Роль дигидропиридинчувствительных Ca-каналов L-типа в фармакологическом действии ноотропных препаратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

институт биоорганической химии и нефтехимии академии наук украины

на правах рукописи ПОЛЕВ ПАВЕЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК:615.214.31.036 ГОЛЬ ДИГИДРОПИРИДШЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ Са-КАЛАЯОВ

ь-типа з фармакологической действий ноотроп-ных препаратов ■ ;

02.00.10 - Бнеорганическая темня,химия природная и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание учеиоа степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии клетки

Научно-производственного центра медицинской биотехнологии Минздрава СССР

. Научный руководитель: кандидат химических наук,

Дудкин С.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор. Курский М.Д. кандидат биологических наук, Скрша Р.М.

Ведущая организация - Институт общей патологии и патологической Физиологии АМН СССР

Запита диссертации состоится "28" февраля 1992 г. в — ч на заседании специализированного совета Д 016.65.01 в Институте биоорганической химии и нефтехимии АН Украины по адресу: 353160, г.Киев, Харьковское в., 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биооганическоя химии и нефтехимии АН Украины.

Автореферат разослан "—" января 1992г.

Ученая секретарь специализированного совета Д 016.65.01

Федоряк Д.М.

-1-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Ноотропные препараты широко применяются как в практике общего здравоохранения для предотвращения возрастных нарушения интеллектуальной деятельности, так и в специальной медицине для улучшения операторской деятельности. Механизм фармакологического эффекта ноотропов и биохимическая мишень их действия в настоящее время не ясны, что является серьезным препятствием для создания новых высокоэффективных препаратов этой группы.

Одним й^ характерных признаков старения и связанных с ним нарушениями памяти и обучения служат изменения в регуляторной системе кальция (Lanfield P.W. et al., 1986).Так, например,известно, что старение сопровождается уменьшением плотности по-тенциалозависимых, дигидропиридинчувствительных Са-каналов в ассоциативных зонах коры мозга (Govoni S. et al., 1985). В последние годы к ролй Са-каналов, как и'самого кальция, в про- . цессах Формирования памяти и обучения привлечено особое внимание исследователей, что связано также с успешным практичес-. ким применением . блокаторов Са - каналов при различных патологических состояниях (Glossnarm J., Striessing П., 1988). Исследование роли Са-каналйв в механизма фармакологического действия ноотропов является актуальной задачей, 'имеющей важное значение как для понимания молекулярных механизмов формирования и сохранения долговременной памяти, так и для целей практического здравоохранения. .

НЕЙ. РАБОТЫ. Целыо настояаей работы явилось изучение влиянии ноотропных препаратов, активатора BAY К 8644 к блокаторов Са-каналов, раздельного и совместного, на уровень дигидропиридинчувствительных Са-каналов в коре головного мозга крыс, а

также их действия в простых моделях обучения и памяти.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ. В задачи исследования входило:

- разработка методики определения плотности рецепторов производных 1,4-дигидропиридина, ассоциированных с Са-каналами L'-типа, в синаптосомальных мембранах коры головного мозга крыс с помощью радиолигандного связывания;

- исследование влияния на плотность рецепторов пирацетама и оксирацетама;

■ - сравнительная оценка изменения плотности рецепторов под действием различных аналогов глицина;

- изучение влияния на уровень рецепторов антагонистов Са--каналов L-типа., а также агониста BAY К 8644 в отсутствие и в присутствии ноотропов;

- исследование действия антагонистов и их сочетаний с но-отропами на феномен запоминания в пассивной реакции избегания.

НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые показано, что в мозге существует ноотропочувствительный механизм, регулирующий биосинтез Са-каналов L-типа. Соединения, обладающие ноотропной активностью, активируют этот механизм и вызывают увеличение содержания Са-каналов в коре мозга, достигающее 200-250% для наиболее эффективных препаратов. Блокаторы Са-каналов, широко использующиеся для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, вызывают обратный эффект, который может быть снят при их совместном введении с ноотропами. Обнаруженные молекулярные эффекты подтверждены при исследовании действия ноотропов и бло- ' каторов на поведение животных в простых моделях памяти и обучения.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Данная работа выполнялась в связи с плановыми заданиями ШШМБ Минздрава СССР,

а также в рамках программы АН СССР "Внутриклеточный сигнал". Результаты данного исследования важны для практического здравоохранения ввиду широкой распространенности (¿локаторов Са-каналов L типа, использующихся для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, особенно для людей, связанных с операторской деятельностью.

АПРОБАЦИЯ. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме " Сигнальные молекулы и механизм поведения животных"(Пущино,июль 1989),Х Обьединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР " Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, сентябрь 1989), "X Конференции молодых ученых " Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, декабрь 1989!, VII Советско -итальянско« симпозиуме по неЯропсихофаЬмакологии (Ленинград,октябрь 1990), ÍII Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев; декабрь .1990). :

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов исследования,, результатов собственных экспериментальных данных и их обсуждения, основных выводов и списка литературы.,

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 127 источников.

1. Определение плотности рецепторов 1,4-дигидропиридина' в коре головного мозга крыс. Рецепторы 1,4-дигидропиридина являются составной частью Са-каналов L-Tima, что однозначно подтверждается данными по идентификации полноценных каналов в искусственных мембранах, содержащих реконструированные очищенные рецепторы ДГП

(Поскегг! еЬ а1., 1986). Определение содержания ДГП-рецепто-Ров проводили в синаптосомалъных мембранах, выделенных из коры головного мозга крыс, так как эта ткань наряду с гиппокампом наиболее обогащена содержанием рецепторов 1,4-дигидропиридина. В работе использовали крыс самцов линии "Вистар" массой 200-250 г. Плотность рецепторов измеряли с помощью радиоактив-номеченного зонда [3Н] ПМД, (60 Ки/мМ ), синтезированного в НПЦМБ Минздрава СССР совместно с НОС АН ЛагвССР и ИМГ АН СССР (БЬеусЬепко е1 а1., 1989). Это соединение является аналогом риодипина ("Форидона"), синтезированного ранее в ИОС АН Латв

250 500 750 В (фмоль/мг)

Рис.2. Зависимость связывания [3Н ] ПНД с синаптосомаяьными мембранами коры мозга крысы от концентрации лиган-да в координатах Скэтчарда ; -Вмакс. 500 фмоль/мг мембранного белка, Кдисс. 1,2 нмоля

ССР и использующегося в клинике для лечения сердечно-сосудис-тьи заболеваний (рис.2).

Связывание зонда проводили при 20°С в буферном растворе 20 мМ трис-НСЬ; рН 7,35, содержащем для оптимизации связывания 1 мМ СаС1,2 и 20 мМ О-цис-дилтиазем. Концентрация мембранного белка составляла 0,1 мг/мл и соответствовала линейному диапазону кривой зависимости связывания зонда от концентрации белка в пробе. Для определения неспецифического связывания в пробы добавляли микромолярный избыток нитрендипина или риодипина. Специальным экспериментом было установлено, что оба блокатора аналогичным оираэом вытесняют зонд из специфических центров связывания, что указывает на идентичность определяемых рецепторов рецепторам ДГП, связанным с Са-каналом Ь-тила.

Исследование синаптосомальных мембран головного мозга крыспоказало, что они содержат один класс невзаимодействующих

г -

ДГП-рецепторов с константой диссоциации^ 1,2 нН и максимальным связыванием 500 фмоль/мг мембранного белка для используемого зонда [3Н ] ПМД (рис.2). Близкие значения параметров связывания ( Кдисс. 2,7 нМ; Емакс. 6080 фмоль /мг) были получены для мембран скелетных мьигц крыс , что также подтверждает правомерность применения [3Н ] ШЩ'для определения плотности ДГП -рецепторов, ассоциированных с Са-каналами Ь-типа в мембранах коры головного коэга. . . .

2. Влияние производных 2-пирролидона на плотность ДГП . -рецепторов в коре головного мозга крыс.

Ноотропные препараты группы 2-пирролидона, наиболее известными представителями которой являются оксирацетам и де-зокси аналог'-пирацетам вызывают стимуляцию метаболизма фосфо-липидов, белков и глюкозы в иоэге, увеличивают синтез ацетил-

холина и /или высокоспецифический захват холина, вызывают увеличение плотности мускариновых рецепторов в коре мозга старых крыс (Сатги еЬ а!., 1989). В то же время известно, что каналы Ь-типа, хотя бы отчасти, вовлечены в модуляцию Са-зависи-мого оборота ацетилхолина (ЫогБЬгога е1 а1., 1986) и, кроме того, показано, что при старении плотность и чувствительность к кальцию ДГП-связывающих центров мозга уменьшается (Соуоп1 е1 а1., 1985). Исследование влияния пирацетама и оксирацетама на В макс.(фмоль/мг)

1000

750

. 500 -----

250 . —

1 6. 1 2 3 4 5 6 Дни Рис.3. Влияние повторного введения пирацетама на уровень ' ДГП - рецепторов в коре мозга крыс . Данные получены в результате анализа зависимости связывания [3Н ] НМД с мембранами от концентрации лиганда. - контроль; Г" I - пирацетам - 100 мг/кг.

плЬтность ДГП-рецепторов в коре головного мозга крыс показало, что при ежедневном йнтраперитолиальном введении в дозе 100 мг/ кг оба ноотропа вызывают медленное, но заметное увеличение в максимальной способности мембран синаптосом связывать- раДкоак-тивкомеченный зоид, достигающей максимума на третий день эксперимента и в дальнейшем не изменяющейся (рис.3). В случае пи-

Таблица 1.

Зависимость уровня ДГП-рецепторов в коре иоэга хрыс.. от дозы нотропов . ■

ДО 39 , Дня 2 мзке. (йколъ/мг) К лисс. (нколЫ

мг/кг

Контроль ■ ■' •

3 498+/-38 » Пираоетам- ьз (1,0-1,61*

100 3 1037+/-65 ■ 1,9 (1.3-3,9)

10 3 1069+/-43 1,2 (1,0-1,4)

1 3 1,? (1,4-2.5)

0,1 3 42б+/-79 Оксйрацетам 2.0 (1,1-3,9)

100 '3 И17+/-18 1,0 (0,4-1,5)

10 3 1360+/-72 1,9 (1,6-2.4)

1 3 567+/-31 1,6 (1,4-2,0)

0,1 . з. 6Ш+/-49 1,7 (1,3-3,6)

* - соответствует доверительному интервалу 95*. рацетама, содержание рецепторов меняется от 550 Фмоль/мг менбранного белка до 1050 Фмояь/мг , в то время как стационар-

нШ1 уровень Вмакс. для оксирацетама достоверно его превшает, достигая 1400 фмоль/мг, что согласуется с более высокой фармакологической активностью последнего. При этом не наблюдается существенных изменения в сродстве рецепторов к зонду (табл.1).

2 4 6 8 10 Дни

Рис. 4. Пролонгирующий эффект оксирацетама на плотность ДГП-рецепторов. Данные получены в результате анализа зависимости связывания [3Н ] ПНД с мембранами от концентрации лиганда. что свидетельствует о том, что вновь появляющиеся центры связывания обладают тени же свойствами, что и существовавшие до введения препаратов. Влияние ноотропов на содержание ДГП-рецепторов является тканеспецифичным, так как они не влияют на связывание-зонда как с синаптосомами выделенными из це-

лостного мозга, так и с микросомами из скелетных. мъшц.

Исследование зависимости увеличения В макс, от дозы ноот-ропов показало, что ежедневное введение препаратов д дозах 0,1 и 1 мг/кг практически не влияет на плотность рецепторов, в то время как в дозе 10 мг/кг наблюдаемый эффект аналогичен полученному при использовании дозы 100 мг/кг как для пирацетама, так и для оксирацетама (табл.1).

Полученные результаты показывают, что уровень ДГП- рецепторов в коре головного мозга увеличивается под действием поот-ропов с временными параметрами, соответствующими биосинтезу белка.

Известно, что оба препарата не метаболизирувтея в организме и время их полужизни в мозге не превышает 300 ми11 (Н1со1аиз, 1982). Мы исследовали длительность наблюдаемого эффекта увеличения плотности ДГП-рецепторов под действием одного из наиболее эффективных ноотропов '- оксирацетама. С этой целью крысам в течении трех дней вводили препарат в дозе 10 мг /кг, после чего инъекции прекращали. Измерения связывания зонда проводили ежедневно в течение 10 дней (рис.4). Как видно из рисунка, оксирацетам обладает "пролонгированностьч" действия, так как вызванное с его помощью стационарное увеличение плотности ДГП-рецепторов поддерживается на том же уровне в течение 4 дней, то есть заведомо дольше присутствия ноотропэ в мозге даже в следовых количествах. Обращает на себя внимание тот факт, что последующее изменение концентрации до исходного уровня полностью проходит за последующие сутки.

Приведенные данные позволяют заключить, что г мозге существует ноотропочувствительннй механизм,регулирующий биосинтез ДГП -рецепторов, ассоциированных с Са-к.зналами 1,-типа.

.,,..-■... -10-

Производные 2- пирролидона активируют этот механизм и вызывают увеличение содержания ДГП-чувствительньх Са-каналов в коре головного мозга, достигающего максимального 2-2,5-кратного уровня при дозах препаратов 10 иг/кг и выше. ' Наблюдаемая пластичность системы ДГП-рецепторрв, ассоциированных с Са-ка-налами, находится в соответствии с улучшением когнитивных , функция мозга, происходящими в результате действия ноотропов.

3. Влияние аналогов.глицина на плотность ДГП-рецепторов в ' коре головного мозга крыс.

Известно, что "классическими" свойствами ноотропов - способность» защищать от электроконвульсивного шока и пшохсин. обладают,также соединения, не принадлежащие к группе 2-пирро-: лидона fGamzu et al., 1989), Ранее было показано, что в соответствии с этими критериями эффективными ноотропными свойствами обладают производные глицина К-ацетилглицилаиид (Наумова и др., 1989) и диамид 2,2-(2,5 - диоксопиперазинил- -1,J)диуксус-¡юп кислоты (Налнии и др., 1990) ). В тоже время N -ацетилгли-цин,глициламид и М-ацетил-альФа-и-бета-алаш:яампд эти свойства не проявляют.

Исследование влияния перечисленных аналогов глицина на плот* пость■ДГП-рецепторов в коре головного коэга крис показало, что они увеличивают число центров связывания радиодктивномечепного зонда в полном соответствии с проявляемыми ноопюшшми свойствами 'табл.2). Соединения з в i при ежедневном штраперитоие-альком введении крысам подобно производили З-пирюлидока вызывает медленное, но заметное увеличение в максимальной способности мембран сииаптосои, получении» чз пори мозга,связывать [3Н] ПМД {рис.5,6). При этом содержание йГП-рецептор-ся меняется от 550 до tlOO фмояь/мг неибрагагого «wa, а взно-

нениЯ в сродстве рецепторов к зонду практически не наблюдается ( Кдисс. 1,2-1,9 нМ)', что свидетельствует о том, что вновь по-

Табдица 2.

Изменение плотности ДГП-рецепторов при повторном введении ноотропов и производных глицина

N Наименование В макс., К дисс..

п/п препарата* фмоль/мг белка нмоль

1. 2-оксопирролидинил- 1075+/-33 ■ 2 1(1,8-2,5)

Анлтвимп

2. 4-окси-2-оксопирроЛи- 1417+/-175 1,0(0,4-1,5)

дии илацетамид

3. М-аиетилглициламид 1175+/-54 1,5(1,2-1.8)

4. Диамид 2,2-(2,5-диок- 1036+/-86 .1 7(1,4-2,5)

сопипера зинил-1,4)ди-

уксусной кислоты ,

5. Я-ацетилглицин 500+/-39 ; ;1 ,8(1,5-2.0)

6. Глициламид. 510+/-59 1 6(1,2-1,8)

7. Н-ацетил-альфа-аланиламид 450+/-80 1 2(1,2-1,7)

8. Л-ацетил-бета-аланиламид 495+/-20 1 6(0,9-2,1)

9. Глицин 548+/-48 1 ,8(1,4-2,5)

» - доза препаратов 100 мг/кг веса »«'- соответствует доверительному интервалу 95*. являющиеся центры связывания обладают теми же свойствами, что и существовавшие до введения препаратов.Наблюдаемое увеличение Вмакс. аналогично таковому для пирзцетама, однако в отличие от последнего , максимум увеличения плотности рецепторов при вве-

В макс.(фмоль/мг)

1000

500

, 0

0, 1мг

контроль гЗг] гЗгп гЗг

1мг 100мг

Юмг г!

Ъ л

3 9 6 9 3 6 9 3 6 9 3 6 9 Дни Рис. 5. Действие Н-ацетилглициламида на плотность ДГП-ре-цепторов в коре мозга крыс рецепторов. Данные получение результате анализа зависимости связывания [3Н ] НМД с мембранами от концентрации лиганда. дении соединений 3 и 4 наблюдается на шестой день эксперимента. При этом эффективная доза соед.4 аналогична таковой для пирацетама и составляет 10 мг/кг в то время как соединение 3 проявляет максимальную активность в дозе на порядок ниже.

Влияние этих соединений на уровень ДГП-рецепторов является специфическим, так как введение крысам соед. 5-8 и глицина (9) в дозе 100 мг/кг на протяжении 9 дней на урорне рецепторов

практически на сказывается. В макс.(фмоль/мг)

1500

1000

500

Юмг

100мг

// гЬ

// гЗ- //

// // // //

// // // п

// // // //

контроль 1мг // // г£- п //

г т т т т Т // // п п '//

1 1 1 тг

— — и // // // // // и // //

— — // // // // // // // // и

— — // // // // п // // // //

-- -- // // // // п // // // И

3 9,369 369 369 Дни Рис.6. Действие диамида 2,2-(2,5-диоксопиперазкнил-1,«) диуксусной кислоты на плотность ДГП-рецепторов в коре мозга крыс. Данные получены в результате анализа зависимости связывания [3Н ] ПМД с мембранами от концентрации лиганда.

Исследование совместного введения оксирацетама и И--аце-тилглициламида при фармакологически эффективных и не эффективных дозах на изменение плотности рецепторов дигидропиридина, показано их 'синергическое действие на эту мишень мозга, при этом значительно ускорялась динамика изменения концентрации

рецепюра в случае замещенного глицина (рис.7), как это было показано вше, и максимальная плотность достигалась уже на

Рис. 7. Влияние совместного введения оксирацетама и Н-ацетилглициламида на плотность ДТП-рецептора в коре мозга крыс; 1+1 иг/кг соответственно, -о- 10+0,1 мг/кг, — контроль третий день эксперимента.

Сравнение полученных результатов с данными, приведенными в разделе 3, показывает, что способность увеличивать плотность ДГП-чувствительньх Са-каналов, по-видимому, является характерным свойством соединений, обладающих ноотропной активностью, в независимости от • их строения. Альтернативным предположением

может бить существование в мозге специфических рецепторов N-ацетилглициламида, связывающих производные 2-пирролидона, однако до настоящего времени рецепторы пирацетама и оксираце-тама в мозге не обнаружены.

4. Ноотропы и блокаторы Са-каналов L-типа оказывают противоположное влияние на плотность ДГП-рецепторов в коре головного мозга крыс.

Блокаторы Са-каналов L-типа широко используются в клинической практике для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Наибольшее распространение получили три основные группы блокаторов: производные. ' 4-зрия-1,4-дигидропиридина (нитрендипин, нифедипин, риодипин и др.),Фенилаякилакина (верапамил, D-600) и тиобензазепина (D-цис-дилтиазем). Эти соединения проникают через геиатоэнцефалический барьер и взаимодействуют со специфическими центрами связывания, которыми наиболее обогащены си-наптическ'ие контакты в коре и гиппокампе. Было показано, что ежедневное введение мышам нифедипина и верапамила в дозе 270-280 мг/кг в течение 28 дней приводит к уменьшению плотности ДГП-рецепторов в мембранах головного мозга и уменьшает захват кальция, стимулируемый вератридином, в срезах мозга (Panza et al.,1985). Дилтиазем в дозе 380 мг/кг подобных эффектов не оказывал.

Исследование влияния риодипина, верапамила и дилтиазема на уровень ДГП- рецепторов в мембранах коры головного мозга крыс показало, что однократное интраперитониальное введение блокаторов в дозе 10 мг/кг вызывает через 24 ч почти двухкратное уменьшение плотности рецепторов без существенных изменений в Кдисс.(рис.8,9,10).Последующее ежедневное введение блокаторов приводит к медленному обращению эффекта, в результате чего

уровень ДГП-рецепторов достигает исходного или даже более высокого на 3-4 день эксперимента, в дальнейшие 3 дня практически не изменяясь. При этом в случае риодипина увеличение плотности рецепторов на 4 день введения достигает 28 * от исходного. Исследование зависимости наблюдаемых эффектов от дозы пос-

1 2 3 4 Дни

Рис. 8. Влияние риодипина (1Л мг/кг) и оксирацетама (Юмг/кг) на уровень ДГП- рецепторов. Данные получены в результате анализа зависимости связывания [3Н] ПМД от концентрации лиганда в координатах Скэтчарда. леднего показало, что в дозе 1 мг/кг риодипин оказывает существенно меньшее отрицательное влияние на уровень рецепторов.

Полученные данные показывают что уже однократное введение блокаторов Са-каналов Ь-типа в дозах сопоставимых с ис-

пользуемыми в клинической практике, вызывает заметное уменьшение уровня ДГП-рецепторов в независимости от характера | В макс.(фмоль/мг) 7501-

500

250 |.

-•- дилтиазем

-о- дилтиазем+оксирацетам

01-

— контроль

_I_

1 2 3 4. Дни

Рис. 9. Влияние дилтиазема (10 мг/кг) и оксирацетама (10мг/кг) на уровень ДГП- рецепторов. Данные получены в результате анализа зависимости связывания [3Н] ПНД от концентрации лиганда в координатах Скэтчарда. связывания блоКаторов с молекулой канала. Иными словами, в случае антагонистов Са-канала наблюдается эффект противоположный описанному вше для соединений, обладающих ноотропной активностью. Исследование влияния на этот эффект ноотропов на примере оксирацетама показало, что при одновременном введении с блокаторами оксирацетама в дозе 10 мг/кг уменьшения плотности ДГП-рецепторов не наблюдается (рис.8,9,10). В случае ве-

рапамила (рис.10) величина Вмакс. даже незначительно, но достоверно увеличивается.

1 2 . 3 ;А ДНИ

Рис.10. Влияние верапамила (10 мг/кг:) и оксирацетама ■ (Юмг/кг) на уровень .ДГП- рецейТоров.. Данные получены в результате ана'лиаа .Зависимости связывания i3H) Т1Щ от концентраций; лйганда в координата^ СКэтчарда.

Примечательным является тот Факт, что однократное введение производного 1,4-дигидропиридина, являющегося агонистом Са -каналов L-типа, BAY К 8644 в дозе 0,1 мг/кг через 24 ч после

йнъекции приводит к 250* увеличению плотности ДГН-рецеигорой

Дни

Лис.11 .Влияний BAY К 8644 (0,1. мг/кг) .оксирацетама (10 мг/кг) и П-ац<гтияглкцилзмида (10 иг/кг) на уровень ДГП-ррце-пторов в кор» мозга крыс, баз азмг-нття в Кдисс., то рсть к эффекту обратному внтагснис-Т1К Са-каил.чя (рлг .11.) . Сопнрстное г,е продг>ш;|» вгонит о

этой эффективной дозе с оксирацетамом и Л-ацетилглициламидом приводит к сглаживанию спонтанного роста рецепторов,причем замещенный глицин полностью подавляет этот эффект.

Из представленных результатов следует, что транзиторное уменьшение или увеличение плотности Са-каналов в коре головного мозга, вызываемое антагонистами или агонистами канала, может быть предотвращено ноотропными препаратами.

5. Участие ДГП-чувствительных Са-каналов в психотропном эффекте ноотропов.

Характерным свойством ноотропных препаратов является их способность действовать на когнитивные функции мозга, улучшая обучаемость и сохранение памятного следа. Используя данные, полученные при выявлении влияния ноотропов и блокаторов Са-ка-налов на уровень рецепторов в коре мозга, на простых моделях памяти и обучения была изучена корреляция между изменениями в поведении и уровнем ДГП-рецепторов. В опытах на беспородных мышах и крысах линии " Вистар" оценивали способность блокаторов Са-каналов различной структуры влиять на феномен запоминания в пассивной реакции избегания. С этой целью использовали метод выработки условной реакции пассивного избегания (УРПИ) описанный в работе (Наумова и др., . 1989). В опытах регистрировали латентный период первого схода с площадки, а также количество животных в группе, достигших критерия обученности (5 мин пребывания на безопасной площадке через 24 ч после начального обучения). Введение препаратов за 1 ч до начального обучения в дозе 10 мг/кг, интраперитониально, приводило к достоверному уменьыенкю величины латентного периода реакции избегания и числа мыией в группе, достигающих критерия обученности через 24 ч после начального обучения (табл.3). Из таблицы.видно, что

риодишш, верапамил и днлтиазек, связывающиеся в различных участках молекулы Са-канала, обладают близким эффектом. Этот Факт с большой степенью достоверности позволяет предположить, что наблюдаемое при введении блокаторов Са - каналов ухудшение воспроизведения обучения в рассматриваемой модели связано с их непосредственным инактивирующим действием на ДГП -чувствительные Са-каналы. Дополнительное подтверждение сделанному предположению было получено при введении дилтиазема непосредственно после обучения мышей. Из табл.3 видно, что в этом случае бло-

Таблица 3.

Особенности влияния олокаторов кальциевых каналов ( 10 мг (на воспроизведение обучения в реакции пассивного избегания

Препараты Условия введения Латентный период,(с) Кол-во мыщей с критерием обуч.5мин1%)

Исходный Через 24ч

Контроль 1ч до 12+/-2 215+/-30 50

обучения

Риодипин 9+/-1 108+/-11* 11

Нифедипин 7 + /-3 163+/'- 5 33

Циннаризин 7 + /-3 205+/- 6 44

Верапамил 7 + /-2 112+/-Н» 22

Дилтиаэем 9+/-2 107+/- 4 ,25

Дилтиаэ°м после 8 + /-3 183+/-15 '40 |

обучения I

* - р< 0,05

катор практически не влияет на измеряемые параметры и, следовательно, нарушение памяти наблюдается лишь в том случае, когда начальное обучение происходит на фоне блокады Са-каналов.

Таблица 4.

Влияние дилтиазема и ноотропов на латентный период реакции избегания при повторном введении

Препараты

Д ни введения

Я а т е н т н ы й и е р и о д (с)

Контроль Дилтиазем Дилтиазем + пирацетам

Ныаи

6+/-1 60+/-6 109+/-11 77+/-8 183+/-12

9+/-3 34+/—3* 9+/-3* 16+/-4» 56+/-12

8+/-1 10+/-5 205+/-11 119+/-Ц 258+/- 4

Крысы

Контроль 7+/-3 60+/- 6 121+/- 7 61+/- 3 131+/-12

Дилтиазем Э+/-4 60+/-23 15+/- 3* 21+/- 3* 121+/- 6 Дилтиазем

+ оксирацетам 8+/-3 131+/-11 200+/-12 300+/- 8 140+/-Э1

1

2

3

4

О

* - Р< 0,05

С целью более подробного изучения обнаруженного эффекта блокаторов на процессы обучения и воспроизведения ми исследовали эффект повторного введения дилтиазема (Ю мг/кг) в тече-

нии 4 дней, измеряя величину латентного периода реакции избегания ежедневно через 1 ч после введения блокатЪра (табл.4). Дилтиазем иироко используется в клинической практике, водорастворим и легко проникает через гематоэнцефалический барьер. Оказалось, что как и при однократном введении, дилтиазем вызывает у обеих групп животных отчетливое нарушение воспроизведения в тесте УРПИ. Однако, если животным, пройедшим обучение на joue дилтиазема, непосредственно после обучения вводили пира-цетам или оксирацетам в дозе 100 мг/кг то наблюдалась отчетливая коррекция ингибируюиего действия блокатора и в большинстве случаев величина латентного периода в течение всех 4 дней превышала таковую для контрольных групп (табл.4). Полученные цанные показывают, . что пирацетам и оксирацетам, эффективно :тимулирушие память и обучение животных в используемой модели (Наумова и др., 1989).проявляют выраженный антагонизм по отно-1ению к ингибирующему действию блокатора.

По-видимому, можно предположить,что антагонизм, наблюдае-<ый в действии блокаторов. и ноотропов на обучение и воспроиз-зедение, может опосредоваться их влиянием на биосинтез Са-ка-1алов L-типа. Возможно, что наблюдаемая в наших экспериментах шастичность содержания каналов этого типа в плазматических шмбранах коры головного мозга является одним из важных :войст'в регуляторной системы кальция, определяющих формирова-ше памяти и, как следствие, положительный эффект ноотропных ¡репаратов при нарушениях интеллектуальной деятельности. Кроме ■ого, результаты данного исследования имеют и принципиальное фактическое значение ввиду широкого распространения блокато-юв Са-канала для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, ¡собенно для людей, связанных с операторской деятельностью.

-246. ВЫВОДЫ

1. Применение нового радиоактивномеченного зонда [3Н] ПНД и модифицированной методики радиолигандного связывания позволило определить, что синаптосомальные мембраны коры мозга крыс содержат один класс невзаимодействующих рецепторов производных 1,4-дигидропиридина, ассоциированных с Са-каналами 1,-типа, с плотностью рецепторов 500+/-50 Фмоль/мг мембранного белка.

2. Ноотропные препараты группы 2-пирролидона, пирацетам и оксирацетам, при ежедневном введение увеличивают уровень ДГП-рецепторов в коре мозга в 2 и 2,5 раза без существенных изменений в Кдисс., с временными параметрами,соответствующими биосинтезу белка. Эффект является тканеспецифичным и достигает максимума на 3 день введения в дозе 10 мг/кг для обоих препаратов.

3. Действие ноотропов на плотность ДГП-рецепторов является "пролонгированным". Повышенный уровень содержания рецепторов сохраняется в течение 4 дней после прекращения введения оксирацетама в дозе 10 мг/кг.

4. Аналоги глицина, обладающие ноотропной активностью: И-ацетилглициламид и диамид 2,2-( 2,5-диоксопиперазинил-1,4 ) ди-уксусной кислоты, увеличивают плотность ДГП-рецепторов до уровня характерного для действия пирацетама. При этом эффективной дозой Л-ацетилглициламида является 1 мг/кг, что на порядок меньше доз производных 2-пирролидона. Производные глицина, не проявляющие ноотропную активность. на уровень рецепторов не влияют. Оксирацетам и Я-ацетилглициламид обладают синергизмом на динамику биосинтеза рецепторов в дозах, являющимися не эффективными при раздельном введение.

5. Блокаторы Са - каналов Ь-типа: риодипин,верапамил,дил-

тиазем, з дозе 10 «г/кг через 24 ч после введения уменьшают в 2 раза плотность ДГП-рецепторов в коре головного" мозга,без существенных изменения в Кдисс.. Последующее ежедневное введение приводит к медленному обращению эффекта.Агонист Са-каналов BAY К 8644 в дозе 0,1 мг/кг вызывает противоположный эффект.Окси-рацетам полностью снимает отрицательное действие блокаторов, а М-ацетилглициламид влияние агониста на увеличение рецепторов.

6. Показано, что блокаторы Са-каналов вызывают существенное ухудшение воспроизведения памятного следа в модели пассивной реакции избегания. При этом, ноотропы проявляют выраженный антагонизм по отношения к ингибирующему действию блокаторов.

7. Обнаруженная пластичность содержания ДГП -рецепторов, ассоциированных с Са-каналами L-типа.в коре головного мозга крыс по-видимому,является одним из важных свойств регу-ляторной системы кальция,определяющий формирование долговременной памяти и, как следствие,положительный эффект ноотропов при нарушениях интелектуальной деятельности..

8. Ввиду широкого распространения блокаторов Са-каналов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний может быть рекомендовано их совместное применение с ноотропами,особенно для людей, связанных с операторской деятельностью.

Список работ, опубликованных по.теме диссертации:

1. Yu.G.Bobkov, S.M.Dudkin, P.V.Polev, Yu.I.Bashnin and N.H.Soldatov. Relationship bitueen behavioral effects of nootropic drugs and dihydropyridine receptors associated with calcium channels in rat cerebral cortex.Int.Symposium "Signal Molecules and Mechanises of Animal Bechavior". Pushino,1989,s. 20.

2. П.В.Полев? Ю.Г.Бобков, H.М.Солдятов. С.М.Дудкин. Про-

цессы Формирования памяти связаны с биосинтезом дигидропири-динчувствительных кальциевых каналов. X Объединен ный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР " Механизмы регуляции клеточной актив ности".Тезисы докладов. Ташкент,1989,с.61.

3. П.В.Полев. Эффект ноотропных препаратов связан с ди-гидропиридинчувствительными кальциевыми каналами.X Конференция молодых ученых " Синтез и исследование биологически активных соедине ниа".Тезисы докладов,Рига,1989,с.Ю4.

4. В.И.Наумова, И.Н.Крылова, Ю.В.Дрозд, П.В.Полев, Ю.И.Башнин,С.М.Дудкин, В.В.Яснецов. Сравнительное влияние ноотропных препаратов на эметический эффект морфина.Бюлл.Зкспер. Биол.Мед.,1989,N6, с.711-713.

5. В.И.Башнин, С.М.Дудкин, Ю.Г.БОбков, Г.Н.Кожухарь, Е.А. Вальдман, П.В.Полев.Новый диамид 2,2-( 2,5-диоксопиперази-нил-1,4) диуксусной кислоты, обладающий антигипоксантной активностью и улучшающий воспроизведение условного рефлекса у животных. Авторское свидетельство N 1651527, приоритет 11.89.

6. S.M.Dudkln, P.V.Polev and N.M.Sgldatov.Calcium entry blockers and oxiracetam oppositely affect dihydropyridihe receptors den slty In rat brain cerebral cortex. Brain Res.,525,1990,319-321

7. Ю.Г.Бобков, П.В.Полев, А.И.Мачула, E.А.Вальдман, Н.М.Солдатов, С.М.Дудкин. Участие дигидропиридинчувствительных Са-каналов в психотропном Эффекте ноотропных препаратов. Бюлл. Эксп.Биол. Мед. ,1990, НЮ, С. 386-389.

8. П.В.Полев, Ю.И.Башнин, В.И.Наумова, .А.И.Мачула, Г.Н.Кожухарь, Ю.Г.Бобков, С.М.Дудкин. Ноотропные свойства М-ацетилглициламида. Бюлл.Эксп.Биол.Мед.',1990, (в печати).

9. А.И. Мачула, П.В. Полев, Е.А. Вальдман, .С..М. Дудкин.'

Дигидропиридинчувствительные Са-канады участвуют в формировании долговременной памяти . VII Советско - итальянский симпозиум по нейропсихофармакояогии . Тезисы докладов . Ленинград, 1990,с.36.

10. С.М. Дудкин, П.В. Полев, D.H. Башнин, Е.А.Вальдман, Ю.Г.Бобков. -Роль Ca - каналов в процессах формирования памяти и обучения. III Всесоюзная конференция по нейронаукам. Тезисы докладов. Киев,1990,с.18.

Подписано в печать' ¿7.12.91. Заказ 504 0oprm60i9ü/I6 Тираж 100

Москва. Типография ВАСХШЭД