Использование новых методов ионизации и фрагментации органических и биоорганических молекул для их идентификации тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Российская академия наук Институт энергетических проблем химической физики

На правах рукописи УДК 543 51

ПОПОВ ИГОРЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

Использование новых методов ионизации и фрагментации органических и биоорганических молекул для их идентификации

01 04 17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

автореферат диссертации на соискание степени кандидата физико-математических наук

Москва, 2007г

ООЗ1ВЗО13

003163019

Работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук

Научный руководитель Доктор физико-математических наук, профессор

Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты Доктор физико-математических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Веденов Александр Алексеевич

Ведущая организация

Московский инженерно-физический институт (Государственный университет)

Защита состоится « 14 » ноября 2007г в 12 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 002 112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу 119334, г Москва, Ленинской проспект, д 38, корп 2, ИНЭП ХФ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова Российской академии наук

Автореферат разослан « 12 » октября 2007г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор физико-математических наук, профессор, Алимпиев Сергей Сергеевич

Кандидат химических наук

М И. Николаева

Общая характеристика работы

Введение. Актуальность проблемы.

Масс-спектрометрия с момента ее появления в начале 20-го века является одним из наиболее информативных физических методов исследования веществ во всех агрегатных состояниях В последнее время масс-спектрометрия переживает бурное развитие Прогресс в развитии масс-спектрометрии был связан с совершенствованием масс-анализаторов, детекторов ионов и, в первую очередь, с созданием и развитием методов ионизации В первых масс-спектрометрах использовались методы ионизации веществ, находящихся в газообразном состоянии, такие как разряд и электронный удар Эти методы позволяли анализировать газообразные вещества или вещества, которые могут быть переведены в газообразное состояние Они в значительной степени покрывали потребности анализа воздуха, различных летучих веществ, в том числе и органического происхождения, в частности, продуктов переработки нефти, да и самой нефти при использовании методов пиролиза В семидесятые годы прошлого века сильно активизировались исследования, направленные на поиск методов неразрушающей ионизации больших органических молекул с целью применить масс-спектрометрию для анализа биологических систем Было открыто несколько методов неразрушающей ионизации биологических молекул с атомными весами до 10 кДальтон Это полевая десорбция, вторичная ионная эмиссия из молекулярной матрицы (глицерин и подобные вещества, дающие протоны при ударе о них ускоренных ионов), бомбардировка быстрыми атомами (FAB), плазменная десорбция Революционизирующим масс-спектрометрию событием стало открытие неразрушающих молекулы методов ионизации электроспрея (ESI) и лазерной десорбции ионизации из матрицы (MALDI), позволяющих ионизовать и вводить в масс-анализатор большие, в сотни Мегадальтон, молекулы биологического происхождения без их разрушения Эти удостоенные Нобелевской премии

открытия послужили толчком к бурному развитию биологической масс-спектрометрии

Ионы могут быть образованы не только при ионизации нейтрального вещества в разном агрегатном состоянии, но и при диссоциации уже образованных ионов Процессы образования ионов при диссоциации ионизированных молекул оказались чрезвычайно важными при исследовании структуры молекул методами масс-спектрометрии, в особенности биологических молекул, таких как ДНК, РНК и белков, являющихся биополимерами Наряду с фрагментацией молекулярных ионов, вызываемой столкновениями этих ионов с атомами или малоатомными молекулами (СЮ), в настоящее время при исследовании структуры биомолекул используется лазерный нагрев ионов - многофотонная лазерная инфракрасная диссоциация (ГОМРО), рекомбинация со свободными электронами (ЕСБ) и электронами, передаваемыми на исследуемые ионы (многозарядные положительные продукты ионизации электроспреем) от отрицательных ионов (ЕТО)

В данной работе основное внимание уделяется дальнейшему совершенствованию и поиску новых применений новых методов ионизации и фрагментации органических молекул - как синтетических низкомолекулярных (на примере взрывчатых веществ), так и природных - белки и пептиды

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящих исследований была разработка новых масс-спектрометрических методов анализа органических молекул, позволяющих исследовать молекулы разного класса, для чего были решены следующие задачи

(1) Разработка масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионным источником, работающим при атмосферном давлении

(2) Разработка чувствительного и селективного метода экспресс-обнаружения взрывчатых веществ в твердом состоянии, позволяющего избежать предварительной подготовки пробы или свести ее к минимуму

(3) Разработка чувствительного метода количественного определения относительных концентраций пептидов с заменами аспарагиновой кислоты на ее изо-форму

(4) Применение метода количественного определения относительных концентраций пептидов с заменами аспарагиновой кислоты на ее изо-форму в случае работы с ионным источником на основе лазерной десорбции из матрицы (MALDI)

Научная новизна.

1 Впервые разработан и создан источник химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом исследуемых веществ

2 Впервые продемонстрирована возможность обнаружения взрывчатых веществ при помощи созданного ионного источника химической ионизации с термодесорбционным вводом анализа взрывчатых веществ, сорбированных на пыли и поверхностях, достигнута чувствительность на уровне 10 нг TNT

3 Впервые создана методика распознавания и количественного определения относительного содержания в бинарных смесях изомерных замен аспарагиновой кислоты в пептидах с использованием СШ и ECD фрагментации

4 Впервые продемонстрирована возможность определения замен при помощи MALDI при атмосферном давлении

5 Впервые в РФ создан масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с интерфейсом для ионных источников, работающих при атмосферном давлении

Практическое значение работы.

Результаты, полученные в данной работе могут быть использованы при создании нового и дальнейшем совершенствовании существующего масс-спектрометрического оборудования, при разработке систем контроля безопасности

различных объектов Кроме того, описанные в диссертации методы, могут быть использованы при изучении молекулярных основ болезни Альцгеймера, а так же при создании новых методов биологических и биохимических исследований, связанных с созданием новых методов молекулярной медицинской диагностики

Личный вклад автора.

Материал, представленный в диссертации получен при непосредственном участии автора, как в постановке задачи, так и при проведении исследований, обсуждении и анализе полученных результатов Работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, часть работ одновременно выполнялось автором в Институте биохимической физики им Н М Эммануэля Российской академии наук и в Институте биомедицинской химии им В Н Ореховича Российской академии медицинских наук в период с 2003 по 2007 годы

Апробация работы.

Результаты работы обсуждались на следующих Российских и международных конференциях «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» в 2003, 2004 гг, 16я международная конференция по масс-спекгрометрии, Эдинбург, Англия, 2003г, 10я международная конференция «Десорбция - 2004», 2004г, Санкт-Петербург, 2я международная семинар-школа «Масс-спекгрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Москва, Россия, 4-7 октября, 2004, Третья международная конференция-школа «Масс-спекгрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007, Третий съезд ВМСО, 2-ая Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», 3-7 сентября 2007 г, Москва, Конференция по программе фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки- медицине», 2006г, 4я Международная конференция «Фрагментация при захвате или передаче электрона

- Фундаментальные аспекты и прилолжения», Гон-Конг, 2006г, Третья международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине», Новосибирск, 2006г , 52я, 53я, 54я, 55я конференции Американского масс-спектрометрического общества в 2004,2005,2006,2007гг

Публикации.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке РФФИ, INTAS, CRDF, в рамках программ Президиума РАН, ОХНМ РАН

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 32 рисунка, 3 таблицы

Содержание работы.

Масс-спектрометрия в настоящее время является одним из наиболее точных и чувствительных методов исследования вещества Однако при проведении масс-спектрометрических исследований требуются громоздкие процедуры предварительной подготовки пробы, предварительного разделения, что делает этот метод зачастую недоступным для рутинного анализа, особенно при решении задач обнаружения микропримссей в воздухе, воде, в пыли, а так же на твердых поверхностях Анализ органических молекул, особенно биологического происхождения - отдельная достаточно сложная задача, для решения которой требуется развитие специальных подходов - мягких неразрушающих методов ионизации Одним из методов ионизации, который широко используется в настоящей работе, является ионизация электрораспылением в вакуум Это метод мягкой ионизации, который работает при атмосферном давлении, поэтому его удобно использовать при сопряжении масс-спектрометра с жидкостным хроматографом При анализе сложных органических молекул масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса предоставляет большие возможности благодаря своим высоким характеристикам по разрешающей способности, чувствительности, точности измерения масс Однако измерительная часть масс-спектрометра ИЦР ПФ работает при сверхнизком давлении (ниже 1 10"9 Topp), поэтому при создании подобных приборов необходимо обеспечить транспортировку ионов из атмосферы в область сверхвысокого вакуума Отличительной особенностью масс-спектрометрии ИЦР ПФ является возможность проведения исследований структуры молекулярных ионов при помощи различных методов фрагментации столкновительной (CID), фрагментации при захвате электронов (ECD), многофотонной лазерной инфракрасной диссоциации (IRMPD) С использованием подобных подходов можно исследовать структуру различных полимерных молекул, в том числе биологических полимеров При исследовании структуры и функции белков и пептидов возникает серьезная проблема, связанная с определением

первичной структуры таких молекул, а так же и изомерного состава В настоящей работе рассматриваются развитые новые подходы к ионизации и фрагментации молекул, позволяющие решать подобные задачи

В главе I приводится литературный обзор, в котором кратко описаны принципы масс-спектрометрии ИЦР, наиболее распространенные конфигурации ионных источников электрораспыления в вакуум, МА1Ю1 при атмосферном давлении, химической ионизации в коронном разряде Так же рассмотрены различные конфигурации атмосферных интерфейсов, масс-спектрометров ИЦР и масс-спектрометров на основе ионных ловушек Кроме того, приводится обзор современных методов фрагментации органических молекул в масс-спеткрометрах, а так же способов определения изомерных форм аминокислот в составе пептидов

Среди основных видов атмосферных интерфейсов можно выделить следующие - конфигурации с нагреваемым металлическим капилляром и конфигурации со стеклянным капилляром и потоком нагретого нейтрального газа Важным элементом атмосферного интерфейса является узел, позволяющий осуществить переход из камеры, в которой находится нагреваемый капилляр (как правило, это первая ступень откачки) в следующую вакуумную камеру (как правило, это вторая ступень откачки) Для осуществления эффективной транспортировки ионов используют различные электродинамические и газодинамические устройства Из элементов, наиболее распространенных в настоящее время, можно выделить такие устройства как скиммер, скиммер в комбинации с одиночной линзой, электродинамическая ионная воронка Особое внимание в литературном обзоре уделено сравнению конструктивных особенностей существующих атмосферных интерфейсов для ввода ионов в вакуумную камеру масс-спектрометра для обоснования конструкции прибора, описанной в главе II

Атмосферный интерфейс для ввода ионов в вакуумную камеру масс-спектрометра является достаточно универсальным, поэтому с его помощью можно

работать практически с любым атмосферным ионным источником В настоящей работе описаны три типа ионных источников - атмосферный МАЛДИ, электроспрей, наноэлектроспрей, а так же химическая ионизация при атмосферном давлении, в т ч с возможностью проведения ионно-молекулярных реакций

Отдельно в литературном обзоре описаны возможные конструкции ионных источников с химической ионизацией, в т ч источников ионов при атмосферном давлении

Глава П посвящена описанию созданного в Лаборатории ионной и молекулярной физики ИНЭП ХФ РАН масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с ионным источником электрораспыления в вакуум

Основной сложностью, возникающей при создании приборов такого типа является необходимость обеспечения эффективной совместной работы ионного источника, работающего при атмосферном давлении, и масс-анализатора, в данном случае масс-спектрометра ИЦР ПФ, который работает в условиях высокого вакуума (1 10 8 Topp и ниже) Атмосферный интерфейс (рис 1) созданного прибора представляет собой нагреваемый металлический капилляр, радиочастотную ионную воронку, и систему транспорта ионов на основе радиочастотных квадруполей с дифференциальной откачкой

Созданный источник ионов состоит из стеклянного шприца с толкателем, используемого для ввода раствора исследуемого вещества, тонкого (50-100 мкм внутренний диаметр) кварцевого острия, соединенного с иглой шприца и металлического нагреваемого капилляра Нагреваемый капилляр служит переходньм элементом между атмосферой и первой ступенью дифференциальной откачки

При ионизации электрораспылением высокое напряжение (2-5 кВ) прикладывается к игле шприца, через который проходит раствор исследуемого образца Между образцом в кварцевом острие и металлическим нагреваемым

злопротическм В

Рис 1 Система радиочастотной транспортировки ионов

капилляром возникает электрическое поле Образующиеся заряженные капли под его воздействием попадают в нагреваемый капилляр, где в газовом потоке происходит их испарение и дробление, вплоть до образования ионов исследуемого вещества

После нагреваемого капилляра ионы попадают в область с давлением 1 10 1 Topp (первая ступень дифференциальной откачки) Для обеспечения эффективного транспорта ионов в следующую камеру системы дифференциальной откачки и фокуссировки ионов на выходе из нагреваемого капилляра была использована радиочастотная ионная воронка

После радиочастотной ионной воронки установлена система транспорта ионов на основе трех линейных квадруполей первый квадруполь работает в вакуумной камере при давлении 1 10"3 Topp (т н столкновительный квадруполь) и помимо транспортной функции обеспечивает дополнительную фокусировку ионного пучка, транспортный квадруполь, работающий при давлении 1 10 5 Topp, который дополнительно может выполнять функцию накопительного квадруполя, транспортный квадруполь, работающий при давлении 1 10"8-1 10"9 Topp, который обеспечивает транспортировку ионов в измерительную ячейку ИЦР, находящуюся в центре сверхпроводящего соленоида (на расстояние 1 метр) Вакуумные камеры

Ток, измеряемый на 164

выходе нз столкновительного 148 квадруполя, пкА ^

116 О

(а)

00

20

40

60

80

Bovine Serum Albumin

Потенциал, прикладываемый к входной электростатической Ю 0линзе ионио! о проводника, В

15 12

Ток, измеряемый на tj выходе из ловушки

ИЦР, пкА

00

20

40

Í

60

(6)

80

Bradykinin

Потенциал, прикладываемый Щ дна входной пластине ловушкн ИЦР, В

«окно захвата» ионов

Рис 2 Экспериментальное энергетическое распределение различных ионов (а) - на выходе из столкновительного квадруполя, (б) - на входе в ловушку ИЦР при столкновительном захвате

описанной системы транспорта ионов отделяются друг от друга посредством металлических диафрагм, диаметр отверстий которых 1-2 мм, на которые подается постоянное напряжение, в результате чего они работаю как электростатические линзы

Захват ионов в измерительной ячейке ИЦР осуществлялся посредством столкновений ионов с молекулами остаточного газа, в результате которых ионы теряли кинетическую энергию за время их прохождения через ловушку (так называемый, накопительный захват ионов) При этом на входную удерживающую пластину ловушки подавался потенциал ниже максимума энергетического спектра распределения ионов (определяемого экспериментально - рис 2), в то время как на выходную пластину ловушки подавался потенциал выше этого максимума Давление остаточного газа в ловушке было достаточно, чтобы ионы испытали несколько столкновений за время одного периода осевых колебаний между удерживающими пластинами и захватывались в поле удерживающего потенциала

12

Взрывчатые вещества на пыли или тампоне

Воздух, содержащий пары CHClj

В масс-спектрометр

Игла коронного разряда

Рис 3 Принципиальное устройство ионного источника химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом

Созданный масс-спектрометр позволяет получать масс-спектры тяжелых молекул с разрешающей способностью до 50000

Кроме этого, показано, что на созданном масс-спектрометре можно использовать различные методики, такие как продолжительное нерезонансное возбуждение, диссоциация индуцированная столкновением с электронами, позволяющие идентифицировать молекулы биополимеров и исследовать их структуру

Глава III посвящена разработке чувствительного и селективного метода экспресс-обнаружения следовых количеств взрывчатых веществ в кристаллическом состоянии Для решения это задачи был разработан и реализован ионный источник на основе химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом описываются конструкция, принцип работы и характеристики ионного источника на основе химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом

50

О

10(Ь

[сны., + CIJ

155

153

IST

226 [TNT-HJ-

TNT" '2.21

10(1

m

b)

257 30Ü (KDX + i.'ij"

501

[CHC1, + C1]"

155 1S3J157

259

1

100

lUUs c) [CHOL, + Ci]-155 153,

2Й&

50

157

300

351 [PETN+ Ct]'

353

m/z

400

Рис. 4. Масе-спсктры a) TNT; b) RDX; v. c) PETN с тампока при атмосферной термодесорбции/хи ми ческой ионизации с использованием воздуха, содержащего СНСЬ.

С использованием описанного метода предполагается детектировать взрывчатые вещества с лротирочных тампонов и пыли с использованием прямой термической десорбции в масс-спектрометр с ионизацией при атмосферном давлении. Специфичность обеспечивается методом МС/МС и ионно-молекулярными реакциями.

Большинство ВВ содержат несколько нитрогрупп и являются нелетучими соединениями с очень низким давлением паров при нормальных условиях (так давление насыщенных паров 1,3,5-тринитро-1,3,5-триазацилогексана (RDX) при

комнатной температуре и атмосферном давлении около 5х10"9 Topp) Это существенно затрудняет их анализ в газовой фазе Для проведения анализа взрывчатых веществ в реальных условиях распространен отбор проб с твердых поверхностей или с пыли С использованием данного метода демонстрируется возможность детектирования взрывчатых веществ, адсорбированных на пыли, или снятых с поверхностей тампоном с использованием метода термодесорбции с поверхностей с одновременной химической ионизацией при атмосферном давлении в коронном разряде

Образцы с тампона или пыли пиролизовались в потоке воздуха, содержащего хлороформ (рис 3) Продукты пиролиза ионизовались коронным разрядом Эксперименты выполнены на коммерческом масс-спектрометре LCQ (Thermo Finnigan San Jose, CA) с источником атмосферной ионизации в моде отрицательных ионов при напряжении на острие разрядника 3 0-4 0 кВ, температуре десольватирующего капилляраЮО °С (В этих экспериментах может быть использован любой масс-спектрометр с атмосферным интерфейсом, в том числе и миниатюрный) Поток воздуха, содержащий хлороформ, получали либо внося в поток открытый флакон с хлороформом либо распыляя хлороформ со скоростью (10 рлитров/мин) Стандартные образцы ВВ 2,4,6-тринитротолуола (TNT), RDX и пентаеритритола тетранитрата (PETN) были получены от Accoustandards Inc (Connecticut, USA) в виде растворов (10 mg/mL в метанол/ацетонитриле) Тампоны были получены от Bamnger Technologies Inc (NJ, USA) Они применяются для проверки багажа в аэропортах на взрывчатку

В результате экспериментов для TNT, RDX и PETN наблюдаются ионы [TNT-H]" (m/z 226), [RDX+Cl]" (m/z 257) и [PETN+Cl] (m/z 351), соответственно Предварительные результаты показывают, что предел детектирования (ПД) для этого метода при мониторинге отдельных ионов меньше 10 ng (TNT), 30 ng (RDX) и 10 ng (PETN) при использовании масс-спектрометра средней чувствительности (см рис 4)

Put. 5, Различий в масс-спектрах столюговителышй фрагментации пеп тидов 1-16 бега-амилоида с заменой Asp-7 на иноформу

Селективность метода обеспечивается сслактивной ионизацией в присутствии паров хлороформа, а так же проведением я о н н о-моя екулярн ых реакций с образованием комплекса Мс йесснгей мер а -

Глава IV посвящена задаче определения изомерного состава аминокислот, входящих в состав пептидов и детектированию сверхнизких концентраций пептидов, содержащих подобные замены.

Была исследована возможность распознавания замен аминокислот на их изомерные формы в пептиде, соотвествующем фрагменту 1-16 бета-амилоида:

ьб+hgo

fy13-NMaP'

h

it

3

m.

Ü

^ (Ы4.К,0)'-

^ \ \ .»..«"С

I i""1 *T

IriH ТЫГСК^" Qcrt ПИН i 1r:

H* ii .T'.ir. ■ ■ .'*". / 'i,. /У

Рис.6. Зависимость относительной интенсивности реберных пиков фрагментов, образующихся при столкповительнои фрагментации, от относительной концентрации пептидов Ый бега амилоида с ¡ичличвыми ячомерными формами аегтарагиновой кислоты в бинарных смесях

[ACE]D1 ABFR5HDSGYIOEVH Н Q15 K[N Н 2] и

ACE[DlAEFR5II[isoD]SGY10EVI-niQ15K[NH2], а также замен аминокислот на их стереоизомеры и структурные изомеры в пептиде, соответствующем фрагменту 5-10 бета-амилоида:

R5H[isoDjSGYI0 [NH2], R5H[L form DjSGYlO [NH2], R5H[D form DjSGYlO [N112].

Пептиды f ACE]D 1AEFR5 HDSG Y1OEVHHQ 15K[Ni [2] и

ACE]DlAEFfWHiisoD]SGY10EVHHQ15K(NH2J были закуплены на фирме Сигма-Генозис (США). Пептиды R5H(isoDJSGY10 [NH2], R5H[L form D]SGY10 [NH2], R5H[D form D]SGY10 [NH2] были синтезированы в Лаборатории белковой инженерии (рук. проф. Е.Ф. Колес а нова) Института биомедицинской химии Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ БМХ РАМН) с использованием протокола «Макро-крэун синтез». Последовательность аминокислот во всех пептидах была подтверждена всеми доступными методами фрагментации — CID

1

1г. [1

1

I

Л

Ж

Д Д.-гг М-К

121

1

СМн«итвлмчикл!Не*ЛьнкТк.пи»э 1125£5 (фр а вшит г1

11 & 56(214 >

За 40 ет рз

(•М&ОИЬГЙ ПК 17М1(СМ) 2»)

Рис. 7. Зависимость относительной интенсивности репсркых пиков фрагметггов, образующихся ггри фрагментации за счет захвата электронов, от относительной концентрации пептидов 1-16 бета амилоида с различными изомерными формами асшфапыойой кислоты в бинарных смесях

(фрагментация при столкновении с молекулами остаточного газа), ECD (фрагментация за счет захвата электрона), IRMPD (фрагментация за счет поглощения излучения инфракрасного лазера)

Проведен детальный анализ процессов фрагментации пептидов методами столкновительной диссоциации (CID), диссоциации при захвате электрона (ECD), фрагментация за счет поглощения излучения инфракрасного лазера (IRMPD) При проведении анализа параметры фрагментации (время и энергия) варьировались в широком диапазоне В результате таких исследований были определены оптимальные параметры фрагментации (это достаточно широкий диапазон параметров), позволяющие получать наиболее существенные различия в масс-спектрах фрагментов исследуемых пептидов в зависимости от того, в какой изомерной форме находится аспарагиновая кислота

При изучении возможности определения замен аспарагиновой кислоты в составе пептида на изо-аспарагиновую кислоту при помощи методов фрагментации CID, ECD и 1RMPD обнаружены существенные различия в спектрах фрагментации, а именно - в спектрах ECD (рис 7) фрагментов пептидов, содержащих изо-форму аспарагиновой кислоты присутствуют пики, соответствующие фрагментам сп+57 и комплиментарные им фрагменты zN-n-57, где п - положение изоформы аспарагиновой кислоты в пептиде, a N- количество аминокислот в пептиде В масс-спектрах ECD фрагментов пептидов, содержащих нормальную форму аспарагиновой кислоты подобные пики отсутствуют Аналогично, в масс-спектрах CID (рис 5) фрагментов пептидов, содержащих изо-форму аспарагиновой кислоты присутствуют пики, соответствующие фрагментам Ьа+Н20, а в масс-спектрах CID и IRMPD фрагментов пептидов, содержащих нормальную форму аспарагиновой кислоты подобные пики отсутствуют

Наличие такого существенного различия в масс-спектрах фрагментации ионов позволило создать методику количественного определения относительной концентрации пептидов (рис 6,7), содержащих L-форму аспарагиновой кислоты или изо-форму аспарагиновой кислоты Для определения чувствительности метода

были проведены измерения масс-спектров смесей модельных пептидов (амилоидов) с аминокислотами (аспарагиновая кислота) в разных изомерных формах (изо-, L- и D-) в широком диапазоне концентраций (1-100%) с концентрационным шагом, соответствующим воспроизводимости метода Достигнутая в настоящее время чувствительность метода составляет 5-15 nmol/L

В масс-спектрах фрагментации пептидов, содержащих L, D стереоизомеры и L-изоформу аспарагиновой кислоты так же были обнаружены существенные различия в относительных концентрациях образующихся фрагментов, например при фрагментации CID и IRMPD ((Ъ5)2+) и 294 2(Ь2), при фрагментации ECD 426 2(с4) и 409 2(ЬЗ)

Были получены линейные калибровочные кривые во всем диапазоне концентраций для всех исследованных пептидов, позволяющие определять концентрации модифицированных пептидов с точностью порядка 0 5% Линейность наблюдается для всех использованных методов фрагментации (ECD, СЮ и IRMPD)

Была продемонстрирована чувствительность метода на уровне 5-15 nM/L в нормальном режиме работы и на уровне 1 nM/L в режиме MRM С использованием наноспрейного ионного источника для проведения анализа необходимо 10 микро литров раствора

Для дальнейшего развития данного метода была продемонстрирована возможность анализа с использованием MALDI ионизации при атмосферном давлении (АР MALDI) Существенным отличием этого метода является то, что при MALDI ионизации образуются преимущественно однозарядные ионы исследуемого пептида, что существенно усложняет изоляцию материнских ионов и фрагментацию Было продемонстрировано, что при использовании метода АР MALDI можно эффективно детектировать замену аспарагиновой кислоты в пептиде на изоаспарагиновую при концентрациях исследуемых пептидов выше чем 100 нМ/л

Основные результаты и выводы.

1 Создан масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с интерфейсом для ионных источников, работающих при атмосферном давлении

2 Разработан и создан источник химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом исследуемых веществ

3 Продемонстрирована возможность обнаружения взрывчатых веществ при помощи созданного ионного источника химической ионизации с термодесорбционным вводом анализа взрывчатых веществ, сорбированных на пыли и поверхностях, достигнута чувствительность на уровне 10 нг TNT

4 Создана методика распознавания и количественного определения относительного содержания в бинарных смесях изомерных замен аспарагиновой кислоты в пептидах с использованием CID и ECD фрагментации

5 Продемонстрирована возможность определения замен при помощи MALDI при атмосферном давлении

Список публикаций:

1 MB Горшков, О Н Харыбин, А Н Вилков, В В Дривен, И А Попов, М И Даштиев, Е Н Николаев Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса для биохимических исследований И Химическая физика, 2002, 21(4), 32-38

2 И А Попов. М В Горшков, О Н Харыбин, А И Спасский, А С Кононихин, Д Н Брумирский, Е Н Николаев Способы увеличения интенсивности ионного тока в масс-спектрометре ИЦР // Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции 2003, т IV, 58

3 Д Н Брумиркий, М В Горшков, О Н Харыбин, И А Попов. О Н Харыбин, И А Тарасова, Е Н Николаев Об эффективности фрагментации ECD в масс-спектрометрии ИЦР И Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции 2003, т IV, 57

4 И А Попов. И В Горшков, О Н Харыбин, А И Спасский, А С Кононихин, Д Н Брумирский, Е Н Николаев Исследование хиральности аминокислот в коротких пептидах с использованием столконовителъной фрагментации П Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции 2003, т IV, 59

5 Eugene Nikolaev, Rui Zhang, Ieor Popov. Mikhail Belov, Richard D Smith Fast trapping of externally acuumulated ions by strong DC defocusing inside ICR cell -"Radial kick" II16th International Mass Spectrometry Conference Edinburg, 2003 p 128

6 И А Попов, О H Харыбин, М Е Белов, Е Н Николаев Исследование захвата низкоэнергетичных ионов в измерительной ячейке ИЦР II Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции 2003, т IV, 21-23

7 Spassky А I, Kharybin О N , Popov IА . Gorshkov М V , Kononikhm A S , Brumirsky D N , Nikolaev Е N Combination of high pressure matrix-assisted laser desorption ionization (MALD1) ion source and radio-frequency ion funnel II Book of abstracts 10th International Conference "Desorption 2004" August 29 -September 2, Saint Petersburg, Russia - 2004, p 121

8 Попов И A . Харыбин О H , Горшков М В , Кононихин А С , Спасский А И, Брумирпский Д Н , Тарасова И А , Дривен В В , Николаев Е Н Масс-

спектрометр ионного циклотронного резонанса для анализа биополимеров И Вторая международная школа-семинар «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Москва, Россия, 4-7 октября, 2004, стр 119-120

9 Горшков M В , Тарасова И А , Брумирский Д H , Харыбин О H, Попов И А . Кононихин А С , Спасский А И , Николаев Е H , Горшков А В , Евреинов В В Возможности структурного анализа синтетических почимеров методом масс- спектрометрии ионного циклотронного резонанса И Вторая международная школа-семинар «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Москва, Россия, 4-7 октября, 2004, стр 229230

10 Попов И А . Харыбин ОН, Брумирский ДН, Кононихин АС, Спасский А И, Горшков M В, Николаев Е H Идентификация хиральности аминокислот в составе пептидов с использованием столкновительной фрагментации II Вторая международная школа-семинар «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Москва, Россия, 4-7 октября, 2004, стр 243-244

11 А И Спасский, О H Харыбин, И А Попов, M В Горшков, А С Кононихин. Д H Брумирский, Е H Николаев Ионный источник ЛДИМ высокого давления с использованием электродинамической ионной воронки II Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции Москва, Россия, 2004, стр 50

12 В Горшков, О H Харыбин, И А Попов, Д H Брумирский, И А Тарасова, А С Кононихин, Е H Николаев Новые методы фрагментации биополимеров для «скорострельной» протсомики II Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук Труды конференции Москва, Россия, 2004,стр 49

13 Spasski] АI, Harybm О N, Popov IА . Kononikhm A S , Brumirsky D N, Chingin К S , Driven V V , Gorshkov M V , Nikolaev E N Intermediate pressure MALDI inside ion funnel for FT1CR //51 th ASMS conference, Nashville, TN, USA May 2004 - 2004, on CD

14 Michael V Gorshkov, Igor A Popov. Oleg N Kharybm, Dmitry N Brumirskiy, Irina A Tarasova, Vladimir V Dnven, Aleksey N Konomkhin, Alexander I Spassky, Eugene N Nikolaev Towards Implementation of Electron Capture

Dissociation Technique for Mass Spectrometers with Radio-Frequency

Multipole Transmission Ion Guides II 52nd ASMS Conference, May 23 - 27, 2004, Nashville, Tennessee, USA

15 Popov IA . Chen H, Kharybm O N , Nikolaev E N , Cooks R G Detection of explosives on solid surfaces by thermal desorption and ambient ion/molecule reactions!/ChemCommun (Camb) -2005, vl5,pp 1953-1955

16 Nikolaev E N , Kharybm O N , Popov I A Atmospheric pressure thermoionization of organics, Recognition of chirality by in situ probing/1 Proceedings of the 53d ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2005

17 Popov I A . Chen H , Kharybm O N , Nikolaev E N , Cooks R G Detection of Some Explosives from Solid Surfaces by Thermal Desorption and chemical ionization in corona discharge and Ambient Ion/Molecule Reactions!I Proceedings of the 53d ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2005

18 Eugene N Nikolaev, Igor A Popov. Oleg N Kharybm, Alexey S Konomkhin, Manna I Nikolaeva and Yunj V Bonsov In situ recognition of molecular chirality by mass spectrometry Hydration effects on differential stability ofhomo-and heterochiral dimethyltartrate clusters II International Journal of Mass Spectrometry Vol 265(2-3), pp Pages 347-358

19 E N Nikolaev, IA Popov. S A Kozin, O N Khaiybin, A S Konomkhin, E F Kolesanova , A I Archakov Recognition of individual ammo acid isomeric form m peptides by FT ICR mass spectrometry application to Alzheimer's disease peptides II The Third International Conference "Genomics, Proteomics, Biomfarmatics and Nanotechnologies for Medicine"Novosibirsk, Russia 12-16 July 2006

20 Igor A Popov. Sergey Kozm, Oleg N Kharybm, Aleksey S Konomkhin, Eugene N Nikolaev Recognition of individual amino acid isomeric form in peptides by FT ICR mass spectrometry Application to Alzheimer's disease peptides //The 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, May 28-June 1, 2006, Seattle, WA, USA

21 Igor A Popov. Sergey A Kozin, Aleksey S Konomkhin, Ivan A Boldin, Oleg N Kharybm, Alexander I Archakov, Eugene N Nikolaev FT ICR mass spectrometry quantitative characterization of an isomerized beta-amyloid peptide using ECD, CID and IRMPD methods II 4th Uppsala International Conference on

Electron Capture and Transfer Dissociation Mass Spectrometry - Fundamental and Applications" Hong Kong December 12-15,2006

22 P S Vinogradov, D M Avtonomov, I A Popov. E N Nikolaev An effect of plasma formation on mechanisms of ionization near a cathode in flow technique mass spectrometry studies // 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 3-7, 2007, Indianapolis, IN, USA

23 Igor A Popov. Sergey A Kozin, Aleksey S Kononikhm, Ivan A Boldin, Oleg N Kharybin, Ekatenna F Kolesanova, Alexander 1 Archakov, Eugene Nikolaev Quantization of isomeric forms of aspartic acid in "Alzheimer peptide" by ECD, CID and 1RMPD methods II 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 3-7, 2007, Indianapolis, IN, USA

24 Aleksey S Konomkhin, Igor A Popov. Sergey A Kozin, Eugene Nikolaev Recognition of aspartic acid isomeric forms in "Alzheimer peptide" using AP MALDI II 55lh ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 3 - 7, 2007, Indianapolis, IN, USA

25 E H Николаев, А С Кононихин, В Г Згода, С А Мошковский, О Н Харыбин, И А Попов. Д М Автономов, И А Агрон, В С Курова, О В Демина, С Д Варфоломеев Разработка и применение метода точной массовой метки в масс-спектрометрии для хромато-масс-спектрочетрического анализа протеома мочи II Фундаментальные науки-медицине Материалы конференции, М Фирма «Слово», стр 168-169, 2006г

26 Щиголев Б А , Попов И А . Кононихин А С , Харыбин О Н , Автономов Д М , Козин С А, Николаев Е Н Определение предельной чувствительности детектирования замены аспарагиновой кислоты на ее изо-форму в составе фрагмента 1-16 амилоида А-бета с использованием метода MRM II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

27 Лукин Б М , Кононихин А С , Попов И А , Козин С А , Николаев Е Н Определение изомерных форм аминокислот в составе пептидов с использованием AP-MALDI II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

28 Д М Автономов, А С Кононихин, И А Попов. Е Н Николаев Поиск посттрансляционных модификаций методами кластеризации масс-спектров триптических пептидов и статистики разностей масс для повышения достоверности идентификации исходных белков. II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

29 Харыбин О Н, Згода В Г, Кононихин А С, Мошковский С А , Попов И А. Николаев ЕН Исследование белкового состава мочи человека II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

30 Янц В В, Головкин Н В , Харыбин О Н , Попов И А . Кононихин А С , Николаев Е Н Десорбционно-электроспрейная ионизация для масс-спектра APEX Qe II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 1621 Апреля, 2007

31 Рюмин П А , Харыбин О Н , Кононихин А С , Попов И А . Николаев Е Н Термоионизация при атмосферном давлении для прямого масс-спектрального анализа II Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии 3-я Международная Конференция-школа, Звенигород, Россия, 16-21 Апреля, 2007

32 Попов И А . Кононихин А С , Янц В В , Харыбин О Н , Козин С А , Николаев Е Н О возможности применения прямых методов ионизации (десорбционно-электрораспьшительная ионизациия и МАЛДИ при атмосферном давлении) для исследования биологических объектов на примере пептида болезни Алъцгеймера II Третий съезд ВМСО, 2-ая Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», 3-7 сентября 2007 г, Москва

Подписано в печать 12 10 2007 г Исполнено 12 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ N° 892 Тираж 50 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Введение.

Глава 1.

Литературный обзор.

Основы масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразование Фурье.

Движение заряженных частиц в электрическом и магнитном полях.

Явление циклотронного резонанса.

Структура современного спектрометра ИЦР и принцип его работы.

ИЦР масс-спектрометрия с преобразованием Фурье.

Ионные источники, работающие при атмосферном давлении.

Источник ионов на основе электрораспыления в вакуум (электроспрей).

MALDI при атмосферном давлении.

Источник MALDI при атмосферном давлении.

APCI - химической ионизации при атмосферном давлении.

Различные конфигурации атмосферных интерфейсов масс-спектрометров

Методы фрагментации органических молекул в масс-спектрометрах.

Столкновительная фрагментация (CID).

Продолжительное нерезонансное возбуждение циклотронного. движения ионов.

Инфракрасная многофотонная диссоциация (IRMPD).

Диссоциация при захвате электрона (ECD/ETD).

Способы определения изомерных форм аминокислот в составе пептидов.

Глава II. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с ионным источником электрораспыления в вакуум.

Конструкция ионного источника электрораспыления в вакуум.

Принцип работы ионного источника электрораспыления в вакуум.

Радиочастотная ионная воронка.

Радиочастотная система транспортировки ионов. Система внешнего накопления и импульсного захвата ионов.

Конструкция вакуумной системы.

Конструкция системы радиочастотной транпортировки ионов.

Измерительная ячейка ИЦР. Захват и накопление ионов.

Столкновительный захват ионов в ячейке ИЦР.

Столкновительная диссоциация ионов при продолжительном нерезонансном возбуждениии циклотронного движения.

Система внешнего накопления и импульсного захвата ионов в измерительной ячейке ИЦР.

Глава III.

Разработка чувствительного и селективного метода экспресс-обнаружения следовых количеств взрывчатых веществ в твердом состоянии.

Источник ионов.

Метод.

Пределы детектирования.

Глава IV.

Глава IV.

Определение изомерного состава аминокислот, входящих в состав пептидов.

Количественный анализ.

Масс-спектрометрия с момента ее появления в начале 20-го века является одним из наиболее информативных физических методов исследования веществ во всех агрегатных состояниях. В последнее время масс-спектрометрия переживает бурное развитие. Прогресс в развитии масс-спектрометрии был связан с совершенствованием масс-анализаторов, детекторов ионов и, в первую очередь, с созданием и развитием методов ионизации. В первых масс-спектрометрах использовались методы ионизации веществ, находящихся в газообразном состоянии, такие как разряд и электронный удар. Эти методы позволяли анализировать газообразные вещества или вещества, которые могут быть переведены в газообразное состояние. Они в значительной степени покрывали потребности анализа воздуха, различных летучих веществ, в том числе и органического происхождения, в частности, продуктов переработки нефти, да и самой нефти при использовании методов пиролиза. В семидесятые годы прошлого века сильно активизировались исследования, направленные на поиск методов неразрушающей ионизации больших органических молекул с целью применить масс-спектрометрию для анализа биологических систем. Было открыто несколько методов неразрушающей ионизации биологических молекул с атомными весами до 10 кДальтон. Это полевая десорбция, вторичная ионная эмиссия из молекулярной матрицы (глицерин и подобные вещества, дающие протоны при ударе о них ускоренных ионов), бомбардировка быстрыми атомами (FAB), плазменная десорбция. Революционизирующим масс-спектрометрию событием стало открытие неразрушающих молекулы методов ионизации электроспрея (ESI) и лазерной десорбции ионизации из матрицы (MALDI), позволяющих ионизовать и вводить в масс-анализатор большие, в сотни Мегадальтон, молекулы биологического происхождения без их разрушения. Эти удостоенные

Нобелевской премии открытия послужили толчком к бурному развитию биологической масс-спектрометрии.

Ионы могут получиться не только при ионизации нейтрального вещества в разных агрегатных состояниях, но и при диссоциации уже имеющихся ионов. Процессы образования ионов при диссоциации ионизированных молекул оказались чрезвычайно важными при исследовании структуры молекул методами масс-спектрометрии, в особенности биологических молекул, таких как ДНК, РЖ и белков, являющихся биополимерами. Наряду с фрагментацией молекулярных ионов, вызываемой столкновениями этих ионов с атомами или малоатомными молекулами (CID), в настоящее время при исследовании структуры биомолекул используется лазерный нагрев ионов - многофотонная лазерная инфракрасная диссоциация (IRMPD), рекомбинация со свободными электронами (ECD) и электронами, передаваемыми на исследуемые ионы (многозарядные положительные продукты ионизации электроспреем) от отрицательных ионов (ETD).

В данной работе основное внимание уделяется дальнейшему совершенствованию и поиску новых применений новых методов ионизации и фрагментации органических молекул - как синтетических низкомолекулярных (на примере взрывчатых веществ), так и природных -белки и пептиды.

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящих исследований была разработка новых масс-спектрометрических методов анализа органических молекул, позволяющих исследовать молекулы разных классов, для чего были решены следующие задачи:

1) Разработка масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионным источником, работающим при атмосферном давлении.

2) Разработка чувствительного и селективного метода экспресс-обнаружения взрывчатых веществ в твердом состоянии, позволяющего избежать предварительной подготовки пробы или свести её к минимуму.

3) Разработка чувствительного метода количественного определения относительных концентраций пептидов с заменами аспарагиновой кислоты на её изо-форму при использовании ионизации на основе метода электрораспыления в вакуум.

4) Применение метода количественного определения относительных концентраций пептидов с заменами аспарагиновой кислоты на её изо-форму в случае работы с ионным источником на основе лазерной десорбции из матрицы (MALDI).

Научная новизна.

1. Впервые разработан и создан источник химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом исследуемых веществ.

2. Впервые продемонстрирована возможность обнаружения взрывчатых веществ при помощи созданного ионного источника химической ионизации с термодесорбционным вводом анализа взрывчатых веществ, сорбированных на пыли и поверхностях, достигнута чувствительность на уровне 10 нг TNT.

3. Впервые создана методика распознавания и количественного определения относительного содержания в бинарных смесях изомерных замен аспарагиновой кислоты в пептидах с использованием СГО и ECD фрагментации.

4. Впервые продемонстрирована возможность определения замен при помощи MALDI при атмосферном давлении.

5. Впервые в РФ создан масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с интерфейсом для ионных источников, работающих при атмосферном давлении.

Практическое значение работы.

Результаты, полученные в данной работе могут быть использованы при создании нового и дальнейшем совершенствовании существующего масс-спектрометрического оборудования, при разработке систем контроля безопасности различных объектов. Кроме того, описанные в диссертации методы, могут быть использованы при изучении молекулярных основ болезни Альцгеймера, а так же при создании новых методов биологических и биохимических исследований, связанных с созданием новых подходов молекулярной медицинской диагностики.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 32 рисунка, 3 таблицы.

Основные результаты и выводы.

1. Создан масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с интерфейсом для ионных источников, работающих при атмосферном давлении.

2. Разработан и создан источник химической ионизации при атмосферном давлении с термодесорбционным вводом исследуемых веществ.

3. Продемонстрирована возможность обнаружения взрывчатых веществ при помощи созданного ионного источника химической ионизации с термодесорбционным вводом анализа взрывчатых веществ, сорбированных на пыли и поверхностях, достигнута чувствительность на уровне 10 нг TNT.

4. Создана методика распознавания и количественного определения относительного содержания в бинарных смесях изомерных замен аспарагиновой кислоты в пептидах с использованием СЮ и ECD фрагментации.

5. Продемонстрирована возможность определения замен при помощи MALDI при атмосферном давлении.

1. Alan G. Marshall, Christopher L. Hendrikson, George S. Jackson. Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry: A primer. //Mass Spectrom. Rev., 1998, II, p. 1-35.

2. Alan G. Marshall. Milestones in Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry technique development. //International Journal of Mass Spectrometry, 200(2000), p. 331-356.

3. Shenheng Guan and Alan G. Marshall. Ion traps for Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: principles and design of geometric and electric configurations. // International Journal of Mass Spectrometry, 220.

4. M.B. Горшков, O.H. Харыбин, A.H. Вилков, B.B. Дривен, И.А. Попов. М.И. Даштиев, Е.Н. Николаев. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса для биохимических исследований. ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2002, том 21, №4, с.32-38

5. Comisarov М.В., Marshall A.G., Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy. Chem. Phys. Lett., 1974, v. 25, No. 2, p. 282 - 283.

6. Brigham E.O., The Fast Fourier Transform., N.Y.: Prentice Hall, 1974.

7. Comisarov, M. В., Marshall A.G.// Chem. Phys. Lett. 1974. V.26. P.489.

8. Fenn J.B., Mann, M., Meng C.K., etc.//Mass Spectrom. Rev. 1990. V. 9. P.37.

9. Smith R.D., Loo J.A., Loo R.R.O., etc.// Mass Spectrom. Rev. 1991. V.10. P.359-451.

10. Henry K.D., Williams E.R., Wang B.H., etc.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V.86. P.9075.

11. Hofstadler S.A., Laude D.A.//Anal. Chem. 1992. V.64. P.569.

12. Winger B.E., Hofstadler S.A., Bruce J.E., etc. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993. V.4. P.566.

13. Winger B.E., Hofstadler S.A., Bruce J.E., etc.// J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993. V.4. P.566.

14. Beu S.C., Senko M.W., Quinn J.P., etc.// J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993. V.4. P.190.

15. Gorshkov M.V., Pasa Tolic L., Udseth H.R., etc// J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998. V.9. P.692.

16. Belov M.E., Gorshkov M.V., Udesth H.R., etc.// Anal. Chem. 2000. V.72. P.2271.

17. Вилков A.H., Николаев E.H., Горшков M.B. // Химическая физика. 2000. т.19. стр. 47.

18. Schweikhard L., Marshall A.G. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993. V.4. P.433.

19. Gorshkov M.V., Pasa Tolic L., Bruce J.E., etc. // Anal. Chem. 1997. V.69. P. 1307.

20. Beu S.C., Laude D.A. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1990. V.97. P.295.

21. Gorshkov M.V., Nikolaev E.N. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1993. V.125. P.l.

22. Senko M.W., Hendrickson C.L., Emmett M.R.,etc.//J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1997. V.8. P.970.

23. Belov M.E., Nikolaev E.N., Anderson G.A., etc. //Anal. Chem. 2001. V.73. P.253.

24. Gorshkov M.V., Pasa-Tolic L., Smith R.D. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999. V.10. P.15-18.

25. Belov M.E., Gorshkov M.V., Alvin K., Smith R.D. // Rapid commun. In Mass Spectrometry, 2001,15: 1988-199631 .Belov M.E., Gorshkov M.V., Udseth H.R., etc. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. V.ll. P.19-23.

26. Karas, M.; Hillenkamp, F. And. Chem. 1988, 60,2299.

27. Laiko V.V., Baldwin M.A. and Burlingame A.L., Anal Chem 2000; 72:5239

28. Philip V.T., Laiko V.V. and Doroshenko V.M., Anal Chem 2004; 76:2462

29. Phillip V. Tan, Victor V. Laiko, and Vladimir M. Doroshenko. Atmospheric Pressure MALDI with Pulsed Dynamic Focusing for High-Efficiency Transmission of Ions into a Mass Spectrometer. Anal. Chem.2004, 76,2462-2469

30. Mikhail E. Belov, Mikhail V. Gorshkov, Harold R. Udseth, Gordon A. Anderson, and Richard D. Smith, Zeptomole-Sensitivity Electrospray Ionization-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry of Proteins, Anal. Chem.2000,72,2271-2279

31. Biological Significance of Isoaspartate and Its Repair System. Takahiko Shimizu, Yasuji Matsuoka, Takuji Shirasawa Biol. Pharm. Bull. 28(9) 1590—1596 (2005)

32. Clarke S., Ageing Res. Rev, 2, 263—285 (2003).

33. Voorter С. E, de Haard-Hoekman W. A., van den Oetelaar P. J., Bloemendal H, de Jong W. W, J. Biol. Chem, 263,19020—19023 (1988).

34. D-aspartic acid in purified myelin and myelin basic protein. Fisher GH, Garcia NM, Payan IL, Cadilla-Perezrios R, Sheremata WA, Man EH. Biochem Biophys Res Commun. 1986 Mar 13;135(2):683-7.

35. Extension of the Drosophila lifespan by overexpression of a protein repair methyltransferase. Chavous DA, Jackson FR, O'Connor CM Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Dec 18;98(26):14814-8. Epub 20

36. Weber D. J, McFadden P. N, Caughey B, Biochem. Biophys. Res. Commun, 246, 606—608 (1998).

37. Beta-Amyloid-(l-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: implications for the pathology of Alzheimer disease. A E Roher, J D Lowenson, S

38. Clarke, A S Woods, R J Cotter, E Gowing, and M J Ball Proc Natl Acad Sci USA. 1993 November 15; 90(22): 10836-10840.

39. Phenotypic Analysis of Seizure-Prone Mice Lacking L-Isoaspartate (D-Aspartate) 0- Methyltransferase. Kim, E., Lowenson, J. D., Clarke, S., and Young, S. G. (1999) J. Biol. Chem. 274,20671-20678.

40. Fales, H. M.; Wright, G. J. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 2339-2340.

41. F.J. Winkler, R. Medina, J.Winkler and H. Krause, 13th International Mass Spectrometry Conference, Budapest, 1994

42. Chiral Analysis by Electrospray Ionization Mass Spectrometry/Mass Spectrometry.1. Chiral

43. Recognition of 19 Common Amino Acids. Zhong-Ping Yao, Terence S.M.Wan, Ka-Ping Kwong and Chun-Tao Che. Anal. Chem.2000,72, 5383-5393

44. Harris, D. C. Quantitative Chemical Analysis, 5th ed.; W. H. Freeman and Co.: New York, 1999; p 74.

45. Chiral Analysis by Electrospray Ionization Mass Spectrometry/Mass Spectrometry.

46. Determination of Enantiomeric Excess of Amino Acids. Zhong-Ping Yao, Terence S.M.Wan, Ka-Ping Kwong and Chun-Tao Che. Anal. Chem.2000, 72, 5394-5401

47. Roepstorff, P and Fohlman, J, Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom, 11(11) 601 (1984).

48. Johnson, RS, Martin, SA, Biemann, K, Stults, JT and Watson, JT, Novel fragmentation process of peptides by collision-induced decomposition in a tandemmass spectrometer: differentiation of leucine and isoleucine. Anal. Chem., 59(21) 2621-5 (1987).

49. Zubarev, R. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Electron Capture Dissociation of Multiply Charged Protein Cations a Nonergodic Process J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3265-3266.

50. Syka, J.E.P., Coon, J.J., Schroeder, M.J., Shabanowitz, J., and Hunt, D.F. 2004. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 9528-9533.

51. Electron capture dissociation distinguishes a single D-amino acid in a protein and probes the tertiary structure. Adams, C.M.; Kjeldsen, F.; Zubarev, R.; Budnik, B.A.; Haselmann, K.F. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004,15,1087-1098.

52. Mass spectrometric differentiation of linear peptides composed of L-amino acids from isomers containing one D-amino acid residue. Scott V. Serafin, Rhonda Maranan, Kangling Zhang, and Thomas Hellman Morton, Anal Chem.2005 Sep l;77(17):5480-7

53. Carr SA, Hemling ME, Bean MF, Roberts GD. Anal. Chem. 1991; 63: 2802.

54. Carr SA, Bean MF, Hemling ME, Roberts GD. Integration of Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Research In Biological Mass Spectrometry, Burlingame AL, McCloskey JA (eds). Elsevier Science: Amsterdam, 1992; 621-652.

55. Papayannopoulus IA, Biemann K. Pept. Res. 1992; 5: 83.

56. Lehmann, W. and Schlosser, A. 2000. Five-membered ring formation in uni-molecular reactions of peptides: A key structural element controlling low-energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35: 1382-1390.

57. J. Yinon, Anal. Chem., 2003, 75,99A.

58. Jason Cournoyer; Peter O'Connor. Estimating Relative Isoaspartyl/Aspartyl

59. Abundances Using ECD. //The 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry and

60. Allied Topics, May 28-June 1,2006, Seattle, WA, USA

61. J. Yinon, J. E. McClellan, R. A. Yost, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997, 11, 1961.

62. S. A. McLuckey, D. E. Goeringer, K. G. Asano, G. Vaidyanathan, J. L. Stephenson, Jr. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1996, 10, 287.

63. K. Hakansson, R. V. Coorey, R. A. Zubarev, V. L. Talrose, P. Hakansson, J. Mass Spectrom., 2000, 35, 337.

64. J. B. Fenn, U.S. Pat. Appl. Publ. 2004, 8 pp.

65. Z. Takats, J. M. Wiseman, B. Gologan, R. G. Cooks, Science 2004, 5695,471.

66. Z. Takats, C. Ismael, T. Nari, R. G. Cooks, Chem. Commun., Submitted.

67. R. J. Beuhler, E. Flanigan, L. J. Greene, L. Friedman, J. Am. Chem. Soc., 1974, 96, 3990.

68. Cummings,J.L., 2004, Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 351, 56-67

69. Завалишин И.А, Яхно H.H., Гаврилова С.И., 2001, Нейродегенеративные болезни и старение

70. Hardy,J. and Selkoe,D.J., 2002, The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353-356

71. Bush, A.I. et al, 1994, Rapid induction of Alzheimer A beta amyloid formation by zinc. Science 265,1464-1467

72. Lee,J.Y. et al, 2002, Contribution by synaptic zinc to the genderdisparate plaque formation in human Swedish mutant APP transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99,7705-7710

73. Kozin,S.A et al, 2001,. Zinc binding to Alzheimer's Abeta(l-16) peptide results in stable soluble complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285,959-964

74. Zirah,S., Kozin,S.A., et al, 2006, Structural changes of region 1-16 of the Alzheimer disease amyloid beta-peptide upon zinc binding and in vitro aging. J Biol. Chem. 281, 2151-2161

75. Roher,A.E., et al, 1993, Structural alterations in the peptide backbone of beta-amyloid core protein may account for its deposition and stability in Alzheimer's disease. J Biol. Chem. 268, 3072-3083

76. Vaughan,D.W. and Peters,A.,1981, The structure of neuritic plaque in the cerebral cortex of aged rats. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 40,472-487.

77. Eugene Nikolaev, Rui Zhang, Igor Popov, Mikhail Belov, Richard D. Smith. Fast trapping of externally acuumulated ions by strong DC defocusing inside ICR cell -"Radial kick". // 16th International Mass Spectrometry Conference. Edinburg, 2003. p.128.

78. Popov I.A. Chen H., Kharybin O.N, Nikolaev E.N, Cooks R.G. Detection of explosives on solid surfaces by thermal desorption and ambient ion/molecule reactions// Chem Commun. (Camb). 2005, v.15, pp. 1953-1955.

79. Nikolaev E.N, Kharybin O.N, Popov I.A. Atmospheric pressure thermoionization of organics, Recognition of chirality by in situ probing// Proceedings of the 53d ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2005