Регуляция плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина в плазматической мембране фибробластов человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ИНСТИТУТ БЯООРГЛ1ШЧЕСКОЯ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ АКАДЕМИИ НАУК. УКРАИНЫ

На правах рукописи

Чернюк Наталья-Николаевна

УДК 577. 35г. 465: 576. 353. 9

РЕГУЛЯЦИЯ ПЛОТНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОИЗВОДИ« 1,4-датЩШШИНА в ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕЫВРАНЕ СИБРОВЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 02.00.10 - биоорганичеокая химия, химия природных и физиологически акгивяьйс веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в Научно-производственном центре медицинской биотехнологии Ш СССР

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук Дудкин С. 1.1.

кандидат биологических наук Скрыма Роман Николаевич доктор биологических наук Борисенко Светлана Николаевна

Ведущая организация:

НПО Биотехнология

Защита диссертации состоится а^^г/йух 1992 г.

в_ часов на заседании Специализированного совета

Д 016.65.01 при Институте биоорганической'химии и нефтехимии АН Украины по адресу: 253160, г.Киев, Харьковское ш. ,50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Сиоорганической химии и нефтехимии АН Украины.

Автореферат разослан______________19й?г.

Ученый секретарь Специализированного совета /

кандидат биологических наук ца^Г 'Тедоряк Д. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одной из фундаментальных проблем в современной биологин является изучение молекулярных механизмов, контролирующих стимуляцию активности клеток человека и животных. Важное звено в цепи передачи внешнего сигнала на цитоплазматичес-кие структуры клетки представляет регуляторная система кальция. Одним из путей регуляции кальциевой сигнализации в-эукариотических клетках моиет служить изменение плотности, кальциевых каналов плазматической мембраны.

В настоящее время по электрофизиологическим и фармакологическим критериям различают три типа потенциалозависимых кальциевых каналов, обычно обозначаемых как L-, Т- и N-каналы (Fedulova et al. , 1985; Nowycky et al. , 1985). В биохимическом плане наибольший интерес представляют медленно инактивирущиеся каналы L-типа.

Интенсивное исследование молекулярных и функциональных свойств каналов L-типа стало возможным после того, как было обнаружено, что альфа1-еубъединина канала, являющаяся собственно каналом, содержит высокоаффинные участки связывания соединений трех типов: производных 1,4-ригидролириди-на, бензотиазепинов и фенилалкиламинов (Campbell et al. , 1988). Эти соединения избирательно и стереоселективно взаимодействуют с участками связывания в составе кальциевого канала в наномолярных и ниже концентрациях, инактивируя или, наоборот, активируя канал, что предопределило их широкое использование в фармакологии ( Janis, Triggle, 1986 ).

Появление радиоактивно меченных производных перечисленных соединений позволяет применять.их в качестве молекулярных зондов при изучении факторов, регулирующих биосинтез

кальциевых каналов Ь-типа, и, соответственно, их содержание в плазматической мембране клеток. При этом наибольший интерес представляют производные 4-арил-1,4-дигидропиридина, центр связывания которых расположен на участке молекулы канала, находящемся с внешней стороны клеточной мембраны.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: установление факторов, определяющих содержание рецепторов производных 1,4-дигидропиридина, ассоциированных с кальциевыми каналами Ь-типа, в плазматической мембране эмбриональных фибробластов человека.

Исходя из поставленной цели, были определены следующие задачи исследования:

1. Изучение взаимодействия радиоактивно меченного зонда с фибробластами человека.

2. Определение влияния факторов роста клеток на содержание рецепторов производных 1,4-дигидропиридина.

3. Изучение роли ионов кальция и сАМР в биогенезе рецеп-.торов производных 1,4-дигидропиридина.

4. Выявление роли биосинтеза белка и гликозилирования в биогенезе рецепторов производных 1,4-дигидропиридина.

б. Исследование функциональной роли рецепторов производных 1,4-дигидропиридина, ассоциированных с кальциевыми каналами Ь-гипа, в стимуляции пролиферации фибробластов человека факторами роста клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Установлено, что структурный аналог риодипина 2,6-диме- ' ,тил-3-метоксикарбонил-5([2,3-^Н ] пропоксикарбонил)-4-(2'-дифторметокеифенид) - 1,4 -дигидропиридин ( С^ШПЩ ) соответствует требованиям, предъявляемым- к молекулярным зондам рецептора производных 1,4-дигидропиридина ( ДТП ), и может

- з -

быть использован для детекции рецептора на уровне десятка фмоль в пробе. Впервые методом радиолигандного анализа идентифицирован ДТП-рецептор в плазматической мембране фиб~ робластсв человека. Показано, что содср.глняе рецептора зависит от наличия межлеточных контактов, определяется природой фактора роста клеток и, соответственно, пролиферативны.ч статусом клеток, а такке уровнем внутриклеточной концентрации • ионов кальция и сАМР. При этом биосинтез кальциевых каналов-плазматической мембраны фиброблас^в человека, по-видимому, может регулироваться на уровне трансляции. '

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Полученные данные показывают, что кальциевые каналы Ь-типа плазматической мембраны участвуют в пролифераршном ответе фибробластов человека, что.может найти, непосредственное применение гак в биотехнологии, так и в медицине для направленного воздействия на продифгративную активность клеток.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные.результаты работы были долокены на: II Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1988), 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), 10 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989) и конференциях НЩ Медицинской биотехнологии МЗ СССР.

ПУБЛИКАЦИЙ

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит кз введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментальных результатов и

их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен в 18 рисунках и 1 таблице. Список литературы включает 127 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В обзоре литературы настоящей диссертации, проведен анализ структурно-функциональных свойств факторов роста клеток и их рецепторов, рассмотрены возможные пути их взаимодействия с основными регуляторными системами клетки.

Методика исследования В работе использовали меченный тритием аналог риодипина [ Н] 1ВД, синтезированный в Институте молекулярной генетики АН СССР, имеющий молярную радиоактивность. 2,1-2,3 Тб/ммоль.

Препараты мембран скелетной мышцы кролика, обогащенных фрагментами поперечных трубочек, выделяли по модифицированному методу Роземблатта ( ВогетЫаЫ еЬ а1., 1981) в присутствии ингибиторов протеиназ и хранили при -40°С.

Фибробласты человека получали из б-недельных эмбрионов по'методу $решни [РгезГитеу, 1983 3. Культивирование клеток проводили при 37°С в среде Игла, содержащей 8% бычьей сыворотки и 27. фетальной сыворотки. Для исследования использовали клетки на 4-15-м пассатах культивирования.' Контрольные эксперименты показали, что в этом интервале исследуемые в; работе характеристики не вависят от времени жизни клеток.

Для выделения мембран фибробластов клетки лизировали и дополнительно гомогенизировали при 4 *С в гомогенизаторе ^ Поттера в присутствии 0.22 Ы сахарозы. ■ Гомогенат центрифу-

гировали 30 мин при 2500 г (4*0) и мембранную фракцию осаждали из супернатанта центрифугированием при 150 ООО г в- те-■ чение 1 ч при 4*0. Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере до концентрации 0.5 мт белка в 1 мл и хранили при . -70*0.

Определение связывания меченого зонда с препаратами мембран проводила при комнатной температуре в 20 мН трис- НСЬ -буфере, рН 7.4, содержащем 1 мМ СаСЬл и 10 мкМ-Ц-цис-дилтиазём для стабилизации рецептора в высокоаффшшой конформации. Концентрация мембранного белка;.сЬставляла 10 мкг/мл и соответствовала линейному диапазону кривой зависимости связывания зонда от концентраций белка в пробе. Для определения неспецифичного связывания в пробы добавляли 0.Б йкМ нитр'ендипин. После достижения раййЬвёсия (через 80 мин) отбирали аликвоты суспензии мембран, . смешивали их с

о •

охлажденным до 0-4 С 20 мМ трис-НСЬ-буфером, - рН 7.4, я быстро пропускали под вакуумом через фильтры О7/С. Общее время обработки'не превышало 10-15 сек. удержанйу» радиоактивность измеряли в смеси БирвгБО^ X. '

Для определения содержания рецептора В нативных фибро-бластах культуралъную среду удаляли, прикрепленные клетки быстро промывали 2 раза инкубационным буфером, содержащим 20 мЫ трие-Н(Х буфер, рН 7. 35, 146 мМ НаСЬ, 1 кМ СаС1л и, если указано, 10 мкЫ 0-цис-дилтиазем. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 22*0 с 2 мл инкубационного буфера, содержащего лизанные концентрации СЛН1ПВД. Показано, что этого времени достаточно для достижения равновесного связывания зонда. Для определения уровня неспецифичного связывания вон-да в контрольных экспериментах инкубацию проводили в присут-

ствии 250-кратного молярного избытка нитрендипина. После инкубации среду отсасывали капилляром, клетки быстро промывали два раза инкубационным буфером, охлажденным до 4*С, а ватем растворяли при 40*С в 1 мл 0.4 Ы ИаОН, содержащего 2.5 % додецилсульфата натрия. Полученный образец в объеме 0. Б мл использовали для измерения радиоактивности.

Полученные данные анализировались на статистическую значимость. с помощью линейной регрессии и Ь-теста Стыодента. Расчет параметров проводили на компьютере 1ВМ РС АТ. Вертикальные и горизонтальные отрезки на рисунках представляют 95%-ный доверительный интервал.

Результаты исследования 1. Связывание радиоактивно меченного зонда с ■ мембранами скелетной мышцы кролика

В качестве молекулярного зонда использовали меченный тритием аналог риодипина С^Ю ПВД Параметры рецепции эонда были исследованы на классическом примере - мембранах скелетной мщицы кролика.

Рассмотрение результатов равновесного связывания зонда в Координатах Скэтчарда показало, что взаимодействие лига-нда с рецептором ограничено одним классом участков связывания. При втом уровень специфичного связывания составил 85%, 9 равновесная константа связывания 3.5 нМ.

Очевидно, что исследованный зонд соответствует требованиям, предъявляемым к молекулярным зондам рецептора ДТП Это соединение может быть использовано для детекции рецептора ДТП на уровне десятка' фмоль в пробе и, соответственно, для тестирования содержания кальциевых каналов Ь-типа в

различных биологических объектах методом радиолигандного анализа.

Z. Изучение взаимодействия радиоактивно печенного аналога риодипина с фибробластами человека В качестве биологической модели нами были выбраны эмбриональные фибробласты человека, которые, несмотря на-трудоемкость культивирования, в последние годы находят все большее распространение при исследовании регуляции ¡снеточной активности факторами роста Эти клетки обладают стабильными свойства!® в течение 4-18 пассажей, при культивировании дают равномерно растущие монослойныэ культуры прикрепленных на поверхности клеток, обладают высокой, чувствительностью к факторам роста и достаточно коротким' меточным циклом, не осложненным процессами дифферзццировкл. В пользу такого выбора говорит тага® тот факт, что согласно данным электрофизкодогических исследований, фйбробласты человека содержат только каналы t-типа (Chen,'Hess, 1987).

В результате исследования установлено,' что плазматическая мембрана фибробластов человека содержит рецептор ДТП, ассоциированный с кальциевым каналом L-типа, идентичный по своей способности связывать производные 1,4-дигидропиридина с рецептором мембраны скелетной мышцы кролика. Удельная плотность рецепторов составляет 1.2 пкмоль на 1 млн. «леток, а равновесная константа связывания Кд 3.9 нМ.

3. Влияние {акторов роста на плотность рецепторов ДТП в плазматической мембране фкбробяас-тов Данные, приведенные в предыдущем разделе, бнли подучены

Я

СУТКИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рис. 1. Зависимость содержания рецепторов ДТП от условий культивирования: а-среда Игла, содержащая 0.12 БСА (1) или 10* сыворотки быка (2); б-влияние 10Х-ной'сыворотки в клетках, предварительно культивируемых в течение 4 сут на среде Игла, содержащей 0. IX ВС Д. Плотность клеток 3-5 тыс. клеток на см-*; концентрация г'шИЩ 1.8 НМ. в условиях культивирования клеток на питательной среде, содержащей сыворотку, т.е. в условиях, когда в среде.постоянно присутствовали факторы роста клеток, стимулирующие пролиферацию. Оказалось, что перевод клеток на бессывороточную среду, содержащую 0. IX ВСА, сопровождается увеличением концентрации рецепторов, которое достигает стационарного уровня ва 2.5-3 суток культивирования (Рис. 1а). Анализ связывания HJ ПЫД показал, что при атом сродство зонда к рецептору практически не. изменяется (Кд 3.2 нМ), а концентрация участков его специфичного связывания ' возрастает до 2.3 пмоль на 1 млн. клеток, т. е. в 1.9 раза Такое изменение

содержания рецепторов ДТП полностью обратимо: последующее культивирование клеток в присутствии сыворотки сопровода-ечся постепенным уменьшением концентрации рецепторов до исходного уровня, которое завершается за 2.5-3 суток (Рис. 16). Следовательно, динамика обоих процессов практичесга одинакова.

Перевод и выдерживание клеток на бессывороточной среде ' в течение 2 -3 дней приводит к полной остановке их пролиферации. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что содержание рецепторов ДТП в плазматической мембране фнбробластов человека увеличивается с уменьшением их пролиферативного статуса. Для изучения этого вопроса мы исследовали стимуляцию покоящихся фнбробластов различными факторами роста клеток (фактором роста фнбробластов, зпи-дермальным фактором роста, инсулином, сывороткой) и проследили связь между содержанием 'рецепторов ДТП и уровнем синтеза ДНК. Клетки переводили в,состояние покоя выдерживанием в бесеызороточной среде, содержащей 0.1 X БСА, в течение 3-4 дней. Это состояние соответствует стационарному содержанию рецепторов, ДТП около 2.3 пмоль на 1 мля. клеток и характеризуется лшь фоновым уровнем синтеза ДНК, определяемым по включению ['штимидина. На рис.2 приведены сравнительные данные о стационарных уровнях содержания рецепторов ДТП в клетках после их культивирования с различными факторами роста и соответствующих уровнях синтеза ДНК. Видно, что уменьшение содержания рецепторов тем больше, чем выше митогенный эффект факторов роста. Наиболее существенное снижение плотности рецепторов ДТП наблюдается при стимуляции клеток фактором роста фнбробластов, который проявлял в дан-

¿.U- -

Рис.2. Влияние митогенов на содержание рецепторов ДТП .(неааштрихованные столбики) и синтез ДНК (заштрихованные столбики) в эмбриональных фибробластах человека. Клетки переводили в состояние покоя ввдёрживанием в течение 4 сут в среде Игла, содержащей 0. IX ЕС А, которую затем заменяли на среду Игла, содержащую 10% сыворотки быка (1), 0. IX БСА (2), EOF, 15 нг/мл (3), инсулин 10

мкг/мл (4) или FGF, 2 нг/мл (Б). Плотность фиброблас-j, j ■

тов 3-5 тыс. клеток на см ; концентрация С НИЩ 1.8 нМ. ноы случае максимальный митогенный эффект. Эпидермальный фактор роста вызывал лишь незначительную стимуляцию синтеза ДНК и, вместе с тем, слабо влиял на содержание рецепторов. По обоим измеряемым параметрам препарат инсулина занимал промежуточное положение между этими факторами.

- и -

Найденные в данной работе изменения содержания рецепторов могут быть следствием изменения восприимчивости клеток к митогенам, стимулирующим пролиферацию за счет каскада сигналов, начинающихся со входа ионов кальция в клетку, опосредуемого, по-видимому, ДТП-чувствительными кальциевыми каналами. Иными словами, изменение содержания рецепторов ДТП в ответ на замедление или стимуляцию пролиферации фиброблас-тов является отражением ключевой роли метаболизма кальция в передаче митогенного сигнала от плазматической мембраны на цитоплазматические структуры клетки.

4. Регуляция биогенеза рецептора ДТП ионами кальция и с А!Л5 Взаимодействие факторов роста клеток 'со специфическими рецепторами на плазматической мембране клеток, как правило, сопровождается индуцированием кальциевого сигнала. В связи с этим, . значительный интерес ' представляло.выяснение роли ионов кальция в биогенезе ДТП-чувствительного кальциевого канала.' Оказалось, что культивирование фибробластов в среде,. содержащей сыворотку и, независимый блокатор дигидропи-ридин-чувствительных "кальциевых каналов дилтиазем, приводит к увеличению концентрации участков связывания С^ЮПВД до уровня, близкого к наблюдаемому при культивировании клеток в бессывороточноД среде, с тем же. характеристическим временем достижения стационарного состояния (2.5-3 сут) (Рис.3). Увеличение содержания рецепторов в данном случае не связано с остановкой клеточной пролиферации, так как в этих условиях дилтиазем на синтез ДНК не влияет. В то же время, добавление в среду культивирования, содержащую сыворотку, каль-

1

- 12 -

1. 2 ■ 3 4 5

РисЗ. Влияние основных посредников клеточной регуляции на содержание рецепторов ДТП. в эмбриональных фиброблас-тах человека Клетки культивировали в течение 4 сут в

среде Игла, содержащей 10% сыворотки быка (1-4), а

«

таюке 1 ыМ 8-Вг-сАЫР (2), 1мкМ А23187 (3), 10 мкМ дил-г тиазем (4), или в бессывороточной среде. Игла, содержащей 0.1% БСА (5).

циевого ионофора А23187 вьйыв'ало.-прртшюположный эффект -резкое уменьшение содержания-рецепторов б клетках, по .абсолютной величине на 30 - 60 % превышающее эффект 10 2-ной сыворотки на покоящиеся фибробласты (Рис.3). При этом, как

и в случае, стимуляции клеток факторами роста, не происходило существенного изменения сродства аонда к рецептору ДТП Таким образом, наблюдаемые эффекты не связаны со структурными перестройками ДТП-чувствительных кальциевых каналов в плазматичеасой мембране клеток, а обусловлены лишь изменением их содержания. Следовательно, можно предположить, что уменьшение внутриклеточной концентрации ионов кальция ' приводит к увеличению числа кальциевых каналов на плазматической мембране, достигающего значения, характерного для покоящихся клеток. Обратный процесс приводит к.уменьшению их содержания до уровня, характерного для активно пролиферирующей культуры фибробластов человека

Факторы роста клеток не вызывают непосредственной стимуляции аденилатциклаэной системы. Однако, хорошо известно, что в клетках последняя тесно сйязана с регуляторной системой кальция. Представляло интерес изучить влияние одного из основных вторичных медиаторов клеточной регуляции - сАМР на биогенез ДТП-чувствительных кальциевых каналов. Оказалось, что культивирование покоящихся клеток в присутствии негид-ролизуемого фосфодиэстеразами аналога сАМР ( 8-Вг-сАМР ) приводит к эффекту, аналогичному действию кальциевого ионо-фора (Рис. 3). Таким ¡не образом не происходит и изменения сродства зонда к рецептору ДТП. : Изучение динамики снижения содержания рецепторов под действием 8-Вг-сАМР показало, что независимо от наличия сыворотки в среде культивирования, т. е. в случае как покоящихся, так и пролиферирущих клеток, изменение уровня содержания рецепторов ДТП проходит черев промежуточный экстремум приблизительно черва 2 --2.5 суток с момента обработки (Рис. 4) и достигает стационарного уров-

к

!

ч

1.6 -

1.0 -

0.5

12 3 4

ВРЕМЯ / дни /

1 2 3 4 «

'. ВРЕ.Й ./ дай /

Рис. 4. Динамика изменения содержания рецепторов ДТП под действием 1мЫ 8-Вг-сАМР: а' - в присутствии 10% сыворотки быка; б - в среде Игла, содер;кадей 0.1% БОА. Остальные условия см. в подписи к рис.3

ня через 3 - 3.5 суток после введения нуклеотида.

Таким образом, полученные данные показывают, что регуляция содержания рецепторов ДТП может осуществляться при участии ионов кальция и сАМР. Возможно, именно эти два основных вторичных посредника играют определяющую роль в каскаде событий, индуцируемых митогенным сигналом и проявляющихся в изменении биосинтеза ДТП-чувствительных кальциевых каналов.

6. Роль биосинтеза белка игликозилирования в биогенезе кальциевых каналов фибробластов С целью выявления стадии, лимитирующей динамику биогенеза потенциалозависимых кальциевых каналов в плазматичес-

0

кой мембране фибробластов, мы исследовали влияние ингибиторов .трансляции и гликозилирования: циклогексимида и ту-никамицина, соответственно, на содержание рецепторов ДТП в клетках, культивируемых' в присутствии сыворотки (Рис.б). Анализ кинетики падения содержания рецепторов ДТП в условиях ингибирования трансляции циклогексимидом показал, что процесс удовлетворительно описывается одной экспонентой и име-. ёт полупериод около 12 ч. Это соответствует скорости оборота рецептора ДТП в клетках 30000+/- 7500 молекул/ч на клетку или 1.1 пмоль участков связывания зонда на 1 млн.

скорость оборота рецептора 30000*7500 молекул/час на клетку

10 20

' ВРЕМЯ /ч/

Рис. 5. Влияние циклогескимида (24 мкг/мл) /о/ и туника-мицина (1 мкг/мл) /о/ на содержание рецепторов в. клетках, культивируемых в среде Игла,' содержащей 10% сыворотки быка. Плотность - 5-7 тыс. клеток на смл, концентрация [''ЮПИД 1.8 нМ.

клеток за 2.5 суток. - Найденная величина в пределах точности измерений совпадает с характеристичной скоростью изменения содержания рецепторов ДТП в условиях активации пролиферации покоящихся клеток сывороткой, при удалении сыворотки и при культивировании фибробластов в присутствии дилтиазема и кальциевого ионофора ( см. выше ). Известно, что субъединицы молекулы кальциевого канала L-тила являются гликопротеи-нами и их гликозилирование представляет собой фактор, определяющий функциональное состояние канала (Campbell et al., 1988). Полученные нами данные показывают, что гликозилиро-вание не является стадией, лимитирующей биогенез канала, тай как кинетика падения содержания рецепторов ДТП в клетках в условиях ингибирования гликозшшрования канала туникамици-ном полностью совпадает с таковой для циклогексимида (Рис5).

Следовательно, можно заключить, что изменения, наблюдаемые в содержании рецепторов ДТП при переходе фибробластов в покоящееся состояние или при стимуляции остановленных клеток различными факторами роста, могут регулироваться на уровне трансляции.

6. Функциональная роль кальциевых каналов L-типа в

стимуляции митогенеза Фибробластов человека Существование в фибробластах механизма регуляции биогенеза рецептора ДТП при участии ДТП-чувствительных кальциевых каналов позволяет предположить наличие более широкой связи - ыевду работой ДТП-чувствительных каналов и митоге-незом. Для выяснения этой связи мы исследовали влияние бло-катора кальциевых каналов нитрендипина на синтез ДНК в фибробластах, стимулированных сывороткой ( табл. 1 ).

* Таблица 1

, Влияние нитрендипина ( 1 мкМ ) на стимулируемый 10%-ной фетальной сывороткой синтез ДНК в фибробластах эмбриона человека

Культура клеток .Нормированное на число клеток включение С Ш тимидина (в X к контролю в отсутствие блокатора),.если нитрендипин добавлен:

одновременно с сывроткой через 18 ч после сыворотки

Субконфлюэнтная Конфлюзнтная . • 40.9+/-26. 3 0+Л-4..4 62. 7+/-24.8 54. 8+/-10.9

Оказалось, что нитрендипин в концентрации 1 мкМ, вызывающей полное блокирование кальциевых Каналов, на 60 % ингйбирует стимулированный сывороткой синтез ДНК в суб-конфлюэнтных культурах и полностью его блокирует в конф-люэнтных культурах. Этот факт указывает на то, что снижение содержания рецепторов ДТП, которое мы наблюдали при увеличении числа межклеточных контактов, не связано с уменьшением роли ДТП - чувствительных каналов в реализации митогенного сигнала, а, по-видимому, является отражением изменения соотношения активных и неактивных форм канала. На величину эффекта блокатора влияет время добавления нитрендипина. Максимальное ингибирование митогенеэа наблюдается при введении нитрендипина одновременно с сывороткой. В то же время, достоверный ингибирующий эффект проявляется через 18 ч после стимуляции митогенеза.

Приведенные данные ' позволяют заключить, что ДГП-чувс-

твительные кальциевые каналы играют весьма важную роль как в биогенезе рецептора ДТП, та« и в синтезе ДНК, стимулируемом митогенами. Иными словами, ДТП-чувствительные кальциевые каналы, являясь источником (проводником) кальция - одного из основных вторичных посредников активации клеток, могут рассматриваться в качестве ватой регуляторной системы митогенеза.

■ Таким образом, в данной работе на примере эмбриональных фибробластов человека установлено наличие функциональной взаимосвязи между факторами роста и ДГП-чувствительныш кальциевыми канала!® плазматической мембраны. Продемонстрировано, что эти кальциевые каналы представляют собой необычайно пластичную систему, отвечающую на воздействие как первичных, так и вторичных посредников пролиферации, а также - реагирующую на увеличение числа межклеточных взаимодействий. Кроме того, полученные данные о том, что кальциевые каналы плазматической мембраны вовлечены в про-лиферативный ответ ¡слеток, делают возможным использование широкого ряда кальциевых антагонистов для воздействия на каналы с целью управления пролиферативной активностью клеток.

ВЫВОДЫ

1. На примере эмбриональных фибробластов человека показано, что система дигидропиридин-чувствительных кальциевых каналов плазматической мембраны клеток обладает высокой пластичностью по отношению к воздействиям различных сиг-,

нальных молекул.

2. Показано, что стимуляция пролиферации фибробластов факторами роста клеток приводит к уменьшению плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина. При этом степень уменьшения содержания рецепторов обратно пропорциональна ми~ тогенной активности факторов.

3. Содержание рецепторов производных 1,4-дигидропиридина в плазматической мембране фибробластов изменяется при повышении внутриклеточной концентрации вторичных посредников: оАМР и ионоз кальция.

4. Показано, что регуляция плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина факторами роста, сАМР и ионами кальция может осуществляться на уровне трансляции.

5. Обнаружено, что образование межклеточных контактов в культуре фибробластов приводит к кажущемуся снижению содержания рецепторов производных 1,4-дигидропиридина. Показано, что это не связано с изменениями в биосинтезе кальциевых каналов, а является, по-видимому, отражением увеличения вероятности существования активной формы канала.

6. Установлено, что кальциевые каналы Ь-типа играют важную роль в стимуляции синтеза ДНК факторами роста в эмбриональных фибробластах человека.

- 20 - '

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дубур Г. Я. , Кастрон В. Е , Скрастиньш И., Мясоедов Е Ф., Шевченко Е Е , Солдатов Е М., Чернюк Е Е Новые радиоактивно меченные молекулярные бонды для исследования рецептора кальциевых антагонистов группы 1,4-дигидро-пиридина. - Виол, мембраны, 1988, т. 5, N. 3, с. 323-326.

2. Солдатов Е М., Гнедой С. Е , Чернюк Е Е , Британова И. А., Дудкин С. М. Митогенез и ассоциированный с кальциевыми каналами рецептор 1,4-дигидропиридинов в эмбриональных фибробластах человека. - Биол. мембраны, 1988, т. 5, N.11, с. 1161-1167.

3. Дудкин С. М., Чернюк Е Е , Почечуева Т. Е , Гнедой С. Е , Солдатов ЕЕ Клеточные культуры как модель исследования свойств потенциалозависимых кальциевых каналов. -II Всесоюзная конференция по нейронаукам, Киев, 1988, тезисы докладов, с. 30-31.

4. Dudkin S. М. , Gnedoj S.N. , Chernyuk N.N. , Soldatov N. M. 1,4-Dlhydropyridine receptor assoqiated With calcium channals in human embryonic fibroblasts. - FEBS Lett., 1988, v. 233, N. 2, p. 352-354.

5. Gnedoj S. N. , Chernyuk N. N. , Dudkin S. M. , Soldatov N. M. Proliferation of human embryonic fibroblasts and the receptor of dihydropyrldine calcium entry blokers. -14-th International Congress of biochemistry, Prague, 1988, Abstracts, v. IV, p. 201.

6. Дудкин С. M. , Солдатов Е М. , Чернюк Е Н. , Британова И. А. Факторы роста и регуляторные . системы клеток. - В сб.: Внутриклеточная сигнализация, М. , Наука, 1988, с. 171176.

- 21 - •

7. Дудкин 0. М. , Гнедой С. а , Чернюк Е Е , Солдатов Е Ы. Рецептор дигидропиридииовых блокаторов входа кальция в эмбриональных фибробластах человека. - Цитология,1989, т. 31, N.3, с. 312-318.

8. Чернюк Я Е , Почечуева Т. а , Гнедой С. Е , Солдатов Е М. тов Е 11, Дудкин С. М. Пластичность кальциевых каналов Ь-типа, как молекулярная основа формирования клеточной памяти. - 10 Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР, Механизмы регуляции клеточной активности, тезисы докладов, Мзсква, 1989, с. 91.

Подписано в печать 27,12.91. Заказ 505 Формат 60x90/16 Tapas 100

Мосгаа. Типография ВАС2Ш