Изучение свойств цитохрома с CANDIDA VALIDA и его гемсодержащих фрагментов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

h о OA

■j

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Специализированный сонет Д 063.41.01

На прапах рукописи

ЖУРАВЛЕВА Дарья Вадимовна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЦИТОХРОМА С CANDIDA VALIDA И ЕГО ГЕМСОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТОВ

Специальность 02.00.10 - Биооргачичргкая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Мое к па - 1993

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии топких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М:В.Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ член-корреспондент Инженерной Академии,

доктор химических наук, профессор МИРОНОВ А.Ф.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ профессор

доктор химических наук МИРОШНИКОВ А.И.

кандидат химических наук ФИЛАТОВ И.А.

' ВЕДУЩЕЕ ПРЕДПРИЯТИЕ МГУ им.М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 01 ноября 1993 года в" " часов иа заседании специализированного Совета Д 063.41.01 при МИТХТ , Москва, 117571, проспект Вернадского,

Д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ , Москва, 119831, ул. М.Пироговская, д.1.

Автореферат разослан "30' сентября 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат химических наук л С ЛЮТИК А.И. ,

Jf __

Актуальность проблемы, Предлагаемая работа посвящена проблемам иыделения и исследования структурных особенностей цитохрома с и его гемсодержащих фрагментом. Цитохром с является электронпереносятим белком, участвующим и происс.се клеточного дыхания как лукяриотических, так и ирокариотичеекпх клеток. В состав цитохрома £ входит полинептид...чя пень, включающая от 103 до 135 аминокислотных остатком, и завьсимости от источника белка, и копалечегно связанный гем с.

На протяжении многих лет цитохром с привлекает пристальное внимание биохимиков, . биофизиков, специалистов о области неорганической, координационной и физической хнмпн, а также физиологов и медиков Интерес исследователей к г.гому белку обусловлен двумя основными причинами Во-перпых, это функциональная значимость цитохрома с в организме человека. Цитохром с используется как лекарственный препарат для улучшения клеточного дыхания, при асфикции новорожденных, астме, шпемичсскон болезни сердца, сердечной недостаточности, хронической пнет.монии, инфекционном гепатите и других заболеваниях, связанных с • нарушением окислительных процессов в организме. Кроме того, известно положительное дейегшк; препарата, и cocían которою входит цитохром с, при лечении катаракты и старческой деградации сетчатки глаза. В мгдиичне нерспс.чтппным' язляегсч также применение. гемсодсржащих фрагментов цитохрома с, со сравнительно небольшой последовательностью аминокислотных остаткон. Дальнейшее исиользоганн^ цитохрома с и его фрагментов с качестве лекарственных пренгршо!» требует глубоких иследозашш механизма их функционирования, структурных особенностей,

л • ' ,u

метаболизма в клетке и разработки аффективных и технологичных методов получения и очистки.

Во-вторых, в силу саоего небольшого размера, легко детектируемой активности и характерных спектров поглощения, цитохром £ широко используется как модельный белок для отработки многообразных методов белковой химии, Цитохром g часто применяется для изучения механизмов, лежащих в основе межбелкового взаимодействия.

Настоящая работа является частью i лаповых исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии гонких органических соединений Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В.Ломоносова по теме: "Синтез молекулярных систем иа основе порфириняв и их димеров, содержащих донорно-акцеагорные заместители, с целью моделирования важнейших природных биологических! процессов и

» „ . . создания на их осноце соединении дл:г медицины, науки и техники .

Цель работы заключалась в выделении и структурном исследовании цитохрома g дрожжей Candida valida н его триптического гемпептида.

Научная tfoftHaaa В ходе работы была изучена способность цитохрома £ осаждаться под действием тетраиодида кадмия и комплекса железа с иодид-ионом и свободным иодом. Исследованы факторы, определяющие агрегирование белка под действием этих комплексных соединений. Предложен метод очистки цитохрома £, включающий стадию осаждения белка комплексом железа. Разработан метод получения гемпептида цитохрома £ трийсиноьым гидролизом непосредственно из цитохрома, осажденного йодным комплексом железа. Исследован состаз получаемого гидролизата," ^ образующегося э гетерогенных условиях. Изучен трипсинолиз

шпохрома с из осадка. Установлена структура и предложена аминокислотная последовательность гемсодсржащего пептида .'(итохроиа с дрож'кей Candida valida. На основания данных fîacc-спектроМетрни сделан яывод о сходстве исследуемого цнтохрсма г дрохокрй Candida valida с известным цнтохромс j с Candida krusei.

Прпггтгчессая "еппость Разработаны две схемы выделения щгпзхрсма с лро;кжей, основагные на осаждении белка солями кадмия и железа, использование которых поззоляет уменьшить вречя н трудоемкость процесса по ту-гения цитохрома £ з чистом виде. Пре,- южепный способ выделения гемнептида цитохрома £ дает возможность получать данное соединение непосредственно из дрожжевой биомассы, минуя стадию очистки цитохрома с, и сократить с :ему очистки самого гемсодержащего фрагмента при сохранении хорошего пыхода це^вого продукта.

Иа защиту выносятся следующие по;. ,женяя:

- разработка методов выделения и »" чистки цитохрома с из дрожжей на примере штамма Candida valida;

- разработка метода выделения гемпептида цитохрома с:

- определение структуры гемпептида из Candida valida;

- изучение закономерностей. осаждения цитохрома £ под действием комплексных соединений кадм"я и железа с ипдид-иопом и иодом;

- исследование трипсинолиза цитохрома £ в гетерогенных условиях;

Публикации По материалам диссертации опубликована одна печатав работа и получено 2 авторских свидетельства. Вторая статья принята к печати -

Апробация Работа обсуждена в завершенном виде на расширенном заседании кафедры Химии и т;хнологии тонких органических соединений 30 июня 1S93 года.

Содержание работы Диссертация состоит • из введения, обзора ли гератуты, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка литературы. Работа изложена на m страницах, включает Аб рисунков и г/ таблиц. Список литературы содержит

m ИСТОЧНИКОВ.

Основные результаты работы и их обсуждение

1. Разработка методов выделения и очистки иитохрома с * 1.) Иь деление питохрома с дрожжей Candida vajida осаждением

тетраиодидом кадмия

Цитохром с в настоящее время является коммерчески дос^гупНшм соединением, поставляемым рядом биохимических фирм, а такж<: биохимическими предприятиями в нашей стране и используется как п биохимии, так и в фармацевтике. Нами предложен новый метод выделения цптохромд с на основе дрожжей Candida valida с использованием комплексного реагента Na2CdI4i, (рис.1, схема 1а). Метод защищен авторским свидетельством.

Согласно' схсМё*Га/;<ос»ждеш1е цитихрома с из ультрафпльтрата иодндом металла явЙи.'!0к ступенью, совмещающей чистку, и концентрирование белка. После иео возможно применение ионообменной хроматографии без промежуточной обработки, так'как концентрация соли не велика. Приведенная схема дает выигрыш в производительности и во времени.

Схема была использована для выделения цлтохромов г из различных источников. В случае цитохрома с Candida valida был

* В руководстве данной работой принимал участие к.х.н., доцент М.А.Кулиш.

Рис. 1 Схемы пыделйайп цитохрома с и гемпеитгща

Дро;:сгси Candida valida ,1

Дезинтеграция

схема 1а,б схема II

проведен подбор оптимальных условий осаждения и ионообменной хроматографии на отечественом катионите К-б. При выделении иснользоиалась концентрация осадителя тетраиодида кадмия 0.025 М, а мри ионообменной хроматографии применяли 1 % раствор аммиака.

Полученный цитохром £ имел чистоту 92-95%. Выход составил 160 мг белка на 1 кг влажной биомассы. Электронный спектр (рис. 2) и алектрофореграмма цнтохрома с, полученного но предложенной схеме, не отличались от данных для белка, выделенного без применения СсП.,2', но методике, включающей ионообменную хроматографию и гель-фильтрацшо.

Длины вали, ни.

Рис.2. Электронный спектр цигохрома с СапсМа val¡da и счисленном (сплошная линия) и восстановленном (пунктирная ли!(ия) саде.

\

Содержанке ионоп кадмия к иола в конечном препарате цитохрома с, определенное с помощью атомной адсорбции н аналитически, не превышает его уропень п образцах, полученных классическим методом.

1.2 Использование полного комплекса железа для выделения ннтохрома с

Цитохром с, получаемый по списанной выше схеме, не содержит ионов кадмия и иода. Тем не менее, применение такого токсичного соединения, как соль кадмия, крайне нежелательно в технологическом плане н требует дополнительных мер для соблюдения требовании экологической безопасности производства. В связи с этим, был проведен поиск соединении, не уступающих тетраиодиду кадмия в эффективности, ио являющихся более безопасными с точки зрения производственного процесса. В результате выполненных исследований было найдено соединение, обладающее перечисленными свойствами. Анализ этого соединения позволяет предположить наличие в реагенте иона двухвалентного железа, иодид-ионов и свободного иода. Подробно исследование процесса осаждения ннтохрома с лгим реагентом приведено в разделе 6. Образующийся осадок ннтохрома с. оказался труднорастворимым: Были подобраны условия его полного и быстрого растворения. Метод основан па использовании для этой цели восстановителя, например дигиосита или аскорбата натрия. По— иидимому, действие последнего заключается р превращении любодного иода, входящего в состав комплекса с жечезом, в иодид. Образующийся комплекс теряет белок-агрегирующие свойства, и цитохром с переходит в раствор.

На основании обнаруженного свойства цитохрома £ осаждаться под действием комплекса железа и иода,была разработана новая схема выделения нитохрома с. Данный метод представляет собой модификацию метода, приведенного на рисунке 1 (схема 16), в котором высаливание нитохрома £ проводится реагентом, содержащим FeC!3 и Nal в соотношении 1:4, а растворение осадка осуществляется при добавлении восстановителя. Цитохром £,полученный но схеме II, обладал электрофоретнческой подвижностью и электронным спектром, идентичными стандарту нитохрома £.

2. Характеристика и первичная структура гемпептида нитохрома с дрожжей Candida valida.

Для исследования аминокислотной последовательности гемсодержащего фрагмента цитохрома £ дрожжей Candida valida гем пептид был получен грнпсинолизом из чистого белка, с последующей очисткой его методом ионообменной хроматографии и гель-фильтрацией па Сефадексс G-25. Гомогенность полученного пептида подтверждена электрофоретически и ВЭЖХ на обращенной фазе.

Для определения молекулярной массы была использойана времяпролетная масс-спс-ктрометрия с ионизацией осколками деления калифорния. Молекулярная масса гемпептида цитохрома £ Candida valida составила 2066±2 Д. Аминокислотный анализ и пептидное картирование позволили установить состав дрожжевого гемпептида.

Результаты аминокислотного анализа представлены в таблице' !.

Первичная структура известных цитохромов с в районе ковалентной связи с гемом включает два пистеина, которые являются инвариантными, а также не менее одного гнсткднпа. На основании аналогии в структуре цитохромоп и результатов аминокислотного анализа мы предполагаем, что гемпепгмд из дрожжей Candida valida, полученный трнпснновым гидролизом, имеет следующую лервнчную структуру:

H-Cys-A[aXj[nJCys-'His-Thr-Ilc'Ciu-Ala-G[y*Gly-Pw-His-Lys-OH

I—_ тем-1

Таблица ,1

Данные аминокислотного анализа гемпептида цитохрома q Candida

valida.

Аминокислотные остатки Результаты аминокислотиого анализа Предположительное количество

•Cys 0.26 2

Ala 2.0 2

His 1.94 2

Glx 1;8 .2

Tiir 0.32 1

Ile 0.96 4

Pro . -

¡Lys 0.84 1 1

Gly 1.88 2 i

Приведенная последовательность позволяет определить молекулярную массу гемнентьда рапной 2068 единицам, что находится в хорошем соответствии с данными масс-епектромегрил.

¡Из гемтетрадеканептидл обработкой химотрипсином и стгфилококовой прогеазой были получены гемиентапептид и

гемоктапеитид цитохрома £ Candida valida. Значения их молекулярных масс соответствуют предложенной структуре гемового фрагмента цитохрома £ Все гемпептиды были исследованы на пероксида.чпую активность. Наибольшую активность среди дрожжевых гемпептндов проявил октапепгид.

Таблица 2

1Тероксидазная активность гемпептндов цитохрома с, выраженная через начальную скорость окисления НАДН в прнсутстмш треч-бутилгидроперекксм, s M/с

Гемпептид КОНЦ.М/л Скорость окисления

Дитохром £ быка Гемнонаиептид 5*10* | 7.0 <-0.6

Гемоктапептид 5*10* 11.8+0.5

Цнтохром £ Candida valida Гемтстрадекааептид- 5*10"? 3.5+0.3

Гемоктапептид 5*10* : 11.3+0.6

Пероксидаза хрена 5*10' 219+0.8

Гечин с* Ю 5 0.18+0.07

, В ходе работы были выделены также ггмсодержащие фрагменты из цитохрома £ сердечной мышцы крупного рогатого скота и проведено сравнение их гл,Тайшета с д: .з.:::ссцыми аналогами. Пероксидазная активность г« моктапептвдоп из цазиых источников оказалась очень близкой, что дает ьоз.\'о::;.чоеть применять гемоктапептид цитохрома £ Candida valida и качестве микропе[оксидаш (Таблица 2).

Трипсннопый гидролиз питохрома с, осажлсниного___ИШШШ

тшжш2М_жед£2ПА

Наряду с получением гемпсптнда дрожжей Candida valida по традиционной схеме, нами было проведено выделение гемсодер «amero фрагмента непосредственно ,13 дрожжевого экстракта, обогащенного цнтохромом g за счет ульграфнльтрацин. Этот экстракт осаждался комплексной солью железа и иода. Осадок подвергался расщеплению трипсином без дополнительной очистки. При трипсинолизе происходило иакои -ение гемсодержащего фрагмента в растворе. Полученный гемпептид был идентичнен выделеннсму традиционным путем, что было подтверждено идентичностью! масс-спектров, электронных спектров и аминокислотного состава.

Анализ трипенновых гидролнзагзв методом ВЭЖХ на обращенной фазе показал, что гемтстрадекапептид является единственным гемсодержащим компонентом гидролизата из осадка. Это значительно облегчает процесс очистки. Гемпепетид, получаемый из осажденного цнтохрома с. может быть очищен в одну стадию методом гель-фильтрации на Сефадексе G-25' в С.4 M растворе бикарбоната аммония..

Предложенный метод получения гемг?птида Тгр^дставлен на рисунке 1 (схема II). Содержание гемпептида в'полученном образце составило 96%.

Была проанализирована зависимость накопления гемпептида в растворе ог времени трипсинолиза. Количественно динамика гидролиза оценивалась на основании данных ВЭЖХ по лощадн пиков гемпептида при 405 нм.

Экспериментальные данные показывают, что на первом этапе трипсинолиз цитохрома с иг осадка идет быстрее, чем при

классическом гидролизе, по-видимому, за счет относительного избытка фермента нал субстратом, находящимся в твердо» фазе. Затем скорость триисинолиза замедляется, и общий выход после 24 часов составляет около 80 %, причем ни дополнительное прибавление трипсина к суспензии, ни увеличение времени реакции существенно не влияют на выход целевого^ продукта.

Таким образом, разработанная схема выделения гемпептида позволяет получать этот препарат без предварительной очистки цитохрома с из обогащенного экстракта дрожжей.

4. Иитохром с дрожжей Candida valida

Цатохром с дрожжей Candida valida был выделен как по разработанной ними методике, так н по традиционной схеме, Еключ'а&щеи мосле ультрафильтрацни обессолнванне концентрата,

ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию на Сефадексе G-

j

75. Очищенный <&лок был охарактеризован спектрально, олек^офрротжссш!, определено содержание железа, а также р! и Mo/:v:<y.-fjp!(a-i ;т.':~сг. Датк-ге пр^дстазл-онь: в таблице 3. Ес-док, выдсхениый по нашей схеме, идентичен по своим физико-химическим свойствам иитохрому с, выделяемому традиционными методами. Электрофорез в присутствии ДСН свсжеочищенного белка показывает гомогенность препарата, но нр:". хранении происходит полимеризация белка в растворе, чг.м шляется характерным для митохондриальн: ¡х цнтохромоа с.

Молекулярная масса цшохрома с, определен!,'-;:;; масс-спектрометричсски, оказалась рл;но:"; 12555*10 Д (сроднее гшачснис масс одно-, двух- и трехзарядмого ион^а). Полученная-величина очень'" близка к масса белка из дрожлсен того же рода - Candida kr.isei, лл;.

которой расчетным молекулярный вес составляет 12.553 Д.

Получив точную величину молекулярной массы, мы смогли определить молярные коэффициенты поглощения цигохрома с, которые составили для восстановленной формы 15480 М 'см1 при длине волны 520 нм, 28260М-,смЛ при 548.3 им, а для окисленной формы при 528.7 нм - 10930 М 'см '.

Таблица 3

Свойства цитохрома £ Candida valida

Окисленная форма

i t Молекулярный вес 12555±Ю

I Изозлектрическая точка 9.8

I Содержание Fe , % 0.43

! Спектральные характеристики, нм | - «шелешшая форма | - восстановленная форма 276, 357, 405, 530 ■410, 520, 549,

Сходство аминокислотной последовательности гемиептида, полученного из данного нитсхро.ча с, с известной структурой гемпентнда дрожжей Candida krusei, равно ., как и близость молекулярных масс цигохромов дают возможность говорить о подобной структуре Аелков из этих двух штаммов.

Для выяснения аминокислотной последовательное г i был выполнен тринтический гндроллз бел::а из Candida valida и проведено : lacc-cn'-scTf смотр::1- ■ ^r.-.ien:::».--.- :к: т."«<;ннь;::

'iiparvt-HT'*). r:.''Jr:'-."' ' ' -. -г - ;

цитозфомг j; Candida krusei. Хотя ндс-.тичность молекулярных масс фрагментов не чоя.ст яьляться однозначным свидетельством ндонтнчност!' аминокислотных лоследователыюстей и составов, дли иитохромоп с из родстиенных штаммос можно сделать предположение об аналогиях в участках последовательности 1-10, 20-44, ('-'1-7У, 80-92, обе,значенных 1, 4. 5, 7, 9 на рис.3.

Рпс.З

Аминокислотная последовательность цнтохрома £ ('andida krusei. Стрелками отмечены места расщепления трипсином.

1 J I 2 i 3 4 4 I

PAPFEO GSAKK CATL.F KTRCA QCHTI EACCP HKVGP

li \ 6 И 7

NLHC1 FSRHS CQAEC i'SYFD AWKRA CVEWA EPTMS

I 8 la ||ioin 1 12 DYLEN Р(Гт1)&1 РСГKM AFCCL KFL4KD RNDLV

TÍMLE ASK

Различи« в молекулярньи: массах фрагментов на 5 а более единиц достаточно однозначно говорят о различиях в аминокислотном составе. По-видимому, такие изменения имеют место в участках 45-59 и 98-109.

Таким образом, исследованный цитохром с Candida valida является близким к цитохрому с Candida krusei, для которого известна аминокислотная лоследовагельность, имеет идентичный гемсодержащий пептид, но обладает мутационными различиями по ряду положений.

Таблица 4

Сращение моле сучярных масс фрагментов иитохромоь с Candida valida и Can 'ida krusei

Номер Молекуляр- Последов;, .г-льность Масса

фрагмента ный вес фрагмент?. фрагмента

С.krusei С.krusei С.krusei С. va! ida

1 1031 PAPFEQGSAK Í03.5

2 764 KGATLFK 761

3 275 IR -

4 2068 CAQCHTIEAGGPlîK 2067

5 1196 VGPNUIGIFSR tí 97

6 1641 l!S( JQAEGYSYTDAWK . 1649

7 2211 / G VEWAEPTMSDVLE NPTir.lK 2214

S 677 YIPGTK -

9 722 MAFGGLK 722

10 217 A К ; I

11 290 DR , _ í

12 1384 NUI.Vr/MLCASK 1370

5. Оса>кдецне нихрома с тегр.чколилом каду/ил Изучение Процесса осаждения показало, что определяющими в

А

реагенте цдяются нон кадмия и иодид-ионы. Простые соли* кадмия, в том числе иоднц кадмия, равно как и .простые иодг.'.ы, не оказывали осаждаощего действия на белок в том же интервале концентраций.

Из литературных данных известно, что а растворе могут существовать комплексы состава СЛ1(1+), Сс11зС1-), Cd¡4(2-). Спектры ЯМР на ядрах 11:1 С«1 н результаты титрования цнтохрома

г •

иоднд-иопом в присутствии ионоз кадмия показали, *гто о состав

реагент^ вход;1 г нон кадмпл и иидид-ноны и соотношении 1 : 4. Из этого был сделав ььшод, что рсакцноикоспособным соединением при осаждении иитакромд с является тетраиодид кадмия..

И результате выполненных спектрофотометр» чсских, электрофорсгнческих и хроматограф» ческих исследовании не удалось обнаружить свидетельств прочного специфического связывания Сс3142" с цмгохромом с. Следовательно, да1шое взаиу.одеистпне можно рассматривать как определенную разновидность высаливания. Нами было показано, что ряд белков также был нодзержен агрегирующему действию данного комплексного иола. Такое влияние тетранодида кадмия говорит о достаточной универсальности этого комплексного соединения как осадителя белков, и дает возможность рассматривать исследования осаждения цитохрома £ как модель для изучения процесса высаливания данным соединением.

Для изучения характеристик высаливания были проведены серки опытов с разными концентрациям« цитохрома с. -На основании экспериментальных дан ■ лх были построены графики зависимости 'степени осаждения от количества-гетра»однда кадмия (рис.,4).

!На начальном этапе добавления неорганической -соли' к раствору белка не наблюдается заметной агрегации, что отражается на графиках линейным горизонтальным участком. После того, как растворимость цитохрома £ снижается до величины его начальной концентрации, начинается резкое выпадение осадка. 'Наклон линии, соответствующей этому участку, отражает скорость процесса осаждения. Агрегация цитохрома £ проходит более интенсивно в растворах с большей концентрацией белка, тогда как в разбавленных растворах цитохром с высаливается медленнее.

Для количественной оценки процесса высаливания была использована эмпирическая формула (1) Ьп Б = Ь + Кб'ш,

где Ь - постоянная высаливания, Кэ - константа высаливания, 5 -концентрация белка, измеренная в граммах/кг растворителя, гп -моляльность раствора соли. Для определения истинных величин Кв и Ь было необходимо провести экстраполяцию экспериментальных данных к случаю идеального разбавления. Зависимость эффективных констант высаливания от разведения с наибольшим приближением описывается кривой Кэ = 94,2 + 237,ЗЕхр(-0,0688(1)

2

концентрация Сй14",тМ

Рис.4 Зависимость концентрации цнтохрома с, остающегося в растворе, от концентрации С<Ш2" Крипыс соответствуют исходным растворам с разным содержанием цитохрома с. Концентрация белка выражена в г/кг воды.

Общий характер наблюдаемого процесса свидетельствует о принадлежности его к нысалпванпю, по необходимо отметить ряд интересных отличий. Первое из них - возможность проводить осаждение нрн мнлимолярных концентрациях соли. Прочие отличия связаны с уникальным влиянием температуры и рН на ход процесса осакденг.я цитохрома с гстраиодндом кадмия.

При проведении агрегации » кисло» среде (рН 4) происходит усиление осаждения. причем увеличивается как константа высаливания, так и постоянная Ь. Опыты, проведенные при трех значениях температуры: 8, 18 и 38 С, не выявили различии между сериями, ни в наклон? кривых, ни в величине Ь.

Изменение хода агрегации в зависимости от характера и концентрации используемого буфера не являлось характеристикой процесса осаждения, а во многом определялось прочностью аниона тетранодида кадмия.

Влияние положигслино заряженных боковых пеней лизина и аргинина было исследовано на ацетилированном цитохроме £. Были получены две фракц .и ацетилированного белка: полностью ацетилирошнный цнтохром с и шггохром с, содержащий 5-6 ацетилированныХ лизиноп. Обе лти фракции подвергались осаждающему действию тетранодида кадмия в значительно меньшей степени, чем исходный цнтохром Экспериментальные данные позволяют сделать вывод о доминировании ионных пзаимодсйствий между цитохромом с и анионом тетранодида кадмия при высаливании, при небольшой роли гидрофобных взаимодействии. Роль аминокислотных остатков может щкже заключаться и создании общего или местного дииолыюго момент«, на молекуле цитохрома с.

Осадки, образующиеся при обработке цчтохрола с тотракодидом кадмия, одержат в споем сос ,ве атомы «ада и кадмия.

Лтомно-адсорбцпонный анализ на кадмий показал наличие 5-8 атомов этого металла на молекулу цитохрома с. Наблюдалось постоянство состава осадка вне зависимости от условий осаждения, что может свидетельствовать о существовании регулярной структуры в осадке. По-видимому, именно исчезновение этого аниона из структуры осадка вызывает его переход в раствор.

в. Осаждение цитохрома с полным комплексом железа.

Проведенные исследования показали, что соединение, вызывающее осаждение автохрома с из раствора, которое ь дальнейшем для простоты будет обозначено как йодный комплекс железа, включает в себя ион двухвалентного железа, иодид-анион и свободный код, возможно в виде трииоднда Г3". Однозначно определить структуру реагента сложно в силу способности солен железа включать о себя как двухвалентные, так к трехвалентные ионы этого металла.

Как л в случае осаждения цитохрома с тегракодндом кадмия, были предприняты попытки выявить специфическое связывание между белком и реагентом. На основании якепернмелтальных .данных был сделан вывед об отсутствии прочного специфического связывания между цитохромом с и йодным комплексом железа.

Для выяснения характера осаждения цитохрома с йодным комплексом железа были выполнены серии опытов при ¡; .зличных концентрациях цитохрома с. Поведение цитохрома с при обработке данным реагентом отличалось от наблюдавшегося три высаливании гетраиодндом кадмия. Прежде всего, следует отметить, что с увеличением копцептраинн белка в растворе требуется возрастающее количество ремонта для осаждения. Зависимость степени осаждения

ium.j;«!a с о. колц :ь грации pea: сита и растворе приведена на рис.П.

Неожидан!,.-д.-. ¡t¡ >ц- .icb действие йодного комплекс;. железа по •,гь- -bino r;¡' ;.i.;,,,poi.;.,¡,.b¡js цитохромам с. Лцм» лнрованные цнто :¡ s с ; ; • оса:кдаются при обработке йодным комплексом . Ci¡0v.0i/'i0CTb к агрегированию зависит сг степени

¿i.:- л.л... л;..,;»!!

Отличительной особенное гыо осадка цитохрома £, полученного осаждением йодным комплексом железа, шг.лась его труднорасгноримость. При продолжительном диализе было возможно регенерировать белок из осадка, он растворялся также при

концентрация ионов железа, мМ

Рис. 5 Зависимость концентрации цитохрома с, остающегося в растворе, от концентрации йодного комплекса железа Кривые соответствуют исходным растворам г разным содержанием цитохрома. Концентрация белка выражена в г/кг воды.

значительной концентрации Топо-ИО!, ¡< частично п растворах цетергентов. Способность быстро переходить 1! растнор под действием :лабых восстановигс-леи явилась специфичным снойством данного зсадка, связанным с природой реагента.

Изменение температуры проведения реакции и диапазоне ?-37°С не оказывает какого либо значительного эффекта на степень )саждсчшя цитохрома с.

'. Исследование механизма трнпенпплиза цитохрома с н осадке.

Прч изучении грипепнодиза было обнаружено, что пептидный остап гидролнзатов осажденного • цитохрома с и раствора белка ущественно различается между собой.

Для выяснения причин этого явления и изучения процесса рипсинолиза в гетерогенной фазе был подробно исследован состав ндролнзата па примере цитохрома с из сердечной мышцы крупного огатого скота. Этот объект был выбран в силу его лучшей зучснности по сравнению с дрожжевым цитохромом с. Фракции, олученные при разделении контрольного гидролизата, были роачалнзирозаны масс-спектрометрически, и на основании олученных данных были соотнесены пики на ВЭЖХ роматограммах.

Наличие существенных различий в составе гидролизатов и тыты но проведению триисинолиза при большой избытке трипсина, >«идимому, исключают возможность перехода цитохрома, с з аствор с последующим гидролизом его.

После исчерпывающего гидролиза цитохрома с со значительным )быгком (1:2) трипсина изменения в хроматограммах были .■значительными - в основном они были вызваны отщеплением

вторых ллг.п.юа в пслтц К'ЛРО'ГК к С17-.У0ЕЕТЬМЕУ1£КРКК, п оасаюплмшсч с;-;; Т-Ь и ЕОиЛУ^К, что соответствует М! ,сра;у>.;!ь;.ч ;

И;.; л'-':ол1:1'л.г..о!!--л! трипсигюлизс гидролхгата, полученного ¡13 с.се»;":;., н" ы»иару»с1Ю достуцнык трипсину нергсщеплеиных

... : , ..т..ос ш.тохрома г небольших коли'..ст' йодного . о.-!.!.' ;; с. > .еясзс чне ны-»ива.-ощ'¡х «¡с.)ждония белка) не приводит к >;омспс.'п;;о ш-дя хромато'рамм.

Продукт гидролиза, полученный чз осадка. практически не содержит пептидов с низкой гндрофобкостыо, время выхода" гсоторых 1"о<:гачляст о примененной системе 6-8 минут, и характеризуется большей чистотой целевого продукта по отношению к гсм-содсржьшим компонентам. Гидролиза? осадка цитохрома с не содержал фракций, соответствующих пептидам аминок хлотноп последов:'Г2лышст1. 74-79 '73-79), 39-53(40-53) и в нем присутствует малое количество пептидов 56-72 и 55-73. Вместе с тем, хро.магограммы показывдыг появление двух новых соединений -со временем зыхода '.1.5 и 16,5 мин, а также значительное увеличение пика со временем ь (хода 10,5 мил.

Данные масс-сп(:ктрометр 11и выявили в первом : из этих пиков соединение с молекулярной, массой 1729 и минерные вещества с массами 796 и 1046. Второй пик ие дает возможности говорить о наличии каких-либо крупных пептидов - . а спектрах присутствуют пики с массой 389 и 303. Увеличившийся пик 7 содержит новое вещество с массой 928, а также все компоненты, .присутствовавшие в соответствуй: цем пи.-г традиционного гидролизата.

Из литературных данных известно, ч.э наиболее тесный контакт между белковыми глобулами при кристаллизации цигох^ома с

7.3

наблюдался в регионе аминокислотных. остатков 45-83. Пространственная органпзацг. 7 ладка включает г глбя также комплексы железа, которые могут блокировать трнпсинолиз в осадке.

Таким образом, исследования трипсинолпза шпохрома с в виде у'1 осадка показали, что данный процесс яндяетсл reTcporeiiUDiM. Расщепление белка происходит на поверхности твердой фазы и сопровождается выделением я растнор гемсодержащого пептида, наряду с другими фрагментами ферментативного гидролиза.

■ ■ '>;-'' .. ■ ВЫВОДЫ

1. Разработана схема выделения щпохрома £ из дрожжей Candida , valiaâ, позволяющая сократить время к трудоемкость процесса получения данного белка. , г

I. Выделен и охарактеризован цигохром g из дрожжей Candida valida J Предложена схема чолуче'И'я чрнпгичоскогс гемпептчда щтохрома £ из обогащенной дрожжевой биомассу. ' i. Установлена структура глмсодержаща> о трипгичес^ого фрагмента 1итохрома£ Candida valida.

i. Исследованы особенности ггеотпкання грипткческого расщепления щтохрсма £, осажденного йодным комплексом железа. ? Показано, то процесс является гетерогенным и протекает между трипсином

растворе н цитохромом £ в твердой фазе. '

. Изучен процесс осаждения цитохрома £ тетралодчдои кадмия ц. одным комплексом железа. Проведен анализ процесса агрегации с эчки зрения теории высаливания.

Основные результаты лт rep rai in и изл">:<ен ы в следующих работах :

1. Лыс ко A.U., Лукьянова Л.Д , Дудченко A.M., Арутюшш A.M.. Журавлева Д.Ii., Кулиш М.А., Миронов А.Ф., Евстигнеева Р.П. ( механизм'.' янтнокендгштого эффекта гемшмапентида читохрома е./, ДАН CCCI'.-19'JO.-T 31Г>.-С.500-501

2. Журавле.ja Д.В.,Кулиш М.Л.,Миронов Л.Ф..Козлов В.И. Давидов Е.1\ Способ получения читохрома с дрожжей вид Candida valida A.c. 16(33024 СССР,- / D.II.-1991 , N2fi.

3. Журавлев;*. Д.В., Кулии' М.А., Миронов А.Ф. Способ получения гемпептида интохроми е A.c. Î7G8P13 СССР/ / Б.И.ч992 -N38.

Заказ 1г'2 Тарза il ¿'-опт?!!о

Ротаг;р;::!тиая ¡¡¡¡ТТЛ! ка.Х.Ь.Лонмиооее М.Гиригохогал ул.,ц.Т