Изучение структуры и биологической активности астеросапонинов и других полярных стероидных соединений морских звезд тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

005045485 ^

Малярепко Тимофей Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АСТЕРОСАПОНИНОВ И ДРУГИХ ПОЛЯРНЫХ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МОРСКИХ ЗВЕЗД

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 7 И ЮН 2012

Владивосток - 2012

005045485

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Кнча Алла Анатольевиа

Официальные оппоненты: Камннскнй Владимир Абрамович,

доктор химических наук, профессор, Дальневосточный федеральный университет, профессор кафедры органической химии Школы естественных наук

Бакунина Ирина Юрьевна,

доктор химических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворождова СО РАН

Защита состоится « 29 » июня 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан « 28 » мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. г Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Стероидные гликозиды (сапонины) являются типичными метаболитами наземного происхождения, которые были выделены из различных видов высших растений. Так, хорошо известные сердечные гликозиды на протяжении долгого времени используются для лечения заболеваний сердца. В то же время данная группа соединений мало распространена в животном мире. Стероидные гликозиды были найдены в большинстве изученных видов морских звезд и совсем недавно в губках, кишечнополостных и некоторых рыбах. Все выделенные сапонины морского происхождения существенным образом отличаются от аналогичных метаболитов растений оригинальностью своих структур.

Класс иглокожих Asteroidea содержит разнообразные по своему химическому строению стероидные метаболиты. Наибольший интерес для исследователей представляют полярные стероидные соединения, к которым принято относить астеросапонины - олигогликозиды с пятью-шестью моносахаридными остатками, полигидроксистероиды, чаще всего имеющие от четырех до девяти гидроксильных групп, и гликозиды полигидроксистероидов (монозиды, биозиды, иногда триозиды). Большинство изученных полярных стероидных соединений морских звезд имеет своеобразное химическое строение, что делает их структурное исследование интересной химической задачей. Несомненно, большое внимание исследователей к окисленным стероидным соединениям морских звезд связано не только с их уникальным химическим строением, но и с разнообразной биологической активностью, которую проявляет данная группа веществ. Например, недавно было показано, что некоторые стероидные гликозиды морских звезд в нетоксичных концентрациях препятствуют перерождению нормальных клеток в опухолевые (канцерпревентивный эффект) и тормозят образование колоний опухолевых клеток (противоопухолевый эффект). Также было установлено, что эти соединения могут проявлять нейротрофические и нейропротекторные свойства: усиливать нейритогенное действие фактора роста нервов (синергетический эффект), стимулировать регенерацию нервных волокон, способствовать выживанию нервных клеток в условиях кислородного голодания.

Первые работы по изучению строения полярных стероидных соединений морских звезд были осуществлены в Японии, а затем были продолжены в Европе (Италия, Испания) и России, однако в настоящее время основные исследования продолжаются в Азиатско-Тихоокеанском регионе: в нашей лаборатории (Лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН им. Г.Б. Елякова), а также группами китайских, корейских, японских и вьетнамских коллег, чьи статьи по данной тематике публикуются в ведущих журналах мира.

Целью настоящей работы являлось изучение структуры и биологической активности астеросапонинов, как наиболее сложно устроенных полярных стероидных соединений морских звезд, а также других сопутствующих им полярных стероидных метаболитов. Знания, полученные в результате их изучения, способствуют дальнейшему развитию исследований в области структурной химии стероидных соединений, их экологической и биологической роли.

ЗАДАЧАМИ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ были: - выделение индивидуальных астеросапонинов и других полярных стероидных соединений из четырех видов морских звезд: Hippasteria kurilensis, Diplasterias brucei, Asleropsis carinifera и Aphelasterias japónica-,

- установление строения новых соединений, включая определение абсолютной стереохимии асимметрических центров и определение принадлежности к D- или L-ряду моносахаридных остатков;

- структурная идентификация известных ранее соединений, найденных в изучаемых морских звездах;

- изучение цитотоксической активности выделенных соединений и их влияния на рост колоний опухолевых клеток.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Морские звезды Hippasteria kurilensis, Diplasíerias brucei, Asleropsis carinifera и Aphelaslerias japónica являются богатым источником полярных стероидных соединений: астеросапонинов, полигидроксистероидов и их гликозидов.

2. В морской звезде Hippasteria kurilensis найдены астеросапонины - гиппастериозиды А, В, С и D, которые содержат новую гексасахаридную цепь.

3. В морской звезде Diplasíerias brucei найдены астеросапонины - дипластериозиды А и В, которые содержат новую пентасахаридную цепь.

4. В морской звезде Asleropsis carinifera обнаружены новые соединения: астеросапонин астеропсизид А, гликозиды полигидроксистероидов - кариниферозиды А, В, С, D, Е и F и три полигидроксистероида: (24Я,255^-24-метил-5а-холестан-3 (3,6а,8,15р, 16р,26-гексаол, (22£,24й,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,6а,8,15Р, 1 бр,26-гексаол и (22£,24ñ,25S)-24-метил-5а-холест-22-ен-ЗР,4р,6а,8,15Р,1бр,26-гептаол.

5. Некоторые полярные стероидные гликозиды морских звезд эффективно ингибируют рост колоний опухолевых клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В ходе проведенной работы исследованы экстракты 4 видов морских звезд, собранных в разных районах Японского, Охотского и Южно-Китайского морей и моря Росса. Выделено 39 индивидуальных полярных стероидных соединений. С помощью спектральных методов и химических превращений установлено полное химическое строение 16 новых соединений (7 астеросапонинов, 6 гликозидов полигидроксистероидов и 3 полигидроксистероидов). Проведена структурная идентификация 23 известных веществ.

Показано, что некоторые из выделенных соединений имеют структурные фрагменты, которые ранее не встречались в стероидных метаболитах морских звезд. В частности, в астеросапонинах обнаружены новые углеводные цепи: P-D-ксилопиранозил-(1—»3)-Р-0-фукопиранозил-(1—♦2)-Р-0-хиновопиранозил-(1—>4)-[Р-0-хиновопиранозил-(1—»2)]-Р-0-ксилопиранозил-(1—»3)-Р-0-хиновопиранозная гексасахаридная цепь и p-D-фукопиранозил-(1—♦2)-р-0-галактопиранозил-(1—►4)-[р-0-хиновопиранозил-(1—>2)]-P-D-хиновопиранозил-(1—>3)-р-0-хиновопиранозная пентасахаридная цепь. Впервые проведено исследование влияния астеросапонинов и гликозидов полигидроксистероидов морских звезд на формирование колоний опухолевых клеток и показано, что некоторые полярные стероидные соединения эффективно ингибируют рост колоний этих клеток.

Практическое значение данного исследования состоит в развитии методов выделения и установления строения новых полярных стероидных метаболитов морских звезд. А новые данные о физиологической активности этих соединений открывают перспективы их дальнейшего исследования в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы были представлены на I Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2004); на X Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ ДВО РАН, 2006); на Российской конференции по иглокожим (Москва, 2011); на 9-ом Азиатско-Тихоокеанском симпозиуме по животным, растительным и микробиальным токсинам (Владивосток, 2011) и на 5-ом международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, 2011).

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. По теме диссертации опубликовано б статей и 5 тезисов докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного исследованию стероидных метаболитов морских звезд и их биологической активности, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 13 таблиц, 4 рисунка и 2 схемы. Список литературы включает 122 цитируемые работы.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.х.н. Кича A.A. Также автор благодарит к.х.н. Иванчину Н.В. за помощь в проведении эксперимента и написании работы, д.х.н. Калиновского А.И. - за получение и помощь в интерпретации ЯМР спектров, к.х.н. Дмитренка П.С. - за получение масс-спектров, академика Стоника В.А. - за полезные научные консультации, к.х.н. Ермакову С.П. - за проведение экспериментов по определению биологической активности полученных веществ, к.б.н. Даутова С.Ш. (ИБМ ДВО РАН, Владивосток, Россия), к.б.н. Смирнова A.B. (ЗИН, Санкт-Петербург, Россия) и доктора Молло Э. (Институт биомолекулярной химии, Неаполь, Италия) - за видовое определение морских звезд.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТСХ - тонкослойная хроматография на пластинках с закрепленным слоем; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; LSI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией ускоренными ионами цезия; ESI-MS - электроспрей-ионизационная масс-спектрометрия; FAB-MS - масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами; MALDI/TOF-MS - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией, усиленной матрицей; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ХС - химический сдвиг, КССВ -константа спин-спинового взаимодействия; с - синглет, д - дублет, т - триплет, к -квартет, дд - дублет дублетов, дт - дублет триплетов, м - мультиплет, ш - широкий; COSY - корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - гетероядерная многополосная корреляция; HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция; NOE - ядерный эффект Оверхаузера; NOESY -спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера и обмена; ROESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат; TOCSY - тотальная корреляционная спектроскопия; Н2ВС - гетероядерная двухсвязанная корреляционная спектроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1 Получение суммарных фракций полярных стероидных соединений из экстрактов морских звезд и выделение индивидуальных соединений

Выделение индивидуальных соединений - это один из главных этапов на пути к структурному изучению стероидных метаболитов морских звезд. Однако получение индивидуальных компонентов является весьма трудной экспериментальной задачей. В подавляющем большинстве случаев данные соединения присутствуют в виде сложных смесей близких по строению веществ.

На первом этапе выделения морские звезды измельчали и экстрагировали этанолом. После чего полученные экстракты фильтровали и упаривали досуха. Для того чтобы избавиться от большого количества неорганических примесей использовали хроматографию на гидрофобных сорбентах: Полихроме 1 или Амберлите ХАО-2.

На следующем этапе хроматографического разделения применяли многократную колоночную хроматографию на гидрофильном сорбенте — силикагеле. Во всех случаях выделения использовали ступенчатый градиент растворителей хлороформ-этанол, постепенно увеличивая полярность элюента. В некоторых случаях, когда требовалась дополнительная очистка полученных фракций, применяли колоночную хроматографию на другом гидрофильном сорбенте - флорисиле.

Третьим, завершающим этапом выделения, ведущим к получению индивидуальных соединений, была ВЭЖХ на обращенно-фазных полупрепаративных и аналитических колонках. В качестве элюента использовали системы водного этанола и водного метанола, иногда с добавлением ацетатного буфера для получения более четкого профиля элюции.

Ниже в качестве примера приведена схема выделения стероидных метаболитов из морской звезды Лз1егор51з сагШ/ега (схема 1). В результате хроматографического разделения на колонках с Амберлитом ХАО-2, силикагелем, флорисилом и ВЭЖХ на обращенной фазе было получено 28 индивидуальных полярных стероидных соединений, из них - 10 новых (астеропсизид А (11), кариниферозиды А-Б (14-19) и стероидные полиолы 26-28) и 18 ранее известных соединений.

2 Установление строения астеросапоиииов и других полярных стероидных соединений морских звезд 2.1 Астеросапоннны из Шрра$1епа кигИеп51$

Из этанольного экстракта морской звезды ШрраНепа кип1епз15 Фишер, 1911 (отряд УакаШа, семейство Сошаз1епс1ае), собранной в Охотском море у побережья Курильских островов выделили новые астеросапоннны - гиппастериозиды А (1), В (2), С (3) и Э (4).

он 2,

; Астеропсизид А (2.2 мг)

Схема 1 — Выделение стероидных метаболитов из Asteropsis carinifera.

(-)-HR-ESI-Macc-cneKTp гликозида 1 содержал пик декатионизированнон молекулы [M — Na]" с m/z 1373.6063, а (+)-Е51-масс-спектр содержал пик катионизированной молекулы [М + Na]* с т/: 1419, что соответствовало молекулярной формуле C6zHi(,i03iSNa. Спектральные данные ЯМР 'Н, |3С и DEPT агликонной части соединения 1 были идентичны аналогичным значениям для регуларозида А, выделенного впервые из морской звезды Halitule regularis и найденного позже в олигогликозидных фракциях других видов морских звезд. В ЯМР спектрах присутствовали сигналы, характерные для стероидного ядра: двух ангулярных метальных групп (5н 0.97 и 1.05; 5с 13.3 и 19.1 м.д.), 9(11)-двойной связи (5н 5.26; 6с 145.4, 116.5 м.д.), метиновой группы, связанной с сульфатной группой (5ц 4.89, 5с 77.3 м.д.), и метиновой группы, связанной с олигосахаридной цепью (5ц 3.78, 5с 80.4 м.д.). Кроме того, в ЯМР спектрах наблюдались сигналы одной третичной метальной группы (5ц 1.44, 5с 23.4 м.д.), трех вторичных метальных групп (5„ 0.89, 0.90 и 0.97; 5с 12.8, 19.1 и 20.2 м.д.), и 22(23)-эпоксигруппы [5Н 2.87 (д,У= 2.3), 2.96 (дц, J = 2.2, 8.0); 5с 64.3, 57.2 м.д.], которые были отнесены к боковой цепи стероидного агликона. На основании этих данных мы предположили, что гликозид 1 содержит в качестве аглнкона 22(23)-эпокси-24-метил-5а-холест-9(11)-ен-Зр,6ос,20-триол с гликозидной связью при С-6 и О-сульфатной группой при С-3. Строение агликона соединения 1 было подтверждено 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и NOESY экспериментами. Абсолютная конфигурация асимметрических атомов углерода С-20, С-22, С-23 и С-24 была установлена как 20R,22R,23S,24S на основании сходства ЯМР сигналов боковой цепи гликозида 1 с аналогичными значениями для регуларозида А, в котором стереохимия боковой цепи 22/?,235,,245 была определена сравнением с модельными соединениями и другими астеросапонинами, имеющими идентичный агликон. Следующие NOESY корреляции подтверждали стереохимию боковой цепи агликона: 1Ь-21/Нц-12, Н-17, Нэ-18 и Н-22; H-22/Hp-16, Hj-21, Н-24 и H-2S; Н-23/Н-17 и Hj-21; Н-24/Н-22; Н-25/Н-23.

Дополнительно к упомянутым выше сигналам ЯМР 'Н спектр гликозида 1 содержал в слабом поле сигналы шести аномерных протонов (5н 4.79, 4.98, 5.33, 4.89, 5.00 и 5.21 м.д.), связанные в спектре HSQC с соответствующими сигналами шести атомов углерода при 5с 105.1, 104.4, 104.6, 101.4, 106.5 и 106.5 м.д. Вместе с масс-спектрами эти данные свидетельствовали о наличии шести моносахаридных остатков в олигогликозидной цепи соединения 1. Значения констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) аномерных протонов (7.0-8.0 Гц) соответствовали ß-конфигурации всех гликозидных связей. Дублеты метальных групп при 5н 1.56, 1.75, 1.47 и 1.46 м.д. в ЯМР 'Н спектре указывали на присутствие четырех остатков 6-дезоксигексоз. Сигналы атомов углерода терминальных моносахаридых остатков углеводной цепи в ЯМР "С и DEPT спектрах гликозида 1 совпадали с соответствующими данными для остатков ß-D-ксилопиранозы и ß-D-хиновопиранозы в спектрах известных астеросапонинов. Сигналы атомов углерода внутренних моносахаридных остатков хорошо согласовывались с соответствующими данными для З-О-замещенной ß-D-хиновопиранозы, 2,4-ди-О-замещенной ß-D-ксилопиранозы, 2-О-замещенной ß-D-хиновопиранозы и З-О-замещенной ß-D-фукопиранозы в ЯМР "С спектре мартастерозида А2. Последовательность моносахаридных остатков в олигосахаридной цепи соединения 1 была также подтверждена данными тандемной масс-спектрометрии. Так, спектр (-)-ESI-MS/MS пика [М - Na]" с m/z 1373 содержал серию фрагментных пиков, соответствующих последовательному отщеплению моносахаридных остатков: т/: 1241 [(М - Na) - 132]" -отрыв ксилозы; 1227 [(М - Na) - 146]" - отрыв хиновозы; 1095 [(М - Na) - 132 - 146]" -отрыв ксилозы и хиновозы; 949 [(М - Na) - 132 - 2 х 146]" - отрыв ксилозы, хиновозы и фукозы; 803 [(М - Na) - 132 - 3 х 146]" - отрыв ксилозы, фукозы и двух хиновоз; 671 [(М

- Na) - 2 x 132 - 3 x 146]" - отрыв двух ксилоз, фукозы и двух хиновоз; 507 [(М - Na) - 2 х 132 - 3 х 146 - 164]" - отрыв олигосахаридной цепи. Для определения моносахаридного состава и отнесения моносахаридов к D- или L-ряду был проведен кислотный гидролиз гликозида 1 с помощью трифторуксусной кислоты. Сумму моносахаридов, полученную после кислотного гидролиза, подвергали реакции гликозилирования с (Я)-(-)-октанолом, затем ацетилировали и анализировали методом ГЖХ полученные ацетаты (-)-2-октилгликозидов сравнением с соответствующими производными стандартных D- и L-моносахаридов согласно методике, описанной Леонтейн с соавторами. В результате было установлено, что все моносахаридные остатки (ксилоза, фукоза и хиновоза), входящие в состав олигогликозидной цепи соединения 1, относятся к D-ряду. Сигналы всех протонов и атомов углерода углеводной цепи гликозида 1 были определены с помощью 1D и 2D ЯМР экспериментов, включая 'Н-'Н COSY, HSQC, TOCSY, НМВС и NOESY. Место присоединения олигосахаридной цепи к агликону и положения гликозидных связей в моносахаридных остатках соединения 1 были установлены с помощью НМВС и NOESY спектров (рис. 1). Так, в этих спектрах были видны следующие кросс-пики: Н-1 (Qui 1)/С-6, Н-6 агликона; Н-1 (Xyl I)/C-3, Н-3 (Qui I); Н-1 (терминальная Qui ПУС-2, Н-2 (Xyl I); Н-1 (Qui III)/C-4, Н-4 (Xyl I); Н-1 (Fuc)/C-2, Н-2 (Qui III) и Н-1 (терминальная Xyl II)/C-3, Н-3 (Fuc). Таким образом, структура гиппастериозида А была установлена как 1.

Сравнение ЯМР 'Н, "С и DEPT спектров, а также тщательный анализ 2D ЯМР спектров гликозидов 1-4 показали, что олигосахаридная цепь и стероидное ядро соединений 1 и 2-4 идентичны.

он

Рисунок 1 - Основные ЫОЕЗУ и НМВС корреляции для углеводной цепи соединений 1-4.

(-)-НЯ-Е81-масс-спектр гиппастериозида В (2) содержал пик декатионизированной молекулы [М - Ка]" с т/г 1359.5890, а (+)-Е81-масс-спектр - пик катионизированной

молекулы [М + Na]* с m/z 1405, что соответствовало молекулярной формуле CíiH^CbiSNa. Спектральные данные ЯМР 'Н и "С олигосахаридной цепи и стероидного агликона соединений 2 и 1 были близки, и отличались только отсутствием метальной группы при С-24 в боковой цепи агликона гликозида 2. Сигналы протонов и атомов углерода в спектрах ЯМР одной третичной метальной группы (5Н 1.44; 5С 23.1 м.д.), двух вторичных метальных групп (5ц 0.93, 0.94; 5с 22.4, 22.8 м.д.) и 22,23-эпоксигруппы [5Н 2.91 (д, J = 2.4), 3.11 (тд, J = 2.3, 6.3); 5С 65.6, 53.2 м.д.] свидетельствовали о присутствии в соединении 2 20-гидрокси-22,23-эпоксихолестановой боковой цепи, найденной впервые в тснуиспинозиде А из морской звезды Coscinaslerías lenuispina, а позже и в некоторых других астеросапонинах. Сигналы всех протонов и атомов углерода олигосахаридной цепи и агликона в гликозиде 2 были определены с помощью 2D ЯМР экспериментов: 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и NOESY. Сигналы атомов углерода боковой цепи стероидного агликона в ЯМР "С спектре гликозида 2 хорошо совпадали с соответствующими сигналами для тенуиспинозида А, в котором абсолютная конфигурация асимметрических центров С-20, С-22 и С-23 была установлена сравнением с синтезированными модельными соединениями. Поэтому мы предположили, что асимметрические атомы углерода в соединении 2 имеют 20Я,22Я,235 конфигурации, которые подтверждаются наличием кросс-пиков в NOESY спектре: H3-21/Hß-12, Н-17, Hj-18 и Н-22; H-22/Hs-16, Н-17 и Hj-21; H-23/Hj-21. В результате структура гиппастериозида В была определена как 2.

(-)-HR-ESI-Macc-cneKTp гиппастериозида С (3) содержал пик декатионизированной молекулы [М - Na]" с m/z 1373.6062, a (+)-ESI-Macc-cneicrp - пик катионизированной молекулы [М + Na]* с m/z 1419, что соответствовало молекулярной формуле CrjHioiOjiSNa. Тщательное сравнение спектральных данных гликозидов 1 и 3 показало, что оба соединения отличаются друг от друга только сигналами боковых цепей стероидных агликонов. Исходя из ЯМР 'Н и "С спектров, мы предположили, что гликозид 3 имеет 20-гидрокси-23-оксо-24-метилхолестановую боковую цепь с одной третичной метальной группой (5ц 1.58; 5с 26.9 м.д.), тремя вторичными метальными группами (5н 0.82, 0.92 и 1.01 м.д.; 5с 18.3, 21.1 и 11.8 м.д.), характерной метановой группой [5н2.89 (д, J= 15.8), 2.69 (д, J= 15.8) м.д.; 5с 53.3 м.д.] и 23-оксогруппой (5С 215.7 м.д.). 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и NOESY эксперименты подтвердили, что агликоном в соединении 3 является известный агликон астеросапонинов — сульфатированный торнастерин В (З-О-сульфат 24-метил-5а-холест-9(11)-ен-23-он-ЗР,6а,20-триол). Отрицательный эффект Коттона ([9]н9 = - 7748) в КД спектре соединения 3 был близок соответствующим значениям для версикозидов В и С ([6]2и = - 6028 и [S]2s4 = - 6884 соответственно), имеющим 205,24Д-торнастерин В в качестве стероидного агликона, и отличался от соответствующего значения для акантагликозида F ([8]275 = - 685), содержащего 205,245-торнастерин В в качестве агликона. Таким образом, была установлена 205',24/f-конфигурация асимметрических атомов углерода и структура гиппастериозида С была определена как 3.

(-)-HR-ESI-Macc-cneKTp гиппастериозида D (4) содержал пик декатионизированной молекулы [М — Na]" с m/z 1345.5749, a (+)-ES[-масс-спектр — пик катионизированной молекулы [М + Na]* с m/z 1391, что соответствовало молекулярной формуле C«jH9jOjiSNa. Данные ЯМР спектров олигосахаридной цепи и стероидного агликона соединения 4 хорошо согласовывались с соответствующими данными для гликозида 2 и отличались только отсутствием метановой группы СНг-24 в боковой цепи, что также подтверждалось разницей молекулярных масс между соединениями 2 и 4 в 14 а.е.м. Применение 2D ЯМР экспериментов ('Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и NOESY) показало, что гликозид 4 содержит в качестве стероидного агликона З-О-сульфат 22,23-эпокси-24-нор-5а-холест-9(11)-ен-Зр,6а,20-триол, который ранее был обнаружен в астериозиде В из морской звезды Asterias

атигепзгз. Сигналы атомов углерода боковой цепи в ЯМР "С спектре соединения 4 были идентичны соответствующим сигналам для астериозида В. Что касается последнего гликозида, то 20Л,22Д,235-конфигурации его асимметрических центров были установлены сопоставлением данных ЯМР с соответствующими данными модельных стероидных соединений, имеющих 22,23-транс- и 22,23-1/1/с-эпокси-24-нор холестановые боковые цепи. Присутствие в спектре ЖШБУ кросс-пиков Нз-21/Нр-12, Н-17, Нз-18, Н-22; Н-22/Н„-16, Нг1б, Н-17, Нз-21, Н-25 и Н-25/Н-22 подтверждало стереохимию боковой цепи. Это позволило нам предположить, что асимметрические центры С-20, С-22 и С-23 гликозида 4 имеют ту же конфигурацию 20Д,22Л,235, что и в астериозиде В. В результате структура гиппастериозида Б бьша определена как 4.

2.2 Полярные стероидные соединения пз 01р1Шепа$ Ътсе'1

Из этанольного экстракта морской звезды 01р1ая1епа* Ьтсе! (семейство Аз1егпс1ае, отряд РогариЬМа), собранной в 2000 г. у побережья моря Росса (залив Терра-Нова, Антарктика) в рамках Национальной Итальянской программы «Исследование Антарктиды» выделено два новых астеросапонина, дипластериозиды А (5) и В (6), и ранее известный астериидозид А (7). Кроме того, в нативном виде был выделен широко распространенный агликон астеросапонинов - З-О-сульфат торнастерина А (8) и два ранее известных гликозида полигидроксистероидов - астериидозид Н (9) и астериидозид Ь (10).

Астеросанопппы: дипластериозиды А (5), В (б) п астернндознд А (7). (-)-НЯ-Е81-масс-спектр дипластериозида А (5) содержал пик декатаонизированной молекулы с т/г 1257.5587 [М — Ка]~, а (+)-Е81-масс-спектр — пик катионизированной молекулы с т/г 1303 [М + Иа]*, что соответствовало молекулярной формуле С»Ня02|8№.

+Na"OjSO'

он

Qui I

5 R, = R, = II

6 R, = II, Rj = CHj

Л-^Д/4 . R2=Ii

lljC-i \

wo—J^j

R.O

Quirn

7 R,= HO

ЯМР 'Н и "С спектры агликонной части гликозида 5 были близки соответствующим спектрам астериидозида А, имеющего широко распространенный для астеросапонинов агликон - З-О-сульфат торнастерина А. Так, ЯМР спектры 5 содержали сигналы двух ангулярных метальных групп (5Н 1.01, 0.96; 8с 13.3, 19.1 м.д.), 9(11)-двойной связи (5Н 5.23; 5С 145.3, 116.4 м.д.), метановой группы, связанной с сульфатной группой (8к 4.91, 5С 77.3 м.д.), и метановой группы, связанной с олигосахаридной цепью (5н 3.79, 5с 80.3 м.д.), характерные для стероидного ядра астеросапонинов. Среди сигналов, относящихся к боковой цепи агликона, наблюдались сигналы третичной метальной группы (8Н 1.57, 8с 26.8 м.д.), двух вторичных метальных групп (8Н 0.89, 0.90;

8с 22.3, 22.4 м.д.), двух метиленовых групп (5н 2.79 и 2.62, 2.45 и 2.27; 5с 54.6, 53.8 м.д.), одной метиновой группы (5ц 2.20; 5С 24.1 м.д.), третичного атома углерода, связанного с гидроксильной группой (5с 73.4 м.д.), и карбонильного атома углерода (5с 211.6 м.д.). 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и ROESY ЯМР эксперименты позволили определить сигналы всех протонов и атомов углерода стероидного ядра и боковой цепи агликона. 20S конфигурация асимметрического центра была определена на основании значения ХС синглета протонов СНэ-21 при 5н 1.57 м.д. и подтверждена наличием кросс-пиков Нз-21/H(i-12 и Н-22/Нц-16 в ROESY спектре. На основании полученных данных было установлено, что агликоном дипластериозида А является известный З-О-сульфат (20S)-5a-холест-9( 11 )-ен-23-он-3 (3,6а,20-триол (сульфат торнастерина А).

В ЯМР 'Н спектре гликозида 5 наблюдались сигналы пяти аномерных протонов при 5ц 4.81, 4.89, 4.91, 4.93 и 5.21 м.д., связанные в спектре HSQC с пятью сигналами атомов углерода при 5С 104.8, 103.0, 103.6, 107.0 и 104.9 м.д. соответственно. Вместе с масс-спектрами это свидетельствовало о наличии в углеводной цепи соединения 5 пяти остатков гексоз. Значения констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) аномерных протонов (7.4-7.8 Гц) указывали на Р-конфигурации всех гликозидных связей. Четыре дублета метильных групп при 5н 1.43, 1.58, 1.73 и 1.79 м.д. в ЯМР 'Н спектре 5 свидетельствовали о присутствии четырех 6-дезоксигексозных остатков. Анализ ЯМР "С спектров дипластериозида А показал, что в углеводной цепи имеются два терминальных остатка: p-D-фукопираноза и P-D-хиновопираноза, а также остатки З-О-замещенной P-D-хиновопиранозы, 2,4-ди-О-замещенной P-D-хиновопиранозы и 2-О-замещенной P-D-гапактопиранозы. Сравнение химических сдвигов атомов углерода в ЯМР "С спектрах 5 и 7 показало, что пентаозид 5 отличается от гексаозида 7 отсутствием терминального остатка P-D-галактопиранозы, о чем свидетельствуют сдвиг в сильное поле сигнала С-3 (5с 75.1 м.д. по сравнению с 84.1 м.д.) и в слабое поле сигналов С-2 и С-4 (5С 73.6 м.д. по сравнению с 71.6 м.д. и 5с 72.3 м.д. по сравнению с 71.8 м.д. соответственно) остатка P-D-фукопиранозы в соответствии с а- и р-эффектами дегликозилирования. Последовательность моносахаридов в углеводной цепи была подтверждена методом ESI-масс-спектрометрии. Так, (—)-ESI-MS/MS спектр пика с m/z 1257 соединения 5 содержал пики с m/z 1011 [(М - Na) - 100 - 146]", 865 [(М - Na) - 100 - 2 х 146]", соответствующие потере одного и двух остатков дезоксигексозы, пики с m/z 849 [(М - Na) - 100 - 146 -162]-, 703 [(М - Na) - 100 - 2 х 146 - 162]", 557 [(М - Na) - 100 - 3 х 146 - 162]-, соответствующие последовательной потере остатков гексозы и одного, двух и трех остатков дезоксигексоз, а также пик с m/z 393 [(М - Na) - 100 - 3 х 146 - 162 - 164]", соответствующий потере углеводной цепи. D-конфигурация всех моносахаридов (хиновозы, галактозы и фукозы) была определена по методике, описанной ранее для соединений 1-4. Сигналы всех протонов и атомов углерода олигосахаридной цепи соединения 5 были определены с помощью 1D и 2D ЯМР экспериментов, включая 'Н-'Н COSY, HSQC, TOCSY, НМВС и ROESY. Место присоединения углеводной цепи в молекуле и позиции гликозидных связей между моносахаридными остатками гликозида 5 были подтверждены НМВС и ROESY спектрами, содержащими кросс-пики Н-1 (Qui 1)/С-6, Н-6 агликона; Н-1 (Qui II)/C-3, Н-3 (Qui I); Н-1 (Gal)/C-4, Н-4 (Qui II); Н-1 (Fuc)/C-2, Н-2 (Gal) и Н-1 (Qui III)/C-2, Н-2 (Qui II). На основании полученных данных структура дипластериозида А была установлена как 5.

В (-)-HR-ESI-Macc-cneKTpe дипластериозида В (6) присутствовал пик декатионизированной молекулы с mlz 1271.5739 [М - Na]", а в (+)-ESI-Macc-cneinpe - пик катионизированной молекулы с mlz 1317 [М + Na]*, что соответствовало молекулярной формуле C5,H.)sOMSNa. ЯМР 'Н и "С спектры гликозида 6 были близки спектрам гликозида 5, что свидетельствовало о присутствии в дипластериозиде В аналогичного

стероидного ядра и углеводной цепи, и отличались только наличием дополнительной метальной группы при С-24 в боковой цепи агликона. В ЯМР спектрах гликозида 6 наблюдались сигналы, относящиеся к его боковой цепи, а именно, сигналы третичной метальной группы (8Н 1.57, 8С 27.0 м.д.), трех вторичных метальных групп (8Н 0.90, 0.81, 1.01; 5с 21.1, 18.5, 12.3 м.д.), одной металеновой группы (5н 2.78; 8С 53.4 м.д.), двух метановых групп (8н 2.39, 2.00; 8с 53.9, 29.8 м.д.), третичного атома углерода, связанного с гидроксильной группой (5с 73.6 м.д ), и карбонильного атома углерода (5с 215.9 м.д.). 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и ROESY эксперименты позволили определить сигналы всех протонов и атомов углерода в молекуле и установить, что агликоном гликозида 6 является известный З-О-сульфат (205>24-метил-5а-холест-9(11)-ен-23-он-Зр,6а,20-триол (сульфат торнастерина В). Как было описано выше для соединений с такой боковой цепью абсолютная конфигурация С-24 устанавливается на основании КД спектров: в случае 24/?-изомера наблюдается сильный отрицательный эффект Котгона, а в случае 245-изомера наблюдается только слабый отрицательный эффект Котгона. В КД спектре 6 в области 260-300 нм нам не удалось зафиксировать эффект Котгона, поэтому мы предположили для него 24,5-конфигурацию. Таким образом, структура дипластериозида В была установлена как 6.

Астериидозид А (7) был структурно идентифицирован сравнением спектров ЯМР 'Н и ,3С и масс-спектров с соответствующими данными для этого соединения, опубликованными в литературе.

З-О-Сульфат торнастерипа А (8), астериндозиды H (9) и L (10). В результате анализа ЯМР 'Н спектров соединения 8, а также данных (-)-MALDI/TOF-Macc-cneKrpa было установлено, что выделенное соединение является нативным агликоном астеросапонинов — З-О-сульфатом торнастерина А.

'9 10

Структуры соединений 9 и 10 были определены с помощью ЯМР 'Н и "С спектров, включая 2D ЯМР эксперименты ('Н-'Н COSY, HSQC, NOESY, НМВС), данных (+)- и (-)-MALDI/TOF-масс-спектров, а также сравнением полученных нами результатов с данными, опубликованными в литературе.

2.3 Полярпые стероидные соеднпения пз Asteropsis carinifera

Из этанольного экстракта морской звезды Asteropsis carinifera Lamarck, 1816 (семейство Asteropseidae, отряд Valvatida), собранной у побережья Вьетнама, выделили новый астеросапонин астеропсизид А (11) и два ранее известных астеросапонина -регуларозид А (12) и торнастерозид А (13). Также было выделено двенадцать гликозидов полигидроксистероидов - шесть новых биозидов, кариниферозидов A-F (14-19), и шесть известных гликозидов, халитулозидов А, В, D и Е (20-23), найденных ранее в морской звезде Halityle regularis, 6-О-сульфата халитулозида А (24) и 4"-0-метил аналога

соединения 24 (25), найденных ранее в морской звезде Nardoa tuberculata. Кроме того, из A. carinifera также было выделено тринадцать полигидроксистероидов, включая три новых: (24Д,255)-24-метил-5а-холестан-Зр,6а,8,15Р,16|3,26-гексаол (26), (22£,24«,25¿>24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,6а,8,15р,1бр,26-гексаол (27) и (22£,24Я,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,4р,ба,8,15Р,1бр,26-гептаол (28), и десять ранее известных соединений 2938.

Астеросапоиииы: астеропсизнд А (11), регуларозид А (12) и ториастерозид А (13). В (-)-HR-ESI-Macc-cneKTpe астеропсизида А (11) присутствовал пик декатионизированной молекулы с тк 1225.5287 [М - Na]~, a (+)-HR-ESI-Macc-cneKrp содержал пик катионизированной молекулы с тк 1271.5085 [М + Na]+, что соответствовало молекулярной формуле Cj7H9jOjr.SNa.

Ri

11 R| - (1), Rj" А

12 R,- (2), R,-B

13 R, - (1), R2 - С

Na'OjSO

OH OH

он ,,-он

4,c-i l HjCy

но ~J*i Fuc /--7 Q»iII НО \HO

OH

но но

Quill Quil 0H 0H

ЧГ

QuiUI

Спектры ЯМР 'Н и "С агликонной части гликозида 11 содержали химические сдвиги протонов и атомов углерода двух ангулярных метальных групп (5н 0.54, 0.94 м.д.; 6с 12.5, 19.0 м.д.), 9(11)-двойной связи (5н 5.22 м.д.; 5с 145.9, 116.1 м.д.), одной метановой группы (5ц 4.88 м.д., 5с 77.2 м.д.), связанной с О-сульфогруппой, и одной метановой группы (5» 3.76 м.д., 5с 80.3 м.д.), связанной с олигосахаридной цепью, которые характерны для стероидного ядра астеросапонинов. Исходя из спектральных данных, мы предположили, что в боковой цепи агликона присутствуют три метальные группы (5н2.27 (с), 2 х 0.93 (д) м.д.; 5с 20.6, 2 х 22.5 м.д.), одна метиленовая группа (5н 2.36 м.д., 5с 53.5 м.д.), одна 23-оксогруппа (5с 200.3 м.д.), находящаяся в а,Р-положении по отношению к двойной связи 20(22) (5ц 6.22 м.д.; 5С 157.1, 124.2 м.д.). Эти данные хорошо согласовывались с соответствующими значениями для известного агликона (20£)-5а-

холеста-9(11),20(22)-диен-23-он-3р,6а-диола с гликозидной связью при С-6 и сульфатной группой при С-3, найденного в астеросапонине хилодозиде А. Применение 2D ЯМР экспериментов, включая 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и ROESY позволило определить сигналы всех протонов и атомов углерода в агликоне гликозида 11. На основании спектров 'Н-'Н COSY и HSQC установили последовательности протонов при атомах углерода С-1 - С-8, С-11 - С-12, С-8 - С-17 через С-14, С-17 - С-21 и С-24 - С-26, С-27. Присутствие кросс-пика Н-22/Ни-16 в спектре ROESY и химический сдвиг атома углерода С-17 при 5С 59.7 м.д. (6С 51.2 м.д. при (20Z)- и 59.1 м.д. при (20£)-20(22)-двойной связи в холестановой боковой цепи) свидетельствовали о ^-конфигурации 20(22)-двойной связи в соединении 11.

Спектр ЯМР 'Н гликозида 11 содержал сигналы пяти аномерных протонов при 8н 4.78, 4.96, 4.95, 4.83 и 5.30 м.д., связанные в спектре HSQC с пятью сигналами атомов углерода при 5с 105.1, 104.5, 102.3, 107.1 и 104.6 м.д. соответственно. Эти данные свидетельствовали о наличии в молекуле соединения 11 углеводной цепи, состоящей из пяти моносахаридных остатков, связанных друг с другом и агликоном (З-гликозидными связями (КССВ от 7.5 до 7.8 Гц). В спектре ЯМР 'Н присутствовали дублеты метальных групп при 5Н 1.57, 1.44, 1.76 м.д., указывающие на наличие в 11 трех остатков 6-дезоксигексоз. Химические сдвиги и КССВ протонов Н-1 - Н-5 остатков хиновозы, ксилозы, галактозы и Н-1 - Н-4 остатка фукозы были определены на основании анализа ID TOCSY спектров при облучении аномерных протонов, а протонов Н-5 остатка фукозы - при облучении протонов дезоксигруппы. Эксперименты ЯМР 'Н-'Н COSY, HSQC, НМВС и ROESY позволили установить сигналы всех протонов и атомов углерода олигосахаридной цепи гликозида 11. В спектре ЯМР 'Н гликозида 11 протоны Н-2 и Н-3 остатка Qui II давали один мультиплет при 5н 4.06 м.д., коррелирующий в спектре HSQC с двумя сигналами атомов углерода при 5с 76.1 и 76.5 м.д. Для уточнения значения сигналов атомов углерода С-2 и С-3 в остатке Qui II применили методику Н2ВС. На основании наличия Н2ВС взаимодействия аномерного протона Н-1 (5ц 5.30 м.д.) с соседним атомом углерода С-2 значение его химического сдвига было установлено как 5с 76.1 м.д. Полученные спектральные данные для моносахаридных остатков хорошо согласовываются с соответствующими данными для терминальных остатков P-D-фукопиранозы и P-D-хиновопиранозы, внутренних остатков З-О-замещенной P-D-хиновопиранозы, 2,4-ди-О-замещенной p-D-ксилопиранозы, и 2-О-замещенной P-D-галакгопиранозы, входящих в состав олигогликозидной цепи известного астеросапонина торнастерозида А. Масс-спектрометрические данные также подтверждали строение углеводной части гликозида 11. Так, в тандемном масс-спектре ESI иона [М - Na]" с m/z 1225 наблюдались фрагментные пики с m/z 1079 [(М - Na) - дезоксигексоза]", 933 [(М -Na) - 2 х дезоксигексоза]", 917 [(М - Na) - дезоксигексоза - гексоза]", 771 [(М - Na) - 2 х дезоксигексоза - гексоза]-, 639 [(М - Na) - 2 х дезоксигексоза - гексоза - пентоза]", 493 [(М - Na) - углеводная цепь]", соответствующие последовательному отрыву моносахаридных остатков в олигосахаридной цепи. Следующие ROESY и НМВС корреляции подтвердили положения гликозидных связей в моносахаридных остатках и место присоединения олигосахаридной цепи к агликону в гликозиде 11: Н-1 (QuiI)/H-6 и С-6 агликона, Н-1 (Ху1)/Н-3 и С-3 (Qui I), Н-1 (Qui 11)/Н-2 и С-2 (Xyl), Н-1 (Gal)/H-4 и С-4 (Xyl), Н-1 (Fuc)/C-2 (Gal). Таким образом, на основании имеющихся данных строение астеропсизида А определили как 11.

Карпииферозиды A-F (14-19) и другие глнкознды полигидроксистероидов (2025). В (+)-HR-ESI-Macc-cneicrpe кариниферозида А (14) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 811.6129 [М + Na]*, соответствующий молекулярной формуле С41Н72О14. ЯМР 'Н, "С и DEPT спектры гликозида 14 показали наличие 41 атома

углерода, в том числе пяти метальных, 12 метиленовых и 19 метановых групп, двух четвертичных атомов углерода, одного третичного атома углерода, связанного с кислородом и двух метоксильных групп.

но.

но'

г^г

он н3со

он

14 R,=H, R2-CH3

15 R,-R2-H, Дк

16 R,-OH, Rj-CH]

ноно.

R, ORj

17 R,-Rj = H,R3-CHj

18 R| = R2 = R3=H

19 R, = OH, K2 - SOj*Na+

no.

rrr

™ ^ OCH, I

22 R,

23 R,

В ЯМР 'H спектре соединения 14 в слабом поле наблюдались сигналы двух аномерных протонов 6н4.36 и 4.71 м.д. (обе КССВ 6.9 Гц), которые в HSQC эксперименте коррелировали с сигналами двух атомов углерода при 8С 103.6 и 104.4 м.д. соответственно. (+)-ESI-MS/MS спектр иона [М + Na]* с m/z 811 содержал фрагментные пики, соответствующие потере ди-О-метилпентозы с m/z 651 [(М + Na) - С7Н12О4]* и одновременной потере ди-О-метилпентозы и пентозы с m/z 519 [(М + Na) - С7Н12О4-CsHaO<]\ Вместе с ЯМР спектрами эти данные позволили выявить присутствие в гликозиде 14 гексагидроксистигмастанового скелета и двух моносахаридных остатков, связанных друг с другом и с агликоном ß-гликозидными связями. Сравнение данных ЯМР 'Н и ,3С спектров соединения 14 с соответствующими данными халитулозида В (21), содержащего ЗР,6а,8,15Р,163,29-гексагидроксиетигмастановый агликон с 2-0-замещенной ß-D-ксилопиранозой при С-29, выявило полную идентичность данного структурного фрагмента в обоих соединениях. Сигналы протонов и атомов углерода, а также КССВ протонов второго моносахаридного остатка совпадали с соответствующими значениями для 2,4-ди-О-метил-р-ксилопиранозного остатка. Эксперименты ЯМР 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС позволили установить сигналы всех протонов и атомов углерода гликозида 14 (рис. 2). D-конфигурация моносахаридов (ксилозы и 2,4-ди-О-метилксилозы)

была определена по методике, описанной ранее для соединений 1-4. Положение гликозидной связи между моносахаридными остатками и место присоединения углеводной цепи к агликону было определено с помощью НМВС спектра, который содержал следующие кросс-пики: Н-1 (Ху1)/С-29 агликона и Н-1 (2,4-ди-0-Ме-Ху1)/С-2 (Ху1). Ранее сообщалось, что Д5с между сигналами С-26 и С-27 для (24Д)-29-гидроксистероидов составляет 1.1-1.4 м.д., а для (245)-29-гидроксистероидов она равна 0.1-0.4 м.д. В соединении 14 Д8с между сигналами С-26 и С-27 составляет 0.9 м.д., что позволило нам отнести его к 24Л-изомеру. Таким образом, структура кариниферозида А была определена как 14.

--'H-'HCOSY '— - НМВС

Рисунок 2 - 'Н-'Н COSY и НМВС эксперименты для кариниферозидов A-F (14-19).

В (+)-HR-ESI-Macc-cneKTpe кариниферозида В (15) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 795.4500 [М + Na]+, соответствующий молекулярной формуле СмНиОи. Подробное сравнение данных ЯМР 'Н и"С спектров соединения 15 и халитулозида В (21), показало, что гликозид 15 отличается от 21 только присутствием 22(23)-двойной связи (5н 5.54 и 5.22; 5с 140.1 и 130.7) в боковой цепи агликона. Кроме того, J = 15.0 Гц указывала на транс-конфигурацию 22(23)-двойной связи. Последовательность протонов от Н-17 до Н-29 в боковой цепи агликона и соответствующих атомов углерода была определена при помощи 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС экспериментов. Разница Д5Н между ХС протонов Н3-26 и Нз-27 в Д22Е-(24/?)-24-гидроксиэтилстероидах составляет 0.05 м.д., в то время как для 245-изомеров она составляет 0.02 м.д. Наблюдаемое значение Д5н между сигналами протонов Hj-26 и Н3-27 соединения 15 составляло 0.05 м.д., что позволило нам отнести его к 24Я-изомеру. Таким образом, кариниферозиду В было приписано строение 15.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneicrpe кариниферозида С (16) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 827.4767 [М + Na]\ соответствующий молекулярной

формуле С41Н72О15. Данные ЯМР гликозида 16 показали хорошее сходство с гликозидом 14, однако соединение 16 содержало дополнительную 4Р-гидроксильную группу (8н 4.25, шс; 5с 69.0) в кольце А стероидного ядра, что также согласовывалось с разницей в молекулярных массах в 16 а.е.м. между 16 и 14. Сигналы протонов и атомов углерода, а также КССВ протонов стероидного ядра были отнесены с помощью 2D ЯМР экспериментов и хорошо совпадали с соответствующими данными для халитулозида А (20), имеющего в качестве агликона 29-О-гликозилированный 24-этил-5а-холестан-3ß,4ß,6a,8,15ß,16ß,29-renTaon. На основании этих данных структура кариниферозида С (16) была определена как 4Р-гидроксипроизводное гликозида 14.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneKTpe кариниферозида D (17) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 781.4713 [М + №]*, соответствующий молекулярной формуле С40Н70О1Э. 1D и 2D ЯМР данные гликозида 17 показали, что кариниферозид D близок по химическому строению к ореастерозиду Е из морской звезды Oreaster reticularis и имеет аналогичный зр,6а,8,15р,24-пентагидрокси-5а-холестановый агликон с 2-замещенным З-О-метил-а-арабинофуранозным остатком при С-24 стероидного агликона. Сигналы протонов и атомов углерода, а также КССВ протонов терминального моносахаридного остатка в соединении 17 хорошо совпадали с соответствующими значениями для остатка 2,4-ди-О-метил-ксилопиранозы в гликозиде 14. Отнесение к D-или L-ряду моносахаридных остатков кариниферозида D проводилось аналогично гликозиду 14. В результате было установлено, что остаток З-О-метил-арабинофураиозы относится к L-ряду, а остаток 2,4-ди-О-метил-ксилопиранозы - к D-ряду. 245-конфигурация была предложена на основании сходства данных ЯМР боковой цепи гликозида 17 с данными ореастерозида Е, халитулозидов D (22) и Е (23) и других 24-0-гликозилированных стероидных соединений из морских звезд. Наличие (1—»2) гликозидной связи между моносахаридными остатками и место присоединения углеводной цепи к агликону были определены из НМВС спектра, содержащего кросс-пики между Н-1 (З-О-Ме-Ага) и С-24 агликона, Н-1 (2,4-ди-0-Ме-Ху1) и С-2 (З-О-Ме-Ага). Таким образом, структура кариниферозида D была определена как 17.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneKTpe кариниферозида Е (18) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 767.4548 [М + Na]*, соответствующий молекулярной формуле CsüHüsOh. Данные 1D и 2D ЯМР спектров и масс-спектров показали, что гликозид 18 отличается от 17 только отсутствием О-метильной группы при С-2 терминального ксилопиранозного остатка. Таким образом, кариниферозиду Е была приписана структура 18.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneicrpe кариниферозида F (19) присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 927.3966 [М + Na]*, соответствующий молекулярной формуле CnHvoOuSNa. ХС протонов и атомов углерода, а также КССВ протонов агликона и одного моносахаридного остатка гликозида 19 хорошо согласовывались с соответствующими данными для акодонтастерозида А из морской звезды Acodontasler conspicitus, имеющего 6-О-сульфат (24Д)-5а-холест-22-ен-ЗР,4р,6а,8,15Р,28-гексаол в качестве агликона с остатком 2-замещенной p-D-галактофуранозы при С-28. Трансконфигурация 22(23)-двойной связи следовала из значения КССВ протонов Н-22 и Н-23 (J = 15.3 Гц). На основании анализа данных 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС экспериментов было установлено, что остаток терминальной 2,4-ди-0-метил-р-0-ксилопиранозы связан с остатком P-D-галактофуранозы (1—»2) гликозидной связью. Таким образом, структура кариниферозида F была определена как 19.

Известные гликозиды, халитулозиды А, В, D и Е (20-23), 6-О-сульфат халитулозида А (24) и 4"-0-метил аналог соединения 24 (25), идентифицировали сравнением спектров

ЯМР 'Н и "С с соответствующими данными для этих соединений, опубликованными в литературе.

Полигидроксистероиды. В (+)-Н11-Е81-масс-спектре соединения 26 присутствовал пик катионизированной молекулы с т/: 505.3466 [М + соответствующий

молекулярной формуле С2»Н5о06. В спектрах ЯМР "С и БЕРТ стероида 26 наблюдались сигналы 28 атомов углерода, включая сигналы пяти метальных групп, девяти метиленовых, одиннадцати метановых групп и двух четвертичных атомов углерода, причем сигналы шести атомов углерода при 6с 66.9, 67.4, 71.2, 72.2, 72.7 и 77.2 м.д. были связаны с атомами кислорода.

он

28 R - ОН, Д"

Химические сдвиги атомов углерода, характеристических протонов и константы спин-спинового взаимодействия протонов стероидного ядра в спектрах ЯМР 'Н и "С соединения 26 практически совпадали с соответствующими сигналами 5а-холестан-3р,6а,8,15р,16|3,26-гекса0ла из морской звезды Halityle regularis. ХС атомов углерода боковой цепи стероида 26 были близки аналогичным значениям в спектре ЯМР "С цертонардостерина М из морской звезды Certonardoa semiregularis, имеющего 24-метил-26-гидроксихолестановую боковую цепь. 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС ЯМР эксперименты позволили установить сигналы всех протонов и атомов углерода в соединении 26 и подтвердили присутствие в нем гидроксигрупп в положениях ЗР,6а,8,15(3 и 16Р стероидного ядра и 26-гидрокси-24-метилхолесгановой боковой цепи.

20Я-Конфигурация асимметрического центра была определена на основании ХС протонов СНэ-21 при 6н 0.93 м.д. (5 0.90-0.96 м.д. для 20Д-стероидов). Так как в боковой цепи стероида 26 имеются еще два асимметрических центра С-24 и С-25, для него возможны четыре стереоизомера по боковой цепи, два из которых относятся к паре трео-изомеров, а другие два — к паре эритро-изомеров. Согласно литературным данным для синтетических 26-гидрокси-24-метилстероидов, данные стереоизомеры отличаются друг от друга ХС атомов углерода С-24, С-27 и С-28, и протонов СНз-27 и СН3-28. Значения ХС атомов углерода С-24 при 5С 35.0 м.д., С-27 при 5с 12.1 м.д. и С-28 при 5С 14.7 м.д., а также ХС протонов СНз-27 при 6Н 0.81 м.д. и СНз-28 при 6Н 0.80 м.д. соответствовали шрео-конфигурации; при эритро-конфигурации эти сигналы в спектрах должны были

быть сдвинуты в более слабое поле. Для определения абсолютной конфигурации асимметрического центра С-25, и, как следствие - С-24, обработкой соединения 26 реагентом Мошера был получен /?-(+)-МТРЛ эфир соединения 26. Известно, что сигналы протонов Н-26 и Н'-26 в спектре ЯМР 'Н 25£-изомера Д-(+)-МТРА эфира сближены по сравнению с этими сигналами в спектре 25й-изомера соответствующего производного. В ЯМР 'Н спектре й-(+)-МТРА эфира соединения 26 ХС протонов Н-26 и Н'-26 составляли 5Н 4.24 и 4.19 м.д. (Д 0.05 м.д.), (при 255-конфигурации сигналы протонов Н-26 и Н'-26 наблюдались в виде широкого дублета при 8н 4.23 м.д., а при 25й-конфигурации - при 6н 4.34 и 4.14 м.д. (Д 0.2 м.д.)), что указывало на ^-конфигурацию асимметрического центра С-25 и, следовательно, ^-конфигурацию асимметрического центра С-24. В результате соединению 26 было приписано строение (24Я,255)-24-метил-5о(-холсстан-3ß,6a,8,15ß, 1 бр,26-гексаола.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneKTpe соединения 27 присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 503.3340 [М + Na]*, соответствующий молекулярной формуле СиНиОв. Сравнение ХС атомов углерода, протонов и соответствующих КССВ в спектрах ЯМР 'Н и "С соединений 26 и 27 показало, что оба соединения имеют идентичное 3ß,6a,8,15ß,16ß-пентагидроксистероидное ядро. Однако, в отличие от стероида 26, спектры ЯМР соединения 27 содержали сигналы двойной связи в боковой цепи (8с 136.6 и 134.4 м.д.; 5н 5.46 и 5.41 м.д.), а молекулярный вес соединения 27 был на две единицы массы меньше. 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС ЯМР эксперименты позволили определить сигналы всех протонов и атомов углерода стероидного ядра и боковой цепи агликона. На основании полученных данных было установлено, что в стероиде 27 имеется 26-гидрокси-24-метилхолестановая боковая цепь с 22(23)-двойной связью. Величина КССВ J22.1t = 15.4 Гц указывала на транс-конфигурацию 22(23)-двойной связи.

20Д-Конфигурация асимметрического центра была определена на основании ХС протонов СНз-21 при 5н 1.03 м.д. (8н 1.04 м.д. для 20Д-Дп-стероидов). Определение стереохимии боковой цепи стероида 27 проводили аналогичным образом, как и для соединения 26. Значения ХС атомов углерода С-24 при 5с 40.8 м.д., С-27 при 5с 14.6 м.д. и С-28 при 5с 17.7 м.д., и ХС протонов СН3-27 при 5Н 0.87 м.д. и СН3-28 при 5Н 0.94 м.д. соответствовали 24Д,25£-трео-конфигурации Д22-24-метил-26-гидроксихолестановой боковой цепи. В ЯМР 'Н спектре Я-(+)-МТРА-производного соединения 27 ХС протонов Н-26 и Н'-26 составляли 5н 4.29 и 4.20 м.д. (Д 0.09 м.д.), (при 255'-конфигурации сигналы протонов Н-26 и Н'-26 наблюдались при 5н 4.31 и 4.19 м.д. (Д 0.12 м.д.), а при 25/?-конфигурации - при 8н 4.38 и 4.13 м.д. (А 0.25 м.д.)), что подтверждало ^-конфигурацию асимметрического центра С-25 и, следовательно, Д-конфигурацию асимметрического центра С-24. На основании полученных данных стероиду 27 было приписано строение (22£,24Д,255)-24-метил-5а-холест-22-ен^,6ос,8,15р,^,26-гексаола.

В (+)-HR-ESI-Macc-cneiape соединения 28 присутствовал пик катионизированной молекулы с m/z 519.3283 [М + Na]*. По данным масс-спектров и спектров ЯМР стероид 28 отличается от соединения 27 наличием в молекуле дополнительной гидроксильной группы и имеет молекулярную формулу С28Н48О7. ХС атомов углерода, протонов и соответствующих КССВ протонов боковой цепи в спектрах ЯМР соединений 27 и 28 были практически идентичны, что свидетельствовало о (22£,24Л,255)-26-гидрокси-24-метилхолестановой боковой цепи в стероиде 28. Анализ данных ЯМР стероида 28 показал, что ХС атомов углерода, протонов и КССВ протонов стероидного ядра были близки с соответствующими сигналами халитулозида А из морской звезды Halityle regiilaris, имеющего 3ß,4ß,6a,8,15ß,16ß-mflpoKCnnbHbie группы в стероидном ядре. Сигналы всех протонов и атомов углерода стероидного ядра и боковой цепи агликона в соединении 28 были отнесены с помощью 'Н-'Н COSY, HSQC и НМВС ЯМР

экспериментов. В результате было установлено, что соединение 28 имеет строение (22£,24Л,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-ЗР,4р,6а,8,15Р,1бр,26-гептаола.

Известные полигидроксистероиды 29-38 идентифицировали сравнением спектров ЯМР 'Н и "С и масс-спектров с соответствующими данными для этих соединений, опубликованными в литературе.

2.4 Астеросапоиіш офиднанозпд F (39) из гонад Aplielasterias japónica

Из водно-этанольного экстракта дальневосточной морской звезды Aphelaslerías japónica (семейство Asteriidae, отряд Forcipulata) был выделен астеросапонин офидианозид F (39).

он

Строение соединения 39 было установлено при помощи ЯМР 'Н и "С спектроскопии, а также на основании данных MALDI/TOF и LSI масс-спектрометрии. Кислотный гидролиз этого гликозида дал сумму моносахаридов, идентифицированную как D-хиновоза : D-ксилоза : D-фукоза (2:2: 1) (ТСХ, ГЖХ в виде перацетатов полиолов, удельное вращение). Сигналы протонов и атомов углерода в ЯМР спектрах гликозида полностью совпадали с соответствующими сигналами офидианозида F из морской звезды Ophidiaster ophidianus. Последовательность моносахаридных остатков в выделенном соединении была дополнительно подтверждена фрагментацией в LSI масс-спектрах. Исходя из этого, мы заключили, что выделенный гликозид идентичен офидианозиду F и имеет структуру 39.

3 Биологическая активность выделенных соединений

Цитотоксическая активность in \itro выделенных соединений была исследована с помощью MTS-метода. Для изучения влияния веществ на формирование и рост колоний опухолевых клеток in vitro применяли метод мягких агаров. В качестве моделей для исследования биологической активности выделенных соединений использовали клетки рака кишечника НТ-29 и НСТ-116, рака молочной железы T-47D и меланомы RPMI-7951 человека. Влияние астеросапонинов и гликозидов полигидроксистероидов морских звезд на формирование и рост колоний опухолевых клеток было изучено впервые.

Цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток гнппастериозндов А (1), В (2), С (3) и D (4). Астеросапонины 1-4 не проявляли цитотоксической активности по отношению к клеткам НТ-29 в концентрациях от 15 до

120 мкг/мл. Для изучения действия на формирование колоний клетки НТ-29 обрабатывали исследуемыми веществами в концентрации 60 мкг/мл. Гиппастериозид D (4) ингибировал рост клеточных колоний на 23%, а также способствовал уменьшению их размеров. Гиппастериозиды А (1) и В (2) сокращали число клеточных колоний на 17 и 16% соответственно, но не уменьшали размеров колоний. Гиппастерозид С (3) не проявил какой-либо значительной активности. Таким образом, показано, что строение стероидного агликона астеросапонинов и особенно длина 22,23-эпокси боковых цепей в агликоне (соединение 4 с укороченной боковой цепью показало более высокую активность), играют важную роль в проявлении данного вида биологического действия.

Цитотоксическая активпость дппластериозидов А (5), В (6) в астериидозида А (7). Астеросапонин 7 был нетоксичен по отношению к клеткам НСТ-116, T-47D и RPMI-7951 в концентрациях от 20 до 160 мкМ. Дипластериозид А (5) проявлял слабую цитотоксическую активность по отношению к клеткам НСТ-116 и T-47D (1С» 136 и 153 мкМ соответственно). Наибольшее цитотоксическое действие гликозиды 5 и 6 показали на клетках RPMI-795 (ICso 67 и 60 мкМ соответственно).

Цитотоксическая активность и влияние па рост колоиий опухолевых клеток регуларозида А (12) и ториастерозида А (13). Астеросапонин 12 проявил слабую цитотоксическую активность по отношению к клеткам T-47D, RPMI-7951 и НСТ-116 с ICso 169, 117 и 142 мкМ соответственно. Гликозид 13 по сравнению с соединением 12 показал более сильные цитотоксические свойства с ICso 82, 35 и 70 мкМ соответственно. Оба соединения проявили способность в нетоксичной концентрации (15 мкМ) эффективно подавлять рост колоний опухолевых клеток. Гликозид 12 ингибировал формирование колоний клеток T-47D на 57% и клеток RPMI-7951 на 26%, а гликозид 13 подавлял формирование колоний клеток T-47D на 53% и клеток RPMI-7951 на 71%.

Цитотоксическая активпость и влияние па рост колоппй опухолевых клеток гликозпдов полпгидрокспстероидов 14, 19-25 из A. carinifera. Гликозиды 19, 22-25 не проявили какого-либо значительного цитотоксического эффекта по отношению к клеткам НСТ-116, T-47D и RPMI-7951 в концентрациях от 10 до 160 мкМ. Гликозид 21 не был токсичен по отношению к клеткам НСТ-116 в тех же концентрациях, но показал незначительную цитотоксическую активность на клетках T-47D (ICso 154 мкМ) и RPMI-7951 (ICso 128 мкМ). Гликозид 20 проявил слабый цитотоксический эффект только на клетках НСТ-116 (ICso 150 мкМ). Гликозид 14 показал наиболее сильное цитотоксическое действие по отношению ко всем исследуемым типам раковых клеток (ICso в пределах от 32 до 66 мкМ) по сравнению с другими гликозидами. Было изучено действие гликозидов 14, 19-25 в нетоксичных концентрациях (15 или 20 мкМ) на формирование колоний опухолевых клеток T-47D и RPMI-7951. Гликозиды 14 и 21 не ингибировали рост колоний клеток T-47D и подавляли рост колоний клеток RPMI-7951 на 38 и 17% соответственно. Сульфатированные соединения 19,24 и 25 подавляли рост колоний клеток T-47D на 38, 64 и 67% соответственно и клеток RPMI-7951 на 57,60 и 50% соответственно. Гликозиды 20, 22 и 23 ингибировали формирование колоний клеток T-47D и RPMI-7951 в меньшей степени (от 20 до 30%). Таким образом, наиболее выраженным ингибирующим эффектом обладали сульфатированные гликозиды 19,24 и 25.

ВЫВОДЫ

1. Исследован состав фракций полярных стероидных соединений четырех видов морских звезд: Hippasteria kurilensis, Diplasterias brucei, Asleropsis carinifera и Aphelasíerias japónica. Выделено 39 полярных стероидных соединений. Установлено химическое строение 16 новых соединений, из них 7 астеросапонинов, 6 гликозидов полигидроксистероидов и 3 полигидроксистероидов. Проведена структурная идентификация 23 соединений с известными веществами.

2. Установлено строение новых астеросапонинов: гиппастериозидов А, В, С и D, дипластериозидов А и В и астеропсизида А.

3. Впервые в астеросапонинах найдены углеводные цепи: Р-0-ксилопиранозил-(1—>3)-Р-0-фукопиранозил-(1—>2)-Р-0-хиновопиранозил-(1—>4)-[р-П-хиновопиранозил-(1—>2)]-Р-0-ксилопиранозил-(1—>3)-Р-0-хиновопиранозная гексасахаридная цепь и P-D-фукопиранозил-( 1 —»2)-р-0-галактопиранозил-(1 —>4)-[Р-0-хиновопиранозил-( 1 —>2)]-Р-0-хиновопиранозил-(1—>3)-Р-0-хиновопиранозная пентасахаридная цепь.

4. Установлено строение новых гликозидов полигидроксистероидов: кариниферозидов А, В, С, D, Е и F.

5. Строение новых полигидроксистероидов установлено как (24Д,255)-24-метил-5а-Х0лестан-3р,бсх,8,15р,1бр,26-гекса0л, (22£,24Д,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,6а,8, 15Р, 16Р,26-гексаол и (22£,24Д,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-3 Р,4Р,6а,8,15Р, 16Р,26-гептаол.

6. Впервые исследовано влияние астеросапонинов и гликозидов полигидроксистероидов морских звезд на формирование колоний опухолевых клеток. Установлено, что некоторые полярные стероидные соединения эффективно ингибируют рост колоний этих клеток. Показано, что сульфатированные стероидные биозиды обладают более ярко выраженным ингибирующим эффектом по сравнению с близкими по строению несульфатированными соединениями.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванчина Н.В., Малярепко Т.В., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П С. Астеросапонин офидианозид F из гонад дальневосточной морской звезды Aphelasterias japónica // Химия природ, соедин. 2005. № 4. С. 392-393.

2. Иванчина Н.В., Малярепко Т.В., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Молло Э. Полярные стероидные соединения из антарктической морской звезды Diplasterias britcei II Химия природ, соедин. 2006. № 5. С. 621-662.

3. Малярепко Т.В., Кича A.A., Иванчина Н.В., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Смирнов A.B. Три новых полигидроксистероида из тропической морской звезды Asteropsis carinifera II Биоорган, химия. 2010. Т. 36, № 6. С. 755-761.

4. Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Ivanchina N.V., Malyarenko T.V., Dmitrenok P.S., Ermakova S.P., Stonik V.A. Four new asterosaponins, hippasteriosides А, В, C, and D, from the Far Eastern starfish Hippasteria kurilensis II Chem. Biodivers. 2011. V. 8, No. 1.

5. Иванчина H B., Малярепко T.B., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Ермакова С.П. Два новых астеросапонина из антарктической морской звезды Diplasterias britcei. Структуры и цитотоксические активности // Биоорган, химия 2011. Т. 37, №3. С. 499-506.

6. Malyarenko T.V., Kicha A.A., Ivanchina N.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Ermakova S.P., Stonik V.A. Cariniferosides A-F and other steroidal biglycosides from the starfish Asteropsis carinifera II Steroids. 2011. V. 12, No. 76. P. 1280-1287.

7. Малярепко T.B., Иванчина Н.В., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Исследование суммы астеросапонинов из гонад дальневосточной морской звезды Aphelasterias japónica И Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии: тез. докл. регион, науч. конф. Владивосток (16-18 ноября 2004 г.). Владивосток: ДВО РАН, 2004. С. 29.

8. Малярепко Т.В., Иванчина Н.В., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Молло Э. Полярные стероидные соединения из антарктической морской звезды Diplasterias brucei И X Международная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии: тез. докл. МЭС, ТИБОХ, Владивосток (12-19 сентября 2006 г.). Владивосток, 2006. С. 28.

9. Малярепко Т.В., Кича A.A., Иванчина Н.В., Ермакова С.П. Биологически активные стероидные метаболиты из тропической морской звезды Asteropsis carinifera II Российская конференция по иглокожим: сб. тез. докл. Москва (7-8 февраля 2011 г.). Москва: Ин-т океанологии им. П.П. Ширшова РАН, 2011. С. 20.

10. Malyarenko T.V., Kicha A.A., Ivanchina N.V., Ermakova S.P. Studies on structure and bioactivity of asterosaponins from the starfish Diplasterias brucei and Asteropsis carinifera II 9th 1ST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins: procced. Vladivostok (4-8 September 2011). Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 59.

11. Малярепко T.B., Кича A.A., Иванчина Н.В., Ермакова С.П. Исследование структуры и противоопухолевой активности стероидных гликозидов из вьетнамской морской звезды Asteropsis carinifera И 5-й Международный симпозиум химия и химическое образование: сб. науч. труд. Владивосток (12-18 сентября 2011 г.). Владивосток: Изд. ДВФУ, 2011. С. 31-32.

Р. 166-175.

Соискатель

Маляренко Т.В.

Маляреико Тимофей Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ II БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АСТЕРОСАПОНИНОВ И ДРУГИХ ПОЛЯРНЫХ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МОРСКИХ ЗВЕЗД

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 22.05.2012 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,45 Тираж 100 Заказ 379 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Основные типы стероидных соединений морских звезд.

2.2 Астеросапонины.

2.3 Гликозиды полигидроксистероидов.

2.4 Полигидроксистероиды и их сульфаты.

2.5 Биологическая активность полярных стероидных соединений морских звезд.

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1 Получение суммарных фракций полярных стероидных соединений из экстрактов морских звезд и выделение индивидуальных соединений.

3.2 Установление строения астеросапонинов и других полярных стероидных соединений морских звезд.

3.2.1 Астеросапонины из Hippasteria kurilensis.

3.2.2 Полярные стероидные соединения из Diplasterias brucei.

3.2.2.1 Астеросапонины: дипластериозиды А (99), В (100) и астериидозид А (101).

3.2.2.2 3-ОСульфат торнастерина А (102), астериидозиды Н (103) и L (104)

3.2.3 Полярные стероидные соединения из Asteropsis carinifera.

3.2.3.1 Астеросапонины: астеропсизид А (105), регуларозид А (106) и торнастерозид А (107).

3.2.3.2 Кариниферозиды A-F (108-113) и другие гликозиды полигидроксистероидов (114-119).

3.2.3.3 Полигидроксистероиды.

3.2.4 Астеросапонин офидианозид F (133) из гонад Aphelasterias japónica.

3.3 Биологическая активность выделенных соединений.

3.3.1 Цитотоксичекая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток гиппастериозидов А (95), В (96), С (97) и D (98).

3.3.2 Цитотоксическая активность дипластериозидов А (99), В (100) и астериидозида А (101).

3.3.3 Цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток астеросапонинов регуларозида А (106) и торнастерозида А (107) из Asteropsis carinifera.

3.3.4 Цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток гликозидов полигидроксистероидов 108,113-119 из Asteropsis carinifera.

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5 ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Стероидные гликозиды (сапонины) являются типичными метаболитами наземного происхождения, которые были выделены из различных видов высших растений. Так, хорошо известные сердечные гликозиды на протяжении долгого времени используются для лечения заболеваний сердца. В то же время данная группа соединений мало распространена в животном мире. Стероидные гликозиды были найдены в большинстве изученных видов морских звезд и совсем недавно в губках, кишечнополостных и некоторых рыбах. Все выделенные сапонины морского происхождения существенным образом отличаются от аналогичных метаболитов растений оригинальностью своих структур.

Класс иглокожих АБ1его1ёеа содержит разнообразные по своему химическому строению стероидные метаболиты. Наибольший интерес для исследователей представляют полярные стероидные соединения, к которым принято относить астеросапонины - олигогликозиды с пятью-шестью моносахаридными остатками, полигидроксистероиды, чаще всего имеющие от четырех до девяти гидроксильных групп, и гликозиды полигидроксистероидов (монозиды, биозиды, иногда триозиды). Большинство изученных полярных стероидных соединений морских звезд имеет своеобразное химическое строение, что делает их структурное исследование интересной химической задачей. Несомненно, большое внимание исследователей к окисленным стероидным соединениям морских звезд связано не только с их уникальным химическим строением, но и с разнообразной биологической активностью, которую проявляет данная группа веществ. Например, недавно было показано, что некоторые стероидные гликозиды морских звезд в нетоксичных концентрациях препятствуют перерождению нормальных клеток в опухолевые (канцерпревентивный эффект) и тормозят образование колоний опухолевых клеток (противоопухолевый эффект). Также было установлено, что эти соединения могут проявлять нейротрофические и нейропротекторные свойства: усиливать нейритогенное действие фактора роста нервов (синергетический эффект), стимулировать регенерацию нервных волокон, способствовать выживанию нервных клеток в условиях кислородного голодания.

Первые работы по изучению строения полярных стероидных соединений морских звезд были осуществлены в Японии, а затем были продолжены в Европе (Италия, Испания) и России, однако в настоящее время основные исследования продолжаются в Азиатско-Тихоокеанском регионе: в нашей лаборатории (Лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН им. Г. Б. Елякова), а также группами китайских, корейских, японских и вьетнамских коллег, чьи статьи по данной тематике публикуются в ведущих журналах мира.

Целью настоящей работы являлось изучение структуры и биологической активности астеросапонинов, как наиболее сложно устроенных полярных стероидных соединений морских звезд, а также других сопутствующих им полярных стероидных метаболитов. Знания, полученные в результате их изучения, способствуют дальнейшему развитию исследований в области структурной химии стероидных соединений, их экологической и биологической роли.

Задачами настоящей работы были: 1) выделение индивидуальных астеросапонинов и других полярных стероидных соединений из четырех видов морских звезд: Hippasteria kurilensis, Diplasterias brucei, Asteropsis carinifera и Aphelasterias japónica; 2) установление строения новых соединений, включая определение абсолютной стереохимии асимметрических центров и определение принадлежности к D- или L-ряду моносахаридных остатков; 3) структурная идентификация известных ранее соединений, найденных в изучаемых морских звездах; 4) изучение цитотоксической активности выделенных соединений и их влияния на рост колоний опухолевых клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1) Морские звезды Hippasteria kurilensis, Diplasterias brucei, Asteropsis carinifera и Aphelasterias japónica являются богатым источником полярных стероидных соединений: астеросапонинов, полигидроксистероидов и их гликозидов.

2) В морской звезде Hippasteria kurilensis найдены астеросапонины -гиппастериозиды А, В, С и D, которые содержат новую гексасахаридную цепь.

3) В морской звезде Diplasterias brucei найдены астеросапонины - дипластериозиды А и В, которые содержат новую пентасахаридную цепь.

4) В морской звезде Asteropsis carinifera обнаружены новые соединения: астеросапонин астеропсизид А, гликозиды полигидроксистероидов -кариниферозиды А, В, С, D, Е и F и три полигидроксистероида: (2AR,25S)-24-метил-5а-холестан-3 р,6а,8,15 Р, 16р,26-гексаол, (22£,24Д,25£>24-метил-5а-холест-22-ен-З р,6а,8,15р, 16р,26-гексаол и (22£,24Д,255>24-метил-5а-холест-22-ен-3 р,4р,6а,8,15(3,16 р,26-гептаол.

5) Некоторые полярные стероидные гликозиды морских звезд эффективно ингибируют рост колоний опухолевых клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе проведенной работы исследованы экстракты 4 видов морских звезд, собранных в разных районах Японского, Охотского и Южно-китайского морей и моря Росса. Выделено 39 индивидуальных полярных стероидных соединений. С помощью спектральных методов и химических превращений установлено полное химическое строение 16 новых соединений (7 астеросапонинов, 6 гликозидов полигидроксистероидов и 3 полигидроксистероидов). Проведена структурная идентификация 23 известных веществ.

Показано, что некоторые из выделенных соединений имеют структурные фрагменты, которые ранее не встречались в стероидных метаболитах морских звезд. В частности, в астеросапонинах обнаружены новые углеводные цепи: Р-О-ксилопиранозил-( 1 —»3)-р-0-фукопиранозил-( 1 —>2)- р-В-хиновопиранозил-( 1 —>4)-[Р-0-хиновопиранозил-( 1 —>2)]- Р-0-ксилопиранозил-( 1 —>3)-Р-В-хиновопиранозная гексасахаридная цепь и Р-В-фукопиранозил-(1-*2)-р-0-галактопиранозил-(1—>4)-[ р-В-хиновопиранозил-( 1 —>2)] - р-0-хиновопиранозил-( 1 —>3)- Р-О-хиновопиранозная пентасахаридная цепь. Впервые проведено исследование влияния астеросапонинов и гликозидов полигидроксистероидов морских звезд на формирование колоний опухолевых клеток и показано, что некоторые полярные стероидные соединения эффективно ингибируют рост колоний этих клеток.

Практическое значение данного исследования состоит в развитии методов выделения и установления строения новых полярных стероидных метаболитов морских звезд. А новые данные о физиологической активности этих соединений открывают перспективы их дальнейшего исследования в качестве потенциальных противоопухолевых агентов.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на I Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2004); на X Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ ДВО РАН, 2006); на Российской конференции по иглокожим (Москва, 2011); на 9-ом Азиатско-Тихоокеанском симпозиуме по животным, растительным и микробиальным токсинам (Владивосток, 2011) и на 5-ом международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного исследованию стероидных метаболитов морских звезд и их биологической активности, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 13 таблиц, 4 рисунка и 2 схемы. Список литературы включает 122 цитируемые работы.

5 ВЫВОДЫ

1. Исследован состав фракций полярных стероидных соединений четырех видов морских звезд: Hippasteria kurilensis, Diplasterias brucei, Asteropsis carinifera и Aphelasterias japónica. Выделено 39 полярных стероидных соединений. Установлено химическое строение 16 новых соединений, из них 7 астеросапонинов, 6 гликозидов полигидроксистероидов и 3 полигидроксистероидов. Проведена структурная идентификация 23 соединений с известными веществами.

2. Установлено строение новых астеросапонинов: гиппастериозидов А, В, С и D, дипластериозидов А и В и астеропсизида А.

3. Впервые в астеросапонинах найдены углеводные цепи: p-D-ксилопиранозил-(1-^3)-р-0-фукопиранозил-(1—>2)-Р-0-хиновопиранозил-(1—»4)-[p-D-хиновопиранозил-(1—>2)]-р-0-ксилопиранозил-(1-^3)-р-0-хиновопиранозная гексасахаридная цепь и р-0-фукопиранозил-(1—^-Р-В-галактопиранозил-(1 —>4)-[р-0-хиновопиранозил-( 1 —>2)]-р-0-хиновопиранозил-( 1 —>3)-P-D-хиновопиранозная пентасахаридная цепь.

4. Установлено строение новых гликозидов полигидроксистероидов: кариниферозидов А, В, С, D, Е и F.

5. Строение новых полигидроксистероидов установлено как (24Я,255)-24-метил-5а-холестан-Зр,6а,8,15р,1бр,26-гексаол, (22£,24Л,25£)-24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,6а,8,15р,16р,26-гексаол и (22£,247г,255)-24-метил-5а-холест-22-ен-Зр,4р,6а,8,15р,1бр,26-гептаол.

6. Впервые исследовано влияние астеросапонинов и гликозидов полигидроксистероидов морских звезд на формирование колоний опухолевых клеток. Установлено, что некоторые полярные стероидные соединения эффективно ингибируют рост колоний этих клеток. Показано, что сульфатированные стероидные биозиды обладают более ярко выраженным ингибирующим эффектом по сравнению с близкими по строению несульфатированными соединениями.

1. Goad L.J., Rubinstein I., Smith A.G. The sterols of echinoderms // Proc. R. Soc. bond. B. Biol. Sci. 1972. V.180, No. 59. P. 223-246.

2. Goodfellow R.M., Goad L.J. The steryl sulphate content of echinoderms and some other marine invertebrates // Сотр. Biochem. Physiol. 1983. V. 76B, No. 3. P. 575578.

3. Goad L.J. Sterol biosynthesis and metabolism in marine invertebrates // Pure Appl. Chem. 1981. V. 53, No. 4. P. 837-852.

4. Stonik V.A., Elyakov G.B. Secondary metabolites from Echinoderms as chemotaxonomic markers. // In: Scheuer P. (Ed.). Mar. Bioorg. Chem. 1988. V. 2. P. 43-86.

5. D'Auria M.V., Minale L., Riccio R. Polyoxygenated steroids of marine origin // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 1839-1895.

6. Kornprobst J.M., Sallenave C., Barnathan G. Sulfated compounds from marine organisms // Сотр. Biochem. Physiol. 1998. V. 119B, No. 1. P. 1-51.

7. De Riccardis F., Minale L., Riccio R., Giovannitti В., Iorizzi M., Debitus C. Phosphated and sulfated marine polyhydroxylated steroids from the starfish Tremaster novaecaledoniae И Gazz. Chim. Ital. 1993. V. 123. P. 79-86.

8. Pradeep Kumar S.V.A.S., Dhananjaya N., Reddy G.B.S. Two new hydroxylated sterol xylosides from the sea cucumber Synapta muculata II J. Chem. Res. (S). 1998. No. 6. P. 404-405.

9. Kicha A.A., Ivanchina N.V., Stonik V.A. Seasonal variations in polyhydroxysteroids and related glycosides from digestive tissues of the starfish Patiria (=Asterina) pectinifera II Comp. Biochem. Physiol. 2004. V. 139B, No. 4. P. 581-585.

10. Garneau F.X., Harvey C., Simard J.L., ApSimon J.W., Burnell D.J., Himmelman J.H. The distribution of asterosaponins in various body components of the starfish Leptasteriaspolaris II Comp. Biochem. Physiol. 1989. V. 92B, No. 2. P. 411-416.

11. Ikegami S. Role of asterosaponin A in starfish spawning induced by gonad-stimulating substance and 1-methyladenine // J. Exp. Zool. 1976. V. 198, No. 3. P. 359-366.

12. Voogt P.A., Huiskamp R. Sex-dependence and seasonal variations of saponins in the gonads of the starfish Asterias rubens: relation to reproduction // Сотр. Biochem. Physiol. 1979. V. 62A, No. 4. P. 1049-1055.

13. Стоник В.А. Морские полярные стероиды // Успехи химии. 2001. V. 70, № 8. С. 763-808.

14. Iorizzi М., De Marino S., Zollo F. Steroidal oligoglycosides from the Asteroidea // Curr. Org. Chem. 2001. V. 5. P. 951-973.

15. Stonik V.A., Ivanchina N.V., Kicha A.A. New polar steroids from starfish // Nat. Prod. Comm. 2008. V. 3, No. 10. P. 1587-1610.

16. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Stonik V.A. Steroid glycosides from marine organisms // Steroids. 2011. V. 76. P. 425-454.

17. Dong G., Xu Т.Н., Yang В., Lin X.P., Zhou X.F., Yang X.W., Liu Y.H. Chemical constituents and bioactivities of starfish // Chem. Biodivers. 2011. V. 8, No. 5. P. 740-791.

18. Kitagawa I., Kobayashi M. Saponin and sapogenol. XXVI. Steroidal saponins from the starfish Acanthaster planci L. (Crown of thorns). (2). Structures of the major saponin thornasteroside A // Chem. Pharm. Bull. 1978. V. 26, No. 6. P. 1864-1873.

19. Turner A.B., Smith D.S.H., Mackie A.M. Characterization of the principal steroidal saponins of the starfish Marthasterias glacialis: structures of the aglycones // Nature. 1971. V. 233. N 5316. P. 209-210.

20. Itakura Y., Komori T. Biologically Active Glycosides from Asteroidea, X. Steroid oligoglycosides from the starfish Acanthaster planci L., 3. Structures of four new oligoglycoside sulfates // Liebigs Ann. Chem. 1986. No. 3. P. 499-508.

21. Riccio R., Iorizzi M., Minale L., Oshima Y., Yasumoto T. Starfish saponins. 34. Novel steroidal glycoside sulfates from the starfish Asterias amurensis // J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1988. No. 6. P. 1337-1347.

22. Riccio R., Iorizzi M., Squillace-Greco O., Minale L., Debray M., Menou J.L. Starfish saponins. 22. Asterosaponins from the starfish Halityle regularis: a novel22,23-epoxysteroidal glycoside sulfate // J. Nat. Prod. 1985. V. 48, No. 5. P. 756765.

23. Riccio R., Pizza C., Squillace-Greco O., Minale L. Starfish saponins. 17. Steroidal glycoside sulphates from the starfish Ophidiaster ophidianus (Lamarck) and Hacelia attenuata (Gray) // Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1985. No. 4. P. 655-660.

24. Itakura Y., Komori T., Kawasaki T. Biologically active glycosides from asteroidea,1.. Steroid oligoglycosides from the starfish Astropecten latespinosus Meissner // Liebigs Ann. Chem. 1983. No. 1. P. 56-68.

25. Findlay J.A., He Z.-Q. Novel sulfated sterol glycosides from Asterias forbesi II J. Nat. Prod. 1990. V. 53, No. 3. P. 710-712.

26. Riccio R., Iorizzi M., Minale L. Starfish saponins. 30. Isolation of sixteen steroidal glycosides and three polyhydroxysteroids from the Mediterranean starfish Coscinasterias tenuispina II Bull. Soc. Chim. Belg. 1986. V. 95, No. 9-10. P. 869893.

27. Tang H.F., Yi Y.H., Li L., Sun P., Zhang S.Q., Zhao Y.P. Asterosaponins from the starfish Culcita novaeguineae and their bioactivities // Fitoterapia. 2006. V. 77, No. l.P. 28-34.

28. Tang H.F., Cheng G., Wu J., Chen X.L., Zhang S.Y., Wen A.D., Lin H.W. Cytotoxic asterosaponins capable of promoting polymerization of tubulin from the starfish Culcita novaeguineae II J. Nat. Prod. 2009. V. 72, No. 2. P. 284-289.

29. Ma X.G., Tang H.F., Zhao C.H., Ma N., Yao M.N., Wen A.D. Two new 24-hydroxylated asterosaponins from Culcita novaeguineae II Chin. Chem. Lett. 2009.

30. V. 20, No. 10.P.1227-1230.