Масс-спектрометрическое изучение морских гликозидов и родственных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Дмитренок Павел Сергеевич

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРСКИХ ГЛИКОЗИДОВ И РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 2007

003174419

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, академик Стоник В А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Барам Г.И. доктор химических наук, Ануфриев В.Ф.

Ведущая организация: Институт органической химии РАН им Н Д Зелинского

совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу 690022, г Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232)31^0-50, e-mail science@piboc dvo ru

С диссертацией молено ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток-22, пр 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН) Текст автореферата размещен на сайге http //www piboc dvo ru

Защита состоится «¿P» ноября 2007 г в часов на заседании диссертационного

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук старший научный сотрудник

Прокопенко Г И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Морские гликозиды и родственные им высокополярные соединения представляют собой большую группу морских вторичных метаболитов, найденных в различных морских организмах, в частности, в морских беспозвоночных (губках, голотуриях, морских звездах и др) В основном интерес к этим соединениям объясняется их разнообразной физиологической активностью, включая противоопухолевые, антивирусные, противовоспалительные, анальгетические, гемолитические, гипотензивные, иммуномодулирующие свойства Кроме того, многие морские гликозиды и родственные им соединения имеют необычное химическое строение, заметно отличаясь от метаболитов наземных организмов Изучение биологической роли и физиологической активности этих веществ, взаимосвязи между их строением и функциями может основываться только на знании химических структур таких соединений

Одним из основных методов структурных исследований морских гликозидов, наряду с методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса, является интенсивно развивающийся в последние годы метод масс-спектрометрии, преимущество которого заключается в высокой селективности, чувствительности и скорости проведения анализа Появление новых вариантов масс-спектрометрии, таких как MALDI, электроспрей, тандемной масс-спектрометрии, значительно расширило возможности структурного исследования новых вторичных метаболитов Для успешного применения масс-спектрометрии необходимо изучение закономерностей масс-спектрометрического распада молекул, выявление взаимосвязей между строением соединений и их масс-спектрометрическим поведением

Целью данной работы является

Применение различных методов масс-спектрометрии для установления структуры некоторых классов морских гликозидов и родственных им соединений, в частности, тритерпеновых гликозидов из голотурий и губок, стероидных олигозидов губок и морских звезд, стероидных моно- и биозидов, полигидроксисгероидов и сульфатированных стероидов из морских звезд

Научная новизна и практическая ценность работы Впервые с помощью различных вариантов масс-спектрометрии (MALDI-TOF, LSI, ESI и EI) было выполнено масс-спектрометрическое изучение 55 новых морских гликозидов и родственных им высокополярных соединений тритерпеновой и стероидной природы из голотурий, губок и морских звезд Впервые для изучения морских гликозидов был применен метод MALDI-TOF масс-спектрометрии Показано, что этот метод позволяет быстро и с высокой чувствительностью оценить чистоту образца, установить молекулярную массу соединений, а в некоторых случаях строение их углеводных цепей и структурные особенности агликонов При исследовании нескольких серий новых сульфатированных гликозидов найдено, что по характеру MALDI-TOF масс-спектров при сравнении спектров в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов можно определять наличие и количество сульфатных групп в молекуле Впервые метод MALDI-TOF масс-спектрометрии был успешно применен для анализа полигидроксилированных стероидов, имеющих сравнительно небольшую молекулярную массу Был предложен комплексный подход к масс-спектрометрическому изучению новых морских гликозидов и родственных им соединений и показано, что для получения более полной структурной информации необходимо сочетание

метода MALDI-TOF масс-спектрометрии с методами LSI, ESI, EI масс-спектрометрии, включая MS/MS эксперименты

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 15th International Mass Spectrometry Conference, Barcelona, 2000, 10th International Symposium on Marine Natural Products, Okinawa, 2001, XI International Symposium on Manne Natural Products, Sorrento, Italy, 2004, 1-й Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений», Алматы, Казахстан, 2003

Публикаиия результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в рецензируемых научных журналах Известия Академии наук, серия химическая, Доклады Академии наук, биохимия, Химия природных соединений, Tetrahedron Letters, Journal of Natural Products, Biochemical Systematic and Ecology, Canadian Journal of Chemistry, Natural Products Communication Кроме того, части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов По теме диссертации опубликовано 20 научных статей и 4 тезисов

Структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного описанию применяемых на данный момент основных вариантов масс-спектрометрического исследования, а также обзору структур и масс-спектров морских гликозидов и родственных им соединений, известных до начала настоящей работы, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты В Экспериментальной части описаны приборы, условия проведения экспериментов и масс-спектры изученных веществ В конце диссертации приведены Выводы и Список цитированной литературы Работа изложена на 148 страницах, содержит 9 таблиц, 36 рисунков и 28 схем Список литературы включает 130 цитируемых работ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю академику Стонику В А, а также сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН, предоставившим образцы индивидуальных природных веществ, которые были изучены в данной работе д х н Авилову С А, д б н Калинину В И , д х н Кича А А , к х н Левиной Э В , к х н Иванчиной HB, к х н Сильченко АС, к х н Антонову АС, к х н Афиятуллову Ш Ш, к х н Санталовой Е А и н с Андриященко П В Автор также благодарен сотрудникам Лаборатории инструментальных методов анализа Полянского В А и Моисеенко О П за помощь в проведении экспериментов и к ф -м н Воинова В Г за предоставленную возможность проведения ESIMS экспериментов

Часто используемые сокращения ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ТСХ - тонкослойная хроматография на пластинках с закрепленным слоем (или тонкослойная хроматограмма), ГЖХ - газо-жидкостная хроматография, FABMS -масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами, LSIMS - жидкостная вторично-ионная масс-спектрометрия, ESIMS - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, EIMS - масс-спектрометрия с ионизацией электронами; MALDI-TOFMS - времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, MALDI QIT-TOFMS - гибридная квадрупольно-ионная ловушка -времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, CAD -диссоциация, индуцированная столкновениями, MS/MS (MS2) - тандемная масс-спектрометрия, DHB - 2,5-дигидроксибензойная кислота, ССА - 4-гидрокси-а-цианокоричная кислота, TFA - трифторуксусная кислота, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, MST - Национальный институт стандартов и технологий (США)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ X. Исследования тритерпеновых гликозидов 1 1. Изучение тритерпеновых гликозидов голотурий

Ранее для масс-спектрометрического изучения тритерпеновых гликозидов голотурий применялись метод электронной ионизации их производных, а также метод FAB масс-спекгрометрии Мы попробовали впервые применить для их исследования современный метод MALDI-TOF масс-спектрометрии, обладающий более высокой чувствительностью, дающий спектры с меньшим количеством «химического шума» пиков фрагментных ионов и требующий меньше времени на съемку спектров и пробоподготовку Кроме того, были применены широко используемые в настоящее время методы электрораспылигельной (ESI) и тандемной масс-спектрометрии

1 1.1. Исследования голотурииов Вг (1), В3 (2) и В4 (3) средиземноморской голотурии

Holothurm pola

При изучении средиземноморской голотурии Н poln было выделено четыре индивидуальных тритерпеновых гликозида, один из которых то данным ЯМР и масс-спектров был идентифицирован с известным ранее голотурином В, а три остальных -представляли собой новые соединения и были названы голотуринами Вг (1), Вз (2) и В4 (3)

Выделенные голотурины В2 (1), Вз (2) и В4 (3) имели одинаковое строение углеводной цепи и различались только строением агликонов При анализе этой группы соединений нами были изучены (+)- и (-)-MALDI-TOF масс-спектры что позволило получить пики ионов катионированных и декатионированных молекул, соответственно, и установить брутго-формулы этих веществ, а также регистрировать пики фрагментных ионов [M-Na-Qui+H]" (ион Yi)

(+)-LSI масс-спектры этих соединений показывали, главным образом, пики ионов катионированных молекул [M+Na]+ (-)-LSI масс-спектр был сходным с (-)-MALDI-TOF масс-спектром, в нем наблюдались также пики фрагментных ионов, соответствующих отрыву хиновозы как целого фрагмента [M-Na-162] (ион Zi) и ионов, образующихся при разрыве хиновозы по С-1 — С-5 пиранозного кольца [M-Na-118]" (ион 1,5Xi)

Кроме того, в (-)-LSI масс-спектрах гликозидов 1, 2 и 3 наблюдались фрагментные пики углеводной цепи с m/z 373 [углевод цепь-Na] (ион Сг), 227 [S03Xyl-2H]" и достаточно интенсивные пики с m/z 211 [S03Xyl-2H-16] и 195 [S03Xyl-2H-32]~, объясняемые нами как фрагменты, соответствующие сульфатированной ксилозе без одного и двух атомов кислорода, соответственно Дополнительно мы наблюдали в (-)-LSI масс-спектрах интенсивные пики с m/z 80 [SO3]" и 97 [HSO4], указывающие на присутствие сульфатных групп в молекулах

Полученные результаты показали, что наиболее информативным для установления особенностей строения углеводной цепи этих гликозидов оказался метод (-)-LSI масс-спектрометрии, а сочетание этих видов масс-спектрометрии (MALDI-TOF и LSI) позволило достаточно надежно установить как молекулярную массу этих соединений, так и определить некоторые особенности строения их дисахаридной цепи, подтвержденные также данными ЯМР спектров

1.1 2. Тритерпеновые гликозиды голотурии Australostichopus mollis. Установление структуры моллисозидов А (5), Bi (6) и В2 (7)

Из метанольного экстракта голотурии Australostichopus mollis было выделено четыре тритерпеновых гликозида, один из которых был идентифицирован с неотионидиозидом (4), выделенным ранее из голотурии Neothyomdium magnum, а три остальных выделенных соединения оказались новыми и были названы моллисозидами А (5), Bi (6) и В2 (7)

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре неотионидиозида (4) наблюдались пики ионов катионированной молекулы с m/z 1179 [M+Na]+ и фрагмента, соответствующего отрыву сульфатной группы с m/z 1077 Применение метода MALDI-TOF в режиме регистрации отрицательных ионов позволило получить пики, соответствующие пику декатионированной молекулы с m/z [M-Na]", а также фрагментные пики, соответствующие последовательному отрыву трех моносахаридных остатков с m/z 957 [M-Na+H-OMeGlc] (Уз), 825 [M-Na+H-OMeGlc-Xyl] (Y2) и 679 [M-Na+H-OMeGlc-Xyl-Qui]" (Yi)

В (+)-MALDI-TOF масс-спектрах высокого разрешения моллисозидов А (5), Bi (6) и В2 (7) наблюдались пики ионов катионированных молекул [M+Na]+ с m/z 1209 4825 (что соответствовало брутго-формуле CsilfaO^SNa), 1195 4516 (C53H8i025SNa) и 1195 4502 (CsiHgiCfeSNa), соответственно Анализ ЯМР спектров позволил установить структуры агликонов и моносахаридных остатков выделенных веществ

Последовательности моносахаридных остатков в углеводных цепях моллисозидов А (5), Bi (6) и В2 (7) подтверждались, аналогично неотионидиозиду (4), наличием в их (-)-MALDI-TOF масс-спектрах пиков фрагментных ионов У3, Y2 и Уь получающихся благодаря отрыву терминального моносахаридного остатка, одновременному отрыву четвертого и третьего моносахаридных остатков, и одновременному отрыву трех терминальных моносахаридных остатков, соответственно

Таким образом, для этой группы соединений, имеющей тетрасахаридную углеводную цепь и сульфатную группу на первом моносахаридном остатке, метод MALDI-TOF масс-спектрометрии позволил надежно определить как их молекулярные массы, так и последовательности моносахаридов в углеводной цепи

1.1 3. Гликозиды голотурии Cucumanafrondosa * Моносульфатированные голостановые фрондозиды группы Аг

о

/—о I /он М

8 R =

9 R =

10 Л =

11 R =

Rl = О

^ R, = и2 я, = н2

сн2он / ¥за СН2ОН

он

RI = H2

о ^

При разделении гликозидов С frondosa была выделена фракция минорных моносульфатированных гликозидов, дающая одно пятно на ТСХ и получившая название фрондозиды группы Аг Фракция включала 7 индивидуальных соединений, пять из которых являлись новыми голостановыми гликозидами фрондозиды А2-1 (8), А2-2 (9), А2-3 (10), А2-4 (И) и А2-6 (12) Структуры агликонов данных соединений были установлены, в основном, с помощью ЯМР спектроскопии, получение информативных масс-спектров было необходимо для подтверждения строения углеводной цепи выделенных тритерпеновых гликозидов

Данные (+)-MALDI-TOF масс-спектрометрии высокого разрешения позволили получить пики ионов катионированных молекул и установить брутго-формулы выделенных фрондозидов группы Аг, а также идентифицировать фрагментные пики, соответствующие отрыву сульфатной группы В (-)-MALDI-TOF масс-спектрах этих гликозидов наблюдались пики ионов декатионированных молекул [M-Na], и пики фрагментных ионов [M-Na-Xyl+H]" (ион Y2ß), [M-Na-OMeGlc+H]" (ион Y3a), образующиеся при отрыве терминальных моносахаридных остатков

Применение метода MALDI QIT-TOF масс-спектрометрии дало больше структурной информации А именно, мы наблюдали в режиме регистрации положительных ионов для гликозидов А2-1 (8), Л2-2 (9) и А2-4 (11), помимо вышеуказанных, малоинтенсивные пики фрагментных ионов, соответствующих одновременному отрыву терминальных Сахаров и сульфатной группы, а также пики ионов катионированной углеводной цепи с m/z 891 [углевод цепь+Na]"1" (С4), и последующие фрагменты с m/z 771 [C4-NaHS04]+ и 639 [Q-NaHS04-Xyl]+

В (+)-MALDI QIT-TOF MS2 масс-спектрах ионов с m/z 1225 [M+Na-SOjlNa+Hf фрондозидов А2-1 (8), А2-2 (9) и А2-4 (11) наиболее интенсивными были пики фрагментов с m/z 639 [углевод uem>+Na-NaHS04-Xyl]+ и 507 [углевод qenb+Na-NaHS04-2Xylf

Полученные для этих соединений MS/MS/MS (MS3) CAD масс-спектры иона с т/г 639 [углевод iienb+Na-NaHSC>4-Xyl]+ показали также наличие фрагментов с m/z 507 [углевод 4enb+Na-NaHS04-2Xyl]+ и 463 [углевод 4em+Na-NaHS04-Xyl-0MeGlcf, a MS4 эксперименты иона с m/z 507 [углевод uenb+Na-NaHS04-2Xylj+ дали пики ионов с m/z 361 [углевод 4enb+Na-NaHS04-2Xyl-Quif и 331 [углевод uenb+Na-NaHS04-2Xyi-0MeGlc]+

Таким образом, применение метода MALDI для этих соединений и, в особенности, MALDI MS" экспериментов позволило получить обильную структурную информацию о строении углеводной цепи для изученных моносульфатированных пентаозидов

Кроме того, были получены (-)-ESI масс-спектры этих соединений в двух различных системах растворителей в одном случае - ацетонитрил 0 1% TFA (1 1), в другом -ацетонитрил 4% ацетат аммония (1 1) Было показано, что спектры были практически идентичны, но во втором случае, как и следовало ожидать, для режима регистрации отрицательных ионов интенсивность пика декагионированной молекулы была значительно выше Поэтому в дальнейшей работе с тритерпеновыми гликозидами голотурий при измерении значений точных масс была использована систему ацетонитрил 4% ацетат аммония (1 1)

• Моносульфатированные неголостановые фрондозиды группы Аг

Были также изучены два моносульфатированных гликозида группы Аг, имеющих подобную углеводную цепь, но неголостановые агликоны, и отличающиеся только положением двойной связи в фрондозиде А->_-1 (13) она занимала 9(П)-положение, а в фрондозиде А2-8 (14) - 7(8)-положение.

О Ас О Ас

Структуры фрондозидов А2-7 (13) и А2-8 (14), в основном установленные методом ЯМР спектроскопии, подтверждались данными масс-спектрометрии В (+)-MALDI-TOF масс-спектрах высокого разрешения имелись пики ионов кашонированных молекул [M+Na] с m/z 1373 5874, что позволило определить их брутто-формулу как CöiH^O^SNa Помимо пиков ионов катионированных молекул с m/z 1373, в спектрах имелись пики фрагментных ионов с m/z 1271, соответствующие отрыву сульфатной группы, с m/z 1139, соответствующие отрыву сульфатной группы и терминального остатка ксилозы, а также с m/z 1095, соответствующие отрыву сульфатной группы и терминального остатка З-О-метилглюкозы Пик фрагментного иона [M-141+Na-H]+ с т/г 1231 (ион f) свидетельствовал о разрыве

боковой цепи по связи С-20 - С-22 Данные МАЬШ С>1Т-ТОР МБ" масс-спектров подтверждали структуру углеводных цепей этих гликозидов

Таким образом, в данном случае применение МА1Х>1 масс-спектрометрии и МА1Л>5 ОП'-ТОР МБ" экспериментов вплоть до МБ4 не позволило статистически достоверно различить эти два изомера 13 и 14, но подтвердило информацию об их молекулярных массах и структурах боковых цепей агликонов, а также дало важную информацию о структуре углеводных цепей этих соединений • Трисульфатированные фрондозиды группы А7

Подфракция высокополярных трисульфатированных фрондозидов группы А7 содержала 10 индивидуальных соединений, из которых ниже будут рассмотрены фрондозиды А7-1 (15) и А7-2 (16), имеющие типичные для большинства голотурий голосгановые агликоны, и ланостановые гликозиды фрондозиды А7-3 (17) и А7-4 (18), являющиеся изомерами по положению двойной связи в полициклической системе агликонов Изофрондозид С (19), отличался от фрондозида А7-4 наличием ацетоксигруппы в боковой цепи агликона Эти гликозиды были изучены нами методами МА1ЛЭ1-ТОЕ и ЕБ! масс-спектрометрии

Для этих трисульфатированных гликозидов в режиме регистрации положительных ионов в MALDI-TOF масс-спектрах на матрице ССА мы не наблюдали пиков катионированных ионов, видимо, по причине высокой лабильности молекул в этой матрице, поэтому мы применили для их изучения более «холодную» матрицу DHB, что позволило нам получить как пики катионированных молекул, так и некоторые фрагментные пики Так, данные (+)-MALDI-TOF масс-спектрометрии подтверждали соответствие структур фрондозидов А7-1 (15) и А7-2 (16) брутто-формулам C59Hs9035S3Na3 и Cs^ftdC^SsNa-? В их (+)-MALDI-TOF масс-спектрах наблюдались пики ионов катионированных молекул [M+Na]+ с m/z 1545 и 1531, соответственно, а также пики фрагменпгных ионов, соответствующие последовательным отрывам двух сульфатных групп, с m/z 1443 и 1341 для гликозвда 15 и с m/z 1429 и 1327 для гликозида 16, причем пики фрагментов были более интенсивными, чем пики катионированных молекул

Аналогично в (+)-MALDI-TOF масс-спектрах фрондозидов А7-3 (17) и А7-4 (18) наблюдались пики ионов катионированных молекул с m/z 1535 [M+Na]+, что подтверждало молекулярные формулы 17 и 18, которые были определены как CsgHosOiíSiiNa.i В (-)-MALDI-TOF масс-спектрах, наряду с пиками декатионированных молекул с m/z 1489 [М-Na], наблюдались пики фрагментных ионов с m/z 1387, соответствующие отрыву одной сульфатной группы, и пики с m/z 1285, соответствующие отрыву двух сульфатных групп, а также пики, отличающиеся на 16 единиц массы, которые соответствуют аддуктам молекулы с калием Изофрондозид С (19) давал в (-)-MALDI-TOF масс-спектре пик с m/z 1531 [M-Na], а также интенсивный пик, соответствующий отрыву ацетатной группы, с m/z 1471 [M-Na-НО Ас], а также пики, соответствующие последовательным отрывам двух сульфатных групп, cm/z 1429 и 1327

Применение метода ESI масс-спеюрометрии в режиме регистрации положительных ионов не давало информативных спектров из-за наличия в этих соединениях большого числа сульфатных групп Полученные дня этих соединений ESI масс-спектры в режиме регистрации отрицательных ионов в системе ацетонитрил 0 1% TFA (1 1) дали ту же структурную информацию, что и метод MALDI-TOF, но картина спектров была качественно иной А именно, основным ионам в данных спектрах соответствовали пики трехзарядных ионов тридекатионированных молекул [M-3Na]3 и пики ионов двухзарядных двдекатиошрованных молекул [M-2Na-SOsNa+H]2 Применение системы растворителей ацетонитрил 4% ацетат аммония (1 1) приводило к получению спектров, где преобладали очень интенсивные пики однозарядных ионов декатионированных молекул [M-Na]

Таким образом, наличие нескольких сульфатных групп в молекуле приводит к тому, что фрагментация декатионированной молекулы идет, в основном, по пути отрыва сульфатных групп, что в дальнейшем стабилизирует образовавшийся фрагмент, и не позволяет получить информацию о структуре углеводной цепи без применения M.S" экспериментов • Дисульфатированный фрондозид А3-1

Недавно из голотурии С frondosa был выделен тритерпеновый гликозид с голостановым агликоном - фрондозид А?-1 (20), имеющим две сульфатные группы в

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре фрондозида А3-1 (20) наблюдался пик катионированной молекулы с m/z 1445 [M+Naf, а также пик с m/z 1343 [M+Na-NaSOi+H]"1", соответствующий отрыву сульфатной группы (-)-MALDI-TOF масс-спектр 20 показал пик декатионированной молекулы с m/z 1399 [M-Na]" и аналогично пик фрагмента, соответствующего отрыву сульфатной группы, с m/z 1297

В (+)-ESI масс-спектре этого гликозида мы не наблюдали информативных сигналов, а в его (-)-ESI масс-спектре в системе ацетонитрил 0 1% TFA (1 1) наблюдался очень интенсивный сигнал двухзарядного иона дидекатионированной молекулы с m/z 688 [М-2Na]2, а в системе ацетонитрил 4% ацетат аммония (1 1) - интенсивный сигнал пика иона декатионированной молекулы с m/z 1399 [M-Na]"

Необходимо отметить, что масс-спектрометрическое поведение молекулы, имеющей две сульфатные группы, было похожим на поведение трисульфатированных гликозидов Следует также отметить, что в режиме регистрации отрицательных ионов не удается зарегистрировать пики полностью десульфатированных молекул, так как отрицательный заряд локализован на остающейся сульфатной группе

Таким образом, сопоставляя данные (+)- и (-)-MALDI-TOF масс-спектров, можно делать выводы о наличии и количестве сульфатных групп в молекуле, а именно, в случае моносульфатированных гликозидов в (-)-MALDl-TOF масс-спектрах регистрируются интенсивные пики ионов декатионированных молекул [M-Na]", а их (+)-MALDI-TOF масс-спектры показывают пики катионированных молекул [M+Na]+ и пик фрагментного иона [M+Na-102]+, соответствующий отрыву сульфатной группы В случае дисульфатированных гликозидов в (-)-MALDI-TOF масс спектрах мы наблюдаем как ионы [M-Na], так и ионы [М-Na-102]", а в их (+)-MALDI-TOF масс спектрах имеются пики ионов [M+Na]+, [M+Na-102]+ и [M+Na-102-102]+ Соответственно, MALDI-TOF масс-спектры трисульфатированных гликозидов содержат в режиме регистрации отрицательных ионов пики ионов [M-Na], [М-Na-102]" и [M-Na-102-102], а в режиме регистрации положительных ионов - [M+Na]+, [M+Na-102f и [M+Na-102-102]+

1 1.4 Кукумариозид Аг-5 из голотурии Cucumaria comcospermium Интересные результаты были получены при изучении MALDI-TOF и LSI масс-спектров выделенного из голотурии Cucumaria comcospermium нового тритерпенового гликозида - кукумариозида Аг-5 (21), имеющего 1бр-ацетоксиголост-7(8)-ен-ЗР-ол-23-он в качестве агликона, пентасахаридную углеводную цепь и одну сульфатную группу, находящуюся на первом от агликона остатке ксилозы

В (+)-LSI масс-спектрах высокого разрешения (режим регистрации положительно заряженных ионов) имелся пик протонированной молекулы с m/z 1379 5575 [М+Н]+, что подтверждало брутго-формулу CöiHssNaC^iS для гликозида 21 Это предположение полностью подтверждено (-)- и (+)-MALDI-TOF масс-спектрами, в которых имелись пики псевдомолекулярных ионов с m/z 1355 [M-Na]" и 1401 [M+Na]+ В (-)-MALDI-TOF масс-спектре, наиболее информативном для таких соединений, наблюдалась фрагментация исходной молекулы, соответствующая как отщеплению агликона от углеводной цепи (пик с

m/z 845), так и отщеплению терминальных углеводных остатков (пики с m/z 1179 и 1223), а таюке других фрагментов углеводной цепи

Таким образом, мы показали, что в некоторых случаях для тритерпеновых гликозидов, имеющих сульфатную группу на первом от агликона моносахаридном остатке методом MALDI-TOF масс-спектрометрии можно получать дополнительную информацию о структуре олигосахаридной цепи

1 2. Тритерпеновые гликозиды губок. Гликозиды австралийской губки Melophlus

При исследовании австралийской губки Melophlus sarasinorum были найдены известные ранее сарасинозиды Ai (22), А2 (23), Аз (24), М (25), L (26) и новые сарасинозиды А4 (27) и Аз (28), принадлежащие к классу нор-ланостановых гликозидов из губок, для которых характерно присутствие GlcNAc и GalNAc в олигосахаридной цепи и 24,25-ен-23-онового фрагмента в боковой цепи 30-норланостанового агликона Данная серия соединений имела одинаковые углеводные цепи и различные агликоны При изучении сарасинозидов мы использовали методы MALDI-TOF и MALDI QIT-TOF масс-спектрометрии, включая MS/MS эксперименты

При получении (+)-MALDI-TOF масс-спектров на BIFLEX III масс-спектрометре для соединений 22-28 при минимальной мощности лазера были зарегистрированы только пики катионированных молекул [M+Na]+, а при увеличении мощности лазера нам удалось получить пики фрагментов Наиболее интенсивными из них являлись пики ионов 1,SX. Yip, Y2aHC4

Для сарасинозидов Ai (22), А2 (23), А3 (24), А4 (27) и А5 (28) были также получены (+)-MALDI QIT-TOF масс-спектры, позволяющие получить более детальную структурную информацию В этих спектрах самыми интенсивными являются пики катионированных молекул [M+Na]+ (100%) Пиков фрагментных ионов было зарегистрировано немного, и их интенсивность составляла 10-20% Основными фрагментами являлись ионы Yip и С4, а также фрагменты, соответствующие отрыву части углеводной цепи - ион Yia

MS/MS (+)-MALDI QIT-TOF CAD масс-спектры пиков [M+Na]+ соединений 22, 23, 24, 27 и 28 показали большее количество пиков фрагментных ионов Так, для сарасинозидов А4 (27) и А5 (28) полученные MS/MS спектры ионов [M+Na]+ также оказались почти

sarasinorum

в.

г Yla "В,

полностью идентичными и показали пики ионов Уза с m/z 1163, Yip с m/z 1122, Y2ct с m/z 1001, [Yiß-Glc]+c m/z 960, Y!ac m/z 798, В., с m/z 549 и пик с m/z490 [549-HNAcf.

Кроме того, были получены MS/MS/MS (MS3) (+)-MALD! QIT-TOF CAD спектры иона Yip с m/z 1122 для сарасинозидов A4 (27) и А? (28). Анализ всех полученных данных показал, что при фрагментации молекулы реализуются два конкурирующих процесса: одновременный отрыв GlcGlc и GalNAc и отрыв GlcGlcGlcNAc как единого фрагмента.

Таким образом, было показано, что пути масс-спектрометрического распада выделенной серии сарасинозидов практически одинаковы, а основная часть фрагментных пиков принадлежит ионам, возникающим в результате отрыва фрагментов углеводной цепи, что позволяет определить как углеводный состав, так и последовательность соединения моносахаридных остатков в углеводной цепи.

2. С ТЕРОИДНЫЕ ОЛИГОГЛИКОЗИДЫ ГУБОК И МОРСКИХ ЗВЕЗД 2.(. Исследование стероидных гликозидов губки Mycale laxissima

но-

29. X=A, R»

HO-Х=А R =

HO-

Х=А. R =

НО -

32. Х=В, R =

НО—.,, R =

НО—., R =

НО-36. Х-А, R =

У-сн,

.0 б-OAc-Glc

Помимо гликозидов, имеющих тритерпеновый агликон, в морских губках также встречаются олигогликозиды со стероидным агликоном. Недавно из губки МусЫе ¡жзята была выделена серия новых соединений, названная микалозидами А -1 (29-37). Выделенные соединения являлись тетраозидами, имели различные стероидные агликоны и два варианта углеводных цепей, отличающихся друг от друга наличием или отсутствием ацетатной группы в положен™ 6 остатка глюкозы. Мы изучили выделенные гликозиды методами МАЬО!-ТОР и £.81 масс-спектрометрии в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов.

В (+)-MALDI-TOF масс-спектрах всех соединений регистрировали интенсивные пики ионов катионированных молекул [M+Na]+, фрагментации в этом режиме практически не наблюдалось (-)-MALDI-TOF масс-спектры этих гликозвдов были не информативны

(+)-LSI масс-спектры соединений 29-37 показывали характерную картину, состоящую из пиков ионов катионированной молекулы [M+Na]^, незначительных по интенсивности пиков ионов Y„ типа и интенсивных пиков ионов фрагментов агликона, соответствующих выбросу одной и двух нейтральных молекул воды, что косвенно подтверждало полишдроксилированный характер агликона

В (-)-LSI масс-спектрах микалозидов A-I регистрировали интенсивные пики ионов депротонированных молекул и интенсивные фрагменты Yn типа, соответствующие последовательному отрыву одного, двух и трех моносахаридных остатков, которые позволяют сделать вывод о характере (последовательности и местах разветвления) углеводной цепи Так как углеводные цепи различаются только наличием ацетатной группы на первом от агликона остатке глюкозы, то различия в строении этих углеводных цепей мы можем установить только косвенно из значений масс фрагментов (тк фрагментация не затрагивает первый от агликона моносахаридный остаток)

2.2. Изучение астеросапонина офидианозида ¥ При исследовании этанольного экстракта гонад дальневосточной морской звезды Aphelasterias japónica был выделен астеросапонии офидианозид F (38) Поскольку это соединение было выделено в небольшом количестве, проведение ЯМР 2D экспериментов было невозможно, и его всестороннее масс-спектрометрическое изучение являлось особенно актуальным

он

Na03S0

Fuc-j-O— ХуН- о— ХуН- о— QuiH-6 38 4 Y3 4yJ .>Y, <*» *Y2|S

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре офидианозида F (38) наблюдались пики катионированных молекулярных ионов с m/z 1291 [Мк+К]+, 1275 [MNa+K]+ и 1259 [MN»+Na]+, а также пик с m/z 1139 [MNa+Na-120]+, указывающий на наличие сульфатной группы в молекуле В (-)-MALDI-TOF масс-спекгре этого гликозида присутствовали пик иона декатионированной молекулы с m/z 1213 [MNa-Na]\ а также фрагментные пики небольшой интенсивности с m/z 1113 [MN»-Na-100] (характерный разрыв боковой цепи агликона торнастерина А, возникающий в результате фрагментации, удаленной от места заряда, аналогичной ретроальдольному распаду молекулы) и ион Yi=Y2ß с m/z 1067 [MNa-Na-146]" соответствующий потере дезоксигексозного остатка (либо фукозы, либо хиновозы)

В (+)-LSI масс-спектре 38 наблюдались пик иона катионированной молекулы с m/z 1237 [Мн+Na]"1", пик фрагмента с m/z 1137 [MH+Na-100]+, соответствующий разрыву боковой цепи, пик с m/z 1091 [M+Na-146]+, соответствующий потере дезоксигексозного остатка, а также слабый пик иона Y2a с m/z 959 [M+Na-Fuc-Xyl]+, соответствующий потере

дезоксигексозного и пентозного остатков В (-)-LSI масс-спектре 38 наблюдался пик иона декатионированной молекулы с m/z 1213 [M-Na]", пик с m/z 1113 [M-Na-100], соответствующий разрыву боковой цепи, пик иона Ys с m/z 1067 [M-Na-146]", соответствующий потере дезоксигексозного остатка, пик иона Y2e с m/z 935 [M-Na-Fuc-Xyl] , соответствующий потере дезоксигексозного и пентозного остатков, пик иона Yi с m/z 657, соответствующий потере четырех моносахаридных остатков (двух дезоксигексоз и двух пентоз), пик иона Yo с m/z 511, соответствующий аниону сульфатированного агликона торнастерина А, а также пик с m/z 411 [511-100], соответствующий разрыву боковой цепи сульфатированного агликона торнастерина А

Таким образом, метод (-)-LSI масс-спектрометрии позволил нам получить наиболее полную информацию о структуре выделенного астеросапонина, в частности, о составе и моносахаридной последовательности в олигосахаридной цепи, а также о структуре агликонной части молекулы

3. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОЛЯРНЫЕ СТЕРОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ МОРСКИХ ЗВЕЗД 3.1 Исследование «укороченных» астеросапонинов и нативных агликонов астеросапонинов

Из дальневосточной морской звезды Aphélasterias japónica были выделены три гликозида, принадлежащих к классу так называемых «укороченных» астеросапонинов афеластерозвд С (39), челиферозид Li (40) и форбезид Ез (41), а также три нативных агликона астеросапонинов афелакетотриол (42), З-О-сульфоторнастерин А (43) и 3-0-сульфоастерон (44) Выделенные соединения были исследованы нами методом LSI масс-спектрометрии

он

В (-)-LSI масс-спектре афеластерозида С (39) наблюдали пик иона декатионированной молекулы с m/z 759 [M-Na]", а также пики с m/z 737 [M-2Na+H] и 657 [M-S03Na-Na t-H]", указывающие на наличие двух сульфатных групп в этом соединении Кроме того, в нем присутствовал пик иона Yo с m/z 511, указывающий на потерю сульфатированного дезоксигексозного остатка

Для челиферозида Li (40), отличающегося строением боковой цепи, (-)-LSI масс-спектр показал похожую фрагментацию в спектре имелись пик иона декатионированной молекулы с m/z 659 [M-Na] , а также пики с m/z 557 [M-SOvNa-Na+H]" и 411 [M-C6Hi0O7SNa-Na+H]

В тоже время в (-)-LSI масс-спектре форбезида Ез (41), имеющего несульфатированный моносахаридный остаток, были зарегистрированы только пики депротонированной (m/z 579 [М-Н]") и декатионизированной молекулы (m/z 557 [M-Na])

Полученные данные показали, что данный вид масс-спектрометрии позволяет получать информацию о молекулярной массе, наличии сульфатных групп и моносахаридного остатка Присутствие двух сульфатных групп в молекуле приводит к появлению фрагментов, соответствующих отрыву сульфатированного остатка хиновозы

Анализ (-)-LSI масс-спектров выделенных нативных агликонов астеросапонинов показал, что в них наблюдались пики ионов декатионированных молекул с m/z 511 [M-Na]" для афелакетотриола (42) и З-О-сульфоторнастерина А (43) и с m/z 411 [M-Na] для 3-О-сульфоастерона (44) Кроме того, в спектре афелакетотриола (42) имелся пик с m/z 493 [М-Na-НгО]", соответствующий потере гидроксильной группы, а в спектре 3-О-сульфоторнастерина А (43) наблюдался характерный дам него пик с m/z 411 [M-Na-100]

Таким образом, этот метод позволяет получить информацию о молекулярной массе нативных агликонов астеросапонинов, а также в некоторых случаях - об их структурных особенностях Спектры характеризуются небольшим количеством фрагментных ионов

В дальнейшей работе метод MALDI-TOF масс-спектрометрии был применен для идентификации подобных соединений Как было установлено, метод MALDI-TOF позвотает быстро и с высокой чувствительностью получать информацию о молекулярной массе веществ в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов

В дальневосточной морской звезде Lethasterias nammensts chehfeia были найдены три серии ионных соединений одна - на основе З-О-сульфоастерона, другая - 3-0-сульфомзоастерона и третья - на основе З-О-сульфоторнастерина А В составе каждой такой серии имелись натриевые соли, тираминовые соли и уникальные соли с алкалоидом салсолинолом, названные нами алкалоидостероидами Выделенные соединения требовали более глубокого масс-спектрометрического изучения

В (-)-MALI>l-TOF масс-спектрах солей З-О-сульфоастерона (44, 46, 49) и 3-0-сульфоизоастерона (45, 47, 50) регистрировали пики молекулярных анионов с m/z 411 [М-Na], а в их (+)-MALDI-TOF масс-спектрах - пики молекулярных катионов с m/z 457 [M+Na]+ Данные ЯМР спектрометрии позволили установить, что эти соединения являлись стереоизомерами по положению С-17 В (-)-MALDI-TOF масс-спектрах солей З-О-сульфоторнастерина А (43, 48, 51) наблюдались пики ионов декатионированных молекул с m/z 511 [M-Na]" На основании полученных данных структуры веществ 44, 45 и 43 были установлены как натриевые соли З-О-сульфоастерона, З-О-сульфоизоастерона и З-О-сульфоторнастерина А, соответственно

В (+)-MALDI-TOF масс-спектрах соединений 46, 47 и 48 присутствовали пики тираминовых катионов с m/z 138, а в масс-спектрах электронного удара наблюдался пик тирамина с m/z 137 [катион-Н] Анализ этих данных вместе с данными ЯМР спектров, а также с данными, приведенными в литературе, позволило установить, что полученные соединения являются тираминовыми солями этих нативных агликонов астеросапонинов

он

XOjSO'

46 X = А 'ХОзБО'

47 Х = А

48 Х-А

ОН

ОН

ОН

49 Х = В

50 Х=В

51 Х=В

А= НО

Строение уникальных ионных гибридов - алкалоидостероидов 49, 50 и 51подтвердило тщательное масе-епектрометрическое изучение Так, в (+)-LSI масс-спектре соединения 51 наблюдались пики молекулярных катионов с m/z 714 [M+Na]+ и 871 [М+катион]+, где М - молекулярная масса соли Молекулярная формула GnHsvCWS для 51 была установлена с помощью (+)-HR MALDI-TOF масс-спектра, имеющего пик с m/z 557 2331 Он соответствует анионной части соли [М-катион+2Ыа]+ с молекулярной формулой C27H430?SNa2 (рассчитано 557 2528) Пик катиона [салсолинол+Н]+ при m/z 180 0988 соответствует молекулярной формуле СюНнОгИ (рассчитано 180 1025) В (-)-MALDI-TOF масс-спектре 51 наблюдался пик [М-катион] при m/z 511, так же как и в спектрах соединений 43 и 48

Соответственно, (+)-LSI масс-спектры соединений 49 и 50 содержали пики ионов катионированных молекул с m/z 614 [M+Na]+, а спектр 50 имел, кроме того, пик с m/z 771 [М+катион]+ Молекулярная формула CutLßOgNS для 49 и 50 была установлена в результате анализа (+)-HR MALDI-TOF масс-спектров, содержащих пики [ Vi-катио H+2Na]+ при m/z 4571517 и 457 1531 (рассчитано 457 1639), соответствующие молекулярной формуле C21H3l06SNa2, и пики катиона [салсолинол+Н]+ при in/z 180 0964 и 180 0976 (рассчитано 180 1025), соответствующие молекулярной формуле Ci0Hi4O2N В (-)-MALDI-TOF масс-спектрах 49 и 50 наблюдался пик [М-катион] при m/z 411

Строение органического катиона салсолинола (1-метил-6,7-дишдрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина) было подтверждено также сравнением спектра электронного удара со спектром, приведенным в базе данных NIST

Таким образом, сочетание различных масс-спектрометрических методов позволило, совместно с данными ЯМР спектроскопии, однозначно установить структуры уникальных ионных гибридов, анионом в которых является нативный агликон астеросапогошов, а катионом - органическая молекула Метод MALDI-TOF масс-спектрометрии позволил получить масс-спектры высокого разрешения, методом (+)-LSI масс-спектрометрии мы получили пики молекулярных катионов изученных ионных конъюгатов Применение масс-спектрометрии электронного удара помогло установить структуры органических катионов -тирамина и салсолинола

Исследования морских звезд семейства Р1егаз1епс1ае показало, что они содержат стероидные дисульфаты, характерные для офиур Были изучены методом МАЦЭ1-ТОР масс-спектрометрии шесть соединений, выделенных из морской звезды Р!егШег риЫИив 52-57

3.3.2. Стероидные дисульфаты офиурного типа из морской звезды Pteraster

pulvillus

Стероиды 53 и 54 являлись ранее неизвестными соединениями Соединения 56 и 57 впервые выделены в виде ионных конъюгатов с тирамином

57 Д5, Ri = OSO3X, R2 = R3 = Н,

52 Д5 Ri = 0S03Na, R2 = Н R3 = ОН

53 Ri =0S03Na, Rj-H, R3-OH X = Na+, HO—P J—'

Метод (+)-MALDI-TOF масс-спектрометрии позволил получить пики ионов катионированных молекул [M+Na]+ соединений 52-55 с m/z 645, 647, 647 и 631, соответственно Для новых соединений 53 и 54 также были получены (+)-MALDI-TOF масс-спектры высокого разрешения, показавшие пики ионов катионированных молекул с m/z 647 2254 [M+Naf для стероида 53 и с m/z 647 2297 [M+Na]+ для соединения 56, что соответствовало молекулярным формулам C27Ü4609S2Na2 (рассчитано 647 2275) В (-)-MALDI-TOF масс-спектрах выделенных стероидов 52-55 наблюдались пики ионов декатионированных молекул [M-Na]~ с m/z 599, 601, 601 и 585, соответственно, а также пики [M-2Na+H]~ с m/z 577, 579, 579 и 563, соответственно

Масс-спектр (-)-MALDI-TOF стероида 56 содержал пики молекулярных анионов с m/z 585 [М-2 KamoHa+Naf и 563 [М-2 катиона+Hf, а в его (+)-MALDI-TOF масс-спектре не набтюдался пик иона катионированной молекулы, но присутствовал пик тираминового катиона [C8Hi2ON]+ с m/z 138 Сравнение интенсивностей сигналов протонов стероидного аниона и тираминового катиона в 'Н ЯМР спектре показало, что соединение 56 является дитираминовой солью (20й)-5а-холесган-3а,21-диола 3,21-дисульфата

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре соединения 57 наблюдались пик иона катионированной молекулы с m/z 629 [M2Na+Na]+, а также пик тираминового катиона с m/z 138 Масс-спектр (-)-MALDI-TOF стероида 57 содержал пики анионов с m/z 583 [М-2 KaTMOHa+Na]" и 561 [М-2 катиона+Н]" Сравнение интенсивностей сигналов протонов стероидного аниона и тираминового катиона показало, что соединение 57 является смесью натриевой и тираминовой солей (20й)-холест-5-ен-За,21-диола 3,21-дисульфата (1 1)

Таким образом, мы установили, что метод MALDI-TOF в режиме регистрации положительных ионов позволяет получить пики молекулярных катионов для подобных стероидных дисульфатов в случае, если противоионом является Na, и увидеть пик, принадлежащий противоиону - органической молекуле тирамину При использовании метода MALDI-TOF в режиме регистрации отрицательных ионов мы во всех случаях легко регистрировали пики декатионированных молекул

(-)-LSI масс-спектры выделенных дисульфатов давали характерную картину пиков ионов декатионированных молекул [Мма-№]~ и [M-2Na+H], очень интенсивного пика фрагментного иона, соответствующего потере одной сульфатной группы [M-NaHS04] и пиков ионов сульфатной группы с m/z 80 [SO3]" и 97 [HSO4] Данные MS/MS экспериментов

подтверждали установленные структуры, показывая интенсивные пики фрагментных ионов [M-NaS03r и [M-NaHSOJ"

3.3 3 Исследования полигидроксистероидов морских звезд. Полигидроксистероиды морских звезд - стероидные соединения, имеющие, как правило, от четырех до девяти гидроксильных групп, эта группа физиологически активных морских изопреноидных соединений характеризуется большим структурным разнообразием Присутствие большого количества гидроксильных групп в молекуле затрудняет получение информации о молекулярной массе вещества методом масс-спектрометрии с электронной ионизацией Как правило, в спектрах наблюдаются пики продуктов последовательной дегидратации Поэтому для получения пиков молекулярных ионов нами, наряду с методом LSI масс-спектрометрии, впервые для веществ этой структурной группы был применен метод MALDI-TOF масс-спекгрометрии

В результате мы изучили масс-спектры более 40 полигидроксистероидов морских звезд В этой работе мы приводим наиболее характерные данные масс-спектров для серии полигидроксилированных стероидных соединений, выделенных из дальневосточной морской звезды Henricia leviuscula

Из морской звезды Н leviuscula было выделено пять полигидроксистероидов один ранее известный 5а-холестан-Зр,4[},6р,8,15р,24-гексаол (58) и четыре новых стероида -(23Ä,24S>5a-xonecTaH-3ß,4ß,6ß,8,15ß,23,24-reimKxii (59), (24Я)-5а-холестан-

3ß,4ß,6ß.8,15ß,24,25-rerrraon (60), 26-О-сульфат Д22Е-24-нор-5а-холестан-Зр,5а,6р,15«;26-пенгаола (61) и 24-О-сульфат (245)-5a-xonecraH-3ß,5a,6ß,l 5а,24-пентаола (62) • Исследования свободных полигидроксистероидов И. leviuscula

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре стероида 58 наблюдался пик иона катионированной молекулы с m/z 491 [M+Na]+, (-)-MALDI-TOF масс-спектр этого несульфатированного гексаола был не информативен Использование метода LSI масс-спекгрометрии позволило получить более подробную информацию о структуре молекулы Так, в (+)-LSI масс спектре 58 наблюдался не только пик протонированной молекулы гексаола с m/z 469 [М+Н]+, но и пики фрагментных ионов, соответствующие последовательной дегидратации молекулы с m/z 451 [М+Н-Н20]+, 433 [M+H-2H2Of, 415 [М+Н-ЗН20]+, 397 [М+Н-4Н20]+ и 379 [М+Н-5Н20]+ В (+)-LSI MS/MS спектрах родительского иона с mJz 469, помимо вышеуказанных, мы также регистрировали пик иона с m/z 361 [М+Н-6Н20]+

В (-)-LSI масс-спектре этого стероида наблюдался интенсивный пик депротонированной молекулы с m/z 467 [М-Н], пик, соответствующий отрыву только одной

молекулы воды, с m/z 449 [М-Н-Н20] и фрагментные даки, соответствующие разрыву боковой цепи и кольца D стероидного ядра молекулы

На основании (+)-MALDI-TOF масс-спектров высокого разрешения соединениям 59 и 60 была приписана молекулярная формула С27Н48О7 (+)-LSI масс-спектры стероидов 59 и 60 были практически идентичны и показали пики молекулярных катионов с m/z 507 [M+NaJ1" Данные ЯМР спектроскопии показали, что эти соединения являются стероидными гексаолами и отличаются друг от друга положением гидроксильных групп в их боковых цепях

(-)-LSI масс-спектры 59 и 60 полностью подтвердили эти данные, в этих спектрах содержались пики, указывающие на разрыв связей в диольных группах боковых цепей изученных соединений с m/z 409 [М-Н-С4Н9ОН]" (ион 'h) для 59 и с m/z 423 [М-Н-С3Н7ОНГ (ион 'i) для 60, соответственно

• Исследования сульфатированных полигидроксистероидов Н leviuscula Стеровду 61 была приписана молекулярная формула C26H4308SNa на основании данных (+)-MALDI-TOF масс-спектров высокого разрешения (+)-LSI масс-спектр этого сульфатированного пенгаола показал не только пики катионированной и протонированной молекулы с m/z 561 [M+Na]+ и 517 [M-Na+2H]+, но также пики, соответствующие последовательному отрыву двух гидроксильных групп с m/z 499 [M-Na+2H-H20]+ и 481 [М-Na+2H-2H20]+ (-)-LSI масс-спектр 61 позволил увидеть пик иона декатионированной молекулы с m/z 515 [M-Na]~, пик, соответствующий потере гидроксильной группы с m/z 497 [M-Na- HjO]", а также пики сульфатной группы с m/z 97 [HSCU]- и 80 [SO3]"

Молекулярная формула соединения 62 была установлена как C27H470sSNa на основании наличия пика молекулярного катиона с m/z 577 2757 [M+Na]+ в (+)-MALDI-TOF масс-спектре высокого разрешения Его (+)-LSI масс-спектр показал пики ионов катионированной и протонированной молекулы с m/z 577 [M+Na]+ и 555 [М+Н]+, а также пик, соответствующий потере сульфатного остатка с m/z 457 [M-HSC>4]+ (-)-LSI масс-спектр этого сульфатированного пенгаола 62 показал, аналогично спектру стероида 61, пики молекулярного аниона с m/z 531 [M-Na]", фрагментного иона, образующегося при потере гидроксильнои группы с m/z 513 [M-Na-H20]_, а также пики сульфатной группы с m/z 97 [HSO4]" и 80 [SO3]"

Таким образом, исследования серии свободных и сульфатированных полигидроксистероидов из морской звезды Н leviuscula методами MALDI-TOF и LSI масс-спектрометрии показали, что метод MALDI-TOF позволяет быстро и с высокой чувствительностью определять молекулярную массу соединений, оценивать чистоту образца и наличие возможных примесей, но, как правило, не дает детальной структурной информации Применение метода LSI масс-спектрометрии позволяет получить важную структурную информацию в режиме как положительных, так и отрицательных ионов Пути фрагментации в этом случае связаны, в основном, с отрывом гидроксильных групп Причем метод LSIMS оказался одинаково информативным как для сульфатированных, так и для свободных полигидроксистероидов

• Тризерамид - новый стероидный конъюгат из морской звезды Astropecten triseriatus В морской звезде Astropecten triseriatus было найдено редкое производное полигвдроксистероида - стероидный тауроконъюгат, названный тризерамидом (63) Для установления его строения нами были использованы методы MALDI-TOF и LSI масс-спектрометрии

ОН

В (+)-MALDI-TOF масс-спектре соединения 63 наблюдались пики ионов катионированной молекулы с m/z 630 [M+Na]+ и 646 [М+К]+. В (-)-LSI масс-спектре этого стероида наблюдали пик молекулярного аниона с m/z 584 [M-Na]', а также целый ряд фрагментных пиков, соответствующих расщеплению боковой цепи и кольца D агликона.

Таким образом, методы MALDI-TOF и LSI масс-спектрометрии могут успешно применяться для анализа полигидроксилированных стероидных соединений морских звезд.

3.3.4. Исследование гликозидов полигндроксистероидов морских звезд В данной работе были исследованы более чем 30 низкомолекулярных полярных стероидных гликозидов морских звезд. Как правило, применение метода MALDI-TOF масс-спектрометрии давало только пики псевдомолекулярных ионов. Для получения пиков структурных фрагментов мы применяли метод LSI масс-спектрометрии.

(-)-LSI: «95 (Yi)

Так, при изучении новых стероидных гликозидов - фригиозидов А (64) и В (65) из дальневосточной морской звезды Н1ррач1епа рЪгу^шпа были получены следующие данные. (-)-MALDI-TOF масс-спектр высокого разрешения гликозида 64 указывал на молекулярную формулу СзвНбзО^ЗИа. (-)-Г31 масс-спектр показал пики ионов У, и Хи соответствующие отрыву О-метилпентозного остатка, и пик иона Хц, соответствующий отрыву двух моносахаридных остатков. В (+)^81 масс-спектре фригиозида А наблюдался пик катионированной молекулы [М+Ка]+ и пики образующихся при ее распаде фрагментных ионов [М-Жа-ЫаНЗС^]*, X,, [У|-1ЧаН804]+, [го^аШ04]+ и [489-Н20]+. Все эти данные свидетельствовали о наличии в 64 сульфатной группы и дисахаридной углеводной цепи.

Масс-спектр высокого разрешения (+)-MALDI-TOF фригиозида В (65) показывал пик, соответствующий молекулярной формуле СззН57<Э|281Ма. В (-)^81 масс спектре пики [М-Ш]" и иона Хо соответствовали наличию сульфатированного гидроксила и монометилированной пентозы в соединении 65.

Аналогичные MALDI-TOF и LSI масс-спектры были получены для фусказида А (66), выделенного из дальневосточной морской звезды Lethasterias fusca, что позволило однозначно установить строение этого сульфатированного биозида

Недавно в дальневосточной морской звезде Hippasteria spmosa были найдены уникальные триозиды, имеющие полигидроксилированный стероидный агликон При установлении строения этих соединений хорошие результаты были получены методами MALDI-TOF и LSI масс-спекгрометрии Так, при изучении спинозида А (67) регистрировали пик [M+Na]+, а также пики фрагментах ионов Yo, Yi, [Yi-NaSC>4+H]+ и [Yo-NaSC>4+H]+

Таким образом, нами было установлено, что при масс-спектрометрическом изучении низкомолекулярных полярных стероидных гликозидов наиболее информативным является метод LSIMS, позволяющий определять как структуры агликонов, так и строение углеводных цепей При применении методов MALDI-TOF и ESI масс-спектрометрии для получения подробной структурной информации необходимо применение техники MS/MS

1 Проведено масс-спектрометрическое изучение 55 новых морских гликозидов и родственных им высокополярных соединений тритерпеновой и стероидной природы из голотурий, губок и морских звезд

2 Впервые для изучения морских гликозидов применен метод MALDI-TOF масс-спектрометрии Показано, что этот метод позволяет быстро и с высокой чувствительностью оценить чистоту образца, установить молекулярную массу соединений, а в некоторых случаях детали строения их углеводных цепей и структурные особенности агликонов

3 Найдено, что по характеру МАПОИГОР масс-спектров при сравнении спектров в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов можно устанавливать наличие и количество сульфатных групп в молекуле

4 Установлено, что в случае гликозидов с одной сульфатной группой, находящейся на первом от агликона моносахаридном остатке, в МАЦШ-ТОР масс-спектрах наблюдается значительное количество фрагментных ионов У-типа

5 Показано, что метод МАЬОМ ОР масс-спектрометрии может успешно применяться для анализа полигидроксилированных стероидов и их гликозидов, имеющих сравнительно небольшую молекулярную массу

6 Предложен комплексный подход к масс-спектрометрическому изучению новых морских гликозидов и родственных им соединений и показано, что для получения наиболее полной

(¥,) (+) LSI S7I„; () LSI 825

5. ВЫВОДЫ

структурной информации необходимо сочетание метода MALDI-TOF масс-спектрометрии с

методами LSI, ESI и EI масс-спектрометрии, включая MS/MS эксперименты

Основные публикации по теме диссертации

1 Ivanchma N V , Kicha А А, Kalmovsky АI, Dmitrenok Р S, Stonik V А, Riguera R, Jimenez С Hemolitic polar steroidal constituents of the starfish Aphelasterias japonica ИJ Nat Prod 2000 V 63. P 1178-1181

2 Dmitrenok P S , Avilov S A, Kalmm V I, Vomov V Application of the MALDI MS for structural investigation of toxic tnterpene glycosides from the sea cucumbers // 15th International Mass Spectrometry Conference, Barcelona, 27 August 2000 PB-D4-21

3 lvanchina N V , Kicha A A , Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Prokof eva N G , Stonik V A The Polar Steroidal Constituents from the Starfish Asterias rathburu // 10th International Symposium on Marine Natural Products, Nago, Okinawa, June 24-29 2001 P 102

4 Ivanchma N V , Kicha A A, Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Prokof eva N G, Stonik V A New steroid glycosides from the starfish Asterias rathbum II J Nat Prod 2001 V 64 N 7 P 945 - 947

5 Кича A A, Иванчина H В , Калиновский А И , Дмитренок П С , Стоник В А Сульфатированные стероидные соединения из курильской популяции морской звезды Aphelasterias japonica II Изв АН Сер хим 2001 №4 С 695 - 698

6 Kalmovsky АI, Antonov A S , Afiyatullov Sh Sh, Dmitrenok P S , Evtushenko E V , Stonik

V A Mycaloside A, a new steroid oligoglycoside with an unprecedented structure from the Caribbean sponge Micale laxissma // Tetrahedron Lett 2002 V 43 P 523 - 525

7 Avilov S A, Antonov A S , Silchenko A S , Kalinin V I, Kalmovsky A I, Dmitrenok P S, Stonik V A , Riguera R , Jimenes С Tnterpene glycosides from the Far Eastern sea cucumber CucumariacomcospeimiumIIJ Nat Prod 2003 V 66 P 910-916

8 Antonov A S , Afiyatullov S S , Kalmovsky AI, Ponomarenko L P , Dmitrenok P S Aminm D L, Agafonova IG, Stonik V A Mycalosides В - I, eight new spermostatic steroid oligoglycosides from the sponge Mycale laxissima IIJ Nat Prod 2003 V 66 P 1082-1088

9 Kicha A A , Ivanchma N V , Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Stomk V A Alkaloidosteroids from the starfish Lethasterias nanimensis chelifera И Tetrahedron Lett 2003 V 44 N 9 P 1935- 1937

10 Ivanchma N V, Kicha A A, Kalmovsky AI, Dmitrenok P S, Stonik V A Hemolytic steroid disulfates from the Far Eastern starfish Pteraster pulvillus H J Nat Prod 2003 V 66 N 2 P 298 - 301

11 Кича A A, Иванчина H В , Калиновский А И, Дмитренок П С, Стоник В А Новые окисленные стероидные соединения морских звезд структурные исследования и биологические функции // Международная научная конференция «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений», Алматы, Казахстан 8-11 октября, 2003 С 73

12 Левина Э В , Калиновский А И , Андриященко П В , Дмитренок П С , Евтушенко Е В , Стоник В А Новый стероидный гликозцд фригиозид А и его агликон из морской звезды Hippasteriaphrygiana//Изв АН Сер хим 2003 №7 С 1539-1543

13 Moraes G , Northcote Р Т , Kalinin V I, Avilov S А, Silchenko A S , Dmitrenok P S , Stonik

V A, Levin V S Structure of the major tnterpene glycoside from the sea cucumber Stichopus

mollis and evidence to reclassify this species into the new genus Australostichopus II Biochem Syst Ecol 2004 V 32 P 637 - 650

14 Кича A A, Иванчина H В , Калиновский А И , Дмигренок П С , Кайнара С О , Аминин Д Л, Агафонова И Г, Стоник В А Полярные стероидные соединения из дальневосточной морской звезды Lethasterias narumensis chelifera II Известия АН Сер хим 2004 № 2 С 427 - 434

15 Ivanchina N V, Kicha А А, Kalmovsky А I, Dmitrenok Р S , Stomk V A New polar steroidal compounds from the Far Eastern starfish Henncia leviuscula IIXI International Symposium on Marine Natural Products-Sorrento, Italy, September 4th-1011' 2004 P45

16 Левина Э В , Калиновский А И , Дмигренок П С , Прокофьева Н Г , Андриященко П В , Стоник В А Тризерамид - новый стероидный конъюгат из морской звезды Astropecten triseriatus // Доклады АН, биохимия 2004 т 396 №3 С 407-409

17 Moraes G, Northcote Р Т, Silchenko A S , Antonov A S , Kalmovsky АI, Dmitrenok Р S , Avilov S А, Kalinin VI, Stomk V A Mollisosides А, В[ and В2 - three new minor tnterpene glycosides from the New Zealand and South Australian sea cucumber Australostichopus mollis (Hutton) // J Nat Prod 2005 V 68, No 6 P 842-847

18 Silchenko A S , Avilov S A, Antonov A S , Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Kalinin VI, Stomk V A, Woodward С , Collin P D Glycosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa III Structure of frondosides A2-l, A2-2, A2-3 and A2-6, foui new minor monosulfated tnterpene glycosides//Can J Chem 2005 V 83, N 1 P 21-27

19 Silchenko A S , Avilov S A, Antonov A S , Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Kalinin VI, Woodward C, Collin PD Glycosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa IV Structure of frondosides A2-4, A2-7, and A2-8, three new minor monosulfated tnterpene glycosides//Can J Chem 2005 V 83 P 2120-2126

20 Иванчина H В , Маляренко T В , Кича А А, Калиновский А И, Дмигренок П С Астеросапонин офидианозид F из гонад дальневосточной морской звезды Apkelasterias japomca//Химия прир соедин 2005 №4 С 392-393

21 Levma Е V, Kalmovsky АI, Andriyashenko Р V, Dmitrenok Р S , Aminm D L, Stomk V А Phrygiasterol, cytotoxic cyclopropane-containing polyhydroxysteroid and related compounds from the Pacific starfish Hippasteria phrygiana //J Nat Prod 2005 V 68 N 10 P 1541-1544

22 Santalova E A, Denisenko V A, Dmitrenok P S , Berdyshev D V, Stomk V A Two New Sarasmosides from the Sponge Melophlus sarasmorum // Nat Prod Commun 2006 V 1 N 4 P 265-271

23 Ivanchina N V, Kicha A A , Kalmovsky A I, Dmitrenok P S , Dmitrenok A S , Chaikma E L , Stomk V A, Gavagmn M , Ctmmo G New Polar Steroidal Compounds from the Far Eastern Starfish Henricia leviuscula I IJ Nat Prod 2006 V 69 N2 P 224-228

24 Silchenko A S, Avilov S A, Kalmovsky AI, Dmitrenok P S , Kalinin VI, Morre J, Deinzer M L, Woodward С , Collin P D Glycosides from the North Atlantic sea cucumber Cucumaria frondosa V - Structure of five new minor tnsulfated tnterpene oligoglycosides, frondosides A7-I, A7-2, А7-З, A7-4, and isofrondoside С // Can J Chem 2007 V 85 N 9 P 626-636

Соискатель

Дмигренок П С

Дмитренок Павел Сергеевич

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРСКИХ ГЛИКОЗИДОВ И РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Автореферат

Подписано в печать 01Л0.2007 г. Формат 60x90/16. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 83. Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» Г. Владивосток, ул. Западная, 10

1. ВВЕДЕНИЕ.

• 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Номенклатура масс-спектрометрической фрагментации.

2.2. Описание различных методов масс-спектрометрии и областей их применения.

2.2.1. Масс-спектрометрия с ионизацией электронами (EIMS).

2.2.2. FAB и LSI масс-спектрометрия. в 2.2.3. Метод электрораспылительной (ESI) масс-спектрометрии.

2.2.4. Метод MALDI-TOF масс-спектрометрии.

2.3. Морские гликозиды и родственные им соединения.

2.3.1. Тритерпеновые гликозиды голотурий.25.

2.2.2. Гликозиды губок.

2.2.3. Полярные стероидные соединения морских звезд.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Исследования тритерпеновых гликозидов.

3.1.1. Изучение тритерпеновых гликозидов голотурий.

3.1.2. Тритерпеновые гликозиды губок. Гликозиды австралийской губки Melophlus sarasinorum

3.2. СТЕРОИДНЫЕ ОЛИГОГЛИКОЗИДЫ ГУБОК И МОРСКИХ ЗВЕЗД

3.2.1. Исследование стероидных гликозидов губки Mycale laxissima.

3.2.2. Изучение астеросапонина офидианозида F

3.3. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПОЛЯРНЫЕ СТЕРОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ МОРСКИХ ЗВЕЗД.

3.3.1. Исследование «укороченных» астеросапонинов и нативных агликонов астеросапонинов.

3.3.2. Стероидные дисульфаты офиурного типа из морской звезды Pteraster f pulvillus.ЮЗ

3.3.3. Исследования полигидроксистероидов морских звезд.

3.3.4. Исследование гликозидов полигидроксистероидов морских звезд.

3.4. ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПОЛЬЗОВАННЫХ МЕТОДОВ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ АНАЛИЗА МОРСКИХ ГЛИКОЗИДОВ И

РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Приборы и оборудование.

4.2. Подготовка образцов и условия съемки спектров.

4.3. Изученные соединения.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы.

Морские гликозиды и родственные им высокополярные соединения представляют собой большую группу морских вторичных метаболитов, найденных в различных морских организмах, в частности, в морских беспозвоночных (губках, голотуриях, морских звездах и др.). В основном интерес к этим соединениям объясняется их разнообразной физиологической активностью, включая противоопухолевые, антивирусные, противовоспалительные, анальгетические, гемолитические, гипотензивные, иммуномодулирующие свойства. Кроме того, многие морские гликозиды и родственные им соединения имеют необычное химическое строение, заметно отличаясь от метаболитов наземных организмов. Изучение биологической роли и физиологической активности этих веществ, взаимосвязи между их строением и функциями может основываться только на знании химических структур таких соединений.

Одним из основных методов структурных исследований морских гликозидов, наряду с методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса, является интенсивно развивающийся в последние годы метод масс-спектрометрии, преимущество которого заключается в высокой селективности, чувствительности и скорости проведения анализа. Появление новых вариантов масс-спектрометрии, таких как MALDI, электроспрей, тандемной масс-спектрометрии, значительно расширило возможности структурного исследования новых вторичных метаболитов. Для успешного применения масс-спектрометрии необходимо изучение закономерностей масс-спектрометрического распада молекул, выявление взаимосвязей между строением соединений и их масс-спектрометрическим поведением.

Целью данной работы было применение различных методов масс-спектрометрии для установления структуры некоторых классов морских гликозидов и родственных им соединений, в частности, тритерпеновых гликозидов из голотурий и губок, стероидных олигозидов губок и морских звезд, стероидных моно- и биозидов, полигидроксистероидов и сульфатированных стероидов из морских звезд.

Задачами настоящей работы были: с-И

- масс-спектрометрическое изучение имеющихся большой серии новых и ранее известных морских гликозидов и родственных им соединений тритерпеновой и стероидной природы с целью установления их строения и идентификации;

- изучение возможности применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов для установления строения морских гликозидов и родственных им соединений;

- сравнение особенностей масс-спектрометрического поведения различных классов соединений и определения оптимальных условий проведения экспериментов; разработка комплексного подхода к масс-спектрометрическому исследованию новых морских гликозидов и родственных им высокополярных соединений с использованием нескольких вариантов масс-спектрометриш

Научная новизна работы.

Впервые с помощью различных вариантов масс-спектрометрии (MALDI-TOF, LSI, ESI и EI) было выполнено масс-спектрометрическое изучение 55 новых морских гликозидов и родственных им высокополярных соединений тритерпеновой и стероидной природы из голотурий, губок и морских звезд. Впервые для изучения морских гликозидов был применен метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. Показано, что этот метод позволяет быстро и с высокой чувствительностью оценить чистоту образца, установить молекулярную массу соединений, а в некоторых случаях строение их углеводных цепей и структурные особенности агликонов. При исследовании нескольких серий новых сульфатированных гликозидов найдено, что по характеру MALDI-TOF масс-спеюров при сравнении спектров в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов можно определять наличие и количество сульфатных групп в молекуле. Впервые метод MALDI-TOF масс-спектрометрии был успешно применен для анализа полигидроксилированных стероидов, имеющих сравнительно небольшую молекулярную массу. Был предложен комплексный подход к масс-спектрометрическому изучению новых морских гликозидов и родственных им соединений и показано, что для получения более полной структурной информации необходимо сочетание метода MALDI-TOF масс-спектрометрии с методами LSI, ESI, EI масс-спектрометрии, включая MS/MS эксперименты.

Публикация результатов исследования.

Основные результаты настоящего исследования опубликованы в рецензируемых научных журналах: Известия Академии наук, серия химическая; Доклады Академии наук, биохимия; Химия природных соединений; Tetrahedron Letters; Journal of Natural Products; Biochemical Systematic and Ecology; Canadian Journal of Chemistry; Natural Products Communication. Кроме того, части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликовано 20 научных статей и 4 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного описанию применяемых на данный момент основных вариантов масс-спектрометрического исследования, а также обзору структур и масс-спектров морских гликозидов и родственных им соединений, известных до начала

5. ВЫВОДЫ

1. Проведено масе-спектрометрическое изучение 55 новых морских гликозидов и родственных им высокополярных соединений тритерпеновой и стероидной природы из голотурий, губок и морских звезд.

2. Впервые для изучения морских гликозидов применен метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. Показано, что этот метод позволяет быстро и с высокой чувствительностью оценить чистоту образца, установить молекулярную массу соединений, а в некоторых случаях детали строения их углеводных цепей и структурные особенности агликонов.

3. Найдено, что по характеру MALDI-TOF масс-спектров при сравнении спектров в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов можно устанавливать наличие и количество сульфатных групп в молекуле.

4. Установлено, что в случае гликозидов с одной сульфатной группой, находящейся на первом от агликона моносахаридном остатке, в MALDI-TOF масс-спектрах наблюдается значительное количество фрагментных ионов Y-типа.

5. Показано, что метод MALDI-TOF масс-спектрометрии может успешно применяться для анализа полигидроксилированных стероидов и их гликозидов, имеющих сравнительно небольшую молекулярную массу.

6. Предложен комплексный подход к масс-спектрометрическому изучению новых морских гликозидов и родственных им соединений и показано, что для получения наиболее полной структурной информации необходимо сочетание метода MALDI-TOF масс-спектрометрии с методами LSI, ESI, EI масс-спектрометрии, включая MS/MS эксперименты.

1. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. Москва, БИНОМ: Лаборатория знаний, 2003, сс. 493.

2. Заикин В.Г., Варламов А.В., Микая А.И., Простаков Н.С. Основы масс-спектрометрии органических соединений. Москва, МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001, сс. 286.

3. Johnstone R.A.W., Rose М.Е. Mass spectrometry for chemists and biochemists. Cambrridge University Press, 1996, pp. 501.

4. Measuring mass. From positive rays to proteins, Ed. By M.A. Grayson, Chemical Heritage Press, Philadelphia, 2002, pp. 149.

5. Бейнон Дж. Масс-спектрометрия и ее применение в органической химии. Москва, Мир, 1964, сс. 701.

6. Snyder P. Biochemical and biotechnological application of electrospray ionization mass spectrometry. ACS, Washington D.C., 1995, pp. 601.

7. Karas M., Hillenkamp F. Advances in Mass Spectrom. Ed. By P. Longevialle, Heyden & Son, London, 1989, pp. 416.

8. Полякова A.A., Хмельницкий P.A. Введение в масс-спектрометрию органических соединений. Ленинград, Химия, 1966, сс. 204.

9. Терентьев П.Б. Масс-спектрометрия в органической химии. Москва, Высшая школа, 1979, сс. 223.

10. Ю.Тахистов В.В. Органическая масс-спектрометрия. Ленинград, Наука, 1990, сс. 223.

11. П.Тахистов В.В. Практическая масс-спекгрометрия органических соединений. Ленинград, ЛГУ, 1977, сс. 278.

12. Зенкевич И.Г., Иоффе Б.В. Интерпретация масс-спектров органических соединений. Ленинград, Химия, 1986, сс. 175.

13. Хмельницкий Р.А., Бродский Е.С. Хроматомасс-спекгрометрия. Москва, Химия, 1984, сс. 216.

14. Физические основы масс-спектрометрии: Методы ионизации. Под ред. Г.А. Толстикова. Уфа, Башкирский филиал АН СССР, 1985, сс. 120.

15. Чепмен Дж. Практическая органическая масс-спектрометрия. Москва, Мир, 1988, сс. 216.

16. McLafferty F.W., Turecek F. Interpretation of mass spectra. Mill Valey: University Science Books, 1993, pp. 422.

17. Хмельницкий P. А., Бродский E.C. Масс-спектрометрия загрязнений окружающей среды. Москва, Химия, 1990, сс.182.

18. Griffiths W.J., Yang Y., Lindgren J.A., Sjovall J. Charge remote fragmentation of fatty acid anions in 400 eV collisions with xenon atoms // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996. V. 10. P. 21-28.

19. Griffiths W.J. Tandem mass spectrometry in the study of fatty acids, bile acids, and steroids // Mass Spectrom. Rev. 2003. V. 22. P. 81-152.

20. Domon В., Costello C.E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates // Glycoconj. J. 1988. V. 5. P. 397-409.

21. Harvey D.J, Matrix-assisted laser desorbtion/ionization mass spectrometry of carbohydrates and glycoconjugates // Int. J. Mass Spectrom. 2003. V. 226. P. 1-35.

22. Liu S., Cui M., Liu Z., Song F. Structural Analysis of saponins from medicinal herbs using electrospray ionization tandem mass spectrometry // J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 2004. V. 15. P. 133-141.

23. Cuyckens F., Claeys M. Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids // J. Mass Spectrom. 2004. V. 39. P. 1-15.

24. Biochemical applications of mass spectrometry. Ed. by Waller G.R. WILLEI-INTERSCIENCE, a Division on John Willei&Sons, Inc. 1972. pp.872.

25. Будзикевич Г., Джерасси К., Вильяме Д. Интерпретация масс-спектров органических соединений. Москва, Мир, 1966, сс. 323.

26. Джонстон Р. Руководство по масс-спектрометрии для химиков-органиков. Москва, Мир, 1975, сс. 236.

27. Рашкес Я.В., Кича А.А., Левина Э.В., Стоник В.А. Масс-спектры полиоксистероидов из морской звезды Patiria pectinifera // Химия природ, соедин. 1985. № 3. С. 361 367.

28. Elaskary Н., Holzl J., Hilal S., Elkashoury E. Cardenolide glycosides with doubly linked sugars from Gomphocarpuc-sinaicus II Phytochemistry. 1999. V. 34. N 5. P. 1399-1402.

29. Reznicek G., Matha M. Determination of the sugar linkage position in glycosides using ammonia chemical ionization mass spectrometry at low gas pressure // Carbohydrate Res. 1996. V. 293. N 1. P. 133-137.

30. Madl Т., Sterk H., Mittelbach M. Rechberger G.N. Tandem mass spectrometric analysis of a complex triterpene saponin mixture of Chenopodium quinoa // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006. V. 17. P. 795-806.

31. Barber M., Bordoli R.S., Elliott G.J., Sedwick R.D., Tyler A.N. Fast atom bombardment: Mass spectrometry. Anal. Chem. 54: 645-657. // Anal. Chem. 1982. V. 54A. P. 645-657.

32. ТанцыревГ.Д., КлейменовH.A. //Доклады АН. 1973. Т. 213. № 3. С. 649

33. Танцырев Г.Д., Поволоцкая М.И. Автор, свид. № 983829 «Способ масс-спектрометрического анализа молекулярных нелетучих веществ». Заявл. 12.03.1981, № 3261121, опубл. В Б.И. 1982, № 47. МКИ № HOJ 49/26.

34. Танцырев Г.Д., Поволоцкая М.И., Сараев В.А. Стабилизирующее действие глицерина на вторично-эмиссионные масс-спектры биоорганических соединений // Химич. физика. 1983. № 6. С. 804-809.

35. Busch K.L. Desorpsion ionization mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 1995. V.30. P. 233-240.

36. De Hoffmann E. Tandem mass spectrometry: a primer // J. Mass Spectrom. 1996. V.31. P. 129-137.

37. Tomer K.B., Gross M.L. Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry for structure determination: remote site fragmentation of steroid conjugates and bile salts // Biomed. Env. Mass Spectrom. 1988. V. 15. P. 89-98.

38. Takayama M. Collision-induced dissociation of glycoside alkali-metal adduct ions in fast-atom-bombardment mass-spectrometry // Org. Mass Spectrom. 1993. V. 28. N 8. P.878-882.

39. Liang F., Li L.J., Abiliz Z., Yang Y.C., Shi J.G. Structural characterization of steroidal saponins by electrospray ionization and fast-atom bombardment tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002. V. 16. N 12. P. 11681173.

40. Komori Т., Kawasaki Т., Schulten H.R. Field desorbtion and fast atom bombardment mass spectrometry of biologically active natural oligoglycosides // Mass Spectrom. Rev. 1985. V. 4. P. 255-293.

41. Whitehouse C.M., Dreyer R.N., Yamashita M., Fenn J.B. Electrospray Interface For Liquid Chromatographs and Mass Spectrometers. // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 675679.

42. Александров M.JI., Галль Л.Н., Краснов H.B., Николаев В.И., Павленко В.А., Шкуров В.А. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении -метод масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ // Доклады АН. 1984. Т. 277. № 2. С. 379-383.

43. Fenn J.B., Mann М., Meng С.К., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules // Science. 1989. V. 26. P. 6471.

44. Liu S., Cui M., Liu Z., Song F., Mo W. Structural analysis of saponins from medicinal herbs using electrospray ionization tandem mass spectrometry // Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. V. 15. P. 133-141.

45. Broberg S., Nord L.I., Kenne L. Oligosaccharide sequences in Quillaria saponins by electrospray ionization ion trap multiple-stage mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2004. V. 39. P. 691-701.

46. Li R„ Zhou Y., Wu Z., Ding L. ESI-QqTOF-MS/MS and APCI-IT-MS/MS analysis of steroid saponins from the rhizomes of Dioscorea panthaica II J. Mass Spectrom. 2006. V. 41. P. 1-22.

47. Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorbtion mass spectrometry of organic molecules // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 2935-2939.

48. Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet laser desorbtion of non-volatile compounds // Int. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. V. 78. P. 53-68.

49. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons //Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 2299-2301.

50. Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Protein and polymer analyses of up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. V. 2. P. 151-153.

51. Zenobi R., Knochenmuss R. Ion formation in MALDI mass spectrometry // Mass Spectrom. Rev. 1998. V. 17. P. 337-366.

52. Spengler В. Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorbtion/ionization mass spectrometry ofbiomolecules //J. Mass Spectrom. 1997. V. 32. P. 1019-1036.

53. Karas M., Gluckmann M., Schafer J. Ionization in matrix-assisted laser desorbtion/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors // J. Mass Spectrom. 2000. V.35.P. 1-12.

54. Stump M.J., Fleming R.S., Gong W.H., Jaber A.J., Jones J.J., Surber C.W., Wilkins C.L. Matrix-assisted laser desorbtion mass spectrometry // Appl. Spectrosc. Rev. 2002. V. 37. P. 275-303.

55. Еляков Г.Б., Стоник B.A. Терпеноиды морских организмов. Москва, Наука, 1986, сс. 270.

56. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Стероиды морских организмов. Москва, Наука, 1988, сс. 207.

57. Калинин В.И., Левин B.C., Стоник В.А. Химическая морфология: Тритерпеновые гликозиды голотурий. Дальнаука, Москва, сс. 284.

58. Stonik V.A., Elyakov G.B. Secondary metabolites from echinoderms as chemotaxonomic markers. In: Scheuer, P.J., eds. Bioorganic Marine Chemistry.Volume 2. Berlin: Springer-Verlag; 1988:43-86.

59. Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V. Marine tetracyclic isoprenoids: structures and biosynthesis // Pure & Appl. Chem. 1990. V. 62. N 7. P. 1259-1262.

60. Еляков Г.Б., Михайлов B.B., Стоник B.A., Кузнецова T.A. Некоторые итоги и перспективы исследований в области морской биохимии и биотехнологии // Биоорганич. химия.1992. Т. 18. N 10-11. С. 1424-1440.

61. Elyakov G.B., Stonik V.A., Mikhailov V.V., Kuznetsova T.A. From Chemistry of Marine Natural Products to Marine Technologies: Research at the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry. // Mar. Tech. Soc. Journal. 1996. V. 30. N 1. P. 21-28.

62. Elyakov G.B., Stonik V.A., Kuznetsova T.A., Mikhailov V.V. New trends of marine biotechnology development. // Pure and Appl. Chem. 1993. V. 6. N 4. P. 811-818.

63. Стоник B.A. Морские полярные стероиды // Успехи химии. 2001. Т. 70. № 8. С. 763-807.

64. Habermehl G., Volkvein G. Aglycones of the toxins from the cuvierian organs of Holothuria forskali and a new nomenclature for the aglycones from Holothutioidea // Toxicon. 1971. V. 9. P. 319-326.

65. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution. // J. Nat. Toxins. 1999. V. 8. P. 235-248.

66. Авилов С.А., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Кукумариозид G2 минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix И Химия природ, соедин. 1991. № 3. С. 438 - 439.

67. Avilov S.A., Kalinin V.I., Makarieva T.N., Stonik V.A., Kalinovsky A.I. Structure of cucumarioside G2, a novel nonholostane glycoside from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix II J. Nat. Prod. 1994. V. 57. № 8. P. 1166 1171.

68. Авилов СЛ., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Кукумариозид G4 новый тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 691 - 694.

69. Дроздова O.A., Авилов C.A., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Новые гликозиды из голотурии Cucumaria japonica II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 242-248.

70. Girard М., Belanger J., ApSimon J. W., Garneau F.-X., Harvey C., Brisson J.-R. Frondoside A. A novel triterpene glycoside from the holothurian Cucumaria frondosa //Can. J. Chem. 1990. V. 68. P. 11-18.

71. Drozdova O.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Riguera R., Jimenes C. Cytotoxic triterpene glycosides from Far-Eastern sea cucumbers belonging to the genus Cucumaria II Liebigs Ann. 1997. № 11. P. 2351-2356.

72. Дроздова O.A., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Трисульфатироваииые гликозиды из голотурии Cucumaria japonica И Химия природ, соедин. 1993. № 3. С. 369-374.

73. Kitagava I., Kobayashi М., Okamoto Y., Yoshikawa М., Hamamoto Y. Structures of sarasinosides Aj, B( and C, new norlanostane-triterpenoid olygoglycosides from the Palauan marine sponge Asteropus sarasinosum И Chem. Pharm. Bull. 1987.V. 35. P. 5036-5039.

74. Schmitz F.J., Ksebati M.B., Gunasekera S.P., Agarwal S. Sarasinoside k\\ a saponin containing aminosugars isolated from a sponge // J. Org. Chem. 1988. V. 53. P. 59415947.

75. Espada A., Jimenez C., Rodriguez J., Crews P., Riguera R. Sarasinosides D-G: four new triterpenoid saponins from the sponge Asteropus sarasinosum II Tetrahedron. 1992. V. 48. P. 8685-8696.

76. Ksebati M.B., Schmitz F.J., Gunasekera S.P. Ponosides A-E, novel triterpene galactosides from a marine sponge, Asteropus sp. H J. Org. Chem. 1988. V. 53. P. 3917-3921.

77. Northcote P.T., Andersen R.J. Xestovanin A and secoxestovanin A, triterpenoid glycosides with new carbon skeleton from the sponge Xestospongia vanilla II J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. P. 6276-6280.

78. Carmely S., Roll M., Loya Y., Kashman Y. The structures of eryloside A, a new antitumor and antifungal 4-methylated steroidal glycoside from the sponge Erylis lendenfeldi И J. Nat. Prod. 1989. V. 52. P. 167-170.

79. Hirota H., Takayama S., Miyashira S., Ozaki S. Structure of a novel steroidal saponin, pachastrelloside A, obtained from a marine sponge of the genus Pachatrella II Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. P. 3321-324.

80. Yeung B.K.S., Homann M.T., Scheuer P.J., Kelly-Borges M. Hapaoside: a 19-norpregnane glycoside from the sponge Clibrochalina olemda II Tetrahedron. 1994. V. 50. P. 12593-12598.

81. Dai H.-F., Edrada R.A., Ebel R., Nimtz M., Wray V., Proksch P. Norlanostane triterpenoidal saponins from the marine sponge Melophus sarassinorum // J. Nat. Prod. V.68.P. 1231-1237.

82. D'Auria M.V., Minale L., Riccio R. Polyoxygenated steroids of marine origin // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 1839 1895.

83. Finamore E., Minale L., Riccio R., Rinaldo G., Zollo F. Novel marine polyhydroxylated steroids from the starfish Myxoderma platyacanthum.JI J. Org. Chem. 1991. V. 56. N 3. P. 1146-1153.

84. Findlay J.A., He Z.-Q., Blackwell B. Minor saponins from the starfish Asterias forbesi. II Can. J. Chem. 1990. V. 68. N 7. P. 1215-1217.

85. Vazquez M.J., Quinoa E., Riguera R., San Martin A., Darias J. Santiagoside, the first asterosaponin from an Antarctic starfish (.Neosmilaster georgianus). II Tetrahedron. 1992. V. 48. N32. P. 6739-6746.

86. Bruno I., Minale L., Pizza C., Zollo F., Riccio R., Mellon F.M. Starfish saponins. Part 14. Structures of the steroidal glycoside sulphates from the starfish Marthasterias glacialis. И J. Soc. Perkin Trans 1.1984. P. 1875-1883.

87. De Riccardis F., Minale L., Riccio R., Giovannitti В., Iorizzi M., Debitus C. Phosphated and sulfated marine polyhydroxylated steroids from the starfish Tremaster novaecaledoniae. И Gazz. Chim. Ital. 1993. Vol. 123. P. 79-86.

88. Зарецкий В.И., Вульфсон Н.С., Заикин В.Г., Паперная И.Б. Определение положения двойной связи в некоторых стероидных системах методом осколочной масс-спектрометрии // Химия природ, соедин. 1967. № 6. С. 383 -391.

89. Якубов Н.И., Рашкес Я.В., Пальянц Н.Ш. Фрагментация неэтерифицированного углеводного звена карденолидов. Монозиды // Химия природ, соедин. 1983. № з. с. 345 354.

90. Kitagawa I., Nishino Т., Matsuno Т., Akutsu H., Kyogoku Y. Structure of holothurin В a pharmacologically active triterpene-oligoglycoside from the sea cucumber Holothuria leucospilota Brandt // Tetrahedron Lett. 1978. № 11. P. 985 -988.

91. Zurita M.B., Ahond A., Poupat C., Potier P., Menou J.L. Invertebres marins du lagon Neo-Caledonien, VII. Etude structurale d'un nouveau saponoside sulfate extraitde l'holothurie, Neothypnidium magnum II J. Nat. Prod. 1986. V. 49, No. 5. P. 809 -813.

92. Santalova E.A., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Berdyshev D.V., Stonik V.A. Two New Sarasinosides from the Sponge Melophlus sarasinorum II Nat. Prod. Commun. 2006. V. 1. N 4. P. 265-271.

93. Dai H.-F., Edrada R.A., Ebel R., Nimtz M„ Wray V., Proksch P. Norlanostane triterpenoidal saponins from the marine sponge Melophlus sarassinorum II J. Nat. Prod. 2005. V. 68. P. 1231-1237.

94. Иванчина H.B., Маляренко T.B., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С. Астеросапонин офидианозид F из гонад дальневосточной морской звезды Aphelasterias japonica II Химия прир. соедин. 2005. № 4. С. 392-393.

95. Ivanchina N.V., Kicha А.А., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A., Riguera R., Jimenez C. Hemolitic polar steroidal constituents of the starfish Aphelasterias japonica И J. Nat. Prod. 2000. V. 63. P. 1178 -1181.

96. Хасин Ю.И., Дмитренок П.С., Елькин Ю.Н. Источник ионов с твердотельной цезиевой пушкой для анализа термолабильных веществ // Научное приборостроение. 1990. С. 81-85.

97. Ivanchina N.V., Kicha А.А., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Prokofeva N.G., Stonik V.A. New steroid glycosides from the starfish Asterias rathbuni II J. Nat. Prod. 2001. V. 64. N7. P. 945 -947.

98. Кича A.A., Иванчина H.B., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Сульфатированные стероидные соединения из курильской популяции морской звезды Aphelasterias japonica И Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 4. С. 695 698.

99. Kicha А.А., Ivanchina N.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Alkaloidosteroids from the starfish Lethasterias nanimensis chelifera II Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. N 9. P. 1935 1937.

100. Iorizzi М., Minale L., Riccio R. Steroidal oligoglycoside sulphates and polyhydroxysteroids from the starfish Asterina pectinifera I I Gazz. Chim. Ital. 1990. V. 120. P. 147- 153.

101. Ivanchina N.V., Kicha A.A., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Hemolytic steroid disulfates from the Far Eastern starfish Pteraster pulvillus // J. Nat. Prod. 2003. V. 66. N 2. P. 298 301.

102. Левина Э.В., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Прокофьева Н.Г., Андриященко П.В., Стоник В.А. Тризерамид новый стероидный конъюгат из морской звезды Astropecten triseriatus II Доклады АН, биохимия. 2004. т. 396. № 3. С. 407-409.

103. Левина Э.В., Калиновский А.И., Андриященко П. В., Дмитренок П.С., Евтушенко Е. В., Стоник В.А. Новый стероидный гликозид фригиозид А и его агликон из морской звезды Hippasteriaphrygiana //Изв. АН. Сер. хим. 2003. № 7. С. 1539- 1543.

104. Иванчина H.B., Маляренко T.B., Кича A.A., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Полярные стероидные соединения из дальневосточной морской звезды Lethasterias fusca II Изв. АН. Сер. хим. 2007, в печати.

105. Kicha А.А., Ivanchina N.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Agafonova I.G., Stonik V.A. Novel steroidal triglycosides, Spinosides А, В and C, from the Far Eastern Starfish Hippasteria spinosa II In press.