболее часто встречающихся разностей (функциональных групп) в ОСРМ спектрах речных фульвокислот (ФК| и ФК||) и гуминовых кислот (ГК).

Полный элементный состав речных фульвокислот определялся в двух экспериментах с различными растворителями. Полученные результаты хорошо согласуются друг с другом и укладываются в следующие диапазоны:: С: 54.3 -54.7%, Н: 4.0 - 5.0%, О: 39.3 - 41.7%, и близки к результатам элементного анализа: С - 52.34, Н - 4.36, О - 42.98. Элементный состав для гуминовых кислот определенный при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ показывает содержание углерода заметно больше (62.9 %), а кислорода ниже (31.2%), по сравнению, с результатам элементного анализа (С - 52.63% и О - 42.04%). Причиной данного феномена может служить различие в эффективности ионизации фракций фульво- и гуминовых кислот при использовании метода электроспрей: компоненты фульфокислот ионизуется легче, чем компоненты гуминовых фракции В четвертой главе описывается разработанная хромато-масс-спектрометрическая методика для анализа биологических жидкостей человека (моча, КВВ) и процедура создания базы данных (БД) точных массово-временных меток, для поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека.

Анализ биологических жидкостей человека строился на классическом подходе, который часто используется в протеомике и состоит из следующих

этапов (1) отбор пробы содержащей белки; (2) очистка, концентрирование и предварительное разделение смеси белков, (3) энзиматическое расщепление белков, (4) хромато-масс-спектрометрический анализ во время которого измеряется точное значение массы биомакромолекулы и время ее выхода из хроматографической колонки, (5) обработка хромато-масс-спектрометрических данных и идентификация белков по базам данных

Экстракты белков из мочи и КВВ подвергались ферментативному гидролизу в присутствии трипсина Смесь полученных пептидов анализировалась на хромато-масс-спектрометрическом комплексе, который состоит из нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия), оснащенного наноспрейным источником ионизации, который был разработан и собран в лаборатории.

Была разработана следующая хромато-масс-спектрометрическая методика-

1) Разделение смеси пептидов, при помощи ВЭЖХ, проводилось методом градиентного элюирования - подвижная фаза В (80% ацетонитрил + 20% вода + 0,1% муравьиной кислоты) изменялась от 3% до 35% в течении 120 минут, скорость потока подвижной фазы была 0,3мкл/мин

2) Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматического измерения спектров (см рис 7). На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 3001600, с разрешением R=25000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР 5*106) На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась либо столкновительная фрагментация, либо фрагментация, при захвате медленных электронов. Столкновительная фрагментация и измерение спектров фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов 3*104) Фрагментация, при захвате медленных электронов и измерение спектров фрагментов осуществлялись в ИЦР ячейке (число ионов

5*105). В режиме автоматического 2-х стадийного анализа петиды, для которых фрагментация уже была проведена, динамическое исключались из рассмотрения на 30 секунд.

Данные хромато-масс-спектрометрического анализа обрабатывались при помощи программы BioworksBrowser 3.1 SRI (Thermo Electron, Бремен, Германия), которая формирует список из точных значения масс пептидов и масс их фрагментов. Данный список используется для поиска и идентификации белков по базе данных NCBInr, при помощи программы Mascot (Matrix Science, London, UK; version 2.0.04).

CAXcaliburV \Urine_1-lO_0-5ul_MS2 9/16/2007 10 32:22 PM

RT 18 92 - 113 54

СТАДИЯ 1: ИЗМЕРЕНИЕ ТОЧНОЙ МАССЫ ПЕПТИДА

123537 1379 43

422.25 493 17 662.ЛЗ

^J. vaJiiIL-V,

Рис. 7. Масс-хроматограмма полученная для пробы мочи (вверху), ИЦР масс-спектр в выделенные момент времени и спектр фрагментации одного пептида.

Было идентифицировано около 200 белков при анализе проб мочи. В одном хромато-масс-спектрометрическом прогоне удается идентифицировать около 120 белков. Приготовление пробы мочи (см. рис.8А) и способ фрагментации пептидов (см. рис.8В) влияют на количество и список идентифицированных белков. В одном хромато-масс-спектрометрическом эксперименте в пробе КВВ удается идентифицировать около 20 белков. Количество идентифицированных белков зависит от способа сбора пробы и от выбора пациента (см. рис.9).

Рис. 8. Диаграммы сравнения количества белков идентифицированные в моче человека при разных методах приготовления образца(А) и фрагментации пептидов(В).

ПРОБА 3 (без фильтра)

ПРОБА 2 (с фильтром)

Рис. 9. Диаграмма сравнения количества белков идентифицированных в КВВ трех пациентов при разных способах сбора пробы.

ПРОБА 4 (с фильтром)

По хромато-масс-спектрометрическим данным возможно сравнение профилей экспрессии белков в КВВ разных пациентов (см. рис. 10).

RT: 20.00- 135.00

КОНТРОЛЬ

70.90

33.37 40-90 ll 39 99 ;01 105.13 86.54 97.10 | JwL. LIL110-54 123J31 133J11

«a-SijW^e II 4 8,91 55,04 | S726J II'»

NL: 1.26Е6 Base PeakF: FTMS + р ESI Full

msf

300.00-1600.00) MS

c1_250907_120ml

§ SO i 40

ПРОБА 2 (с фильтром)

NL: 2.53E6 Base Peak F: FTMS + p ESI Full ms[

300.00-1600.00] MS

c2_250907_120mi

vjttoiju

; ПРОБА 4 (с фильром)

52 40 55.89 »Л? „.,«(» 59 45

20 30 40 50

NL: 5.45Е6 Base Peak F: FTMS + p ESI Full

300.00.1600.00]

20 130

Рис. 10, Хромато-масс-спектрометрические данные для обазца-котроля и 2-х проб КВВ, собранных от разных пациентов.

База данных точных массово-временных меток.

По списку пептидов, идентифицированных программой MASCOT, проводилось утверждение точных массо-временных меток. Процедура утверждения заключалась в следующем: если вычисленная масса (подсчитанная по идентифицированной аминокислотной последоватльености) совпадала с измеренной в пределах погрешности прибора, то данная масса вместе со временем', выхода пептида из хроматографической колонки утверждалась, как точная

массово-временная метка (см рис 11) Из пептидов, которые самоутвердились, как точные массово-временные метки, формировалась новая база данных

Рис 11 Принцип формирования базы данных точных массово-временных меток

В заключении приводятся основные выводы

• Разработаны методы точного измерения масс многоатомных молекул биологического происхождения с помощью масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье

• Методы применены для анализа сложных систем протеом человеческих жидкостей, гумусовые кислоты Показано, что в случае протеома мочи человека удается идентифицировать до 120 белков в одном хромато-масс-спектральном прогоне Результаты полученные для гумусовых кислот хорошо согласуются с результатами традиционного элементного анализа. В случае конденсатов

выдыхаемого воздуха человека удается определить до 30-ти белков и сравнить профили экспрессии белков

• Предложен способ пробоподготовки образца, позволяющий увеличить выход многозарядных ионов в методе МАЛДИ

• Создана база данных точных массово-временных меток для исследования протеома мочи человека

• Разработан новый программный пакет для анализа состава гуминовых веществ, который позволяет- 1) определение заряда ионов, основанное н симуляции распределения изотопов, 2) фильтрация входных данных на основ результатов определения заряда ионов, 3) вычисление обобщенной статистик разности масс; 4) вычисление дефектов масс Кендрика, 5) определени стехиометрических формул для фрагментов, полученных в спектре обобщеннь разностей масс, и ионов в исходном масс-спектре, 6) вычисление элементног состава анализируемого образца, и 7) построение диаграмм ван Кревелена,

Публикации:

1) Куненков Э. В , Кононихин А. С , Перминова И В , Гармаш А В , Попов И. А, Николаев Е Н «Анализ гумусовых кислот методом ИЦР МС с использованием обобщенной статистики разности масс» // Третий съезд ВМСО, 2-ая Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», 3-7 сентября 2007 г., Москва

2) Erast V Kunenkov, Aleksey S Kononikhin, Irma V Perrmnova, Andrey V. Garmash, Igor A Popov, Eugene N Nikolaev Improvements in peak capacity of and molecular formular assignment to FTICR MS data attained on fractions of Humic acids // 8th European FTMS conference and Russian-German workshop, August 27- September 1, Moscow, Russia, 2007

3) Eugene N Nikolaev, Igor A Popov, Oleg N Harybin, Alexey S Kononikhin, Yunj V Borisov, In situ recognition of molecular chirality by mass spectrometry. Influence of hydration on chirality effects on dimethyltartrate cluster stability. International Journal of Mass Spectrometry Vol 265, Issues 2-3, 2007, 347-358

4) Erast V. Kunenkov, Aleksey S Kononikhin, Irina V Perminova, Andrey V Garmash, Igor A. Popov, Eugene N. Nikolaev. Complex mixtures analyses by FTICR-MS using statistics of mass differences// Proceedings of the 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and AlliedTopics, Indianapolis, USA, 2007

5) Кононихин А С , Куненков Э В , Попов И А , Гармаш А В , Перминова И В , Николаев Е.Н Опрделение элементного состава гуминовых веществ при помощи масс-спектрометрии иноннго циклотронного резонанса с преобразованием Фурье // Масс-спектрометрия в химической физике,

биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

6) Куненков Э В , Кононихин А. С , Перминова И. В , Гармаш А В , Попов И А, Николаев Е Н Применение обобщенной статистики разностей масс для анализа сложных систем методом FTICR-MS // Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

7) Харыбин О.Н., Згода В.Г., Кононихин А.С., Мошковский СЛ., Попов И.А., Николаев Е Н Исследование белкового состава мочи человека // Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

8) Д М Автономов, А С Кононихин, И А Попов, Е Н Николаев Поиск посттрансляционных модификаций методами кластеризации масс-спектров триптических пептидов и статистики разностей масс для повышения достоверности идентификации исходных белков // Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

9) Братанов Д О, Калупов Т Л, Кононихин А С, Курова В С , Анаев Э X, Николаев Е Н , Варфоломеев С Д Протеомный анализ конденсатов выдыхаемого воздуха человека // Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007,

10)Е Н Николаев, А С Кононихин, В Г Згода, С А. Мошковский, О Н Харыбин, И А Попов, Д М Автономов, И А Агрон, В С Курова, О В Демина, С Д. Варфоломеев Разработка и применение метода точной массовой метки в масс-спектрометрии для хромато-масс-спектрометрического анализа протеома мочи // Фундаментальные науки-медицине Материалы конференции, М Фирма «Слово», стр. 168-169, 2006 г

11)Яковлева М А, Сакина Н JI, Кононихин А С , Фельдман Т Б., Николаев Е Н, Донцов А Е и академик Островский М А Обнаружение и исследование продуктов фотоокисления флуорофора липофусциновых гранул из клеток пигментного эпителия глаза человека □ Л'-ретинилиден-Л'-ретинилэтаноламин (А2Е) БИОФИЗИКА, Доклады Академии Наук, 2006, том 409, №3, стр 411-414

12)Kunenkov, E.V, Kononikhin, A.S, Perminova, IV, Garmash, A V., Nikolaev, E N, Popov, IA 2006 Analysis of FTICR-MS data on humic substances and synthetic polyelectrolytes using different data processing techniques. Abstracts of the First Int Symposium on Ultrahigh Resolution Mass Spectrometry for the Molecular level Analysis of Complex (BioGeo)Systems, 6-7 Nov. 2006, GSF, Oberschleissheim, Germany

13)Kunenkov, E.V., Kononokhin, A S, Gaspar, A., Schmitt-Kopplin, Ph, Perminova, I V, Garmash, A V, Hertkorn, N, Popov, IA , Nikolaev, E N Comparison of FTICR data on the Suwannee river humic and fulvic acids Abstracts of the First Int Symposium on Ultrahigh Resolution Mass Spectrometry for the Molecular level Analysis of Complex (BioGeo)Systems, 6-7 Nov 2006, GSF, Oberschleissheim, Germany

14)IgorA Popov, Sergey A Kozin, Ivan A. Boldin, Aleksey S Konomkhin, Eugene N. Nikolaev, Oleg N Kharybin, Alexander I Archakov Recognition of individual amino acid isomeric form in peptides by FT ICR mass spectrometry Application to Alzheimer's disease peptides. // Proceedings of the 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Seattle, USA, 2006

15)A Konomkhin, E Nikolaev, V Frankevich, and R Zenobi, Letter Multiply Charged Ions in Matrix-Assisted Laser Desorption/Iomzation Mass Spectrometry Generated from Electrosprayed Sample Layers, Eur J Mass Spectrom 11,257260 (2005)

Введение.

Глава 1. Литературный обзор

1. Развитие масс-спектрометрии ИЦР ПФ.

1.1. Циклотрон.

1.2. Ловушка Пеннинга.

1.3. Масс-спектрометр ИЦР ПФ.

1.4. Методы ионизации.

1.5. Протеомный анализ «по восходящей»(ВОТТОМ UP).

1.6. Методы фрагментация (МС/МС).

1.7. Поиск и идентификация Пост-Трансляционных Модификаций.

1.8. Развитие метода точных массово-временных меток.

1.9. Гумусовые кислоты.

1.10. Моча человека.

1.11. Конденсаты выдыхаемого человеком воздуха.

Глава 2. Увеличение выхода многозарядных ионов в методе МАЛДИ.

Глава 3. Исследование элементного состава гумусовых кислот при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ.

Глава 4. Исследование белкового состава мочи и КВВ человека при помощи масс-спектрометрии ИЦР ПФ.

4.1. Хромато-масс-спектрометрическая методика для анализа проб мочи и КВВ человека.

4.2. Метод точных массово-временных меток для исследования белкового состава мочи человека.

4.3. Поиск и идентификация пост-трансляционных модификаций в белках, содержащихся в моче человека.

Выводы.

При помощи современных методик, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря созданию новых методов ионизации вещества, метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ), которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды.

Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами масс-спектрометрии. Главными достоинствами данной методики являются: высокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. На базе современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно реализовать методики для однозначной идентификации элементного состава как индивидуальных биомолекул, так и их смесей.

В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. Относительно небольшим набором генов кодируется большое количество разных белков. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина -протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать геномные исследования. Современная масс-спектрометрия ИЦР ПФ занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики - идентификация белков и пост-трансляционных модификаций в них.

Поскольку масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапазоном, а в различных организмах содержится большой диапазон относительных концентраций белков - необходимо использовать масс-спектрометры ИЦР ПФ в комбинации с существующими аналитическими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез).

Главной целью в данной работе являлись разработка и оптимизация методов использующих масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования элементного и протеомного состава таких объектов как: (1) моча человека, (2) конденсаты выдыхаемого человеком воздуха (КВВ), (3) гумусовые кислоты.

В работе были поставлены (и решены) следующие задачи: (1) исследовать механизмы получения многозарядных ионов и разработать способ, позволяющий увеличить выход многозарядных ионов в методе МАЛДИ; (2) исследовать возможности различных методов фрагментации для идентификации биомакромолекул; (3) исследовать зависимость достоверности идентификации биомакромолекул от точности измерения масс и разрешения; (4) разработать хромато-масс-спектрометрические методики для анализа белкового состава мочи и КВВ человека; (5) разработать и внедрить метод точной массово-временной метки для анализа белкового состава мочи; (6) разработать подход идентификации белков с учетом произвольных посттрансляционных модификаций в них и использовать данный подход при исследовании протеома мочи человека; (7) создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека; (8) разработать методику на основе масс-спектрометрии ИЦР для исследования элементного состава гумусовых кислот.

Практическая значимость проведенных исследований:

Предложенный способ получения многозарядных ионов в методе МАЛДИ позволит более эффективно использовать данный метод для масс-спектрометрии ИЦР ПФ.

Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для анализа биологических жидкостей человека могут быть в дальнейшем использованы для диагностики различных отклонений в организме человека, вызванных, в том числе, заболеваниями.

Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека.

Новый подход для анализа гумусовых кислот может использоваться для элементного и сравнительного анализа сложных смесей, различного БиоГео происхождения. Методики, развитые для анализа конденсатов выдыхаемого человеком воздуха, в дальнейшем могут быть использованы для создания новых методов диагностики состояния легких.

Структура диссертации следующая.

Первая глава является литературным обзором, в котором дается краткое описание объектов, исследуемых в работе (гумусовые кислоты, моча и конденсаты выдыхаемого человеком воздуха), обсуждаются трудности и ограничения традиционных методов исследования данных объектов, обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) для исследования данных объектов, в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР.

Более подробно рассмотрены вопросы касающиеся точности измерения масс и разрешающей способности масс-спектрометра ИЦР ПФ, поскольку от этих характеристик напрямую зависит точность и однозначность идентификации, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей.

Во второй главе рассмотрены механизмы получения многозарядных ионов и разработан способ, позволяющий увеличить выход многозарядных ионов в методе МАЛДИ.

В третей главе описывается метод определения элементного состава гумусовых кислот, основанный на точном измерении масс при помощи масс-спектрометра ИЦР ПФ и статистической обработке данных. Особое внимание уделено новому методу статистической обработки, который был использован для анализа ИЦР масс-спектров.

В четвертой главе описывается хромато-масс-спектрометрическая методика, разработанная для анализа белкового состава мочи и КВВ человека, и применение метода точных массово-временных меток для поиска и идентификации белков, содержащихся в моче человека. Также описывается подход развитый для поиска произвольных пост-тарнсляционных модификаций белков, содержащихся в моче человека.

Выводы:

• Разработаны методы точного измерения масс многоатомных молекул биологического происхождения с помощью масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье.

• Эти методы применены для анализа сложных систем: моча человека, конденсаты выдыхаемого человеком воздуха, гумусовые кислоты. Показано, что в пробе мочи человека удается идентифицировать до 120 белков в одном хромато-масс-спектрометрическом прогоне. В случае конденсатов выдыхаемого воздуха человека удается определить до 30-ти белков и сравнить профили экспрессии белков.

• Предложен и опробован способ приготовления образца, позволяющий увеличить выход многозарядных ионов в методе МАЛДИ.

• Создана база данных точных массово-временных меток для исследования протеома мочи человека. База данных может использоваться для быстрого поиска и идентификации белков без применения методов фрагментации. Идентификация при этом производится по точной массе пептидов и временам их удерживания в хроматографической колонке.

• Новый метод для поиска пост-трансляционных модификаций позволил значительно снизить время поиска и определить наиболее часто встречающиеся пост-трансляционные модификации белков, содержащихся в моче человека.

• С использованием масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и нового метода вычисления обобщенной статистики разности масс более детально исследован элементный состав гумусовых кислот. Полученные результаты хорошо согласуются с результатами традиционного элементного анализа.

1. Lawrence Е.О. and Livingston M.S., The production of high speed light ions without the use of high voltages, Phys Rev, 1932,40: 19.

2. Penning F.M., Introduction of an axil magnetic field in the discharge (Glimmentladung) between two coaxial cylinders, Physica, 1936,111:873.

3. Marshall A.G., Milestones in Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry technique development, Int J Mass Spectrom, 2000, 200: 331356.

4. Guan S. and Marshall A.G., Ion traps for Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: principles and design of geometric and electric configurations, Int J Mass Spectrom, 1995, 146: 262-296.

5. Comisarow M.B. and Marshall A.G., Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, Chem Phys Lett, 1974, 25: 282-283.

6. Comisarow M.B., Marshall A.G., Frequency-sweep Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectroscopy, Chem Phys Lett, 1974, 26: 489- 490.

7. Marshall A.G., Hendrikson C.L. and Jackson G.S., Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry: A primer, Mass Spectrom Rev, 1998,17:1-35.

8. Brigham E.O., The Fast Fourier Transform., N.Y.: Prentice Hall, 1974.

9. Белл Дж., Введение в Фурье-спектроскопию. Пер. С англ. М.: Мир, 1975

10. Alleman М., Kellerhals Н., Wanczek К.Р., A new Fourier transform mass spectrometer with a superconducting magnet, Chem Phys Lett, 1980, 75: 328 -331.

11. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F. and Whitehouse С. M., Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules, Science, 1989, 64: 246.

12. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M., Electrospray Ionization-Principles and Practice, Mass Spectrom Rev, 1990, 9: 37-70.

13. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F., Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules, Anal Chem, 1985, 57: 2935-2939.

14. Karas M., Bachman D., Bahr U, Hillenkamp F., Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds., Int J Mass Spectrom Ion Proc, 1987, 78: 53-68.

15. Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T., Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry, Rapid Commun Mass Spectrom, 1988,2: 151-153.

16. Karas M, Hillenkamp F., Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons, Anal Chem, 1988, 60: 2299-2301.

17. Barber M., Bordoli R.S., Sedwigck R.D. et al., Fast atom bombardment of solids (FAB) a new ion-source for mass spectrometry, J Chem Soc Chem Commun, 1981: 325-327.

18. Fenselau C., Cotter R.J, Chemical aspects of fast atom bombardment, Chem Rev, 1987, 87: 501-512.

19. Vertes A., Methods and Mechanisms of Producing Ions from Large Biomolecules, "Laser Desorption of Large Molecules: Mechanisms and Models". Ed. K. G. Standing and W. Ens, Plenum Press, New York, 1991.

20. Beavis R.C. and Chait B.T., 38th ASMS Conf Mass Spectrom Allied Top, 1990, 152-153.

21. Zhigilei L.V. and Garrison B.J., Molecular dynamic simulation study of the fluence dependence of particle and plume composition in laser desorption and ablation of organic solids, Appl Phys lett, 1999, 74, 1341-1343.

22. Vertes A. and Gijbels R., Laser Ionization Mass Analysis, Wiley, New York, 1993,127-175.

23. Zenobi R. and Knochenmuss R., Ion formation in MALDI Mass Spectrometry, Mass Spectrom Rev, 1998,17: 337-366.

24. Gimon M.E. et al., Are Proton Transfer Reaction of Excited States Involved in UV Laser Desorption Ionization, Organic Mass Spectrom, 1992,27: 827-830.

25. Lao P.-C. and Allison J., Ionization Processes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization mass Spectrometry: Matrix -dependent Formation of M+H. and [M+Na] Ions of Small Peptides and Some Mecanistic Comments, J. Mass Spectrom, 1995,30: 408-423.

26. Karas M. et al., Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors, Int J Mass Spectrom, 2000, 35: 1-12.

27. Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов H.B., Николаев В.И., Шкуров В.А., Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый метод масс-спектрометрического анализа, ДАН СССР, 1984, 277, №2, с.379-383.

28. Cottrell J., Database Searching for Protein Identification and Characterization, ASMS Tutorial, 2005.

29. Bogdanov B., Smith R.D., Proteomics by FTICR Mass-Spectrometry: Top-Down and Bottom-Up., Mass Spectrom Rev, 2005,24: 168- 200.

30. Henzel W.J., Billeci T.M., Stults J.T., Wong S C., Grimley C., Watanabe C., Proc Natl Acad Sei USA, 1993, 90: 5011.

31. James P., Quadroni M., Carafoli E. and Gönnet G., Biochem Biophys Res Commun, 1993, V. 195, 58-64

32. Mann M., Hojrup P. and Roepstorff P., Biol Mass Spectrom, 1993, V. 22,338345.

33. Pappin D.J.C., Hojrup P. and Bleasby A.J., Curr Biol, 1993, 3: 327.

34. Yates J.R., 3rd., Speicher S., Griffin P.R. and Hunkapiller T., Anal Biochem, 1993,214:397-408.

35. Eng J.K., McCormack A.L. and Yates J.R., 3rd., An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database, J Am Soc Mass Spectrom, 1994, 5:976-989.

36. Yates J.R., McCormack A.L., Eng J., Mining genomes with MS, Anal Chem, 1996, 68: 534A-540A.

37. McCormack A.L., Schieitz D.M., Goode B., Yang S., Barnes G., Drubin D., Yates J.R., Direct analysis and identification of proteins in mixtures by1./MS/MS and database searching at the low-femtomole level, Anal Chem, 1997, 69: 767-776.

38. Little D.P., Speir J.P., Senko M.W., O'Connor P.B., McLafferty F.W., Infrared multiphoton dissociation of large multiply charged ions for biomolecule sequencing, Anal Chem, 1994, 66: 2809-2815.

39. Price W.D., Schnier P.D., Williams E.R., Tandem mass spectrometry of large biomolecular ions by blackbody infrared radiative dissociation, Anal Chem, 1996,68: 859-866.

40. Ijames C.F., Wilkins C.L., Surface-induced dissociation by Fourier transform mass spectrometry,^««/ Chem, 1990, 62: 1295-1299.

41. Zhong W., Nikolaev E., Wysocki V. and Futrell J., Realization of Self-Assembled Monolayer SID in FT ICR, Anal Chem, 1997, 69: 2496-2503.

42. Rakov V.S., Futrell J.H., Denisov E.V., Nikolaev E.N., Instrumentation of kinetic energy-resolved surface-induced dissociation in Fourier transform mass spectrometry, Eur J Mass Spectrom, 2000, 6 (3): 299-317.

43. Zubarev R.A., Kelleher N.L., McLafferty F.W., Electron capture dissociation of multiply charge protein cations: A nonergodic process, J Am Chem Soc, 1998,120: 3265-3266.

44. Mann M., Jensen O.N., Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat biotechnol, 2003,21.

45. Lane C.S., Mass spectrometry-based proteomics, CMLS, Cell Mol Life Sci, 2005,2.

46. Mann M. and Wilm M., Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags, Anal Chem, 1994, 66:4390-4399.

47. Craig R. and Beavis R.C., A method for reducing the time required to match protein sequences with tandem mass spectra, Rapid Commun Mass Spectrom, 2003,17(20):2310-2316.

48. Eng J.K., McCormack A.L. and Yates J.R., 3rd., An approach to correlatetandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database, J Am Soc Mass Spectrom, 1994, 5: 976-989.

49. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S., Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis, 1999,20: 3551-3567.

50. Lipton M.S., Pasva-Tolic' L., Anderson G.A., Anderson D.J., Auberry D.L., Battista J.R., Daly M.J., Fredrickson J., Hixson K.K., Kostandarithes H., Masselon C., Markillie L.M., Moore R.J., Romine M.F., Shen Y., Stritmatter

51. E., Tolic' N., Udseth H.R., Venkateswaran A., Wong K.-K., Zhao R., Smith R.D., Global analysis of the Deinococcus radiodurans proteome by using accurate mass tags, Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 11049-11054.

52. Pasva-Tolic' L., Lipton M.S., Masselon C.D., Anderson G.A., Shen Y., Tolic' N., Smith R.D., Gene expression profiling using advanced mass spectrometric approaches, J Mass Spectrom, 2002, 37: 1185-1198.

53. Bossio R.E., Marshall A.G., Baseline resolution of isobaric phosphorylated and sulfated peptides and nucleotides by electrospray ionization FTICR MS: Another step toward mass spectrometry-based proteomics, Anal Chem, 200, 74: 1674-1679.

54. He F., Hendrickson C.L., Marshall A.G., Baseline mass resolution of peptide isobars: A record for molecular mass resolution, Anal Chem, 2001, 73: 647650.

55. Kearney P., Thibault P., Bioinformatics meets proteomics—bridging thegap between mass spectrometry data analysis and cell biology, J Bioinformatics Comput Biol, 2003,1: 183-200.

56. Geromanos S.J., Richardson K., Young P., Denny R., Gorenstein M., Li G.-Z., Riley T., Silva J., Opiteck G.J., Dongre A.R., Hefta S.A., 52ndASMS Conf Mass Spectrom Allied Top, 2004.

57. Johnson K.L., Mason C.J., Muddiman D.C., Eckel J.E., Analysis of the low molecular weight fraction of serum by LC-dual ESI-FT-ICR mass spectrometry: Precision of retention time, mass, and ion abundance, Anal Chem, 2004, 76: 5097-5103.

58. Li X., Pedrioli P., Eng J., Martin D., Yi E., Lee H., Aebersold R., A tool to visualize and evaluate data obtained by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, Anal Chem, 2004, 76: 3856- 3860.

59. Radulovic D., Jelveh S., Ryu S., Hamilton T.G., Foss E., Mao Y., Emili A., Informatics platform for global proteomic profiling and biomarker discovery using liquid-chromatography-tandem mass spectrometry, Mol Cell Proteom, 2004, 3: 984-997.

60. Rabi I.I., Zacharias J.R., Millman S. and Kusch P., A New Method of Measuring Nuclear Magnetic Moment, Phys Rev, 1938, 53:318.

61. Taylor R., Hare J.P., Abdul-Sada A.K., Kroto H.W., Isolation, separation and characterization of the fiillerenes C60 and C70: the third form of carbon, J Chem Soc Chem Commun, 1990,20: 1423-1425.

62. Martin G.E, Zekter A.S., Two-Dimensional NMR Methods for Establishing Molecular Connectivity, VCH Publishers, Inc: New York, 1988.

63. Kurt W., NMR of Proteins and Nucleic Acids Wiley-Interscience, New York, NYUSA 1986.

64. Van Krevelen D.W., Fuel, 1950,29:269.

65. Van Krevelen D.W., OrgGeochem, 1984, 6: 1.

66. Kim S., Kramer R.W., Hatcher P.G., Graphical method for analysis of ultrahigh-resolution broadband mass spectra of natural organic matter, the van Krevelen diagram, Anal Chem, 2003, 75: 5336-5344.

67. Wu Z., Rodgers R.P., Marshall A.G., Anal Chem, 2004, 76:2511.

68. Kendrick E., Anal Chem, 1963,35:2146.

69. Hughey C.A., Hendrickson C.L., Rodgers P.R., Marshall A.G., Kendrick mass defect spectrum: a compact visual analysis for ultrahigh-resolution broadband mass spectra, Anal Chem, 2001, 73: 4676-4681.

70. Bowman J.H., Costello C.E., O'Connor G.T., Walter R.E., Mass Spectrometric Analysis of Eicosanoids and Proteins in Exhaled Breath Condensate, 53thd ASMS Conf Mass Spectrom Allied Top, 2005.

71. Montuschi P. et al., Am JRespir Crit Care Med, 1999,160: 216-220.

72. Corradi M. and Mutti A., Exhaled Breath Analysis: from Occupational to Respiratory Medicine, Acta Biomed Ateneo Parmense, 2005, 76: 20-29.

73. Neumann L., A powerful system for sampling pure breath condensate, 2001 Erich JAEGER GmbH.

74. Kononikhin A., Nikolaev E., Frankevich V. and Zenobi R., Letter: Multiply Charged Ions in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Generated from Electrosprayed Sample Layers, Eur J Mass Spectrom, 2005,11: 257-260.

75. Karas M. et al., Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors, Int J Mass Spectrom, 2000, 35: 1-12.

76. Kunenkov E.V., Kononikhin A.S., Perminova I.V., Garmash A.V., Popov I.A., Nikolaev E.N., Complex mixtures analyses by FTICR-MS using statistics of mass differences, 55th ASMS Conf Mass Spectrom Allied Top, 2007.

77. Kunenkov E.V., Kononokhin A.S., Gaspar A., Schmitt-Kopplin Ph., Perminova I.V., Garmash A.V., Hertkorn N., Popov I.A., Nikolaev E.N.,

78. Tanner S., Shu H., Frank A., Wang L.-C., Zandi E., Mumby M., Pevzner P.A., Bafna V., Anal Chem, 2005,77:4626 -4639.