Исследование роли парамагнитных интермедиатов в биологически важных процессах методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

/

На правах рукописи

Поляков Николай Эдуардович

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ПАРАМАГНИТНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ПРОЦЕССАХ МЕТОДАМИ СПИНОВОЙ ХИМИИ И ХИМИЧЕСКОЙ РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

□□3476538

Новосибирск - 2009

003476538

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор, Берлинский Виталий Львович

Ведущая организация: Институт «Международный томографический центр» СО РАН

Защита состоится "21" октября 2009 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 003,014.01 при Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХКГ СО РАН. Автореферат разостлан июля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук, Володин Александр Михайлович,

доктор химических наук, Анисимов Олег Александрович

Д.х.н.

А. А. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Диссертационная работа посвящена исследованию современными физическими методами короткоживущих парамагнитных интермедиатов, образующихся в процессах с участием биологически важных молекул в растворах и организованных средах.

Актуальность работы связана как с объектами исследования, поскольку парамагнитные частицы в биологических системах находятся в зоне пристального внимания, так и с полученными результатами, дающими ответы на ряд вопросов важных сегодня для физической органической химии, биохимии, фармакологии и медицины. В работе на примерах модельных фотоиндуцированных реакций исследованы детальные механизмы окислительно-восстановительных превращений биологически важных соединений, или их аналогов. Прежде всего, это - процессы с участием синтетических аналогов ЫАОН - 1,4-дигидропиридинов, и природных полиенов, включая каротиноиды, в растворах и организованных средах. На основании проведенных методом химической поляризации ядер (ХПЯ) исследований можно считать установленной роль одноэлектронного переноса в трансформации дигидропиридинового цикла в пиридиновый, а также в процессах цис-транс фотоизомеризации природных полиенов. В частности, изучение свойств ион-радикалов природных полиенов в настоящее время приобретает особую актуальность, поскольку они входят в состав многих биологических систем, для цис-транс изомеризации которых предполагаются процессы с переносом заряда. Так, например, в диссертации обнаружены ион-радикальные стадии цис-транс изомеризации ретиналя, входящего в состав зрительного пигмента родопсина. Считается, что именно цис-транс изомеризация инициирует процесс зрительного восприятия в глазу человека и других млекопитающих.

Значительный интерес представляют и радикальные процессы с участием каротиноидов - широко распространенного класса природных пигментов. Они синтезируются растениями и микроорганизмами и

)

присутствуют во многих пищевых продуктах, включая овощи, фрукты и рыбу. В большинстве природных процессов, включая фотосинтез, их роль чаще всего связывают с реакциями переноса энергии и электрона. В медицине интерес к каротиноидам связан, прежде всего, с их антиоксидантными свойствами. Сегодня антиоксиданты, и в частности каротиноиды, используются на практике в комплексном лечении таких серьезных заболеваний как рак, болезни сердца, нервной системы, а также возрастные дегенеративные изменения мышечных тканей. В связи с упомянутым интересом к антиоксидантным свойствам каротиноидов можно утверждать, что химические и физико-химические исследования реакционной способности каротиноидов в окислительно-восстановительных Процессах в настоящий момент являются приоритетными. Имеющаяся в литературе информация о короткоживущих парамагнитных и диамагнитных интермедиатах, образующихся в реакциях каротиноидов со свободными радикалами, весьма ограничена, а структура интермедиатов, как правило, только предполагается. Поэтому именно исследованиям, связанным с реакционной способности каротиноидов, а также их короткоживущих парамагнитных интермедиатов принадлежит значительное место в настоящей диссертации.

Понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач биохимии и фармакологии. Успешное решение этой проблемы имеет принципиальное значение не только для фундаментальной науки. Знание тонких механизмов процессов определяющих связывание и диссоциацию лиганд-рецепторных комплексов позволит понять причину терапевтического действия лекарства, разработать методы для контроля действия лекарства в организме, и минимизировать возможные побочные эффекты. До настоящего времени, однако, физико-химические аспекты связывания мало изучены. В частности, отсутствуют представления о физико-химических взаимодействиях, заставляющих лекарство связываться

с рецептором, а также о химических трансформациях лекарства в активном центре рецептора, облегчающих дальнейшую диссоциацию комплекса лекарство-рецептор. Предпринятые в настоящей работе попытки обосновать возможность метаболизма лекарственных препаратов при взаимодействии с рецептором, и, в результате исследования модельных систем, установить факторы, ответственные за образование и диссоциацию комплекса «лекарство-рецептор», в этом смысле являются пионерскими.

Самостоятельный практический интерес представляют исследования фотопревращений лекарственных препаратов, выполненные в диссертации на примерах нифедипина и лаппаконитина, т.к. в литературе имеются сведения о фототоксичности этих препаратов.

Исследование методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии окислительно-восстановительных процессов в организованных средах, предпринятое во второй части диссертации, представляется актуальным с нескольких точек зрения. Кроме необходимости понимания механизмов межмолекулярных взаимодействий в системах с ограниченной подвижностью, к которым можно отнести практически все биологические системы, самостоятельный интерес представляет исследование воздействия магнитного поля на течение этих процессов. Напомним, что проведение реакций во внешнем магнитном поле является одним из способов управления физико-химическими свойствами биологически активных соединений. Обнаружение в настоящей работе значительных магнитных эффектов (сотни процентов) на выход свободных радикалов в фотоинициированных процессах с участием ряда карбонильных соединений является наглядной демонстрацией возможностей методик спиновой химии. Эти эффекты легли в основу разработанного в настоящей работе кинетического метода, позволяющего изучать динамику радикальных пар в организованных средах.

Во второй части диссертации представлен также цикл работ, посвященных исследованию структуры и реакционной способности

комплексов включения нифедипина и лаппаконитина с глицирризиновой кислотой. Актуальность данного исследования связана с известными из литературы и собственных исследований автора фактами воздействия комплексообразования на лечебные свойства препаратов. В частности, в настоящей работе было обнаружено значительное (в десятки и сотни раз) усиление терапевтической активности препаратов нифедипина и лаппаконитина в присутствие глицирризиновой кислоты. Создание эффективных лекарственных препаратов на основе комплексов включения с природными соединениями сегодня является бурно развивающейся областью медицинской химии. Использование комплексов включения позволяет направленно регулировать (усиливать или ослаблять) те или иные свойства лекарственных соединений. Полученные в настоящей работе результаты могут иметь практическое значение для регулирования свойств и других лекарственных препаратов, в частности, увеличения их фотостабильности и биодоступности, а также снижения токсичности (включая фото-токсичность).

Цель работы.

Целью настоящей диссертационной работы являются исследования роли короткоживущих парамагнитных интермедиатов, в процессах с участием дигидропиридинов - синтетических аналогов КАБН, природных полиенов, включая ретиналь и каротиноиды, а также биологически активных карбонильных соединений и некоторых лекарственных препаратов. Исследования проводятся в растворах и организованных средах с целью установления основных факторов, определяющих воздействие среды на процессы. Кроме традиционных методик спиновой химии и химической радиоспектроскопии в диссертации используется специально развитый кинетический метод, основанный на импульсной микроволновой накачке электронных переходов в радикальной паре.

Научная новизна и практическая значимость.

Для процесса фотоокисления ряда 1,4-дигидропиридинов -синтетических аналогов КА£)Н, удалось проследить все постулируемые в литературе стадии: перенос электрона, протона, атома водорода. При этом получены практически важные данные о свойствах ион-радикалов и нейтральных радикалов дигидропиридинов. Эти данные, в частности, использованы в настоящей работе при обсуждении возможного метаболизма лекарств на рецепторах.

Систематически изучен процесс фотоиндуцированной цис-транс изомеризации полиненасыщенных соединений в присутствии акцепторов электрона в растворах и организованных средах. Показано, что геометрическая изомеризация, протекающая по механизму переноса электрона, который ранее был известен для замещенных этиленов, в случае полиенов может осуществляться по нескольким различным каналам. Продемонстрировано, что различные изомеры могут иметь общее триплетное состояние, и возможна одновременная цис-транс изомеризация вокруг двух двойных связей. Показано, что метод ХПЯ дает информацию об относительных квантовых выходах образования различных изомеров и их предшественниках, недоступную другими методами.

Измерены константы скорости реакции различных каротиноидов с перекисными радикалами, и обнаружена корреляция констант скоростей с окислительными потенциалами каротиноидов. Кроме того обнаружена зависимость окислительно-восстановительных свойств каротиноидов от среды (раствор или супрамолекулярное окружение), а также определены условия, при которых каротиноиды могут проявлять как антиоксидантную, так и про-оксидантную активность. Эти результаты не только ставят точку в споре о том, чем определяются антиоксидантные свойства каротиноидов, но и могут использоваться на практике при подборе каротиноидов, обладающих антиоксидантными или про-оксидантными свойствами для решения конкретных задач.

Работы по исследованию природы и свойств супрамолекулярных комплексов глицирризиновой кислоты с каротиноидами и лекарственными препаратами нифедипином и лаппаконитином можно считать пионерскими. Впервые детально изучены практически важные процессы фотодеградации лаппаконитина, а также воздействие глицирризиновой кислоты на фотостабильность лаппаконитина и нифедипина.

Учитывая, что в настоящее время создание супрамолекулярных комплексов лекарственных препаратов с различными природными соединениями является одним из самых многообещающих направлений в области медицинской химии, полученные в работе результаты, безусловно, имеют и самостоятельную значимость в плане использования глицирризиновой кислоты для повышения биодоступности и фотостабильности других биологически активных соединений.

Выдвинута гипотеза о возможной роли процессов переноса электрона в механизме связывания ряда лекарственных препаратов с клеточными рецепторами. Гипотеза проиллюстрирована на модельной реакции двух лекарств (нифедипина и лаппаконитина) с аминокислотами, входящими в состав центров связывания соответствующих рецепторов. Продемонстрировано, что образующиеся анион-радикалы указанных соединений нестабильны и в акте обратного переноса электрона в лиганд-рецепторном комплексе получаются уже другие соединения. Это может служить причиной распада лиганд-рецепторного комплекса.

Создан время-разрешенный импульсный вариант метода ргос!ис1-у1е1<1-с1е1ес1е(1-Е811, РУЕБК. Применение данной методики позволяет детектировать спектр ЭПР промежуточной радикальной пары по изменениям в выходе продукта реакции - долгоживущего спинового адцукта, а также предоставляет уникальные возможности для получения кинетической информации о динамике радикальных пар в растворах. В работе были измерены кинетические параметры радикальных пар

образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений, включая биологически активные ацетиленовые кетоны, в мицеллах SDS.

Апробация и публикации.

Основное содержание диссертации опубликовано в 32 статьях. Результаты работы были также представлены автором на ряде международных и российских конференций, в том числе на XI Международной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии", Москва, 2001; VII Международном симпозиуме "Magnetic Field and Spin Effects in Chemistry and Related Phenomena", Tokyo, Japan, 2001; VI конференции памяти Воеводского "Физика и химия элементарных химических процессов, Новосибирск, 2002; X АРАМ topical seminar and Conference "Nanoscience and Technology", Novosibirsk, 2003; IX International Seminar on Inclusion Compounds, Novosibirsk, 2003; Международной конференции «Происхождение и эволюция биосферы», 2005, Новосибирск; International Symposium "Advances in Science for Drug Discovery", Moscow, 2005; IV International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (SPIN-2005), Novosibirsk, 2005; IV International Symposium "Design and Synthesis of Supramolecular Architectures", Kazan, 2006; XVII Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, 2006; 36-th and 37-th Southeast Magnetic Research Conferences, USA, 2007 and 2008; International Conference on Molecular/Nano-Photochemistry, Photocatalysis and Solar Energy (Solar'08). Cairo, Egypt, 2008.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, семи глав, списка основных результатов и выводов, а также списка цитированной литературы (363 ссылки). Работа изложена на 280 страницах, содержит 114 рисунков и 32 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава диссертации посвящена подробному описанию используемых в работе методических подходов и экспериментальных установок. Важнейшее место в исследованиях процессов с участием радикальных частиц в настоящее время занимают методики спиновой химии. В основе этих методик лежат эффекты химической поляризации ядер (ХПЯ) и электронов (ХПЭ), а также влияние внешних и внутренних магнитных полей на радикальные химические процессы. К преимуществам этих методов относится их более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методами ЯМР и ЭПР, а также высокая информативность. Так, метод ХПЯ позволяет одновременно получать информацию о парамагнитных интермедиатах, конечных продуктах реакции, и кинетике отдельных стадий.

Говоря о преимуществах тех или иных методов исследования, нельзя не отметить, что каждый метод имеет и свои ограничения, и по области применения, и по чувствительности, и по временному разрешению. Поэтому каждый метод в отдельности, как правило, не дает всей необходимой информации о процессе, особенно для таких сложных объектов, какими являются биологические системы. Для более глубокого изучения механизмов сложных процессов необходимо применение комбинации различных методов, а также создание новых методик и экспериментальных установок, наилучшим образом подходящих для решения конкретной задачи. В представленной работе значительное внимание уделяется разработке и применению комплексного использования современных физико-химических методов для исследования биологически важных процессов. Особое внимание уделено время-разрешенным методам спиновой химии в сочетании с оптической спектроскопией, ЭПР и ЯМР в стационарном и импульсном вариантах. Основная часть работ выполнена в лаборатории Магнитных явлений Института химической кинетики и горения СО РАН на ЯМР спектрометрах фирм Уапап, Вгикег и 1ео1 с

различной напряженностью магнитного поля, снабженных стационарными и импульсными источниками света для проведения фотохимических экспериментов и регистрации эффектов ХПЯ. Кроме того, часть работ выполнена автором диссертации в рамках международного сотрудничества с коллегами из Латвии, США и Японии. Мы благодарны коллегам из Латвии за синтез широкого набора замещенных 1,4-дигидропиридинов -аналогов природного кофермента NADH. В содружестве с Университетом штата Алабама, США (Проф. Л.Д. Кисперт), выполнен цикл работ, посвященный исследованию окислительно-восстановительных процессов с участием каротиноидов и их супрамолекулярных комплексов. Совместно с группой Д-ра Оказаки (National Industrial Research Institute of Nagoya, Japan) создан время-разрешенный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) для исследования динамики радикальных пар и магнитных эффектов в организованных средах.

Главы 2-7 настоящей диссертации содержат описание конкретных исследований, при этом работа поделена на две части: исследования парамагнитных интермедиатов для процессов в растворах (главы 2-5) и в организованных средах (комплексы типа «хозяин-гость» и мицеллы, главы 6-7).

Вторая глава диссертации посвящена процессам фотоиницированного окисления 1,4-дигидропиридинов (ДТП) — синтетических аналогов природного кофермента NADH в присутствии акцепторов электрона. Дискуссия о реализации гетеролитического или гемолитического механизмов превращения NAD+ в NADH в живых системах не утихает последние несколько десятилетий. В настоящей работе исследования проводились с использованием различных методов спиновой химии: стационарная ХПЯ в сильных и слабых магнитных полях, ХПЯ с временным разрешением, а также СПЯ (стимулированная поляризация ядер). Исследование модельных процессов фотоиницированного окисления ряда замещенных 1,4-дигидропиридинов в присутствии различных

акцепторов электрона позволило установить роль радикальных частиц и проследить за всеми стадиями процесса превращения ДТП в пиридин. Показано, что во всех случаях первым актом реакции является перенос электрона с ДТП на акцептор - хинон. Дальнейшая судьба катион-радикала ДГП существенно зависит от структуры заместителей в пиридиновом кольце. Наибольшее влияние при этом оказывает наличие и природа заместителя при атоме азота. Для 1Ч-незамещенных ДГП наиболее вероятным является перенос протона в ион-радикальной паре с атома азота на анион-радикал хинона с образованием последовательной нейтральной радикальной пары. Третьим шагом реакции является отрыв атома водорода из 4-го положения пиридинового кольца в нейтральном радикале с образованием соответствующего пиридина (Схема 1).

Схема 1.

Показано, что катион-радикалы ДГП являются нестабильными частицами независимо от наличия заместителя при атоме азота. Поскольку образование 1Ч-центрированного нейтрального радикала ДГП для Ы-замещенных ДГП, как правило, невозможно, дальнейшие превращения их катион-радикалов происходят уже в растворе, а не в геминальной РП. Вторым актом реакции для таких ДГП является отрыв атома водорода из 4-го положения в катион-радикале с образованием соответствующего катиона пиридиния. Для ДГП с метальным заместителем при атоме азота катионы пиридиния стабильны и могут быть зарегистрированы в ЯМР спектре. С другой стороны, ацильный заместитель при атоме азота дестабилизирует катион пиридиния, что приводит к его распаду в микросекундном

временном диапазоне с образованием соответствующего пиридина (Схема 2).

Схема 2.

R

R

R

lï + QH2

|Г + СО-СН3 + QHj

N

СОСН3

сосн3

Отметим, что разнообразие путей фотопревращения дигидропиридинов позволило нам в данной серии работ продемонстрировать широкие возможности методов спиновой химии для исследования механизмов сложных радикальных превращений синтетических аналогов NADH, и для идентификации парамагнитных интермедиатов. Но самый главный вывод касается того, что установленные для фотоинициированных реакций ДТП с акцепторами электронов последовательности радикальных стадий, скорее всего, будут таковыми и для реакций смешения, в которых ХПЯ не проявляется, но образуются те же продукты. Подтверждением этого заключения являются недавние работы М.С. Афанасьевой (J. Phys. Chem. В, 2006, 110, 21232-21237; J. Аш. Chem. Soc., 2006, 128, 8651-8658), в которых были зарегистрированы спиновые эффекты в процессах ферментативного окисления NADH и нифедипина (диметиловый эфир 1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(2'-нитрофенил)-3,5-дикарбокси пиридина) пероксидазой хрена в растворах. На основании анализа полевых зависимостей магнитного эффекта были предложены схемы процессов, включающие в качестве первой стадии перенос электрона от NADH и ДТП на активный центр фермента.

Третья глава диссертации посвящена исследованию механизмов цис-транс изомеризации полиненасыщенных соединений. В этой главе описаны механизмы фотоинициированной цис-транс изомеризации полиенов, в присутствии акцепторов электрона, включающие стадию переноса электрона. В отличие от оптических методов исследования, методы ЯМР и

ХПЯ позволяют раздельно наблюдать сигналы от разных изомерных форм, что позволило нам впервые применить эти методы для исследования механизмов изомеризации сложных молекул, содержащих несколько сопряженных двойных связей. В качестве примера на рисунке 1 приведены спектры ХПЯ зарегистрированные при фотолизе ненасыщенного кетона в присутствие донора электрона трифениламина (ТФА).

(с)

—1—1—I—■—I—■—|—■—I— 2.4 2.2 2.0 1.8 ррт

Рисунок 1. (а) Фрагмент *Н ЯМР спектра (алифатическая часть, транс-цис изомер, (т-ц)) в С^СЭД (Ь) и (с) спектры ХПЯ зарегистрированные при фотолизе изображенного кетона в присутствие ТФА в СВ3С>1. Исходный изомер т-ц (Ь) и т-т (с).

Следует отметить, что доказательство участия одноэлектронного переноса в процессе цис-транс фотоизомеризации замещенных этиленов в присутствие доноров и акцепторов электрона впервые было получено именно методами спиновой химии и это считается одним из важных её достижений. В представленном цикле работ получены экспериментальные доказательства участия следующих промежуточных короткоживущих частиц в реакциях цис-транс изомеризации полиенов: триплетные возбужденные состояния, образующиеся при рекомбинации триплетной

7 13

ион-радикальной пары; катион-радикалы и дикатионы; а также вторичные интермедиа™ образующиеся из ион-радикалов: нейтральные радикалы и бирадикалы (Схема 3).

Схема 3. Механизмы изомеризации полиненасыщенных соединений, включающие стадию переноса электрона.

Р + Б

Р-во-«—в-Р -— ИРП—Р3 -*■ Р-во

аддукт, / \ (3 = амины,

бирадикал / \ароматичскиеуглводороды) (Б = хинон) / \

Н+ Р + ■» Р-1зо

(Р-ионон) (каротиноиды)

На схеме Р - это полиен, а Б - партнеры (амины, хиноны, ароматические углеводороды), которые могут играть роль донора либо акцептора электрона. Для каждого из описанных вариантов установлен детальный механизм изомеризации.

Примером комплексного подхода к изучению биологически важных процессов является исследование окислительно-восстановительных реакций каротиноидов, описанное в четвертой главе. В представленном цикле работ, выполненных с использованием различных физико-химических методов (ЯМР, ЭПР (включая импульсные методики), ХПЯ, ВЭЖХ, электрохимия, оптическая спектроскопия и флюоресценция) изучен ряд окислительно-восстановительных процессов с участием природных и синтетических каротиноидов. В работе исследованы реакции каротиноидов с хинонами, ионами металлов, а также со свободными кислород-центрированными и углерод-центрированными радикалами в растворах. Структуры некоторых изученных каротиноидов представлены на рисунке 2.

(3-каротин (XXV)

7'-апо-7',7'-дициан-Р-каротин (XXIX)

Рисунок 2. Структурные формулы некоторых каротиноидов.

Методом ЭПР со спиновыми ловушками были измерены относительные скорости реакции каротиноидов со свободными радикалами (ксаДэт). к5т - константа скорости реакции радикала с ловушкой. Одним из важных достижений настоящей работы явилось обнаружение корреляции ксаДэт с потенциалами окисления каротиноидов (Рис. 3).

?е

20-

р-каротин (а), кантаксантин (Ь), 8'-апо-р-каротин-8'-аль (с),

15- 7'-апо-7',7'-дициан-р-каротин (с1), . этил 8'-апо-р-каротин-8'-ат (е).

5-

а

0.50 0.55

0.60 0.65 0.70 0.75 Потенциал, V уэ. БСЕ

Рисунок 3. Диаграмма зависимости относительных констант скорости захвата перекисных радикалов каротиноидами от потенциала окисления каротиноидов.

При этом наименьшая скорость реакции наблюдалась для (З-каротина, а наибольшая для апо-каротиноидов с полярными заместителями (структура некоторых из этих каротиноидов показана на рисунке 2). Этот результат позволил нам сделать выбор между обсуждаемыми в литературе возможными направлениями реакции свободных радикалов с каротиноидами (радикальное присоединение, отрыв атома водорода, и окисление) в пользу последнего. Показано, что в присутствие ионов железа каротиноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидантные свойства, и предложено объяснение данному явлению.

Проведенное в настоящей главе рассмотрение позволяет сделать несколько важных заключений. Прежде всего, перенос электрона характерен для каротиноидов не только при их превращениях в фотосинтетических центрах, но и при взаимодействии со свободными радикалами, а также при цис-транс изомеризации. Можно констатировать, что именно склонность к одноэлектронному переносу объединяет наиболее

важные биологические процессы с участием каротиноидов. Среди них фотосинтез и фотоизомеризации ретиналя, являющегося частью зрительного пигмента родопсина, а также реакции со свободными радикалами (антиоксидантная способность).

В пятой главе диссертации описан развитый в рамках настоящей работы оригинальный подход к изучению механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий на молекулярном уровне. Представленный экспериментальный подход основан на моделировании отдельных стадий процесса взаимодействия лекарства с аминокислотами, расположенными в активных центрах клеточных рецепторов. Основой для построения модели послужили приведенные в литературе расчеты (K.-J. Schleifer, е.а., J. Med. Chem., 1999, 42, 2204-2211), указывающие на образование донорно-акцепторного комплекса между молекулой гипотензивного препарата нифедипина и аминокислотой тирозином, располагающимся в активном сайте кальциевого рецептора. В работе было предположено, что в таком комплексе может происходить одноэлектронный перенос. Данная гипотеза проиллюстрирована на примере двух лекарственных препаратов: гипотензивного лекарства нифедипина - блокатора кальциевых рецепторов, и антиаритмика лапаконитина - блокатора натриевых каналов.

,ОМе

......ОМе

■ОН ..

он

no2

L-h

/К^СООСН,

i х

^N CH,

'з

О

н

'з

Лаппаконитин

Нифедипин

Механизм взаимодействия между молекулами лекарств и аминокислотами тирозином и триптофаном, входящими в состав активных центров соответствующих рецепторов, изучен методом химической поляризации ядер, включая время разрешенный вариант. Установлено, что первичной стадией процесса в обеих системах действительно является перенос электрона. Показано, что анион-радикалы этих лекарственных соединений нестабильны и быстро (в микросекундном временном диапазоне) превращаются в продукты, не способные к связыванию с рецептором (Схемы 4, 5). Этот факт важен, поскольку проливает свет на практически не изученную природу диссоциации комплекса лекарства с рецептором.

Отдельная часть работы посвящена исследованию возможных механизмов фототоксичности нифедипина и лаппаконитина. Показано, что оба этих соединения фоточувствительны в УФ диапазоне и при фото возбуждении вступают в реакции переноса электрона с как рядом аминокислот, так и с другими органическими молекулами. Установлено, что результатом реакции является образование набора короткоживущих К-, 0-, и С-центрированных свободных радикалов и ион-радикалов нифедипина, лаппаконитина и партнеров.

Кроме того, в триплетном возбужденном состоянии лаппаконитин сам подвергается внутримолекулярному переносу электрона с последующим образованием пары свободных радикалов. Детально описаны механизмы всех исследованных процессов. Логично предположить, что короткоживущие парамагнитные интермедиа™ могут быть причиной высокой токсичности лаппаконитина.

Схема 4. Механизм фотоиндуцированного взаимодействия нифедипина с N-ацетил-тирозином.

н

Ac'N~"fC00H ÇH2

СООСН3

(nf"' Tyr-OH*

NF

H*-transfer

СООСНз + Tyr.¿

Схема 5. Механизм фототрансформации лаппаконитина (Lap) в присутствии аминокислот (А-Н).

Lap + А-Н -(Lap' + А-Н )

R +

N-COCH, Н 3

OR —ОН

-N—U—СН3 + А

Во второй части диссертации (главы 6-7) описываются окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений в организованных средах (супрамолекулярные комплексы включения и мицеллы).

Шестая глава посвящена изучению динамики радикальных пар в мицеллярных растворах. В представленном цикле работ реализована идея об использовании импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. За основу была взята стационарная методика РУЕБЯ (ргос1ис1-у1е1с1-с1е1ейес1-Е811), с использованием спиновых ловушек для захвата и последующей регистрации короткоживущих радикалов с помощью стационарного ЭПР. Применение данной методики позволяет детектировать спектр ЭПР промежуточной радикальной пары по изменениям в выходе продукта реакции - долгоживущего спинового аддукта. Созданный в результате данной работы время-разрешенный импульсный вариант метода РУЕБЯ обладает целым рядом преимуществ перед существовавшими на тот момент методиками, использующими аналогичный принцип микроволновой

накачки электронных переходов в РП, поскольку в рамках этого подхода нет ограничений ни в выборе системы (не требуется присутствие флуоресцирующего реагента как в методе ОД ЭПР), ни в скорости регистрации (как в методе СПЯ). С помощью развитого подхода были измерены кинетические параметры радикальных пар, образующихся при фотолизе ряда биологически-активных карбонильных соединений, таких как антрахиноны и ацетиленовые кетоны (Схема 6). Известно, что многие природные и синтетические антрахиноны и их производные обладают противоопухолевой активностью, а ацетилен-содержащие кетоны используются как антигрибковые препараты.

Схема 6. Структурные формулы антрахинона, ацетиленовых кетонов и спиновых ловушек, используемых в работе.

О 0 0

РЬ—=—"—РИ РИ—=—^—РИ Р11—^—РЬ

ХЫ Х1Л1 хин

Вг Вг

Сульфонат 3,5-дибром-4-нитрозобензола РВЫ

В первую очередь отметим, что для всех кетонов и хинонов зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выхода продуктов в реакциях фотовосстановления (сотни процентов). В качестве примера на рисунке 4 приведена зависимость выхода спинового аддукта от внешнего магнитного поля при фотолизе ацетиленового кетона в мицелле 805. Точка 334 мТл демонстрирует масштаб эффекта наложения микроволнового поля.

Антрахинон

В /шТ

Рисунок 4. Влияние магнитного поля на выход спинового аддукта при фотолизе кетона ХЫ1 в 0.2 М растворе мицеллы БОБ. Эффект ЭПР переходов кетильного радикала индуцированных микроволновым полем проявляется при резонансном значении поля 334 мТл. Сплошная линия представляет расчетную кривую.

Полевая зависимость магнитного эффекта при приложенном микроволновом поле представляет собой ЭПР спектр промежуточной радикальной пары (Рисунок 5).

В0 I шТ

Рисунок 5. ЭПР спектр радикальной пары, зарегистрированный при фотолизе антрахинона в мицеллярном растворе ЗОБ. Микроволновое поле мощностью 4 прикладывалось в течение 5 мкс сразу после импульса лазера (X - 308 нм, 124 ш1). Правая ось: выход спинового аддукта в микромолях/литр, левая ось: уменьшение выхода аддукта (в %).

Применение импульсной микроволновой накачки электронных переходов позволяет проследить за временной эволюцией радикальных пар и рассчитать следующие кинетические параметры: кн - скорость образования РП в результате отрыва атома водорода от соответствующего донора; к^с - скорость синглет-триплетной конверсии в РП; кР - скорость рекомбинации РП и кеК - скорость выхода радикалов из мицеллы.

Рисунок 6. Три импульсных последовательности с

изменяемой длительностью микроволнового импульса и варьируемой задержкой между микроволновым и лазерным импульсом.

На рисунке 6 изображены три реализованных в работе варианта импульсных последовательностей. В первом методе (отмеченном как ИП 1) короткий микроволновой импульс (обычно это 50 не) прикладывается к системе через варьируемое время т после лазерного импульса. При этом величина отклика системы (уменьшение выхода спинового аддукта) будет пропорциональна мгновенной концентрации РП в данный момент времени. Во втором методе (ИП 2) микроволновой импульс стартует до подачи импульса лазера и заканчивается через варьируемое время т после лазерного импульса. В этом случае воздействию микроволнового поля подвергнутся все РП, образовавшиеся за время т после лазерного импульса.

В результате, варьируя время т, мы получим зависимость концентрации РП от времени отражающую только кинетику образования радикальных пар. Импульсная последовательность 3 позволяет детектировать только те РП, время жизни которых превышает время т. В результате получается

ИП 1

ИП2

Лазер М\¥

ИПЗ

спадающая кинетическая кривая с характерным временем спада отражающем время жизни РП и релаксационные процессы (Рис. 7). Кинетические параметры РП, полученные в данной работе суммированы в Таблице 1.

к ^ЕвС кн

АО/БОБ 11.8 0.2 6.0

АС^Оз'/вБЗ 45.0 3.0 6.0

ХЫ 10 0.2 10

ХЫ1 6.5 0.2 1.0

хып 7.0 0.2 3.7

Таблица 1. Кинетические параметры радикальных пар. Константы скорости даны в единицах 106 с'1.

Рисунок 7. Зависимости сигнала РУЕБЯ от времени для трех импульсных последовательностей (см. Рис. 5.), зарегистрированные при фотовосстановлении антрахинона (а) и антрахинон-2-сульфоната (Ь) в мицелле БОБ (0.2 М). Концентрация спиновой ловушки 1 мМ. Лазерное облучение проводилось в течение 20 с. на длине волны 335 нм. Расчетные кривые представлены прерывистой линией (ИП-1), сплошной линией (ИП-2) и пунктиром (ИП-3).

Эксперименты по лазерному импульсному фотолизу ацетиленовых кетонов позволили измерить времена жизни триплетных состояний кетонов и соответствующих кетильных радикалов, а также зарегистрировать значительный магнитный эффект на времена жизни кетильных радикалов (Рис.8 и Таблица 2).

Отметим, что магнитный эффект не наблюдается на времена жизни триплетных состояний кетонов, поскольку их образование не включает магнито-чувствительных стадий.

Рисунок 8. Кинетика спада промежуточного поглощения при фотолизе кетона XVI в мицеллярном растворе. Слева - кетильного радикала (X = 370 нм) в отсутствие (а) и в присутствие (Ь) магнитного поля (150 мТл), справа - триплетного состояния (X = 550 нм) (зависимость от магнитного поля отсутствует).

Таблица 2. Времена жизни возбужденного триплетного состояния и кетильного радикала кетонов XLI-XLII в мицеллярных растворах SDS и Brij 35 измеренные по спектрам промежуточного поглощения на длинах волн 550 и 370 нм. Времена жизни приведены в наносекундах. (*) не измерялась из-за перекрывания сигналов продуктов.

кетон XLI XLII

мицелла тт тк (Н=0) тк (Н=150 мТл) тт тк (Н=0) тк (Н=150 мТл)

SDS 91 440 2800 1460 * 2420

Brij 35 <5 950 3800 56 ИЗО 3100

Приведенные в данной главе примеры использования метода РУЕБЯ с временным разрешением демонстрируют уникальные возможности данного метода для получения кинетической информации о динамике радикальных пар в растворах. Полученные данные о структуре радикальных пар и о кинетике процесса фотовосстановления ряда карбонильных соединений хорошо согласуются с данными полученными другими методами, в частности, методами ХПЯ и лазерного импульсного фотолиза. Отметим, что использование в исследовании комбинации различных кинетических методов существенно повышает объем и достоверность полученной информации. В последующие годы этот метод успешно применялся нашими японскими коллегами для исследования бирадикалов, а также радикальных пар в других средах с ограниченной подвижностью, в частности, в нанопорах (М. Окагак^ е1 а1., РЬуэ. СЬеш. СЬет. РЬуэ., 2002, 4, 1201-1205).

В контексте исследования природы влияния организованной среды на реакционную способность химических соединений, наиболее важными являются следующие наблюдения. Это существенные изменения времен жизни РП и вероятностей клеточной рекомбинации свободных радикалов в мицеллах по сравнению с гомогенным раствором, а также зависимость динамики партнеров РП от параметров самой мицеллы. Эти наблюдения

содержат указания на возможные причины изменений в механизмах и направлении реакций для многостадийных радикальных процессов в организованных средах. Исследованию таких процессов с участием биологически важных соединений методом ХПЯ, а также другими физическими методами посвящена следующая глава диссертации.

В Главе 7 представлены два цикла работ посвященных исследованию комплексов включения ряда лекарственных препаратов и каротиноидов. В первой части рассматривается важная проблема, имеющая отношение к практическому применению каротиноидов в качестве антиоксидантов. Это -комплексообразование каротиноидов и влияние организованной среды на их реакционную способность в окислительно-восстановительных процессах. Известно, что такие свойства каротиноидов, как гидрофобность, высокая фоточувствительность и химическая активность, существенно затрудняют их применение на практике. Одним из путей решения подобных проблем в фармакологии является использование комплексов включения типа «гость-хозяин». Молекулы «гостя» в комплексе могут менять свои физические, и химические свойства, а также биодоступность и стабильность. На первом этапе методами ЯМР, ЭПР и оптической спектроскопии были исследованы комплексы включения каротиноидов и их структурного аналога р-ионона с циклодекстринами. Показано, что комплексы каротиноидов с циклодекстринами образуют агрегаты в водных растворах, обладают повышенной фотостабильностью, однако теряют способность захватывать свободные радикалы. Интересной находкой в этом плане явилось использование в качестве молекулы «хозяина» ¡3-глицирризиновой кислоты (ГК) - природного соединения принадлежащего к тритерпеновым гликозидам. Впервые показано, что ГК образует комплексы с каротиноидами не только в водных растворах, но и в ряде органических растворителей (ДМСО, ацетонитрил, спирты). В частности, по изменению интенсивности флюоресценции кантаксантина в ДМСО была оценена

константа стабильности комплекса между молекулой кантаксантина и димером ГК (Рис. 9).

I, нм

[ГК], мМ

Рисунок 9. (а) Спектр флюоресценции раствора кантаксантина, 0.02 мМ в отсутствие и в присутствие глицирризиновой кислоты (ГК) в ДМСО содержащем 5% воды. Длина волны возбуждения 470 нм, регистрации - 620 нм. (Ь) Зависимость изменения интенсивности флюоресценции каротиноида от концентрации ГК в растворе.

Из рисунка видно, что ход кривой отличается для диапазона концентраций 0.01 - 1 мМ и > I мМ. На момент выполнения настоящей работы, кроме вышеописанных комплексов состава 2:1 были описаны мицеллы глицирризиновой кислоты, образующиеся в растворах с концентрацией более 1 мМ.

В работе показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов. Было зарегистрировано уменьшение скоростей переноса электрона в реакции с акцепторами, а также удлинение времени жизни катион-радикалов каротиноидов в комплексах, приводящее к изменению соотношения продуктов реакции. На Рис. 10 приведен пример изменения кинетики спада сигнала поглощения катион-радикала р-каротина в реакции с дихлор-дициан-бензохиноном (ДДХ) в присутствие ГК.

Время, сек

Рисунок 10. Кинетики спада сигнала поглощения катион-радикала Р-каротина на 935 нм в отсутствие и в присутствие ГК. Концентрации р-каротина и ДДХ равны 4 цМ.

В отличие от комплексов с циклодекстринами, экспериментально обнаружено многократное (в десятки раз) увеличение скорости захвата перекисных радикалов (антиоксидантная активность) каротиноидами в комплексе с ГК (Рис. 11), и установлено, что причина этого явления кроется во влиянии комплексообразования на окислительные потенциалы каротиноидов.

Следует отметить, что, несмотря на большой интерес к использованию комплексов включения с целью направленного изменения свойств включенных соединений, до сих пор остается открытым вопрос о природе влияния комплексообразования на их реакционную способность. Представленные в настоящей главе результаты исследований процессов одноэлектронного переноса с участием комплексов каротиноидов являются практически единственной попыткой приблизиться к решению этого вопроса.

[Саг] = 0 мМ [ГК] = 0 мМ

[Саг] = 1 мМ [ГК] = 0 мМ

[Саг] = 1 мМ [ГК] = 1 мМ

3300 3350 3400

Магнитное поле / Гс

3450

Рисунок 11. Спектры ЭПР аддукта РВИ-ООН в отсутствие (вверху) и в присутствие кантаксантина и его комплекса с ГК в ДМСО. [РВЫ] = 5 мМ, [РеСЬ] = 1 мМ, [Н202] = 0.5 М.

В Главе 7 представлен также цикл работ, посвященных исследованию комплексов включения нифедипина и лаппаконитина с глицирризиновой кислотой, в частности, влияния комплексообразования на реакционную способность этих соединений. Используя оптическую и ЯМР спектроскопию (включая релаксационные методы) нам удалось показать, что глицирризиновая кислота образует очень стабильные комплексы как с нифедипином, так и с лаппаконитином (константа стабильности порядка 105 М'1, что на два порядка превышает типичное значение для комплексов циклодекстринов). В частности для нифедипина образование комплекса было доказано по изменению его растворимости в присутствие ГК (Рис. 12), а также по изменению времени фазовой релаксации Т2 (Рис. 13). Следует отметить, что в экспериментах на животных с участием автора диссертации было обнаружено значительное (в сотни раз) усиление терапевтической активности нифедипина в присутствие ГК.

0,00 0,01 1 2 [ГК], мМ

Рисунок 12. Диаграмма растворимости нифедипина как функция концентрации ГК в 5% метанольном растворе в воде.

Рисунок 13. Кинетики спада сигнала эха метильных протонов НФ в чистом метаноле (1), в метаноле в присутствие 0.7 мМ ГК (2), и в 30% метанольном растворе в присутствие 0.7 мМ ГК (3).

В работе также продемонстрировано, что комплексообразование с ГК существенно снижает скорость фотодеградации нифедипина и лаппаконитина, приводящей к образованию активных свободных радикалов. Данный результат может иметь практическое значение при использовании комплексообразования для увеличения фотостабильности этих, а также других лекарственных препаратов, для увеличения их биодоступности и снижения токсичности (включая фото-токсичность).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

I. В первой части работы, в результате исследования строения и свойств радикальных интермедиатов в растворах, установлены детальные механизмы ряда биологически значимых процессов:

(1) Продемонстрировано, что фотоинициированное окисление акцепторами электрона синтетических аналогов NADH - 1,4-дигидропиридинов (ДТП) проходит по радикальному пути с образованием тех же продуктов, которые получаются и в реакциях смешения: соответствующих пиридинов или катионов пиридиния.

(2) На примере широкого набора полиненасыщенных соединений получены экспериментальные доказательства участия короткоживущих парамагнитных частиц в реакциях фотоинициированной цис-транс изомеризации.

(3) Продемонстрировано, что скорости реакций перекисных радикалов с каротиноидами с коррелируют с их окислительными потенциалами. Это прямо указывает на связь антиоксидантной активности каротиноидов с процессом переноса электрона. Установлено, что каротиноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидантные свойства, и определена роль ионов металлов в этих процессах.

(4) Показано, что при фотолизе лекарственных препаратов нифедипина и лаппаконитина в растворах образуются активные короткоживущие парамагнитные интермедиаты: бирадикалы, ион-радикалы и нейтральные радикалы, могущие быть причиной фототоксических побочных эффектов, возникающих при медицинском применении этих препаратов.

II. Во второй части исследованы процессы в организованных средах:

(5) Создан время разрешенный импульсный вариант метода РУЕБЛ, позволяющего регистрировать спектры ЭПР короткоживущих радикальных пар. Измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда биологически активных карбонильных соединений в

мицеллах SDS, а также зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выхода и времена жизни свободных радикалов, (б) Показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов в окислительно-восстановительных реакциях. Обнаружено, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде, и существенно увеличивает фотостабильность нифедипина и лаппаконитина. Последний результат может быть использован в медицинской практике, т.к. исследованные лекарства являются фототоксичными.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих статьях:

1. The Mechanisms of the Oxidation of NADH Analogs. 1 .Photochemical Oxidation of N-Unsubstituted 1,4-Dihydropyridines by Various Acceptors /М.В. Taraban, A.I. Kruppa, N.E. Polyakov, et al. //J. Photochem. Photobiol. A Chem.- 1993.- V.73.- P. 151-156.

2. The Mechanisms of the Oxidation of NADH Analogs 2. N-Methyl Substituted 1,4-Dihydropyndines /А.1. Kruppa, M.B. Taraban, N.E. Polyakov, et al. //J. Photochem. Photobiol. A Chem.- 1993.- v.73.- P. 159163.

3. The Mechanisms of the Oxidation of NADH Analogs. 3. Stimulated Nuclear Polarization (SNP) and CIDNP in Low Magnetic Fields in Photooxidation Reactions of 1,4-Dihydropyridines by Quinones /N.E. Polyakov, A.I. Kruppa, M.B. Taraban, et al. //J. Photochem. Photobiol. A Chem.- 1993.-V.74.- P.75-79.

4. The mechanisms of the oxidation of NADH analogues. 4. Photooxidation of N-acetyl-substituted 1,4-dihydropyridine in the presence of quinones /N.E. Polyakov, A.I. Kruppa, T.V. Leshina et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chem.- 1997,- V.111.-P.61-64.

5. EPR Spin trapping detection of carbon-centered carotenoid and P-ionone radicals /T.A. Konovalova, N.E. Polyakov, L.D. Kispert et al. //Free Rad. Biol. Med.- 2000,- V.28.- P.1030-1038.

6. One-electron transfer product of quinone addition to carotenoids: EPR and optical absorption studies /N.E. Polyakov, V.V. Konovalov, T.V. Leshina, et al. //J. Photochem. Photobiol A: Chem.- 2001,- V.141.- P.l 17-126.

7. The Carotenoids as Antioxidants. Spin-Trapping ESR and Optical Study /N.E. Polyakov, A.I. Kruppa, T.V. Leshina, et al. //Free Rad. Biol. Med.-

2001.- V.31.- P.43-52.

8. Carotenoids as scavengers of free radicals in a Fenton reaction: antioxidants or pro-oxidants? /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, T.A. Konovalova et al. //Free Rad. Biol. Med.- 2001.- V.31.- P.398-404.

9. Electron transfer mediated geometrical cis-trans isomerization of polyenes /N. E. Polyakov, T. V. Leshina, L. D. Kispert //RIKEN Review- 2002,-V.44.-P.140-148.

10. The influence of electron donors and acceptors on isomers distribution under the photolysis of p-ionone /N. E. Polyakov, T.V. Leshina //Mol. Phys.-

2002,- V.100.- P.1297-1302.

11. Photoinitiated electron transfer interaction of all-trans retinal with electron donors and acceptors IN. E. Polyakov, V. S. Bashurova, P. S. Schastnev, et al. //J. Photochem. Photobiol., A: Chem.-1997.- V.107.- P.55-62.

12. Single electron transfer in the phototransformations of P-ionone in the presence of electron acceptors /N. E. Polyakov, A. I. Kruppa, V. S. Bashurova, et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chem.- 1999.- V.128.- P.65-74.

13. The role of radicals in the phototransformations of p-ionone in the presence of electron donors in solution /N. E. Polyakov, A. I. Kruppa, V. S. Bashurova, et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chem.- 2002.- V.153.-P.113-119.

14. Electron transfer mediated geometrical photoisomerization of a,p-unsaturated ketones in the presence of electron donors in solution /N. E. Polyakov, V. S. Bashurova, T. V. Leshina, et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chem.- 2002.- V.153.- P.77-82.

15. Изучение комплексов включения некоторых терпеноидов с (3-циклодекстрином методом ЯМР (Обзор) /О.А. Лузина, Н.Ф.Салахутдинов, Н.Э. Поляков, и др. /Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения- 2002.- №7,- С.21-25.

16. Radical pair dynamics observed with pulse-mode PYESR /N.E. Polyakov, M. Okazaki, Y. Konishi et al. //Applied Mag. Res.- 1994,- V.7.- P.149-166.

17. Dynamic properties of SDS micelle as detected by «Radical-pair-probe» with using pulse PYESR technique /М. Okazaki, N.E. Polyakov, K. Toriyama //J.Phys.Chem.- 1995,- V.99.- P.6452-6456.

18. Radical pair dynamics in the photoreduction of anthraquinone in SDS micellar solution detected by pulse-mode PYESR: temperature and salt dependences /N.E. Polyakov, M. Okazaki, Y. Konishi et al. //J.Phys.Chem.-1995,- V.99.- P.15108-15113.

19. A pulse-mode PYESR study on the dynamics of radical pair produced in photoreaction of anthraquinone in SDS micellar solution /N.E. Polyakov, M. Okazaki, Y. Konishi et al. /Я. Phys. Chem.- 1998,- V.98.- P.10558-10562.

20. PYESR study on the dynamic behaviour of RP generated in photoreaction of acetylenic ketones in SDS micellar solution /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, M. Okazaki et al. //J. Phys. Chem.- 1994,- V.98.- P.10563-10567.

21. Photochemistry of acetylenic ketones in SDS micellar solution as studied by PYESR and transient absorption techniques /N.E. Polyakov, M. Okazaki, H. Fukaya et al. //Photochem. Photobiol.- 1995.- V.61.- P.545-551.

22. Photo-CIDNP Study of the Interaction of Tyrosine with Nifedipine. An Attempt to Model the Binding Between Calcium Receptor and Calcium Antagonist Nifedipine /N.E. Polyakov, M.B. Taraban, T.V. Leshina //Photochem. Photobiol.- 2004.- V.80.- P.565-571.

23. Mechanisms of photoinduced electron transfer reactions of lappaconitine with aromatic amino acids. Time-resolved CIDNP study /N. E. Polyakov, V. K. Khan, M. B. Taraban, et al. //Org. Biomol. Chem.- 2005.- V.3.- P.881-885.

24. Некоторые аспекты реакционной способности каротиноидов. Окислительно-восстановительные процессы и комплексообразование /Н. Э. Поляков и Т. В. Лёшина //Успехи химии- 2006,- Т.75,- №12.-С.1175-1192.

25. p-Ionone cyclodextrins inclusion complexes: 'H NMR study and photolysis /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, A. Petrenko, et al. /Я. Photochem. Photobiol. A: Chem.-2003,-V.l61,- P.261-267.

26. Inclusion Complexes of Carotenoids with Cyclodextrins. 'H NMR, EPR and Optical Studies /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, T.A. Konovalova et al. //Free Rad. Biol. Med.- 2004.- V.36.- P.872-880.

27. Complexation of lappaconitine with glycyrrhizinic acid. Structure, stability and reactivity studies /N. E. Polyakov, V. K. Khan, M. B. Taraban //J. Phys. Chem. В.- 2005,- V.109.- P.24526-24530.

28. Host-Guest Complexes of Carotenoids with p-Glycyrrhizic Acid /N. E. Polyakov, T. V. Leshina, N. F. Salakhutdinov et al. /Я. Phys. Chem. B.-2006.- V.l 10,-P.6991-6998.

29. Antioxidant and Redox Properties of Supramolecular Complexes of Carotenoids with P-Glycyrrhizic Acid /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, N. F. Salakhutdinov, et al. //Free Rad. Biol. Med.- 2006,- V.40.- 1804-1809.

30. Окислительно-восстановительные реакции природного алкалоида лаппаконитина /Н. Э. Поляков и Т. В. Лёшина //Известия РАН, сер. Химическая- 2007,- №4.- С.608—619.

31. Phototransformation products of alkaloid lappaconitine: multinuclear NMR study /N. E. Polyakov, T. V. Leshina, A. V. Tkachev, et al. /Я. Photochem. Photobiol., A: Chem.- 2008.- V.l97,- P.290-294.

32. Complex of Calcium Receptor Blocker Nifedipine with Glycyrrhizic Acid /N. E. Polyakov, V. K. Khan, M. B. Taraban, et al. //J. Phys. Chem. B.-2008.- V.l 12.- P.4435-4440.

Подписано к печати 7 июля 2009 г. Тираж 100 экз. Заказ №964 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090. Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел. 335 - 66

- ВВЕДЕНИЕ.

- ГЛАВА 1. Экспериментальная часть.

1.1. Измерение и анализ стационарных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях

1.2. Измерение время-разрешенных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях.

1.3. Измерение и анализ эффектов ХПЯ в слабых магнитных полях.

1.4. Метод PYESR с временным разрешением для измерения кинетических параметров образования и гибели короткоживущих радикальных пар.

1.5. Метод ЭПР со спиновыми ловушками как инструмент для измерения скоростей радикальных реакций.

1.6. Методы измерения стехиометрии и констант стабильности комплексов включения органических соединений.

- ГЛАВА 2. Исследование механизмов окисления синтетических аналогов NADH.

2.1. Введение.

2.2. Фотоокисление 1,4-дигидропиридинов хинонами.

2.3. Исследование парамагнитных интермедиатов методами СПЯ и ХПЯ в слабых магнитных полях.

2.4. Фотоокисление N-ацетил замещенного 1,4-дигидропиридина в растворе.

3.2. Фотоиндуцированная изомеризация а,Р-ненасыщенных кетонов.-51

3.3. Фотоизомеризация ретиналя.-59

3.4. Фотоиндуцированные превращения изомеров р-ионона в растворах.-70

3.5. Заключение.-100

- ГЛАВА 4. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов.-101

4.1. Введение.-101

4.2. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов с хинонами и ионами металлов.-103

4.3. Реакции каротиноидов со свободными радикалами. Антиоксидантные свойства каротиноидов.-107

4.4. Роль процессов с переносом электрона в про-оксидантной активности каротиноидов.-116

4.5. Заключение.-124

- ГЛАВА 5. Попытка моделирования элементарных стадий лиганд-рецепторных взаимодействий.-126

5.1. Постановка задачи.-126

5.2. Моделирование взаимодействия нифедипина с кальциевым рецептором с использованием методов спиновой химии.-127

5.3. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов с участием природного алкалоида лаппаконитина.-140

5.3.1. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов в реакциях лаппаконитина с индивидуальными аминокислотами.-140

5.3.2. Изучение механизма фототрансформации лаппаконитина методами ХПЯ и ЯМР.-152

5.4. Выводы и биологическое значение результата.-165 ГЛАВА 6. Исследование кинетических закономерностей поведения радикальных пар в мицеллярных растворах с использованием импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП.-167

6.1. Введение.-167

6.2. Описание методики.-168

6.3. Изучение динамики радикальных пар в мицелярных растворах.-174

6.4. Исследование структуры и динамики мицелл с использованием время-разрешенного метода PYESR. Влияние температуры и концентрации соли на структуру и динамику мицеллы.-178

6.5. Фотохимия ацетиленовых кетонов в SDS мицеллах. Влияние внешнего магнитного поля на выход радикальных продуктов реакции.-189

6.6. Заключение.:.-200

• ГЛАВА 7. Влияние организованной среды на окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений.-202

7.1. Введение.-202

7.2. Строение и реакционная способность комплексов включения каротиноидов с цикло декстринами.-203

7.3. Супрамолекулярные комплексы каротиноидов с глицирризиновой кислотой.-221

7.4. Изучение комплексообразования нифедипина с глицирризиновой кислотой. .-237

7.5. Исследование влияния комплексообразования на реакционную способность лаппаконитина.-245

7.6. Выводы и биологическое значение результатов.-251

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.-253

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.-254

Введение.

В последнее десятилетие произошел качественный скачок в исследовании химических процессов происходящих в живой природе. Этот прогресс характеризуется, прежде всего, переходом с макро уровня на микро уровень в понимании механизмов этих процессов. Особый прогресс был достигнут в биологии и медицине, свидетельством чему является присуждение Нобелевских премий по медицине в последние годы. Немалая заслуга в этом принадлежит, несомненно, развитию и применению новых физических методов исследования биологически важных процессов. В настоящей работе с помощью современных физических методов исследована роль парамагнитных интермедиатов ряда конкретных биологически активных соединений в процессах, представляющих практический интерес для биологии и медицины. Это - окисление 1,4-дигидропиридинов - аналогов- кофермента NADH, лиганд-рецепторное взаимодействие, цис-транс изомеризация полиенов, антиоксидантная активность каротиноидов, а также фотостабильность и фототоксичность ряда лекарственных препаратов.

Современные физические методы позволяют не только изучать структуру продуктов конкретных биохимических процессов, но и получать новую информацию о структуре И' временах жизни короткоживущих интермедиатов этих реакций, а также о механизмах процессов на молекулярном уровне. Широкое применение в биологии и- медицине нашли структурные методы исследования. В частности, методы химической радиоспектроскопии (ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)) позволяют исследовать структуру и динамику сложных биологических молекул и их парамагнитных форм. В настоящее время эти методы применяются для исследования структуры белков, олиго- и поли-нуклеотидов и других биополимеров. Поскольку биологическая активность биополимеров напрямую связана с их пространственной структурой, эти данные имеют огромное практическое значение, в частности, для понимания механизмов работы клеточных рецепторов и для создания новых более эффективных лекарственных форм.

Наряду со структурными методами широкое развитие получили кинетические методы исследования химических процессов. Большая часть этих методов основана на импульсной инициализации реакций с последующей регистрацией временной эволюции исходных соединений или продуктов реакции (конечных и промежуточных). Наибольшим временным разрешением обладают фотохимические и радиационные методы генерации химической реакции. Помимо огромного разнообразия фотохимических процессов происходящих в живой природе, эти методы позволяют генерировать и изучать свойства промежуточных парамагнитных интермедиатов, про которые известно, что они образуются в темновых реакциях в живых клетках. Моделирование, в частности, ферментативных процессов с помощью фотохимической генерации позволяет повысить концентрацию короткоживущих парамагнитных интермедиатов, и тем самым облегчает их регистрацию. Такой же цели нередко служит проведение реакций в так называемых организованных средах (мицеллы, комплексы «гость - хозяин», и др.). Известно, что большинство фотохимических процессов и многие ферментативные процессы протекают по радикальному механизму. В настоящей работе автор также будет прибегать к такого рода моделированию, т.е. исследовать модельные фотопревращения биологически важных молекул, а также их реакции в организованных средах.

Целью настоящей диссертационной работы являются исследования методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии роли корокоживущих парамагнитных интермедиатов, образующихся в процессах с участием биологически важных молекул в растворах и организованных средах. В качестве объектов исследования выбраны 1,4-дигидропиридины - синтетические аналоги NADH, природные полиены, включая ретиналь, являющийся частью зрительного пигмента родопсина, и каротиноиды, а также биологически активные карбонильные соединения и некоторые лекарственные препараты. Выбор объектов, определяющий во многом актуальность и практическую» значимость представленной работы связан со следующими обстоятельствами. Все выбранные соединения, или их природные аналоги, участвуют в биологических системах в окислительно-восстановительных превращениях, механизмы которых не были установлены.ранее. И именно роль парамагнитных частиц в этих процессах, являлась, а кое-где является и поныне, предметом дискуссии.

В настоящее время методики спиновой химии занимают' важнейшее место в исследованиях процессов с участием радикальных частиц. Эти методы основаны на явлении химической поляризации ядер (ХПЯ) и электронов (ХПЭ), а также на явлении влияния магнитного поля на радикальные химические процессы, открытые в семидесятые годы группой новосибирских и московских ученых (открытие № 300 «Закономерность радикальных химических процессов», авторы: A.JI. Бучаченко, Э.М. Галимов, Т.В. Лешина, Ю.Н. Молин и Р.З. Сагдеев). К преимуществам этих методов относится их более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методами ЯМР и ЭПР, а также высокая информативность. Так, метод ХПЯ позволяет одновременно получать информацию о парамагнитных интермедиатах, конечных продуктах реакции, и кинетике отдельных стадий.

Говоря о преимуществах тех или иных методов исследования, нельзя не отметить, что каждый метод имеет и свои ограничения, и по области применения, и по чувствительности, и по временному разрешению. Поэтому каждый метод в отдельности, как правило, не дает всей необходимой информации о процессе, особенно для таких сложных объектов, какими являются биологические системы. Для более глубокого изучения механизмов сложных процессов необходимо применение комбинации различных методов, а также создание новых методик и экспериментальных установок, наилучшим образом подходящих для решения конкретной задачи. В представленной работе значительное внимание уделяется разработке и применению комплексного использования современных физико-химических методов для исследования биологически важных процессов. Особое внимание уделено время-разрешенным методам спиновой химии в сочетании с оптической спектроскопией, ЭПР и ЯМР в стационарном и импульсном вариантах. Подробному описанию используемых в этих исследованиях экспериментальных установок и методических подходов посвящена Глава 1 диссертации. Основная часть работ выполнена в лаборатории Магнитных явлений Института химической кинетики и горения СО РАН на ЯМР спектрометрах фирм Varian, Bruker и Jeol с различной напряженностью магнитного поля, снабженных стационарными и импульсными источниками света для проведения фотохимических экспериментов и регистрации эффектов ХПЯ. Кроме того, часть работ выполнена автором диссертации в рамках международного сотрудничества с коллегами из Латвии, США и Японии-. Мы благодарны коллегам из Латвии за синтез широкого набора замещенных 1,4-дигидропиридинов - аналогов природного кофермента NADH. В. содружестве с Университетом штата Алабама, США (Проф. Л.Д. Кисперт), выполнен цикл работ, посвященный исследованию окислительно-восстановительных процессов с участием широкого набора каротиноидов и их супрамолекулярных комплексов. Совместно с группой Д-ра Оказаки (National Industrial Research Institute of Nagoya, Japan) создан время-разрешенный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) для исследования динамики радикальных пар и магнитных эффектов! в организованных средах. В проведении расчетов участвовали сотрудники лаборатории Теоретической химии ИХКГ СО РАН, Проф. Счастнев П.В. и Башурова B.C.

Главы 2-7 настоящей диссертации посвящены описанию конкретных исследований процессов с участием биологически важных соединений с использованием набора физических методов. При этом результаты работы поделены на две части: исследование процессов в гомогенных растворах (главы 2-5) и в организованных средах (комплексы «хозяин — гость» и мицеллы, главы 6-7).

Вторая глава диссертации посвящена исследованию процессов с переносом электрона в реакциях 1,4-дигидропиридинов (ДГП) - синтетических аналогов природного кофермента NADH. Дискуссия о возможностях гетеролитического и гемолитического механизмов превращения этого соединения в живых системах не утихает последние несколько десятилетий. В настоящей работе исследования проводились с использованием различных методов спиновой химии: ХПЯ в сильных и слабых магнитных полях, ХПЯ с временным разрешением, а также СПЯ (стимулированная поляризация ядер). Исследование модельных реакций фотоиницированного окисления целого ряда замещенных 1,4-дигидропиридинов в присутствии различных акцепторов электрона и сравнение фотоинициированных и темновых процессов позволило установить роль радикальных частиц в этих процессах. В частности, удалось проследить за всеми тремя* стадиями процесса превращения ДТП в пиридин: последовательный перенос электрона, протона и атома водорода, или электрона, протона, электрона). Сравнения эффектов ХПЯ ряда замещенных ДГП показали, что механизм реакции существенно различается для N-замещенных и N-незамегценных ДГП. Для того, чтобы установить как зависит механизм реакции от физико-химических параметров системы, от полярности среды и структуры молекулы ДГП, был изучен фотолиз различных синтетических N-замещенных и N-незамещенных ДГП в полярной и неполярной средах.

Следующий цикл работ посвящен исследованию механизмов цис-транс изомеризации полиненасыщенных соединений. Этот вопрос подробно освещен в Главе 3 диссертации. В< этой главе описаны механизмы» цис-транс изомеризации, полиенов,' включающие стадию переноса электрона. В'отличие от оптических методов исследования, методы ЯМР и ХПЯ позволяют раздельно наблюдать сигналы от разных изомерных форм, что позволило нам впервые применить эти методы для исследования механизмов изомеризации сложных молекул содержащих несколько сопряженных двойных связей. Следует отметить, что доказательство участия одноэлектронного переноса в процессе цис-транс фотоизомеризации замещенных этиленов в присутствие доноров и акцепторов электрона впервые было получено именно методами спиновой химии и это считается одним из важных её достижений. Изучение свойств ион-радикалов природных полиенов в настоящее время приобретает особую актуальность, поскольку они входят в состав многих биологических систем, в которых идут процессы цис-транс изомеризации, предположительно с переносом заряда. Так, например,* 11 -цис ретиналь является хромофором зрительного пигмента родопсина. Считается, что его цис-транс изомеризация инициирует процесс зрительного восприятия в глазу человека и других млекопитающих. В представленном цикле работ получены экспериментальные доказательства участия следующих промежуточных короткоживущих частиц в реакциях цис-транс изомеризации полиенов: триплетные возбужденные состояния, образующиеся при рекомбинации триплетной ион-радикальной пары; катион-радикалы и дикатионы; а также вторичные интермедиаты образующиеся из ион-радикалов: нейтральные радикалы и бирадикалы. Для каждого из описанных вариантов установлен детальный механизм изомеризации.

Примером комплексного подхода к изучению биологически важных процессов является исследование окислительно-восстановительных реакций каротиноидов, описанное в четвертой главе. В представленном цикле работ, выполненных с использованием различных физико-химических методов исследования (ЯМР, ЭПР (включая импульсные методики), ХПЯ, ВЭЖХ, электрохимия, оптическая спектроскопия и флюоресценция) изучен ряд окислительно-восстановительных процессов с участием природных и синтетических каротиноидов. Известно, что каротиноиды являются одним из самых распространенных классов пигментов'в природе. Они синтезируются растениями и микроорганизмами и присутствуют во многих пищевых продуктах, включая овощи, фрукты и рыбу. В большинстве природных процессов, включая фотосинтез, их роль чаще всего связывают с реакциями переноса энергии и электрона. В медицине интерес к каротиноидам связан, прежде всего, с их антиоксидантными свойствами. Сегодня антиоксиданты, и в частности каротиноиды, используются на практике в комплексном лечении таких серьезных заболеваний,как рак, болезни сердца, нервной системы, а также возрастные дегенеративные изменения мышечных тканей. В связи с упомянутым" интересом к антиоксидантным свойствам каротиноидов можно утверждать, что именно химические и физико-химические исследования реакционной способности каротиноидов в окислительно-восстановительных процессах в настоящий момент являются приоритетными. Сегодня исследователи разных специальностей, от физиков и химиков, до биологов и медиков, заняты выяснением природы основных факторов, определяющих их антиоксидантную активность. Имеющаяся в литературе информация о короткоживущих парамагнитных и диамагнитных интермедиатах, образующихся в реакциях каротиноидов со свободными радикалами, весьма ограничена, а структура интермедиатов, как правило, только предполагается. Поэтому именно на исследования, связанные с реакционной способности каротиноидов, а также их короткоживущих парамагнитных интермедиатов» были направлены работы, описанные в настоящей главе диссертации. Показано, что в зависимости от условий эксперимента и природы каротиноида они могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидантные свойства. При этом, антиоксидантная активность каротиноидов напрямую связана с их восстановительной способностью.

В пятой главе диссертации описан развитый в рамках настоящей работы оригинальный подход к изучению механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий на молекулярном уровне на примере моделирования взаимодействия ряда лекарственных препаратов и их комплексов с активными центрами рецепторов. Понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач биохимии и фармакологии. Успешное решение этой проблемы имеет принципиальное значение не только для фундаментальной науки. Понимание механизма взаимодействия лекарства с клеточным рецептором может стать определяющим фактором при разработке новых лекарственных средств. Вот почему в последние годы стали появляться работы направленные на изучение механизмов процессов происходящих в активных центрах клеточных рецепторов на молекулярном уровне, постепенно вытесняя широко используемый до этого макроскопический подход. Представленный экспериментальный подход основан на моделировании с помощью физических методов отдельных стадий процесса взаимодействия лекарства с аминокислотами, остатки которых располагаются в активных центрах клеточных рецепторов. Основой для построения модели послужили приведенные в литературе расчеты, указывающие на образование донорно-акцепторного комплекса между молекулой гипотензивного препарата - нифедипина и аминокислотой — тирозином, располагающимся в активном сайте кальциевого рецептора. В работе было предположено, что в таком комплексе может происходить одноэлектронный перенос. Данная гипотеза* была проверена и получила экспериментальное подтверждение на примере двух лекарственных препаратов: нифедипина - блокатора кальциевых рецепторов, и лапаконитина — блокатора натриевых каналов. Механизм взаимодействия между молекулами лекарств и аминокислотами тирозином и триптофаном, входящими в активные центры соответствующих рецепторов, изучен методами ядерного магнитного резонанса и химической поляризации ядер, включая версию с временным разрешением. Доказано, что первичной стадией процесса в обеих системах действительно является перенос электрона. Показано, что анион-радикалы обоих лекарственных соединений нестабильны и быстро (в микросекундном временном диапазоне) превращаются в продукты, не способные к связыванию с рецептором. Этот факт важен, поскольку проливает свет на практически не изученную природу диссоциации комплекса лекарства с рецептором.

Отдельный интерес представляют результаты исследования фотохимии нифедипина и лаппаконитина в растворах в присутствие доноров и акцепторов электрона. Вопрос о фотостабильности лекарственных препаратов весьма актуален для фармакологии, поскольку фотораспад приводит не только к уменьшению терапевтической активности препарата, но и может привести к образованию токсических продуктов или интермедиатов. Показано, что оба этих соединения фоточувствительны в УФ диапазоне и при фото возбуждении вступают в реакции переноса электрона с рядом аминокислот, а также другими органическими молекулами. Установлено, что результатом реакции является образование широкого набора N-, О-, и С-центрированных свободных радикалов и ион-радикалов нифедипина, лаппаконитина и партнеров. Кроме того, в триплетном возбужденном состоянии лаппаконитин сам подвергается внутримолекулярному переносу электрона с образованием бирадикала. Детально описаны механизмы всех исследованных процессов. Не исключено, что именно короткоживущие парамагнитные интермедиаты являются причиной высокой токсичности лаппаконитина.

Во второй части диссертации (главы 6-7) описываются окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений в организованных средах и развитый оригинальный подход для исследования кинетики процессов в организованных средах — мицеллах.

Шестая глава посвящена изучению динамики радикальных пар в мицеллярных растворах. Эта проблема представляет интерес, прежде всего, с точки зрения понимания механизмов межмолекулярных взаимодействий в системах с ограниченной подвижностью, к которым можно отнести практически все биологические системы. Отметим, что именно в таких системах были зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выход продуктов реакции. В последние несколько десятилетий вопрос о влиянии слабых магнитных и электрических полей на живые системы привлекает внимание многих исследователей, включая медиков и биологов. Это связано как с фундаментальными проблемами понимания механизмов ориентации животных в магнитном поле Земли, так и с практическими задачами оценки возможного вредного воздействия современных диагностических и лечебных методов. Обнаружение в наших работах значительных магнитных эффектов (сотни процентов) на выход свободных радикалов в фотоинициированных процессах с участием ряда карбонильных соединений является наглядной демонстрацией, как актуальности этих проблем, так и реальности решения стоящих перед наукой задач.

В представленном цикле работ реализована идея об использовании импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. Созданный в результате данной работы время-разрешенный импульсный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) обладает целым рядом преимуществ перед существовавшими на тот момент методиками, использующими аналогичный принцип микроволновой накачки электронных переходов в РП. В работе были измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений (антрахинон и ацетилен-замещенные ароматические кетоны) в мицеллярных растворах, а также изучено влияние внешних факторов (температура и концентрация соли) на структуру и динамику самих мицелл. Отметим, что все исследованные системы представляют интерес и с точки зрения их биологической активности. Известно, что многие природные и синтетические антрахиноны и их производные обладают противоопухолевой активностью, а ацетилен-содержащие кетоны используются как антигрибковые препараты.

В первой части следующей Главы затронута проблема касающаяся комплексообразования каротиноидов и влияния организованной среды на их реакционную способность в окислительно-восстановительных процессах. Известно, что такие свойства каротиноидов, как гидрофобность, высокая фоточувствительность и химическая активность, существенно затрудняют их применение на практике. Одним из путей решения подобных проблем в фармакологии, является использование комплексов включения типа «гость-хозяин». Молекулы «гостя» в комплексе могут изменить свои физические, химические и биологические свойства. Установлено, что комплексообразование может значительно увеличить стабильность и биодоступность включенных молекул. Работы представленные в диссертации можно считать пионерскими, поскольку в литературе практически отсутствовали данные, касающиеся физико-химических свойств комплексов включения каротиноидов. Интересной находкой' в этом плане явилось использование в качестве молекулы «хозяина» р-глицирризиновой кислоты - природного соединения принадлежащего к тритерпеновым гликозидам. Показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов. Было зарегистрировано уменьшение скоростей переноса электрона в реакции с акцепторами, а также удлинение времени жизни катион-радикалов каротиноидов в комплексах, приводящее к изменению соотношения продуктов реакции. Экспериментально обнаружено многократное увеличение скорости захвата перекисных радикалов (антиоксидантная активность) каротиноидами в комплексе, и установлена причина этого явления. Следует отметить, что, несмотря на большой интерес к использованию комплексов включения с целью направленного изменения свойств включенных соединений, до сих пор остается открытым вопрос о природе влияния комплексообразования на их реакционную способность. Представленные в настоящей главе результаты исследований процессов одноэлектронного переноса с участием комплексов каротиноидов, — это немногочисленные примеры попыток ответить на поставленные вопросы. Прежде всего, показано, что перенос электрона характерен для каротиноидов не только при их превращениях в фотосинтетических центрах, но и при взаимодействии со свободными радикалами, а также при цис-транс изомеризации. Можно констатировать, что именно склонность к одноэлектронному переносу объединяет наиболее важные биологические процессы с участием каротиноидов, начиная от фотосинтеза и фотоизомеризации ретиналя в* составе зрительного пигмента родопсина, и кончая их антиоксидантной активностью.

В'Главе 7 представлен также цикл работ, посвященных исследованию структуры и реакционной способности комплексов включения нифедипина и лаппаконитина с. глицирризиновой- кислотой. Поводом для данных исследований явилось экспериментальное обнаружение значительного (в десятки и- сотни раз)' усиления терапевтической активности этих препаратов в^ присутствие глицирризиновой кислоты. Создание- эффективных лекарственных препаратов на основе комплексов-включения-с природными; соединениями сегодня является бурно развивающейся- областью медицинской' химии. Использование комплексов^ включения позволяет направленно' регулировать (усиливать или ослаблять) те или иные свойства лекарственных соединений. Используя оптическую и ЯМР спектроскопию (включая релаксационные методы) удалось показать, что глицирризиновая1 кислота, образует очень стабильные комплексы как с нифедипином, так, и с лаппаконитином. Показано, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде и существенно снижает скорость фоторазложения нифедипина и лаппаконитина и выход свободных радикалов. Данный результат может иметь практическое значение для- увеличения фотостабильности, других лекарственных препаратов, увеличения их биодоступности и снижения токсичности (включая, фототоксичность).

В. заключение отметим, что полученные в настоящей работе результаты могут представлять интерес для. разных областей науки, (химическая физика, химия, биохимия, медицина). Кроме того, результаты, полученные во второй части диссертации, касающиеся повышению стабильности каротиноидов и лекарственных препаратов за счет комплексообразования; имеют несомненное практическое значение и будут небезынтересны для пищевой промышленности, косметологии и фармакологии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

I. В первой части работы, в результате исследования строения и свойств радикальных интермедиатов в растворах, установлены детальные механизмы ряда биологически значимых процессов:

1) Продемонстрировано, что фотоинициированное окисление акцепторами электрона синтетических аналогов NADH - 1,4-дигидропиридинов (ДГП) проходит по радикальному пути с образованием тех же продуктов, которые получаются и в реакциях смешения: соответствующих пиридинов или катионов пиридиния.

2) На примере широкого набора полиненасыщенных соединений получены экспериментальные доказательства участия короткоживущих парамагнитных частиц в реакциях фотоинициированной цис-транс изомеризации.

3) Продемонстрировано, что скорости реакций перекисных радикалов с каротиноидами с коррелируют с их окислительными потенциалами. Это прямо указывает на связь антиоксидантной активности каротиноидов с процессом переноса электрона. Установлено, что каротиноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидан гные свойства, и определена роль ионов металлов в этих процессах.

4) Показано, что при фотолизе лекарственных препаратов нифедипина и лаппаконитина в растворах образуются активные короткоживущие парамагнитные интермедиаты: бирадикалы, ион-радикалы и нейтральные радикалы, могущие быть причиной фототоксических побочных эффектов, возникающих при медицинском применении этих препаратов.

II. Во второй части исследованы процессы в организованных средах:

5) Создан время разрешенный импульсный вариант метода PYESR, позволяющего регистрировать спектры ЭПР короткоживущих радикальных пар. Измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда биологически активных карбонильных соединений в мицеллах SDS, а также зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выхода и времена жизни свободных радикалов.

6) Показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов в окислительно-восстановительных реакциях. Обнаружено, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде, и существенно увеличивает фотостабильность нифедипина и лаппаконитина. Последний результат может быть использован в медицинской практике, т.к. исследованные лекарства являются фототоксичными.

6.6. Заключение.

В представленной главе описана идея использования импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. В результате реализации этой идеи был создан время-разрешенный импульсный вариант метода product-yield-detected-ESR, PYESR. Применение данной методики позволяет детектировать спектр ЭПР промежуточной радикальной пары по изменениямs в выходе продукта реакции -долгоживущего спинового аддукта. В этом заключается преимущество данного подхода перед остальными аналогичными методиками, поскольку мы не ограничены ни в выборе системы (не требуется присутствие флуоресцирующего реагента как в методе ОДЭПР), ни в скорости регистрации (как в методе СПЯ). Дополнительное преимущество данного метода по сравнению с обычным методом ЭПР заключается еще и в возможности детектировать короткоживущие геминальные РП при комнатных температурах. Необходимым условием регистрации качественных спектров PYESR является наличие большого магнитного эффекта реакции, что достигается в данной методике использованием мицеллярных растворов. Демонстрация значительных эффектов магнитного поля на выход продуктов реакции в организованной среде, представленная в данной главе, имеет большое самостоятельное значение, поскольку организованная среда имеет непосредственное отношение ко всем биологическим системам. Интерес исследователей к проблеме влияния внешнего слабого магнитного поля на химические процессы в живой природе связан с попыткой понять механизм ориентации животных и птиц по сторонам света, с анализом возможного вредного воздействия электромагнитных излучений на здоровье человека, а также с поиском новых возможностей управления химическими процессами.

Приведенные в данной главе примеры использования метода PYESR с временным разрешением демонстрируют уникальные возможности данного метода для получения кинетической информации о динамике радикальных пар в растворах. В настоящей работе были измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений (антрахинон и ацетиленовые кетоны) в мицеллярных растворах. Полученные данные о структуре радикальных пар и о кинетике процесса фотовосстановления хорошо согласуются с данными полученными другими методами, в частности, методами ХПЯ и лазерного импульсного фотолиза. Отметим, что использование в исследовании комбинации различных кинетических методов существенно повышает объем и достоверность полученной информации. В последующие годы этот метод успешно применялся нашими японскими коллегами для исследования бирадикалов, а также радикальных пар в других средах с ограниченной подвижностью, в частности, в нанопорах [321-322].

В контексте глобальной проблемы влияния организованной среды на реакционную способность химических соединений, рассматриваемой в настоящей диссертации, наиболее важными являются следующие наблюдения. Это существенные изменения времен жизни РП и вероятностей клеточной рекомбинации свободных радикалов в мицеллах по сравнению с гомогенным раствором, а также зависимость динамики партнеров РП от параметров самой мицеллы. Эти наблюдения содержат указания на возможные причины изменений в механизмах и направлении реакций для многостадийных радикальных процессов в организованных средах. Исследованию таких процессов с участием биологически важных соединений методом ХПЯ, а также другими физическими методами посвящена следующая глава диссертации.

ГЛАВА 7. Влияние организованной среды на окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений.

7.1. Введение

Исследование влияния организованной среды на радикальные процессы с участием биологически активных соединений представляет интерес с нескольких точек зрения. Во-первых, такие исследования помогают лучше понять механизмы химических процессов происходящих в живой природе. А, во-вторых, они имеют несомненное прикладное значение, поскольку многие из этих соединений широко используются в качестве лекарственных препаратов, витаминов или пищевых продуктов. В последние годы стало развиваться направление, связанное с попыткой усилить терапевтическое действие препаратов с помощью комплексов включения. Использование супрамолекулярных комплексов в медицине сегодня является одним из наиболее эффективных способов улучшения свойств существующих лекарственных препаратов. Наибольшие успехи в этом направлении были достигнуты в увеличении растворимости лекарств, повышении их биодоступности и уменьшении побочных эффектов.

В настоящей главе описаны результаты работ посвященных изучению влияния комплексообразования на реакционную способность ряда биологически активных соединений (ряда каротиноидов и двух лекарственных препаратов, нифедипина и лаппаконитина) в процессах, , которые в растворах исследовались в первой части диссертации. Используемые комплексанты, циклодекстрины (ЦД) и глицирризиновая кислота (ГК), а также методы анализа комплексов включения подробно описаны в Главе 1 настоящей диссертации. Поводом для начала этих исследований послужило открытие, сделанное с участием автора настоящей работы, значительного увеличения терапевтической активности лаппаконитина и нифедипина (в 20 и 300 раз, соответственно) в присутствие ГК. Было предположено, что данный эффект может быть связан с образованием комплексов ГК с лекарственным соединением, но ни структура этих комплексов, ни механизм влияния комплексообразования на терапевтическую активность препарата известны не были. Отметим, что лаппаконитин и нифедипин являются не единственными примерами, для которых был обнаружен синергизм при совместном использовании с глицирризиновой кислотой.

Учитывая, что в настоящее время создание супрамолекулярных комплексов лекарственных препаратов с различными природными соединениями является одним из самых многообещающих направлений в области медицинской химии, полученные нами

202 результаты, безусловно, имеют и самостоятельную значимость в плане использования глицирризиновой кислоты для повышения биодоступности и фотостабильности биологически активных соединений.

7.2. Строение н реакционная способность комплексов включения каротиноидов с циклодекстринами.

Применение каротиноидов в качестве антиоксидантов на практике (в пищевой промышленности, косметологии и медицине) сильно затруднено из-за нестабильности каротиноидов в присутствие кислорода воздуха, их гидрофобности и высокой светочувствительности. Поэтому, целью получения из них комплексов включения является, прежде всего, преодоление указанных трудностей при использовании каротиноидов. Наибольшее количество работ в этой области посвящено приготовлению и изучению свойств комплексов каротиноидов с циклодекстринами (Рис. 1.10). Прикладные исследования уделяли основное внимание улучшению растворимости и стабильности каротиноидов в водных растворах [323-325], а фундаментальные - изучению структуры комплексов, биодоступности каротиноидов на клеточном уровне, проникновению каротиноидов через клеточные мембраны, а также использованию циклодекстринов как моделей природных ферментов [326-336].

Благодаря разнообразию и насыщенности цветовой гаммы каротиноидов, они нашли применение в пищевой промышленности не только как антиоксиданты, но и как красители для пищевых продуктов. Применение комплексов каротиноидов с циклодекстринами в качестве пищевых красителей продемонстрировало как увеличение стабильности красителя при хранении, так и получение более стойкой окраски продуктов питания. В частности, добавление в рацион питания лососевых рыб комплекса астаксантина с циклодекстрином значительно улучшает стойкость окраски мяса лосося при хранении по сравнению с добавкой чистого астаксантина [337]. Комплекс циклодекстрина с Р-каротином обладает значительно менее насыщенной окраской по сравнению с раствором Р-каротина в органических растворителях. Ряд авторов используют даже термин «бесцветный» для характеристики этого комплекса [325]. Это качество комплекса заинтересовало косметологов, которые предложили использовать комплекс в качестве добавки в косметические крема в качестве антиоксидантов [323]. Полученные таким способом составы обладают приятным розовым цветом, в отличие от насыщенно-кирпичного при добавке чистого Р-каротина. В России комплекс Р-каротина с Р-циклодекстрином широко применяется под названием «Циклокар» как биологически активная добавка, а также как сырье для пищевой промышленности и детского питания

338, 339]. В тоже время, показано, что хотя (3-циклодекстрин и увеличивает стабильность P-каротина по отношению к действию света, повышенной температуры и кислорода воздуха, применение других циклодекстринов, а именно а-циклодекстринов и в особенности метилированных (3-циклодекстринов дает существенно больший эффект [340]. Широкое применение на практике именно (3-циклодекстрина связано по-видимому с его доступностью и относительно низкой стоимостью.

В связи с этим, нельзя не отметить, что авторы перечисленных прикладных работ не рассматривают вопрос о сохранении полезных свойств каротиноидов при комплексообразовании, в частности их антиоксидантной активности. Поскольку антиоксидантная активность каротиноидов, как было показано выше, связана с их реакциями со свободными радикалами, комплексообразование вполне способно оказать влияние на эти процессы. Поэтому этот вопрос требовал специального исследования.

7.2.1. Комплексы включения циклодекстринов с /З-иононом.

Логично предположить, что образование комплекса будет происходить путем включения циклогексенового кольца каротиноида во внутреннюю полость циклодекстрина. Поскольку каротиноиды практически не растворимы в водных растворах, на первом этапе работы мы исследовали образование комплекса со структурным аналогом большинства каротиноидов, Р-иононом [341].

Комплексы готовились путем смешения водных растворов ЦД со спиртовым раствором Р-ионона и дальнейшего перемешивания смеси на магнитной мешалке в течение нескольких часов. Для доказательства образования комплекса использовался один из наиболее удобных и информативных методов исследования комплексов включения, а именно спектроскопия ЯМР [342]. Этот метод дает прямое доказательство включения органического субстрата в полость ЦД. Причиной высокой чувствительности метода ЯМР является изменение магнитного окружения протонов расположенных во внутренней полости ЦД (Нз и Н5) при вытеснении молекул воды молекулой «гостя» (см. Рис. 1.10). Это отражается в заметном изменении химических сдвигов протонов Нз и Н5, в то время как химические сдвиги внешних протонов Hi, Н2 and Н4 остаются неизменными. Метод ЯМР дает информацию о стехиометрии, динамике и структуре комплекса 4

-p-lonone включения. В частности, диаграмма Джоба (зависимость химического сдвига от относительной концентрации субстрата и ЦД) позволяет рассчитать стехиометрию комплекса [342, 343]. В таблице 7.1 приведены значения химических сдвигов протонов Р-ЦД и Р-ионона (индивидуальные и в комплексе) в водном растворе.

1. Бучаченко A. JI. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях / A. JT. Бучаченко, Р. 3. Сагдеев, К. М. Салихов-Москва: Наука, 1978,- 296с.

2. Goez М. Pseudo steady-state photo-CIDNP measurements /M.Goez //Chemical Physics Letters-1992,- V.188.- P.451-456.

3. Kaptein R. Simple Rules for CIDNP /R.Kaptein //Journal of the Chemical Society Chemical Communication- 1971,- V.21.- P.732-733.

4. Salikhov K.M. Mutual effect of nuclei upon CIDNP in high field. Violation of Kaptein rules /К.М. Salikhov //Chem. Phys.- 1982,- V.64.- P.371-380.

5. Polyakov N.E. Mutual Effects of Nuclei on CIDNP Formation in Benzophenone /N.E. Polyakov, T.V. Leshina, R.Z.Sagdeev //Chem. Phys. Lett.- 1985.- V.14.- P.566-571.

6. Hore P.J. An exception to the CIDNP sign rules /P.J. Hore, S. Stob, J. Kommink, R. Kaptein //Chem. Phys. Lett.- 1983.- V.98.- P.409-413.

7. Schaublin S. Fourier spectroscopy of nonequilibrium states, application to CIDNP, Overhauser experiments and relaxation time measurements /S. Schaublin, A. Honener and R.R. Ernst //J.Magn.Reson.- 1974,- V.13.- P. 196-216.

8. Closs G.L. Laser flash-photolysis with MMR detection. Microsecond time-resolved CIDNP separation of geminate and random phase processes /G.L. Closs and R.J. Miller //J.Am.Chem.Soc.-1979.- V.101.- P.1639-1644.

9. Miller R. J. Application of Fourier transform NMR spectroscopy to submicrosecond time-resolved detection in laser flash photolysis /R. J. Miller and G. L. Closs //Rev. Sci. Instrum.- 1981.- V.52.-P.1876-1885.

10. Shaw D. Fourier transform NMR spectroscopy /D. Shaw.- Amsterdam: Elsevier, 1976.

11. И. Фаррар Т. Импульсная и фурье спектроскопия ЯМР /Т. Фаррар, Э. Беккер,- М: Мир, 1973.

12. Ноге P. J. Photochemically induced dynamic nuclear polarization (photo-CIDNP) of biological molecules using continuous wave and time-resolved methods /Р. J. Hore, R.Kaptein //A.C.S. Symposium Series- 1982,- V.191.- P.285-318.

13. Изучение эффектов ХПЯ с разрешением во времени в реакции переноса атома водорода при фотолизе бензальдегида в растворе /Ю.П. Центалович, А.А. Обыночный, М.В. Бурлов и др. /Теорет.эксперим. химия- 1988,-№.24.- С.324-329.

14. Tsentalovich Yu.P. Time-resolved CIDNP study of hydrogen transfer in the photolysis of carbonyl-containing compounds /Yu.P. Tsentalovich, A.A. Obynochny, R.Z. Sagdeev //Chem. Phys.- 1989,-V.139.- P.301-306.

15. Kinetics of nuclear polarization in the geminate recombination of biradicals /Yu.P.Tsentalovich, A.V.Yurkovskaya, R.Z.Sagdeev et al. /Chem. Phys.- 1989.- V.139.- P.307-315.16