Окисленные стероидные соединения морских звезд: структурные исследования и изучение биологических функций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кича Алла Анатольевна

ОКИСЛЕННЫЕ СТЕРОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ МОРСКИХ ЗВЕЗД: СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток - 2003

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дльневосточного отделения РАН

Научный консультант: академик Стоник В.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Камерницкий A.B.

доктор химических наук, профессор Каминский В.А.

доктор химических наук, с.н.с. Звягинцева Т.Н.

Ведущая организация: Институт органической химии

Уфимского научного центра РАН

Защита состоится " " января 2004 г. в " /О" часов на заседании Диссертационного совета Д.005.005.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН, факс: (4232) 31-40-50.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, K.X.H., с.н.с.

Прокопенко Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Класс морских звезд (А51его!ёеа), относящийся к типу иглокожих (ЕсЫпос1егта1а), состоит из более чем 1500 видов. Свыше 100 видов морских звезд обигакгг в Японском, Охотском и Беринговом морях, причем здесь они являются ведущими видами в биоценозах. Многие морские звезды - хищники, они наносят существенный вред подводным плантациям моллюсков, а в тропиках и коралловым рифам. Поэтому в некоторых морских районах существует необходимость ограничения численности этих животных и их утилизации.

Морские звезды отличаются от других животных большим разнообразием стероидных соединений. В них присутствуют различные группы этих веществ, но особое внимание привлекают окисленные стероидные соединения, к которьм относятся полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксистероидов, астеросапонины -стероидные олигогликозиды с пятью - шестью моносахаридными остатками, и другие родственные им вещества.

В основном интерес к окисленным стероидным соединениям морских звезд объясняется их разнообразной физиологической активностью. Экстракты морских звезд и индивидуальные вещества, выделенные из них, проявляют антивирусные, антимикробные, анальгетические, противовоспалительные, гипотензивные и другие биологические свойства. Окисленные стероиды играют определенную экологическую роль, являясь алломонами - веществами, отпугивающими многих морских животных: двустворчатых и брюхоногих моллюсков, морских ежей, лилий, актиний.

Кроме того, эти соединения часто имеют своеобразное химическое строение, значительно отличаясь от стероидных метаболитов наземных растений и животных. Изучением строения и свойств окисленных стероидных соединений морских звезд помимо нашей лаборатории (лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН) занимаются научно-исследовательские группы из университетов Неаполя (Италия), Сантьяго де Компостелла (Испания), Фукуоки (Япония) и ряда других стран, а статьи, посвященные этой теме, публикуются в ведущих научных журналах мира.

К началу 80-х гг., когда были начаты наши исследования, из окисленных стероидных соединений морских звезд были известны только высокополярные "классические" астеросапонины, для которых характерно наличие сульфатированного стероидного агликона с Д9(и)-двойной связью и Зр,6а-диольной группировкой.

Целью данной работы является изучение структур и биологической роли низкомолекулярных полярных стероидов, в основном, полигидроксистероидов (число гидроксильных групп в них колеблется от четырех до девяти), монозидов и биозидов полигидроксистероидов, дисульфатированных стероидов и близких к ним по полярности сульфатов и монозидов астерогенинов. Знание химического строения этих соединений может использоваться в дальнейшем для изучения строения и зависимости структура -активность для подобных стероидов, прогнозирования возможной физиологической активности новых соединений, выявления полезных свойств этих веществ и формирования предложений по их практическому использованию. Кроме того, результаты такого рода исследований важны для понимания биологических функций окисленных стероидов, а также изучения их экологической роли в морских биоценозах.

ЗАДАЧАМИ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ были:

- выделение большой серии новых полярных стероидов из морских звезд, установление их структуры и изучение их свойств, включая биологическую активность;

- изучение зависимости состава окисленных стероидных соединений морских звезд от места их обитания;

- изучение распределения окисленных стероидных соединений, в том числе полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, в различных частях тела морских звезд и сезонных изменений в содержании этих соединений с целью выяснения их биологической роли.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Морские звезды содержат разнообразные окисленные стероидные соединения: полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксистероидов, дисульфатированные стероиды, сульфаты астерогенинов и монозиды астерогенинов.

2. Окисленные стероидные соединения морских звезд проявляют гемолитические, эмбриотоксические и канцерпревентивные свойства, для некоторых из них характерны кардиотропный эффект, способность активировать р-1,3-0-глюканазу из моллюска.

3. Полигидроксистероиды и их гликозиды содержатся в органах пищеварения морских звезд, в отличие от астеросапонинов, присутствующих во всех органах и тканях животных.

4. Полигидроксистероиды и их гликозиды присутствуют в морских звездах постоянно на протяжении всего года. Их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания животных. Химическое строение и свойства полигидроксилированных стероидных соединений морских звезд имеют определенное сходство с желчными спиртами и кислотами животных и человека. Все это предполагает, что одной из биологических функций этих веществ является их участие в пищеварительных процессах.

5. Состав суммарной фракции окисленных стероидных соединений в морских звездах одного вида не постоянен и может изменяться в зависимости от места сбора животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд было выделено 76 окисленных стероидных соединений. Установлено строение 50 новых соединений и проведена структурная идентификация 26 веществ с известными ранее веществами.

Впервые были выделены гликозиды полигидроксистероидов с (1->5) и (1->6) гликозидными связями в углеводных цепях, а также гликозиды, содержащие редкие моносахариды: галактофуранозу, 2,3-ди-О-метилксилопиранозу, 5-О-сульфат 3-О-метиларабинофуранозу и 2-О-сульфат арабинофуранозу.

Впервые в окисленных стероидах морских звезд обнаружены необычные фрагменты: 23-кето-24-гидроксихолестановая, 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая и 28,29-дигидрокси-24-пропилхолесгановая боковые цепи, а также 24-гликозилированная 24,26-дигидроксихолесгановая боковая цепь, сочетающая одновременно структурные признаки гликозидов и свободных полигидроксистероидов.

Найдена новая структурная серия стероидных соединений морских звезд, названных нами алкалоидостероидами. Эти соединения представляют собой ионные гибриды, состоящие из окисленного стероидного аниона и алкалоидного катиона.

Выполнены биологические испытания полигидроксистероидов и родственных гликозидов и показано, что они проявляют гемолитические и цитотоксические свойства. Установлено, что левискулозид Ь обладает канцерпревентивным действием, а 'астеросапонин' Р) и его десульфаггированное производное способны формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Показано, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов могут активировать р-1,3-Д-глюканазу из моллюска 8р1$и1а яасИа/тета, а некоторые астерогенины - оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска.

Изучено распределение полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в различных частях тела морской звезды. Показано, что свободные стерины и асгеросапонины присутствуют во всех изученных тканях животных, а полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов - только в органах пищеварения - желудке и пилорических выростах. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морской звезде. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, и их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенбза перед нерестом. Исходя из этого, а также на основании сходства их химического строения и свойств с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека сделано предположение, что одной из биологических функций полигидроксистероидных соединений является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у более высокоразвитых животных.

Изучены сезонные изменения в составе суммарной фракции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах, принадлежащих к одной популяции. Показано, что в течение года состав этих веществ является довольно постоянным, несмотря на незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одного и того же вида морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений у них различен и зависит от места сбора животных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы были представлены на VII Молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически-активным соединениям (Ереван, 1984); Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1989); VI, IX, X Международных симпозиумах по морским природным соединениям (Дакар, Сенегал, 1989; Таунсвилл, Австралия, 1998; Окинава, Япония, 2001); международной конференции "Сапонины в пище, пищевом сырье и лекарственных растениях" (Пулавы, Польша 1999); 2-м Мезвдународном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, 2000); Международном морском биотехнологическом конгрессе (Таунсвилл, Австралия, 2000); международной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" (Алматы, Казахстан, 2003).

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в научных журналах: Химия природных соединений; Биоорганическая-химия; Известия Академии-наук, серия химическая; Tetrahedron Letters; Journal of Natural Products (Lloydia); Comparative Biochemistry and Physiology, В. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликованы 53 работы, в том числе 33 научных статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам и функциям стероидных соединений морских звезд, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты, и Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, использованный в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитированной литературы. Работа изложена на 320 страницах, содержит 72 таблицы, 18 рисунков и 8 схем. Список литературы включает 295 цитируемых работ.

Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН к.х.н. Иванчиной Н.В., к.х.н. Левиной Э.В., Андриященко П.В., к.х.н. Пономаренко Л.П. - за помощь в работе и проведении ряда химических экспериментов, к.х.н. Калиновскому А.И., Дмитренку П.С., к.х.н. Елькину Ю.Н., к.х.н. Ильину С.Г. - за получение и помощь в обработке спектральных данных.

Автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН к.б.н. Горшкову И.А., к.б.н. Горшкова Б.А., к.х.н. Федорова С.Н., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Бурцеву Ю.В., к.б.н. Прокофьеву Н.Г., Чайкину Е.Л., к.б.н. Аминина Д.Л., к.б.н. Агафонову И.Г., Лихацкую Г.Н., Шенцову Е.Б. за проведение изучения физиологической активности соединений, а также к.б.н. Смирнова A.B., к.б.н. Грузова E.H. (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург), к.б.н. Даутова С.Ш., к.б.н. Яковлева Ю.М. (ИБМ ДВО РАН, г. Владивосток), определивших видовую принадлежность изученных морских звезд.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; FABMS - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; LSIMS - масс-спектрометрия с ионизацией ускоренными ионами цезия; ESIMS - электроспрей-ионизационная масс-спектрометрия; EIMS - масс-спектрометрия с ионизацией электронами; MALDI/TOFMS - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией усиленной матрицей; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ХС - химический сдвиг; КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; COSY - корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - гетероядерная многополосная корреляция; HMQC - гетероядерная многоквантовая корреляция.

РЕЗУЛЬТАТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение суммарных фракций окисленных стероидных соединений из экстрактов морских звезд и выделение индивидуальных соединений

Окисленные стероидные соединения присутствуют в морских звездах в виде сложных смесей близких по строению веществ. Содержание индивидуальных полярных стероидов невелико и составляет всего 0.01 — 0.0001% от сырого веса морской звезды. Поэтому получение индивидуальных полярных стероидов из экстрактов морских звезд является сложной экспериментальной задачей.

Выделение низкомолекулярных полярных стероидов состояло из трех основных этапов: 1) выделение суммарной фракции полярных стероидов; 2) выделение суммарной фракции стероидных соединений средней полярности, в которую входят полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксисгероидов, сульфаты и монозиды асгерогенинов; 3) выделение индивидуальных стероидных соединений.

Для осуществления первого этапа выделения спиртовые экстракты морских звезд разделяли с помощью обращеннофазной колоночной хроматографии на гидрофобных сорбентах - полихроме-1 или амберлите XAD-2. Второй этап выделения заключался в отделении среднеполярных стероидных соединений от более полярных олигогликозидов -астеросапонинов. Этот процесс осуществляли с помощью колоночной гельпроникающей хроматографии на сефадексе LH-20. Для осуществления третьего этапа выделения использовали комбинацию многократной колоночной хроматографии на силикагеле и флорисиле. В результате получали подфракции, обогащенные одним или несколькими стероидными соединениями и дающие индивидуальное пятно по данным тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для дальнейшего разделения полученных подфракций и выделения индивидуальных соединений применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) высокого давления на полупрепаративных и аналитических

колонках. В некоторых случаях, когда все же не удавалось разделить сложные суммы природных стероидов, использовали также мягкое сольволитическое десульфатирование или ацетилирование с последующим разделением полученных производных.

В ходе данной работы были отработаны и усовершенствованы методы выделения окисленных стероидных соединений с помощью обращеннофазовой, гельпроникающей, адсорбционной хроматографии и ВЭЖХ. В каждом конкретном случае тщательно подбирались оптимальные условия разделения. Поэтому применявшиеся методики для различных видов морских звезд имели некоторые отличия при их сравнении друг с другом. В качестве примера применяемого подхода к получению среднеполярных окисленных стероидов из морских звезд приведена схема выделения пяти соединений из глубоководной морской звезды МеАШег тиггауг (схема 1).

МеОН - вода (2:1)

Суммарная фракция Силикагель Ь 40/100 мкм

полигиАпоксистсроидов _^ хлороформ - МеОН

и гликозидов ступенчатый градиент

палигидооксистевоадов (4 :о.5-2:1)

т

Схема 1. Выделение полигидроксилированных соединений из МеЖа$1ег тиггауг.

2. УСТАНОВЛЕНИЕ СТРОЕНИЯ ОКИСЛЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

ИЗ МОРСКИХ ЗВЕЗД 2.1. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из РаШа (=Ах1ег1па) реа1п1/ега

Из этанольного экстракта дальневосточной морской звезды РаПпа (= А.'Иегма) ресПт/ега (семейство Аз1епшс1ае, отряд Уа1уаШа) выделили окисленные стероиды -гликозиды 1 и 6, гексаол 2, гептаол 3, окгаол 4, сульфатированный октаол 5. Так как к моменту выделения 1 в морских звездах были обнаружены только астеросапонины, гликозид 1 назвали 'астеросапонином' Р]. На самом деле соединение 1 не является "классическим" астеросапонином. Установление его строения помогло в дальнейшем при определении структур других выделенных нами полигидроксилированных стероидных соединений.

К=К1-П Э. П=иои3

3. R=H, ^=ОН 5а. Я=К,=Н

4. Р^И^ОН 56. К=0503"Ма+, И,=Ас

'Астеросапонин' Р1 (1). Соединение 1 имело полосы поглощения при 3450 см"1 и 1060 см"1 в ИК спектре, а в 13С ЯМР спектре - сигнал аномерного атома углерода углеводного остатка при 8 109.4 м.д., что вместе с химическими свойствами 1 подтверждало его гликозидную природу. Наличие стероидного агликона в 1 вытекало из его характерного окрашивания в условиях реакции Либермана-Бурхарда и 'II ЯМР спектра десульфатированного производного 1а, в котором присутствовали сигналы протонов пяти метальных групп. Элементный анализ, полоса поглощения при 1230 см'1 в ИК спектре и легкое сольволитическое десульфатирование свидетельствовали о том, что 'астеросапонин' Р] - сульфатсодержащий гликозид. Атомно-абсорбционный анализ

показал, что в 1 присутствует ион При кислотном гидролизе 1 давал моносахарид, идентифицированный как 3-0-метил-£-арабиноза. Деметилирование ацетата моносахарида ВВг3 в хлористом метилене с последующим дезацетилированием привело к ¿-арабинозе ([а]п, БХ, ГЖХ).

Дальнейшую структурную информацию о гликозиде 1 получили после сравнительного анализа 13С ЯМР спектров 1, десульфатированного производного 1я, гекса-О-метил-производного 16 и пентаацетата 1в (схема 2). Сигналы при 5 109.4, 89.0, 83.6, 80.8, 68.4 и 57.6 м.д. в спектре 1 и сигналы при 8 109.7, 88.8, 84.0, 81.1, 63.2 и 57.6 м.д. в спектре 1а хорошо согласовывались с литературными данными для а-метил-Л-арабинофуранозида с учетом сдвигов, которые обусловлены наличием 0-сульфогруппы в положении С-5' и О-метильной группы в положении С-3'. Остальные двадцать семь сигналов в 13С ЯМР спектрах 1 и 1а относились к стероидному агликону, причем пять из них были сдвинуты в слабое поле за счет связи с кислородом.

Метилирование по Хакомори привело к получению производного 16. В 13С ЯМР спектре 16 имелось шесть сигналов О-метильных групп и сохранялся синглет третичного углерода, связанного с гидроксилом (5 75.1 м.д.). Из чего следовало, что из пяти гидроксильных групп агликона четыре - являются вторичными, а одна - третичной. Ацетилирование соединения 1ядало пентаацетат 1в, в 13С ЯМР спектре которого также присутствовал сигнал третичного углерода, связанного с гидроксилом (5 74.9 м.д.).

Высокотемпературное гидрирование 'астеросапонина' Р1 над Р(1/СаСОз катализатором дало 5а-холестан, идентифицированный ГЖХ и ГЖХ-масс-спектрометрией. В результате был сделан вывод, что агликон 'астеросапонина' Р1 имеет 5а-холестановый скелет.

Схема 2. Химические превращения десульфатированного 'астеросапонина' Р] (1а).

Окислением десульфатированного производного комплексом СЮз/Ру получили трикетон 1г. ИК спектр 1г показал поглощение кетогрупп в пятичленном (1740 см'1) и

шестичленном циклах (1720 и 1715 см'1). El масс-спектр трикетона 1г содержал пики с m/z 446 и 428 (отщепление моносахаридного остатка), 317 (отщепление боковой цепи вместе с моносахаридом), 271 и 245 (расщепление кольца D), позволяющие предположить, что углеводный остаток присоединен к гидроксильной группе, находящейся в боковой цепи.

Окисление десульфатированного производного 1а СгОз/СНзСООН привело к дикетону 1д. При сравнении 'Н ЯМР спектров десульфатированного производного 1а, трикетона 1г, дикетона 1д и отнесении сигналов моносахаридного остатка был обнаружен однопротонный мультиплет при 5 3.57 м.д. (Н-24). Эксперимент по разностному спин-декаплингу выявил однопротонный мультиплет Н-25 (8 1.90 м.д.), давший дублет при облучении Нз-26 и Нз-27, и септет - при облучении частотой, соответствующей сигналу при § 3.57 м.д. В 13С ЯМР спектре 1а сигнал С-24 был сдвинут в слабое поле, а сигналы С-23 и С-25 в сильное поле в соответствии с а- и ß-эффектами гликозилирования по сравнению со спектрами эпимерных 24-гидроксистероидов. На этом основании был сделан вывод, что моносахаридный остаток присоединен к С-24.

Для определения локализации и относительной ориентации гидроксильных групп в агликоне 1а были выполнены эксперименты по разностному спин-декаплингу с варьируемой мощностью облучения. Исходя из мультиплетного сигнала Н-3 при 8 4.01 м.д. (AW = 31.8 Гц), установили расположение протонов при С-3 - С-8, а исходя из триплета дублетов Н-15 при 6 4.80 м.д. {AW= 22.5 Гц) - расположение протонов при С-14 - С-17, С-20. В результате определили, что гидроксильные группы находятся в положениях 3ß,6a,8 и 15а. Эксперименты по ЯЭО с десульфатированным гликозидом 1а также свидетельствовали о 15а- и ба-ориентации гидроксильных групп. При облучении Нз-18 (8 1.30 м.д.) и Нз-19 (8 1.44 м.д.) в слабом поле было обнаружено усиление сигналов только Н-15 и Н-6, соответственно.

Из полученных данных следовало, что строение 'астеросапонина' Pi соответствует формуле 1. 'Асгеросапонин' Pi был одним из первых представителей гликозидов полигидроксистероидов из морских звезд. Позже японские исследователи с помощью рентгеноструктурного анализа десульфатированного гликозида 1а определили абсолютную конфигурацию С-24 как 24S. Приемы, аналогичные описанным выше, применялись нами для установления строения других полигидроксилированных стероидных соединений.

Гексаол 2, гептаол 3 и октаол 4. По данным 13С ЯМР спектров 2,3 и 4 имели по 27 атомов углерода и, соответственно, 6, 7 и 8 гидроксильных групп. Взаимное расположение гидроксильных групп в 2, 3 и 4 было установлено с помощью 'Н ЯМР спектров с применением экспериментов по разностному спин-декаплингу.

Так, исходя из широкого мультиплета Н-3 при 8 3.97 м.д. в спектре 3, установили расположение протонов при С-3 - С-8, а исходя из дублета дублетов Н-15 при 8 5.02 м.д., установили расположение протонов при С-14 - С-17, С-20. Из двух возможных положений первичной спиртовой группы (С-21 или С-26) в 3 было выбрано положение С-26. Разностный спин-декаплинг на Н-26 (8 3.61 м.д.), Н'-26 (8 3.73 м.д.) и Нз-27 (8 1.058 м.д.) дал один и тот же мультиплет Н-25 (8 1.80 м.д.). При гомодекаплинге на Н-25 сигналы Н-26 и Н'-26 превратились в АВ-квартет, а дублет Нз-27 стал синглетом. При ацетилировании 3 получили тетраацетат За. Сравнение Н ЯМР спектров соединений 3 и За показало, что ацетоксильные группы присоединены к С-3, С-6, С-15 и С-26.

Строение 2 и 4 было доказано аналогичным путем. Дополнительное подтверждение относительной конфигурации гидроксильных групп при С-6 и С-15 в 4 получили с помощью спектров дифференциального ЯЭО, которые давали усиление сигнала Н-6 при облучении Нз-19 и сигнала Н-15 при облучении Нз-18. Высокотемпературное гидрирование 2, 3 и 4 над Pd/СаСОз катализатором дало 5а-холестан. Все полученные

данные отвечали формулам 2,3 и 4.

Сульфат октаола 5. Стероидный скелет соединения 5 был подтвержден фрагментацией в масс-спектрах. В 13С ЯМР спектре 5 наблюдали 27 сигналов атомов углерода, из которых 8 были связаны с кислородом. Расположение и относительная конфигурация гидроксильных групп в S были определены экспериментами по разностному спин-декаплингу. КССВ Н-14, Н-15 и Н-16 октаола 5 соответствовали 15а,16а-ориентации протонов. Дополнительное подтверждение относительной конфигурации гидроксильных групп при С-15 и С-16 получили с помощью спектра дифференциального ЯЭО для 5, который не имел откликов в слабом поле при облучении Нз-18 и содержал сигнал Н-6 при облучении Нз-19.

Стероид 5 по результатам элементного и атомно-адсорбционного анализов содержал сульфат-ион и ион Na+. Сигнал С-б в 13С ЯМР спектре 5 был сдвинут в слабое поле на величину 9.4 м.д. по сравнению с С-6 в 4. Сигнал протона при С-6 в *Н ЯМР спектре 5 также был смещен в слабое поле на 0.97 м.д. по сравнению с ХС Н-6 в 4. На этом основании заключили, что сульфатная группа в 5 присоединена к С-6. Попытка мягкого десульфатирования соединения 5 смесью пиридин-диоксан при 90° не была успешной. Десульфатированное производное 5а бьшо получено обработкой 5 2 N HCl. В 'Н ЯМР спектре 5а наблюдалось смещение сигнала Н-6 в сильное поле на 0.87 м.д. по сравнению с соединением 5, что подтвердило локализацию сульфооксигруппы при С-6. Все эти данные соответствовали формуле 5.

'Астеросапонин' Рг (б). В результате десульфатирования подфракции, содержащей сумму гликозидов 1 и 6, и разделения полученных продуктов на силикагеле, выделили десульфатированный гликозид 6а. Позже, при использовании ВЭЖХ, удалось получить соединение 6 в индивидуальном виде.

Кислотный гидролиз десульфатированного производного ба дал /,-арабинозу. Сигналы атомов углерода углеводного фрагмента в 1 С ЯМР спектре ба соответствовали а-метил-1-арабинофуранозиду. Данные ЯМР спектров свидетельствовали о том, что агликон в ба (как и гексаол 2) имеет насыщенное стероидное ядро с гидроксильными группами в положениях 3ß,6а,8,15а и 16ß, а моносахаридный остаток присоединен к боковой цепи.

В HREI масс-спектре ба присутствовал пик иона с m/z 478 [М-моносахаридный остаток]+ состава С29Н50О5. Данные ЯМР спектров и масс-спектра показали, что агликон содержит 29 атомов углерода, а его боковая цепь является десятиуглеродной и имеет изопропильную группу. Из экспериментов по разностному спин-декаплингу и ЯЭО следовало, что сигналы протонов при 5 3.58 и 4.07 м.д. и атома углерода при 8 67.5 м.д. в ЯМР спектрах гликозида ба принадлежат атомам, находящимся в месте присоединения арабинофуранозного остатка к боковой цепи, а в состав ба входит следующий фрагмент: -СНг-СНг-О-а-^-Ага/. Стереохимия асимметрического центра С-24 в ба была определена как R по ХС Нз-26 и Н3-27 в *Н ЯМР спектре при сравнении со спектрами модельных соединений.

Высокотемпературное гидрирование соединения ба и 24-этилхолесгерина над Pd/СаСОз катализатором в обоих случаях привело к 24-этил-5а-холестану.

Позже с помощвю ВЭЖХ удалось выделить гликозид б в индивидуальном виде. В результате анализа 'Н ЯМР спектра 6 было установлено, что сульфатная группа в б расположена при С-2' а-арабинофуранозного остатка.

2.2. Исследование фрагментации в масс-спектрах полигидроксистероидных соединений из Patlria (= Asterina) pectlnifera

С целью установления закономерностей распада полигидроксистероидных

соединений было проведено изучение Е1 масс-спектров высокого разрешения полученных из Р. ресипфга веществ 1-4,1а и 6а.

Во всех спектрах прослеживались сигналы, соответствующие продуктам последовательной дегидратации М+, вплоть до образования углеводородных фрагментов. Присутствие диольных и триольных группировок в стероидном ядре стимулировало ряд направлений распада стероидного скелета, менее выраженных у стероидов с меньшим числом гидроксильных групп. С увеличением числа гидроксильных групп в ряду соединений 2,3, 4 увеличивался вклад ионов [М-Н20]+.

Спектры гексаола 2 и гептаола 3 содержали мало интенсивные пики молекулярных ионов. В спектрах октаола 4 и гликозида 6а таких пиков не было, но наблюдались пики ионов [М-Н2О]"1". Наибольший по массовому числу пик в спектре десульфатированного гликозида 1а соответствовал иону [М-2Н20]+. В условиях снятия масс-спектров соединение 1 подвергалось, вероятно, термической деструкции и давало пик иона [М-ЫаН804-4Н20]+.

Схема 3. Происхождение основных ионов в НЯЕ1 масс-спектрах соединений 1-4,1а и 6а.

Некоторые пути распада полигидроксипроизводных были общими для различных стероидов с боковой цепью из 8 - 10 атомов углерода. Наиболее универсальным

свойством спектров этих соединений являлся разрыв связи С-17 - С-20 (ионы Б). Другим важным направлением фрагментации соединений с холестановым или стигмастановым скелетами был разрыв связей С-20 - С-22 (ионы А), С-13 - С-17 и С-14 - С-15 кольца D (ионы Г). Соединения, не содержащие гидроксильные группы при С-4 и С-7, показывали заметные пики Ci5 ионов (Д) с m/z 251 (la, 2, 6а) и 197 (1), образующихся путем разрыва связей колец С и D. Эти же соединения давали С17 ионы (В), образованные путем разрыва связей С-15 - С-16 и С-13 - С-17.

Были найдены пути распада полигидроксистероидов, характерные, в основном, только для данной группы соединений. Очень важен с аналитической точки зрения разрыв в кольце С связей С-8 - С-14 и С-12 - С-13 (ионы Ж и Е). Образующиеся при этом фрагменты свидетельствуют о присутствии гидроксильной группы при С-8. Общим свойством спектров изученных соединений являлся распад кольца В по связям С-5 - С-б и С-9 - С-10 со стабилизацией заряда на кольце А (ионы Т). Октаол 4 образовывал при этом ион с m/z 129, а все остальные соединения, не содержащие гидроксильную группу при С-4, давали фрагменты с m/z 95 очень высокой интенсивности.

Полученные данные могут быть полезны при изучении строения других полярных стероидов.

2.3. Установление строения гликозидов полигидроксистероидов из Culcita novaeguineae

Из тропической морской звезды Culcita novaeguineae (семейство Oreasteridae, отряд Valvatida) в качестве основного компонента суммарной фракции окисленных стероидных соединений средней полярности был выделен новый полигидроксилированный гликозид -кульцитозид Ci (7). В результате ацетилирования подфракции, содержащей сумму преимущественно двух соединений, разделения полученных продуктов на силикагеле и флорисиле с последующим дезацетилированием были получены еще 2 новых гликозида: кульцитозиды С2 (8) и Сз (9).

Кульцитозид Ci (7). В продуктах кислотного гидролиза 7 были идентифицированы арабиноза и 2,4-ди-О-метилксилоза в соотношении (1:1). По удельному вращению арабинозу отнесли к ¿-ряду, а 2,4-ди-О-метилксилозу - к О-ряду.

С помощью экспериментов по двойному резонансу на протонах и сравнения *Н ЯМР спектров 7 со спектрами 1 и 4 места расположения гидроксильных групп в 7 установили как 3ß,4ß,6a,8,15 и 24. Конфигурация гидроксильной группы при С-15 была определена по КССВ протона Н-15 Ju,\s = 5.6 Гц как ß (при 15а-ОН значение ./14,15 = 9.8 - 11 Гц).

'TTwrrwwTTWW rrwwr fwrrvr г IT w т TT TT T T W TW TTTTTW T TT T тттшп

Определение времен спин-решеточной релаксации и ХС углеродных атомов моносахаридов позволило установить, что к боковой цепи агликона присоединен остаток 2-О-замещенной а-£-Агаг, а концевым является остаток 2,4-ди-ОМе-Ху1р. Метилирование 7 по Хакомори, последующий метанолиз и ацетилирование продуктов метанолиза дало а-и р-метил 2,3,4-три-О-метилксилопиранозиды. Ацетилирование 7 привело к гексаацетату 7а, в котором ацетатные группы находились при С-3, С-б, С-15, С-3', С-5' и С-3". Все эти данные свидетельствовали о присоединении концевого моносахарида к С-2' остатка а-£-Агаг.

Кульцитозиды С2 (8) и Сз (9). Кислотный гидролиз, метилирование по Хакамори с последующим метанолизом и ацетилированием, анализ 13С и 'Н ЯМР спектров 8, 9 и 7 продемонстрировали идентичность их углеводных цепей.

По сравнению с 7 в ЯМР спектрах 8 имелись дополнительные сигналы, свидетельствующие о наличие гидроксильной группы при С-16 в кольце О. КССВ Н-14, Н-15 и Н-16 в 'Н ЯМР спектре 8 указывали на 15о,16а-ориентацию протонов. Таким образом, в стероидном ядре кульцитозида Сг бьшо установлено Зр,4р,6а,8,15р,1бр-расположение гидроксильных групп.

Анализ спектральных данных показал, что в 9 отсутствует гидроксильная группа при С-4, а расположение остальных гидроксилов такое же, как и в гликозиде 8.

В 'н ЯМР спектрах 8 и 9 в слабом поле отсутствовал мультиплетный сигнал Н-24, характерный для 24-О-гликозилированных полигидроксистероидов морских звезд. Вместо него имелись два однопротонных дублета дублетов при 8 2.59 и 4.02 м.д. Регистрация эффекта Оверхаузера при облучении аномерного протона Н-1' арабинофуранозного остатка (8 5.60 м.д.) в спектре 8 дала усиление сигналов при 8 2.59 и 4.02 м.д., что свидетельствовало о присоединении углеводной цепи к СНг-группс. Присутствующий в слабом поле сигнал атома С-28 в 13С ЯМР спектрах 8 и 9 (8 69.3 и 69.1 м.д., соответственно) подтверждал присоединение углеводной цепи к данному атому.

Высокотемпературным каталитическим гидрированием над Р(1/СаСОз катализатором с последующей идентификацией в продуктах гидрирования 24-метил-5а-холестана было подтверждено, что 8 и 9 имеют эргостановый скелет. Кульцитозиды Сг и Сз были одними из первых биозидов полигидроксистероидов с агликонами эргостанового типа, найденных в морских звездах.

2.4. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Сгойй^еграррошз

В дальневосточной морской звезде Сгоя,«м7ег/>ар/>о.н« (семейство 8о1аз1еп<1ае, отряд Уе1аи'(1а), собранной в Охотском море у побережья Курильских островов, были найдены новые полигидроксистероидные гликозиды - кроссастерозиды Р[, Рг, Рз и Р4 (10-13), а также известные ранее стероидные гексаолы 14,15 и аттенуатозид В-1 (16). Гликозиды 10 и 11 выделили в результате ацетилирования подфракции, содержащей преимущественно эти два соединения, разделения полученных продуктов на силикагеле и флорисиле с последующим дезацетилированием.

Кроссастерозиды Р[ и Р2 (10 и 11). Моносахаридный анализ для 10 и 11 показал наличие О-галактозы и 2-0-метил-£>-ксилозы (1:1). По данньм 'Н и 13С ЯМР спектров установили, что остаток галактозы находится в фуранозной форме, остаток 2-0-метилкилозы - в пиранозной форме, а гликозидные связи имеют р-конфигурацию. Сравнение ХС протонов углеводных частей 10 и ацетилированного производного 10а показало, что ОАс-группы в 10а находятся при С-3', С-5', С-6', С-3" и С-4". Следовательно, в 10 остаток Р-2-ОМе-£>-Ху1р присоединен к остатку р-О-Оа^ гликозидной

связью (1-»2). Совпадение спектральных данных углеводных цепей 10 и 11 свидетельствовало об их полной идентичности.

Разностным спин-декаплингом установили Зр,бр,8,15а,1бр-расположение гидроксильных групп в 10. Сравнение участков 13С и 'Н ЯМР спектров гликозида 10 и 11, относящихся к сигналам атомов А/В колец стероидного ядра, выявило наличие в 11 дополнительной 4Р-ОН группы. Сигналы атомов С-20 - С-29 в 13С ЯМР спектрах 10 и 11 практически совпадали с соответствующими сигналами в спектре десульфатированного 'астеросапонина' Р2 (6а). На основании литературных данных для различных 24-этил-производных холестерина установили, что наблюдаемые различия в ХС атомов углерода и протонов СНз-26 и СНз-27 соответствовали Л-конфигурациям асимметрических центров С-24 в 10 и 11. Впервые в гликозидах полигидроксистероидов была найдена галактофураноза, ранее в астеросапонинах встречалась только галаетопираноза.

Кроссастерозид Рз (12). В результате кислотного гидролиза 12 была получена 3-0-метил-О-глюкоза. Сигналы атомов углерода и протонов, а также КССВ протонов моносахаридного остатка в ЯМР спектрах 12 хорошо согласовывались с соответствующими значениями в спектрах 1,3-ди-0-метил-Р-/)-глюкопиранозида.

Присутствие в 13С ЯМР спектре 12 сигналов атомов углерода метиленовых групп при 5 119.0, 132.6, 136.0 и 157.6 м.д. доказывало, что в нем имеются две двойные связи. Разностный спин-декаплинг при облучении винильного протона Н-15 (5 5.46 м.д.) превратил сигналы соседних протонов Н-16 (б 2.10 м.д.) и Н-16' (5 1.83 м.д.) в дублеты дублетов с КССВ 7.6, 16.1 и 10.7, 16.2 Гц, соответственно. Регистрация эффекта

Оверхаузера при облучении Н-15 выявила усиление сигналов Н-7е (8 2.71 м.д.) и Н-7а (8 1.84 м.д.). Эти эксперименты свидетельствовали о том, что одна двойная связь находится в положении 14(15). Другая двойная связь присутствовала в боковой цепи агликона: облучение мультиплетов при 8 5.17 м.д. (Н-22, Н-23) дало сигналы ЯЭО протонов всех метальных групп, образующих дублеты. Значение ХС С-20 (8 39.7 м.д.) соответствовало ¿■-конфигурации 22(23)-двойной связи в боковой цепи. Из экспериментов по разностному спин-декаплингу и ЯЭО следовало, что сигналы протонов при 8 3.34 (Н-26) и 4.03 (Н'-26) м.д. в 'Н ЯМР спектрах 12 принадлежат атомам, находящимся в месте присоединения моносахаридного остатка к боковой цепи. Полученные данные полностью отвечали формуле 12.

Кроссастерозид Р4 (13). Кислотный гидролиз 13 дал смесь ¿-арабинозы и 2,4-ди-О-метил-О-ксилозы в соотношении 1:1. Место присоединения углеводной цепи при С-24 и (1—»5) гликозидная связь между моносахаридными остатками были подтверждены регистрацией сигналов ЯЭО. Так, при облучении Н-1' (8 5.57 м.д.) наблюдали усиление сигналов Н-24 (8 3.65 м.д.) и Н-2' (8 4.85 м.д.). Облучение Н-5' (8 4.24 м.д.) дало усиление сигналов Н'-5' (8 4.46 м.д.) и Н-1" (8 4.70 м.д.). В свою очередь, при облучении Н-1" (8 4.70 м.д.) было отмечено усиление сигналов Н-5' (8 4.24 м.д.), Н-2" (8 3.38 м.д.), Н-3" (8 3.96 м.д.) и Н-5" (8 3.30 м.д.). Сигнал С-4' в спектре 13 был сдвинут в сильное поле на 2.3 м.д., а сигнал С-5' - в слабое поле на 6.9 м.д. по сравнению с сигналам незамещенного арабинофуранозного остатка в 13С ЯМР спектре 6а. Эти данные хорошо согласовывались с Р- и а-эффектами гликозилирования для атомов С-5 и С-6 глюкопиранозного остатка в Р-генцибиозе, что дополнительно подтверждало присоединение концевого моносахаридного остатка к С-5' арабинофуранозы в 13. Обычно в углеводной цепи гликозидов полигидроксисгероидов встречается (1—>2) гликозидная связь, (1->5) гликозидная связь была обнаружена в этой группе соединений из морских звезд впервые.

2.5. Стероидный гексаол и гликозиды полигидроксистероидов из Непг1с1а <1ег]^Ы

Стероидный гексаол (17), гликозиды полигидроксистероидов, названные нами хенрициозидами Н] (= левискулозид I), Н2 и Нз (18-20), и левискулозид в (21) были получены из этанольного экстракта морской звезды Неппсш с1ег]^1т (семейство ЕсЫпаз1епс1ае, отряд 5рши1оз1(1а), собранной в Охотском море у о. Онекотан (Курильские острова). Гликозиды 18 и 21 были выделены ранее из морской звезды Неппсга 1аеУ1шсо1а.

Гексаол 17. Строение стероидного ядра в 17 было установлено сравнением ХС протонов и атомов углерода в ЯМР спектрах со спектрами кроссастерозида Р2 (11), кульцитозида С] (7) и было подтверждено экспериментами по разностному спин-декаплингу. Сигналы атомов углерода боковой цепи в 17 совпадали с аналогичными сигналами в спектре (245)-5а-холесган-Зр,4р,6а,8,15Р,24-гексаола из морской звезды СоторЫа '\vatsnm.

Для определения конфигурации асимметрического центра С-24 стероид 17 обработали хлорангидридами (/?)-(+)- и (5)-(-)-а-метокси-а-(трифторметил)-фенилуксусной кислоты (МТРА, реагент Мошера). В результате были получены /?-(+)-МТРА и 5-(-)-МТРА эфиры 17а и 176, соответственно. В 'Н ЯМР спектре 17а (СИзСЮ) сигналы Нз-26 (8 0.83 м.д., д, У= 7.1 Гц) и Нз-27 (8 0.85 м.д., д, У = 7.1 Гц) находились в более сильном поле по сравнению с сигналами Нз-26 (8 0.89 м.д., д, 7= 7.0 Гц) и Н3-27 (8 0.92 м.д., д,J = 7.0 Гц) в спектре 176. Исходя из этих данных, абсолютная конфигурация С-24 в 17 была определена как До получения нами гексаола 17 в морских звездах были найдены только два свободных 24-гидроксистероидных полиола.

Хенрициозид Н] (18). В отличие от 17 соединение 18 содержало моносахаридный остаток, идентифицированный согласно результатам кислотного гидролиза и данным ЯМР спектров как 2,4-ди-0-метил-р-£>-ксилопираноза. При облучении Н-1' в условиях ЯЭО в 'Н ЯМР спектре 18 наблюдали усиление сигнала Н-3. Селективная развязка от протонов в 13С ЯМР спектре 18 и эксперимент по ЯЭО показали, что моносахаридный остаток присоединен к С-3 агликона. Анализ 'Н ЯМР спектров Л-(+)-МТРА и ¿'-(-)-МТРА эфиров гликозида 18 позволил определить абсолютную конфигурацию С-24 как Полученные данные соответствовали формуле 18, такую же структуру имеет ранее известный левискулозид I из Неппсш \aeviuscola.

Хенрициозиды Н2 и Нз (19, 20). Согласно спектральным данным и результатам кислотного гидролиза 19 и 20 содержали остаток 2,3-ди-0-метил-О-ксилопиранозы. Спектры ЯМР хенрициозида Н2 хорошо согласовывались со спектральными данными аптиконной части десульфатированного эхинастерозида А из ЕсЫпазгег ¡еровИиз. В отличие от 19 хенрициозид Нз не имел двойной связи в боковой цепи. Отнесение сигналов атомов углерода в боковой цепи 19 было сделано на основании ./-модулированного 13С ЯМР спектра.

Сигналы атомов С-27 при 8 14.5 м.д. и С-28 при 8 17.7 м.д. в 13С ЯМР спектре 19 были характерны для трео-конфигурации асимметрических центров С-24 и С-25. В 'Н ЯМР спектре Я-(+)-МТРА эфира 19а (СОзСГО) сигналы Н-26 (8 4.12 м.д., дд) и Н'-26 (8 4.25 м.д., дд) были более близки (Д 0.13 м.д.), чем те же сигналы Н-26 (8 4.03 м.д., дд) и Н'-26 (8 4.38 м.д., дд) в спектре 5-(-)-МТРА эфира 196 (Д 0.35 м.д.), что свидетельствовало о (255)-конфигурации и, соответственно, (24/^-конфигурации в 19.

Аналогичным способом определили стереохимию боковой цепи в гликозиде 20. По ХС сигналов С-27 (8 17.5 м.д.) и С-28 (8 14.0 м.д.) в 13С ЯМР спектре 20 установили эритро-конфигурацию боковой цепи. В 'Н ЯМР спектре 5-(-)-МТРА эфира 206 (СБзСЮ) сигналы Н-26 (8 4.16 м.д., дд) и Н'-26 (8 4.23 м.д., дд) были более близки (Д 0.07 м.д.), чем

сигналы Н-26 (8 4.13 м.д., ДД) и Н'-26 (8 4.37 м.д., дд) в спектре Д-(+)-МТРА эфира 20а (Д 0.23 м.д.). На этом основании абсолютная конфигурация С-25 в соединении 20 была определена как Л, и, соответственно, конфигурация С-24 была установлена как К.

эритро

4.12ДД Н Н 425ДД

0(+)МТРА

19а

403 дд I Н Н 4 38 дд

196 '

0(-)МТРА

Рис. 1. Возможные варианты боковых цепей гликозида 19 и полученные из него МТРА-производные 19а и 196.

ОН

трео

0(+)МТРА

20а

-ОН

20 эритро

ОН

4 16 ДД Н Н 4 23 дд

К -

р ^ 0(-)МТРА

206

Рис. 2. Возможные варианты боковых цепей гликозида 20 и полученные из него МТРА-производные 20а и 206.

Впервые в гликозидах полигидроксистероидов была найдена 2,3-ди-0-метил-0-ксилоза.

2.6. Гликозиды полигидроксистероидов из $о1Шег ¿аи>эот

Из морской звезды 8о1азгег ¡Ьтзот (семейство 8о1айеп<1ае, отряд Уе1ай<1а), собранной в Охотском море у о. Онекотан (Курильские острова), получили два новых гликозида полигидроксистероидов - соластерозиды 81 (22) и Бг (23).

Соластерозид 81 (22). По данным кислотного гидролиза гликозид 22 содержал остаток П-ксилозы. В 'Н ЯМР спектре 22 мультиплеты протонов агликона частично перекрывались, поэтому для лучшего отнесения сигналов, это соединение ацетилировали и получили гептаацетат 22а. Широкий мультиплет Н-3 (3.60 м.д., АИ/= 20 Гц) в 'Н ЯМР спеюре 22а и узкий сигнал Н-6 (3.75 м.д., АИ/ = 7.5 Гц) в спектре гликозида 22 свидетельствовали о присутствии в агликоне ЗР,бр-диольной группировки. Положение гидроксильной группы при атоме С-15 было определено как 15а сравнением величины ХС С-14 (8 63.6 м.д.) в 13С ЯМР спектре и КССВ Н-15 (8 3.88 м.д., тд, 3.5, 9.5 Гц) в 'н ЯМР спектре 22 с соответствующими значениями для гранулатозида В из морской звезды

Скоггатег %гапи1аы$. Эксперименты по ЯЭО и разностному спин-декаплингу для гептаацетата 22а подтвердили эти выводы, и доказали, что моносахаридный остаток присоединен к С-24 боковой цепи, а в положении С-26 находится еще одна гидроксильная группа В гликозидах полигидроксистероидов морских звезд углеводный фрагмент чаще всего присоединен к атому С-24 боковой цепи, но С-26 при этом не является окисленным. Для свободных полигидроксистероидов наиболее характерно гидроксилирование по атому С-26, но не по С-24. Одновременное присутствие гликозидного остатка при С-24 и гидроксила при С-26 в соласгерозиде 8] обнаружено впервые для природных стероидных гликозидов.

Соластерозид вг (23). В 13С ЯМР спектре 23 присутствовали сигналы двух моносахаридных остатков. При кислотном гидролизе 23 идентифицировали единственный моносахарид - С-галакгозу. Значения ХС атомов С-1" - С-6" и С-1' - С-4' в спектре соластерозида Эг соответствовали сигналам в спектре Р-метил-£>-галактофуранозида. Однако сигнал С-6' был сдвинут по сравнению с С-6" в слабое поле на 6.4 м.д., а сигнал С-5' по сравнению с С-5" - в сильное поле на 2.0 м.д. Эти данные хорошо соответствовали а- и Р-эффектам гликозилирования, приведенным для атомов С-5 и С-6 глкжопиранозного остатка в р-генцибиозе, и свидетельствовали о наличии (1->6) гликозидной связи между моносахаридными остатками в 23. Сигналы атомов углерода боковой цепи гликозида 23 были идентичны подобным сигналам в 13С ЯМР спектрах кроссасгерозидов Р1 (10) и Рг (11) из Сго$йа$1ег рарро$и$. Из чего следовало, что гликозид 23 имеет стигмастановый скелет с /?-конфигурацисй при С-24, а углеводная цепь присоединена к С-29. Обычно биозиды полигидроксистероидов морских звезд имеют (1->2) гликозидную связь в углеводной цепи, (1-»6) гликозидная связь для соединений этой группы была найдена нами впервые.

2.7. Полигидроксистероиды из Оепог/ксиз сгкраШз

Морская звезда Ыепоскясж спзраШ (семейство С1епо(И8Ыс1ае, отряд РахПк^сЬ) была собрана в заливе Посьет Японского моря. Из метанольного экстракта этой звезды были выделены ранее известный гексаол 24, новые полигидроксистероиды 25-27 и десульфатироващшй стероид 28.

Гексаол 24 и гептаол 25. По даным ЯМР спектров соединение 24 идентично гексаоду из морской звезды Luidla maculata. Различия, наблюдаемые в спектрах 24 и 25 для атомов С-23 - С-27 и Н-26, Н'-26 и Нз-27, указьшали на наличие дополнительной гидроксильной группы при С-25 в 25. В слабом поле 13С ЯМР спектра стероида 25 по сравнению со спектром 24 присутствовал дополнительный сигнал при 8 70.5 м.д. На основании экспериментов по ЯЭО и данных 13С ЯМР спектра, полученного в условиях J-модуляции, установили, что в 25 имеется гидроксильная группа при С-25. Так как в ЯМР спектрах 25 присутствовали двойные сигналы Н-26, Н'-26, Нз-27, С-24, С-26, С-27, пришли к выводу, что стероид 25 является суммой двух эпимеров по С-25.

Сульфат гептаола 26. Сравнение данных 13С ЯМР спектров стероида 26 и десульфатированного 'астеросапонина' Р2 (6а) из Patiria pectimfera позволило предположить в 26 наличие сульфатной группы при С-29 и присутствие дополнительной гидроксильной группы при С-28. Сольволиз 26 дал десульфатированное производное 26а. В его 'Н ЯМР спектре сигналы Н-29 и Н'-29 были смещены в сильное поле по сравнению с их положением в спектре стероида 26, что подтверждало положение сульфооксигруппы. (+)-FAB масс-спектр 26 содержал пики с m/z 653 [MK+Na]+ (или [Mns+K]*) и 631 [Мк+Н]+, что указывало на наличие в соединении обоих катионов (Na+ и К+). Гептаол 26 имеет необычную для полигидроксистероидов боковую цепь со свободной гидроксильной группой при С-28 и сульфатированной гидроксильной группой при С-29.

Гексаол 27. По данным (+)-FAB масс-спектра, содержащего пики при m/z 599 [Мк+Н]+ и 583 [Мыа+Н]+, полиол 27 являлся смесью натриевой и калиевой солей. Так как соединение 27 было выделено в небольшом количестве, основная информация о его строении была получена в результате изучения ЯМР спектров его десульфатированного производного 27а, выделенного из продуктов сольволиза суммарной фракции полигидроксистероидов. Сигналы атомов углерода боковой цепи в С ЯМР спектре 27а

совпадали с аналогичными сигналами в спектре стероидного пентаола из морской звезды Archaster typicus. Величина КССВ (/22,23 =15 Гц) соответствовала транс-конфигурации 22(23)-двойной связи. Сигналы Н-26 и Н'-26 в 'Н ЯМР спектре 27 бьии сдвинуты в слабое поле по сравнению с соответствующими сигналами соединения 27а. Из этого следовало, что сульфатная группа в 27 связана с гидроксильной группой при С-26.

24-Пропилгептаол 28. В результате сольволиза фракции полигидроксистероидов и хроматографического разделения продуктов десульфатирования был выделен стероид 28. Присутствие в 'Н и 1 С ЯМР спектрах стероида 28 сигнала дополнительной метальной группы и наличие одного сигнала протона при С-29 вместо двух, по сравнению со спектрами соединения 26, свидетельствовало о наличии в боковой цепи пропильного фрагмента с гидроксильными группами при С-28 и С-29. Эти выводы были подтверждены Н ЯМР экспериментами с использованием двойного резонанса: при последовательном облучении Н-28, Н-29 и Нз-30 в разностных спектрах наблюдались сигналы соседних протонов.

Ранее 24-пропилстероиды находили только в стериновых суммах из микроводорослей, губок и морских звезд. Стероид 28 является первым 24-пропилполигидроксистероидом морского происхождения.

2.8. Лептастерозид L из Leptasterias polaris acérvala

Из морской звезды Leptasterias polaris acervata (семейство Asteriidae, отряд Forcipulatida), собранной у о. Онекотан (Курильские острова, Тихоокеанское побережье) с помощью колоночной хроматографии на различных сорбентах были выделены подфракции полигидроксилированных стероидных соединений. Однако ВЭЖХ этих подфракций на колонке Zorbax ODS не дала чистых веществ. Полученные подфракции были подвергнуты сольволитическому десульфатированию. Разделение полученных продуктов на колонке с флорисилом привело к выделению нового стероидного гликозида - лептастерозида L (29).

ОН

ОН

^ / ОН

По результатам кислотного гидролиза и данным 13С ЯМР спектра лептастерозид Ь (29) содержал остаток р-О-глюкопиранозы. Расположение гидроксильных групп в агликонной части гликозида 29, их относительная стереохимия и место гликозилирования при С-29 были определены разностным спин-декаплингом и сравнением ЯМР спектров 29, сульфатированного гептаола 26 из аепоЖясиз спяраШя и соластерозида Эг (23) из Зо^ег сктьот. При облучении Н-29 в условиях ЯЭО наблюдали усиление сигналов Н'-29 и Н-Г. Это указывало на присоединение моносахаридного остатка к С-29 боковой цепи. Ранее боковая цепь 29-гидроксисгигмастанового типа, гликозилированная остатком

глюкопиранозы, была найдена только в писастерозиде Р из Рианег giganteus. Однако этот гликозид отличался от лептастерозида Ь строением полициклической части агликона.

2.9. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Сетата$1ег patagonicus

Морская звезда Сегата$<ег patagomcus (семейство йотаМет^ае, отряд Уа1уа1Ма) была собрана в Охотском море у о. Шиашкотан (Курильские острова). Из этанольного экстракта этой морской звезды с помощью ВЭЖХ на прямой и обращенной фазах выделили 5 полигидроксистероидов (15,30-33), два из которых (30,31) оказались новыми. Кроме того были выделены 5 новых стероидных гликозидов - церамастерозидов Си Сг, Сз, С4 и С5 (34-38).

Полигидроксистероиды 15, 30-33. Расположение и конфигурация гидроксильных заместителей в 30 были установлены разностным спин-декаплингом. Сигналы атомов углерода и протонов боковой цепи в ЯМР спектрах стероида 30 совпадали с аналогичными сигналами в ЯМР спектрах полиолов 2-4 из Patina pectinifera. Строение боковой цепи в 30 было подтверждено экспериментами по двойному резонансу на атомах Нг-26, Нз-27 и Н-25.

Строение боковой цепи в 31 было установлено экспериментами с использованием двойного резонанса: при последовательном облучении Н-20, Н-22, Н-23 и Нз-26 в разностных спектрах наблюдались сигналы соседних протонов. Сигналы Н-22 при 8 5.37 м.д. (дд, J = 6.5, 15.0 Гц), Н-23 при 8 5.50 м.д. (дд, J= 7.0, 15.0 Гц) и Н-24 при 8 3.72 м.д. (т, J = 5.0 Гц) в ]Н ЯМР спектре стероида 31 соответствовали литературным данным для (245)-Д22£-24-гидроксистероидов. На этом основании конфигурация асимметрического центра С-24 в 31 была определена как S.

Стероиды 15, 32 и 33 были идентифицированы сравнением их 'Н ЯМР спектров со спектрами известных соединений, выделенных ранее из морских звезд Crossaster papposus (15), Dermasterias ¡mbricata (32), Halityle regularis и Haceha attenuata (33).

Церамастсрозиды Ci (34), Ci (35) и Сз (36). Моносахаридный анализ, данные ЯМР и сравнение со спектрами кроссастерозидов P¡ (10) и Рг (11) из Crossaster papposus показали полную идентичность углеводных цепей 34 и 36 с углеводными цепями 10 и И. Структуры углеводных цепей и места присоединения к агликонам в гликозидах 34 и 36

были подтверждены экспериментами ЯЭО. При облучении Н-2' в галактофуранозном остатке зарегистрировали усиление сигнала аномерного протона Н-1" 2-0-метилксилопиранозного звена. В свою очередь, при облучении аномерного протона Н-1' остатка галактозы наблюдалось усиление сигналов Н-28 и Н'-28.

Положения и конфигурации гидроксильных групп в стероидном ядре и боковой цепи гликозидов 34-36 установили с помощью разностного спин-декаплинга и подтвердили сравнением со спектральными данными кульцитозидов С2 (8) и Сз (9) из Culcita novaegumeae. В гликозиде 35, в отличие от 36, присутствовал остаток 2,4-ди-ОМе-p-D-Xylp вместо остатка 2-f3-D-OMe-Xylp.

Церамастерозиды С4 (37) и С5 (38). В продуктах кислотного гидролиза 37 были идентифицированы £>-галактоза и 2-0-метил-0-ксилоза. Структуру 37 определили методом разностного спин-декаплинга и подтвердили сравнением спектральных данных с параметрами выделенных ранее соединений. Сигналы атомов углерода боковой цепи гликозида 37 совпадали с соответствующими сигналами в С ЯМР спектре кроссастерозида Рз (12) из Оо55ж(ег рорротъ. Сигналы атомов углерода, протонов и КССВ протонов в ЯМР спектрах полициклической части 37 совпадали с таковыми для ЯМР спектров кульцитозида С1 (7). Спектральные данные углеводной части гликозида 37

полностью совпадали с аналогичными данными для углеводных частей церамасгерозидов Ci (34) и С3 (36).

В продуктах кислотного гидролиза 38 идентифицировали Л-ксилозу и 2-0-метил-£>-ксилозу. Сравнение 13С ЯМР спектров 38 и халитулозида А из Halityle régulons показало совпадение сигналов углеводных цепей, что говорило об их идентичности. Разностный спин-декаплинг и анализ 13С ЯМР спектров агликонных частей гликозида 38 и дистоластериозида D2 из Distolasterias троп показали, что в агликоне присутствует 22(23)-от/)а;/с-двойная связь, а гидроксильные группы находятся в Зр,6а,8,150,24-положениях. Место привязки углеводной цепи к С-24 в 38 было установлено из регистрации сигнала ЯЭО Н-24 при облучении аномерного протона Н-Г в остатке ксилозы.

Соединения 33-37 имели редкое для гликозидов морских звезд строение углеводной цепи. Ранее остаток p-D-галактофуранозы встречался только в четырех гликозидах, причем три из них (10, 11, 22) были выделены из дальневосточных видов морских звезд Crossaster papposus и Solaster dawsorn, а индикозид А - из тропического вида Astropecten indiens.

Морская звезда ¿шгйая/ег (СШгШег) (ктйот (семейство Вепйюресйиёае, отряд МйотуоМа) была собрана у о. Атласова в Охотском море. Из метанольного экстракта этих животных был выделен новый стероидный гексаол 39.

Строение 39 было установлено методами разностного спин-декаплинга и ЯЭО (рис. 3) и подтверждено сравнением ХС и КССВ протонов в 'Н ЯМР спектрах гексаола 39 и полигидроксистероидов 24 и 25 с аналогичным стероидным ядром из С1епо(11$си$ сгарсШя.

2.10. Стероидный гексаол из Luidlaster dawsoni

HÔ

ОН

ОН

ÇH3u !

НО

Рис. 3. Взаимодействия протонов, выявленные разностным спин-декаплингом (стрелки) и ядерным эффектом Оверхаузера (штриховые стрелки).

Сигналы протонов боковой пепи Н-26 при 8 3.49 м.д., Н'-26 при 5 3.38 м.д, Н3-27 при 8 0.82 м.д. и Нз-28 при 8 0.82 м.д. в *Н ЯМР спектре 39 совпадали с соответствующими сигналами описанного в литературе (245,25Л)-24-метил-26-гидроксистероида. На этом основании в полиоле 39 установлены конфигурации асимметрических центров при С-24 как 5 и при С-25 как Я.

Из глубоководной морской звезды МгЛш&ег тиггау/' (семейство Сошая1епс1ае, отряд Уа1уаШа), собранной в Филиппинском море, выделили соединения 40 и 41, а также сумму гликозидов 42+43. Кроме того, был получен известный полигидроксистероид 14, ранее выделенный нами из морской звезды Сгоззстег раррозт. Для разделения смеси 42+43 было проведено ее ацетилирование и разделение полученных ацетатов с помощью ВЭЖХ на обращеннофазовой колонке. Последующее дезацетилирование индивидуальных ацетатов дало индивидуальные соединения 42 и 43. Новые гликозиды 40-43 были названы медиастерозидами М], М2, Мз и М4, соответственно. Эксперименты по разностному спин-декаплингу и сравнение ЯМР спектров гликозидов 40-43 со спектральными данными церамастерозида С5 (38) из Сегата.ч>ег patagonicus позволили установить, что медиастерозиды М1 - М4 имеют одинаковый агликон, а гидроксильные группы находятся в положениях Зр,6а,80,150 и 24.

Медиастерозиды М1 (40), М2 (41) и Мз (42). Гликозиду 40 была приписана брутто-формула Сз8НббО[з в соответствии с данными элементного анализа, Е51М8 и ЯМР спектроскопии. Данные кислотного гидролиза, анализ ЯМР спектров и сравнение со спектрами кроссастерозидов Р1 (10) и Р4 (13) из СУомсШег рарроэш, а также эксперименты по разностному спип-декаплингу свидетельствовали о том, что медиастерозид М| имеет в качестве углеводной компоненты 2-ОМе-р-/>Ху1р-(1->5)-а-£-Агаг дисахаридный остаток. Присутствие (1-»5) гликозидной связи между моносахаридными остатками в 40 и присоединение углеводного фрагмента к С-24 стероидного агликона подтверждали дополнительные данные. Так, в результате присоединения 2-О-метилксилозы к арабинозе сигнал С-5' арабинозного остатка в 13С ЯМР спектре медиастерозида М[ бьш сдвинут от 8 62.5 к 8 69.8 м.д. в сравнении с

2.11. Стероидные гликозиды из Ме<ИШег тиггау1

НО

ОН

40

незамещенной арабинозой. В эксперименте по ЯЭО облучение Н-Г (8 5.55 м.д.) усиливало сигналы Н-24 (8 3.63 м.д.) и Н-2' (8 4.83 м.д.). Аналогичным способом было доказано строение углеводных цепей гликозидов 41 и 42. Ранее (1-»5) гликозидная связь в гликозидах из морских звезд была найдена только в кроссастерозиде Р4 (13) из Crossaster papposus.

Медиастерозид М4 (43). В ESI масс-спектре 43 наблюдался псевдомолекулярный пик с m/z 743 [М-Н]'. Анализ данных 'Н Я MP спектра 43 и сравнение их со спектрами кульцитозида Ci (7) из Culata novaeguineae и хенрициозида Нг (19) из Неппсга derjugmi указывали на то, что 43 имеет 2,3-ди-0Ме-р-0-Ху1р-(1->2)-а-1-Агаг дисахаридное звено. Облучение Н-Г (8 5.67 м.д.) арабинозы в 43 привело к регистрации ЯЭО для сигнала Н-24 (8 3.63 м.д.). Значения ХС атомов углерода углеводной цепи в 13С ЯМР спектре 43 подтвердили присутствие (1->2) гликозидной связи между моносахаридными звеньями. Так, сигнал С-2' (8 92.4 м.д.) был сдвинут в слабое поле, а сигналы С-Г (8 107.2 м.д.) и С-3' (8 77.6 м.д.) - в сильное поле по сравнению с соответствующими сигналами в спектрах 40-42, благодаря 2-О-гликозилированию арабинозного остатка.

2.12. Полярные стероидные соединения из Lethasterias nanimensis chelifera (курильская популяция, о. Шиашкотаи)

Из этанольного экстракта морской звезды Lethasterias nammensis chelifera (отряд Forcipulatida, семейство Asteriidae), собранной у о. Шиашкотан (Курильские острова, Тихоокеанское побережье), выделили известный нативный астерогенин - 3-0-сульфоторнасгерин А (44) и новый стероидный гликозид - челиферозид Li (45).

*Na"03S0

ОН

46

47

+Na"03S0'

сн, ;

*Na"03S0-^-^—"P Ó OH

T YTY

48

49

50

51

OH

Среди продуктов кислотного гидролиза суммарной фракции астеросапонинов из этой же морской звезды были идентифицированы шесть известных агликонов астеросапонинов: астерон (46), 17а-изомер астерона - изоастерон (47), (20Е)-Зр,6а-дигидрокси-5а-холеста-9(11),20(22)-диен-23-он - изомартастерон (48), (17Е)- и (172)-

3р,6а-дигидрокси-5а-холеста-9(11),17(20)-диен-23-оны (49, 50) а также редко встречающийся стероидный триол 51.

З-О-сульфоторнастерин А (44). Спектр ЯМР |3С 44 был практически идентичен спектру З-О-сульфоторнастерина А, полученного ранее энзиматическим гидролизом версикозида А из морской звезды Asterias amurensis. Десульфатирование 44 привело к торнастерину А, который идентифицировали по 'Н ЯМР спектру. Значения ХС атомов углерода стероидной боковой цепи в спектре ЯМР |3С 44 были близки соответствующим значениям в спектре синтетического (205)-торнастерина А, что позволило определить S-конфигурацию асимметрического центра С-20 в 44.

Челиферозид Li (45). По данным ЯМР спектров предположили, что агликоном челиферозида Li является астерон (46). Разрешение некоторых сигналов в ЯМР спектрах 45 было неудовлетворительным, поэтому были получены его производные. Ацетилирование 45 дало диацетат 45а. Сравнение 'Н и С ЯМР спектров 45а со спектрами астерона и пектинозида D из Patiria pectimfera, содержащего в качестве агликона З-О-сульфоастерон, показало, что моносахаридный остаток в 45а связан с С-6, а сульфооксигруппа присоединена к С-3 агликона. Сольволитическое расщепление 45 привело к десульфатированному производному 456. *Н ЯМР спектр 456 позволил идентифицировать в нем остаток р-Д-хиновопиранозы. При сольволизе диацетата 45а получили десульфатированный диацетат 45в. Из 'Н ЯМР спектра соединения 45в следовало, что сулъфооксигруппы находятся при С-3 агликона и С-4' моносахаридного остатка. Из всех полученных данных следовало, что строение челиферозида Li соответствовало формуле 45. Близкие по строению форбезиды Е, Е1-Е3 были обнаружены в морской звезде Asterias forbesi. Челиферозид Li и форбезиды Е, Е1-Е3 стали первыми представителями так называемых "укороченных" астеросапонинов - новой структурной разновидности астеросапонинов.

Стероидный триол 51. В результате рентгеноструктурного исследования 51 установили его пространственную структуру (рис. 4). В 51 определили конфигурации асимметрических центров С-20 и С-23 как S, и следующие конформации колец: А, В -кресло, С - 13р,14а-полукресло, D - 13р-конверт.

Рис. 4. Пространственная структура стероидного триола 51.

2.13. Алкалоидостероиды и другие полярные стероидные соединения из паттет15 сИеН/ега (курильская популяция, о. Онекотан)

Исследование морской звезды 1е/йа5/епаг паптети сМфга, собранной у о. Онекотан (Курильские острова, Охотское море) привело к выделению 12 индивидуальных стероидных соединений. Стероиды З-О-сульфоастерон, З-О-сульфоизоастерон, З-О-сульфоторнастерин А были получены в виде 1-метил-6,7-дигидрокси-1,2,3,4-

тстрагидроизохинолиновых солей (соединения 52, 55, 58), в виде тираминовых солей (соединения 54, 57, 59) и в виде натриевых солей (соединения 44, 53, 56). Соединения 52, 54-58 являются новыми. Кроме найденного ранее челиферозида Li (45) были также выделены известные ранее форбезид Ез (60) и пикноподиозид С (61). Из нестероидных соединений впервые в морских звездах был найден алкалоид 1-метил-1,2,3,4-тетрагидро-Р-карболин-З-карбоновая кислота (МТСА, 62). Выделенные соединения в большинстве близки по химическому строению астеросапонинам, но лишены углеводной цепи или имеют всего один моносахаридный остаток. Гликозиды 45 и 60 относятся к группе «укороченных» астеросапонинов, гликозид 61 - к группе гликозидов полигидроксистероидов.

Ионные гибриды 52, 55, 58 состоят из стероидного аниона и алкалоидного катиона -салсолинола. Они являются представителями новой группы ионных соединений, названных нами алкалоидоегероидами.

Алкалоидостероиды 52, 55, 58 и родственные соединения 44,53,54,56,57,59. По данным MALDI/TOF масс-спектров, Н и 13С ЯМР спектров стероид 53 оказался натриевой солью З-О-сульфоастеропа, впервые полученного японскими исследователями в качестве продукта мягкого кислотного гидролиза астеросапонинов. В *Н и 13С ЯМР спектрах сульфатированных соединений 52 и 54, кроме сигналов З-О-сульфоастерона, имелись также дополнительные сигналы, которые были отнесены к органическим противоионам.

'Н, )3С и DEPT ЯМР спектры соединения 52, а также применение HSQC, 'Н-'Н COSY и НМВС экспериментов позволили, в основном, установить структуру органического катиона. Спектры HSQC и 'Н-'Н COSY содержали кросс-пики, устанавливающие взаимосвязь следующих сигналов: С-Г при 8 51.1 - с квартетом при 8 4.80 м.д., С-3' при 8 39.7 - с двумя связанными друг с другом мультиплетами при 8 3.60 и 3.77 м.д, С-4' при 8 25.2 - со связанными друг с другом дублетом триплетов при 8 2.92 и мультиплетом при 3.08 м.д., С-5' при 8 116.1 - с синглетом при 8 7.03 м.д., С-8' при 8 113.7 - с синглетом при 8 7.13 м.д., С-1Г при 8 19.7 - с дублетом при 8 1.81 м.д. Спектры НМВС содержали кросс-пики: Н-17С-3', С-8', С-9', С-10'; Н2-37С-1', С-4', С-10'; Н2-4'/С-3', С-5', С-9', С-10'; Н-57С-4', С-7', С-9'; Н-87С-1', С-6', С-10'; Н3-117С-1', С-9'. При облучении Н-5' был зарегистрирован сигнал ЯЭО Н2-4'. Облучение Н-8' дало сигналы ЯЭО Н-1' и Н3-11'. На основе этих данных органический катион в 52 бьи предварительно идентифицирован как 1-метил-6,7-дигидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин

(салсолинол). Было показано, что 52 является ионным гибридом стероида З-О-сульфоастерона и алкалоида салсолинола.

Дополнительные сигналы в 'Н и 13С ЯМР спектрах соединения 54 соответствовали тирамину. Так, в 'Н ЯМР спектрах присутствовали два дублета ароматических протонов при 8 7.08 (2Н, J = 8.5 Гц) и 6.77 м.д. (2Н, J = 8.5 Гц) и два триплета метиленовых протонов при 8 3.10 (2Н, J = 7.5 Гц) и 2.84 м.д. (2Н, J = 7.5 Гц). В 13С ЯМР спектрах (CD3OD) 54 имелись сигналы: С-1' - 157.7, С-2', С-6' - 130 8, С-4' - 128.5, С-3', С-5' - 116.7, -CH2-N< - 42.3 и Аг-СН2< - 33.8 м.д. В (+)-MALDI/TOF масс-спектре 54 присутствовал пик тираминового катиона с m/z 138, а в масс-спектрах электронного удара наблюдался пик тирамина с m/z 137 [катион-Н]+. Так было показано, что 54 является тираминовой солью З-О-сульфоастерона.

Учитывая различия в *Н и 13С ЯМР спектрах стероидов 53 и 56, а также данные MALDI/TOF масс-спектров, установили, что 56 отличается от 53 только Па-конфигурацией и является натриевой солью З-О-сульфомзоастерона. В ЯМР спектрах родственных соединений 55 и 57, кроме сигналов З-О-сульфоюоастерона, присутствовали дополнительные сигналы, свидетельствующие о наличии в молекулах органических

противоионов. ЯМР анализ показал, что эти вещества (55 и 57), как и соответствующие производные З-Осульфоасгерона (52 и 54), имеют в качестве органических катионов салсолинол (55) и тирамин (57).

•ХОзЭО'

58. X = А

59. X = В

Стероид 44 идентифицировали как натриевую соль З-О-сульфоторнастерина А. В ЯМР спектрах соединений 58 и 59, кроме сигналов З-О-сульфоторнастерина А, имелись также дополнительные сигналы, позволившие сделать вывод, что 58 является солью З-О-сульфоторнастерина А с салсолинолом, а 59 - с тирамином.

Строение алкалоидостероидов 52, 55, 58 подтвердило тщательное масс-спектрометрическое изучение. Так, в (+)-Ь51МЯ 58 наблюдались псевдовомолекулярные пики с т/г 714 [М+№]+ и 871 [М+катион]+, где М - молекулярная масса соли. Молекулярная формула Сзу^СЬЫБ для 58 была установлена с помощью (+)-Н1ШАЦ)1/ТОР масс-спектра, имеющего пик с т/г 557.2331. Он соответствует анионной части соли [М-катион+2№а]+ с молекулярной формулой Сг?Н4з078^2 (рассчит. 557.2528). Пик катиона [салсолинол+Н]+ при т/г 180.0988, соответствует молекулярной формуле СюНиОгИ (рассчит. 180.1025). В (-)-МАЬ01/Т0Р масс-спектре 58 наблюдался пик [М-катион]' при т/г 511, так же как и в спектрах родственных соединений 44 и 59. Аналогичным образом были определены молекулярные формулы алкалоидостероидов 52 и 55.

Из всех стероидов, найденных в ходе данного исследования, наиболее необычны ионные гибриды, включающие в свой состав салсолинол. Нейротоксический алкалоид салсолинол впервые был найден в моче больных, страдающих болезнью Паркинсона, позже - в некоторых видах высших растений, пищевых продуктах и напитках. Салсолинол также известен как потенциальный маркер в этиологии алкоголизма. В морских звездах салсолинол ранее обнаружен не был.

Сравнение оптических вращений соединений 52, 55, 58 и соответствующих натриевых солей 53, 56, 44, а также R- и 5-салсолинолов позволило предположить, что в ионные гибриды 52, 55 и 58 включен, в основном, Я-изомер салсолинола. Обычно этот энантиомер преобладает в животных, в отличие от растений. Из родственных алкалоидостероидам 52, 55 и 58 соединений в настоящее время известны фенетиламмониевая и 2-аминоимидазольная соли сульфатированных стероидов из губок и тираминовые соли сульфатированных стероидов из морских звезд.

(1 S,3S)-1 -Метил-1,2,3,4-тетрягидро-р-карболин-3-карбоновая кислота (МТСА) (62). Анализ 'Н, 13С и DEPT ЯМР спектров, а также данные HSQC, 'Н-'Н COSY и НМВС экспериментов позволили определить структуру 62. Известно, что биогенетическим предшественником МТСА является ¿-триптофан. Из этого факта, а также значения оптического вращения соединения 62, следовало, что асимметрический центр С-3 имеет S-конфигурацию. Относительная стереохимия асимметрического центра С-1 была установлена с помощью эксперимента ЯЭО: при облучении Н-3 наблюдалось усиление сигналов Н-1 и Н-4. На этом основании абсолютная конфигурация С-1 в 62 была определена как S. Соединение 62 (МТСА) относится к p-карболиновым алкалоидам и было ранее найдено в растениях, рыбах, млекопитающих. В морских звездах МТСА обнаружена впервые.

2.14. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japónica (приморская популяция, залив Посьет)

Из этанольного экстракта морской звезды Aphelasterias japónica (семейство Asteriidae, отряд Forcipulatida) выделили два новых соединения - дисульфатированный хиновозид, названный афеластерозидом С (63), и стероид, названный афелакетотриолом (64), а также ранее известные челиферозид Li (45), натриевую соль З-О-сульфоторнастерина А (44), натриевую соль 3-0-сульфоастерона (53) и форбезид Ез (60).

ОН

Афсластсрозид С (63) и афелакетотриол (64). В (-)-FABMS спектре 63 наблюдались псевдомолекулярный пик с m/z 759 [M-Na]', пики с m/z 121 [M-2Na+H]" и 657 [M-SOsNa-Na+H]", указывающие на наличие двух сульфатных групп в этом соединении, пик с m/z 511 [759-Cf,Hio07SNa+H]", соответствующий потере сульфатированного дезоксигексозпого остатка (249 единиц массы). Основные выводы относительно структуры 63 были сделаны на основе сравнения 'Н и 13С ЯМР спектров 63 и описанного ранее челиферозида Li (45). Спектры ЯМР 'Н и 13С соединений 63 и 45 были близки и отличались друг от друга только сигналами боковой цепи. В результате кислотного гидролиза гликозида 63 получили /J-хиновозу и десульфатированный агликон 63а.

1.32 CHj

NaOjSO.—О

ОН н 4.33

Рис. 5. Корреляции протонов в афеластерозиде С (63), установленные 'Н-'Н COSY экспериментом.

Аналогов спектральных данных, относящихся к боковой цепи афеластерозида С, в литературе найдено не было. Исходя из 13С ЯМР спектров некоторых известных стероидных соединений холестанового ряда с различными функциональными группами в боковой цепи, были рассчитаны возможные значения ХС атомов углерода в боковой цепи для гликозида 63. На основании расчетов предположили, что 63 имеет в боковой цепи одновременно 23-кето- и 24-гидроксигруппы. Такое строение боковой цепи в 63, как и всей молекулы в целом, было подтверждено DEPT экспериментом, а также спектрами HMQC и 'Й-'Н COSY (рис. 5). В 'Н ЯМР спектре 63 присутствовали дублеты протонов трех метильных групп боковой цепи при S 0.94 (Нз-21), 1.01 (Н3-26) и 0.80 м.д. (Нз-27). Значения ХС других протонов боковой цепи при 5 2.08 (Н-20), 2.53 (Н-22), 2.39 (Н'-22), 3.91 (Н-24) и 2.09 м.д. (Н-25) были отнесены с помощью HMQC и 'Н-'Н COSY спектров, давших возможность определить сигналы всех протонов, включая и те, которые в обычных протонных спектрах перекрываются. Таким образом установили, что строение афеластерозида С соответствует формуле 63.

Сравнение *Н ЯМР спектров соединений 64, 63 и 63а показало, что структура стероида 64 соответствует агликону гликозида 63. Строение боковой цепи 64 было подтверждено экспериментами по разностному спин-декаплингу. При подавлении сигналов Нз-26 (5 1.01 м.д.) и Н3-27 (5 0.79 м.д.) наблюдали отклик сигнала Н-25 (8 2.09 м.д.), а при гомодекаплинге на Н-25 дублеты протонов Н-24, Нз-26 и Нз-27 превращались в синглеты. Афеластерозид С (63) и афелакетотриол (64) имеют редкую 23-кето-24-гидроксибоковую цепь, ранее не встречавшуюся в стероидах.

2.15. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japónica (курильская популяция, о. Онекотан)

Исследование морской звезды Aphelasterias japónica, собранной в Охотском море у о. Онекотан (Курильские острова), привело к выделению четырех сульфатированных стероидных соединений: нового гликозида - афеластерозида D (65), ранее известных

пикноподиозида С (61), натриевой соли 3-0-сульфо-24,25-дигидромартастерона (66) и тираминовой соли З-О-сульфоторнастерина А (59).

Афеластерозид D (65). Строение гликозида 65 было установлено на основе данных ЯМР спектроскопии, включая спектры HMQC и 'Н-'Н COSY. Сигналы и КССВ протонов, а также ХС атомов углерода в ЯМР спектрах 65 практически совпадали с аналогичными значениями в спектре лептастерозида L (29) из Leptasterias polaris acérvala, за исключением некоторых сигналов моносахаридного остатка. Так, сигналы Н-Г, Н-2' и Н-3' в спектре 65 наблюдались при 8 5.04, 5.14 и 4.51 м.д. (у лептастерозида L - при 8 4.90, 4.07 и 4.27 м.д., соответственно), а сигналы С-1\ С-2', С-3' - при 8 102.0, 80.4 и 78.1 м.д. (у лептастерозида L - при 8 104.6, 75.1 и 77.7 м.д., соответственно). Учитывая эти различия, предположили, что гликозид 65 отличается от лептастерозида L только присутствием сульфатной группы при С-2' остатка глюкопиранозы. Анализ ЯМР спектров и MALDI-TOF масс-спектров позволил приписать соединению 65 брутто-формулу CssHsiOnSNa. Сольволитическое расщепление 65 привело к десульфатированному соединению, идентифицированному как лептастерозид L. Мы предположили, что асимметрический центр С-24 в 65 имеет Ä-конфигурацию, а остаток сульфатированной глюкопиранозы в 65 относится к -D-ряду, поскольку ранее это было установлено для 29. На основе этих данных афеластерозиду D приписано строение 65. Это первый случай обнаружения в морских звездах гликозида, сульфатированного по положению С-2' остатка глюкозы.

Сульфатированный стероид 66. Структура 66 была подтверждена MALD/TOF масс-спектрами, DEPT и HMQC спектрами. В результате было установлено, что 66 является натриевой солью 3-0-сульфо-24,25-дигидромартастерона - нагивного агликона некоторых астеросапонинов.

2.16. Гликозиды полигидроксистероидов и ! Asterias rathbuni

Из этанольного экстракта морской звезды Asterias rathbuni (отряд Forcipulata, семейство Asteriidae) было выделено четыре соединения: два новых гликозида -ратбуниозиды Ri (67) и R.2 (68), а также два ранее известных соединения - амуренсозид А (69) и натриевая соль З-О-сульфомартастерона (70).

Ратбуниозид Ri (67). Кислотный гидролиз 67 привел к D-ксилозе. В (+)-HRMALDI/TOF масс-спектре 67 присутствовал псевдомолекулярный пик с m/z 591.3876 [M+Na]+, соответствующий молекулярной формуле СзгН5608 (рассчит. m/z 591.3867 [M+Na]+). Строение 67 было установлено, в основном, в результате анализа данных спектров ЯМР 'Н, 13С и DEPT и сравнения их со спектрами пентаола 30 из Ceramaster patagomcus и (245)-24-0-(р-ксилопиранозил)-5а-холестан-ЗР,6а,8,15а,24-пентаола из Heliaster hehanthus. Относительная конфигурация гидроксила при С-15 была определена сравнением КССВ Н-14 и Н-15 с соответствующими литературными данными для стероидных соединений, имеющих 15а- и 15Р-гидроксильные группы. Так, при конфигурации 15а-ОН протон Н-14 в 'Н ЯМР спектре дает дублет дублетов с КССВ (Jm,is = 10.0 Гц), а сигналы Н-16 и Н-16' практически совпадают. При конфигурации 15Р-ОН для протона Н-14 наблюдается дублет дублетов с КССВ (./14,15 = 5.5 Гц), а сигналы Н-16 и Н-16' расходятся на 0.8 м.д. В 'Н ЯМР спектре 67 сигналы Н-14 (8 1.00 м.д., да, J = 5.5, 11.2 Гц), Н-15 (8 4.48 м.д., тд, J = 2.0, 5.5, 7.5 Гц), Н-16 (5 2.60 м.д., дт, J= 7.5, 14.6 Гц) и Н-16' (8 1.73 м.д., м) соответствовали 15р-конфигурации гидроксильной группы. Расположение гидроксильных групп и место присоединения моносахаридного остатка (С-24) в 67 были подтверждены 'Н-'Н COSY, HMQC и НМВС корреляциями. Таких стероидных агликонов, имеющих Зр,6а,15р,24-тетрагидроксизамещение, ранее не было найдено в гликозидах полигидроксистероидов морских звезд.

Ратбуниозид R2 (68). Молекулярная формула ратбуниозида R.2 была определена как C32HJ6O9 на основании данных ЯМР спектров и (+)-HRMALDI/TOF масс-спектра, в котором наблюдали псевдомолекулярный пик с m/z 607.3877 [M+Na]+ (рассчит. m/z 607.3817 [M+Na]+). Строение 68 определили на основании сравнения его ЯМР спектров со спектрами гликозида 67 и стероидного гексаола 27а из Ctenodiscus crispaíus.

Амуренсозид А (69). *Н и 13С ЯМР спектры 69 совпадали с соответствующими спектрами известного амуренсозида А из морской звезды Asterias amurensis.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петербург

« ОЭ КК> акт 1

—

Сульфатированный стероид 70. Данные МАЬШ/ТОР масс-спектра, *Н и 13С ЯМР спектров и атомно-адсорбционного анализа позволили идентифицировать стероид 70 как натриевую соль З-О-сульфомартастерона, нативного генина мартастерозида В и некоторых других известных астеросапонинов.

2.17. Стероидные дисульфаты из ПегШегриМИт

Из водно-этанольного экстракта морской звезды Р1ега.ч1ег риЫНия (отряд Уе1айс1а, семейство Р1егайепс1ае), собранной у о. Кунашир в Охотском море, было выделено шесть соединений: динатриевые соли (20Л)-холест-5-ен-За,4р,21-триол 3,21-дисульфата (71), (20Л)-5а-холестан-За,4р,21-триол 3,21-дисульфата (72) и (20Я)-5сс-холестан-2р,За,21-триол 3,21-дисульфата (73), а также (20Я)-5а-холестан-За,21 -диол 3,21-дисульфат в виде динатриевой (74) и дитираминовой (75) солей, (20й)-холесг-5-ен-За,21-диол 3,21-дисульфат, полученный в виде натриево-тираминовой соли (1:1) (76). Стероиды 72 и 73 являются новыми соединениями. Соединения 75 и 76 выделены в виде ионных коньюгатов с тирамином впервые.

Дисульфатированные стероидные триолы 71, 72 и 73. По данным (+)- и (-)-МА1Л31/ТОР масс-спектров и ЯМР спектров стероид 71 идентифицировали как динатриевую соль (20Я)-холест-5-ен-За,4р,21-триола 3,21-дисульфата, выделенного ранее из офиур ОрЫоКис fi^agllls, ОрЬига 1ехШга1а, Оркюпо1и$ vlctor¡ae, а также из морских звезд Р1ега$1ег ¡еязеШш и Ргегапег ер.

0S03"Na+

OSOjNa*

71. Д° 72

+Na"03S0.....

ОН

Масс-спектр (+)-HRMALDI/TOF соединения 72 имел псевдомолекулярный пик с m/z 647.2254 [M+Na]+, что соответствовало молекулярной формуле СгтНдбОдЗгИаз (рассчит. m/z 647.2275 [M+Na]+). Строение 72 следовало из анализа ЯМР спектров, DEPT, 'Н-'Н COSY и HMQC экспериментов. В 'Н ЯМР спектре 72 присутствовали два дублета дублетов при 5 3.90 (J = 6.9, 9.6 Гц) и 4.18 (J= 3.8, 9.6 Гц) м.д., характерных для протонов группы СН2-21, связанной с О-сульфогруппой. Кроме того, ХС атомов С-11 - С-18 и С-20 - С-27 в 13С ЯМР спектре 72 совпадали с соответствующими сигналами ранее описанного 5а-холестан-3а,21-диола 3,21-дисульфата. На основании этого заключили, что две другие гидроксильные группы находятся в кольцах А и В. Мультиплетносгь и небольшие КССВ сигналов протонов метиновых групп при 5 4.39 (к, J = 2.8 Гц) и 3.76 (т, J = 2.8 Гц), связанных с гидроксильными группами, указывали на экваториальные положения Н-3 и Н-4. Сравнение ХС атомов С-3 и С-4 с соответствующими сигналами для 5а-холестан-За,4р-диола показало, что вторая сульфатная группа расположена у атома С-4. Стереохимия асимметрического центра С-20 была определена как 20R на основании ХС и формы сигнала протонов Нг-21 в *Н ЯМР спектре десульфатированного стероида 72а (8 3.70 м.д., м, Щ/2 =11 Гц). Таким образом, строение 72 было установлено как динатриевая

соль (20Л)-5а-холестан-За,4р,21-триола 3,21-дисульфата. В стероидах из морских звезд и офиур За,4р-гидроксизамещение в насыщенной 5а-холестановой скелетной системе было описано впервые.

Аналогично установили строение 73. Положение сульфатной группы в стероидом ядре соединения 73 было определено на основании его 13С ЯМР спектра. Совпадение ХС сигналов С-1 и С-4 в 13С ЯМР спектре 73 с соответствующими значениями для (20й)-5а-холест-24-ен-2р,За,21-триола 3,21-дисульфата, свидетельствовало о присутствии в 73 2р,За-диольной группировки с сульфатной группой при С-3. Таким образом, строение нового соединения соответствовало формуле 73.

Дисульфатированные стероидные диолы 74, 75 и 76. По данным (+)- и (-)-МА1Л)1/ТОР масс-спектров и ЯМР спектров стероид 74 идентифицировали как динатриевую соль (20Д)-5а-хо лестан-3а,21 -диола 3,21-дисульфата, полученного ранее из офиуры ОрНюйегта 1о^1саис1ит.

В 'Н и 13С ЯМР спектрах соединения 75, кроме сигналов стероидной части, идентичных спектральным данным соединения 74, присутствовали дополнительные сигналы, соответствующие тирамину. А (+)-МАЦЖГОР масс-спектр 75 содержал пик тираминового катиона с т/г 138. Сравнение интенсивностей сигналов протонов стероидного аниона и тираминового катиона в *Н ЯМР спектре показало, что соединение 75 является дитираминовой солью (20Д)-5а-холесган-За,21-диола 3,21-дисульфата. Это был первый случай выделения из морских звезд и офиур стероидного дисульфата в виде тираминовой соли. Обычно такие соединения встречаются в виде натриевых солей.

Сигналы протонов и атомов углерода в ЯМР спектрах 76, относящиеся к стероидной части, совпадали с соответствующими сигналами в спектре (20Я)-холест-5-ен-За,21-диола 3,21-дисульфата из офиур ОрЬас1егта 1ощ1саис1ит, ОрНшга ¡ап1 и 81е%орЫига ЪтсЫасШ. Сравнение интенсивностей сигналов протонов стероидного аниона и тираминового катиона показало, что соединение 76 является натриево-тираминовой (1:1) солью (20Л)-холест-5-ен-За,21 -диола 3,21-дисульфата.

Таким образом, исследование полярных стероидов дальневосточной морской звезды Р1егаИег риЫИш продемонстрировало, что этот вид морских звезд, как и изученные ранее в нашей лаборатории другие виды морских звезд семейства Р1егаз1еп(1ае, содержит стероидные дисульфаты, характерные для офиур. Эти данные подтверждают мнение некоторых таксономистов о более тесном филогенетическом родстве офиур и морских звезд по сравнению с другими классами типа ЕсЫпос1егта1а.

3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ОКИСЛЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МОРСКИХ ЗВЕЗД

Исследование гемолитических, эмбриотоксических и антимикробных свойств.

В качестве моделей для изучения гемолитических и эмбриотоксических свойств

0Б03"Х+

74. X = Ыа'

окисленных стероидных соединений использовали эритроциты крови мышей и эмбрионы морских ежей Strongylocentrotus intermedius и Strongylocentrotus rmdus. Было показано, что гемолитические и эмбриотоксические свойства гликозидов полигидроксистероидов зависят от строения как агликона, так и углеводной цепи, а также от рН, температуры и ионной силы среды. Таким образом, большая часть изученных низкомолекулярных полярных стероидов обладала умеренными гемолитическими и эмбриотоксическими свойствами, и в концентрациях 20-5- 150 мкМ останавливала деление оплодотворенных яйцеклеток морского ежа на стадии одного или двух бласгомеров. Цитотоксическая активность этих соединений, также как и активность астеросапонинов и тритерпеновых гликозидов голотурий, обусловлена, вероятно, их мембранотропными свойствами.

Исследование антимикробиального действия стероидных соединений из морской звезды Patina pectinifera показало, что полигидроксистероиды 3, 4, 'астеросапонин' Pi (1) и его десульфатированное производное 1а обладали слабой антимикробиальной активностью.

Влияние на активность р-1,3-0-глюканазы из кристаллического стебелька двустворчатого моллюска Spisula sachalinensis. Действие веществ оценивали по способности ускорять или тормозить реакцию гидролиза ламинарана (р-1,3-£)-глюкана) ферментом. Было установлено, что гликозиды полигидроксистероидов (1, 11 и 16) оказывали активирующее действие на р-1,3-£>-глюканазу, тогда как натриевая соль 3-0-сульфоторнастерина А (44) проявляла незначительное ингибирующее действие. Эти результаты были подтверждены анализом продуктов ферментативной реакции с помощью ВЭЖХ. Возрастание количества низкомолекулярных продуктов (глюкозы, ламинарибиозы) в присутствии исследуемых гликозидов по сравнению с контролем свидетельствовало об увеличении активности фермента

'Астеросапонин' Pj: каналообразующее действие на БЛМ, кардиотонический эффект. Было изучено влияние сульфатированного монозида 'астеросапонина' Pi (1) и его десульфатированного производного 1а на ионную проницаемость модельных мембран. Впервые было показано, что изменение ионной проницаемости мембран в присутствии монозидов полигидроксистероидов обусловлено образованием в них ионных каналов. При низких концентрациях 1 и 1а (1-5 мкг/мл) параметры этих каналов близки к параметрам природных ионных каналов. На этом основании можно предположить, что монозиды полигидроксистероидов могут выполнять роль регуляторных или сигнальных молекул.

При исследовании действия гликозида 1 на частоту сердечных сокращений у лягушек при внутривенном введении был обнаружен кардиотонический эффект, подобный эффекту растительных сердечных гликозидов.

Стимулирующие эффекты агликонов астеросапонинов на сердце моллюска Spisula sachalinensis. Было показано, что астерогенины, полученные в результате кислотного гидролиза суммы асгероспошшов из морской звезды Lethasterias nammensts chelifera, способны стимулировать мышечные сокращения изолированного сердца моллюска Spisula sachalinensis. Причем агликоны холестанового ряда, 24,25-дигидромартастерон (77) и изомартастерон (48), в большей степени увеличивали силу сердечных сокращений (инотропный эффект), чем агликон прегпанового ряда астерон (46). Все изученные соединения снижали частоту сердечных сокращений (хронотропный эффект). Подобное действие на сокращения сердца лягушек и млекопитающих характерно для сердечных гликозидов из растений.

Исследование влияния астерогенинов на Са2+ транспорт в клетках карциномы Эрлиха показало, что агликон прегнанового ряда 46 стимулировал проникновение Са2+ в клетки, а агликоны холестанового ряда 77 и 48 ингибировали Са2+ транспорт. При изучении действия астерогенинов на Ыа+,К+-зависимую АТФазу мозга крыс установили,

что агликоны с холестановьтм скелетом 77 и 48 умеренно ингибнровали фермент, а прегнановый агликон 46 не оказывал влияния на фермент.

Канцерпревентивное действие. Было изучено канцерпревентивное действие левискулозида G (21). Установили, что 21 в нетоксичных концентрациях (20 - 30 мкМ) тормозит образование колоний эпидермальных клеток мыши линии JB6 С141 Р+ в мягком агаре в присутствии эпидермального фактора роста. На тех же клетках было показано, что гликозид 21 препятствует перерождению нормальных клеток в опухолевые, уменьшая активацию ядерного фактора NFkB при ультрафиолетовом облучении и ингибируя активацию фактора транскрипции АР-1 в отсутствии облучения.

4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ПОЛИГИДРОКСИСТЕРОИДОВ И

ГЛИКОЗИДОВ ПОЛИГИДРОКСИСТЕРОИДОВ В МОРСКИХ ЗВЕЗДАХ

В настоящее время структурные исследования полярных стероидных метаболитов морских звезд развиваются очень быстро, значительно опережая соответствующие биологические исследования. В данной работе впервые была предпринята попытка изучить биологическую роль полигидроксилированных стероидных соединений в морских звездах. Такого рода вещества не найдены в других классах типа иглокожих. Чем объяснить присутствие полигидроксистероидов только у морских звезд по сравнению с представителями других классов иглокожих? Известно, что большинство морских звезд являются активными хищниками. Представителей других классов иглокожих по способу питания, в основном, можно отнести к микрофагам, питающихся детритом и взвешенными в воде микроорганизмами. Вероятно, с преобладанием хищного способа питания связаны особенности строения органов пищеварения морских звезд, имеющих одновременно желудок и пилорические выросты (гепатопанкреас). У других классов иглокожих гепатопанкреас отсутствует. Пилорические выросты морских звезд хорошо развиты, они в несколько раз превышают размеры желудка. Им отводится особая роль в переваривании пищи. Многие морские звезды очень прожорливы и обладают способностью быстро переваривать большие фрагменты пищи. В связи с особенностями питания им необходима мощная пищеварительная система.

Одним из возможных подходов к изучению функциональной роли природных соединений является исследование распределения вторичных метаболитов в различных органах и тканях животных-продуцентов. Мы провели сравнительное исследование содержания не только полигидроксилированных стероидных соединений, но также стеринов и астеросапонинов в различных компонентах тела морской звезды Patina pectimfera.

Другой распространенный подход по установлению биологических функций природных соединений заключается в исследовании сезонных и географических изменений содержания этих соединений в животных-продуцентах. Что касается стероидов морских звезд, то подобные исследования проводились только в отношении стеринов и астеросапонинов. Мы исследовали изменения в содержании полярных стероидов, в том числе полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, в морской звезде Р. pectimfera в течение года.

4.1. Распределение свободных стеринов,

полигидроксистероидов и стероидных гликозидов в различных частях тела морской звезды Patiria (=Asterina) pectlnlfera

Для определения среднего содержания стероидных соединений в различных частях тела морской звезды собранные экземпляры Р. pectimfera были разделены на три группы.

Каждый экземпляр препарировали и отбирали для дальнейшего исследования следующие пять компонентов тела: аборальную (верхнюю) сторону звезды, оральную (нижнюю) сторону звезды, гонады, желудок и пилорические выросты. Одинаковые части тела животных объединяли в каждой группе отдельно, гомогенизировали и экстрагировали водным этанолом. Экстракты обрабатывали бензолом. Из бензольных слоев получали фракции, содержащие свободные стерины. Из водно-этанольных слоев получали фракции, содержащие полярные стероиды: астеросапонины, полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды.

Распределение свободных стеринов в различных частях тела Р. ресйт/ега. Свободные стерины выделяли препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле. Полученные стерины анализировали ГЖХ и ГЖХ-МС в виде соответствующих ацетатов. Было установлено, что стерины присутствуют во всех изученных частях тела морской звезды. Во всех фракциях были идентифицированы десять основных соединений. Все они относились к Д7 стеринам. В стериновых суммах не были найдены станолы, Д5, 4-метил и 4,4-диметил стерины, которые обычно присутствуют в других видах морских звезд. Установили, что основным компонентом во всех фракциях был 5а-холест-7-ен-Зр-ол (С27Д7), составлявший 60-70 % от стериновых сумм. Два других стерина, 24^-метил-5а-холеста-7,22£-диен-ЗР-ол (С28 Д7'22) и 24!;-этил-5а-холест-7-ен-ЗД-ол (С29 А7), также составляли существенную часть стериновых фракций. Таким образом, суммы свободных стеринов из разных частей тела морской звезды не отличались значительно друг от друга.

Распределение полярных стероидов в различных частях тела Р. ресйт/ега. Суммы полярных стероидов, полученные из экстрактов различных компонентов тела Р. рес11т/ега, очищали колоночной хроматографией на полихроме-1. Содержание полярных стероидов в желудке и, особенно, в пилорических выростах было значительно выше, чем в других частях тела. В то же время содержание полярных стероидов в стенках тела и гонадах было приблизительно одинаковым (табл. 1).

Таблица 1. Содержание полярных стероидов (мг/г сырого веса) в различных частях тела Р. ресПпг/ега

Части тела Группы Среднее значение (± Б.Е.)

I II III

Аборальная сторона 3.8 4.7 3.7 4.1 (±0.55)

Оральная сторона 2.3 2.1 3.7 2.7 (+ 0.87)

Желудок 11.9 7.2 6.4 8.5 (± 2.90)

Гонады 3.2 4.0 2.9 3.4 (± 0.57)

Пилорические 18.2 13.6 17.7 16.5 (± 2.50)

выросты

Полученные фракции полярных стероидов разделяли с помощью гельфильтрации на сефадексе Ш-20 на две подфракции. Подфракция 1 содержала окисленные стероиды средней полярности: полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды. Подфракция 2 состояла из более полярных астеросапонинов. Соотношение подфракций 1 и 2 (в %) в различных частях тела приведены в табл. 2. Из таблицы видно, что токсичные астеросапонины присутствуют во всех изученных частях тела морской звезды, в то время как полигидроксистероиды и родственные гликозиды были найдены только в органах пищеварения (желудке и пилорических выростах). Последние вещества составляли основную часть полярных стероидов в пилорических выростах (77.5%) и значительную часть в желудке (31.4%).

ГГГ ГПГГ ГГ ГРГГГГ гг Г Г Г Г 1Г ГГГ ГГГ Г ГГГГ ГГ Г Г гг лпгшт

ГГ Г ГГГГГ ГГГГ ГГГГ IГГ

Суммы астеросапонинов из разных частей тела морской звезды проявлялись в виде четкой зоны близко расположенных пятен на ТСХ-пластинках со значениями Я/ в пределах от 0.27 до 0.40. Число наблюдаемых пятен варьировало от трех в сумме астеросапонинов из пилорических выростов и до шести - из гонад. Цвет пятен также варьировал в разных фракциях астеросапонинов. Эти результаты продемонстрировали различия в составе сумм астеросапонинов из разных частей тела Р. ресит/ега, что совпадало с данными, полученными ранее для других видов морских звезд.

Таблица 2. Соотношение (%) подфракций 1 (полигидроксистероиды и родственные

гликозиды) и 2 (астеросапонины) из различных частей тела Р. ресит/ега

Подфракции Аборальная сторона Оральная сторона Желудок Гонады Пилорические выросты

1 — — 31.4% — 77.5%

2 100% 100% 68.6% 100% 22.6%

Суммы полярных стероидов из различных компонентов тела Р. ресит/ега были протестированы также на гемолитическую активность. Хорошо известно, что астеросапонины обладают достаточно высокой гемолитической активностью, а полигидрокистероиды и родственные гликозиды показывают обычно слабые или умеренные гемолитические свойства. Суммы полярных стероидов, выделенные из стенок тела морской звезды, проявили более высокую гемолитическую активность по сравнению с соответствующими суммами из органов пищеварения, особенно по сравнению с суммами из пилорических выростов.

ВЭЖХ анализ сумм полигидроксистероидов и родственных им гликозидов из желудка и пилорических выростов Р. реЫт/ета. Соединения, соответствующие пикам на хроматограммах (ВЭЖХ), собирали и идентифицировали по данным ТСХ и 'Н ЯМР спектроскопии с веществами, полученными нами ранее или описанными в литературе. В результате в суммах полигидроксистероидов и родственных гликозидов из печени и желудка Р. ресит/ега были идентифицированны 'астеросапонины' Р[ (1) и Р2 (6), гексаол 2, гептаол 3, октаол 4, сульфат октаола 5, октаол 78 (5а-холестан-3|3,4р,6а,7а,8,15р,16р,26-октаол), гептаол 79 (5а-х0лестан-3р,6а,7а,8,15р,16р,26-гепта0л) и определено их относительное содержание.

Суммы полигидроксилированных соединений из желудка и пилорических выростов показали почти идентичные хроматограммы, которые отличались друг от друга относительным содержанием отдельных компонентов. Исходя из этого, был сделан вывод о сходстве качественного состава этих сумм. Сульфатированные соединения 1, 5 и 6 составляли 51.3 % в пилорических выростах и 24.3 % в желудке. Гептаол 3 - 12.7 % в пилорических выростах и 13.9 % в желудке и октаол 78 - 4.6 % в пилорических выростах и 4.2 % в желудке. Другие стероиды составляли не более 1% смеси. Сульфатированных соединений в пилорических выростах было в два раза больше (51.3%), чем в желудке (24.3%). Для того, чтобы проанализировать содержание сульфатированных стероидов, был проведен мягкий сольволиз соответствующих фракций. На основании анализа ВЭЖХ полученных десульфатированных продуктов заключили, что 'астеросапонин' Р[ является основным компонентом в пилорических выростах, в то время как сульфатированный октаол 5 является преобладающим компонентом в желудке.

О биологических функциях стероидных соединений в морских звездах. Принято считать, что одной из основных биологических функций астеросапонинов, стероидных олигогликозидов морских звезд, является защита этих животных от хищников. Полученные нами результаты подтверждают это мнение. Действительно, хотя астеросапонины были обнаружены во всех изученных частях тела морской звезды Р.

pectinifera, гемолитическая активность полярных стероидов из стенок тела, где из полярных стероидов присутствовали только астеросапонины, была выше по сравнению с гемолитической активностью стероидных сумм из внутренних органов. Как и в других исследованиях, наблюдались различия в составе токсичных астеросапонинов из разных частей тела морской звезды, особенно из стенок тела и гонад. Это может быть связано с реализацией данными соединениями также других биологических функций. Например, ранее было отмечено участие некоторых астеросапонинов в регуляции созревания ооцитов и действии в качестве кофакторов акросомальной реакции.

Так же как и астеросапонины, свободные стерины были найдены во всех изученных частях тела морской звезды. Все идентифицированные свободные стерины принадлежали к Д7 стеринам с преобладанием 5а-холест-7-ен-ЗР-ола. Очевидно, такой состав связан с необходимостью защищать свои собственные клетки против токсичного действия астеросапонинов. Ранее было установлено, что замена Д3 стеринов на Д7 стерины в мембранах клеток морских звезд значительно понижает проницаемость этих мембран при воздействии на них астеросапонинов.

Наши результаты показали, что полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды играют иную, по сравнению с астеросапонинами, биологическую роль. Исходя из локализации этих соединений в органах пищеварения морской звезды, мы пришли к выводу об их возможном участии в переваривании пищи.

4.2. Сезонные изменения содержания полярных стероидов, включая полигидроксистероиды и родственные им гликозиды, в органах пищеварения морской звезды Patiria (=Asterlna) pectinifera

Для определения средних значений концентраций полярных стероидов и средних значений гонадного и печеночного индексов, ежемесячно собирали три группы морских звезд P. pectinifera. Сезонные изменения гонадного и печеночного индексов (G.I. и P.C.I., соответственно) морской звезды P. pectinifera, полученные в течение 2001 года, представлены в графическом виде на рис. 6. Свежие гомогенизированные органы пищеварения экстрагировали водным этанолом. Суммы полярных стероидов из пилорических выростов и желудка P. pectinifera очищали колоночной хроматографией на амберлите XAD-2. Сезонные изменения содержания полярных стероидов, полученных из двенадцати сборов морских звезд в Амурском заливе (залив Петра Великого, Японское море) в течение года, приведены на рис. 7. Фракции полярных стероидов из морских звезд, собранных в определенном месяце, объединяли и разделяли далее гельфильтрацией на сефадексе LH-20 на две подфракции: полигидроксистероидов и родственных низкомолекулярных гликозидов (подфракция_1) и астеросапонинов (подфракция 2). Соотношение подфракций 1 и 2 в пилорических выростах и желудке P. pectinifera, собранной в течение года, представлено в табл. 3. Исходя из данных, указанных на рис. 7 и в табл. 3, рассчитали значения концентраций полигидроксистероидных соединений (подфракция 1) в органах пищеварения P. pectinifera (рис. 8). Полученные результаты продемонстрировали, что содержание полярных стероидов (рис. 7), в том числе полигидроксистероидов и родственных гликозидов (рис. 8), заметно варьировало по сезонам и изменялось в течение годового репродуктивного цикла.

Известно, что репродуктивный цикл морских звезд включает три основных периода: гаметогенез (процесс развития половых клеток), нерест и посленересговую перестройку. Активное пищевое поведение морских звезд обычно связано с гаметогенезом и

1 Гонадный индекс СЛ. = (сырой вес гонад/сырой вес морской звезды)х100, печеночный индекс Р.С.1. = (сырой вес пилорических выростов/сырой вес морской звезды)х100.

r rwr ttm wt» rr wr r

r rwr

r w rrrr r r m

rr r r rr r rw r wwwrrrr mwrrrvwrr r rr r rr

перестроечными процессами. Сезонные колебания гонадного и печеночного индексов у Р. ресЧт/ега показали значительное сходство в течение годового цикла (рис. 6), то есть размеры пилорических выростов изменялись пропорционально размерам гонад. Низкие значения гонадного и печеночного индексов наблюдались в период перестройки с осени и до весны (октябрь - апрель). Некоторое возрастание этих значений имело место в феврале. Интенсивные гаметогенетические процессы начались в конце весны. В результате гонадный индекс достиг наивысших значений летом с конца мая по август. Нерест сопровождался падением гонадного индекса в августе - сентябре.

Jan Feb Маг Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Jan

Рис. 6. Сезонные вариации гонадного и печеночного индексов (G.I. и P.C.I., соответственно) в P. pectmifera.

Таблица 3. Соотношение (%) подфракций 1 (полигидроксистероиды и родственные им гликозиды) и 2 (астеросапонины) из пилорических выростов и жеудка P. pectmifera

Месяц Пилорический вырост Желудок

Подфракции Подфракции

1 2 1 2

Январь I 81% 19% 71% 29%

Февраль 79% 21% 73% 27%

Март 85% 15% 65% 35%

Апрель 75% 25% 50% 50%

Май 69% 31% 61% 39%

Июнь 68% 32% 77% 23%

Июль 80% 20% 57% 43%

Август 77% 23% 70% 30%

Сентябрь 74% 26% 60% 40%

Октябрь 75% 25% 56% 44%

Ноябрь 92% 8% 51% 49%

Январь II 81% 19% 68% 32%

32-, 302826242220181614121086420-

—■— полярные стероиды (мг/г гепатопанкреаса) » полярные стероиды (мг/г желудка)

¿ат\ реЬ Маг Арг Мау .Лип ии! Аид Бер Ос! Оес Jan

Рис. 7. Сезогшые вариации в содержании полярных стероидов в органах пищеварения Р. ресит/ега.

Уровень полярных стероидов в пищеварительных тканях Р. ресит/ега заметно варьировал в течение года (рис. 7). В некоторые месяцы стандартные ошибки были довольно значительны, особенно для желудка, что отражает, по-видимому, определенные различия между отдельными образцами морских звезд. Эти различия, прежде всего, связаны с неполной синхронизацией гаметогенеза в морских звездах. С другой стороны состояние гепатопанкреаса более стабильно, нежели желудка, который может быть пустым или находиться в процессе активного переваривания пищи.

22-,

■ полигидроксистероиды и родственные ниэкомолекулярные

гликозиды (мг/г гепатопанкреаса) • полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды (мг/г желудка)

20

16

16

14

12

10

8

6

4

2

О

.Лап РеЬ Маг Арг Мау .Лип >1и1 Аид Зер Ой Ь1оу Оес ^п

Рис. 8. Сезонные вариации в содержании полигидроксистероидов и родственных гликозидов в органах пищеварения Р. ресит/ега.

Максимальный уровень полярных стероидов, в том числе полигидроксистероидных соединений, в пилорических выростах и желудке Р. ресШфга приблизительно соответствовал максимальному развитию пилорических выростов и гонад (рис. 6, 7, 8). Нерест и начало перестройки (август, сентябрь, октябрь) сопровождались понижением содержания этих соединений. Их уровень возрастал во время перестройки (ноябрь -январь) и понижался в конце этого периода (февраль - апрель). Однако в марте, когда значения гонадного и печеночного индексов были минимальными, в желудке наблюдался максимальный уровень окисленных стероидных соединений. По-видимому, мартовская аномалия была связана с активным питанием морских звезд в момент сбора. Мы заметили, что желудки всех животных, собранных в марте были наполнены пищей.

Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы. Полигидроксистероиды и родственные гликозиды присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, а их максимальные концентрации совпадают с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. В марте, когда питание было особенно активным, уровень низкомолекулярных полярных стероидов в желудке был максимальным. Из этого следует, что полигидроксилированные стероидные соединения выполняют биологическую функцию, связанную с процессами пищеварения морских звезд.

Постоянное присутствие низкомолекулярных полярных стероидов в морских звездах, вероятно, связано также с другой биологической ролью. Хорошо известно, что астеросапонины токсичны для клеток, содержащих Д5 стерины в мембранах, так как, образуя комплексы с Д3 стеринами, разрушают клеточные мембраны. Поэтому клетки самих морских звезд содержат Д7 стерины вместо Д5 стеринов. Д5 Стерины, поступающие в морские звезды с пищей, либо сульфатируются, либо превращаются в Д7 стерины. Не исключено, что какая-то часть избыточных А5 стеринов трансформируется в полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов. Таким образом, одна из возможных функций низкомолекулярных полярных стероидов связана с тем, что они участвуют в биохимических механизмах защиты животных против собственных видовых токсинов.

4.3. Сходство полигидроксилированных стероидных соединений морских звезд с желчными спиртами и кислотами позвоночных и их возможные биологические функции

Пилорические выросты (гепатопанкреас) морских звезд - орган, осуществляющий одновременно функции печени и поджелудочной железы, которые секретируют основные пищеварительные ферменты и компоненты желчи у высших животных. Основньми компонентами желчи у высших животных и человека являются желчные спирты и кислоты, способствующие усвоению жиров, особенно неполярных липидов и холестерина.

При сравнении структурных особенностей молекул стероидных соединений желчи позвоночных с молекулами полигидроксилированных соединений морских звезд становится очевидным их структурное сходство. Те и другие соединения относятся, в основном, к насыщенным полиокисленным стероидным соединениям. Часто эти соединения находятся в пищеварительных органах в связанной форме. Стероидные спирты морских звезд - в виде сульфатов и гликозидов, иногда - фосфатов. Кислоты морских звезд - в виде коньюгатов с таурином и 2-гидроксиметилтаурипом. Аналогичные спирты позвоночных - в виде сульфатов и дисульфатов. Кислоты позвоночных - в виде амидов глицина и таурина.

Как желчные спирты и кислоты позвоночных, так и полигидроксилированные стероиды морских звезд являются амфифильными соединениями: одна часть их молекул имеет гидрофобные свойства, другая часть - гидрофильные свойства. Изучая стабильность образующейся эмульсии полигидроксистероидных соединений из морских звезд в воде, мы установили, что эти морские метаболиты, подобно стероидным компонентам желчи, обладают эмульгирующими свойствами. Было показано, что основной компонент суммы полигидрстероидов из Р. ресипфга 'астеросапонин' Р] так же, как и соли желчных кислот, способен солюбилизировать суспензию 1-пальмитоил-глицерина в воде.

К числу важных биологических свойств желчных кислот и спиртов относятся их гемолитическое действие и антибактериальная активность. Полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды морских звезд также обладают этими свойствами.

В биосинтезе желчных спиртов и кислот животных и человека, происходящем в печени, основную роль играет Р450 цитохром монооксигеназная система (МО). Очевидно, что для биосинтеза полиоксистероидов в морских звездах также требуются ферментативные системы, способные к глубокому окислению стероидного ядра. Недавно было показано присутствие цитохрома Р450 и других МО систем в представителях трех классов иглокожих - морских звездах, голотуриях и морских ежах. Причем наивысшие уровни активности цитохрома Р450 были найдены в пилорических выростах и желудке морской звезды. Этот факт дает основание предполагать, что найденные в морских звездах цитохром Р450 и другие МО системы пищеварительных органов принимают участие в биосинтезе окисленных стероидных соединений этих животных.

Обобщив полученные нами экспериментальные результаты, а также литературные данные, мы пришли к следующим выводам:

1. Полигидроксистероиды и родственные гликозиды морских звезд имеют определенное структурное сходство с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека.

2. Полигидроксистероиды и родственные гликозиды морских звезд также как и желчные спирты и кислоты других животных и человека обладают эмульгирующими свойствами, гемолитическим действием и антибактериальной активностью.

3. В пищеварительных органах морских звезд присутствуют цитохром Р450 и другие МО системы, принимающие участие в биогенезе желчных спиртов и кислот у высших животных и человека.

Исходя из сказанного выше и данных, приведенных в разделах 4.1. и 4.2., мы сделали заключение, что одной из основных функций полигидроксистероидов и родственных низкомолекулярных гликозидов в органах пищеварения морских звезд является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам позвоночных и человека.

5. ЗАВИСИМОСТЬ СОСТАВА ПОЛЯРНЫХ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В МОРСКИХ ЗВЕЗДАХ ОТ МЕСТА ИХ

ОБИТАНИЯ

Морским звездам свойственна внутривидовая и индивидуальная изменчивость. Особенно это характерно для родов с большим числом видов. Очень часто у близких видов встречаются параллельные вариации, например, длинно- или коротколучевое строение тела, густоиглая или редкоиглая поверхность тела и т. д. Виды морских звезд могут изменяться морфологически в зависимости от их географического распространения,

от поселения на больших или малых глубинах, от характера грунта и других экологических факторов. Иногда морские звезды одного и того же вида из различных мест обитания значительно отличаются друг от друга по характеру питания и связанному с ним поведению. Такие роды, как Henricia, Asterias, Leptasterias и некоторые другие, дают особенно наглядные примеры всех этих изменений. Вероятно, процессы видообразования внутри этих родов активно происходят и в настоящее время.

5.1. Сезонные изменения состава суммарных фракций полигидроксистероидов и родственных им гликозидов в органах пищеварения морской звезды Patiria (=Asterina) pectinifera

Для отдельных видов морских звезд нами были замечены колебания в составе полярных стероидов у животных, собранных в различных районах. В частности, три изученных ранее популяции Aphelasterias japónica и две популяции Lethasterias nammensis chehfera продемонстрировали значительные различия в составе полигидроксистероидов и родственных низкомолекулярных гликозидов. Предположительно, эти различия могли зависеть как от места обитания животных, где существенную роль играют различные источники питания и другие экологические факторы, так и от сезонных циклов жизнедеятельности морских звезд. Чтобы внести некоторую определенность в вопрос зависимости стероидного состава морских звезд от места их обитания, мы изучили сезонные изменения состава суммарных фракций полигидроксилированных стероидных соединений в пищеварительных органах морской звезды Р. pectinifera, принадлежащей одной популяции.

ВЭЖХ анализ суммарных фракций полигидроксистероидов и родственных соединений из органов пищеварения Р. pectinifera. Суммы полигидроксистероидов и родственных низкомолекулярных гликозидов (подфракции 1, см. раздел 4.2.), полученные в течение года из двеннадцати сборов Р. pectinifera, после дополнительной очистки проанализировали с помощью ВЭЖХ. В результате было установлено, что ' астеросапонин' Р| (1) всегда оставался основным компонентом, а стероидные полиолы гептаол 3, октаол 4 и октаол 78 - преобладающими компонентами суммарной фракции полигидроксистероидных соединений. Гептаол 79 был минорным компонентом, а 'астеросапонин'Рг (2) и сульфат октаола 5 присутствовали в следовых количествах на протяжении всех сезонов. Таким образом, было показано, что в течение года в пищеварительных тканях Р. pectinifera, собранной в одном и том же районе, наблюдались близкие по составу суммы полигидроксистероидных соединений с небольшими количественными колебаниями в их содержании.

5.2. Географические изменения состава полярных стероидных соединений в морских звездах

Сравнение двух июльских сборов морской звезды Р. pectinifera из разных мест обитания, Амурский залив (залив Петра Великого, Японское море) и залив Посьет (Японское море), показало заметные различия в относительном содержании полигидроксистероидов и родственных гликозидов. Так, в популяции из залива Посьет сульфатированный октаол 5 составлял значительную часть в полигидроксистероидной сумме из пилорических выростов и являлся основным в желудке. С другой стороны, в популяции из Амурского залива соединение 5 присутствовало в следовых количествах в обоих органах. В морских звездах из Амурского залива гексаол 2 не был найден вообще, а уровень октаола 4 был значительно выше, чем в популяции из залива Посьет. Эти данные показали, что состав полигидроксистероидной суммы в Р. pectinifera может варьировать в

зависимости от места обитания. Аналогичные результаты были получены в ходе исследований стероидного состава других видов морских звезд, собранных в разных местах.

Стероиды из морской звезды Aphelasterias japomca исследовались трижды. Из животных, собранных в заливе Посьет (Японское море), мы выделили шесть соединений близких по строению к астеросапонинам и имеющих 3-0-сульфо-3р,6а-дигидрокси-д9'("'-стероидный фрагмент, три из них были гликозилированы по положению С-6. Из морской звезды, собранной около острова Онекотан (Курильские острова, Охотское море), мы получили четыре соединения, два из них принадлежали к гликозилированным стероидным пентаолу и гексаолу. Изучение японскими исследователями животных, собранных в заливе Муцу (префектура Аомори, Япония), привело к выделению пяти соединений, два из них относились к ксилозилированным стероидным пентаолу и гексаолу. Единственным общим соединением, основным по содержанию во всех трех популяциях, был З-О-сульфоторнастерин А.

Из тихоокеанской популяции морской звезды Crossaster papposus мы выделили пять полигидроксилированных соединений, три из них являлись моногликозидами. Из атлантической популяции того же самого вида шведские ученые получили четыре биозида полигидроксистероидов. В этих двух популяциях не было найдено ни одного общего стероидного соединения.

Ранее из морской звезды Lethasterias nammensts chelifera, собранной у побережья острова Шиашкотан (Курильские острова, Тихоокеанская сторона), мы выделили наряду с низкомолекулярными полярными стероидами значительное количество астеросапонинов с углеводными цепями из пяти-шести моносахаридных остатков. Исследование морской звезды Lethasterias nammensts chelifera, собранной у побережья острова Онекотан (Курильские острова, Охотское море), показало, что во фракции полярных стероидов астеросапонины вообще отсутствуют.

Кроме перечисленных выше четырех видов, аналогичные различия в стероидном составе наблюдались также нами и другими учеными при изучении морских звезд Culcita novaeguineae, Echinaster sepositus, Oreaster reticulates и Distolasterias троп. Таким образом, сравненительное изучение различных популяций одного и того же вида морских звезд во многих случаях показало определенные различия в их стероидном составе. В то же время стероидный состав внутри одной популяции остается довольно стабильным, что показано нами при изучении полярных стероидов P. pectmifera.

Морским звездам, особенно дальневосточным видам, присуща высокая внутривидовая и индивидуальная изменчивость. Причиной их высокой биохимической изменчивости, по-видимому, являются различные спектры питания в разных географических районах и другие экологические факторы.

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы выделения суммарных фракций и индивидуальных окисленных стероидных соединений из спиртовых экстрактов морских звезд. Они включают применение гидрофобной, гельпроникающей и адсорбционной колоночной хроматографии с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на прямой и обращенной фазах.

2. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд выделено 76 полярных стероидных соединений. Проведена структурная идентификация 26 соединений с известными веществами и установлено химическое строение 50 новых соединений, из них 11 полигидроксистероидов, 26 гликозидов полигидроксистероидов, 10 сульфатов и монозидов астерогенинов и 3 стероидных дисульфата.

3. Из морских звезд выделены представители новой группы стероидных солей, состоящих из стероидного аниона и алкалоидного катиона, названные нами алкалоидостероидами. Их строение было установлено.

4. Найдены и структурно изучены редкие в морских звездах стероидные гликозиды с (1->5) и С1 —>6) гликозидными связями между моносахаридными остатками. Впервые выделены гликозиды с остатками редких моносахаридов: галактофуранозы, 2,3-ди-О-метилксилопиранозы, 5-О-сульфат З-О-метиларабинофуранозы и 2-0-сульфат арабинофуранозы, а также с 24-О-гликозилированной 24,26-дигидрокси боковой цепью.

5. Впервые в полярных стероидах обнаружены такие структурные фрагменты как 23-кето-24-гидроксихолестановая, 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая и 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая боковые цепи.

6. Показано, что гемолитическая и цитотоксическая активности полигидроксистероидов и родственных веществ зависят от химической структуры, рН, температуры и ионной силы среды. Для 'астеросапонина' Р| обнаружен кардитонический эффект, характерный для сердечных растительных гликозидов. Получены данные о его способности формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Установлено, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов способны активировать р-1,3-£>-глюканазу из моллюска Зр^тЬ иасЬа1теп$15, а некоторые астерогенины оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска. У левискулозида в обнаружена способность тормозить канцерогенез, вызванный действием опухолевых промоторов.

7. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных частях тела морских звезд, в отличие от полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, найденных только в органах пищеварения - желудке и пилорических выростах.

8. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, а их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из полученных данных, а также на основании сходства химического строения и свойств полигидроксилированных стероидных соединений с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека высказано предположение, что одной из основных биологических функций этих веществ является их участие в переваривании пиши подобно желчным спиртам и кислотам у позвоночных.

9. Показано, что в течение года состав низкомолекулярных полярных стероидов в морских звездах из одной и той же популяции остается довольно постоянным, хотя наблюдаются незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одних и тех же видов морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений может изменяться, и зависит от места их обитания.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кича A.A.. Калиновский А.И., Левина Э.В., Стоник В.А. Астеросапонин Pi из дальневосточной морской звезды Patina pectmifera II Химия природ, соедин. 1981. № 5. С. 669 - 670.

2. Kicha А.А. Kalinovsky A.I., Levina E.V., Stonik V.A., Elyakov G.B. Asterosaponin Pi from the starfish Patiriapectmifera И Tetrahedron Lett. 1983. V. 24. N 36. P. 3893 - 3896.

3. Кича А А.. Калиновский А.И., Левина Э.В., Стоник B.A., Еляков Г.Б. Полигидроксилированные стероиды из пищеварительных органов морской звезды Patiria pectmifera II Биоорган, химия. 1983. Т. 9. № 7. С. 975 - 977.

4. Кича A.A.. Калиновский А.И., Левина Э.В. Полигидроксилированные стероиды из морской звезды Patina pectmifera II Химия природ, соедин. 1984. № 6. С. 738 - 741.

5. Кича А А.. Калиновский А.И., Левина Э.В., Рашкес Я.В., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Новый стероидный гликозид из морской звезды Patina pectmifera П Химия природ, соедин. 1985. № 3. С. 356 - 361.

6. Рашкес Я.В., Кича A.A.. Левина Э.В., Стоник В.А. Масс-спектры полиоксистероидов из морской звезды Patinapectinifera II Химия природ, соедин. 1985. № 3. С. 361 - 367.

7. Кича A.A.. Калиновский А.И., Левина Э.В., Андриященко П.В. Кулыдатозид Ci из морских звезд Culata novaeguineae и Lincha guildingt II Химия природ, соедин. 1985. № 6. С. 801 - 804.

8. Кича A.A.. Калиновский А.И., Андриященко П.В., Левина Э.В. Кульцитозиды С2 и Сз из морской звезды Culata novaeguineae II Химия природ, соедин. 1986. № 5. С. 592 -596.

9. Левина Э.В., Калиновский А.И., Андриященко П.В., Кича A.A. Стероидные гликозиды из морской звезды Echinaster sepositus И Химия природ, соедин. 1987. № 2. С. 246 -249.

10. Кича А А.. Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидный гексаол из Crossasterpapposus II Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 432 - 433.

11. Кича A.A.. Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1989. № 5. С. 669 - 673.

12. Кича А.А. Калиновский А.И., Стоник В.А. Минорные полиоксистероиды из морской звезды Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1990. № 2. С. 218 - 221.

13. Кича A.A.. Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные сульфаты из морской звезды Lethastenas nammensis chelifera И Химия природ, соедин. 1991. № 4. С. 520 - 523.

14. Кича A.A.. Калиновский А.И., Стоник В.А. Агликоны из гликозидов морской звезды Lethastenas nammensis chelifera II Химия природ, соедин. 1992. № 1. С. 145 - 146.

15. Кича А А .^Калиновский А.И., Горбач (Иванчина) Н.В., Стоник В.А. Новые полиоксистероиды из дальневосточной морской звезды Henricia sp. II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 249 - 253.

16. Кича A.A.. Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Crossaster papposus И Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 257 - 260.

17. Кича A.A.. Калиновский А.И. Выделение лаевиусколозида G из морской звезды Henricia derjugmi и коррекция структуры эхинастерозидов Bi и В2 // Химия природ, соедин. 1993. № 4. С. 619 - 620.

18. Кича А А . Калиновский А.И., Иванчина Н.В., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Solaster dawsoni Verrill II Изв. АН. Сер. хим. 1993. № 5. С. 980 - 982.

19. Кича А А.. Калиновский А.И., Иванчина Н.В., Елькин Ю.Н., Стоник В.А. Полигидроксистероиды из дальневосточной морской звезды Ctenodiscus crispatus II Изв. АН. Сер. хим. 1994. № 10. С. 1821 - 1825.

20. Кича А.А. Калиновский А.И., Стоник В.А. Новый высокогидроксилированный стероидный гликозид из морской звезды Leptasterias polaris acervata // Изв. АН. Сер. хим. 1995. №6. С. 1164- 1165.

21. Кича А А. Калиновский А.И., Стоник В.А. Новые полигидроксистероиды и стероидные гликозиды из дальневосточной морской звезды Ceramaster patagónicas // Изв. АН. Сер. хим. 1997. № 1. С. 190 - 195.

22. Gorshkov В.А., Kapustina I.I., Kicha А.А.. Aminin D.L., Gorshkova I.A. Stimulatory effects of starfish sapogenins (Asterias amurensis and Lethasterias nanimensis chelifera) on molluscan heart (Spisula sachalmensis) II Сотр. Biochem. Physiol. C. 1998. V. 120. P. 235 -239.

23. Кича A.A.. Калиновский А.И., Иванчина H.B., Стоник В.А. Новый стероидный гексаол из дальневосточной морской звезды Luidiaster dawsoni II Изв. АН. Сер. хим. 1998. № 10. С. 2088 - 2090.

24. Kicha А.А.. Kalinovsky A.I., Ivanchina N.V., Stonik V.A. New steroid glycosides from the deep-water starfish Mediaster murrayi II J. Nat. Prod. 1999. V. 62. N 2. P. 279 - 282.

25. Kicha A.A.. Kalinovsky A.I., Ivanchina N.V., Stonik V.A. Polyhydroxylated steroidal saponins from Asteroidea (Starfish) // Saponins in food, foodstuffs and medicinal plants / Eds. Oleszek, W., Marston, A. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, Boston, London.

2000. V. 45. P. 65 - 72.

26. Ivanchina N.V., Kicha A.A.. Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A., Riguera R., Jiménez С. Hemolytic polar steroidal constituents of the starfish Aphelasterias japónica И J. Nat. Prod. 2000. V. 63. N 8. P. 1178 -1181.

27. Кича A.A.. Иванчина H.B., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. "Астеросапонин" Рг из дальневосточной морской звезды Patina (Asterina) pectmifera И Изв. АН. Сер. хим. 2000. № 10. С. 1818 - 1820.

28. Ivanchina N.V., Kicha А.А.. Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Prokof eva N.G., Stonik V.A. New steroid glycosides from the starfish Asterias rathbum II J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N 57. P. 945 - 947.

29. Kicha A.A. Ivanchina N.V., Gorshkova I.A., Ponomarenko L.P., Likhatskaya G.N., Stonik V.A. The distribution of free sterols, polyhydroxysteroids and steroid glycosides in various body components of the starfish Patiria (= Asterina) pectmifera И Сотр. Biochem. Physiol.

2001. V. 128B. P. 43 - 52.

30. Кича A.A.. Иванчина H.B., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Сульфатированные стероидные соединения из курильской популяции морской звезды Aphelasterias japónica II Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 4. С. 695 - 698.

31. Ivanchina N.V., Kicha А.А. Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Hemolytic steroid disulfates from the Far Eastern starfish Pteraster pulvillus II J. Nat. Prod. 2003. V. 66. N2. P. 298-301.

32. Kicha A A.. Ivanchina N.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Alkaloidosteroids from the starfish Lethasterias nanimensis chelifera И Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. N 9. P. 1935 - 1937.

33. Prokof eva N.G., Chaikina E.L., Kicha A.A.. Ivanchina N.V. Biological activities of steroid glycosides from starfish // Сотр. Biochem. Physiol. 2003. V. 134B. N 4. P. 695 - 701.

Соискатель

'^У&лХ.А

Кича А.А.

Кича Алла Анатольевна

ОКИСЛЕННЫЕ СТЕРОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ МОРСКИХ ЗВЕЗД: СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ

Автореферат

ЗАО «Фартоп» Г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Изготовленно с машинописных листов Отпечатанно 12 ноября 2003г.

í 2 0 4 1 4 2о 4 îf

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

СТРОЕНИЕ, БИОГЕНЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ

СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В МОРСКИХ ЗВЕЗДАХ.

2Л. Общие сведения о классе Asteroidea (морские звезды).

2.2. Основные типы стероидных соединений морских звезд.

2.2.1. Стерины морских звезд.

2.2 Л Л. Стерины и сульфаты стеринов.

2.2.1.2. Биогенез стеринов в морских звездах.

2.2.1.3. Биологические функции стеринов в морских звездах.

2.2.2. Полигидроксистероиды и родственные низкомолекулярные гликозиды морских звезд.

2.2.2Л. Полигидроксистероиды.

2.2.2.2. Моно- и биозиды полигидроксистероидов.

2.2.3. Астеросапонины.

2.2.3.1. Агликоны астеросапонинов и их биосинтез.

2.2.3.2. Астеросапонины первого структурного типа.

2.2.4. Физиологическая активность полярных стероидных соединений морских звезд.

2.2.5. Биологические функции астеросапонинов.

2.3. Оксигеназы морских звезд.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Введение.

3.2. Получение суммарных фракций полярных стероидов из экстрактов морских звезд и выделение индивидуальных соединений.

3.3. Установление строения окисленных стероидных соединений морских звезд.

3.3.1. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из Patiria (=Asterina) pectinifera.

3.3.2. Исследование фрагментации в масс-спектрах полигидрокси-стероидных соединений из Patiria (= Asterina) pectinifera.

3.3.3. Гликозиды полигидроксистероидов из Culcita novaeguineae.

3.3.4. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из

Crossaster papposus.

3.3.5. Стероидный гексаол и гликозиды полигидроксистероидов из Henricia derjugini.

3.3.6. Гликозиды полигидроксистероидов из Solaster dawsoni.

3.3.7. Полигидроксистероиды из Ctenodiscus crispatus.

3.3.8. Лептастерозид L из Leptasteriaspolaris acervata.

3.3.9. Полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов из

Ceramaster pat agon icus.

3.3.10. Стероидный гексаол из Luidiaster dawsoni.

3.3.11. Гликозиды полигидроксистероидов из Mediaster murrayi.

3.3.12. Полярные стероидные соединения из Lethasterias nanimensis chelifera (курильская популяция, о. Шиашкотан).

3.3.13. Алкалоидостероиды и другие полярные стероидные соединения из Lethasterias nanimensis chelifera (курильская популяция, о. Онекотан).

3.3.14. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japonica (приморская популяция, залив Посьет).

3.3.15. Полярные стероидные соединения из Aphelasterias japonica (курильская популяция, о. Онекотан).

3.3.16. Гликозиды полигидроксистероидов из Asterias rathbuni.

3.3.17. Стероидные дисульфаты из Pterasterpulvillus.

3.4. Физиологическая активность окисленных стероидных соединений морских звезд.

3.4.1. Исследование гемолитических, эмбриотоксических и антимикробных свойств.

3.4.2. Влияние на активность (3-1,3-/>-глюканазы из кристаллического стебелька двустворчатого моллюска Spisula sachalinensis.

3.4.3 'Астеросапонин' Р^ каналообразующее действие на БЛМ, кардиотропный эффект.

3.4.4. Стимулирующие эффекты агликонов астеросапонинов на сердце моллюска Spisula sachalinensis —.

3.4.5. Канцерпревентивное действие.

3.5. Биологические функции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах.

3.5.1. Распределение свободных стеринов, полигидроксистероидов и стероидных гликозидов в различных частях тела морской звезды Patina (= Asterina) pectinifera.

3.5.2. Сезонные изменения содержания полярных стероидов, включая полигидроксистероиды и родственные гликозиды, в органах пищеварения морской звезды Patiria (= Asterina) pectinifera.

3.5.3. Сходство полигидроксилированных стероидных соединений морских звезд с желчными спиртами и кислотами позвоночных и их возможные биологические функции.

3.6. Зависимость состава полярных стероидных соединений в морских звездах от места их обитания.

3.6.1. Сезонные изменения состава суммарных фракций полигидроксистероидов и родственных гликозидов в органах пищеварения морской звезды Patiria (= Asterina) pectinifera.

3.6.2. Географические вариации состава полярных стероидных соединений в морских звездах.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Класс морских звезд (Asteroidea), относящийся к типу иглокожих (Echinodermata), состоит из более чем 1500 видов. Свыше 100 видов морских звезд обитают в Японском, Охотском и Беринговом морях, причем здесь они являются ведущими видами в биоценозах. Многие морские звезды -хищники, они наносят существенный вред подводным плантациям моллюсков, а в тропиках и коралловым рифам. Поэтому в некоторых морских районах существует необходимость ограничения численности этих животных и их утилизации.

Морские звезды отличаются от других животных большим разнообразием стероидных соединений. В них присутствуют различные группы этих веществ, но особое внимание привлекают окисленные стероидные соединения, к которым относятся полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксистероидов, астеросапонины - стероидные олигогликозиды с пятью — шестью моносахаридными остатками, и другие родственные им вещества.

В основном интерес к окисленным стероидным соединениям морских звезд объясняется их разнообразной физиологической активностью. Экстракты морских звезд и индивидуальные вещества, выделенные из них, проявляют антивирусные, антимикробные, анальгетические, противовоспалительные, гипотензивные и другие биологические свойства. Окисленные стероиды играют определенную экологическую роль, являясь алломонами — веществами, отпугивающими многих морских животных: двустворчатых и брюхоногих моллюсков, морских ежей, лилий, актиний.

Кроме того, эти соединения часто имеют своеобразное химическое строение, значительно отличаясь от стероидных метаболитов наземных растений и животных. Изучением строения и свойств окисленных стероидных соединений морских звезд помимо нашей лаборатории (лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН) занимаются научно-исследовательские группы из университетов Неаполя (Италия), Сантьяго де Компостелла (Испания), Фукуоки (Япония) и ряда других стран, а статьи, посвященные этой теме, публикуются в ведущих научных журналах мира.

К началу 80-х гг., когда были начаты наши исследования, из окисленных стероидных соединений морских звезд были известны только высокополярные "классические" астеросапонины, для которых характерно наличие сульфатированного стероидного агликона с Д9( 11 ^двойной связью и Зр,6а-диольной группировкой.

Целью данной работы является изучение структур и биологической роли низкомолекулярных полярных стероидов, в основном, полигидроксистероидов (число гидроксильных групп в них колеблется от четырех до девяти), монозидов и биозидов полигидроксистероидов, дисульфатированных стероидов и близких к ним по полярности сульфатов и монозидов астерогенинов. Знание химического строения этих соединений может использоваться в дальнейшем для изучения строения и зависимости структура - активность для подобных стероидов, прогнозирования возможной физиологической активности новых соединений, выявления полезных свойств этих веществ и формирования предложений по их практическому использованию. Кроме того, результаты такого рода исследований важны для понимания биологических функций окисленных стероидов, а также изучения их экологической роли в морских биоценозах.

Задачами настоящей работы были:

- выделение большой серии новых полярных стероидов из морских звезд, установление их структуры и изучение их свойств, включая биологическую активность;

- изучение зависимости состава окисленных стероидных соединений морских звезд от места их обитания;

- изучение распределения окисленных стероидных соединений, в том числе полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, в различных частях тела морских звезд и сезонных изменений в содержании этих соединений с целью выяснения их биологической роли.

Научная новизна работы. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд было выделено 76 окисленных стероидных соединений. Установлено строение 50 новых соединений и проведена структурная идентификация 26 веществ с известными ранее веществами.

Впервые были выделены гликозиды полигидроксистероидов с (1—>5) и (1—>6) гликозидными связями в углеводных цепях, а также гликозиды, содержащие редкие моносахариды: галактофуранозу, 2,3-ди-О-метилксилопиранозу, 5 "бисульфат З-О-метиларабинофуранозу и 2-О-сульфат арабинофуранозу.

Впервые в окисленных стероидах морских звезд обнаружены необычные фрагменты: 23-кето-24-гидроксихолестановая, 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая и 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая боковые цепи, а также 24-гликозилированная 24,26-дигидроксихолестановая боковая цепь, сочетающая одновременно структурные признаки гликозидов и свободных полигидроксистероидов.

Найдена новая структурная серия стероидных соединений морских звезд, названных нами алкалоидостероидами. Эти соединения представляют собой ионные гибриды, состоящие из окисленного стероидного аниона и алкалоидного катиона.

Выполнены биологические испытания полигидроксистероидов и родственных гликозидов и показано, что они проявляют гемолитические и цитотоксические свойства. Установлено, что левискулозид L обладает канцерпревентивным действием, а 'астеросапонин' Pj и его десульфатированное производное способны формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Показано, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов могут активировать Р-1,3-D-глюканазу из моллюска Spisula sachalinensis, а некоторые астерогенины - оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска.

Изучено распределение полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в различных частях тела морской звезды. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных тканях животных, а полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов — только в органах пищеварения - желудке и пилорических выростах. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морской звезде. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, и их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из этого, а также на основании сходства их химического строения и свойств с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека сделано предположение, что одной из биологических функций полигидроксистероидных соединений является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у более высокоразвитых животных.

Изучены сезонные изменения в составе суммарной фракции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах, принадлежащих к одной популяции. Показано, что в течение года состав этих веществ является довольно постоянным, несмотря на незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одного и того же вида морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений у них различен и зависит от места сбора животных.

Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в научных журналах: Химия природных соединений; Биоорганическая химия; Известия Академии наук, серия химическая; Tetrahedron Letters; Journal of Natural Products (Lloydia); Comparative Biochemistry and Physiology, В. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликованы 53 работы, в том числе 33 научных статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам и функциям стероидных соединений морских звезд, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты, и Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал,

5. ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы выделения суммарных фракций и индивидуальных окисленных стероидных соединений из спиртовых экстрактов морских звезд. Они включают применение гидрофобной, гельпроникающей и адсорбционной колоночной хроматографии с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на прямой и обращенной фазах.

2. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд выделено 76 полярных стероидных соединений. Проведена структурная идентификация 26 соединений с известными веществами и установлено химическое строение 50 новых соединений, из них 11 полигидроксистероидов, 26 гликозидов полигидроксистероидов, 10 сульфатов и монозидов астерогенинов и 3 стероидных дисульфата.

3. Из морских звезд выделены представители новой группы стероидных солей, состоящих из стероидного аниона и алкалоидного катиона, названные нами алкалоидостероидами. Их строение было установлено.

4. Найдены и структурно изучены редкие в морских звездах стероидные гликозиды с (1—>5) и (1—>6) гликозидными связями между моносахаридными остатками. Впервые выделены гликозиды с остатками редких моносахаридов: галактофуранозы, 2,3-ди-(9-метилксилопиранозы, 5-0-сульфат 3-0-метиларабинофуранозы и 2-0-сульфат арабинофуранозы, а также с 24-0-гликозилированной 24,26-дигидрокси боковой цепью.

5. Впервые в полярных стероидах обнаружены такие структурные фрагменты как 23-кето-24-гидроксихолестановая, 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая и 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая боковые цепи.

6. Показано, что , гемолитическая и - цитотоксическая активности полигидроксистероидов и родственных веществ зависят от химической структуры, рН, температуры и ионной силы среды. Для 'астеросапонина* Р| обнаружен кардитонический эффект, характерный для сердечных растительных гликозидов. Получены данные о его способности формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Установлено, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов способны активировать р-1,3-/)-глюканазу из моллюска Spisula sachalinensis, а некоторые астерогенины оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска. У левискулозида G обнаружена способность тормозить канцерогенез, вызванный действием опухолевых промоторов.

7. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных частях тела морских звезд, в отличие от полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, найденных только в органах пищеварения - желудке и пилорических выростах.

8. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, а их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из полученных данных, а также на основании сходства химического строения и свойств полигидроксилированных стероидных соединений с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека высказано предположение, что одной из основных биологических функций этих веществ является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у позвоночных.

9. Показано, что в течение года состав низкомолекулярных полярных стероидов в морских звездах из одной и той же популяции остается довольно постоянным, хотя наблюдаются незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одних и тех же видов морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений может изменяться, и зависит от места их обитания. т я t ш

1. Жизнь животных // Ред. Зенкевич Л.А. М.: Просвещение. 1968. Т. 2. С. 247 -271.

2. Филимонова Г.Ф. Функциональная морфология пищеварительной системы иглокожих // Л.: Наука. 1979. С. 35 60.

3. Дьяконов A.M. Морские звезды морей СССР // М: Академия наук СССР. 1950. 103 с.

4. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Стероиды морских организмов // М.: Наука. 1988. 208 с.

5. Stonik V.A., Elyakov G.B. Secondary metabolites from Echinoderms as chemotaxonomic markers // Marine Bioorganic Chemistry / Ed. Scheuer P. Springer-Verlag: New York. 1988. V. 2. P. 43 86.

6. D'Auria M.V., Minale L., Riccio R. Polyoxygenated steroids of marine origin // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 1839 1895.

7. Minale L., Riccio R., Zollo F. Steroidal oligoglycosides and polyhydroxysteroids ^ from Echinoderms // Progress in the Chemistry of Organic Natural Products / Eds.

8. Herz H., Kirby G.W., Moore R.E., Steglich W., Tamm Ch. Springer-Verlag: New York. 1993. V. 62. P. 75 -308.

9. Kornprobst J.-M., Sallenave C., Barnathan G. Sulfated compounds from marine organisms // Сотр. Biochem. Physiol. 1998. V. 119B. N 1. P. 1 51.

10. Iorizzi M., De Marino S., Zollo F. Steroidal oligoglycosides from the Asteroidea // Curr. Org. Chem. 2001. V. 5. P. 951 973.

11. Стоник В.А. Морские полярные стероиды // Успехи химии. 2001. Т. 70. № 8. С. 763 807.

12. Bergman W. Sterols: their structure and distribution // Comparative Biochemistry / Eds. Florkin M., Mason H.S. Academic Press: New York. 1962. V. 3. P. 103 162.

13. Gupta K.C., Scheuer P.J. Echinoderm sterols // Tetrahedron. 1968. V. 24. N 17. P. щ 5831 5837.

14. Ballantine J.A., Lavis A., Morris R.J. Sterols of some oceanic holothurians // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1981. V. 53. N 1. P. 89 103.w

15. De Simone F., Dini A., Minale L., Riccio R., Zollo F. The sterols of the asteroid Echinaster sepositus // Сотр. Biochem. Physiol. 1980. V. 66B. N 3. P. 351 357.

16. D'Auria M.V., Finamore E., Minale L., Pizza C., Riccio R., Zollo F., Pusset M., Tirard P. Steroids from the starfish Euretaster insignis: a novel group of sulphated 3(3,21 -dihydroxy-steroids // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1984. N 10. P. 2277 -2282.

17. Goad L.J., Rubinstein I., Smith A.G. The sterols of echinoderms // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1972. V.180. P. 223 246.

18. Goodfellow R.M., Goad L.J. The steryl sulphate content of echinoderms and some other marine invertebrates // Сотр. Biochem. Physiol. 1983. V. 76B. N 3. P. 575 -578.

19. Han Y.H., Ham J.H., Lee N.J., Park C.H., Shin Y.H., Lee D.U. Antimutagenic activity of 5a-cholest-7-en-3p-ol, a new component from the starfish Asterina pectinifera II Biol. Pharm. Bull. 2000. V. 23. N 10. P. 1247 1249.

20. Smith A.G., Goad L.J. Sterol biosynthesis in starfish Asterias rubens and Henricia sanguinolenta И Biochem. J. 1971. V. 123. P. 671 675.

21. Goad L.J. Sterol biosynthesis and metabolism in marine invertebrates // Pure Appl. Chem. 1981. V. 53. N4. P. 837 852.

22. Voogt P. A., Van Rheenen J.W.A. On the origin of the sterols in the sea star Asterias rubens II Сотр. Biochem. Physiol. 1976. V. 54B. N 4. P. 479 482.

23. Goad L.J. The sterols of marine invertebrates: composition, biosynthesis, and metabolites // Marine Natural Products. Chemical and Biological Perspectives / Ed. Scheuer P.J. Academic Press: New York. 1978. V. 2. P.76 173.

24. Teshima S.I., Kanazawa A. Biosynthesis of sterols in a starfish, Laiaster leachii II Сотр. Biochem. Physiol. 1975. V. 52B. N 2. P. 437 441.

25. Teshima S.I., Kanazawa A. Biosynthesis of sterols from mevalonate in a starfish, Coscinasterias acutispina II Bull. Jap. Soc. Scient. Fish. 1976. V. 42. N 7. P. 813 -818.

26. Sheikh Y.M., Djerassi C. Acanthasterol cyclopropane-contaning marine sterol from Acanthaster plancill J. Chem. Soc. 1971. N 11. P. 600 - 604.w

27. Kobayashi M., Mitsuhashi H. Structure and synthesis of amurosterol, a new marine sterol with unprecedent side chain, from Asterias amurensis Liitken // Tetrahedron. 1974. V. 30. N 14. P. 2147 2150.

28. Smith A.G., Rubinstein I., Goad L.J. The sterols of the echinoderm Asterias rubens II Biochem. J. 1973. V. 135. P. 443 455.

29. Burnell D.J., ApSimon J.W., Gilgan M.W. Seasonal and geografic variations of the sterols from the starfish Asterias vulgaris Verrill // Steroids. 1982. V. 39. N 4. P. 357-369.

30. Smith A.G., Goodfellow R., Goad L.J. Intermediacy of 3-oxosteroids in conversion of cholest-5-en-3P-ol into 5a-choIestane-3P-ol by starfish Asterias rubens and Poraniapulvillus II Biochom. J. 1972. V. 128. P. 1371 1372.

31. Smith A.G., Goad L.J. The conversion of cholest-5-en-3}-ol into cholest-7-en-3[}-ol by the echinoderms Asterias rubens and Solaster papposus II Biochem. J. 1975. V. 146. P. 35 40.

32. Goodfellow R.M., Goad L.J. Observations on the sterol sulphates and sterol esters of the echinoderm Asterias rubens II Biochem. Soc. Trans. 1973. V. 1. N 3. P. 759 -761.

33. Mackie A.M., Singh H.T., Owen J.M. Studies on the distribution, biosynthesis and function of steroidal saponins in echinoderms // Сотр. Biochem. Physiol. 1977. V. 56B.N1. P.9-14.

34. Mackie A.M., Singh H.T., Fletcher T.G. Studies on the cytolytic effects of seastar (Marthasterias glacialis) saponins and synthetic surfactants in the plaice Pleuronectesplatessa II Mar. Biol. 1975. V. 29. N 4. P. 307 314.

35. Itakura Y., Komori T. Structure elucidation of two new oligoglycoside sulfates, versicoside В and versicoside G // Liebigs Ann. Chem. 1986. N 2. P. 359-373.

36. Kamiya Y., Ikegami S., Tamura S. A novel steroid, 3p,6a,15a,24£,-tetrahydroxy-5a-cholestane from asterosaponins // Tetrahedron Lett. 1974. N 8. P. 655 658.щ>

37. Кича А.А., Калиновский А.И., Левина Э.В., Стоник В.А. Астеросапонин Р| из дальневосточной морской звезды Patiria pectinifera // Химия природ, соедин.1981. №5. С. 669-670.

38. Minale L„ Pizza С., Zollo F., Riccio R. 5a-Cholestane-3p,6p,15a,16p,26-pentol: а polyhydroxylated sterol from the starfish Hacelia attenuata II Tetrahedron Lett.1982. V. 23. N 17. P. 1841 1844.

39. Riccio R., Minale L., Pizza C., Zollo F., Pusset J. Structure of nodososide, a novel type of steroidal glycoside from the starfish Protoreaster nodosus II Tetrahedron Lett. 1982. V. 23. N 28. P. 2899 2902.

40. Riccio R., Minale L., Pagonis S., Pizza C., Zollo F., Pusset J. A novel group of highly hydroxylated steroids from the starfish Protoreaster nodosus II Tetrahedron. 1982. V. 38. N 24. P. 3615 3622.

41. Кича A.A., Калиновский А.И., Левина Э.В., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Полигидроксилированные стероиды из пищеварительных органов морской звезды Patiria pectinifera II Биоорган, химия. 1983. Т. 9. № 7. С. 975 977.

42. Kicha А.А., Kalinovsky A.I., Levina E.V., Stonik V.A., Elyakov G.B. Asterosaponin Pi from the starfish Patiria pectinifera 11 Tetrahedron Lett. 1983. V. 24. N36. P. 3893 3896.

43. De Riccardis F., Minale L., Riccio R., Giovannitti В., Iorizzi M., Debitus С. Phosphated and sulfated marine polyhydroxylated steroids from the starfish Tremaster novaecaledoniae II Gazz. Chim. Ital. 1993. V. 123. P. 79 86.

44. Finamore E., Minale L., Riccio R., Rinaldo G., Zollo F. Novel marine polyhydroxylated steroids from the starfish Myxoderma platyacanthum И J. Org. Chem. 1991. V. 56. N 3. P. 1146- 1153.

45. De Riccardis F., Minale L., Riccio R., Iorizzi M., Debitus C., Duhet D., Monniot C. A novel group of polyhydroxycholanic acid-derivatives from the deep-water starfish Styracaster caroli II Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. N 4. P. 4381 4384.

46. Андриященко П.В., Левина Э.В., Калиновский А.И. Стероидные соединения из дальневосточных морских звезд Luidia quinaria и Distolasterias elegans И Изв. АН. Сер. хим. 1996. № 2. С. 473 476.

47. Левина Э.В., Калиновский А.И., Андриященко П.В., Стоник В.А., Дмитренок П.С. Стероидные полиолы из дальневосточной морской звезды Henricia sanguinolenta И Изв. АН. Сер. хим. 2002. № 12. С. 2132 2134.

48. Riccio R., Iorizzi M., Minale L., Oshima Y., Yasumoto T. Novel steroidal glycoside sulphates from the starfish Asterias amurensis И J. Chem. Soc. Perkin Trans. I.

49. T 1988. N6. P. 1337- 1347.

50. De Marino S., Palagiano E., Zollo F., Minale L., Iorizzi M. A novel sulphated steroid with a 7-membered 5-oxalactone B-ring from an Antarctic starfish of the family Asteriidae // Tetrahedron. 1997. V. 53. N 25. P. 8625 8628.

51. Adam G., Marquardt V. Brassinosteroids // Phytochem. 1986. V. 25. N 8. P. 1787 -1799.

52. Levina E.V., Andriyaschenko P.V., Stonik V.A., Kalinovsky A.I. Ophiuroid-typesteroids in starfish of the genus Pteraster II Сотр. Biochem. Physiol. 1996. V. 114B.N LP. 49-52.

53. Levina E.V., Andriyaschenko P.V., Kalinovsky A.I., Stonik V.A. New ophiuroid-type steroids from the starfish Pteraster tesselatus II J. Nat. Prod. 1998. V. 61. N 11. P. 1423 1426.

54. Левина Э.В., Андриященко П.В., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Стероидные соединения из дальневосточной морской звезды Diplopteraster multiples // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. № 3. С. 215 219.

55. Shubina L.K., Fedorov S.N., Levina E.V., Andriyaschenko P.V., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Smirnov I.S. Comparative study on polyhydroxylated steroids from echinoderms // Сотр. Biochem. Physiol. 1998. V. 119B. N 3. P. 505 511.

56. Casapullo A., Finamore E., Minale L., Zollo F., Carre J.B., Debitus C., Laurent D., Folgore A., Galdiero F. New cytotoxic steroidal glycosides from the starfish Fromia monilis II J. Nat. Prod. 1993. V. 56. N 1. P. 105-115.

57. Pizza C., Minale L., Laurent D., Menou J.-L., Orstom C. Steroidal glycosides from the starfish Choriaster granulatus II Gazz. Chim. Ital. 1985. V. 115. P. 585-589.

58. De Riccardis F., Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Debitus C. The first occurrence of polyhydroxylated steroids with phosphate conjugation from the starfish Tremaster novaecaledoniae II Tetrahedron Lett. 1992. V. 33. N 8. P. 1097-1100.

59. Casapullo A., Finamore E., Minale L., Zollo F., Carre J.B., Debitus C., Laurent D., Folgore A., Galdiero F. New cytotoxic steroidal glycosides from the starfish Fromia monilis II J. Nat. Prod. 1993. V. 56. N 1. P. 105 115.

60. Wang W., Li F., Alam N., Liu Y., Hong J., Lee C.-K., Sik 1m K., Jung J.H. New saponins from the starfish Certonardoa semiregularis II J. Nat. Prod. 2002. V. 65. P.t* 1649- 1656.

61. Qi J., Ojika M., Sakagami Y. Linckosides A and B, two new neuritogenic steroid glycosides from the Okinawan starfish Linckia laevigata II Bioorgan. Med. Chem.2002. V. 10. P. 1961 1966.

62. Калиновский A.M., Левина Э.В., Стоник B.A., Дмитренок П.С., Андриященко П.В. Стероидные полиолы из дальневосточных морских звезд Henriciasanguinolenta и Henricia leviuscula leviuscula II 2003. Изв. АН. Сер. хим. 2004. № 2. (в печати).

63. Kitagawa I., Kobayashi M. Steroidal saponins from the starfish Acanthaster planci L. (Crown of thorns). (2). Structures of the major saponin thornasteroside A //

64. Chem. Pharm. Bull. 1978. V. 26. N 6. P. 1864 1873.

65. De Simone F., Dini A., Finamore E., Minale L., Pizza C., Riccio R., Zollo F. Structure of sepositoside A, a novel steroidal cyclic glycoside from the starfish Echinaster sepositus II J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1981. N 7. P. 1855 1862.

66. Riccio R., Dini A., Minale L., Pizza C., Zollo F., Sevenet T. Structure of lusonicoside A, further steroidal cyclic glycoside from the Pacific starfish

67. Echinaster luzonicus II Experientia. 1982. V. 23. N 38. P. 68 70.

68. Iorizzi M., de Riccardis F., Minale L., Riccio R. Chemical constituents from the starfish Echinaster brasiliensis И J. Nat. Prod. 1993. V. 56. N 12. P. 2149-2162.

69. De Marino S., Minale L., Zollo F., Iorizzi M., Le Bert V., Roussakis C. Cytotoxic asterosaponins from an Antarctic starfish of the family Echinasteridae // Gazz. Chim. Ital. 1996. V. 126. P. 667 672.

70. Ikegami S., Kamiya Y., Tamura S. A new sterol from asterosaponins A and В // Tetrahedron Lett. 1972. N 16. P. 1601 1604.

71. Sheikh Y.M., Tursch B.M., Djerassi C. 5a-Pregn-9(l l)-ene-3p,6a-diol-20-one and 5a-cholesta-9(ll),20(22)-diene-3p,6a-diol-23-one. Two novel steroids from the starfish Acanthaster planci II J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. N 4. P. 3278 3280.

72. ApSimon J.W., Eenkhoorn J.A. Synthesis of 3p,6a-dihydroxy-5a-pregn-9(ll)-en-T 20-one, the major sapogenin of the starfish Asterias forbesi И Can. J. Chem. 1974.

73. V. 52. N 12. P. 4113 -4116.

74. Iorizzi M., Riccio R. Naturally occurring glycosides // Steroidal Olygoglycosides From Marine Sources / Ed. Ikan R. John Wiley & Sons Ltd. 1999. P. 41 68.

75. Turner A.B., Smith D.S.H., Mackie A.M. Characterization of the principal steroidal saponins of the starfish Marthasterias glacialis: structures of the aglycones // Nature. 1971. V. 233. N 5316. P. 209 210.

76. Riccio R., Pizza C., Squillace-Greco O., Minale L. Steroidal glycoside sulphates from the starfish Ophidiaster ophidianus (Lamarck) and Hacelia attenuata (Gray) // Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1985. N 4. P. 655 660.1. T*

77. Riccio R., Iorizzi M., Minale L. Isolation of sixteen steroidal glycosides and three polyhydroxysteroids from the mediterranean starfish Coscinasterias tenuispina И Bull. Soc. Chim. Belg. 1986. V. 95. N 9-10. P. 869 893.

78. Riccio R., Iorizzi M., Minale L., Oshima Y., Yasumoto T. Novel steroidal glycoside sulphates from the starfish Asterias amurensis II J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1988. N6. P. 1337- 1347.

79. Riccio R., Zollo F., Finamore E., Minale L., Laurent D., Bargibant G., Pusset J. A novel steroidal glycoside sulfate from the starfishes Protoreaster nodosus and Pentaceraster alveolatus II J. Nat. Prod. 1985. V. 48. N 2. P. 266 272.

80. Okano K., Ohkawa N., Ikegami S. Structure of ovarian asterosaponin-4, an inhibitor of spontaneous oocyte maturation from the starfish Asterias amurensis II Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. N 9. P. 2823 2826.

81. T 84. Fujimoto Y., Yamada Т., Ikekawa N., Nishiyama I., Matsui Т., Hoshi M. Structureof acrosome reaction-inducing steroidal saponins from the egg jelly of the starfish, Asterias amurensis И Chem. Pharm. Bull. 1987. V. 35. N 5. P. 1829 1832.

82. Itakura Y., Komori T. Steroid oligoglycosides from the starfish Acanthaster planci L., 3. Structures of four new oligoglycoside sulfates // Liebigs Ann. Chem. 1986. N 3.P. 499-508.

83. Riccio R., Iorizzi M., Squillace-Greco O., Minale L., Debray M., Menou J.L. Asterosaponins from the starfish Halityle regularis: a novel 22,23-epoxysteroidal glycoside sulfate II J. Nat. Prod. 1985. V. 48. N 5. P. 756 765.

84. Komori Т., Matsuo J., Itakura Y., Sakamoto K., Ito Y., Taguchi S., Kawasaki T. Steroid oligoglycosides from the starfish Acanthaster planci L., 1. Isolation and structure of the oligoglycoside sulfates // Liebigs Ann. Chem. 1983. N 1. P. 24 36.

85. Burnell D.J., ApSimon J.W., Gilgan M.W. Variations in the levels of asterone and asterogenol, two steroids from the saponins of the starfish, Asterias vulgaris (Verrill) // Steroids. 1984. V. 44. N 1. P. 67 76.

86. Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Yasumoto T. Steroidal oligoglycosides from the starfish Distolasterias nipon II J. Nat. Prod. 1993. V. 56. N 10. P. 1786 1798.

87. De Marino S., Iorizzi M., Zollo F., Amsler C.D., Greer S.P., McClintock J.B. Three new asterosaponins from the starfish Goniopecten demonstrans II Eur. J. Org. Chem. 2000. N 24. P. 4093 4098.

88. De Riccardis F., Minale L., Riccio R., Goivanniti В., Iorizzi M., Debitus C. Phosphated and sulfated marine polyhydroxylated steroids from the starfish Tremaster novaecaledonia I I Gazz. Chim. Ital. 1993. V. 123. N 2. P. 79 86.

89. Finamore E., Zollo F., Minale L., Yasumoto T. Steroidal glycoside sulfates and polyhydroxysteroids from Aphelasterias japonica II J. Nat. Prod. 1992. V. 55. N 6. P. 767-772.

90. Левина Э.В., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Биосинтез гликозидов морской звезды

91. Patiria pectinifera П IV Всесоюзный коллоквиум по иглокожим. Тбилиси. Тезисы докл. 1979. С. 124 126.

92. Burnell D.J., ApSimon J.W. Echinoderms saponins // Marine Natural Products. Chemical and Biological Perspectives / Ed. Scheuer P.J. Academic Press: New York. 1983. V. 5. P. 287-389.

93. Teshima S.I., Fleming R., Gaffney J., Goad L.J. Studies on steroids metabolism in the echinoderm Asterias rubens II Marine Natural Products Chemistry / Eds. Faulkner D.J., Fenical W;H. Plenum Press: New York. 1977. P. 133 146.

94. Капустина И.И., Стоник В .А., Левина Э.В. Биосинтез астеросапонинов из холестерина и других стеринов в условиях in vitro гомогенатами гонад и печени морских звезд // Химия природ, соедин. 1985. № 5. С. 663 667.

95. Findlay J.A., Не Z.-Q., Blackwell В. Minor saponins from the starfish Asterias forbesill Can. J. Chem. 1990. V. 68. N 7. P. 1215 1217.

96. Finamore E., Minale L., Riccio R., Rinaldo G., Zollo F. Novel marine polyhydroxylated steroids from the starfish Myxoderma platyacanthum И J. Org.

97. T Chem. 1991. V. 56. N3. P. 1146 1153.

98. Vazquez M.J., Quinoa E., Riguera R., San Martin A., Darias J. Santiagoside, the first asterosaponin from an Antarctic starfish (Neosmilaster georgianus) II Tetrahedron. 1992. V. 48. N 32. P. 6739 6746.

99. Higuchi R., Fujita M., Matsumoto S., Yamada K., Miyamoto Т., Sasaki T. Isolation and structure of four new steroid glycoside di-O-sulfates from the starfish

100. T Asteropecten latespinosus II Leibigs Ann. Chem. 1996. N 5. P. 837 840.

101. Y 105. Diaz de Vivar M.E., Maier M.S., Seldes A.M. Labidiasteroside A, a novel saponinfrom the Antartic starfish Labidiaster annulatus II Molecules. 2000. V. 5. P. 350 -351.

102. Chludil H.D., Seldes A.M., Maier M.S. Antifungal steroidal glycosides from the Patagonian starfish Anasterias minuta: structure — activity correlations // J. Nat. Prod. 2002. V. 65. N 2. P. 153 157.

103. Findlay J.A., He Z.-Q., Jaseja M. Forbeside E: a novel sulfated sterol glycosidewfrom Asterias forbesi II Can. J. Chem. 1989. V. 67. N 12. P. 2078 2080.

104. Findlay J.A., He Z.-Q. Novel sulfated sterol glycosides from Asterias forbesi II J. Nat. Prod. 1990. V. 53. N 3. P. 710 712.

105. Palagiano E., Zollo F., Minale L., Iorizzi M., Bryan P., McClintock J., Hopkins T. Isolation of 20 glycosides from the starfish Henricia downeyae, collected in the gulf of Mexico // J. Nat. Prod. 1996. V. 59. N 4. P. 348 354.

106. Krebs H. Chr. Recent developments in the field marine natural products with emphasis on biologically active compounds // Progress in the Chemistry of Organic

107. Natural Products / Eds. Herz W., Griesebach H., Kirby G.W., Tamm Ch. Springer:

108. New York. 1986. V. 49. P. 151-178.

109. Habermehl G.G., Krebs H. Chr. Toxins of echinoderms. // Studies in Natural Products Chemistry / Ed. Atta-Ur-Rahman Elsevier Publishers: Amsterdam. 1990. V. 7. P. 265 289.

110. Mackie A.M. Avoidance reactions of marine invertebrates to either steroid glycosides of starfish or synthetic surface-active agents // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1970. V. 5.P. 63 -69.

111. Bryan P.J., McClintock J.B., Hopkins T.S. Structural and chemical defenses ofiechinoderms from the northern Gulf of Mexico // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1997. V. 210. N2. P. 173 186.

112. Rio G.J., Stempien M.F.Jr., Nigrelli R.F., Ruggieri G.D. Some biochemical and physiological properties of toxins from several species of Asteroidea // Toxicon. 1965. V. 3.N2. P. 147 155.

113. Hashimoto Y., Yasumoto T. Confirmation of saponin as a toxic principle of starfish // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1960. V. 26. N 11. P. 1132 1138.

114. Baslow M.H. Echinodermata (starfish, sea urchins and sea cucumbers) // Marine Pharmacology / Eds. Williams K., Wilkins A. Baltimore. 1969. P. 171 177.

115. Andersson L., Lidgren G., Bohlin L., Magni L., Ogren S., Afzelius L. Studies of Swedish marine organisms. I. Screening of biological activity // Acta Pharm. Suec. 1983. V. 20. N6. P. 401 -414.

116. Owellen R.J., Owellen R.G., Goroc M.A., Klein D. Cytolytic saponin fraction from Asterias vulgaris И Toxicon. 1973. V. 11. P. 319 323.

117. Yasumoto Т., Watanabe Т., Hashimoto Y. Physiological activities of starfish saponin // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1964. V. 30. N 4. P. 357 364.

118. Fusetani N., Kato Y., Hashimoto K. Biological activities of asterosaponins with special reference to structure activity relationships // J. Nat. Prod. 1984. V. 47. N 6. P. 997 - 1002.

119. Nigrelli R.F., Stempien M.F.Jr., Ruggieri G.D., Liguori V.R., Cecil J.T. Substances of potential biomedical importance from marine organisms // Fed. Proc. 1967. V. 26. N4. P. 1197- 1205.

120. Pettit G.R., Day J.F., Hartwell J.L., Wood H.B. Antineoplastic components of marine animals// Nature. 1970. V. 227. N 5261. P. 962 967.

121. Komori Т. Toxins from the starfish Acanthaster planci and Asterina pectinifera И Toxicon. 1997. V. 35. N 10. P. 1537 1548.

122. Аминин Д.Л., Анисимов М.М., Мокрецова Н.Д., Стригина Л.И., Левина Э.В. Влияние тритерпеновых и стероидных гликозидов на овоциты, яйца и эмбрионы голотурии Stichopus japonicus и морского ежа Strongylocentrotus nudus II Биол. Моря. 1986. № 3. С. 49 52.

123. Bryan P.J., Rittschof D., McClintock J.B. Bioactivity of echinoderm ethanolic body-wall extracts: an assessment of marine bacterial attachment and macroinvertebrate larval settlement// J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1996. V. 196. N 1-2. P. 79 96.

124. Minale L., Pizza C., Riccio R., Zollo F. Steroidal glycosides from starfishes // Pure ^ Appl. Chem. 1982. V. 54. N 10. P. 1935 1950.

125. Webber H.H., Ruggieri G.D. Food-drugs from the sea // Marine Technology Soc. Washington, D.C. 1976. P. 354 365.

126. Choi D.H., Shin S., Park I.K. Characterization antimicrobial agents extracted from Asterinapectinifera II Int. J. Antimicrobial agents. 1999. V. 11. N 1. P. 65 68.

127. Andersson L., Bohlin L., Iorizzi M., Riccio R., Minale L., Moreno-Lopez W. ^ Biological activity of saponins and saponin-like compounds from starfish andbrittle-stars // Toxicon. 1989. V. 27. N 2. P. 179 188.

128. Lindgren G., Andersson L., Bohlin L. Stuides of Swedish marine organisms // Acta Pharm. Suec. 1985. V. 22. N 5. P. 351 356.

129. Andersson L., Bohlin L., Riccio R., Minale L. Three novel minor polyhydroxylated steroidal glycosides from the starfish Crossaster papposus L // J. Chem. Res. (S). 1987. P. 246.

130. Ukai K., Iwanaga A., Nagai H., Namikoshi M. Prevention by polyhydroxysteroids and saponins ofpectinifera of the desquamation of the stratum corneum cells // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. N4. P. 913 915.

131. Garneau F.X., Harvey C., Simard J.L., ApSimon J.W., Burnell D.J., Himmelman J.H. The distribution of asterosaponins in various body components of the starfish Leptasterias polaris И Сотр. Biochem. Physiol. 1989. V. 92B. P. 411 416.

132. Yamaguchi M. Coral-reef asteroids of Guam // Biotropica. 1975. N 7. P. 12-23.

133. Lucas J.S., Hart R.J., Howden M.E., Salathe R. Saponins in eggs and larvae of Acanthaster planci (L.) (Asteroidea) as chemical defenses against planktivorous fish

134. T //J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1979. V. 40. P. 155 165.

135. Ikegami S. Role of asterosaponin A in starfish spawning induced by gonad

136. T" stimulating substance and 1-methyladenine H J. Exp. Zool. 1976. V. 198. N 3. P.359.366.

137. Ikegami S., Kamiya Y., Shirai H. Characterization and action of meiotic maturation inhibitors in starfish ovary // Exp. Cell Res. 1976. V. 103. N 2. P. 233 236.

138. Yasumoto Т., Tanaka M., Hashimoto Y. Distribution of saponin in echinoderms 11 Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1966. V. 32. N 5. P. 673 676.

139. Kanatani H., Ikegami S., Shirai H., Oide H., Tamura S. Purification of gonadstimulating substance obtained from radial nerves of starfish Asterias amurensis // Develop. Growth Diff. 1971. V. 13. N 3. P. 151-155.

140. Kanatani H. Induction of spawning and oocyte maturation by 1-methyl-adenine in starfishes // Exp. Cell Res. 1969. V. 57. N 2-3. P. 333 338.

141. Kanatani H., Shirai H. Mechanism of starfish spawning. 2. Some aspects of action of a neural substance obtained from radial nerve // Biol. Bull. 1969. V. 137. N 2. P. 297-301.

142. Mita M. 1-Methyladenine: a starfish oocyte maturation-inducing substance // Zygote. 2000. V. 8.P.S9-S11.

143. Uno Y., Hoshi M. Separation of sperm agglutinin and acrosome reaction inducing substance in egg jelly of starfish // Science. 1978. V. 200. N 4337. P. 58 - 59.

144. Ikegami S., Tamura S., Kanatani H. Starfish gonad: action and chemical identification of spawning inhibitor // Science. 1967. V. 158. N 3804. P. 1052 -1053.

145. Ikegami S., Tamura S. Spawning inhibitor in gonads of starfish Asterina pectinifera //Agric. Biol. Chem. 1972. V. 36. N 11. P. 1899 1903.

146. Voogt P.A., Huiskamp R. Sex-dependence and seasonal variations of saponins in the gonads of the starfish Asterias rubens: relation to reproduction // Сотр.

147. T Biochem. Physiol. 1979. V. 62A. P. 1049 1055.

148. Burns B.G., Logan V.H., Burnell J., ApSimon J.W. Estimation of a steroid released from the crud saponins of the starfish Asterias vulgaris by solvolysis: seasonal and geographic abundance // Anal. Biochem. 1977. V. 81. P. 196 208.

149. Schoenmakers H.J.N. In vitro biosynthesis of steroids from cholesterol by the ovaries and pyloric caeca of the starfish Asterias rubens II Сотр. Biochem. Physiol.1. T 1979. V.63B. P. 179-84.

150. Schoenmakers H.J.N., Voogt P.A. In vitro biosynthesis of steroids from progesterone by the ovaries and pyloric caeca of the starfish Asterias rubens II Gen. Сотр. Endocrinol. 1980. V. 41. P. 408 16.

151. Livingstone D.R. Cytochrome P-450 and oxidative metabolism in invertebrates // Biochem. Soc. Trans. 1990. V. 18. P. 15 19.

152. Den Besten P.J., Herwig H.J., Donselaar E.G., Van Livingstone D.R. Cytochrome P-450 monooxygenase system and benzoa.pyrene metabolism in echinoderms // Mar. Biol. 1990. V. 107. P. 171 177.

153. Ikegami S., Kamiya Y., Tamura S. New sterol from asterosaponins A and В // Tetrahedron Lett. 1972. N 16. P. 1601 1604.

154. Ikegami S., Okano K., Muragaki H. Structure of glycoside B2, a steroidal saponin in the ovary of the starfish, Asterias amurensis И Tetrahedron Lett. 1979. N 20. P. 1769- 1772.

155. Ikegami S., Kamiya Y., Tamura S. Isolation and characterization of spawning inhibitors in ovary of starfish, Asterias amurensis // Agric. Biol. Chem. 1972. V. 36. N6. P. 2005-2012.

156. Okano K., Ikegami S. Separation of ovarian asterosaponins in the starfish Asterias amurensis II Agric. Biol. Chem. 1981. V. 45. N 3. P. 801 803.

157. Кича A.A., Калиновский А.И., Левина Э.В., Рашкес Я.В., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Новый стероидный гликозид из морской звезды Patiria pectinifera II Химия природ, соедин. 1985. № 3. С. 356 361.

158. Кича А.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Новый высокогидроксилированный стероидный гликозид из морской звезды Leptasterias polaris acervata II Изв. АН. Сер. хим. 1995. № 6. С. 1164 1165.

159. Кича А.А., Калиновский А.И., Иванчина Н.В., Елькин Ю.Н., Стоник В.А. Полигидроксистероиды из дальневосточной морской звезды Ctenodiscus crispatus II Изв. АН. Сер. хим. 1994. № 10. С. 1821 1825.

160. Кича А.А., Калиновский А.И., Андриященко П.В., Левина Э.В. Кулыдитозиды С2 и Сз из морской звезды Culcita novaeguineae II Химия природ, соедин. 1985. № 5. С. 592 096.

161. Кича А.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1989. № 5. С. 669 673.

162. Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Ivanchina N.V., Stonik V.A. New steroid glycosides from the deep-water starfish Mediaster murrayi // J. Nat. Prod. 1999. V. 62. N 2. P. 279-282.

163. Кича A.A., Калиновский А.И., Левина Э.В. Полигидроксилированные стероиды из морской звезды Patiria pectinifera II Химия природ, соедин. 1984. №6. С. 738-741.

164. Кича А.А., Иванчина Н.В., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В .А. "Астеросапонин" Р2 из дальневосточной морской звезды Patiria (Asterina) pectinifera И Изв. АН. Сер. хим. 2000. № 10. С. 1818 1820.

165. Dmitriev В.А., Backinovsky L.A., Chizhov O.S., Zolotarev B.M., Kochetkov N.K. Gas-liquid chromatography and mass-spectrometry of aldononitrile acetates and partially methylated aldononitrile acetates // Carbohyd. Res. 1971. V. 19. N 3. P. 432 -438.

166. Шашков A.C., Чижов O.C. Спектроскопия |3С ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорган, химия. 1976. Т. 2. № 4. С. 437 496.

167. Hakomori S. A rapid permethylation of glycolipid and polysaccharide catalyzed by methylsulfinil carbanion in dimethyl sulfoxide // J. Biochem. (Tokyo). 1964. V. 55. N1. P. 205 208.

168. Delseth C., Kashman Y., Djerassi C. Ergosta-5,7,9(ll),22-tetraen-3(3-ol and its 24Z-ethyl homolog, 2 new marine sterols from the red-sea sponge Biemna-fortis И Helv. Chim. Acta. 1979. V. 62. N 6. P. 2037 2045.

169. Harrison I.T., Tokes L., Riegl J. Screening method for compounds with a particular carbon skeleton in biological samples // Chem. and Ind. 1976. N 6. P. 219 220.

170. Koisumi N., Fujimoto Y., Takeshita Т., Ikekawa N. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of 24-substituted steroids // Chem. Pharm. Bull. 1979. V. 27. N 1. P. 38 -42.

171. Eggert H., Van Antwerp C.L., Bhacca N.S., Djerassi C. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of hydroxy steroids // J. Org. Chem. 1976. V. 41. N 1. P. 71 -78.

172. Vanderah D.J., Djerassi С. Marine natural-products synthesis of four naturally occurring 20-p-H cholanic acid-derivatives // J. Org. Chem. 1978. V. 43. N 7. P. 1442 - 1448.

173. De Correa R.S., Riccio R., Minale L., Duque C. Starfish saponins, part 21: steroidalчglycosides from the starfish Oreaster reticularis. II J. Nat. Prod. 1985. V. 48. N 5. P. 751 755.

174. Cho Y., Higuchi R., Marubayashi N., Ueda I., Komori T. Crystallographic analysis of disulfated asterosaponin-Pl isolated from the starfish Asterina pectinifera // Leibigs Ann. Chem. 1992. N 1. P. 79 81.

175. Van Antwerp C.L., Eggert H., Meakins G.D., Miners J.O., Djerassi C. Additivity relationships in carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of dihydroxy steroids //J. Org. Chem. 1977. V. 42. N 5. P. 789 793.

176. Yamada Y., Suzuki S., Iguchi K., Kikuchi H., Tsukitani Y., Horiai H., Nakanishi H. New polyhydroxylated sterols from the soft coral Lobophytum pauciflorum (Ehrenberg) II Chem. Pharm. Bull. 1980. V. 28. N 2. P. 473 478.

177. Ritchie R.G.S., Cyr N., Korsch В., Koch H.J., Perlin A.S. Carbon-13 chemical shifts of furanosides and cyclopentanols. Configurational and conformational influences // Can. J. Chem. 1975. V. 53. N 10. P. 1424 1433.

178. Изучение строения L-арабинанов из корней алтея лекарственного Althaeaofficinalis L. и коры ивы белой Salix alda L. методом 13С-ЯМР // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. № 2. С. 240 245.

179. Tori К., Seo S., Yoshimura Y., Nakamura M., Tomita Y., Ishii H. C-13 NMR-speetra of saikosaponins A, C, D and F isolated from Bupleurum-falcatum L // Tetrahedron Lett. 1976. N 46. P. 4167 4170.

180. Usui Т., Yamaoka N., Matsuda K., Sugiyama H., Tuzimura K., Seto S. C-13 Nuclear magnetic-resonance spectra of glucobioses, glucotrioses, and glucans // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. 1973. N 20. P. 2425 2432.

181. Tory K., Seo S., Yoshimura Y., Arita H., Tomita Y. Glycosidation shifts in carbon-13 NMR spectroscopy: carbon-13 signal shifts from aglycone and glucose to glucoside // Tetrahedron Lett. 1977. N 2. P. 179 182.

182. Riccio R., D'Auria M.V., Iorizzi M., Minale L., Laurent D., Duhet D. Steroidal glycosides from the starfish Gomophia watsoni II Gazz. Chim. Ital. 1985. V. 115. N 8. P. 405 409.

183. D'Auria M.V., Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Uriarte E. Structure of two new steroidal glycoside sulfates (miniatosides A and B) and two new polyhydroxysteroids from the starfish Patiria miniata II J. Nat. Prod. 1990. V. 53. N l.P. 94-101.

184. Minale L., Pizza C., Plomitallo A., Riccio R., Zollo F., Mellon F.A. Sulphated steroid glycosides from the starfish Hacelia attenuata II Gazz. chim. ital. 1984. V. 114.N3.P. 151-158.

185. Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Debray M., Menou J.L. Steroidal glycosides from the starfish Halityle regularis II J. Nat. Prod. 1986. V. 49. N 1. P. 67 78.

186. Рашкес Я.В., Кича A.A., Левина Э.В., Стоник В.А. Масс-спектры полиоксистероидов из морской звезды Patiria pectinifera II Химия природ, соедин. 1985. № 3. С. 361 367.

187. Зарецкий В.И., Вульфсон Н.С., Заикин В.Г., Паперная И.Б. Определение положения двойной связи в некоторых стероидных системах методом осколочной масс-спектрометрии // Химия природ, соедин. 1967. № 6. С.383 -391.

188. Якубов Н.И., Рашкес Я.В., Пальянц Н.Ш. Фрагментация неэте-рифицированного углеводного звена карденолидов. Монозиды // Химия природ, соедин. 1983. № 3. С. 345 354.

189. Кича А.А., Калиновский А.И., Левина Э.В., Андриященко П.В. Кульцитозид С| из морских звезд Culcita novaeguineae и Linckia guildingi II Химия природ, соедин. 1985. № 6. С. 801 804.

190. Gorin P.A.J., Mazurek М. С-13 and proton nuclear magnetic-resonance studies on methyl aldofuranosides and their 0-alkyl derivatives // Carbohyd. Res. 1976. V. 48. N2. P. 171 186.

191. Minale L., Pizza C., Riccio R., Zollo F. A novel 24-0-gIycosidated steroid from the starfish Hacelia attenuata И Experientia. 1983. V. 39. N 6. P. 567 569.

192. Minale L<, Pizza C., Riccio R., Zollo F. Further 24-0-glycosidated steroid from thestarfish Hacelia attenuata II Experientia. 1983. V. 39. N 6. P. 569 571.

193. Кича A.A., Калиновский А.И., Стоник В.А. Минорные полиоксистероиды из морской звезды Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1990. № 2. С. 218-221.

194. Кича А.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 257 260.

195. Кича А.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидный гексаол из Crossaster papposus II Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 432 433.

196. Левина Э.В., Калиновский А.И., Андриященко П.В., Кича А.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Echinaster sepositus II Химия природ, соедин. 1987. №2. С. 246-249.

197. Калиновский А.И., Мальцев И.И., Антонов А.С., Стоник В.А. Изучение структуры гликозидов голотурий методом спектроскопии 13С ЯМР // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. № 12. С. 1655 1663.

198. Wright J.L.C., Мс Innes A.G., Shimizu S., Smith D.G., Walter J.A., Idler D., Khalil W. Identification of C-24 alkyl epimers of marine sterols by l3C nuclear magnetic resonance spectroscopy // Can. J. Chem. 1978. V. 56. N 14. P. 1898 1903.

199. Zollo F., Finamore E., Minale L. Novel polyhydroxysteroids and steroidal glycosides from the starfish Sphaerodiscus placenta II J. Nat. Prod. 1987. V. 50. N 5. P. 794 799.

200. Кича A.A., Калиновский А.И., Горбач (Иванчина) Н.В., Стоник В.А. Новые полиоксистероиды из дальневосточной морской звезды Henricia sp. // Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 249 253.

201. Кича А.А., Калиновский А.И. Выделение лаевиусколозида G из морской звезды Henricia derjugini и коррекция структуры эхинастерозидов Bi и В2 // Химия природ, соедин. 1993. № 4. С. 619 620.

202. Zollo F., Finamore Е., Minale L. Two novel steroidal glycoside sulphates from the starfish Echinaster sepositus И Gazz. Chim. Ital. 1985. V. 115. P. 303 306.

203. Riccio R., Iorizzi M., Squi 1 lace-Greco O., Minale L., Laurent D., Barbin Y. Steroidal glycosides from the starfish Poraster superbus II Gazz. Chim. Ital. V. 115. P. 505 -509.

204. Кича A.A., Калиновский А.И., Иванчина H.B., Стоник В.А. Стероидные гликозиды из морской звезды Solaster dawsoni verrill II Изв. АН. Сер. хим.1993. №5. С. 980-982.

205. Minale L., Pizza С., Riccio R., Squillace-Greco О., Zollo F., Pusset J., Menou J.L. New polyhydroxylated sterols from the starfish Luidia maculata II J. Nat. Prod. 1984. V. 47. N5. P. 784-789.

206. Riccio R., Santaniello M., Squillace Greco O., Minale L. Structure elucidation of (22£,247?,25i?)-24-methyl-5a-cholest-22-ene-3p,4p,5,6a,8,14,15a,25,26-nonaol

207. T and (22£,24iS')-24-methyl-5a-cholest-22-ene-3p,4p,5,6a,8}14,15a,25,28-nonaol,minor marine polyhydroxysteroids isolated from the starfish Archaster typicus II J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1989. N 4. P. 823 826.

208. Komori Т., Sakamoto K., Matsuo J., Sanechika Y., Nohara Т., Ito Y., Kawasaki Т., Schulten H.-R. Biologically active glycosides from the starfish Acanthaster planei L. and Luidia maculata M. et T. //Tetrahedron Lett. 1979. N 41. P. 120 123.

209. Riccio R., Squillace Greco O., Minale L., Duhet D., Laurent D., Pusset J., Chauviere G., Pusset M. Steroidal glycosides from Pacific starfishes of the genus Nardoa И J. Nat. Prod. 1986. V. 49. N 6. P. 1141 1145.

210. Iorizzi M., Minale L., Riccio R. Steroidal oligoglycoside sulphates and polyhydroxysteroids from the starfish Asterina pectinifera И Gazz. Chim. Ital. 1990. V. 120. P.147 153.

211. Tsuda M., Schroepfer G. J. Jr. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of C27 sterol precursors of cholesterol II J. Org. Chem. 1979. V. 44. N 8. P. 1290 1293.

212. Zollo F., Finamore C., Martuccio C., Minale L. Steroidal glycosides from the starfish Pisaster giganteus //. J. Nat. Prod. 1990. V. 53. N 4. P. 1000 1005.

213. Кича A.A., Калиновский А.И., Стоник В.А. Новые полигидроксистероиды и стероидные гликозиды из дальневосточной морской звезды Ceramaster patagonicus II Изв. АН. Сер. хим. 1997. № 1. С. 190 195.

214. Капустина И.И., Калиновский А.И., Полоник С.Г., Стоник В.А. Новые астеросапонины из морской звезды Distolasterias nipon II Химия природ, соедин. 1987. № 2. С. 250 -255.

215. Riccio R., Minale L., Bano S., Ahmad V.U. Structure of a novel steroidaf 5-0-methyl galactofuranoside from the starfish Astropecten indicus II Tetrahedron Lett. 1987. V. 28. N 20. P. 2291 2294.

216. Кича A.A., Калиновский А.И., Иванчина H.B., Стоник В.А. Новый стероидный гексаол из дальневосточной морской звезды Luidiaster dawsoni II Изв. АН. Сер. хим. 1998. № 10. С. 2088 2090.

217. Micheel F., Klemer A., Chemie der zucker und polysaccharide // Leipzig: Akademische Verlagsgesellschaft, Geest & Portigk. G. 1956. P. 339 435.

218. Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Higa Т., Tanaka J. Steroidal glycosides and polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae И J. Nat. Prod. 1991. V. 54. N5. P. 1254- 1264.

219. Кича A.A., Калиновский А.И., Стоник В.А. Стероидные сульфаты из морской звезды Lethasterias nanimensis chelifera // Химия природ, соедин. 1991. № 4. С. 520 523.

220. Кича А.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Агликоны из гликозидов морской звезды Lethasterias nanimensis chelifera II Химия природ, соедин. 1992. № 1. С. 145- 146.

221. De Simone F., Dini A., Finamore E., Minale L., Pizza C., Riccio R. Sapogenins from the starfish Astropecten aurantiacus and Marihasterias glacialis I I Сотр. Biochem. Phisiol. 1979. V. 64B. P. 25 32.

222. Findlay J.A., Agarwal V.K. Aglycones from the saponin of the starfish Asterias vulgaris II J. Nat. Prod. 1983. V. 46. N 6. P. 876 888.

223. Itakura Y., Komori Т., Kawasaki Т. Steroid oligoglycosides from the starfish Asterias amurensis cf. Sladen, 1. Structural elucidation of a new olygoglycoside sulfate // Leibigs Ann. Chem. 1983. N 12. P. 2079 - 2091.

224. Veares M.P., Goad L.G., ApSimon J.W. Thornasterol A sulfate, a constituent of the starfish Asterias rubens II Сотр. Biochem. Physiol. 1988. V. 90B. N 1. P. 25 -28.

225. Honda M., Komori T. Structures of thornasterols A and В // Tetrahedron Lett. 1986. V. 27. N29. P. 3369-3372.

226. Ikegami S., Kamiya Y., Tamura S. A novel steroid, 3(i,6a,23£-trihydroxy-5a-cholest-9(ll)-en, from asterosaponins // Terahedron Lett. 1972. N 35. P. 3725 -3728.

227. Kicha A.A., Ivanchina N.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Alkaloidosteroids from the starfish Lethasterias nanimensis chelifera II Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. N 9. P. 1935 1937.

228. Ikegami S., Kamiya Y., Tamura S. A novel steroid conjugate, 5a-pregn-9(ll)-ene-3p,6a-diol-20-one-3-sulfate, from a starfish saponins, asterosaponin A. // Tetrahedron. 1973. V. 29. P. 1807-1810.

229. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A., Riguera R., Jimenez C. Hemolytic polar steroidal constituents of the starfish Aphelasterias japonica II J. Nat. Prod. 2000. V. 63. N 8. P. 1178 1181.

230. Кича А.А., Иванчина Н.В., Калиновский А.И:, Дмитренок П.С., Стоник В.А. Сульфатированные стероидные соединения из курильской популяции морской звезды Aphelasterias japonica И Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 4. С. 695 698.

231. Ivanchina N.V., Kicha А.А., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Hemolytic steroid disulfates from the Far Eastern starfish Pteraster pulvillus И J. Nat. Prod. 2003. V. 66. N 2. P. 298 301.

232. Sandler M., Bonham Carter S., Hunter K.R., Stern G.M. Tetrahydroisoquinoline alkaloids: in vivo metabolites of L-dofa in man // Nature. 1973. V. 241. P. 439 -443.

233. Rommelsbacher H., Susilo R. Tetrahydroisoquinolines and carbolines: Putative natural substances in plants and mammals // Progress in Drug Research / Ed. Jucker E. Basel: Birkhouser. 1985. V. 29. P. 415 459.

234. Liu Y.-M., Gordon P., Green S., Sweedler J.V. Determination of salsolinol enantiomers by gas chromatography mass spectrometry with cyclodextrin chiral columns // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 420. P. 81 - 88.

235. Li H., Matsunaga S., Fusetani N., Fujiki H., Murphy P.T., Willis R.H., Baker J.T. Echinoclasterol sulfate phenethylammonium salt, a unique steroid sulfate from the marine sponge, Echinoclathria subhispida //Tetrahedron Lett. 1993. V. 34. P. 5733 5736.

236. Tsukamoto S., Kato H., Hirota H., Fusetani N. Isolation of unusual 2-aminoimidazolium salt of steroid trisulfate from a marine sponge Topsentia sp. // Fish. Sci. 1997. V. 63. N 2. P. 310 312.

237. Bruno I., Minale L., Riccio R. Steroidal glycosides from the starfish Pycnopodia heliantoides //J. Nat. Prod. 1989. V. 52. N 5. P. 1022 1026.

238. Adachi J., Asano M., Ueno Y. Tetrahydro-P-carboline-3-carboxylic acids and contaminants of Z,-tryptophan // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 501 515.

239. Herderich M., Gutsche В. Tryptophan-derived bioactive compounds in food // Food Rev. Internat. 1997. V. 13. P. 103 135.

240. Turner E., Klevit R., Hager L.J., Shapiro B.M. Ovothiols, a family of redox-active mercaptohistidine compounds from marine invertebrate eggs // Biochem. 1987. V. 26. P. 4028 4036.

241. Pathirana C., Andersen RJ. Imbricatine, an unusual benzyltetrahydroisoquinoline alkaloid isolated from the starfish Dermasterias imbricata // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 8288 -8289.

242. Kobayashi M., Hayashi Т., Hayashi K., Tanabe M., Nakagawa Т., Mitsuhashi H. Polyhydroxysterols of the soft coral Sarcophyton glaucum: isolation and synthesis of 5a-cholestan-lp,3p,5,6p-tetrol // Chem. Pharm. Bull. 1983. V. 31. N 6. P. 1848 -1855.

243. Rashid A., Mackie W., Colquhoun I.J., Lamba D. Novel synthesis of monosulphated methyl a-D-galactopyranosides // Can. J. Chem. 1990. V. 68. N 7. P. 1122 1127.

244. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Prokof eva N.G., Stonik V.A. New steroid glycosides from the starfish Asterias rathbuni // J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N 7. P. 945 947.

245. Vazquez M.J., Quinoa E., Riguera R., San Martin A. Helianthoside from Heliaster helianthus, an asterosaponin with a СЗ'-sulphated pyranose // Can. J. Chem. 1993. V.71.N8.P. 1147-1151.

246. D'Auria M.V., Paloma L.G., Minale L., Riccio R., Zampella A. On the composition of sulfated polyhydroxysteroids in some ophiuroids and the structure determination of six new constituents // J. Nat. Prod. 1995. V. 58. N 2. P. 189 196.

247. Riccio R., D'Auria M.V., Minale L. Unusual sulfated marine steroids from the ophiuroid Ophioderma longicaudum II Tetrahedron. 1985. V. 41. N 24. P. 6041 -6046.

248. Roccatagliata A.J.; Maier M.S.; Seldes A.M. New sulfated polyhydroxysteroids from the Antarctic ophiuroid Astrotoma agassizii // J. Nat. Prod. 1998. V. 61. P. 370 -374.

249. Fedorov S.N., Levina E.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Sulfated steroids from Pacific brittle stars Ophiopholis aculeate, Ophiura sarsi and Stegophiura brachiactis И J. Nat. Prod. 1994. V. 57. N 12. P. 1631 1637.

250. Prokofeva N.G., Chaikina E.L., Kicha A.A., Ivanchina N.V. Biological activities of steroid glycosides from starfish // Сотр. Biochem. Physiol. 2003. V. 134B. N 4. P. 695-701.

251. Сова B.B., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров C.H., Елякова Л.А. Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность (3-1,3-глюканаз // Химия природ, соедин. 1994. № 5. С. 647 650.

252. Likhatskaya G.N., Kicha A.A. Channel-forming activity of asterosaponin Pi in the model lipid membranes // First Euro Conference on Marine Natural Products. Abstracts. Greece. 1997. P. 135.

253. Anderson J.M. Studies on the cardiac stomash of a starfish, Patiria miniata (Brandt) // Biol. Bull. Mar. Biol. Kab. Lab. Woods Hole. 1959. V. 117. N 2. P. 185 201.

254. Camacho Z., Brown J.R., Kitto G.B. Purification and properties of trypsin-like proteases from the starfish, Dermasterias imbricata // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. N 15. P. 3964-3972.

255. Seldes A.M., Gros E.G. Main sterols from the starfish Comasterias lurida // Сотр. Biochem. Physiol. 1985. V. 80B. P. 337 339.

256. Higuchi R., Noguchi Y., Komori Т., Sasaki T. *H NMR spectroscopy and biological activities of polyhydroxylated steroids from the starfish Asterina pectinifera Muller et Troschel // Liebigs Ann. Chem. 1988. N 12. P. 1185 1189.

257. Nishiyama I., Matsui Т., Fujimoto Y., Ikekawa N., Hoshi M. Correlation between the molecular-structure and the biological activity of CO-ARIS, a cofactor for acrosome reaction-inducing substance // Dev. Growth Differ. 1987. V. 29. P. 171 -176.

258. Касьянов В.Л., Медведева Л.А., Яковлев C.H., Яковлев Ю.М. Размножение иглокожих и двустворчатых моллюсков // М.: Наука. 1980. 207 с.

259. Hoshita Т. Bile alcohols and primitive bile acids // Sterols and bile acids / Eds. Danielsson H., Sjovall J. Elsevier: Amsterdam, New York, Oxford. 1985. P. 279 -302.

260. Borgstrom В., Barrowman A J., Lindstrom (Lund) M. Roles of bile acids in intenstinal lipid digation and absorption // Sterols and bile acids / Eds. Danielsson H., Sjovall J. Elsevier: Amsterdam, New York, Oxford. 1985. P. 405 426.

261. Физер Jl., Физер M. Стероиды // М.: Мир. 1964. С. 439 455.

262. Kuwabara М., Ushiroguchi Т., Kihira К., Kuramoto Т., Hoshita Т. Identification of bile alcohols in urine from healthy humans // J. Lipid Res. 1984. V. 25. N 54. P. 361 -368.

263. Kihira K., Yasuhara M., Kuramoto Т., Hoshita Т. New bile alcohols, 5a- and 50-dermophols from amphibians // Tetrahedron Lett. 1977. N 8. P. 687 690.

264. Anderson I.G., Haslewood G.A.D. Comparative studies of bile salts. 16-Deoxymyxinol, a second bile alcohol from hagfish // Biochem. J. 1969. V. 112. P. 763 765.

265. Хевтман Э. Биохимия стероидов//M.: Мир. 1972. 175 с.

266. Schoenmakers H.J.N. The variation of 3P-hydroxy steroid dehydrogenase activity of the ovaries and pyloric caeca of the starfish Asterias rubens during the annual reproductive cycle // J. Сотр. Physiol. 1980. V. 138. P. 27 30.

267. Voogt P.A., Broertjes J.J.S., Oudejans R.C.H.M. Vitellogenesis in sea star: physiological and metabolic implications // Сотр. Biochem. Physiol. 1985. V. 80A. P. 141 147.

268. Voogt P.A., Den Besten P.J., Jansen M. Steroid metabolism in relation to the reproductive cycle in Asterias rubens L // Сотр. Biochem. Physiol. 1991. V. 99B. P. 77 82.

269. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (Holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. V. 8. N 2. P. 235 248.

270. Iorizzi M., Minale L., Riccio R., Higa Т., Tanaka J. Steroidal glycosides and polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae II J. Nat. Prod. 1991. V. 54. N5. P. 1254- 1264.

271. Andersson L., Bano S., Bohlin L., Riccio R., Minale L. A novel bioactive steroidal glycoside from the starfish Crossaster papposus II J. Chem. Research (S). 1985. P. 366-367.

272. Elkin Y.N. Gas chromatographic separation of the methyl ether methylglycopyranoside series hexose, 6-deoxyhexose and pentose acetates // J. Chromatogr. 1979. N 180. P. 163 169.

273. Nelson Т.Е. A photometric adaptatin of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. N l.P. 375 381.

274. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. Purification and some properties of P-(l,3)-glucan glucanohydrolase from the crystalline style of bivalve, Spisula sachalinensis II Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 212. P. 111 115.