Изучение взаимодействия витамина K1 и его производных с аминокислотами хинон-связывающего сайта фотосистемы I тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЕОНОВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

Изучение взаимодействия витамина ^ и его производных с аминокислотами хинон-связывающего сайта фотосистемы I

02.00.10-Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им Н А Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова

Научный руководитель

Доктор химических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Евстигнеева Рима Порфирьевнз}

Доктор химических наук, профессор Миронов Андрей Федорович

Официальные оппоненты

Доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович

Доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы

Ведущая организация Институт биохимии им А Н Баха

Защита состоится r¿&£>5', в 15 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им M B Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова (119831, Москва, ул М Пироговская, д 1)

Автореферат разослан

г

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

Кандидат химических наук, Старший научный сотрудник

ЛютикА И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Важное место в современной науке отводится исследованиям, посвященным поиску альтернативных источников энергии. Одним из наиболее перспективных направлений представляется изучение природных фотосинтетических процессов преобразования энергии солнечного света с целью ее возможного использования для пополнения мировых энергоресурсов. В настоящее время эффективность этих исследований обусловлена развитием биотехнологических, физических и физико-химических методов, позволяющих изучать молекулярные основы механизмов переноса энергии и электрического заряда, а также влияние белково-липидного окружения на функцию доноров и акцепторов редокс-эквивалентов. В связи с этим является актуальным изучение структур функционально значимых элементов фотосинтетических систем, в частности взаимодействия филлохинона с аминокислотами хинон-связывающего сайта (Д-сайта) и донорно-акцепторного взаимодействия на участке А0-А1 в фотосистеме I (ФС1).

Пигмент-белковый комплекс ФС1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, обусловленное переносом - электронов от периферических белков, таких как пластоцианин или цитохром к водорастворимым природным акцепторам — ферредоксину или флаводоксину. Фотосистема I содержит около 12 полипептидных субъединиц, три из которых РваА, РэаВ и РваС связывают ~100 молекул хлорофилла а (СИ! а), 15-25 (5-каротиноидов, 2 молекулы филлохинона и 3 железо-серных кластера (РечЗ«). образуя комплекс ФС1. Перенос электрона осуществляется с участием симметрично расположенных кофакторов. В этом процессе задействованы первичный донор (димер хлорофилла а), первичный акцептор Ао (мономер хлорофилла а), вторичный акцептор А1 (молекула филлохинона, витамина К, (К1)) и железо-серные кластеры Рх, Яа, Яз. Хлорофиллы и филлохиноны располагаются симметрично в двух областях и координируются РваА и РваВ субъединицами.

Молекулы филлохинона локализуются в хинон-связывающих сайтах, образованных отдельными участками полипептидных субъединиц РваА и РваБ. Малая идентичность этих полипептидов (45-50% по всей длине) обуславливает различный характер связывания молекул витамина К1 с белковым окружением и, следовательно, особенности их функций. На основании сайт-направленного мутагенеза было сделано предположение, что Тгр А697, принадлежащий РваА-субъединице и являющийся лигандом, влияет на редокс-потенциал ДД и на

переносе

восстановление железо-серного кластера Рх, ч -оРОЭДДОДООвВДбНАа

БИБЛИОТЕКА

электрона только вдоль PsaA-области ФС I. Наряду с этим была высказана гипотеза о возможности переноса электрона как вдоль PsaA, так и вдоль PsaB ветвей. В этом случае одна молекула витамина ^ ответственна за медленный, а вторая - за быстрый перенос электрона P. и Joliot А.). Аминокислотные остатки в составе PsaA и PsaB, вероятно, предопределяют такое различие в функции вторичного акцептора электрона. До сих пор остается открытым вопрос, участвуют ли в переносе электрона в ФС1 кофакторы обеих ветвей (PsaA и PsaB) или только одной, а также вопрос относительно роли отдельных кофакторов, в частности филлохинона.

Изучение взаимодействия филлохинона с аминокислотами хинон-связывающего сайта является необходимым для установления особенностей транспорта электрона и выяснения роли каждой молекулы филлохинона в этом процессе. Одним из удобных подходов для изучения - свойств Ai-сайта является создание искусственных нековалентно связанных систем, моделирующих взаимодействие витамина ^ и его производных с аминокислотами.

Работа выполнена в рамках программ научных исследований Министерства образования РФ, проводимых в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова - на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений по теме № 1Б-3-865 «Химический и микробиологический синтез биологически активных соединений, моделирующих процессы энергопереноса и биорегуляции».

Цель работы. Данная диссертация посвящена изучению искусственных систем, моделирующих взаимодействия витамина ^ и его производных с аминокислотами хинон-связывающего сайта фотосистемы I.

Научная новизна Разработан новый подход к моделированию взаимодействия витамина ^ с аминокислотными остатками хинон-связывающего сайта фотосистемы I. Получены нековалентные комплексы витамина ^ и его производных с аминокислотами, обеспечивающими локализацию филлохинона в А1- сайте ФС1. Показана роль Тгр в переносе энергии с участием витамина Предложена схема энергетического изменения витамина ^ в комплексе с Тгр, на основании которой сделано предположение, что нафтохроманол как структурный изомер восстановленной формы витамина ^ может являться интермедиатом вторичного акцептора электрона в ФС1.

Получены модели взаимодействия первичного (Ш а) и вторичного (К1) акцепторов электронов с аминокислотами. Установлено влияние Тгр и Туг на донорно-акцепторное взаимодействие Ш а-К1. Получены комплексы Ш а и/или Ш Ь с К1 и

Тф, изучены их флуоресцентные свойства. Показана адекватность свойств искусственных моделей Chi а/Ь-Тгр-К1 минимальному комплексу ФС1, выделенному из шпината.

Получены модифицированные частицы ФС1, не содержащие вторичного акцептора A1, функция последнего реконструирована путем введения экзогенных К1 и нафтохроманола. Получены подтверждения возможности участия нафтохроманола в этом процессе.

Практическая ценность работы - Установлены свойства искусственных нековалентно связанных комплексов витамина K с хлорофиллами и ароматическими аминокислотами, моделирующие взаимодействия кофакторов с аминокислотными остатками белковых сайтов фотосистемы I. Разработанные подходы к моделированию могут быть использованы в исследовании молекулярных механизмов природных процессов переноса энергии и биорегуляции с участием хинонов (фотосинтез, у-карбоксилирование белков каскада свертывания крови, окислительное фосфорилирование).

На защиту выносятся следующие положения.

1. Разработка подхода к моделированию взаимодействия витамина K с аминокислотными остатками Агсайта ФС1;

2. Изучение физико-химических свойств нековалентных комплексов витаминов K и K и- их производных (гидрохинона, хингидрона, нафтохроманола) с аминокислотами Агсайта;

j. Изучение физико-химических свойств моделей в виде нековалентных комплексов хлорофиллов а и/или b (Chl а и/или bj с витамином K, (или нафтохроманолом) и аминокислотами; 4. Изучение редокс-свойств Р7оо в модифицированных частицах ФС1; Публикации По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы 3 докладов.

Апробация работы Основные результаты работы были доложены на III съезде фотобиологов России и школе молодых ученых (Воронеж, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002) и IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003).

Содержание работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, включает рисунка, схем и таблиц. Список литературы содержит источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение нековалентных комплексов витамина K1 и его производных с аминокислотами

При изучении in vivo сродства хинонов с различными заместителями к Ai-сайту ФС1 была высказана гипотеза об образовании комплекса К1-Агсайт, ответственного за локализацию филлохинона. Данный комплекс стабилизирован различными типами взаимодействий нековалентного характера: водородными связями, гидрофобными и пл- электронными взаимодействиями. Одним из подходов к установлению факта существования таких взаимодействий является создание искусственных моделей на уровне нековалентно-связанных систем. Нековалентные комплексы витамина K1 с аминокислотами А^сайта являются удобными объектами для исследования особенностей взаимодействия в A1-сайте.

Для получения комплексов использовали витамин K1 и его синтетический аналог - витамин К3(КЗ), их восстановленные и изомерные формы (гидрохиноны (2НК1, 2НКЗ), хингидроны (К1/2НК1, КЗ/2НКЗ) и нафтохроманол) (рис.1). Сравнительное изучение моделей с витаминами K1 и К3, а также с их производными обусловлено необходимостью определения вклада гидрофобного фитильного фрагмента и 1,4-нафтохиноновой структуры во взаимодействие с аминокислотными остатками. Коммерческие витамины K1 и К3 очищали хроматографическим и методами. Дигидровитамины (гидрохиноны) K1 и Kj получали каталитическим гидрированием и восстановлением с помощью SnCl2/HCI, соответственно. Хингидроны K1 и К3 получали из эквимолярных количеств хинона и гидрохинона. Нафтохроманол синтезировали апкилированием 1-ацетата менадиола изофитолом с последующей внутримолекулярной циклизацией образовавшегося 1-ацетата дигидровитамина K1 и удалением ацетильной группы в кислотной среде.

нафтохроманол

Рис. 1. Структуры витаминов Kt и Кэ и их производных.

В качестве аминокислотной компоненты использовали Тгр, Phe, Thr, Val, Leu, lie, Ala, Boc-Thr-OMe, Вос-Тгр-ОМе в L- форме. Выбор аминокислот обусловлен их присутствием в Ar-сайте. Метиловый эфир t-Boc-L-Thr получали метилированием t-Boc-L-Thr, выделенного из его дициклогексиламмониевой (ДЦГА) соли. Метиловый эфир t-Boc-L-Тф получали из гидрохлорида метилового эфира L-Trp нейтрализацией и последующей реакцией с ВосгО.

Нековалентные комплексы получали с количественным выходом смешением базовых растворов компонентов с последующим удалением растворителя (метод 1). Полученные комплексы характеризовались элементным анализом и спектральными методами (ИК- и УФ-слектроскопия, флуориметрия). Вместе с тем в ходе эксперимента нами был использован метод 2, основанный на смешении базовых растворов компонентов без удаления растворителя. Комплексы, полученные по методам 1 и 2, сопоставимы по слектрофотометрическим и флуориметрическим характеристикам.

В работе использовали следующие методы: ИК-спектроскопия, спектрофотометрия, флуориметрия (для исследования модельных систем) и спектроскопия светоиндуцированных абсорбционных изменений (при изучении модифицированного комплекса ФС1).

Изучение физико-химических свойств нековалентных комплексов витаминов К1 и K и их производных с аминокислотами А1-сайта

В ходе первого этапа работы были проведены исследования нековалентных комплексов методом ИК-спектроскопии с целью выявления образования водородных связей между аминокислотными и нафтохиноновыми компонентами/

Сравнение спектров исследуемых комплексов и индивидуальных компонентов показало, что хиноны в составе комплекса не оказывают влияние на бетаиновую часть молекулы гидрофобных аминокислот. Для комплексов Thr-K1 и Thr-КЗ показано разрушение межмолекулярных ассоциатов Thr появляются новые полосы поглощения при 3320 см'1 и 3380 см'1, соответственно (табл. 1 и 2).

Для комплексов 2НКЗ с аминокислотами отмечено образования прочных ассоциатов за счёт водородных связей с участием ОН - группы гидрохинона, амино- и карбоксильной групп аминокислоты. Следует также отметить, что взаимодействия 2НКЗ и КЗ/2НКЗ с Val, Leu, Phe приводят к разрушению водородных связей между молекулами 2НКЗ и 2НКЗ, КЗ и 2НКЗ, сопровождающемуся смещением или исчезновением полос поглощения при 3193 см-1 и 3280 см-1, соответственно (табл. 1).

Для комплексов Тгр-2НКЗ и Тгр-К3/2НКЗ показано разрушение водородных связей между молекулами исходных 2НКЗ и КЗ/2НКЗ и образование новых водородных связей между индольной NH-группой Тгр и ОН-группой гидрохинона (исчезают полосы 3280 и 1640см"1, появляется полоса 1688 см-1).

Таким образом, водородные связи образуются между.Тгр и гидрохиноном КЗ (во взаимодействии участвуют группы Тгр и - хингидроном КЗ (во

взаимодействии также участвуют группы 1^-Ничяола и О-Н), ^г и хинонами К1 и КЗ (во взаимодействии участвуют группы О-Н и С=О).

Таблица 1,

Изменение полос поглощения (см"1) аминокислот в комплексах с витаминами Kj и Kj

и его производными

Аминокислота AK-K1 AK-КЗ AK-2HK3 AK-K3/2HK3 Вид колебаний

Val. 3100-2000 1590 3100-2000 1616 1S90 3100-2000 1616 1590 3100-2000 1590 3100-2000 1616 1592 вал. N-H (NH,*) деф. N-H (NH,*) вал. acc. C=0(C00")

Leu 3100-2000 1612 1590 - 3100-2000 1612 1590 3100-2000 1615 1590 3100-2000 1612 1590 вал. N-H (NH,*) деф. N-H (NH,*| вал. ace. OO (COO")

Phe 3100-2000 1620 1584 - 3100-2000 1620 1584 3100-2000 1617 1584 3100-2000 1620 1584 NH,*, вал. N-H (NH,') NH,*, деф. N-H (NH,*) вал. асе. OO (COO-)

Thr 3134 3100-2000 1616 1592 3320 3134 3100-2000 1616 1592 3380 3134 3100-2000 1620 1592 3134 3100-2000 1620 1592 3280 3134 3100-2000 1620 1592 вал. N-H или вал. О-Н вал. N-H (NH,*) вал. N-H (NH,*) деф. N-H (NH,*) вал. acc. OO (COOl

ТФ 3378 3100-2000 1612 1579 3378 3100-2000 1612 1579 3374 3100-2000 1607 1579 3371 3100-2000 1616 1579 3371 3100-2000 1616 1580 вал. N-H (индол.) вал. N-H (NH,*) деф. N-H (NH,*) Ban. acc. C=0 (COO')

Таблица 2.

Изменение полос поглощения С=0 связи хинона и О-Н связи гидрохинона и _хингидрона в комплексах с аминокислотами_

Исходное -соединение Leu Val Phe Thr Тгр

К1 1659 (С=0) 1662 (С=0) 1656 (С=0) 1662 (С=0)

КЗ 1662 (С=0) 1664 (С=0) 1664 (С=0) 1668 (С=0) 1660 (С=0) 1660 (С=0)

2НКЗ 3193 3303 (О-Н) _ 3320 (О-Н) 3193 (О-Н) _

КЗ/2НКЗ 1640 (С=0) 3280 (О-Н) 1664 (С=0) 3340 (О-Н) 1668 (С=0) 1668 (С=0) 3320 (О-Н) 1662 (С=0) 3280 (О-Н) 1668 (С=0)

Следующим этапом работы стало исследование электронных свойств нековалентных комплексов. Для витамина K1 и его производных с аминокислотами в УФ-области показано, что практически все системы независимо от структуры характеризуются слабыми типами взаимодействия, обусловленными поляризационными или дисперсионными силами. Практически для всех нековалентных комплексов, кроме К1 с Leu и Не и хингидрона с Тгр, отмечено уменьшение оптической плотности поглощения, свидетельствующее о возникновении электронного состояния, подобного тг-стэкингу (рис. 2).

Рис. 2. Электронные свойства нековалентных комплексов аминокислот А]-сайта с хинонами витаминов (а) К( и (Ь) КЗ и их производными. Растворы для спектрофотометрических исследований готовились с концентрацией не менее чем 10'5М.

Системы, содержащие КЗ и его производные, обладают свойствами, отличными от соответствующих комплексов с К1. Полученные результаты подчеркивают особую роль гидрофобного фитильного фрагмента природного витамина K1. В связи с этим витамин Кз был исключен из дальнейших исследований.

Исследование флуоресцентных свойств витамина K1, его производных и их нековалентных комплексов с аминокислотами показало участие аминокислотных компонентов в образовании стабильного энергетического состояния, обеспечивающего перераспределение энергии между окисленными и восстановленными формами витамина K1. Для систем Тгр с К1, 2НК1, К1/2НК1 результаты флуориметрических исследований были обработаны с помощью соотношения Штерна-Фольмера в виде линейной зависимости lo/l от содержания компонентов комплекса в исследованных системах (рис. 3-5). Образование комплекса с переносом заряда в системах Тгр-К1 (1:1) и (1:2) регистрировалось по ярко выраженным перегибам линейной зависимости (рис. 3), что соответствует моделям локализации двух молекул филлохинона в различных субъединицах или только в одной, причем большей энергией обладает комплекс Тгр-К1 (1:1). Это подтверждает факт локализации двух молекул Л в разных областях.

0,5

0 J-■-,-,-,-,

0 2 4 6 8 10

Количество молекул одного из компонентов комплекса

Рис. 3. Изменение флуоресцентных свойств комплекса Тгр-К1 в зависимости от изменения соотношения компонентов, 10 - интенсивность Тгр, I - интенсивность комплекса. Точка (0;1) соответствует индивидуальному Тгр. а. увеличение количества молекул Тгр в комплексе с двумя молекулами витамина К1; Ь. увеличение количества молекул Тгр в комплексе с одной молекулой К1. В исследованных растворах концентрация компонентов комплекса (1:1) составляла 1,34х10-7 моль/л.

Кроме того, наши данные свидетельствуют об участии как минимум одной молекулы хинона в переносе энергии. Ее функция усиливается при взаимодействии с пептидным окружением из-за нековалентного связывания с одним остатком Тгр.

Образуется комплекс с переносом заряда, энергетическое состояние которого определяется хиноновой компонентой.

Для комплексов Тгр-2НК1 линейные зависимости изменения lo/l от концентрации как Тгр, так и 2НК1, рассматривались относительно флуоресценции каждого из флуорофоров (Рис. 4). Резкое увеличение lo/l наблюдается в системе Тгр-2НК1 (1:1), а небольшой перегиб - в комплексе с двукратным избытком Тгр. Поскольку для комплекса Тгр-2НК1 (1:2) отмечается резкое понижение отношения 1о/1 до величин сопоставимых с данными для Тгр, комплекс с переносом заряда в рассматриваемой системе энергетически близок к донору и может сам выполнять роль донора электронов. Соотношения Штерна-Фольмера для комплексов Тгр-К1/2НК1 аналогичны результатам исследования комплексов Тгр -2НК1 (рис. 5). Так для комплексов Тгр с 2НК1 и К1/2НК1 в соотношении (1:2) отмечено возникновение комплекса с переносом заряда с низким уровнем энергии, величина которой обеспечивает непреодолимый барьер для переноса электрона от вторичного акцептора электронов к железо-серным центрам, что еще раз косвенно подтверждает участие обеих молекул филлохинона, локализованных симметрично в субъединицах PsaA и PsaB, в переносе электрона.

I 2 4 6 8 10 .оличество молекул одного из компонентов

комплекса

Рис. 4. . Изменение флуоресцентных свойств комплекса Тгр-2НК1 в зависимости от изменения соотношения компонентов. 10 - интенсивность флуорофора, I - интенсивность комплекса, а. увеличение количества молекул Тгр в комплексе (относительно Тгр); Ь. увеличение количества молекул Тгр в комплексе (относительно 2НК1); с. увеличение количества молекул 2НК1 в комплексе (относительно 2НК1); с1. увеличение количества молекул 2НК1 в комплексе (относительно Тгр). Точка (0;1) соответствует индивидуальному соединению, относительно которого рассчитывается величина 1о/1.

Эти данные позволяют также предположить образование комплексов с переносом заряда, энергетическое состояние которых определяется как аминокислотным, так и гидрохиноновым компонентом.

Наши результаты свидетельствуют об участии Тгр в электрон-транспортной цепи в Ф^, что согласуется с данными по мутагенезу о функциональном значении ТгрВ677 и ТгрА697. Кроме того, можно сделать вывод о необходимости участия обеих молекул филлохинона, локализованных в А и В областях, в процессе переноса электронов к железо-серным кластерам.

Рис. 5 Изменение флуоресцентных свойств комплекса Тгр-К1/2НК1 в зависимости от изменения соотношения компонентов. 10- интенсивность Тгр, I - интенсивность комплекса, а. увеличение количества молекул Тгр в комплексе; Ь. увеличение количества молекул К1/2НК1 в комплексе; Точка (0;1) соответствует индивидуальному Тф.

В связи с тем, что нафтохроманол является изомером дигидровитамина Кь а в литературе имеются сведения о его присутствии в биологических системах наряду с филлохиноном (участие в окислительном фосфорилировании и в Glu-остатков протромбина в процессе свертывания крови), то было решено включить данное соединение в исследования и в перспективе доказать возможность его образования из филлохинона в ФС1.

Спектры флуоресценции системы Trp-нафтохроманол характеризуются двумя максимумами испускания. В один из них больший вклад вносит молекула Тгр, а в другой - молекула нафтохроманола (табл. 3). Соотнесение соответствующих максимумов испускания с данными для индивидуальных компонентов показало образование комплекса с переносом заряда с промежуточным энергетическим состоянием между Тгр и нафтохроманолом, о чем свидетельствует сдвиги максимумов

эмиссии и уменьшение интенсивности. Влияние второй молекулы нафтохроманола являлось существенным и проявлялось в сдвигах длин волн испускания на 4-10 нм, а также в небольшом изменении вида спектра и интенсивностей флуоресценции (табл. 3). Сопоставление данных по комплексам Тгр-К1 и Тгр-нафтохроманол показало идентичную тенденцию в поведении спектров. Однако вторая молекула К1 тушит флуоресценцию комплекса в 3,6 раза сильнее.

Таблица 3.

Флуоресцентные свойства Тгр и метилового эфира 1-Все-_-триптофана в комплексе с

Комплекс ' Триптофан Вос-Тгр-ОМе

Лет. НМ' I. пр.ед. Лет, НМ ' I, пр.ед.

Тгр 346,0 1140 346,5 1674

Тгр-нафтохроманол 352,0 1000 354,0 1427

(1:1) 409,5 616 412,5 790,4

Тгр-нафтохроманол - 356,0 975 356,2 1389

(1:2) 419,0 1088 422,5 1367

* для индивидуального нафтохроманола Лет 424,5 нм и интенсивностью €50 пр. ед.

В природных системах во взаимодействиях с кофакторами участвуют именно боковые фуппы аминокислот. В связи с этим были исследованы комплексы нафтохроманола с защищенным триптофаном. Флуоресцентные свойства комплекса Вос-Тгр-ОМе-нафтохроманол сопоставимы со свойствами системы Тгр-нафтохроманол (незначительный сдвиг максимума испускания в длинноволновую область).

Кроме того методом ИК-спектроскопии показано, что образование комплекса Тгр-нафтохроманол сопровождается появлением полосы поглощения неионизированной а-карбоксильной группы Тгр (1760см1). Это указывает на подвижность атома водорода гидроксильной группы в 6-ом положении нафтохроманового цикла. Для аналогичного комплекса с К1 подобной тенденции не отмечено. Поэтому можно предположить, что в нативной ФС1 образование активной формы нафтохроманола гораздо более выгодно, чем анион-радикала филлохинона.

УФ-спектры систем нафтохроманол-аминокислота показали незначительные изменения оптической плотности и максимума поглощения по сравнению с индивидуальным нафтохроманолом. Исключение составляют лишь электронные свойства системы нафтохроманол-Тгр, для которой отмечался сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область с увеличением оптической плотности, что сопоставимо со свойствами систем К1 -Тгр.

Сравнение флуоресцентных свойств структурных изомеров: нафтохроманола и 2НК1, позволило сделать вывод, что способность к образованию комплекса с переносом заряда с аминокислотами у 2НК1 выше, чем у нафтохроманола. Таким образом, последнее соединение может являться промежуточным при трансформации хинона в гидрохинон в процессе переноса электрона в ФС1. Следовательно, нельзя исключать возможность появления данного изомера в составе Ai-сайта в период его активации. Это заключение также подтверждается изменением флуоресцентных свойств комплексов с переносом заряда Тгр-К1, Тгр-2НК1, Тгр-К1/2НК1 и Тгр-нафтохроманол. Как видно из рисунка 6, витамин K и его производные в комплексе с Тгр образуют последовательную цепь переноса энергии. При этом Тгр является донором, который передает энергию комплексу Trp-K,, затем Тгр-нафтохроманол и далее через Тгр-2НК1 к комплексу с хингидроном. В этой цепи комплекс Тгр-нафтохроманол является промежуточным между хиноновой и гидрохиноновой формами витамина K1.

2500-zm

с£

q> t5CO

m ет

о «ю о. с:

~ 600 о

за эео зоо «о со ш

длина волны испускания, нм

Рис. 6. Сравнение флуоресцентных свойств нековапентных комплексов Тгр с витамином К( и его производными.

Физико-химические свойства моделей в виде нековалентных комплексов хлорофиллов а и/или b с витамином K (или нафтохроманолом) и аминокислотами

Для подтверждения полученных результатов на моделях более сложного состава, соответствующего участку A^A, в ФС1, нами исследовались комплексы хлорофилл-филлохинон/нафтохроманол-аминокислота.

Плоскости молекул хлорофилла а (Ао) и филлохинона (АО образуют некоторый двугранный угол, что, по-видимому, соответствует минимуму энергии рассматриваемой системы. Хотя молекулы находятся на расстоянии 8,6 А, между

ними возможны взаимодействия. Результаты наших экспериментов (табл. 4) свидетельствуют об образовании эксиплекса Ш a - филлохинон с более низким значением энергии полученной системы. Флуоресцентные свойства этого комплекса характеризуются уменьшением флуоресценции в коротковолновой области и ее увеличением - в длинноволновой, что обусловлено миграцией энергии от хлорофилла а к филлохинону. Влияние триптофана на комплекс Ш a-K1 выражалось в изменении вида спектра флуоресценции (рис. 7). Максимум испускания смещался в коротковолновую область (Д 56 нм) относительно максимума комплекса Ш а-^ и в длинноволновую область относительно максимума индивидуального

триптофана (табл. 4). При этом интенсивность флуоресценции относительно комплекса Ш a-K1 увеличивалась почти в 100 раз и незначительно изменялась относительно триптофана. Подобные изменения можно было бы объяснить аддитивностью спектров исходных систем, однако для комплекса Ш а-^-Тгр в длинноволновой области отмечалось резкое увеличение интенсивности флуоресценции более чем • в 2 раза (') при сохранении максимума эмиссии. Сам триптофан в этой области не флуоресцирует (рис. 7).

Выбор длины волны облучения обусловлен максимумами поглощения индивидуальных компонентов и нековалентных комплексов.

Литературные данные о взаимодействиях между Тгр и Chl а, к сожалению, отсутствуют. Однако, полученные нами результаты свидетельствуют о наличии взаимодействия как между филлохиноном и Тгр, так и между Chl а и Тгр. В обоих случаях регистрируется образование комплекса с переносом заряда, в котором существенную роль играет Тгр.

Ch! Ь не является непосредственным участником цепи переноса электрона в комплексе Ф^, но функционирует как в Ф^ и ФСИ. Известно, что Chl b входит в состав светособирающей антенны и, наряду с другими пигментами, улавливает энергию солнечного света и передает ее на Chl а. Для сопоставления свойств модельной системы и комплекса Фа необходимо было иметь информацию о свойствах комплексов с Chl Ь и смесью хлорофиллов а и b. Флуоресцентные свойства комплексов Chl b-K1 и Chl а/b-K подобны комплексу с Chl а. При добавлении триптофана к этим комплексам отмечали существенное смещение максимума флуоресценции в коротковолновую область и увеличение интенсивности в ~7 раз (табл.4). Относительно триптофана максимумы испускания комплексов Chl b-^-Тгр и Chi а/^^-Тгр смещались в длинноволновую область с уменьшением интенсивности на ~30 %. Мы предположили, что происходит образование комплекса с промежуточным значением энергии между системой Chl b-K1 и триптофаном.

Таблица 4.

Максимумы флуоресценции для различных комплексов

Комплекс К» нм Максимум для Chi Максимум для Chl-Kl Максимум для СМ-К1 -аминокислота

Km, HM 1, пр.ед. Лат} НМ 1, пр.ед. Лет» НМ I. пр.ед.

Chi а - К1 - Тгр (15:2:1) 2ЭЗ 332 352 405,8 211 204 340' 332 404,5 174 397 348,5 2143

460 686 3507 685,5 3402 685,5 6635

Chlb-K1-Trp (15:2:1) 293 334 361 407,5 165 180 161 334 361 406 68 113 165 353,5 1465

460 670 4863 670 5441 670 5010

Chla-Chl й - Kl - Тгр (15:5:2:1) 293 333 349 402 251 245 287 332 357 401,5 216 241 336 348,5 1488

460 657 687 2004 3786 655,5 687,5 1831 3606 683 4021

Chi а-Kl-Туг (15:2:1) 285 319 330 404 206 218 151 329 403,5 164 196 312 815

460 686 3507 685,5 3402 684.5 2859

Известно, что в состав полипептидных субъединиц комплекса Фа наряду с

триптофаном входят другие ароматические аминокислоты, в частности туг, что может

оказать влияние на флуоресцентные свойства системы (табл. 4). Для комплексов СИ! а-К1-Туг и СИ! а-К1-Тгр в области 300-500 нм эмиссия определяется в большей степени аминокислотной компонентой. В области испускания хлорофилла (600-800 нм) влияние аминокислот на А«,, не наблюдается. Интенсивность флуоресценции СИ! а изменяют как Тгр, так и Туг, однако, вклад Тгр более существенный (табл. 4.).

Изучение - флуоресцентных свойств комплексов, содержащих хлорофилл, нафтохроманол и Тгр, показало тенденцию к образованию комплекса с переносом заряда идентичную системе Тгр-нафтохроманол (1:2) (табл. 5). Влияние СИ! а выражалось лишь в незначительном тушении флуоресценции по сравнению с системой без пигмента.

Таблица 5.

Максимумы флуоресценции для комплексов хпорофилп-нафтохроманол-Тгр

Комплекс нм Максимум для Chi Максимум для Chl-нафтохроманол Максимум для Chi— нафтохроманол-аминоки слота

Amt HM 1. пр.ед. Km НМ I. пр.ед. Kmi HM 1. пр.ед.

Chi а-нафтохроманол -Тгр (15:2:1) 293 359,0 458,5 187 78 358,0 460,0 151 126 356,0 462,0 215 131

460 686,5 919 686,5 898 686,5 989

Chla-Chl/>-нафтохроманол-Тгр (15:5:2:1) 293 360,0 460,0 137 87 357,0 461,0 170 77

460 644,0 688,0 502 1032 644,0 j 688,0 516 1051 644,0 688,0 494 1067

Сопоставление свойств моделей со свойствами комплекса ФС1

Для оценки изученных хлорофилл-содержащих моделей; было проведено сравнение их свойств со свойствами частиц ФС1, являющихся минимальным пигмент-белковым комплексом, который сохраняет ферментативную и фотоокислительную активность, присущую комплексу ФСК Частицы ФС1наряду с другими кофакторами содержат хлорофиллы и две молекулы филлохинона. Поэтому в качестве модельной системы использовался многокомпонентный комплекс Chl a-Chl b-K1 -Trp (15:5:2:1).

Лиофилизованные частицы ФС1 получали из листьев майского шпината. При выделении за основу была взята классическая методика (J. Anderson и N. Boardman). Выделенные частицы характеризовались- спектрофотометрически, их активность проверяли методом регистрации светоиндуцированных абсорбционных изменений. Содержание хлорофиллов а и b в полученных частицах ФС1 составило 0,64 мг/мл.

В длинноволновой области (600 - 800 нм) спектры флуоресценции комплекса ФС1 и модельной системы Chl a-Chl b-K1 -Trp сравнимы (рис. 8b). В области 300-500

нм наблюдается сдвиг максимума эмиссии модельной системы в длинноволновую область (Д 8 нм) относительно максимума эмиссии частиц ФС1 (рис. 8а). При этом спектры флуоресценции частиц ФС1, снятые в воде и этаноле, характеризуются одинаковым максимумом с той лишь разницей, что в водной среде максимум несколько уширен.

Результаты, полученные при изучении физико-химических свойств разработанных нами моделей, свидетельствуют об их адекватности минимальному комплексу ФС1, что подтверждает возможность использования модельных систем такого типа для изучения свойств и функции нативной ФС1. Для всех исследованных систем, в том числе и частиц ФС1, показано существенное влияние аминокислотного окружения на флуоресцентные свойства, причем наибольший вклад вносит аминокислотный остаток Тгр.

PSI в воде PSI в этаноле ChlabKTrp

<500 4000 КОС

эооо

I W»

) гая

} 15® Е 1ÛÛO

— PSI в воде

- PSI в этаноле -ChlabKTrp

длжа волны m

длина ВОЛНЫ нм

Рис. 8. Флуоресцентные свойства исследуемых систем и ФСI -частиц (а) при Хех=293 нм (в диапазоне 300-500 нм) и -(Ь) при Хех=460 нм (в диапазоне 600-800 нм). Для фотосистемы I (в спирте) характерны следующие максимумы испускания и интенсивности -(в произвольных единицах): 340,5 нм (980); 664 нм (976); 683,5 нм (1158); для фотосистемы I (в воде): 330,5 нм (248); 690 нм (667); для комплекса Chi a- Chi MCt-Trp: 348,5 нм (1489); 683 нм (4021).

Модификация частиц ФС1

Для подтверждения возможности образования нафтохроманола в ФС1 при трансформации филлохинона в его восстановленную форму нами исследовались модифицированные частицы ФС1. Модификацию осуществляли- экстракцией вторичного акцептора с последующей реконструкцией его функции за счет экзогенных К1 и нафтохроманола.

Экстракция одной и/или двух молекул филлохинона из комплекса ФС!

Одну молекулу филлохинона из лиофилизованных частиц ФС1 экстрагировали гексаном (получали Сотр1ех1), а две молекулы К1 - смесью гексан-метанол (100.0,3) (получали Сотр1ех2). Экстракцию проводили в темноте при постоянном охлаждении системы (~4°С). Прохождение экстракции контролировали методом ВЭЖХ.

Встраивание экзогенных филлохинона и нафтохроманола в модифицированный комплекс ФС!

Реконструкцию функции вторичного акцептора в Сотр1ех1 и Сотр1ех2 осуществляли введением раствора соответствующего экзогенного А1-компонента в 5-ти кратном избытке при перемешивании в течение 5 минут с последующей 16-ти часовой выдержкой при 0°С. Получали комплексы ФС1, содержащие:

• 1 нативную и 1 экзогеннную молекулу филлохинона (Сотр1ех11)

• 1 нативную молекулу филлохинона и 1 экзогенную молекулу нафтохроманола (Сотр1ех12)

• 1 нативную молекулу филлохинона и эквимолярную смесь экзогенных филлохинона и нафтохроманола (Сотр1ех13)

• 2 экзогенные молекулы филлохинона (Сотр1ех21)

• 2 экзогенные молекулы нафтохроманола (Сотр1ех22)

• эквимолярную смесь экзогенных филлохинона нафтохроманола (Сотр1ех23)

Изучение оедокс-свойств Ртп в модифицированных ФС1-часгицзх

Образцы модифицированных частиц ФС1 исследовали с помощью регистрации светоиндуцированных абсорбционных изменений в ответ на единичные вспышки света при 703 им, отражающие окислительно-восстановительные свойства первичного донора электрона Р700. Вспышка света вызывает быстрое окисление Р700 с последующим ре-восстановлением фотоокисленного Р700* в темноте. В отсутствие природных доноров и акцепторов кинетика темнового восстановления Р700 обусловлена возвратом фотомобилизованного электрона от одного из связанных акцепторов электрона.

Сравнение относительных амплитуд и кинетики спада светоиндуцированных абсорбционных изменений позволяет определять количество активных комплексов ФС1 и степень реконструкции экзогенных хинонов (табл. 5).

Медленные фазы кинетики спада, характерные для всех исследованных образцов, включая немодифицированный комплекс Ф^, по всей вероятности, обусловлены переносом электрона с терминального Ре«54 кластера на молекулярный кислород, присутствующий в исследуемой системе (рис. 9).

В частицах Ф^ без одной молекулы филлохинона при встраивании экзогенных A1-компонентов наблюдается увеличение степени окисления Р700 (табл. 5). Самый высокий процент отмечен для К1. Нафтохроманол, встраиваясь в комплекс Ф^, увеличивает степень окисления Р700 на ~9,4%. При реконструкции эквимолярной смесью филлохинон/нафтохроманол для нафтохроманола зарегистрирована конкуренция с К1. Однако степень встраивания нафтохроманола составила лишь -3,2%.

Таблица 5.

Степень окисления Р700 в модифицированных ФС!-частицах.

В Complex2 окисление P700 отмечено, но в очень малой степени. Это, вероятно, объясняется гетерогенностью, свойственной Ф^, не позволяющей модифицировать ~10-20% комплексов. Для частиц Ф^, не содержащих вторичного акцептора A1, отмечено увеличение степени окисления P700 на -76-300 % (!), что в - 17 раз больше по сравнению с образцами Ф^ без одной молекулы филллохинона. Это связано с тем, что Complex1 содержит одну эндогенную молекулу К1, которая способна выполнять функции вторичного акцептора. В то время как Complex2, не содержащий ни одного A1, стремиться включить экзогенный нафтохинон и тем самым восстановить перенос электрона к Fx. Для Complex21 отмечена степень окисления P700 на ~22% ниже, чем для Complexi, что свидетельствует о более эффективной работе системы электронного транспорта, содержащей одну эндогенную молекулу филлохинона,

нежели две экзогенные. Аналогично системам с одной экстрагированной молекулой филлохинона, показано увеличение степени окисления Р700 при встраивании нафтохроманола. Примечательно, что в конкурентной реакции с К1 степень встраивания нафтохроманола увеличивается в 3 раза и достигает ~10%.

Сотр1ех1 и Сотр1ех2 по сравнению с частицами ФС1 теряют свою активность на 68-94%, соответственно, однако при встраивании экзогенного филлохинона в модифицированный комплекс ФС1 восстановление функции вторичного акцептора

происходит лишь на 62,5-75%, причем эффективнее восстанавливает свою активность Complex2.

Результаты, полученные методом оптической спектроскопии свидетельствуют о необходимости присутствия филлохинона в ФС1 для эффективного переноса электрона, а также подтверждают наши предположения о возможности участия нафтохроманола, как структурного изомера восстановленного К1, в переносе электрона в комплексе ФС1.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый подход к моделированию взаимодействия витамина K1 с аминокислотными остатками А1-сайта ФС1, который может быть использован в исследовании молекулярных механизмов природных процессов переноса энергии и биорегуляции с участием хинонов (фотосинтез, у~ карбоксилирование белков каскада свертывания крови, окислительное фосфорилирование).

2. Получены нековалентные комплексы витамина K1 и его производных с аминокислотами А1 сайта ФС1, моделирующие взаимодействия филлохинона с белковым окружением. Проведено исследование физико-химических свойств полученных моделей. Отмечено, что Тгр играет роль донора в переносе энергии с участием филлохинона;

3. Предложена схема фотохимического превращения витамина K1 в комплексе с Тф, на основании которой нафтохроманол, как структурный изомер восстановленной формы витамина K1 может являться интермедиатом вторичного акцептора электрона в ФС1;

4. Получены модели взаимодействия первичного и вторичного акцепторов электронов с аминокислотами. Изучены физико-химические свойства искусственных моделей и показана их адекватность минимальному комплексу ФС1;

5. Проведены выделение и модификация частиц ФС1. Получены подтверждения возможности образования нафтохроманола в процессе превращения хинона в гидрохинон при переносе электрона к железо-серному кластеру Fx в ФС1

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Леонова Н.М., Жукова Е.Э. Флуоресцентные свойства филлохинона и его производных в модельных системах хинон-связывающего сайта фотосистемы I. // Тезисы докладов Третьего съезда фотобиологов России и школы молодых ученых. -Воронеж. - 2001 г.-С. 114.

2. Леонова Н.М., Жукова Е.Э., ¡Евстигнеева P.flj Изучение взаимодействия филлохинона и его производных с триптофаном в модели хинон-связывающего сайта фотосистемы I.// Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества.-. Санкт-Петербург.-2002, С.251.

3. Леонова Н.М., Тюняткина А.А., Климова Я.А., Жукова Е.Э. Изучение взаимодействия молекулярных ансамблей на основе хлорофиллов а и 6 с витамином K1 и его производными и TRP// IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов. Труды конференции.- Суздаль. -2003.- С. 266-267.

4. Леонова Н.М., Жукова Е.Э., Миронов А.Ф., Физико-химические свойства нековалентных комплексов витаминов K1 и K3 с аминокислотами// Моск. гос. академия тонк. хим. техн. - М., 2003. - 20 с. - 6 ил. - Библиограф. 12 назв. -Рус. -Деп. В ВИНИТИ 25.12.2003, № 2259-В2003;

5. Леонова Н.М., Жукова Е.Э., Модель хинон-связывающего сайта фотосистемы I: исследование комплексов переноса заряда филлохинона и его производных с триптофаном // Биофизика-2004.- №4- (статья принята к печати)

6. Леонова Н.М., Климова Я.А., Жукова Е.Э., Миронов А.Ф. Модель донорно-акцепторного взаимодействия A0-A1 фотосистемы Ml Биофизика. (статья в печати)

Подписано в печать

Формат 60x90/16

Отпечатано на ризографе. Тираж 100 экз.

Издательско-полиграфический центр МИТХТ 117571 Москва, пр. Вернадского, 86.

«10213

1

1. Введение стр.

2. Литературный обзор на тему:

Современные аспекты исследования фотосистемы» стр.

2.1. Принципы передачи фотосинтетической энергии стр.

2.2. Оксигенный фотосинтез стр.

2.3. Реакционный центр ФСII стр.

2.4. Исследования структуры бактериальной ФС1 стр.

2.5. Цепь передачи электронов стр.

2.6. Изучение хинон-связывающего сайта фотосистемы I стр.

2.7. Промежуточные состояния хинона и взаимосвязь с компонентами цепи переноса электронов и их окружением стр.

2.8. Модификация реакционного центра фотосистемы I стр.

3. Результаты работы и их обсуждение стр.

3.1. Синтез производных витамина К1 и защищенных аминокислот стр.

3.2. Изучение физико-химических свойств нековалентных комплексов витаминов К1 и Кз и их производных с аминокислотами А [-сайта стр.

3.3. Изучение физико-химических свойств нековалентных комплексов хлорофиллов а и/или Ъ с витамином К1 (или нафтохроманолом) и аминокислотами стр.

3.4. Изучение редокс-свойств Р700 в модифицированных частицах фотосистемы I стр.

4. Экспериментальная часть стр.

4.1. Общие методы, реактивы, материалы и приборы стр.

4.2. Синтез производных витамина К1 и К3 стр.

4.3. Получение защищенных аминокислот стр.

4.4. Выделение хлорофиллов а и Ь стр.

4.5. Получение лиофилизованных частиц фотосистемы Г стр.

4.6. Получение нековалентных комплексов витаминов К1 и К3 и их производных с аминокислотами А1-сайта стр.

4.7. Приготовление растворов Тгр и хлорофиллов а и Ъ для построения калибровочных графиков стр.

4.8. Модификация частиц ФС1 стр.

5. Выводы стр.

Важное место в современной науке отводится исследованиям, посвященным поиску альтернативных источников энергии. Одним из наиболее перспективных направлений представляется изучение природных фотосинтетических процессов преобразования энергии солнечного света с целью ее возможного использования для пополнения мировых энергоресурсов. В настоящее время эффективность этих исследований обусловлена развитием биотехнологических, физических и физико-химических методов, позволяющих изучать молекулярные основы механизмов переноса энергии и электрического заряда, а также влияние белково-липидного окружения на функцию доноров и акцепторов редокс-эквивалентов. В связи с этим является актуальным изучение структур функционально значимых элементов фотосинтетических систем, в частности взаимодействия филлохинона с аминокислотами хинон-связывающего сайта (А1-сайта) и донорно-акцепторного взаимодействия на участке А0-А1 в фотосистеме I (ФС1).

Пигмент-белковый комплекс ФС1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, обусловленное переносом электронов от периферических белков, таких как пластоцианин или цитохром Сб, к водорастворимым природным акцепторам — ферредоксину или флаводоксину. Фотосистема I содержит около 12 полипептидных субъединиц, три из которых РзаА, РэаВ и РэаС связывают ~100 молекул хлорофилла а (СЫ а), 15-25 р-каротиноидов, 2 молекулы филлохинона и 3 железо-серных кластера (Ре434), образуя комплекс ФС1. Перенос электрона осуществляется с участием симметрично расположенных кофакторов. В этом процессе задействованы первичный донор Р700 (димер хлорофилла а), первичный акцептор Ао (мономер хлорофилла а), вторичный акцептор А1 (молекула филлохинона, витамина К1 (К1)) и Ре484-кластеры Рх, ра, Рв- Хлорофиллы и филлохиноны располагаются симметрично в двух областях и координируются РзаА и РваВ субъединицами.

Изучение взаимодействия филлохинона с аминокислотами хинон-связывающего сайта является необходимым для установления особенностей транспорта электрона и выяснения роли каждой молекулы филлохинона в этом процессе. Одним из удобных подходов для изучения свойств А1-сайта является создание искусственных нековалентно связанных систем, моделирующих взаимодействие витамина К1 и его производных с аминокислотами.

Целью настоящей работы явилось изучение искусственных систем, моделирующих взаимодействия витамина К1 и его производных с аминокислотами хинон-связывающего сайта фотосистемы I.

В связи с этим, нами были синтезированы производные и изомерные формы витамина Кь а также защищенные аминокислоты; получены нековалентные комплексы витамина К1 и его производных с аминокислотами, обеспечивающими локализацию филлохинона в А1- сайте ФС1; получены модели взаимодействия первичного (СЬ1 а) и вторичного (К1) акцепторов электронов с аминокислотами; получены модифицированные частицы ФС1, не содержащие вторичного акцептора А], функция последнего реконструирована путем введения экзогенных витамина К1 и нафтохроманола. В работе использовали спектральные методы (ИК- и УФ- спектроскопия, флуориметрия), а также метод регистрации светоиндуцированных абсорбционных изменений.

5. Выводы

1. Разработан новый подход к моделированию взаимодействия витамина К1 с аминокислотными остатками А1-сайта ФС1, который может быть использован в исследовании молекулярных механизмов природных процессов переноса энергии и биорегуляции с участием хинонов (фотосинтез, у-карбоксилирование белков каскада свертывания крови, окислительное фосфорилирование).

2. Получены нековалентные комплексы витамина К1 и его производных с аминокислотами А1- сайта ФС1, моделирующие взаимодействия филлохинона с белковым окружением. Проведено исследование физико-химических свойств полученных моделей. Отмечено, что Тгр играет роль донора в переносе энергии с участием филлохинона;

3. Предложена схема фотохимического превращения витамина К1 в комплексе с Тгр, на основании которой нафтохроманол, как структурный изомер восстановленной формы витамина К], может являться интермедиатом вторичного акцептора электрона в ФС1;

4. Получены модели взаимодействия первичного и вторичного акцепторов электронов с аминокислотами. Изучены физико-химические свойства искусственных моделей и показана их адекватность минимальному комплексу ФС1;

5. Проведены выделение и модификация частиц ФС1. Получены подтверждения возможности образования нафтохроманола в процессе превращения хинона в гидрохинон при переносе электрона к железо-серному кластеру Бх в ФС1;

1. Whitmarsh, J., Govindjee, // The photosynthetic process, In: "Concepts in Photobiology: Photosynthesis and Photomorphogenesis", 1996, pp. 11-51

2. Schubert, W.-D., Klukas, O., Saenger, W., Witt, H. T., Fromme, P., KrauB, N., // Photosystem I of Synechococcus elongatus at 4Â Resolution: Comprehensine Structure Analysis. J. Mol. Biol, 1997,V. 272, pp.741-769

3. K.H. Rhee, E.P. Morris, J. Barber, W. Kuhlbrandt, 11 Three-dimensional structure of the plant photosystem II reaction centre at 8 Â resolution. Nature, 1998, V. 396, pp. 283-286.

4. Zouni, H.T. Witt, J. Kern, P. Fromme, N. KrauM, W. Saenger, P. Orth, // Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 Â resolution. Nature, 2001, V. 409, pp.739-743

5. Joliot, P. and B. Kok, // Oxygen evolution in photosynthesis, In: Govindjee (ed.) Bioenergetics of Photosynthesis, Academic Press, 1975, pp. 387-412.

6. Joliot, N.Y., Barbieri, P. G., Chabaud, R., // Un nouveau modele des centre photochimique du systeme II, Photochem. Photobiol., 1969, V.10, pp. 309-329

7. Klein,' M.P., Sauer, K. and Yachandra, Y.K., // Perspectives on the structure of the photosynthetic oxygen evolving manganese complex and its relation to the Kok's cycle,-Photosynth. Res., 1993, V.38, pp. 265-277

8. Lavergne, J., Junge W., // Proton release during the redox cycle of the water oxidase,-Photosynth. Res., 1995, V.38, pp. 279-296

9. Renger, G., // Water cleavage by solar radiation an inspiring challenge to photosynthesis research, - Photosynth. Res., 1993, V. 38, pp. 229-287

10. Whitmarsh, J. and H.B. Pakrasi, // Form and Function of cytochrome b559, In: Advances in Photosynthesis, 1996, V. 4, Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions

11. Krauss, N., W. Hinrichs, I. Witt, P. Fromme, W. Pritzkow, Z. Dauter, C. Betzel, K.S. Wilson, H.T. Witt and W. Saenger // Three-dimensional structure of system I of photosynthesis at 6 Â resolution,- Nature, 1993, V.361, pp. 326-331

12. Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N., // Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution, Nature, 2001, V. 411, pp. 909-917

13. Fromme, P., Witt, H.T., // Improved isolation and crystallisation of photosystem I for structural analysis, Biochim. Biophys. Acta, 1998, V.1365, pp. 175-184

14. The Photosystems: Structure, Function and Molecular Biology,- Ed. By J. Barber, Elsevier Science Publishers, 1992, pp. 443-469,501-549

15. Jordan, P., Fromme, P., Krauss, N., //Structure of photosystem I, Biochim. Biophys. Acta, 2001, V.l507, pp. 5-31

16. Guergova-Kuras, M., Boudreaux, В., Joliot, A., Redding, K., // Evidence for two active branches for electron transfer in photosystem I,- PNAS 2001, V. 8, pp. 4437-4442

17. Brettel, K., Leibbl, W.^/Electron transfer in photosystem I, BBA 2001, V. 1507,pp. 100-114

18. Iwaki, M., Takahashi, M., Shimada, K., Takahashi, Y., Itoh, S., // Photoaffinity labeling of the phylloquinone-binding polypeptides by 2-l azidoanthraquinon in Photosystem 1 particles,-FEBS Letters. 1992,V. 312.,pp.27-30

19. L. Fish, U. Kiick, L. Bogorad, // Two partially homologous adjacent light-inducible maize chloroplast genes encoding polypeptides of the P700 chlorophyll a-protein complex of photosystem I,- J. Biol. Chem., 1985, V.260, pp. 1413-1421

20. O. Klukas, W.-D. Schubert, P. Jordan, N. Krauss, P. Fromme, H.T. Witt, W. Saenger, Localisation of Two Phylloquinones, Qk and Qk', in an Improved Electron Density Map of Photosystem I at 4-A Resolution, J. Biol. Chem., 1999, V. 274, pp.7361-7367

21. O. Klukas, W.-D. Schubert, P. Jordan, N. Krauss, P. Fromme, H.T. Witt, W. Saenger, // Photosystem I, an Improved Model of the Stromal Subunits PsaC, PsaD, and PsaE, J. Biol. Chem., 1999, V.274, pp. 7351-7360

22. Q. Xu, P.R. Chitnis, // Organization of Photosystem I Polypeptides (Identification of PsaB Domains That May Interact with PsaD), Plant Physiol., 1995, V.108, pp. 1067-1075

23. J. Sun, Q. Xu, V.P. Chitnis, P. Jin, P.R. Chitnis, // Topography of the Photosystem I Core Proteins of the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, J. Biol. Chem., 1997, V. 272, pp. 21793-21802

24. W.-D. Schubert, O. Klukas, W. Saenger, H.T. Witt, P. Fromme, N. Krauss, // A Common Ancestor for Oxygenic Photosynthesic Systems: A Comparison Based on the Structural Model of Photosystem I, J. Mol. Biol., 1998, V.280, pp. 297-314

25. Hecks, K. Wulf, J. Breton, W. Leibi, H.-W. Trissl, // Primary Charge Separation in Photosystem I: A Two-Step Electrogenic Charge Separation Connected with P700+A0- and P700+A1- Formation, -Biochemistry, 1994, V. 33, pp. 8619-8624

26. R. Malkin, //On the function of two vitamin Ki molecules in the PS I electron acceptor complex, FEBS Lett., 1986, V.208, pp. 343-346

27. J. Biggins, P. Mathis, // Functional Role of the Vitamin Kl in Photosystem I of the Cyanobacterium Synechocystis 6803, Biochemistry, 1988, V.27, pp. 1494-1500

28. S. Kumazaki, H. Kandori, H. Petek, K. Yoshihara, I. Ikegami, // Primary Photochemical Processes in P700-Enriched Photosystem I Particles: Trap-Limited Excitation Decay and Primary Charge Separation,-J. Phys. Chem., 1994, V.98, pp.10335-10342

29. F. MacMillan, J. Hanley, L. van der Weerd, M. Knupling, S. Un, A.W. Rutherford, // Orientation of the Phylloquinone Electron Acceptor Anion Radical in Photosystem 1,-Biochemistry, 1997, V.36, pp. 9297- 9303

30. R. Bittl, S.G. Zech, P. Fromme, H.T. Witt, W. Lubitz, // Pulsed EPR Structure Analysis of Photosystem I Single Crystals: Localization of the Phylloquinone Acceptor,- Biochemistry, 1997, V.36, pp. 12001-12004

31. S.E.J. Rigby, M.C.W. Evans, P. Heathcote, // ENDOR and Special Triple Resonance Spectroscopy of Ai*~ of Photosystem 1,- Biochemistry,1996, V.35, pp. 6651-6656

32. M. Iwaki, S. Itoh, // Structure of the Phylloquinone-Binding (Q4>) Site in Green Plant Photosystem I Reaction Centers: the Affinity of Quinones and quinonoid Compounds for the Q4> Site,- Biochemistry, 1991, V.30, pp. 5347-5352

33. F. Yang, G. Shen, W.M. Schluchter, B.L. Zybailov, A.O. Ganago, I.R. Vassiliev, D.A. Bryant, J.H. Golbeck, // Deletion of the PsaF Polypeptide Modifies the Environment of the

34. Redox-Active Phylloquinone (Ai). Evidence for Unidirectionality of Electron Transfer in Photosystem I, J. Phys. Chem. B, 1998, V.102, pp. 8288-8299

35. P. Joliot, A. Joliot, // In Vivo Analysis of the Electron Transfer within Photosystem I: Are the Two Phylloquinones Involved?,- Biochemistry, 1999, V.38, pp. 11130-11136

36. Ikegami, S. Katoh. Enrichment of Photosystem I reaction center chlorophyll from spinach chloroplasts. \\ Biochimica et Biophysica Acta 376 (1975) 588 592

37. M. Iwaki, S. Itoh. Electron transfer in spinach photosystem I reaction center containing benzo -, naphtho- and antraquinones in place of phylloquinone,\\ FEBS Letters 256 (1989) 11-16

38. S. Itoh, M. Iwaki and I. Ikegami. Extraction of viyamin K1 from Photosystem I particles by treatment with diethyl ether and its effects on the Ai- EPR signal and System I photochemistry. \\ Biochimica et Biophysica Acta 893 (1987) 508-516

39. J. Biggins. Evaluation of selected benzoquinones, naphthoquinones and antraquinones as replacements for phylloquinone in the Ai acceptor site of the Photosystem I reaction center. \\ Biochemistry 29 (1990) 7259 7264

40. Brettel, K., // Electron transfer and arrangement of the redox cofactors in photosystem I, -Biochim. Biophys. Acta, 1997, V.1318, pp. 322-373

41. J. H. Golbeck, D. A. Bryant (1991) Photosystem I. In Light-driven reactions in Bioenergetics. Current topics in Bioenergetics series. Vol. 16, pp. 83 177. Academic Press, New York.

42. J. H. Golbeck. Structure and function of Photosystem I. \\ Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43 (1992) 293 324

43. Ikegami, S. Itoh, M. Iwaki. Photoactive Photosystem I particles a molar ratio of chlorophyll a to P700 of 9. \\ Plant and Cell Physiology 36 (1995) 857 864

44. Ikegami, S. Itoh. Evidence for the interaction of the Photosystem I secondary electron acceptor X with chlorophyll a in spinach Photosystem I particles. \\ Biochimica et Biophysica Acta 893 (1987) 517-523

45. S. Itoh, M. Iwaki, I. Ikegami. Modification of Photosystem I reaction center by the extraction and exchange of chlorophylls and quinones. \\ Biochimica et Biophysica Acta 1507 (2001) 115-138

46. S. Itoh and M. Iwaki. Vitamin K1 (phylloquinone) restores the turnover of FeS centers in the ether-extracted spinach PS I particles. \\ FEBS Letters 243(1) (1989) 47-52

47. P. Setif, I. Ikegami, J. Biggins. Light-induced charge separation in Photosystem I at low temperature is not influenced by vitamin K-l. \\ Biochimica et Biophysica Acta 894 (1987) 146-156

48. S. Itoh, M. Iwaki. Full replacement of the function of the secondary electron acceptor phylloquinone (vitamin Kj) by non-quinone carbonic compounds in green plant Photosystem I photosynthetic reaction centers. \\ Biochemistry 30 (1991) 5340 5346

49. M. R. Gunner, P. L. Dutton. Temperature and -AG0 dependence of the electron transfer from BPh" to Qa in reaction center protein from Rhodobacter sphaeroides with different quinones as Qa- W Journal of American Chemical Society 111 (1989) 3400 3412

50. Ikegami, S. Itoh, M. Iwaki. Photoactive Photosystem I particles a molar ratio of chlorophyll a to P700 of 9. \\ Plant and Cell Physiology 36 (1995) 857 864

51. Ikegami, B. Ke. A 160-kilodalton Photosystem I reaction center complex low-temperature fluorescence spectroscopy. \\ Biochimica et Biophysica Acta 764 (1984) 80-85

52. Ikegami, B. Ke. A 160-kilodalton Photosystem I reaction center complex low-temperature absorption and EPR spectroscopy of the early-electron acceptors. \\ Biochimica et Biophysica Acta 764 (1984) 70-79

53. M. Iwaki, M. Takahashi, K. Shimada, Y. Takahashi and S. Itoh. Photoaffinity labeling of the phylloquinone-binding polypeptides by 2-azidoanthraquinone in photosystem I particles. \\ FEBS Letters 312(1) (1992) 27-30

54. S. Hoshina, R. Sakurai, N. Kunishima, K. Wada, S. Itoh. Selective destruction of iron-sulfur centers by heat/ethylene glycol treatment and isolation of Photosystem I core complex. \\ Biochimica et Biophysica Acta 1015 (1990) 61-68

55. M. Kobayashi, E. J. van der Meent, C. Erkelens, J. Amesz, I. Ikegami, T. Watanabe. Bacteriochlorophyll g epimer as possible reaction center component of Heliobacteria. \\ Biochimica et Biophysica Acta 1057 (1991) 89 96

56. H. U. Schoeder, W. Lockau. Phylloquinone copurifies with the large subunit of phoyosystem I. \\ FEBS Letters 199(1) (1986) 23-26

57. M. Iwaki, S. Itoh. Reaction of reconstituted acceptor quinone and dynamic equilibration of electron transfer in the Photosystem I reaction center. \\ Plant and Cell Physiology 35 (1994) 983-993

58. S. Itoh, M. Iwaki, in: N. Mataga, T. Okada, H. Masuhara (Eds.), Dynamics and Mechanisms of Photoinduced Transfer and Related Phenomena, Elsevier, Amsterdam, 1992, pp. 527 541

59. Semenov, I. Vassiliev, A. van der Est, M. Mamedov, B. Zybailov, G. Shen, D. Stehlik, B. Diner, P. Chitnis, J. Golbeck. Recruitment of a foreign quinone into the Ai site of Photosystem I. \\ Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 23429 23438

60. Electron-Nuclear Double Resonance Spectroscopy,- J. Biol. Chem., 2000, V.275, pp. 85318539

61. Фотосинтез (в 2-х томах) / Говинджи // -T.l. М.: Мир. -1987. -С. 727.

62. J. Kruk, К. Strzalka / Fluorescence properties of plastoquinol, ubiquinol and a-tocopherol quinol in solution and liposome membranes / Biophys. Chem., V. 30, 1988, pp 143-149.

63. M. A. Slifkin / Charge Transfer interaction of Biomolecules // Academic Press, New York.-1971.-P.209

64. Andreasson, L. E. and Vangard, T. // Annual Revue of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. -V. 39. -1988. -P. 379-411.

65. Пат. США 2348037. Vitamin and process of obtaining same. / Thayer S.A., Bincley S.B., McKee R.W. et. A11.-C.A., 1954, v 39,159

66. Boyland E. Manson D. The reduction of p-quinones with litium aluminium hydride. J. Am. Chem. Soc., 1951, v. 73, pp.1837—1839

67. Mauer H., Isler O. Sintesis of vitamins K.- Methods in Ensimology, 1971, Part C., pp. 491543

68. Sawa Y. Tsuji K. Production of 1,4-naphtohydroquinone.- Ann. Rept. Shionogi Res.Lab., 1965,v. 6, pp. 7-15

69. Химия витаминов /В.М.Березовский /М.: «Пищевая промышленность», 1973,562 стр.

70. Справочник по аналитической химии / Ю.КХЛурье / М.: «Химия», 1971,443 стр.

71. Химия. / Пер. с нем. В.А.Молочко, С.В.Крынкиной. М.:«Химия». - 1989. - с.198-199

72. Martius С., Nitz-Litzow D. Uber den Wirkungsmechanismus des dicoumarols und verwandter Verbindungen. Biochim. Biophis. Acta, 1953, v.12, 4, pp.134-140

73. The New Sinthetic 6- Chromanyl Phosphate of Vitamin К 1(го) and Its Behavior in a Enzymatic System from Mycobacterium phlei / Asano A., Brodie A.F., et. al. J. Biol. Chem., 1962, v.237, p 2411-2412

74. Racker E., Mechanism of Synthesis of adenosine Triphosphate.- Advan. Enzymol., 1961, v. 23., '2, pp. 323-399

75. Chielewska L Oxidate and photosynthetic phosphorylation involving 2-methylquinones. -Biochim. Biophys. Acta, 1960, v. 39, 4, pp. 1770-171

76. Синтез производных 2-метил-1,4-нафтохинона возможных метаболитов витамина Ki / И.В. Арефьева, Е.Э.Жукова, Р.П.Евстегнеева / Тезисы докладов всесоюзной конференции по химии хинонов и хиноидных соединений, Красноярск, с. 137.

77. Yukio Nagahira, Kazunori Mysuki and Hideo Fukutome / Charge Transfer Interaction and Hydrogen Bonding between Vitamin К1 and Dihydrovitamin Ki // Jounal of the Physical Society of Japan. -V. 50. -1 1. -1981. -P. 255-260

78. Mathis, R. // Biochimica et biophysica Acta. -V. 1018. -1990. -P. 163-167

79. Rutherford, A. W. and Heathcote, P. // Photosynthesis Research. -V. 6. -1985. -P. 295-316

80. Инструментальные методы химического анализа/ Г. Юинг // -М.: «Мир». 1989

81. Способ получения витамина К1 из дигидровитамина К1./ Патент № 21859 С.Китамура, Т.Фудзита и др.(Перевод с японского языка) // -М.: -1978 -С.2

82. A.Schoberg, R.Moubasher, A. Said / Action of vitamin KI on a-amino acids // Nature/ -V. 164.-№ 140.-1949

83. Межмолекулярные взаимодействия: от двухатомных молекул до биополимеров / Б.Пюльман //-М.: «Мир». -1981. С. 592

84. Биофизическая химия / Ч.Кантор, П. Шиммел // -М.: «Мир». -1984. С. 173

85. D. Т. Ewing, J. М. Vandenbelt, and О. Kamm / The ultraviolet absorption of vitamins Ki, Кг, and some related compounds//J. Biol. Chem. -V. 131.-1939.-pp. 345-356.

86. G. Katsui, H. Fukawa, S. Kuima / Preparation oft he reference Standards of Phylloquinone Oxide, Menaquinone-4 Oxide and Menadione for High-Performance Liquid Cromatography // Vitamins. -V. 65. №10. -1991.- pp. 481-488.

87. Государственная фармакопея СССР/ изд. 11, выпуск 1, т. 1, стр. 45-47

88. Ч.Кантер, П. Шиммел / Биофизическая химия, т.2, стр. 85-113

89. A.G. Szabo, D.M.Rauner / Fluorescence decay of tryptophan conformers in aqueous solution/ Journal of the American Chemical Society, 102:2,16,1980, pp 554-561

90. P. Уэйн. Основы и применения фотохимии./ пер. с англ. Верещагиной JI.H., Разживина А.П.- М.: Мир, 1991г.-304 с.

91. N. Melkozernov, V. Н. R. Schmid, G. W. Schmidt, R. Е. Blankenship. (1998) Journal of Physical Chemistry В 102 8183 8189

92. Аскаров К.А., Березин Б.Д., Евстигнеева Р.П. и др., // Порфирины: структура, свойства, синтез.-М.: Наука, 1985.-333 с.

93. Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор, // Биология (В 3-х томах), -Т.1: Пер. с англ./Под ред. Р. Сопера. М.:Мир, 1990.,368 с.

94. Anderson, J. М., Boardman, N. К., // Fractionation of the Photochemical systems of photosynthesis, Biochim. Biophys. Acta, 1966, V.l 12, pp. 403-421

95. Органикум/ X. Беккер, Т.Домшке, Э. Фангхенель и др./ В 2-х томах, Т.2: пер. с нем. М: Мир, 1973 .-479с. - с.285