Исследование взаимодействия молекулярных вариантов транскортина с плазматической мембраной синцитиотрофобласта плаценты человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ8 ОЙ

') Л Г ■ 7

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ

На правах рукописи

КИСЕЛЕВА Елена Павловна

• УДК 577.112 t 577.17

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВАРИАНТОВ ТРАНСКОРТИНА С ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕБРАНОИ СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТА ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА

02.оо.ю-Биоорганическая химия, химия Природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск 1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси,

Научный руководитель:

-член-корреспондент АН Беларуси доктор химических наук О.А.Стрельченок Официальные оппоненты:

-доктор химических наук профессор Д..И.Метелица -кандидат биологических наук М.В.Шолух Ведущая организация:

-Институт фотобиологии АН Беларуси

Защита состоится " зо '' сентября 1993 г, в час. на

заседании специализированного совета Д 006.22.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу. 220067, ГСП, ул-Жодинская, 5/2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической Химии АНБ .

Автореферат разослан " 199з г.

Учения секретарь специализированного совета кандидат химических наук Н г И. Литвмнко

Л1шаЛ£Ш£ХЬ_Х£Шл. Стероидные гормоны играют важную роль в регуляции процессов жизнедеятельности и адаптации организма к изменяющимся условиям окру-тающей среды. Широко распространена точка зрения о биологической активности свободных стероидных гормонов, которая реализуется благодаря диффузии последних в клетки-миШени. 8 соответствии с этими представлениями, специфические стероидсвязывающие гликопротеины крови транспортируют стероиды в биологически неактивной Форме и ограничивают. тем сашм поступление гормонов в клетки. Однако в последние годы появились данные, не укладывающиеся в рамки традиционных представлений о физиологической' роли этих гликопротеинов и свидетельствующие о возможности проявления гормональной активности связанными ими стероидами.

Выяснение Физиологической роли транскартина (кортикостсроидсвягшваюиего глобулина, КОТ) представляет особый интерес в связи с обнаружением в крови беременных, жеждон двух молекулярных вариантов этого гликолротеииа, различавшихся по структуре углеводного компонента и сродству к мембранам ряда тканей. Один из них, КСГ нормальной крови доноров (иКСГ)| существует также в крови мужчин и небеременных донедш, а другой, связанная с беременностью разновидность КОГ (сбКСГ). появляется при беременности и некоторых патологических состояниях организма человека.

Изучение взаимодействия молекулярных вариантов КСГ с синцитиотрофобластом . плаценты человека представляет значительный интерес с точки зрения выяснения роли этих гликопротеинов в механизме гормонального действия стероидов. В плазматической мембране этой.ткани обнаружены два типа участков специфического связывания этих гликопротвинов с различным сродством к нКОГ и сбКСГ. СинцитиотроФобЛаст является хорошо охарактеризованной тканью-мишеныо глюкокортикоидсо, около 90% которых в крови беременных женщин связано с молекулярными . вариантами КСГ. Кроме того, синцитиотрофобласт представляет собой составную масть плацентарного .барьера* через Который осуществляется обмен различными веществами, в тоМ числе стероидными гормонами, между кровеносными системами матери и плодп. . '

1|елыо настоящей работы увилось изучение взаимодействия нКСГ и сбКСГ с ммкровезикулами,полученными из плазматической мембраны синцитиотрофобласта, а также исследование влияния молекулярных вариантов КСГ на проникновение через мембрану синцитиотрофобласта связанного с ними кортизола.

Работа выполнена • в рамках научно-технической программы 0.74.Ó5 "Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих ' важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное .хозяйство" и Республиканской программы "Фундаментальные- исследования в БССР для медицины" и представляет собой часть проводимых в лаборатории химии белковых гормонов Института биоорганической химии АН Беларуси исследований строения и биологической функции гликопротеинов крови, специфически связывающих низкомолекулярные гормоны.

Научная новизна. Проведено исследование взаимодействия нКСГ и сбКСГ с мембранными микровезикулами синцитиотрофобласта Плаценты человека В условиях, допускающих протекание процессов траисмембранного Переноса компонентов комплексов "стероид -гликопротеин1'. , Установлена роль связанных с нКСГ и сбКСГ стероидных гормонов в указанном взаимодействии; определены егс кинетические параметры. Изучено влияние вариантов КСГ не взаимодействие связанного с ними кортизола с синцитиотрофобластом и его трансмембранный перенос, . чтс является необходимым условием реализации гормонального эффекте этого стероида в фетоплацентарной системе.

Положения И результаты, поносимые на защиту.'

1. Образование комплексов со стероидными гормонами ка* условие специфического взаимодействия нКСГ и сбКСГ с мембраноГ синцитиотрофобласта; зависимость сродства нКСГ и сбКСГ с мембране от структуры стероида.

2. Кинетические параметры взаимодействия комплексоЕ "вариант КСГ - кортизол" с микт>овезикулами.

3. Проникновение только одного из вариантов КСГ - нКСГ -через мембрану синцитиотрофобласта; существование различию

механизмом взаимодействия комплексов "нКСГ(сбКСГ) - кортизол" с синцитиотрофобластом. '

4. Влияние Вариантов КСГ на проникновение кортизола через мембрану синцитиотрофобласта и их роль в защите кортизола от окисления в кортизон.

медицинской диагностике широко применяются тести, основанные на определении в сыворотке крови человека общей концентрации глкжокортнкоидов и прогестшов и их несвязанных с белками крови фракция. Полученные нами данные ' свидетельствуют в пользу диагностической ценности тестов, основанных на определении концентрации комплексов КСГ с указанными гормонами. Данные о концентрации связанных с нКСГ и сбКСГ ■ стероидных гормонов, содержащихся п крови беременных женщин» могут быть использованы для контроля за протеканием-беременности и развитием плода.

Дпробания работы. Материалы, диссертации докладывались на Республиканской конференции молодых, ученых АН БССР и БГУ "Биохимия и биофизика клеточных процессов" (Минск, 1990), на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов я гормонов на эффекторные-клетки" (Суздаль, 1989) и на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рёцепторнах систем" (Таллинн, 1990).

• Публикации. По теме диссертации опубликовано з статьи и з тезиса докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит "из введения, трех тл^н и выводов. Включает 21 рисунок, 13 таблиц. Список цитируемой литературы содержит.2П7 ссылок.

БЗАИМОДЕЙСТВИЕ ШЛЕКУЛЯРШХ ВАРИАНТОВ КСГ С ИМКРОВЕЗИКУЛАМИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ СШЩИТИОТРОФОБЛАСТА ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА

1.1. Характеристика препарата микровезикул сшщитиотрофобласта

Синцитиотрофобласт плаценты человека представляет собой поляризованный эпителий. локализованный между кровотоками беременной ¡сенщины и плода. Этот слой клеток является важнейшей составной частью плацентарного барьера, При участии которого осуществляется поступление различных веществ, в том числе гормонов, от матери к плоду. Взаимодействие связанных с гормонами, молекулярных вариантов КСГ с синцитиотрофобластом представляет собой геюгостадийннй процесс, изучение которого предполагает.анализ кинетики процессов мембранного связывания и трансмеибранного переноса. Удобной моделью Для такого исследования являются микровезикулы, образованные из фрагментов плазматической мембраны синццтиотрофоблаета.

Частицы оинцитиотрофобласта

1. перемешивание в о,5 л о,эх ыаС1

2. фильтрование

3. центрифугирование. 6 00g, 1о мин

ядра, остаткй клеток

нитохондриальная Фракция

супернатант

центрифугирование, 260008, 15 МИН

супернатант

центрифугирование, юооооа, во мин

фракция микровеэикул цитозоль

плазматических 'мембран Рис.1. Схема Получения фракции микровезикул плазматических мембран.

Полученные с помощью стандартно« методики (рис.1) шкровезикулы являются замкнутыми и обращены внешней стороной ¡apy.r.y. В отличие от целых клеток, везикулы не содержат (итоплазматических Ферментов и связывающих белков, способных (сказнть результаты кинетического анализа. В то же время они 1меют все основные характеристики плазматической мембраны синцитиотрофобласта, в частности, высокую активность маркерного ¡юрмента 5•-нуклеотидазы (( 4,56+0,20 )• мкМ Р;1 /иг,и- пг

Зелка). Ото делает их пригодными для исследования ряда функций плаценты, в частности, процессов взаимодействия с гормонами и грансмембранного переноса.

1.2. Селективность связывания молекулярных вариантов КСГ с микровезикулами

В литературе высказывалось мнение, что биологический смысл специфического взаимодействия стероидсвязывающих белков крови- о. мембранами клеток состоит в доставке связанных с ними стероидов з ткани-мишени стероидных гормонов. Если это так, то можно предположить, что мембранные участки связывания молекулярных вариантов КСГ должны проявлять селективность в отношении их комплексов с определенными стероидами, и Связывание этих белков микровезикулами будет зависеть от насыщенности их стероидом, то зсть от концентрации последнего.

В работе использовали методический подход,^ заключавшийся в анализе связывания в квазиравновесных условиях. Исследование проводили при температуре 40, что позволило изучить начальный этап взаимодействия молекулярных вариантов КСГ с ■■мкровезикулами - процесс мембранного связывания. Для исследования стероидной зависимости специфического связывания нКСГ (сбКСГ) с мембраной синцитиотрофобласта были изучены взаимоотношения между количеством связанных мембраной нКСГ (сбКСГ) при возрастающих концентрациях в среде кортизола, кортикостерона, прогестерона и тестостерона и долей нКСГ IсбКСГ), находящихся в комплексе с кавдкм из этих стероидов (типичные примеры результатов аналогичных экспериментов представлены на рис.2). Связывание нКСГ и сбКСГ мембраной

I

a Й

8

LO C\J

I—I

8 «

ai cn U! (4 О

В 1,0

I 0,8

ч

CD

. 0,6

к

° 0,4

1 0,2 t-t о Гч fci

Ш.

Й1

^ fh

10 8 ■ 6 4 2

5-1СГ11 5-I0-10 5'IO-9 5-ПГ8 5•IQ~' IIC

Кортизол, M

w fcj Pi

' M1 l-O C\! i-i !

a; t

crt a

m i

bi с

П f

о E

I?5

jjmc . 2. Зависимость связывания меченых изотопом [ ' I ] нКСГ

(столбики без штриховки) и сбКСГ (заштрихованные столбики) микровезикула!in от концентрации кортизола при 4° (средние значения и стандартные отклонения по результатам пяти независимых определений). Концентрации [ ^'Ч)-меченых нКСГ и сбКСГ - 1- 10-М и 5. 1 соответственно. НС -

неспецифическое связывание.

й

ы ю

C\J

м

CD

m v m ■ о

3

| о,з

cu

. 0,6

«

Eh

° 0,4

S3 0,2 н

о p(

в

n

T IIC 0

P Б T IIC

Рис.а.Связывание гормональных комплексов [

125,

]-печеных нКСГ (А) о

И) и сбКСГ (Б) (В'Ю--11 М) микровезнкулами при 4

(средние значения и стандартные отклонения по результатам

пяти независимых определений). Концентрации кортизола (К),

прогестерона (Р), кортикостерона (В) и тестостерона (Т) --7

й- 10 М (каждый). НС - неспецифическое связывание. 0 - связывание в отсутствие стероида.

I

I

I

I

синцнтиотро'Яобласта в присутствии корткзола наблюдали при

-II -10

концентрациях гликопротеинов ю - ю И, значительно более

низких, чем зчачения равновесных констант диссоциации их

-Ч

комплексов с кортизолом (Кд^Ю М при 4 ). При таких концентрациях нКСГ и сбКСГ доля комплекса "гликопротеин -кортизол" определяется концентрацией стероида.

Как видно на рис.2, доля гликопротеина, связанного мембраной, возрастает при увеличении концентрации гормона вблизи значения К комплекса нКСГ (сбКСГ) - кортизол. то есть б условиях, когда существенно возрастает доля молекул гликопротеина, ассоциированных с гормоном. Насыщение мембранного связывания молекулярных вариантов КСГ достигается при концентрации гормона вблизи 10 И, когда практически все молекулы гликопротеина находятся в виде комплексов со стероидом. Это свидетельствует о том, что молекулярные вар., штн КСГ взаимодействуют с мембранными участками связывания только в виде комплексов с гормоном.

На рис.3 представлены результаты сравнительного изучения специфического связывания нКСГ <А1 И сбКСГ (Б) мембраной синцитиотрофобласта в присутствии кортизола, кортикостерона, прогестерона и тестостерона прИ концентрациях каждого стероида в среде 5-10 М» обеспечивающих наличие в растворе не менее Яох нКСГ и с0КСГ в связанном с каждым -конкретным стероидом состоянии. В случае нКСГ кортйКоо^ероН, прогестерон и тестостерон увеличивали мембранное связывание Гликопротеина микровезикулами по сравнению с величиной- его НеспеиифИЧесКой адсорбции примерно в той же степени, что и Кортизол. В случае сбКСГ кортизол вызывал более существенное увеличение связывания указанного гликопротеина, чеМ прогестерон, кортккостероН г]и>и тестостерон (рис.з), Поскольку концентрация стероидов 5- ю м является насыщающей для образования комплекса с гликопротеином, полученные данные свидетельствуют о более высоком сродстве к мембранным участкам связывания • Комплекса сбКСГ с кортизолом, чем с другими Гормонами.

Физико-химической основой стероидной зависимости мембранного связывания КСГ, очевидно, является изменение конформации молекулы гликопротеина гри взаимодействии со

- в -

стероидом, которое зависит от природы связанного стероида. Это предполагает, что конформацмя нКСГ (сбКСГ), лишенного стероида, существенно отличается от конформации гликопротеина в комплексе с кортизолом, кортикостероном, прогестероном и тестостероном. Изменения конформации сбКСГ, индуцированные связанным кортизолом, отличаются от изменений, вызванных образованием комплекса этого гликопротеина с кортикостероном, прогестероном и тестостероном. Эти различия достаточны для того, чтобы определить избирательность взаимодействия комплекса сбКСГ -кортизол с мембраной сннцитиотрофобласта.

На основании различий в связывании с микровезикулами стероидных комплексов нКСГ и сбКСГ, отличающихся только по структуре углеводного компонента, можно заключить, что в формировании детерминант мембранного узнавания комплексов стероид - глмкопротеин принимают непосредственное участие олигосахаридные цепи КСГ. По-видимому, конформационные изменения полинептидной цепи нКСГ (сбКОГ), вызванные связыванием определенных стероидов, приводят к избирательному изменению пространственной ориентации олигосахаридных цепей, расположенных на поверхности гликопротеина.

1.3. Кинетика взаимодействия молекулярных вариантов КСГ с микровезикулай!

В результату исследований, выполненных ранее в нашей

лаборатории, в плазматической мембране синцмитиотрофобласта

плаценты человека были обнаружены участки специфического

связывания молекулярных вариантов КСГ двух типов. Одни из них,

высокоаффинные, проявляют сродство к нКСГ и сбКСГ,

характеризующееся значениями К,,, равными соответственно 2,5'ю

М и 3,3-Ю ' М. Другие, относительно низкоаффинные, проявляют

более высокое сродство к нКСГ, К„= 1,6- М, чем к сбКСГ, К

_9 Д

= 4,5-Ю И. Высокоаффинные участки связывания характеризуются

более низкими значениями 'максимальной связывающей емкости (I},

s 3 фмоль/мг), чем относительно низкоаффинные ' <В„,„„,„ = 150

г, IVjcu\ с

фмоль/мг). Приведенные данные получены при 4 .

Была изучена кинетика взаимодействия кортизольных комплексов молекулярных вариантов КСГ с микровезикулами сннцитиотрофобласта при температуре 23°допускающей протекание транспортных процессов. Для определения кинетических параметров указанного взаимодействия определяли концентрационную зависимость начальной скорости связы^ния нКСГ и сбКСГ с микровезикулами в присутствии 5-10 И кортизола. ' В

соответствии с существованием .двух типов участков специфического связывания молекулярных вариантов использовали два диапазона концентраций гликопротеинов: 1 • 10

- б-'-ю-^ М и 5-- 1- М. Графическим анализом

полученных данных по методу Лайнуивера-Берка были определены значения К у и V (с . Последний показатель использовали для анализа удельной скорости связывания ууц по формуле уу д = V г.;акс ^лакс • ^ем ' где п,макс " максимальная емкость связывания на единицу мембранного белка (см.выше), Смем - Концентрация мембранного белка в пробе. Кроме того, экспериментальные данные были обработаны по методу Хилла.

Полученные.результаты приведены в табл.1, Они подтверждают существование в мембране сннцитиотрофобласта двух типов участков связывания молекулярных вариантов КСГ. Как и при 4°, при 2 з0 высокоаффиннке участки связывания проявляют большее сродство к сбКСГ, относительно низкоаффинные - к нКСГ.

Значения коэффициента Хилла, близкие к единице, свидетельствуют о том, что при 23° реакции специфического связывания указанных ••' гликопротеиов мембраной

сннцитиотрофобласта не являются кооперативными, в отличие от <вазиравновесных условий, в которых .наблюдалась положительная «©оперативность связывания. :

Очевидны различия между кинетическими параметрами ззаимодействия с микровезикулами молекулярных вариантов КСГ, особенно в случае высокоаффиннях участков. Поскольку нКСГ и сбКСГ различаются только строением олигосахаридных цепей, юлученные данные свидетельствуют о непосредственном участии глеволных компонентов указанных гликопротеинов во взаимодействии с мембраной сннцитиотрофобласта. Ие исключено, по различия в значениях к ,» и У^д молекулярных вариантов КСГ

указывают на существование двух различных механизмов взаимодействия иКСГ и сбКСГ с данной мембраной.

Таблица 1

Кинетические параметры специфического связывания нКСГ и сбКСГ в комплексе с кортизолом йикровезикулами при 23+2° в двух диапазонах концентраций гликопротеинов: А - 1- Ю-12 - 6- Ю-11 М, Б - 5-.10-10 - 1-10-7 №

Гликопротеин Ку, М v^, с ^ Н««

ю-12 А

нКСГ (2, ,7+2,1)- (1 г 2+0, ,4)- ю-3 0,9

сбКСГ (0, ,7+0,2)- ю-12 (4, Б ,6+1 , ,9)- ю-4 0,7

НКСГ (1, ,U0,1)- (1 ,2+0, ,6>- Ю-2 0,8

СбКСГ (4 ,0+0,4)- ю-9 (1 ,7+0 ,5). 1 (Г2 1,0

«Приведены средние значения и стандартные отклонения по результатам трех независимых определений »»Н-коэффициент Хилла

1.4. Возможность трансмембранного транспорта молекулярных вариантов КСГ .

Биохимические и иммунохимические доказательства присутствия белков, подобных КСГ, в ряде тканей-мишеней стероидных гормонов, позволяют предположить существование механизма переноса КСГ крови через плазматические мембраны клеток. Таким образом ' может . осуществляться совместное Поступление в клетки гликопротеина и связанного с ним гормона.

С целью проверки ' возьожности .переноса молекулярных вариантов КСГ через иепбрану синцнтиотрофоОлаета изучали связывание микровезикулами иортизолышх комплексов меченых изотопом f х''- Г}' нКСГ и coKCI* при различных 4 анмЧиииях

концентрации сахарозы в инкубационном буфере. При этом исходили из того, что внутривезикулярный объем является функцией осмолярности среды. В параллельной серии экспериментов вместо микровезикул использовали мембранные фрагменты, полученные с помощью гипоосмотического "шока" микровезикул, то есть лишенные внутреннего объема. Используемые концентрации гликопротеинов м) позволили изучить их взаимодействие с относительно низкоаффинными участками связывания.

Как видно на рис.4, в используемом диапазоне концентрация сахарозы (О - 0,75 М) наблюдается линейная зависимость количества связанного микровезикулами кортизольного комплекса нКСГ от величины, обратной осмолярности инкубационной среды. Экстраполяция графика к бесконечно большой ' концентрации сахарозы в инкубационной среде (что соответствует нулевому значению внутривезикулярного объема) позволила определить величину мембранносвязанной фракции нКСГ. Она .совпадает с постоянным при всех использовавшихся концентрациях сахароза количеством нКСГ, связанного мембранными фрагментами. Зависимость связывания нКСГ микровезикулами от объема внутривезикулярного пространства свиде*ельствует о трансмембранном переносе этого гликопротеина. В пользу этого заключения .свидетельствует также сходство графиков взаимодействия с микровезикулами нКСГ и кортизола, который, как известно; накапливается внутри мембранных микровезикул.

В отличие от нКСГ, сбКСГ не проникает во внутреннее пространство микровезикул. Такой вывод вытекает . из независимости связывания микровезикулами этого, гликопротеина от осмолярности среды (рис.4).

Аналогичные результаты были получены при исследовании влияния осмолярности среды на взаимодействие молекулярных вариантов КОГ с высокоаффинными участками связывания (при концентрации гликопротеинов Н): только нКСГ накапливался

во внутривезикулярном пространстве.

Гак как сбКСГ не ограничивает поглощение кортизола пнкровезикуламм (рис.4), мы полагаем, что рКСГ функционирует как транспортный "челнок", снабжающий трофобласт стероидом. В случае нКСГ. по-видимому, происходит совместный трансмембранный

10 8 6 4 2

1/Сахароза, ьГ

РИС.4

I.Зависимостьувязывания ( Ц] кортизола (1, 1 *), С (2.2'I и I X]сбКСГ (3, 3') при 23° микровези^

125

i]нксг микровезикулами (1,2,3) и фрагментами (1', 2', 3') плазматической мембраны сннцитиотрофобласта о^ осмолярности среды, ^онцен^^ция ( Шкортизола - 1-10 М, кортизола - 1-ю М, [ И-

—о

меченых гликопротеинов - !• ю И.

3

50 . 60 Время, ипн

Рис.5. Временная, зависимость связывания (~Н1кортизола

микровезикулами при различных температурах в отсутствие, гликопротеинов (1) и в присутствии нКСГ (2) и сбКСГ (3). Данные типичного эксперимента.гКонцентрация стеромда -1-Ю м, гликопротеинов - !• 10 И.

перенос гликопротеина и связанного с ним горм-па, причем этот пропесс не зависит от фдародн стм-онда. Гоь, параллельное изучение взаимодействия ЦнКСГ в присутствии насыщающих

концентраций кортизола, прогестерона и тестостерона с одним и тем же препаратом микровезикул показало (табл.2), что величина связывания нКСГ в комплексе с любым гормоном была практически одинаковой и в равной степени зависела от внутреннего объема микровезикул.

125

Таблица 2,

Взаимодействие [ ЦнКСГ в комплексе с кортизолом (А),

прогестероном (Б) и тестостероном (В) с микровезикулами синцитиотрофобласта при различных значениях осмолярности инкубационной среды при 37° . Приведены результаты типичного эксперимента. Концентрация гликопротеина - 1- Ю- М, стероидов

- 1-10 м.

Концентрация сахарозы в 0,17 М буфере,М

—:---

Связывание комплекса [ ЦнКСГ-

стероид, имп/мин

А Б В

0,75 5500 5800 5400

0, 50 6600 6000 5900

0,25 8000 7800 8200

0, 13 8900 8600 8900

0,06 9500 9600 9600

0 10600 11000 10900

Последствия взаимодействия нКСГ и сбКСГ в комплексе со стероидами с каждым из двух известных типов участков связывания, локализованных в плазматической мембране синцитиотрофобласта, не зависят от типа последних (высокоаффинные или относительно низкоаффинные) и определяются исключительно природой гликопротеина < нКСГ или сбКСГ).

эти гликопротеины отличаются .только строением углеводных компонентов, полученные данные свидетельствуют о том, что олигосахармдные цепи вовлечены не только в первичный акт узнавания данных гликопротеинов связывающими участками, но и, в последующие биохимические процессы.

1.5. Влияние молекулярных вариантов КСГ на взаимодействие кортизола с микровезикулами

В соответствии с общепринятой моделью действия стероидных гормонов, поступление стероидов в клетки является необходимым условием реализации их гормонального эффекта. Поскольку кортизол находится в крови беременных женщин, преимущественно в виде комплексов с молекулярными вариантами КСГ, мы исследовали влияние этих гликопротеинов на транспорт этого гормона через мембрану синцитйотрофобласта.

Наш была определена временная зависимость связывания микровезикулами [ ^Н)кортизола, свободного и находящегося в комплексе с молекулярными вариантами КСГ, при различных температурах (рис.5). Количество, связанного микровезикулами стероида . во - всех случаях увеличивалось с ' повышением температуры. Очевидно, что при 4° связывание [ н]кортизола отражало количество стероида, находящегося на поверхности плазматической мембраны синцитиотрофобласта. При более высокой температуре, допускающей протекание транспортных процессов, количество связанного микровезикулами стероида определяется двумя составляющими: количеством мембранносвязанного гормона и количеством гормона, поступившего во . внутривезикулярное пространство. Температурная зависимость связывания

Г^Н]кортизола микровезикулами, подтверждает трансмембранный перенос гормона, поскольку, повышение температуры увеличивает скорость транспортных процессов.'

Для изучения кинетики взаимодействия с микровезикулами свободного и связанного с молекулярными вариантами КСГ кортизола определяли .концентрационную зависимость начальной скорости связывания гормона в отсутствие и в присутствии нКОГ (1Ю~" (!) или сбКСГ /5-Ю ' 11). Указанные концентрации

- 5 -

молекулярных вариантов КС Г гарантировали, что во всем использовавшемся диапазоне концентраций [ °нIкортизола (1-70 нМ) более 90% гормона находилось в виде комплекса с соответствующим гликонротеином. Графическим анализом полученных данных по методу Эди-Хофсти были определены кинетические параметры исследуемого взаимодействия: и^ и Полученные

данные приведены в табл.Э.

Таблица 3.

Кинетические параметры специфического связывания кортизола и его комплексов с молекулярными вариантами КСГ микровезикулами при 23+2° (средние значения и стандартные отклонения по результатам трех-четырех независимых определений)*

: _ —г

Препарат Кц-ю м Млакс'* 10 , м- с

КОРТИЗОЛ 35,0+10,0 13,4+0,5

кортизол-нксг 78,0+57,0 16,8+5,2

кортизол-сбксг 52,0+18,0 27,2+17,1

«Различия значений К у ' и V ка1(с специфического ' связывания микровезикулами кортизола и комплексов кортизол-гликопротеин не являются статистически достоверными (Р>0,05)

Сходство временной зависимости связывания (рис.5) и кинетических параметров взаимодействия с микровезикулами свободного и связанного с нКСР(сбКСГ) кортизола свидетельствует о том, что связанный с гликопротеинами и свободный гормон в равной степени доступны транспортным системам, локализованным в мембране ошщитиотрофобласта. Таким • образом, нКСГ и сбКСГ не препятствуют транс-мембранному переносу связанного с ними кортизола и, гю-видимому, реализации гормонального эффекта стероида п клетках трофоблнста.

Г-»то обусловлено либо быстрой .циеооцшнииа комплекса стероид - глик<>гф</т<;ж1 на ннкшнем поверхности наметана, лиЛ" гр'шемеинрчшшм переносом указанного комплекса как единого пологе. Ляшшо, полученные при изучении тр.шемеппрашюго

- le -

транспорта молекулярных вариантов КСГ в синцитиотрофобласт, свидетельствуют о том, что в случае сбКСГ может реализовываться первая возможность. Рецепция комплекса сбКСГ - кортизол мембраной синцитиотрофобласта сопровождается диссоциацией комплекса непосредственно на мембране. При этом кортизол транспортируется в плаценту по известному механизму, а гликопротеин возвращается во внешнюю среду, где может участвовать в доставке в синцитиотрофобласт следующей молекулы стероида. В отличие от сбКСГ,- нКСГ проникает через мембрану синцитиотрофобласта совместно с гормоном,

1.6. Влияние молекулярных вариантов КСГ на ферментативное окисление кортизола мембраной синцитиотрофобласта

Ранее было обнаружено [ 1 ], что трансмембранный перенос кортизола сопровождается его окислением 11 £> гидроксистероиддегидрогеназой (lip -ГСД) (ЕС.1.1.146) синцитиотрофобласта с образованием кортизона, гормональная активность которого намного ниже, чем кортизола. ' Было высказано мнение, что благодаря этому осуществляется защита плода от чрезмерного количества кортизола, проникающего из крови матери.

Мы изучали ферментативное окисление микровезикулами кортизола, который вносился в инкубационную среду как в свободном виде, так и в виде комплексов с молекулярными вариантами К.СГ. Полученные данные представлены на рис.6 и в табл.4.

Скорость ферментативного окисления кортизола, как свободного, так и в комплексе с гликопротеином, зависит от температуры. Так, при 4° за 1 час около половины кортизола, внесенного в инкубационную среду, превращается в кортизон, в то время как при 37° более 90% кортизола окисляется в течение нескольких минут. При этих температурах практически не наблюдалось влияния нКСГ и рКСГ на ферментативное окисление кортизола в кортизон. Однако, э:то влияние было отчетливо

Kant M.Е., Harbison K.D., Harrison R.W.// J. Riol.'- Chpm.

- 1979. - Vol.254, N14 . - P . 62 1 B-GüZ 1 .

выражено при температуре 23°: в присутствии иКСГ(сбКСГ) наблюдалось статистически достоверное снижение доли кортизона (рис.6,табл.4). Следует отметить, что в отдельных экспериментах мы наблюдали замедление окисления кортизола на 50%.

В случае свободного кортизола поступление стероида во внутривезикулярное пространство может происходить как путем свободной диффузии, так и по механизму специфического транспорта в результате взаимодействия с мембранным рецептором глюкокортикоидов Вероятно, в последнем случае кортизол будет защищен от действия lip -ГСД в процессе трансмембранного переноса. Выяснить соотношение свободной диффузии и специфического транспорта кортизола в наших экспериментах не представлялось возможным.

В случае кортизола, связанного с нКСГ или сбКСГ, можно было ожидать, что гормон поступает во внутривезикулярное пространство по механизму специфического транспорта совместно с нКСГ или по "челночному" механизму в результате диссоциации комплекса сбКСГ - кортизол на поверхности везикул, связыванию с мембранным рецептором глюкокортикоидов и транспорту в комплексе с данным рецептором во внутривезикулярное пространство. Однако, в условиях используемой экспериментальной системы in vitro невозможно избежать диссоциации комплекса нКСГ(сбКСГ) кортизол в инкубационной среде. Это, по-видимому, и является причиной того, что- окисление кортизола все-таки происходит.

Представляет также интерес вопрос о том, сопряжены ли процессы трансмембранного переноса и ферментативного окисления кортизола. В литературе было высказано мнение [1) о сопряженности этих процессов на основании данных о том, что введение в инкубационную среду nad+ стимулировало как ферментативное окисление глюкокортикоидов, так и Их накопление во внутривезикулярном пространстве. Наши результаты, представленные в табл.4, подтверждают активирующее, влияние nad+ на оба рассматриваемых процесса вне зависимости от того, находится стероид в свободном виде или в .комплексе с нКСГ(сбКСГ).

Однако, нами было показано, что стероид, находящийся в межвезикулярном пространстве, подвергается ферментативному

Таблица

Фер^цтатизиое окисление кортизола микровезикулами синцктиотроФобласта в различных экспериментальных условиях.

Доля кортизола (Ё) и кортизола <ю, %

Время ,мин. в отсутствие нКСГ в присутствии нКСГ

- - Е С. ,0. Р Е с, ,0.

4°

60 53 ,0 47 «0 3, ,8 55, ,0 45, 0 4, ,5

• 23°

5 41 ,5 58 .5 8, ,2 48, ,6 51, ,4 ' 6, ,8

1° 32 ,5« 67 ,5« 2, ,5 39, 60, >.з» 4, ,4

15 32 ,4 67 »6 5, ,7 37 , •52, ,7 6, ,0

30 . 28 ,0« 72 ,0* 5, ,6 41, ,0» 59, 0* . 1, 1 4

60 23 ,8« 76 ,2« . -г, ,4 39, ,5« 60, 5 8, ,5

60+НАР+ 20 ,0 80 гО 4, ,5 со ,0 82, 0 5, ,2

371а

5 10 .0 90 ,0 7, ,2 9, ,0 91, , 0 Б, ,0

30 8 .0 92 ,0 6, ,7 7, ,0 93, ,0 5, , 8

5+НАЬ+ . 7 .0 93 ,0 5, ,8 5, ,0 95, ,0 7, , 1

30*КАП+ . '' 3 97 ,0 4, ,0 2, ,0 98, 0 3, ,1

Стандартное отклонение (С.О.) рассчитано на основании 6-1 независимых определений.

«Различия концентраций стероидов в отсутствие и в присутствии нКСГ статистически достоверны (Р<0,05).

в Рн

О

60 40 20

12 3

5 мин

12 3 30 мин

12 3 60 мин

Рис.6 Ферментативное окисление свободного (1) и связанного с нКСГ (2) или с сбКСГ . (3) кортизола микровезикулами синцитиотрофобласта при 23°. Концентрация кортизола -1-Ю и, гликопротеинов - 5- 10 М.

100

80

и

о со я

н р(

о

60

40

3 ^ 2

0

20 '40 .60

Время, мин

Рис.7 Временная зависимость ферментативного окисления кортизола, связанного микровезикулами (1, 2) и находящегося в межвезикулярном пространстве (3,4) в отсутствие связывающих белков (2, 4) ив присутствии нКСГ (1, з) при 23°. Данные типичного ¡эксперимента. Концентрация кортизола - 1> 10 н, нКОГ - 5- 10- ^ м.

окислению даже в большей степени, чем стероид, связанный микровезикулами (рис.7). Подобные результаты могли бы быть получены в случае солюбилизации мембранной Ир,-ГОД в процессе инкубации микровезикул со стероидом и гликопротеинами. Однако

нами получены доказательства прочной ассоциации lift -ГОД с

о

мембраной синцитиотрофобласта. Кроме того, при 4 , когда процессы транскембрпннэго транспорта заторможены, около половины [ H]KopTi!.:«,."j-, суойодного или связанного KCl', за 1ч окислялось в кортизон (табл.4). В совокупности, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что процессы трансмембранного переноса и окисления кортизола, по-видимому, не сопряжены.

Таким образом, получены экспериментальные данные в условиях in vitro, которые свидетельствуют в пользу того, что нКСГ и сбКСГ могут предотвращать ферментативное окисление кортизола в кортизон в процессе поступления гормона в синцитиотрофобласт, и следовательно, доставляют в клетки данной ткани гормонально активные глюкокортикоиды.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения взаимодействия нКСГ и сбКСГ с микровезикулами, полученными' из плазматической мембраны синцитиотрофобласта . плаценты человека в квазиравновесных условиях, установлено, что образование комплексов молекулярных вариантов КСГ со стероидами является необходимым условием специфического связывания этих гликопротеинов данными микровезикулами. Природа связанного с гликопротеином стероида по разному влияет на сродство нКСГ и сбКСГ к мембране.

2. Определены кинетические параметры связывания молекулярных вариантов КСГ (в виде комплекса с кортизолом) микровезикулами при 23°: к до и v-уд и коэффициент Хилла .

3. Обнаружено, что только один из молекулярных вариантов КСГ - нКСГ - способен проникать через мембрану синцитиотрофобласта. Это означает, что углеводный компонент КСГ не только может участвовать в первичном акте взаимодействия комплекса "стероид - гликопротеин" с мембраной, но и определяет

механизм последующего трансмембранного переноса стероидного гормона.

4. На основании исследования кинетики связывания микровезикулами кортизола - свободного и находящегося в комплексе с молекулярными вариантами КСГ - показано; что образование комплексов ' с этими стероидсзлзывающими гликонротеинами не препятствует трансменбранному переносу кортизола.

5. . Показано, что трансмембранный перенос кортизола сопровождается его ферментативным окислением с образованием гормонально неактивного кортизона.' Молекулярные варианты КСГ могут предотвращать окисление кортизола в кортизон в процессе поступления гормона в синцитиотрофобласт.

Основные результаты диссертации изложены в б публикациях:

1. Киселева Е.И., Аввакумов Г.В., Стрельченок O.A. Кинетика взаимодействия молекулярных вариантов транскорТина человека с плазматической мембраной синцитиотрофобласта плаценты человека// Известия АН БССР, сер-биол.н. - деп. в ВИНИТИ 21.02.89, N1297 - Б89. .

2. Киселева E.tl.V Аввакумов Г. В. Взаимодействие стероидных гормонов и комплексов транскортин-стероид .с мембраной синцитиотрофобласта/ /в кн.: Механизмы действия медиаторов и гормонов -на эффекторные клетки, Тезисы Всесоюзн.конф., Суздаль, 1989, с.76.

3. Киселева E.I1., Пашкевич И.И., Аввакумов Г.В. Влияние транскортиНа на окисление , кортизола мембранами синцитиотрофобласта плаценты человека// Известия АН БССР, сер.биол.Н. - деп. В ВИНИТИ 18.05.90, N2725 - Б90.

4. Киселева Б.П. Рецепция комплексов транскортин - стероид везикулами мембраны синцитиотрофобласта// в кн.: Биохимия и биофизика клеточных процессов, Тезисы конф. молодых ученых АН БССР и БГУ, Минск, 199.0, е.17,

5. Киселева Е.П., Ваижевич И.Й., льиакумов I .В. lu.iieinka взаимодействия • гормон-белковых- комплексов с мембранными везикулами// в кн.: Биохимия рецепторных систем, Тьзнс.ы Воесоюзн; симпоз., Таллинн, 1990, с.26.