Методы масс-спектрометрии для решения стереохимических задач в ряду производных цитизина и циклопропанкарбоновой кислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

005057454

На правах рукописи

ЕРАСТОВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ СТЕРЕОХИМИЧЕСКИХ ЗАДАЧ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИТИЗИНА И ЦИКЛОПРОПАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 8 АПР г

ЇА4

Уфа-2013

005057454

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук

Галкин Евгений Григорьевич

Официальные оппоненты: Кантор Евгений Абрамович

доктор химических наук, профессор

(ФГБОУ ВПО «Уфимский государственный нефтяной

технический университет», заведующий кафедрой

физики)

Грабовский Станислав Анатольевич

кандидат химических наук, доцент

(ФГБУН Институт органической химии Уфимского

научного центра РАН, старший научный сотрудник)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической и физической химии ии. А.Е. Арбузова РАН

Защита состоится 26 апреля 2013 г. в 14 — часов на заседании диссертационного совета Д 002.004.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, Башкортостан, г. Уфа, проспект Октября, 71, зал заседаний. Телефакс: (,347) 2356066. Е-таі!: с1іето^@апгЬ .ги.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан 23 марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор Ф. А. Валеев

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В последние годы современные методы масс-спектрометрии, такие как МА1Л)1 и электроспрей, находят всё большее число стереохимических приложений. Однако для многих объектов исследования наилучшим образом подходит классический метод хроматомасс-спектрометрии электронного удара, поскольку он позволяет анализировать смеси без предварительного разделения, а спектры являются наиболее информативными. Таким образом, изучение возможностей метода электронного удара в стререохимии представляется актуальным. В качестве объектов исследования выбраны два класса соединений - природные и синтетические хинолизидиновые алкалоиды, а также производные метилового эфира циклопропанкарбоновой кислоты. Производные хинолизидиновых алкалоидов привлекают внимание исследователей благодаря высокой нейрофизиологической активности. Внимание ко второй группе соединений вызвано проводимыми в ИОХ УНЦ РАН исследованиям реакций каталитического взаимодействия ненасыщенных соединений с метилдиазоацетатом. В обоих случаях возникают проблемы идентификации и оценки вкладов стереоизомеров в полученных реакционных смесях.

Работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по темам «Разработка новых методов синтеза гетероциклических систем» (номер государственной регистрации 0120.0 80144) и «Выделение, структурные исследования, трансформации, синтез и биологическая активность природных соединений (номер государственной регистрации 01201152194)

Цель работы.

Поиск масс-спектрометрического способа, позволяющего определить содержание диастереомеров хинолизидиновых алкалоидов в смеси независимо от содержания в ней посторонних компонентов; идентификация продуктов реакции взаимодействия метилдиазоацетата с ненасыщенными соединениями и определение их конфигурации.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые для определения содержания диастереомеров в их смеси применены масс-спектрометрические методики на основе сканирования электрического поля и сканирования выбранных ионов, что привело к увеличению различий между спектрами в диастереомерных парах и повышению чувствительности метода к целевым соединениям. Использование сканирования электрического поля в сочетании с ионной масс-

фрагментографией позволило добиться улучшения разделения хроматографических пиков диастереомеров.

Применив методы хроматомасс-спектрометрии электронного удара и тандемную масс-спектрометрию, удалось найти способ идентификации продуктов взаимодействия ненасыщенных соединений с метилдиазоацетатом. С целью увеличения различия между практически одинаковыми масс-спектрами цис- и транс- изомеров полученных циклопропановых производных, применена техника ионизации при низкой энергии электронов, а проведённые ab initio расчёты позволили отнести масс-спектр к форме того или иного изомера. Такой комплекс экспериментальных и расчётных методов для решения подобного рода задач ранее не применялся.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на Всероссийской конференции по органической химии (г. Москва, 2009 г.), Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (г. Уфа, 2011 г.), V Всероссийской конференции «Новые достижения в химии п химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012 г.)

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, и тезисы 5 докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 129 страницах, содержит 4 таблицы, 7 схем и 6 рисунков; состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы включает 144 наименований. В приложении приведены масс-спектры изучаемых соединений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Определение диастереомерного состава производных ]Ч-(2-оксиэтил)-цитизина

Масс-спектрометрия электронного удара является удобным методом для анализа природных и синтетических алкалоидов хинолизидинового ряда. Для оценки вкладов диастереомеров в смесях производных Ы-(2-оксиэтил)-цитизина (1-6) необходимо было разработать масс-спектрометрический способ, работающий независимо от содержания посторонних компонентов, а также оценить его точность и границы применимости. Сложность заключалась в том, что масс-спектры диастереомеров на качественном уровне близки, а количественных различий не достаточно для анализа смеси обычным методом. Эффективного хроматографического разделения добиться не удавалось, поэтому вычислить вклад по площадям пиков не представлялось возможным.

Изучены 3 пары диастереомеров: :Ы-(2-адамантил-2-оксиэтил)-цитизин 1 и 2, N-(2-фенил-2-оксиэтил)-цитизин 3 и 4, ]<1-(2-оксипропил)-цитизин, 5 и 6. Для исследования были доступны как индивидуальные диасгереомеры, так и реакционные смеси, содержащие R- и S- формы в разных соотношениях, а также посторонние примеси.

1 R=Ad, R-

2 S-

3 r«C6H5, R-

4 S-

SR=CH3, R-6 S-

Масс-спектры соединений 1-6 характеризуются крайне малой интенсивностью молекулярных ионов. Поэтому определение брутто-состава с использованием масс-спектров высокого разрешения проводилось по значениям пиков ионов [М-П20]+. Наиболее интенсивные пики в масс-спектрах соответствуют: отрыву заместителя R (m/z 233), отщеплению групп CH(OH)R или 0=CHR (m/z 203 и 204 соответственно), а также ионам, образующихся при расщеплении геггероцикла по узловым точкам.

Масс-спектры всех шести компонентов на качественном уровне очень близки. Наиболее заметное различие в каждой паре диастереомеров - в относительной интенсивности ионов m/z 203 и 204. Разница для пары изомеров составляет 10-40%. В принципе такого различия в масс-спектрах должно быть достаточно для уверенного отнесения масс-спектра к какой-либо конкретной форме. Но при переходе к смеси изомеров появляется проблема их разделения. При хромаггографировашш оба диастереомера (для каждой из трёх пар) выходят широкими пиками с практически

одинаковыми временами выхода. Масс-спектры накладываются друг на друга и регистрируются как один усреднённый. Использовать другие колонки не представляется возможным из-за слишком высокой температуры кипения соединений. Иными словами, при обычном хроматомасс-спектрометрическом анализе установить вклад изомеров в смеси не представляется возможным.

Для решения данной проблемы нами было предложено производить сканирование не полного масс-спектра, а только узкого диапазона масс, в который попадают интересующие ионы m/z 203 и 204. Вместо традиционного сканирования магнитного поля было решено использовать сканирование электрического поля. Данный способ позволяет более чем на порядок повысить чувствительность по интересующей нас паре ионов, а также понизить время записи спектра. Влияние посторонних компонентов практически исключено, поскольку даже если они образуют малоинтенсивные ионы, попадающие в выбранный диапазон, их наличие не помешает интерпретации, к тому же слишком мала вероятность того, что они попадут в этот же хроматографический пик.

Таким образом, поменяв режим регистрации спектра, хроматограмма существенно измененилась. Во-первых, практически полностью исчез уровень фона, во-вторых, пропали пики посторонних компонентов. Ну, а самый важный результат - на единственном оставшемся уширенном пике стало наблюдаться некоторое разделение. Программе обработке данных не составило труда вычислить вклад каждого диастереомера для каждой из трёх пар соединений.

Для оценки границ применимости предложенного способа анализа был проделан следующий опыт. Приготовлены три раствора с содержанием соединений 5 и б в соотношении 1:10, 1:1 и 10:1. Объём раствора подбирался таким образом, чтобы масса вещества составляла порядка 10"8 г. Во всех трёх случаях программе обработки данных удалось разделить пары полученных хроматографических пиков и вычислить вклад каждого из них. Для смеси 1:1 полученный результат очень близок к теоретическому. При малых концентрациях наблюдается отклонение в сторону уменьшения количества минорного компонента. При концентрации компонента 5 10% погрешность составляет 3%. Таким образом, метод не претендует на высокую точность, но в большинстве случаев точное значение не так важно. Главное его преимущество - возможность работать с низкими концентрациями, а также в присутствии большого числа посторонних соединений.

2. Определение дпастереомерного состава аддуктов реакции Дильса-Алъдера, образованных при взаимодействии К-метилцитизина, (-)-леонтидина и (-)-термопсина с ]У-фенилмалеимидо!и

Каждый из трех аддуктов существует в форме пары диастереомеров 7-8, 9-10 и 1112. В нашем распоряжении были как чистые соединения, так и реакционные смеси.

Масс-спектры данных соединений получены впервые. Они характеризуются довольно интенсивными пиками молекулярных ионов, а также двумя пиками ионов, образованными по ретрореакции Дильса-Альдера. Диастереомеры заметно отличаются между собой: вклад молекулярных ионов в полный ионный ток для соединений 7, 9, 11 значительно больше, чем у соответствующих изомеров 8, 10,12.

Вследствие высокой температуры кипения использование

газохроматографического разделения не представлялось возможным. Если при хроматографическом анализе удалось добиться хотя бы небольшого разделения по времени, то в случае прямого ввода надеяться на это не стоило. При использовании прямого ввода единственным критерием вклада содержания компонентов может стать отношение интенсивностей характеристических ионов. Чем точнее удастся его измерить, тем точнее можно провести количественный анализ.

В качестве характеристических ионов можно выбрать любую пару. Главное, чтобы в диастереомерах различие по ним было максимальным. Второе важное условие -необходимо, чтобы они находились вблизи друг друга, поскольку при сканировании электрического поля в большом диапазоне масс, чувствительность к более тяжелым фрагментам заметно снижается. Выбор пал на ионы m/z 173 для всех соединений и ионов m/z 204, 230 и 244 для 7-8, 9-10 и 11-12 соответственно. Несмотря на то, что максимальное различие в спектрах проявляется в интснсивностях пиков молекулярных ионов, использовать их при данном способе анализа нецелесообразно, поскольку они находятся на большом удалении от других интенсивных ионов.

8

10

12

Для того чтобы как можно более точно измерить интенсивности интересующих ионов, сканирование проводилось в режиме регистрации выбранных ионов (SIM). Данный способ анализа обладает максимальной чувствительностью, доступной на магнитно-секторном приборе, так как сканируется не весь диапазон масс, а лишь несколько выбранных ионов. При каждом цикле сканирования прибор автоматически подстраивает параметры сканирования, сверяясь с парой реперных ионов стандарта (перфторкеросина). Благодаря высокому разрешению посторонние примеси практически не влияют на точность измерения. Данный метод прекрасно зарекомендовал себя в количественном анализе.

Искажения, вызванные изменяющимся ускоряющим напряжением, безусловно, присутствовали. Но поскольку эталонные спектры для индивидуальных диастереомеров регистрировались в тех же условиях, что и для смесей, ошибка в измерениях интенсивностей ионов особого значения не имела.

Вводимое в источник ионов количество вещества подбиралось таким образом, чтобы интенсивность регистрируемых ионов попадала в динамический диапазон масс-спектрометра. Экспериментально было выбрано значение порядка 10~8 - 10"6 г.

Для оценки случайной погрешности был выполнен следующий эксперимент. В режиме сканирования выбранных ионов зарегистрированы масс-спектры соединений 7 и 8 (в их спектрах различие по интенсивностям ионов максимальное). Количество второго на порядок превосходило количество первого (10"7 и 10~8 г). Из каждого опыта были выбраны по 30 сканирований, равномерно перекрывающих область выхода вещества. В расчёт не брались величины ионного тока, полученные на пороге чувствительности или «зашкалившие» значения. Также отбрасывались сканирования, явно выбивающиеся из общей зависимости. Величины отношения интенсивности иона m/z 204 к иону m/z 173 (%) представлены на графике (ex. 1).

• соед. 7 ■ соед. 8

Схема 1. Усреднённые результаты отношения I204/I173 в 30-ти сканированиях для диастереомеров 7 и 8.

Видно, что точки хорошо ложатся на прямые, параллельные оси х. Рассчитанная по методу Стьюдента ошибка в измерении концентрации составила порядка 5%. Конечно, это число не учитывает другие факторы, которые могут повлиять на измерение, такие как фракционирование смеси (неодновременное испарение изомеров) и матричные эффекты (влияние посторонних компонентов).

Для определения нижнего предела чувствительности были приготовлены три смеси с концентрацией каждого диастереомера 10"3, 10"4 и 10"5 г/л. Для анализа отбирали по 1 мкл из каждого образца. То есть, в источник ионов вводили 2-10"', 2-Ю"10 и 2-10"11 г смеси диастереомеров с соотношением 1:1. Рассчитанное значение относительной интенсивности ЬмЛш в0 всех случаях должно составлять 12,25. Полученные значения вместе с доверительным интервалом представлены на графике (сх. 2).

14 12 10

Ä

5 6

2 0

Схема 2. Точность анализа и доверительный интервал в зависимости от концентрации. Рассчитанное значение I204/I203 составляет 12.25.

Видно, что для первой смеси рассчитанное значение хорошо совпадает с экспериментальным, доверительный интервал вполне приемлемый. При дальнейшем снижении концентрации не только увеличивается разброс значений между различными сканированиями (что ухудшает доверительный интервал), но и проявляется ошибка, связанная с низким уровнем сигнала менее интенсивного иона m/z 204, приводящая к занижению измеренного значения. Предел обнаружения находится в области гораздо более низких концентраций, но при этом нельзя с уверенностью судить о вкладе стереоизомеров. Высокие концентрации также приводят к ошибке, связанной с «зашкаливанием» ионного тока максимального иона m/z 173, что приводит к завышению результата Но эта проблема решается разбавлением раствора.

1.00Е-09

1.00Е-10 Введённая масса, г

1.00Е-11

Таким образом, использование сканирования выбранных ионов с введением пробы через прямой ввод может найти практическое применение, когда необходимо определить состав смеси стереоизомеров, при условии, что они имеют хотя бы небольшое, но выраженное различие в масс-спектрах. Проведение анализа в режиме высокого разрешения зачастую лишает необходимости предварительной очистки вещества. Более того, возможно анализировать даже такие сложные смеси, как растительные экстракты, содержащие целевой компонент в минорных количествах. Использование же методов ВЭЖХ/МС также не обязательно даст положительный результат, поскольку метод ионизации электроспрей относится к мягким, и не вызывает глубокую фрагментацию; применение тандемных методов доступно отнюдь не на всех приборах.

Самое ценное, что метод не ограничивается анализом пары диастереомеров. Кроме них возможно анализировать другие структурные изомеры со схожими на качественном, но различными на количественном уровнях спектрами.

К недостаткам следует отнести необходимость правильно выбрать концентрацию, чтобы избежать выхода за рамки динамического диапазона детектора. Необходимо располагать хотя бы небольшим количеством очищенных изомеров, чтобы выбрать из их обычных масс-спектров нужные ионы и зарегистрировать спектры в режиме SIM. Необходимо также быть уверенным, что выбранные ионы не образуются другими соединениями, содержащимися в смеси. Ещё один минус — анализ целевой, с его помощью нельзя ничего узнать о других, в том числе и об основных компонентах смеси.

3. Определение принадлежности к циклопропановой или открытой форме продуктов каталитического взаимодействия метилового эфира диазоуксусной кислоты с ненасыщенными соединениями

В лаборатории мегаллоорганического синтеза и катализа ИОХ УНЦ РАН проводилось изучение каталитического взаимодействия ненасыщенных соединений с метилдиазоацетагом. Нашей целью было масс-спектромегрическое исследование полученных реакционных смесей.

-О.

Вт-

CI-

13

14

15

-О.

16

17

18

В каталитической реакции из соединений 13-18 образуются не только производные метилового эфира циклопропанкарбоновой кислоты (19-24), но и изомерные им продукты с двойной связью (25-30), а также более высокомолекулярные соединения, образованные при вторичной реакции (сх. 3).

СООСНз

Схема 3. Два основных направления протекания реакции взаимодействия ненасыщенных соединений с метилдиазоацетатом.

Количество продуктов и их выходы сильно различаются в зависимости от природы олефина, катализатора и условий реакции. Кроме того, каждое из соединений 19-24 может существовать в форме цис- и транс- изомеров (19-24)а и (19-24)6. Таким образом, на хроматограмме может наблюдаться немалое число пиков.

Выполнить их идентификацию - сложная задача, поскольку среди них наблюдается набор соединений с одинаковым составом и очень близкими масс-спектрами (что характерно для большинства изомеров, в частности циклопропанов). Вероятность ошибочной идентификации недопустимо высока. Использование других физико-химических методов, в частности ЯМР, связано со сложностью разделения смеси и наработкой нужного количества индивидуальных компонентов.

Масс-спектры, полученные при стандартном способе проведения анализа не содержат достаточной информации, позволяющей различить изомеры (19-24) и (25-30). Необходимо было найти способ, позволяющий с уверенностью определить наличие структурного фрагмента того или иного типа. Для этой цепи наиболее удобно использовать метод тандемной масс-спектрометрии (диссоциация индуцированная столкновениями В/Е=сопй). Он позволяет зарегистрировать масс-спектрометрическую характеристику не всего соединения, а любого выбранного нами иона. Полученный таким образом масс-спектр называют спектром дочерних ионов. Он показывает, какие ионы образовались из данного выбранного иона. Для иона каждой структуры характерен свой уникальный масс-спекп дочерних ионов. Различия в спектрах дочерних ионов будут свидетельствовать о различии в структурах родительских ионов. Таким образом, для того чтобы установить принадлежность соединения к какому-либо классу, необходимо

получить масс-спектры дочерних ионов известных соединений, содержащих данный характеристический фрагмент.

Характеристический фрагмент должен отвечать следующим требованиям: присутствовать во всех соединениях, характеризоваться большой интенсивностью, иметь простой и понятный механизм образования, он должен подвергаться дальнейшему распаду (для того чтобы его спектр состоял не из единственного иона), а также быть общим для стереоизомеров. Всем этим требованиям удовлетворяет ион m/z 113, имеющий брутто-состав СбНдОг+ (подтверждено данными масс-спектрометрии высокого разрешения). В первом приближении его образование можно рассматривать как простую реакцию отщепления радикала (схема 4).

т

-R

СООСНз

Н2С

-СООСНз

m/z 113

19-24

сооснз СООСНз

25-30 m/z 113

Схема 4. Условные структуры и механизм образования ионов 113 из циклической и открытой форм.

В действительности механизм реакций может быть сложнее, да и структуры ионов m/z 113 иные, чем на схеме, но в рассматриваем случае это не играет решающей роли. Важно то, что данные ионы характеризуется различными спектрами дочерних ионов, которые позволяет отличить циклическую форму от алифатической.

Для получения спектров CID структур с известным строением наилучшим образом подошла реакционная смесь, полученная из бромистого аллила (13). Она состоит из исходного соединения, двух пар геометрических изомеров 19 и 25 и небольшого количества примесей.

На хроматограмме, полученной в режиме связанных сканирований B/E=const для иона m/z 113, наблюдалось четыре пика. В каждой паре геометрических изомеров спектры с точностью повторялись, но несколько отличались между парами.

На рисунке 1 изображены полученные спектры В/К=сопя1. На первый взгляд, различия могут показаться случайными. Тем не менее, они повторялись при повторном проведении опыта, и самое главное - в других реакционных смесях 14-17. Таким образом, необходимый признак, позволяющий различить циклопропановые структуры и их алифатические изомеры, был найден.

doki_p<Hjma_daiJl13 111003132034 *341-367 RT: 5.77-6.21 AV: 27 NL: 1.78Е5 Т: +р El Fdlmfi21lil0@dd4791 00[44 50-11550)

51 ^ 53 55 ^ 57 59 ^ Н ^ g 73 ^ ге

Н2С'

СООСНз

dotö_pd-bma_dau113_111003132034 #404-417 RT: 6.63-7.05 AV: 14 NL: 1.76Є6 Т: + р El Full Пб2 113.10@cid4791.00 [44 50-115.50]

3 50 J 40;

51 53 55 57 58

Н2С

«3Ä в7

СООСНз

Рисунок 1. Масс-спектры B/E=const для ионов m/z ИЗ открытой и циклической форм.

В реакционной смеси соединения 18 среди продуктов присутствуют только циклопропановые структуры. Поскольку в исходном ненасыщенном углеводороде атом углерода при двойной связи замещен метильной группой, вместо иона m/z 113 необходимо рассматривать гомологичный ион m/z 127. Безусловно, спектр его дочерних ионов будет другим, но общие черты фрагментации оказались весьма схожие (рис. 2).

h«iKN«_Bejl_dau127 60 RT: 10 40-10.42 AV: 2 ML 6.08E6

T: ♦ p El PuB гтж2127.00веИ47вЗ 00 (44.50-129.S0|

1СХЬ

80:

?

л т-

Ц

7 =0-

1 ло1

£

Ith

73 75 77 79 в1

ИЗ 117

95 100 103 110 115 130 ШД

Рисунок 2. Масс-спектр B/E=const для иона m/z 127 циклической формы.

Основные ионы в данном спектре либо гомологичны (m/z 95, 99) , либо такие же, как в спектре иона m/z 113 (m/z 85).

Данный подход может использоваться при анализе смесей, образованных в сходных реакциях. Для этого потребуется предварительно создать библиотеку спектров дочерних ионов возможных структурных фрагментов, что в дальнейшем значительно упростит процесс отнесения спектра к определённому соединению.

4. Стереоизомерное отнесение производных метилового эфира циклопропялкарболовой кислоты

Вторая, более сложная задача, которая ставилась перед нами - предложить метод определения пространственного расположения заместителей в циклических структурах, пригодный для анализа реакционных смесей.

Соединения 19-24 могут существовать в форме цис- (а) и транс- (б) изомеров. Масс-спектры изомеров либо довольно близки друг к другу (19-22), либо различия имеют малопонятный, несистемный характер (23-24).

Как уже упоминалось ранее, основная причина таких отличий - высокая избыточная энергия молекулярных ионов, образовавшихся при ионизации электронами с энергией 70 эВ. Несмотря на то, что ион приобретает сверх потенциала

ионизации относительно небольшое но сравнению с 70 эВ количество энергии, этого различия оказывается достаточно для протекания энергетически маловыгодных процессов, такие как перегруппировки в МИ и вторичная фрагментация. Совокупность этих процессов приводит к появлению большого количества ионов, интенсивности которых будут зависеть от многих факторов, и не могут быть однозначно интерпретированы. Само собой, в большинстве случаев, такие явления как стереоизомерные эффекты остаются скрытыми. Даже если они проявятся в виде различия интенсивностей каких-либо ионов, то далеко не всегда удаётся найти какие-либо закономерности, как это было в случае хинолизидиновых производных 7-12.

Для того чтобы избавиться от влияния побочных процессов энергия ионизирующих электронов была снижена со стандартной величины 70 эВ до величины, несколько превышающей потенциал ионизации исследованных соединений.

Влияние ионизирующего напряжения на масс-спектр было изучено на примере соединений 20(а, 6). При величине 20 эВ наблюдалось только исчезновение малоинтенсивных ионов, очевидно, образованных в невыгодных процессах. При дальнейшем понижении энергии ионизации масс-спекгр начинал меняться, снижалась интенсивность некоторых ионов. Одновременно с этим резко падала чувствительность прибора, поэтому, при величинах ниже 12 эВ, спектры уже не могли быть уверенно зарегистрированы даже при соответствующей подстройке параметров прибора. Относительная интенсивность молекулярного иона напротив возрастала. Из-за большого разброса энергий электронов нельзя добиться таких условий, чтобы в масс-спектре остался только молекулярный ион и несколько самых выгодных фрагментных. Однако, сравнивая масс-спектры при разных значениях энергии ионизации, можно выявить тенденцию к повышению или понижению относительной интенсивности ионов. Для соединения 20 с понижением энергии ионизации возрастает только относительная интенсивность МИ и иона m/z 113.

Наиболее удобным оказалось значение 12 эВ, так как при нём основные тенденции к изменению масс-спектров уже проявляются, но чувствительности прибора ещё вполне достаточно. Спектры всех остальных соединений 20-24 были зарегистрированы при данной величине. Как показали квантово-химические расчёты, потенциалы ионизации для всех соединений находились в пределах 6-8 эВ.

При 12 эВ масс-спектры стереоизомеров начинают заметно различаться по интенсивности пика иона m/z 113. Поскольку при низком значении ионизирующей энергии имеют место только наиболее выгодные процессы фрагментации, логично утверждать, что интенсивность нона m/z 113 будет больше в спектре того изомера, для

которого процесс отщепления заместителей более выгодный. Поскольку реакции отщепления в случае обоих изомеров приводит к одним и тем же ионам и нейтральным фрагментам, наиболее выгодным этот процесс будет для изомера, обладающего наибольшей энтальпией образования (сх. 5).

Схема 5. Термодинамическое объяснение стереоизомерного эффекта в масс-спектрометрии

Это хорошо известный факт в масс-спектрометрии. Он нашёл своё подтверждение на многих соединениях даже при 70 эВ. Понизив напряжение ионизации, мы только лишь избавляемся от посторонних конкурирующих процессов, тем самым, делая вывод более надёжным.

Для того чтобы это правило работало, необходимо выполнения нескольких условий. Самое главное из них — оба изомера при распаде должны образовывать одинаковые продукты. Идентичность спектров B/E=const для иона m/z 113 даёт положительный ответ на этот вопрос. Второй важный момент. Масс-спектрометрический распад с точки зрения кинетики — сложная система параллельных и последовательных реакций. Мы же из этих реакций рассматриваем только одну. Само собой, конкурирующие процессы не могут не оказать на неё влияния. Несмотря на то, что пара стереоизомеров имеет общие пути фрагментации, большая часть которых не затрагивает центр, отвечающий за стереоизомерные различия, пренебрегать этими процессами не всегда корректно, а как-либо учесть не представляется возможным. Единственный выход — рассматривать только те соединения, в чьих спектрах ионы, образованные в посторонних процессах, мало интенсивны. Мы же пошли по другому пути - понизили интенсивность протекания посторонних процессов путём понижения энергии ионизирующих электронов.

В соответствии с вышеизложенным, отнесение хроматографического пика к цис- или транс- изомеру можно выполнить на основании одной лишь интенсивности иона m/z 113 в его низковольтном спектре. Тот спектр, в котором ион будет более

+ R

Q, >Q2

/013), >/013):

'2

интенсивен, должен соответствовать энергетически менее выгодной структуре. Для того чтобы определить, какая структура наиболее выгодна, мы применили квантово-химические расчёты.

Расчёты включали в себя поиск наиболее выгодного конформера для каждого из изомеров. Они проводились в три этапа с последовательным увеличением уровня расчётного метода. На каждом этапе проверялось принадлежность найденной конфигурации к локальному минимуму или седловой точке; отбрасывались заведомо невыгодные структуры. В целях экономии компьютерного времени на последнем этапе (самый точный метод) расчёт матрицы Гесса проводился только для самых выгодных структур; оставшиеся структуры не рассматривались. Для каждого изомера изначально подбиралось 4-6 гипотетических конформеров. Для соединений 23, 24 их количество возросло до 11. Чтобы избежать перебора большого количества конформеров, некоторые параметры, такие как, например, ориентация карбоксиметильной группы относительно циклопропанового кольца, определялись единожды и использовались в последующих расчётах.

Результаты расчёта величин разницы полных энергий транс-изомера и цис-изомера приведены в таблице 3.3. В первом случае расчёт проводился по методу МР2/6-311 С((1,р), во втором по методу ВЗЬУР/6-31Ю(с1,р). Конформационный анализ при использовании любого метода выявлял одну и ту же наиболее выгодную структуру, но для большинства молекул конформационное состояние цис- и трансизомеров оказывалось различным. Эта одна из причин больших различий по энергиям для некоторых структур, например, 21 и 22. Несмотря на то что на количественном уровне результаты расчётов с использованием разных методов сильно разнятся, ответ на главный вопрос остаётся одинаковым: во всех случаях цис- изомер менее выгоден, чем транс-изомер. Какой метод заслуживает большего доверия - вопрос открытый, поскольку сравнение с экспериментальными данными не проводилась. Наиболее правдоподобными выглядят результаты, полученные по методу ВЗЬУР/6-31Ю(<1,р).

соед. ЕСП-ЕГС). кДж/моль

МР2/6-311 С(с1,р) ВЗЬУР/6-31Ш((1,р)

19 0.5 3.1

20 0.5 2.8

21 3.4 6.1

22 11.8 10.9

23 2.2 5.5

24 - 2.1

методами МР2/6-31 Ш(с1,р) и В31ЛФ/6-31 Ю(<1,р).

Таблица 1 составлена по результатам расчётов только самых выгодных конформеров. Положительные значение величин разности энергий свидетельствуют о том, что транс-изомеры во всех случаях более выгодны. Ожидалось, что в случаях 23 и 24 из-за наличия внутримолекулярной водородной связи в цис-изомере и её отсутствии в транс-изомере картина может поменяться на противоположную, но этого не произошло. Несмотря на отсутствие значительных различий по энергии, структуры изомеров 23 и 24 различаются между собой гораздо больше, чем остальные пары изомеров. Такое различие в структурах не может не сказаться на предпочтительных направлениях фрагментации. При энергии электронов 70 эВ в спектрах наблюдается большое количество ионов, значительная часть которых обусловлена фрагментацией с участием диоксолановых циклов. Каждый из каналов фрагментации зависит не только от стереохимии, но и от протекания других конкурирующих процессов, которые, возможно, также зависят от стереохимии. То есть мы имеем очень сложную кинетическую систему. Однако при снижении энергии ионизирующего напряжения вклад конкурирующих процессов заметно убывает, но всё равно остаётся довольно высоким; это заметно снижает надёжность изомерного отнесения. И чем сложнее структура, тем менее достоверно её отнесение к определённому изомеру предложенным нами методом.

Для более простых соединений (19-22), напротив, количество конкурирующих процессов в низковольтной фрагментации заметно меньше, а разница по энергиям между цис- и транс- изомерами более значительная, так что их идентификация не вызывает больших сомнений.

Итак, к менее энергетически выгодному геометрическому изомеру следует отнести соединение, в масс-спектре которого вклад фрагментного иона m/z 113 больше, чем в масс-спектре его антипода. Естественно, берётся в расчёт интенсивность пика, выраженная по отношению к интенсивности какого-либо другого пика. В большинстве работ - к пику молекулярного иона. Однако наши соединения интенсивных молекулярных ионов не образуют. В низковольтных спектрах, они практически не регистрируются, вместо них наблюдаются ионы [М-Н]+ и [М+Н]+. Поэтому учитывая большое сходство спектров изомеров, величина характеристического иона m/z 113 была отнесена к полному ионному току (сумма интенсивностей всех ионов в спектре). Результаты измерений представлены в таблице 2. Полученная характеристика и послужила отправной точкой для стереоизомерных отнесений.

соед. Вклад иона m/z 113 в ПИТ, %

Дис-изомер 7ранс-изомер

19 41 30

20 52 34

21 14,8 11,7

22 28 15

23 13,1 10,7

24 20,3 17,5

Таблица 2. Вклады в полный ионный ток иона m/z 113 для цис- и транс- изомеров.

Из таблицы видно, что, как и ожидалось, отнесённая к полному ионному току интенсивность иона m/z 113 для цис- изомера всегда выше, чем для транс-изомера. Несмотря на полученное сходство экспериментальных данных с теоретическими предположениями, было решено более детально изучить механизм реакции элиминирования. Дело в том, что этот процесс может оказаться сложнее, чем одноактный простой разрыв связи. В таком случае, вывод о скорости протекания реакции, сделанный на основе термодинамических характеристик молекулярного иона и его фрагментов окажется некорректным.

5. Изучение механизма распада производных метилового эфира циклопропанкарбоновой кислоты

Квантово-химические расчёты проведены для наиболее простых соединений 20(а, б). Если для 206 (транс-изомер) структура молекулярного иона принципиально не отличалась от структуры исходной молекулы, то для 20а (^коичомер) картина была уже иная. При ионизации последнего наблюдается выгодный процесс переноса атома водорода от метиленовой группы к карбонильной с образованием дистонического иона. Для транс-изомера данный процесс невозможен. Однако при элиминировании радикала хлора снова наблюдается обратный перенос прогона (вывод подтверждён расчётным методом релаксационного сканирования). В итоге, структура фрагментного иона m/z 113 остаётся такой же для цис- и транс- формы, но механизмы его образования существенно различаются (сх. 6).

/\ /ч

а—сн ^с—осн, с|-с. ^с—

1; ""«их*

С-ОСК-,

//

Схема 6. Различные механизмы отщепления радикала хлора для цис- и транс- изомера соединения 20.

Энергетические характеристики частиц изображённых на схеме 6, представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Энергетические характеристики процесса отщепления радикала хлора от молекул 20(а, б). Величины полной энергии указаны в Хартри. Знак # обозначает нерелаксированный молекулярный ион.

Первый акт ионизации - образование нерелаксированного молекулярного иона — частицы с геометрическими характеристиками, идентичными исходной молекуле, но лишённой одного электрона (на диаграмме отмечен знаком #). Такая частица является неустойчивой. Она стремится либо перейти в равновесное состояние, либо диссоциировать. Время перехода в равновесное состояние имеет порядок времени колебания связи 10~13 с. Это очень быстрый процесс, он не может заметно влиять на результирующую скорость распада. После перехода в равновесное состояние следует этап диссоциации. Поскольку, как было показано выше, в цис- изомере наблюдается водородный перенос, полученная структура оказывается более выгодной. Следовательно, eö распад - менее выгодный процесс, чем для транс-формы. Из этого утверждения следует, что для цис- изомера процесс элиминирования радикала хлора менее выгодный; интенсивность иона m/z 113 должна быть ниже.

Полученное несоответствие с экспериментальными данными можно объяснить тем, что по каким-либо причинам данная схема не реализуется. Либо за счёт избыточной энергии диссоциация происходит до наступления релаксации, либо структура с переносом протона в реальности не образуется. Заметим, что для её образования требуется время, сравнимое с временем для диссоциации. Нельзя исключать также влияние конкурирующих процессов распада, которые данная схема никак не рассматривает. Тем не менее, из расчётов всё же можно заключить, что диссоциация сгереоизомеров может протекать по совершенно разным механизмам.

21

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ определения содержания диастереомеров производных N-(2-оксиэтил)-цитизина в их смеси методом ГХ-МС в режиме сканирования электрического поля. Благодаря тому, что при данном методе сканирования за короткое время регистрируется лишь узкий диапазон масс, заметно возросла чувствительность и уменьшилось влияние посторонних примесей, а разделение хроматографических пиков соответствующих диастереомеров при том же хроматографическом режиме стало более выраженным.

2. Дтя определения вкладов диастереомеров адцуктов реакции Дильса-Альдера, образованных по реакции N-метилцитизина, (-)-леонтидина и (-)-термопсина с N-фенилмалеимидом, использован метод сканирования выбранных ионов (SIM) с прямым введением пробы в источник ионов. Содержание диастереомеров определялось по величине отношения интенсивностей характеристических ионов, измеренной с большой точностью благодаря выбранному методу сканирования.

3. При аналнзе продуктов взаимодействия ненасыщенных соединений с метилдиазоацетатом показана эффективность техники тандемной масс-спектрометрии. Поскольку полученные при этом спектры дочерних ионов для производных циклопропанкарбоновой кислоты и их изомеров с линейной цепью отличались друг от друга, идентификация соответствующих соединений заметно упростилась.

4. С помощью техники низковольтной масс-спектрометрии, а также кваотово-химических расчётов выполнено отнесение масс-спектров производных метилового эфира циклопропанкарбоновой кислоты к формам цис- или трансизомеров. Если прн традиционном проведении эксперимента масс-спекгры изомеров не имели выражеш1ых различий, то с применением низковольтной тсхннки эти отличия приобрели закономерный характер, связанный с различиями во внутренних энергиях изомерных пар.

5. Показано, что вследствие внутримолекулярных взаимодействий масс-спектрометрический распад диастереомерной пары метилового эфира 2-(хлорметил)циклопропанкарбоновой кислоты протекает по различным механизмам: с прямым разрывом связи для транс- изомера и с образованием перегруппировочного дистоничсского иона для цис- изомера.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Ерастов A.C., Галкин Е.Г. Структурный анализ изомерных компонентов смесей, образованных при реакции циклопропанирования метилдиазоацетатом. // Башкирский химический журнал. - 2012. - Т. 19. - № 1. - С.46-48.

2. Ерастов АС., Галкин Е.Г., Цыпышева И.П., Абдуллин М.Ф. Анализ вкладов диастереомеров производных цитизина методом масс-спектрометрии электронного удара с использованием прямого ввода и сканирования выбранных ионов. // Бутлеровские сообщения. - 2012. -Т.31. — №7. - С.38-42.

3. Пташко Д.О., Ерастов АС., Ханова М.Д., Галкин Е.Г. Особенности масс-спектрометрической фрагментации (циклопропилметил)фенилового эфира и (циклопропилметил)фенилового амина. // Тезисы докладов Всероссийской конференции по органической химии. - Москва. - 2009. - С.179.

4. Пташко Д.О., Ерастов A.C., Ханова М.Д. Перегруппировка (циклопропилметил)-фенилового эфира в присутствии кислот Льюиса. // Тезисы докладов Всероссийской конференции по органической химии. - Москва. - 2009. -С.350.

5. Пташко Д.О., Гайсин Р.Д., Ерастов A.C. Синтез и превращения циклопропансодержащих производных фенола и анилина. // Тезисы докладов Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука - Образование - Инновации». - Урумчи, КНР. -2009.-С.76.

6. Пташко Д.О., Ерастов A.C., Галкин Е.Г. Применение низковольтной масс-спектрометрии для установления конфигурации производных метиловых эфиров циклопропанкарбоновой кислоты. // Материалы VI Всероссийской научной INTERNET-копферещии «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии». - Уфа. - 2011. - С. 25-27.

7. Ерастов A.C., Галкин Е.Г. Определение вкладов диастереомеров хинолизидиновых алкалоидов, модифицированных по реакции Дильса-Альдера методом масс-спектрометрии электронного удара. // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. - Барнаул. — 2012. - С.157.

ЕРАСТОВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТР ИИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ СТЕРЕОХИМИЧЕСКИХ ЗАДАЧ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИТИЗИНА И ЦИКЛОПРОПАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 22.03.2013 г. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-изд.л.1,5. Тираж 110 экз. Заказ №167.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3 ГОУ ВПО «Башгосмедуниверсгает РОСЗДРАВА»

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук

На правах рукописи

04201357558 ЕРАСТОВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТОДЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ СТЕРЕОХИМИЧЕСКИХ ЗАДАЧ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИТИЗИНА И ЦИКЛОПРОПАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

02.00.04 - Физическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук Е. Г. Галкин

___

Уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ..............................................................................................................................................2

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..............................................................................................................7

1.1. Методы масс-спектрометрии в стереохимическом анализе.................................................7

1.1.1. Методы идентификации диастереомеров...........................................................................7

1.1.2. Методы идентификации энантиомеров.............................................................................12

1.1.3. Кинетический метод.............................................................................................................16

1.1.3.1. Хиральное распознование с использованием комплексов переходных металлов... 17

1.1.3.2. Хиральное распознование с использованием краун-эфиров (супрамолекулярная химия в газовой фазе, метод «гость-хозяин»)...................................................................................21

1.1.4. Метод хирального распознавания......................................................................................25

1.1.5. Методы анализа энантиомеров, основанные на хроматографическом разделении.... 27

1.1.6. Стереоизомерный анализ с использованием электронного удара и химической ионизации.............................................................................................................................................29

1.1.7. Тандемная масс-спектрометрия.........................................................................................34

1.1.8. Использование сканирования электрического поля.........................................................37

1.1.9. Низковольтная масс-спектрометрия...................................................................................38

1.2. Применение методов квантовой химии................................................................................42

1.2.1. Метод РРКМ..........................................................................................................................43

1.2.2. Применение методов квантовой химии для установления направления фрагментации и структур фрагментных ионов...........................................................................................................46

1.2.3. Оценка прочности разрывающихся связей или энтальпий образования исходных и полученных ионов................................................................................................................................50

1.3. Масс-спектрометрическая фрагментация изучаемых соединений.....................................53

1.3.1. Производные циклопропана...............................................................................................53

1.3.2. Алкалоиды хинолизидинового ряда...................................................................................56

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................................................59

2.1. Описание масс-спектрометра и методов анализа................................................................59

2.2. Анализ производных 1М-(2-оксиэтил)-цитизина.....................................................................62

2.3. Анализ производных эфиров циклопропанкарбоновой кислоты........................................63

2.4. Ab initio расчёты........................................................................................................................65

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................................................67

3.1. Определение диастереомерного состава алкалоидов хинолизидинового ряда...............67

3.2. Структурный анализ продуктов каталитического взаимодействия непредельных соединений с метилдиазоацетатом...................................................................................................81

3.3. Стереоизомерное отнесение производных метилового эфира циклопропанкарбоновой кислоты..................................................................................................................................................87

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................100

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................................101

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

CID Диссоциация, индуцированная столкновениями

ESI, ESI/MS Электроспрей, метод ионизации

MS-MS, MS2 Масс-спектрометрия вторичных ионов

APCI Химическая ионизация при атмосферном давлении

FT-ICR Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье

FAB Бомбордировка быстрыми атомами

P/iA Ретрореакция Дильса-Альдера

TX/MC, GC/MS Хроматомасс-спектрометрия

XH, CI Химическая ионизация

3Y, EI Электронный удар

MIKES Спектрометрия кинетических энергий ионов, проанализированных по массе

SIM Сканирование выбранных ионов

30 Энтальпия образования

KPT Квазиравновесная теория

PPKM Статистическая теория Райса, Рамспергера, Касселя и Маркуса

MM Молекулярный ион

B3)KX, HPLC Высокоэффективная жидкостная хроматография

m/z Массовое число, отношение массы иона к его заряду

B3Y Вторичный электронный умножитель

3H Энергия ионизации

Проблема идентификации стереоизомеров масс-спектрометрическим методом интересовала исследователей на самых ранних этапах развития метода. В 70-90-х годах вышло большое количество работ, в которых применялся классический метод электронного удара. Дальнейшее распространение новых методов ионизации и разделения ионов способствовало утрате интереса к традиционной масс-спектрометрии. Однако приборы продолжали совершенствоваться. Сопряжение магнитно-секторного масс-спектрометра с капиллярным хроматографом и высокопроизводительным компьютером, разработка новых программных пакетов вывела метод электронного удара на новый уровень. Несмотря на жёсткую конкуренцию, он продолжает быть востребованным. Более того, для ряда объектов исследования является едва ли не единственным возможным.

В настоящей работе предложены два способа количественного анализа вкладов стереоизомеров в смеси с использованием сканирования электрического поля и сканирования выбранных ионов. Исследования проводились на природных и синтезированных алкалоидах хинолизидинового ряда, однако подход может быть использован и с другими классами соединений. Вторая часть работы посвящена стереоизомерной идентификации производных метиловых эфиров циклопропанкарбоновой кислоты.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю кандидату химических наук Галкину Евгению Григорьевичу за выбор темы исследования и постановку задачи, за руководство и внимание, оказанное при выполнении работы.

Выражаю признательность заведующему лабораторией металлоорганического синтеза и катализа Федерального государственного бюджетного Учреждения науки Института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук доктору химических наук, профессору Докичеву В.А. и сотрудникам его лаборатории, аспирантам Пташко Денису и Ивановой Лидии, а также сотруднику лаборатории Биоорганической химии кандидату химических наук Цыпышевой И.П.за предоставленные соединения и соавторство.

Отдельная благодарность доктору химических наук профессору Сергею Леонидовичу Хурсану за бесценные консультации по вопросу проведения квантово-химических расчётов и помощь в интерпретации полученных результатов.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Методы масс-спектрометрии в стереохимическом анализе

До недавнего времени господствовало противоречивое мнение [1], что масс-спектрометрический анализ дает мало информации о

пространственном строении исследуемой молекулы. Считается, что высокие энергии ионизирующих электронов нивелируют различия, вызванные пространственными характеристиками молекулы. Однако это справедливо лишь отчасти.

Тем не менее, начиная с 60-х годов [2] регулярно появляются работы, посвященные использованию масс-спектрометрии для решения стереохимических проблем. С каждым годом, особенно в наши дни, их количество неуклонно возрастает [3]. Если масс-спектры электронного удара стереоизомеров, как правило, практически неразличимы, то использование низкоэнергетических методов ионизации (химическая ионизация, электроспрей и т.д.) в сочетании с тандемной масс-спектрометрией позволяют делать надежные выводы о пространственной структуре молекул. На сегодняшний день встречаются даже работы, посвящённые масс-спектрометрическому изучению конформации белков. [4].

1.1.1. Методы идентификации диастереомеров.

Хорошо известно [5], что энантиомеры практически не отличаются между собой по физическим свойствам. Они плавятся в одной точке, имеют одинаковую растворимость, плотность, показатель преломления, ИК- и УФ-спектры, и даже спектры ЯМР. На заре развития масс-спектрометрии о разделении энантиомеров не могло быть и речи, ведь по масс-спектрам

электронного удара сложно различить даже структурные изомеры, например орто-, мета- и пара- дизамещённые бензолы.

В то же время диастереомеры, как правило, имеют различия по большинству физических и химических свойств, они фактически отличаются друг от друга как структурные изомеры. Основной причиной такого различия в поведении является то, что энантиомеры изометричны. Это означает, что любому расстоянию между двумя заданными атомами (не важно, связанным или нет) в одном изомере соответствует точно такое же расстояние в другом изомере. Подобная изометрия не реализуется в ряду диастереомеров и структурных изомеров.

Различия в длинах связей диастереомеров приводят к различию в энергиях диссоциации, в результате чего возможны различия в масс-спектрах. Наблюдения стереоизомерного эффекта описаны в самых ранних работах. Не угасает интерес к нему и сегодня. Появление сравнительно новых методов ионизации, таких как бомбардировка быстрыми атомами и электроспрей, открыло новые горизонты масс-спектрометрии. Появилась возможность проводить исследования сложных биологических структур, которые ранее не подходили для масс-спектрометрического анализа из-за слишком высокой температуры кипения или термодеструкции.

В работе [6] проведено изучение стереоизомерного эффекта в 11а-ОН-17|3- и 11(3-ОН-17(3- эстрадиолах 1 и 2. Актуальность исследования вызвана тем, что сродство эстрадиолов к эстрогенному рецептору зависит строго от стереохимии ОН-группы в 11-ом положении. СГО-эксперименты показали, что исследуемые стероиды по некоторым направлениям распадаются с различными константами скорости в зависимости от а/(3-конфигурации гидроксила.

Известно, что первая ступень фрагментации - депротонирование по наиболее кислотному центру. Квантовохимическими расчётами обоих диастереомеров определена наиболее выгодная структура депротонированного иона. Их конфигурации оказались различными. Данные расчётов энергий, проведённых методом B3P86/6-31G*, согласуются с экспериментальными значениями кислотности в газовой фазе, полученными методом H/D-обмена на масс-спектрометре с ионной ловушкой. Более выгодный p-изомер (по данным расчётов) характеризуется более интенсивным пиком иона [М-Н]", то есть он менее подвержен фрагментации. Напротив, интенсивность фрагментных ионов [М-Н-СН20]" и [М-Н-С2Н4]" в нём оказывается выше.

В работе японских исследователей [7] для разделения а- и (3- аномерсв 1-0-октадецил-3-0-(Ы-ацетил)нейраменил-зп-глицерола (3 и 4) использован метод ESI/MS-MS. Показано, что ионы [M+Na]+ имеют различные структуры (в первом случае моноциклическую, во втором - бициклическую). Следовательно, каждый из аномеров должен характеризоваться собственными каналами распада. Несмотря на то, что спектры ESI/MS практически не различимы, при переходе к MS в спектрах появляются значительные различия. В а-аномере преобладает ион [M+Na-ROH]+, тогда как для (3-аномера более характерен фрагмент [M+Na-C2iH4303Na2]+.

COONa~| Na+ ^^ ^—o ~|Na+

с3н7о3\ C00Na

AcHN

о3с3н7^Г^о—V-OR —

AcHN Л--

a-anomer (3) OR

[M+Na-ROH]

\QH I .-O^ m/z=336

~|Na+

"I Na+ NaO

/ rvuni^ I

AcHN

COONa_

AcHN-\__~~~ у I HO' j - . q

ОН /Я / +Na-"*' \ tl

O^ о \ ; .--О CieH37

P-anomer (4) VNa" xc н

18 37 т/г=389

R=CH2CH(OH)CH2OC i 8H37

Этой же группой исследователей проведена аналогичная работа по масс-спектрометрической идентификации N-ацетил-лактосамина-6,6' -дисульфата. [8] Вторичные масс-спектры ионов [M+Na]+ также характеризовались различиями, связанными с различиями в структурах аддуктов.

Не менее информативными могут быть и ESI масс-спектры отрицательных ионов. В работах [9, 10] проведено масс-спектрометрическое исследование изомеров алкалоида 7-гидрокситаксана, отличающихся конфигурацией гидроксильного радикала, а также их производных. Единственное существенное различие наблюдалось в масс-спектрах отрицательных ионов, в интенсивности пика (М-Н)\ Для идентификации стереоизомеров пришлось привлекать квантовохимические расчёты. Для каждого изомера были рассчитаны наиболее вероятные структуры депротонированных ионов, по данным расчётам определены наиболее выгодные. К изомеру с самой малой энергией фрагментного иона был отнесён масс-спектр с наибольшей интенсивностью соответствующего пика.

Стоит упомянуть об ещё одном интересном методе идентификации стереоизомеров. Использование прибора с ионной ловушкой (Ion Trap) позволяет проводить эксперименты с самоионизацией. Подобрав необходимую последовательность импульсов, можно добиться того, что образованные в результате электронного удара ионы в течение

определённого время взаимодействуют с нейтральными молекулами, затем происходит регистрация спектра образовавшихся ионов. В отличие от классической химической ионизации в качестве ионов-реагентов выступает целый набор ионов, образованных из этого же соединения.

В работе [11] проведено исследование стереоизомерных арилгликозидов, а также их структурных изомеров, отличающихся положением радикала в ароматическом кольце.

Масс-спектры электронного удара четырёх изомеров О-гликопиранозиларенов 5 практически не имеют различий. Однако при использовании самоионизации интенсивности характеристических ионов отличаются уже заметно. Немалое влияние на полученные спектры оказывает время самоионизации - параметр, который можно выбирать в ходе эксперимента.

Mm/z 362 5' m/z 515

Наибольшее отличие изомеров зафиксировано в спектрах CID для иона-аддукта 5' m/z 515, образованного в условиях самоионизации. Вероятнее всего, пространственные структуры данных диастереомерных частиц сильно различается благодаря внутримолекулярным взаимодействиям между циклами. Методика CID позволяет выбрать любой ион-адцукт. Поскольку при самоионизации образуется большое количество аддуктов различного состава, среди них наверняка найдётся хотя бы один, который позволит уверенно различить изомеры.

В более ранней работе [12] проведено сравнение метода самоионизации с обычной химической ионизацией на примере цис- и транс- (4-гидрокси-4-метил-циклогексил)-бензоатов. В данной молекуле центры, «отвечающие» за стереоизомерные эффекты (1-ый и 4-ый атом углерода циююгексанового кольца) расположены далеко друг от друга, поэтому масс-спектры электронного удара не имеют существенных различий. При использовании химической ионизации аммиаком наблюдаются различия в интенсивностях пиков [МН-СбН5СООН]+. При переходе к самоионизации стереоизомерные различия значительно увеличиваются.

Несмотря на то что во всех из рассмотренных выше работах используются разные принципы, можно отметить их общую особенность. Различия в масс-спектрах диастереомеров вызваны различными механизмами реакции элиминирования или присоединения, и как следствие, образование продуктов с разными структурами. Дальнейший их распад протекает по разным механизмам, что обуславливает видимое различие во вторичных масс-спектрах.

1.1.2. Методы идентификации энантиомеров.

Как было отмечено выше, масс-спектры энантиомеров не зависимо от способа ионизации, как правило, не отличаются друг от друга. Но это отнюдь не означает, что масс-спектрометрия не применима для их анализа. При реакции исследуемых соединений с хиральным реагентом образуется диастереомер, конфигурацию которого определить значительно легче.

Вполне логичным было применить метод хирального дериватизирующего агента, известный в ЯМР как метод Мошера [13]. В роли хирального агента выступает хлорангидрид а-метокси-а-

трифторметилфенилуксусной (МТРА) кислоты в Я-конфигурации, известный как реагент Мошера (6).

о

В работах [14,15] реагент Мошера 6 использован для количественного определения энантиомеров 3,4-метилендиоксиметамфетамина

(наркотическое вещество Экстази) и его метаболитов в моче и в плазме крови. Исследуемые образцы сперва подвергаются экстракции смесью этилацетата и гексана 1:1, затем проводят взаимодействие экстракта с хиральным агентом при 80°С в течении 20 минут. Следующий этап -хроматомасс-спектрометрический анализ. Поскольку в пробе содержится целый набор посторонних соединений, необходимо использовать сканирование выбранных ионов. При правильном выборе хроматографического режима пики двух полученных диастереомеров хорош�