Каталитические системы получения водорода биофотолизом воды тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правахгп'кописи

НИКОЛЬСКАЯ Анна Борисовна

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРОДА БИОФОТОЛИЗОМ ВОДЫ

02.00.04 - физическая химия 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

7 ФЕВ 2013

005049249

Москва - 2012

005049249

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук.

Научные руководители: член-корр. РАН, доктор химических наук

Варфоломеев Сергей Дмитриевич,

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Курочкин Илья Николаевич, заведующий лабораторией постгеномной химии кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова;

доктор биологических наук, профессор Василов Раиф Гаянович, начальник НТК биоэнергетики НИЦ «Курчатовский институт».

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук, г. Москва.

Защита состоится «20» февраля 2013 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан <>/(}» di/f$m% 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук.

Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Водород широко применяется в различных химических

процессах, связанных с гидрированием, но также рассматривается в качестве

перспективной альтернативы традиционным ископаемым топливам.

Основное производство водорода сегодня связано с реализацией различных

термохимических процессов. Однако огромный научно-практический интерес и

актуальность представляет собой биологический способ получения водорода, так

как он позволяет избежать загрязнения окружающей среды и использования

ископаемого топлива, применить в качестве катализаторов клетки микроорганизмов

при условиях, характерных для их жизнедеятельности, создать экологичные

каталитические системы производства, функционирующие в отсутствие высоких

температур и давления в рабочем реакторе.

К числу методов получения водорода биологическим путем относятся:

анаэробная ферментация углеводсодержащих сред с участием клеток бактерий,

прямой или непрямой биофотолиз воды, катализируемый клетками микроводорослей

или цианобактерий и т.д. Однако все они находятся пока на стадии технологических

разработок и характеризуются низкой эффективностью. Альтернативой таким

методам может служить биофотолиз воды, осуществляемый в две стадии клетками

разных микроорганизмов, включающими накопление биомассы клеток кислород-

продуцирующих микроорганизмов (КМ), способных осуществлять фотосинтез, и

последующую ее анаэробную конверсию клетками водород-продуцирующих

бактерий. Принципиальная схема процесса выглядит следующим образом: Ьу

2С02 + 2Н20-► 2(СН20) + 02 (осуществляется клетками КМ);

2(СН20> 2Н2 + 2СО: (осуществляется клетками бактерий).

Такой процесс является весьма перспективным в связи с тем, что он использует единственный и исключительно чистый источник энергии, имеющий неограниченные резервы, - свет, и имеет огромное практическое значение с точки зрения получения альтернативных видов топлив. Применение иммобилизованных клеток в обсуждаемых процессах позволяет повысить выходы конечных продуктов, упростить

Список сокращений: АБЭ-ферментация - ацетон-бутанол-этанольная ферментация; АТФ -аденозинтрифосфат; ИБК - иммобилизованный бнокатализатор; ПВС - поливиниловый спирт: КМ - кислород-продуцирующие микроорганизмы.

операции выращивания и хранения культур микроорганизмов, а также позволяет создать новую перспективную технологию получения водорода.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы была разработка системы сопряжения процессов фоторазложения воды и образования водорода на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

В рамках этой работы решались следующие основные задачи:

1 - разработать биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий рода Clostridium, продуцирующих водород в процессе ацетон-бутанол-этанольной ферментации (АБЭ-ферментации), оптимизировать его состав и условия функционирования, а также определить основные каталитические характеристики биокатализатора;

2 - определить возможность использования биомассы различных КМ для ее конверсии иммобилизованными клетками бактерий рода Clostridium в водород, и отобрать культуры КМ, позволяющие накапливать биомассу, подлежащую наиболее эффективной конверсии в целевой продукт;

3 - разработать методы эффективного накопления биомассы клеток КМ для их конверсии в водород, а также метод иммобилизации клеток этих микроорганизмов;

4 - определить возможность использования культуральной жидкости, получаемой после стадии применения иммобилизованных клеток рода Clostridium в качестве среды для накопления биомассы клеток КМ;

5 - установить режим эффективного функционирования биокаталитической системы получения водорода биофотолизом воды из биомассы КМ.

Научная новизна. Впервые предложена кинетическая модель роста клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum в режиме их инактивации нейтральными продуктами, которые образуются в процессе АБЭ-ферментации.

Впервые установлено, что использование криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве носителя для иммобилизации клеток Clostridium acetobutylicum приводит к существенному повышению выходов водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозосодержащих сред.

Впервые показана возможность использования биомассы широкого спектра КМ в качестве потенциального субстрата для получения водорода в процессе АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum. Обнаружено

влияние биохимического состава и условий культивирования клеток КМ на выходы целевого продукта.

Впервые установлено, что использование криогеля ПВС в качестве носителя для иммобилизации клеток зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris позволяет значительно повысить эффективность накопления биомассы свободных клеток КМ в средах различного состава в полунепрерывном и непрерывном режимах культивирования.

Впервые предложен двухстадийный процесс биофотолиза воды по замкнутому циклу с использованием клеток микроводорослей и анаэробных бактерий для получения водорода.

Научно-практическая значимость. Разработан и оптимизирован по составу новый биокатализатор на основе клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС, который может быть многократно использован для получения водорода в процессе АБЭ-ферментации сред разного состава в реакторах различного типа, при этом скорость накопления целевого продукта может быть улучшена в 17 раз.

Установлено, что в качестве сред для получения водорода в процессе АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum можно использовать среды, содержащие термически предобработанную биомассу клеток КМ. Предлагаемые среды являются экологически чистым и доступным сырьем, но, в отличие от целлюлозо- или крахмало- содержащих сред, требуют значительно меньших затрат на их получение, предобработку и использование.

Разработан новый биокатализатор на основе клеток микроводорослей Chlorella vulgaris, включенных в поры криогеля ПВС, который позволяет накапливать биомассу клеток данного вида в средах различного состава в полунепрерывном и непрерывном режимах культивирования со скоростью в 8 раз выше, чем в случае использования известного из литературы аналога.

Впервые предложена новая замкнутая биокаталитическая система получения водорода биофотолизом воды, представляющая собой двухстадийный процесс с участием клеток КМ и водород-продуцирующих бактерий, полный рабочий цикл которого может быть осуществлен многократно.

Основные положения, выносимые на защиту: 1 - Кинетическая модель роста клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum в режиме их инактивации нейтральными продуктами, которые образуются в процессе АБЭ-ферментации.

2 - Биокатализатор на основе клеток Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС, может быть многократно использован для эффективного получения водорода в процессе АБЭ-ферментации сред различного состава в реакторах разного типа;

3 - Использование термически предобработанной биомассы клеток зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, культивирование которых проводилось в минеральной среде с добавлением глюкозы, в качестве субстрата для АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum позволяет получить максимальные выходы водорода;

4 - Биокатализатор на основе клеток Chlorella vulgaris, включенных в криогель ПВС, может быть успешно использован для накопления биомассы клеток данного вида с высокой скоростью в средах различного состава в полунепрерывном и непрерывном режимах культивирования;

5 - Сопряжение процессов накопления биомассы Chlorella vulgaris и АБЭ-ферментации клетками Clostridium acetobutylicum позволяет создать новую биокаталитическую систему получения водорода биофотолизом воды.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в постановке задач, проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. Все изложенные в диссертации результаты получены автором лично или при его непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: VIII, IX, X, XI Ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ "Биохимическая Физика" (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011), International conference «Catalysis for renewable sources: fuel, energy, chemicals» (Tsars Village, St. Petersburg suburb, Russia, 2010), 18th and 19th European Biomass Conference and Exhibition (Lion, France, 2010, and Berlin, Germany, 2011).

Публикации. Основные результаты работы по теме диссертации представлены в 18 печатных работах: из них 4 статьи в рецензируемых журналах, входящих в

Перечень ВАК, 4 статьи и 10 тезисов в сборниках трудов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 169 стр., включая 58 рисунков, 34 таблицы, и состоит из введения, 3 глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы (209 источников).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы исследований, определены цель и основные задачи исследования, приведена схема разрабатываемой в рамках данной работы системы, показана практическая значимость данной работы.

Литературный обзор состоит из трех разделов, в которых изложены способы получения водорода биологическим путем; показаны преимущества использования анаэробной ферментации клетками бактерий рода Clostridium для получения целевого продукта и приведен широкий спектр субстратов, которые могут использоваться для этих целей; обсуждены методы иммобилизации клеток рода Clostridium; представлен обзор по публикациям, посвященным анаэробной ферментации биомассы клеток КМ с образованием водорода; рассмотрены условия культивирования и методы иммобилизации клеток микроводорослей рода Chlorella, биомасса которых рассматривается как субстрат для получения водорода.

Материалы и методы:

Объектами исследования данной работы были клетки анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum В-1787, клетки зеленых микроводорослей Cosmarium sp., Chlorella vulgaris C-l, Dunaliella salina Teod. штамм rsemsu-D-I, Dunaliella tertiolecta штамм rsemsu-D-3, Narmochloropsis sp. штамм rsemsu-N-1, клетки цианобакгерий Nostoc sp., Arthrospira phitensis (NORDST.) GEITL. штамм 1/02-П и клетки красных микроводорослей Galdieria partita Sentz. штамм rsemsu-G-3. Условия культивирования для каждой из перечисленных культур микроорганизмов были индивидуальными. При работе с ними применялись традиционные микробиологические методы. Содержание углеводов в клетках КМ определялось фенольным методом.

Состав среды, в которой культивировались клетки Clostridium cicetobutylicum В-1787, был следующим (в г/л): триптон 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; глюкоза 50,0 (рН 6,8). Клетки Chlorella vulgaris С-1 выращивались в минеральной среде, в состав которой входили: KN03 - 5,0; КН2Р04 - 1,25; К2НР04хЗН20 - 3,35, MgS04x7H20 -2,5; FeS04x7H20 - 0,009; трилон Б - 0,037; раствор микроэлементов А - 1 мл. Раствор микроэлементов А содержал (г/л): Н3В03 - 2,86; МпС12х4Н20 - 1,81; ZnS04x7H20 -0,22; NH4V03 - 0,023; Мо03 - 0,015 (рН 6,8 - 7,0). Стерилизация сред осуществлялась при температуре 108 °С и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.

Иммобилизация клеток Clostridium acetobutylicum В-1787 и Chlorella vulgaris С-1 проводилась с использованием криогеля ПВС, полученного путём «замораживания-оттаивания» раствора полимера определенной концентрации. Накопленная биомасса клеток Clostridium acetobutylicum отделялась от культуралыюй жидкости и смешивалась с раствором ПВС в необходимом соотношении. Полученная смесь с помощью стерильного шприца распределялась по ячейкам 96-луночных планшетов, которые помещались далее в морозильную камеру при -20 °С и впоследствии размораживались. Клетки Chlorella vulgaris принудительно вводились в поры носителя, предварительно сформированного в виде блоков, после процедуры «замораживания-оттаивания».

АБЭ-ферментация иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum в средах различного состава проводилась анаэробно в атмосфере аргона при 37 "С в реакторах объемом 0,015 л, 0,5 л и 5 л. Оптическую плотность суспензии клеток микроорганизмов определяли спектрофотометрически (А = 540 им). Значение рН приготовленных сред и отбираемых в процессе экспериментов проб контролировалось потенциометрически. Концентрация глюкозы в среде определялась глюкозидазным методом, а концентрация внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) - люциферин-люциферазным методом с использованием биолюминесцентного реагента ООО «Люмтек» (Россия). Газовая хроматография применялась для анализа содержания водорода в газовой фазе.

Для представления полученных в работе данных проводились расчеты кинетических параметров роста клеток микроорганизмов, показателей конверсии субстрата в водород, скорости накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации под действием свободных или иммобилизованных клеток Clostridium acetobutylicum, а

также скорости накопления водорода, отнесенные к единице массы разработанного биокатшшзатора. При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали среднее значение и значение стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее, чем в трех повторностях.

Результаты и обсуждение: 1. Разработка иммобилизованного биокатализатора (ИБЮ на основе клеток бактерий С/тгг/с/жж асеюЬшуИсит и исследование его свойств. На рис. 1а представлена кривая роста свободных клеток С. асеюЬиГуНсит в среде, содержащей 50 г/л глюкозы. Наибольшая плотность клеток в среде (ОО540 = 25,3; концентрация биомассы 15,9 г/л) достигалась к 30 ч культивирования клеток данного штамма, чему соответствовал значительный рост концентрации внутриклеточного АТФ в клетках бактерий (рис. 16). Удельная скорость роста клеток бактерий /л составила 0,56 ч"1.

Время, п Время, я

Рис. 1. Кинетика роста свободных клеток С. асетЬшуИсит (а) и кинетика изменения

концентрации внутриклеточного АТФ в процессе их роста (б) в среде с 50 г/л глюкозы (СШ54о - оптическая плотность при длине волны 540 нм).

После 32 ч концентрация внутриклеточного АТФ и плотность клеток С. асеюЬиГуНсит быстро снижались. Это было обусловлено тем, что катализ АБЭ-ферментации клетками бактерий данного вида осуществлялся в две стадии: на первой фазе происходили активный рост свободных клеток бактерий и накопление в среде уксусной и масляной кислот, образование которых сопровождалось выделением водорода и быстрым снижением рН среды до значений 4,5 - 5,0. Это влекло за собой переключение метаболических процессов на вторую фазу процесса ферментации -

рост клеток С. асеюЬшуИсит заметно замедлялся, скорость накопления целевого продукта падала, и начиналось интенсивное образование нейтральных продуктов (ацетона, бутанола и этанола), которые в высоких концентрациях отрицательно воздействовали на жизнедеятельность свободных клеток С. асеюЬмуИсшп. Полученные данные по рН-зависимости процесса АБЭ-ферментации хорошо согласовывались с литературными данными. В целом, скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферементации клетками С. асеюЬшуИсит достигала 58,2 ± 2,5 мл/л среды/сут.

Кинетику изменения концентрации клеток по концентрации внутриклеточного АТФ (рис. 16) можно описать следующей системой дифференциальных уравнений:

Л ^

лг

— = аЫ Л

в которых N - число живых клеток бактерий, выраженное через концентрацию внутриклеточного АТФ (Ю-7 моль/мл); Р - количество образующегося продукта в жидкой фазе, выраженное в тех же единицах измерения, что и параметр ц -удельная скорость роста (ч"1); а - коэффициент, отражающий скорость гибели клеток; а - стехиометрический коэффициент, отражающий прирост продукта на единицу концентрации АТФ в клетке в единицу времени (ч'1); п - безразмерная величина, показывающая, сколько молекул продукта является губительным для одной клетки бактерий. При ц = 0,56 ч"1, а = 0,08 (мл/моль)"2- ч"\ а = 0,189 ч"1 и л = 0,5 рассчитанная зависимость числа живых клеток бактерий С. асеюЬиГуИсшп хорошо коррелирует с экспериментальной кривой (рис. 2). Индукционный период составил 17 ч и фаза, соответствующая ему, была отсечена.

При варьировании одного из параметров /I, а, а или п при фиксированных значениях всех остальных в приведенных выше дифференциальных уравнениях можно сделать следующие выводы:

- чем выше удельная скорость роста ¡1 клеток С. асеюЬшуИсит, тем выше концентрация внутриклеточного АТФ этих клеток и тем раньше достигается ее максимальное значение (рис. За);

2 60 -1 50-

Рис. 2. Корреляция между экспериментальной и теоретически рассчитанной кинетической кривой

"ь 40 -

-Рассчет

♦ Эксперимент

внутриклеточного АТФ в клетках С. асеюЬшуПсит в среде с 50 г/л глюкозы.

изменения

концентрации

а 0 10 20 30 40 50 60

Время, ч

— чем ниже параметры а и а, тем выше концентрация живых клеток бактерий (рис. 36 и Зв);

— чем выше значение параметра«, тем более чувствительны клетки бактерий к присутствию продуктов их метаболизма в жидкой фазе (рис. Зг).

Полученная кинетическая модель роста свободных клеток С. ас&оЬифНсит в среде, содержащей 50 г/л глюкозы, наглядно подтверждает то, что образуемые этими клетками в жидкой фазе продукты, являются сильными ингибиторами, и наличие их в высокой концентрации является губительным для них.

Для иммобилизации клеток С. асе1оЬшуИсит их биомасса отбиралась приблизительно через 23 - 26 ч после начала их роста (рис. 1). В качестве носителя был выбран криогель ПВС в связи с тем, что именно этот носитель зарекомендовал себя одним из лучших для иммобилизации клеток различных микроорганизмов, успешно использованных в разнообразных биотехнологических процессах.

Первоначально было исследовано влияние состава ИБК на выход водорода в процессе АБЭ-ферментации клетками С. асе1оЪии?Исит. Для этого были разработаны образцы биокатализатора, в которых варьировалась концентрация ПВС, используемого для иммобилизации клеток, (10%, 12,5% и 15%) и концентрация иммобилизуемой бактериальной биомассы (7%, 10% и 13%). Эти образцы экспонировались в мини-реакторах в среде с 50 г/л глюкозы в течение 48ч. Начальная концентрация иммобилизованных клеток во всех средах была одинаковой и составляла 10 г/л. В ходе процесса контролировалась скорость накопления водорода в газовой фазе и концентрация внутриклеточного АТФ в культуральной жидкости

(жидкой фазе) с С. асеюЬшуИсит.

1 60

о

? 50

0

2 40 30

и

1 20 | Ю

,1 0

целью контроля прироста свободных клеток бактерий

0 20 40 60

Время, *!

20 40 60

Время, ч

-и = 0,60

—11=0.56 ---И = 0.50

Рис. 3. Теоретически рассчитанные кривые изменения концентрации клеток по концентрации внутриклеточного АТФ в процессе роста свободных клеток С. асеюЬигуЧсит при варьировании параметров ц (а), а (б), а (в), п (г).

В результате проведенной оптимизации состава ИБК с использованием аддитивно-решетчатого метода описания объекта было установлено, что максимальная скорость накопления водорода наряду с минимальной концентрацией внутриклеточного АТФ свободных клеток в культуральной жидкости (1,4x10" моль/мл) достигалась при использовании ИБК следующего состава: 15% ПВС и 7% биомассы клеток С. асеюЬиГуНсит. Скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы в данном случае составила 80,6 ± 3,4 мл/л среды/сут, что было выше в 1,4 раза, чем в случае использования клеток С. асеИ)Ьи1уИсит в неиммобилизованном виде (58,2 ± 2,5 мл/л среды/сут). Это позволяет сделать вывод о

том, что иммобилизация клеток данного вида снижает ингибирующее воздействие на них образующихся в жидкой фазе продуктов.

Исследование свойств разработанного ИБК было проведено в реакторах трех типов: в мини-реакторе (0,015 л), в 0,5 л-реакторе с рН-контролем и в 5 л-реакторе с рН-контролем и непрерывным перемешиванием. Кинетика накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации под действием ИБК на основе клеток С. исеюЬшуЧсит во всех рассматриваемых системах приведена на рис. 4. Во всех системах использовалась среда, содержащая 50 г/л глюкозы. Процесс велся в анаэробных условиях в атмосфере аргона при 37 °С в течение 96 ч.

Рис. 4. Кинетика накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации под действием ИБК на основе клеток С. асеюЬшуИсит в среде с глюкозой (50 г/л) в мини-реакторе (♦), 0,5 л-реакторе

И 0 20 40 60 80 100 (□) и 5 л-реакторе (А).

К Время, ч

Было установлено, что при функционировании ИБК на основе клеток С. асеюЬмуПсшп в мини-реакторе максимальная скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы (100,8 ± 4,2 мл/л среды/сут) достигалась при отводе газовой фазы из мини-реактора и при концентрации иммобилизованных клеток 15 г/л в среде и была в 1,7 раза выше величины аналогичного параметра, полученного для свободных клеток бактерий. Было отмечено наличие индукционного периода (24 ч, рис. 4) в процессе накопления водорода, что, вероятно, было обусловлено адаптацией клеток к новым условиям и активацией метаболических процессов после процедуры «замораживания-оттаивания». Степень конверсии глюкозы составила 50%.

При переходе к 0,5 л-реактору оказалось, что установленная для иммобилизованных клеток С. асе1оЬшуИсит в мини-реакторе оптимальная концентрация не удовлетворительна для успешного проведения АБЭ-ферментации. Это было связано с тем, что при переходе к реакторам большего объема,

о

значительную роль начинали играть массообменные процессы. Наилучшие результаты в данном случае были получены при концентрации иммобилизованных клеток в среде 5,5 г/л.

Несмотря на то, что индукционный период в этом случае длился 48 ч, скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы под действием ИБК на основе клеток С. acetobutylicum в 0,5 л-реакторе с постоянным отводом газовой фазы превысила аналогичную величину, полученную в мини-реакторе с тем же ИБК, в 3 раза (302,4 + 11,5 мл/л среды/сут) (рис. 4). Это было связано с тем, что в случае 0,5 л-реактора осуществлялось рН-статирование среды 1М раствором КОН в интервале 6,0 - 6,5, что не позволяло клеткам бактерий в полной мере переключить метаболические процессы с пути преимущественного накопления водорода на стадию образования нейтральных продуктов.

Было показано, что разработанный ИБК на основе клеток С. acetobutylicum может быть многократно использован в средах, содержащих 50 г/л глюкозы. При этом индукционный период отсутствовал и скорость накопления водорода, полученная для четвертого цикла функционирования используемого ИБК, превысила аналогичную величину, достигнутую в первом цикле АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками С. acetobutylicum, в 1,8 раза и составила 557,8 ± 13,4 мл/л среды/сут. Степень конверсии глюкозы составила 91,8%.

Концентрация иммобилизованных клеток С. acetobutylicum в 5 л-реакторе с перемешиванием среды (70 об/мин) и постоянным отводом газовой фазы, как и в 0,5 л-реакторе, составила 5,5 г/л (рис. 5а). В используемом реакторе также осуществлялось рН-статирование среды 1М раствором КОН в интервале 6,0 - 6,5. Разработанный ИБК на основе клеток С. acetobutylicum показал высокую эффективность функционирования в течение 4 циклов процесса АБЭ-ферментации (рис. 4, рис. 56). Так, скорость накопления водорода к концу 3-его рабочего цикла составила 983,7 + 24,1 мл/л среды/сут (степень конверсии глюкозы составила 98,2%), что было в 16,9 раз выше, чем для свободных клеток, и в 9,8 раз выше, чем для 0,5 л-реактора. Таким образом, постоянное перемешивание позволило снизить влияние массообменных процессов и в сочетании с рН-статированием среды значительно повысить эффективность процесса получения водорода при использовании иммобилизованных клеток С. acetobutylicum.

Рис. 5. Внешний вид 5 л-реактора с ИБК на основе клеток С. acetobutylicum (а) и кинетика накопления водорода в нем в процессе АБЭ-ферментации глюкозы (б). Пунктиром отмечено время замены среды в реакторе с ИБК.

В табл. 1 представлены основные кинетические параметры конверсии глюкозы в водород свободными и иммобилизованными клетками С. acetobutylicum в реакторах разного типа. Как видно, выход водорода (YHyJr) и коэффициент конверсии глюкозы в водород (У p/s) возрастали при переходе от мини-реакторов к 5 л-реактору с ИБК на основе клеток С. acetobutylicum не менее, чем в 2,5 раза. Скорость накопления водорода (Qp) достигала в 5 л-реакторе максимальных значений - 42,3 мл/л/ч. Это превысило значение аналогичного параметра, полученного в мини-реакторе со свободными клетками, в 17,6 раз. Таким образом, иммобилизация клеток С. acetobutylicum в криогель ПВС и многократное использование этих клеток в 5 л-реакторе позволили значительно улучшить производительность клеток по водороду.

В табл. 1 также представлены данные по скоростям накопления водорода, отнесенным к единице массы разработанного ИБК, (Пкат), при этом максимальное значение было достигнуто в 5 л-реакторе (572 мл/кг биокатализатора/ч), что превысило в 25 раз аналогичную величину для мини-реакторов, а в сравнении с клетками Clostridium butyricum, иммобилизованными в агаровый гель (450 мл/кг биокатализатора/ч; Karube I., 1982), полученный ИБК характеризовался скоростью накопления водорода в 1,3 раза выше. Полученные результаты могут иметь огромное значение для процессов получения альтернативных видов топлив биологическим путем.

Таблица 1. Кинетические параметры конверсии глюкозы в водород свободными и иммобилизованными клетками С. асе^ЬиГуИсит в реакторах разного типа: 1 - мини-реактор со свободными клетками С. асеюЬшуИсит, 2 - мини-реактор с иммобилизованными клетками С. асеГоЬиГуНсит, 3 - 0,5 л-реактор с иммобилизованными клетками С. асеюЬшуИсшп (четвертый цикл функционирования), 4-5 л-реактор с иммобилизованными клетками С. асеюЬигуНсит (третий цикл функционирования).

——_____ Тип реактора Параметр 1 2 3 4

Ymdr, % от теорет.возм.уровня 3,70 6,50 19,50 16,10

Yp/s 0,07 0,13 0,39 0,32

Qp, мл/л/ч 2,40 4,20 23,24 42,30

Пка„„ мл/кг биокатализатора/ч - 23,11 313,80 571,92

2. Конверсия предобработанной биомассы КМ в водород под действием

иммобилизованных клеток С. acetobutylicum.

В качестве субстрата для АБЭ-ферментации под действием ИБК на основе клеток С. acetobutylicum была взята биомасса клеток зеленых микроводорослей Cosmarium sp., Chlorella vulgaris, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Nannochloropsis sp., клеток цианобактерий Nostoc sp., Arthrospira platensis и клеток красных микроводорослей Galdieria partita. Для всех отобранных культур микроорганизмов был проведен анализ содержания белков, углеводов и липидов в клетках, который показал, что большая часть использованных КМ отличается весьма высоким содержанием углеводов (выше 40%).

Все образцы биомассы клеток КМ подвергались предобработке путем термолиза при 108°С и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин и помещались в виде водной суспензии в мини-реактор в концентрации 20 - 30 г сух.в-в/л. Также туда вносился ИБК на основе клеток С. acetobutylicum так, что концентрация иммобилизованных клеток в среде составляла 15 г/л. Процесс велся в анаэробных условиях в атмосфере аргона при 37 °С в течение 96 ч. Полученные данные по накоплению водорода при использовании предобработанной биомассы КМ в качестве единственного источника всех питательных компонентов представлены в табл. 2 и на

рис. 6. Как видно, во всех случаях, кроме образца №11 (Chlorella vulgaris), отсутствовал индукционный период (рис. 6).

Таблица 2. Скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации под действием иммобилизованных клеткок С. acetobutylicum в среде, содержащей предобработанную биомассу клеток различных КМ.

№ Название штамма Концентрация углеводов в среде, г/л Скорость накопления водорода, мл/л среды/сут УHyän %

1 Arthrospira platensis 8,2 69,4±3,3 27,2

2 Arthrospira platensis 7,8 20,2+1.4 8,3

3 Nannochloropsis sp. 14,7 38,1+1,9 8,3

4 Nannochloropsis sp. 15,1 ~0 -

5 Nannochloropsis sp. 15,4 80,6+3,4 16,8

6 Nannochloropsis sp. 23,2 40,3+2,1 5,6

7 Dunaliella tertiolecta 14,4 4,5+0,2 1,0

8 Dunaliella tertiolecta 12,7 15,7+1,3 4,0

9 Dunaliella salina 16,1 6,7±0.3 1,3

10 Galdieria partita 14,4 ~0 -

11 Chlorella vulgaris 14,5 33,6+1,8 7,4

12 Cosmarium sp. 12,7 2,2+0,1 0,6

13 Nostoc sp. 10,8 6,7±0,3 2,0

Рис. 6. Кинетика накопления водорода в процессе конверсии предобработанной биомассы клеток КМ под действием ИБК на основе клеток С. acetobutylicum (1-ый рабочий цикл): □ - №5, А - №1, 0 -№2, Д - №6, ♦ - №3, • - №8, х -№11. Контроль (о) - 50 г/л глюкозы.

В табл. 2 также приведены данные по концентрациям углеводов в средах, содержащих разрушенную биомассу клеток микроводорослей и цианобактерий, и по выходам водорода (YHydr), полученным из расчета того, что концентрация углеводов

считалась равной концентрации глюкозы в среде. Было принято, что конверсия углеводов так же, как и глюкозы в мини-реакторах, осуществлялась на 50%.

Было обнаружено, что при использовании образцов биомассы КМ №6, №7, №8, №9, №12 и №13 выходы водорода были ниже выхода, полученного в случае использования среды с глюкозой (50 г/л) - 6,5% (табл. 2). Во всех остальных случаях полученные значения превышали эту величину. Вероятно, это было связано с различиями в строении клеток микроводорослей и цианобактерий в каждом отдельном случае, а также с тем, в каких условиях культивировались клетки КМ.

Наибольшие выходы водорода были получены в мини-реакторах со средой, содержащей предобработанную биомассу клеток Nannochloropsis sp. и A. platerisis (табл. 2, образцы №5 и №1). Однако с использованием этих клеток связан ряд существенных проблем. В случае клеток Nannochloropsis sp. технически затрудненной является стадия отделения биомассы клеток от среды, используемой для ее наращивания, в связи с крайне малыми размерами этих клеток. Клетки цианобакгерии Л. platensis растут в морской воде или в средах с повышенным содержанием солей, вследствие чего требуются весьма значительные затраты на дорогостоящее оборудование, устойчивое к коррозии, которую могут вызывать солесодержащие среды.

В связи с этим, наиболее выгодным субстратом для АБЭ-ферментации с точки зрения выходов водорода и условий его накопления, а также отделения биомассы, используемой в качестве субстрата для этого процесса, являются клетки Chlorella vulgaris (табл. 2, образец №11). Размеры этих клеток составляют 5-10 мкм. Составы сред, требуемых для их культивирования, содержат минимальное количество солей. При многократном использовании ИБК, полученного на основе клеток С. acetobuylicum, для трансформации биомассы клеток С. vulgaris в водород полностью отсутствовал индукционный период, характерный для 1-ого цикла процесса АБЭ-ферментации той же биомассы клеток (рис. 6). К концу 4-ого цикла скорость накопления водорода составила 44,0 ± 2,1 мл/л среды/сут, что было выше на 24% скорости, полученной в течение 1-ого цикла функционирования ИБК (рис. 7). Эта же скорость осталась и на 5-ом цикле использования иммобилизованных клеток С. acetobuylicum в аналогичной среде.

500

Рис. 7. Кинетика накопления водорода при многократном использовании ИБК на основе клеток бактерий С. acetobuylicum в среде с предобработанной биомассой клеток С. vulgaris (пунктиром отмечено время = Время ч замены среды в реакторе с ИБК).

Выход водорода в 4-ом цикле работы ИБК составил 9.8% от теоретически возможного уровня, что превысило выход, полученный в процессе 1-ого цикла функционирования ИБК в виде иммобилизованных клеток С. acetobuylicum, в 1,3 раза и в случае мини-реакторов с глюкозой - в 1,5 раза. Это позволяет сделать вывод о том, что использование предобработанной биомассы клеток С. vulgaris, представляющую собой экологически чистое, дешевое и доступное сырье, в качестве субстрата для получения водорода в процессе АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками С. acetobuylicum является весьма перспективным. 3. Влияние условий накопления биомассы клеток С. vulgaris на характеристики этого процесса и на параметры проведения АБЭ-Ферментации под действием иммобилизованных клеток С. acetobuylicum.

Для эффективного накопления биомассы клеток С. vulgaris использовалась минеральная среда (Tamiya Н., 1953) при круглосуточном освещении (1000 Люкс). Источником углерода являлся углекислый газ, содержавшийся в воздухе. Удельная скорость роста клеток (р) составила 0,21 сут"1, концентрация накопленной биомассы к 120 суткам культивирования достигала 35 - 40 г/л.

Было исследовано влияние введения в минеральную среду дополнительных органических источников углерода, в частности глюкозы и глицерина, на накопление биомассы клеток С. vulgaris. Это было связано с тем, что глюкоза является основным компонентом отходов переработки целлюлозосодержащего сырья или отходов сельскохозяйственной промышленности, а глицерин содержится в больших количествах в отходах производства биодизеля. Для сравнения в данной работе в качестве источника углерода также был взят ацетат натрия, являющийся весьма дешевым субстратом. Использование таких субстратов для накопления биомассы КМ

в комбинации с углекислым газом в качестве основных источников углерода могло бы сделать этот процесс еще более привлекательным с экологической точки зрения.

На рис. 8 приведена кинетика накопления биомассы клеток С. vulgaris в минеральной среде с добавлением глюкозы, глицерина или ацетата натрия в концентрации 5 г/л. Вне зависимости от вносимого органического субстрата удельная скорость роста (ju) возрастала не менее, чем в 1,5 раза (табл. 3) по сравнению с режимом культивирования, проводившимся в отсутствии добавок.

Рис. 8. Кинетика роста клеток С. vulgaris при круглосуточном освещении в минеральной среде без добавления (о) и с добавлением (5 г/л): глюкозы (♦), глицерина (п) или ацетата натрия (A) (OD540 -оптическая плотность при длине волны 540 нм).

5 10

Время, сутки

Таблица 3. Значения удельной скорости роста (jj) и скорости накопления биомассы (V) клеток С. vulgaris при введении в минеральную среду определенного дополнительного органического источника углерода в концентрации 5 г/л.

Субстрат СО; Глюкоза Глицерин Ацетат натрия

fi, сут"' 0,21 ±0,04 0,42±0,06 0,39+0,06 0,32+0,04

V, г/л/сут 0,05+0,001 1,53+0,03 1,22+0,02 0.32+0,01

Наилучшие скорости накопления биомассы клеток С. vulgaris были получены в случае добавления в минеральную среду в качестве дополнительного источника углерода глюкозы (табл. 3). Уровень накопления биомассы в этом случае достигал 13- 14 г/л за 10 сут, что было выше уровня накопления биомассы в отсутствии глюкозы за этот же период времени в 30 раз.

Интересным оказалось то, что в случае добавления в минеральную среду органического субстрата возрастало существенно содержание в клетках С. vulgaris углеводов - в 1,3 раза - в сравнении с режимом накопления клеток в отсутствие добавок. В связи с этим была исследована эффективность АБЭ-ферментации предобработанной биомассы клеток рассматриваемого вида, выращенных в минеральной среде с глюкозой, и ее сравнение с данными, полученными в случае

использования биомассы этих же клеток, культивирование которых проводилось в отсутствие глюкозы.

Биомасса клеток С. vulgaris, накопленная в минеральной среде с глюкозой, подвергалась термолизу при 108 "С и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин. Затем, в концентрации 26 г сух.в-в/л она вносилась в мини-реакторы вместе с иммобилизованными в криогель ПВС клетками бактерий С. acetobutylicum в концентрации 15 г/л. Процесс АБЭ-ферментации осуществлялся в течение 96 ч анаэробно при 37 °С. Накопление водорода в данном случае происходило без индукционного периода, и скорость накопления целевого продукта достигла 58,2+2,3 мл/л среды/сут, что было выше в 1,3 раза, чем в случае 4-ого цикла функционирования того же ИБК в среде с биомассой клеток С. vulgaris, культивирование которой проводилось в отсутствие глюкозы. Выход водорода от теоретически возможного уровня не изменился и составил 9,8%.

Вероятно, полученные данные были связаны с одной стороны, с тем, что в случае внесения в мини-реактор биомассы клеток С. vulgaris, накопленной в минеральной среде с глюкозой, концентрация углеводов составляла 18,8 г/л, что выше в 1,3 раза той концентрации, которая создавалась в случае использования биомассы клеток С. vulgaris, полученной в отсутствие органического субстрата. С другой стороны, режим культивирования в первом случае, возможно, стимулировал образование таких углеводов в клетках С. vulgaris, которые клетки бактерий С. acetobutylicum способны были деградировать с большей скоростью, чем те углеводы, которые были доступны им в случае использования в качестве субстрата биомассы клеток С. vulgaris, выращенной во втором случае.

Длительное культивирование клеток С. vulgaris в минеральной среде с глюкозой было проведено в полунепрерывном режиме при высокой концентрации исходно вносимых клеток. При этом процедуру внесения свежей среды возможно было осуществлять многократно, и она сопровождалась увеличением скорости накопления биомассы клеток С. vulgaris и достижением стабильно высоких ее значений. Концентрация биомассы клеток микроводорослей достигала 31,5 ± 0,5 г/л.

Накопленная в полунепрерывном режиме культивирования биомасса клеток С. vulgaris в дальнейшем использовалась для осуществления непрерывного режима культивирования в экспериментальном лабораторном фотобиореакторе (ООО

«АСПЕКТ», Россия) (рис. 9а). Суспензия клеток микроводорослей помещалась в реактор объемом 20 л, из которого посредством центробежного насоса она прокачивалась со скоростью 20 л/мин через систему стеклянных трубок с внутренним диаметром 35 мм и внешним диаметром 38 мм. Через среду круглосуточно барботировался углекислый газ со скоростью 1 - 2 мл/мин. Также в данной системе осуществлялось постоянное освещение мощностью 5000 Люкс источниками света с длиной волны в интервалах 450 - 480 нм и 640 - 700 нм одновременно. Фотобиореактор был оснащен полностью автоматизированной системой контроля рН среды, проводимости среды, температуры культивирования и концентрации растворенного кислорода в среде. Регулярно производилась замена 4 л суспензии клеток С. vulgaris на 4 л свежей среды. Полученная в непрерывном режиме культивирования в минеральной среде с глюкозой зависимость концентрации и числа клеток С. vulgaris, накапливающихся в среде, от времени представлена на рис. 96. Видно, что в данном случае оказалось возможным весьма эффективное наращивание и поддержание культуры клеток С. vulgaris в концентрации 8 - 10 г/л в течение не менее 50 суток культивирования в автоматизированной системе используемого 20 л-фотобиоре актора.

Рис. 9. Общий вид фотобиореактора, используемого для непрерывного культивирования клеток С. vulgaris, (а) и кинетика накопления этих клеток в нем (б): ♦ - концентрация клеток С. vulgaris в среде, о - число клеток С. vulgaris в среде. Пунктиром отмечено время замены 20% объема суспензии клеток микроводорослей на свежую среду.

Для иммобилизации клетки микроводорослей С. vulgaris принудительно вводились в поры криогеля ПВС, сформированного в виде полимерных блоков

о

размером 220x220 мм, высотой 5 мм и массой 72,0 ± 0,2 г (рис. 10а) путем «замораживания-оттаивания» 11%-ного раствора ПВС, которые далее помещались в фильтрационную установку ФД-293-3 (НПК «Биотест», Россия) (рис. 106). Через такую систему посредством перистальтического насоса прокачивалась со скоростью 70 мл/ч суспензия клеток С. vulgaris (1 л) с концентрацией 7х107 кл/мл (10 г/л, рис. 9).

Рис. 10. Фотографии, иллюстрирующие процесс получения ИБК на основе клеток С. vulgaris: а - пласты криогеля ПВС; б - фильтрационная установка для иммобилизации клеток С. vulgaris, в - пласт криогеля ПВС с иммобилизованными клетками С. vulgaris.

При внесении разработанного ИБК на основе клеток С. vulgaris в концентрации 54 г/л в минеральную среду с глюкозой (5 г/л) он обеспечивал скорость накопления этих клеток в ней, равную 20,2 + 0,6 г сух.в-в/м"/сут. Появившийся в процессе выполнения данной работы зарубежный аналог, представлявший собой клетки Chlorellasp., иммобилизованные методом абсорбции в объеме подложки, изготовленной на основе пенополистирола, обеспечивал лишь 2,57 г сух.в-в/м2/сут биомассы клеток.

На основании вышесказанного можно заключить, что внесение разработанного ИБК на основе клеток С. vulgaris в минеральную среду с добавлением глюкозы позволяет накапливать биомассу клеток микроводорослей с высокой эффективностью, что, несомненно, является положительным фактором в процессе получения водорода путем АБЭ-ферментации предобработанной биомассы КМ иммобилизованными клетками С. acetobutylicum.

4. Сопряжение процессов с участием двух биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроводорослей С. vulgaris и клеток бактерий С. acetobutylicum

Клетки С. vulgaris успешно росли в минеральной среде, содержавшей 25% термообработанной культуральной жидкости, полученной после АБЭ-ферментации

иммобилизованными клетками С. асеюЬиГуИсит, с удельной скоростью 0,56 сут" , что было выше в 1,3 раза, чем в случае выращивания клеток микроводорослей этого же вида в минеральной среде с добавлением 5 г/л глюкозы. Концентрация биомассы клеток микроводорослей к 24 суткам культивирования достигала 26 ± 0,4 г/л.

Принципиальная схема получения водорода биофотолизом воды, разработанная на основе полученных в данной работе результатов, приведена на рис. 11.

Концентрирование биомассы клеток С. vulgaris

Термическая предобработка биомассы клеток С. vulgaris

СО,

hv

Накопление биомассы КМ

о2 ¥

Биомасса клеток зеленых микроводорослей С. vulgaris

Н,

АБЭ-ферментация

Биомасса клеток анаэробных бактерий С. acetobutylicum

Термолиз культуральной жидкости

Отделение культуральной жидкости от биомассы клеток С. acetobutylicum

Рис. 11. Принципиальная схема получения водорода биофотолизом воды с использованием биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris и бактерий С. acetobutylicum.

Полный рабочий цикл предлагаемой схемы (рис. 11) может быть осуществлен непрерывно не менее 5 раз без замены используемых ИБК на основе клеток микроорганизмов. Каждый такой цикл сопровождается поглощением углекислого газа, являющегося одним из основных загрязнителей воздуха, а также раздельным образованием кислорода и водорода, которые имеют широкое практическое применение на сегодняшний день. В частности, водород может напрямую использоваться в качестве альтернативного источника энергии.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен и детально исследован феномен экстремальной зависимости от времени количества физиологически активных клеток Clostridium acetobutylicum. Предложена кинетическая модель роста этих клеток на базе системы дифференциальных уравнений, учитывающая их инактивацию избыточным

количеством органических растворителей, образующихся в процессе АБЭ-ферментации. Получено хорошее соответствие кинетической модели и экспериментальных данных.

2. Разработан и оптимизирован по составу новый биокатализатор на основе клеток Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС. Показано, что скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы под действием такого биокатализатора в мини-реакторах в 1,7 раза превышает скорость накопления водорода свободных клеток.

3. Показана возможность масштабирования и многократного использования иммобилизованного биокатализатора на основе клеток Clostridium acetobutylicum, при этом скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы может быть увеличена в 17 раз.

4. Впервые установлена и количественно охарактеризована возможность использования биомассы различных КМ в качестве субстрата для получения водорода в ходе АБЭ-ферментации, катализируемой иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum. Показано, что для получения максимальных выходов целевого продукта целесообразно использовать биомассу клеток зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, накопление которой осуществлялось в минеральной среде с добавлением глюкозы.

5. В результате оптимизации условий культивирования клеток микроводорослей Chlorella vulgaris установлено, что наиболее эффективное накопление биомассы достигалось в минеральной среде с добавлением глюкозы при круглосуточном люминесцентном освещении и высокой концентрации исходно вносимых клеток в полунепрерывном и непрерывном режимах культивирования.

6. Разработан новый биокатализатор на основе клеток микроводорослей Chlorella vulgaris, которые принудительно вводились в поры криогеля ПВС, сформированного в виде полимерных блоков. Он позволяет в минеральной среде с добавлением глюкозы накапливать в 8 раз больше биомассы клеток микроводорослей, чем при использовании известного аналога.

7. Впервые показана возможность создания замкнутой биокаталитической системы получения водорода биофотолизом воды, полный рабочий цикл которой может быть осуществлен многократно.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В РАБОТАХ:

1. Ефременко E.H., Степанов H.A., Никольская А.Б.. Сенько О.В., Спричева О.В., Варфоломеев С.Д. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола // Катализ в пром-ти, 2010. № 5. С.70 - 76. (ВАК)

2. Efremenko E.N., Nikolskava A.B., Lyagin I.V., Senko O.V., Makhlis T.A., Stepanov N.A., Maslova O.V., Mamedova F.. Varfolomeev S.D. Production of biofuels from pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized Clostridium acetobutylicum cells // Bioresource Technology, 2012. V. 114. P. 342 -348. (ВАК)

3. Сенько O.B., Гладченко M.A., Лягин И.В., Никольская А.Б.. Маслова О.В., Чернова Н.И., Киселева С.В., Коробкова Т.П., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. Трансформация биомассы фототрофных микроорганизмов в метан // Альтернативная энергетика и экология, 2012. Т. 108(3). С. 89 - 94. (ВАК)

4. Никольская А.Б.. Холстов A.B., Лягин И.В., Мамедова Ф., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д.. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения задач альтернативной энергетики и экологии // Альтернативная энергетика и экология, 2012. Т. 108(4). С. 95 - 100. (ВАК)

5. Efremenko E.,_Stepanov N., Nikolskava A.. Senko О., Gudkov D., Spiricheva O., Varfolomeev S. Immobilized cells of various microorganisms in production of liquid biofuels // In book. 18th European Biomass Conference and Exibition, 3-7 May 2010 Lyon, France (Eds. J. Spitzer, J.F. Dallemand, D. Baxter, H. Ossenbrink, A. Grassi, P.Helm), ETA-Florence Renewable Energies, P. 1753 - 1758.

6. Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskava A.. Maslova O., Zorov I., Sinitsyn A. Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // In book. 19th European Biomass Conference and Exhibition, 6-10 June 2011, Berlin, Germany (Eds. Faulstich, M„ Ossenbrink, H., Dallemand, J.F., Baxter, D., Grassi, A., Helm, P.), ETA-Florence Renewable Energies, P. 1735 - 1738.

7. Никольская А.Б.. Сенько O.B., Ефременко E.H. Трансформация биомассы фототрофных микроорганизмов в биотоплива // Междунар. научно-практ. конф-

ция «Рациональное использование ресурсного потенциала регионов России и сопредельных государств», Брянск, 2011, 18 - 19 ноября, С. 118 - 125. 8. Nikolskava A.. Stepanov N„ Senko О.. Lyagin I., Efremenko E., Varfolomeyev S. Hydrogen-producing immobilized biocatalyst: composition and properties // Modern Problems in Biochemical Physics. New Horizons. Nova Science Publ., N.Y., 2012. P. 163- 170.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в проведении экспериментов н.с. Сенько О.В., к.х.н. Лягину И.В., к.т.н. Степанову Н.А., м.н.с. Холстову А.В. и м.н.с. Сироткиной М.С., за поддержку и терпение автор благодарит свою семью.

Подписано в печать 10.01.2013г.

Усл.пл. - 1.5 Заказ №11679 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Получение водорода биологическим путем.

1.1.1. Способы получения водорода биологическим путем.

1.1.2. Получение водорода при темновой ферментации сред различного состава клетками бактерий рода Clostridium.

1.1.3. Иммобилизация клеток бактерий рода Clostridium и ее влияние на выходы водорода.

1.2. Анаэробная ферментация биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов с образованием водорода.

1.3. Биомасса клеток микроводорослей рода Chlorella как субстрат для получения водорода: условия культивирования и возможность иммобилизаци.

1.3.1. Влияние условий культивирования клеток микроводорослей рода Chlorella на выход и скорость накопления биомассы.

1.3.1.1. Составы сред.

1.3.1.2. Влияние концентрации углекислого газа на рост клеток микроводорослей.

1.3.1.3. Влияние соотношения объемов газовой и жидкой фаз в реакторе на рост клеток микроводорослей.

1.3.1.4. Влияние температуры на рост клеток микроводорослей.

1.3.1.5. Роль света и интенсивности освещения в процессе культивирования клеток микроводорослей.

1.3.1.6. Влияние концентрации клеток микроводорослей в среде на их рост.

1.3.2. Иммобилизация клеток микроводорослей рода Chlorella.

1.4. Цели и задачи работы, вытекающие из обзора литературы.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Химические реактивы.

2.1.2. Микроорганизмы.

2.2. Методы.

2.2.1. Культивирование клеток микроорганизмов.

2.2.1.1. Культивирование клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum.

2.2.1.2. Культивирование клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов.

2.2.2. Иммобилизация клеток микроорганизмов.

2.2.2.1. Иммобилизация клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum.

2.2.2.2. Иммобилизация клеток зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris.

2.2.3. Биохимический анализ клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов.

2.2.3.1. Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов.

2.2.3.2. Определение липидов.

2.2.3.3. Определение белков.

2.2.3.4. Опредление углеводов.

2.2.4. АБЭ-ферментация иммобилизованными клетками анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum в средах различного состава.

2.2.5. Измерение оптической плотности суспензии клеток микроорганизмов и рН среды.

2.2.6. Определение концентрации глюкозы.

2.2.7. Определение концентрации внутриклеточного АТР биолюминисцентным методом.

2.2.8. Анализ водорода в газовой фазе в процессе АБЭ-ферментации клетками бактерий.

2.2.9. Анализ спиртов в жидкой фазе в процессе АБЭ-ферментации клетками бактерий.

2.2.10. Определение кинетических параметров процессов с использованием свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка биокатализатора на основе иммобилизованных клеток водород-продуцирующих бактерий рода Clostridium и исследование его свойств.

3.1.1. Выбор штамма водород-продуцирующей культуры рода Clostridium.

3.1.2. Выбор среды для эффективного выращивания клеток С. acetobutylicum.

3.1.3. Оптимизация состава иммобилизованного биокатализатора на основе клеток С. acetobutylicum, включенных в криогель поливинилового спирта.

3.1.4. Физико-химические параметры процесса АБЭ-ферментации глюкозы под действием ИБК, полученного на основе клеток С. acetobutylicum.

3.1.4.1. Свойства ИБК, полученного на основе клеток С. acetobutylicum, в мини-реакторе.

3.1.4.2. Свойства ИБК, полученного на основе клеток С. acetobutylicum, в 0,5 л-реакторе: влияние рН-статирования среды и многократного использования исследуемого ИБК.

3.1.4.3. Свойства ИБК, полученного на основе клеток С. acetobutylicum, в 5 л-реакторе: влияние дополнительного перемешивания среды.

3.1.4.4. Сравнительный анализ основных параметров процесса АБЭ-ферментации, осуществляемого свободными и иммобилизованными клетками С. acetobutylicum.

3.2. Конверсия предобработанной биомассы кислород-продуцирующих микроорганизмов в водород под действием иммобилизованных клеток С. acetobutylicum.

3.2.1. Анализ биохимического состава клеток различных кислород-продуцирующих микроорганизмов.

3.2.2. Выбор способа предобработки биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов.

3.2.3. Получение водорода из предобработанной биомассы кислород-продуцирующих микроорганизмов с помощью иммобилизованных клеток С. acetobutylicum.

3.2.4. Обоснование выбора культуры кислород-продуцирующих микроорганизмов рода Chlorella в качестве субстрата для получения водорода в ходе АБЭ-ферментации, катализируемой иммобилизованными клетками С. acetobutylicum.

3.3. Физико-химические параметры процесса накопления биомассы клеток С. vulgaris, используемой в качестве субстрата в процессе АБЭ-ферментации иммобилизованными клетками С. acetobuylicum.

3.3.1. Накопление биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris в минеральной среде.

3.3.2. Введение дополнительного органического источника углерода в минеральную среду для накопления биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris.

3.3.3. Полунепрерывный и непрерывный процесс накопления биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris в минеральной среде с глюкозой.

3.3.4. Влияние иммобилизации клеток микроводорослей С. vulgaris на процесс накопления их биомассы.

3.4. Сопряжение процессов с участием клеток микроводорослей С. vulgaris и клеток бактерий С. acetobutylicum.

3.4.1. Исследование возможности использования культуральной жидкости, образующейся после АБЭ-ферментации с участием клеток С. acetobutylicum, в качестве дополнительного источника питательных веществ в среде для культивирования клеток микроводорослей С. vulgaris.

3.4.2. Первичная оценка устойчивости разработанной системы сопряженных процессов фоторазложения воды и образования водорода на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Биоэнергетика в последние 10-15 лет стала занимать все более заметное место в мировом производстве тепла, электричества и моторных топлив [1].

Всплеск интереса к биомассе связан с истощением запасов ископаемого топлива, стремлением к энергосбережению и национальной энергобезопасности и необходимостью сокращения эмиссии парниковых газов, поэтому использование этого возобновляемого источника энергии находит все большее распространение как в развивающихся, так и в промышленно развитых странах [2,3]. Биомасса - шестой по запасам из доступных на настоящий момент источников энергии после горючих сланцев, урана, угля, нефти и природного газа и пятый по производительности после прямой солнечной, ветровой, гидро и геотермальной энергии [4]. Ее классифицируют на древесную (до 80%), травяную и плодовую биомассу. Также к ней относят отходы пищевой, сельскохозяйственной и лесоперерабатывающей промышленностей [5].

Повышенное внимание на сегодняшний день уделяется биомассе кислород-продуцирующих микроорганизмов, т.е. микроводорослям и цианобактериям. Это обусловлено тем, что их культивирование в сравнении с другими представителями биомассы обладает рядом существенных преимуществ [6]:

1 - микроводоросли способны расти круглый год в фотобиореакторах закрытого типа;

2 - микроводоросли растут в водной среде, содержащей минимальное количество питательных веществ, что упрощает процесс самого культивирования;

3 - размещение фотобиореакторов может быть на непахотных землях, что сводит к минимуму экологические последствия, связанные с землепользованием;

4 - микроводоросли улучшают качество воздуха, поскольку могут фиксировать ССЬ (1 кг сухой биомассы водорослей может использовать до 1,83 кг ССЬ);

5 - выращивание микроводорослей не требует применения гербицидов и пестицидов в отличие от сельскохозяйственных культур, что имеет огромное экономическое и экологическое значение.

Кроме этого кислород-продуцирующие микроорганизмы являются углеводсодержащим сырьем, что позволяет их использовать в качестве субстрата для анаэробного сбраживания клетками бактерий, продуцирующих водород.

Водород является одним из основных претендентов на использование в качестве топлива, т.к. он превышает по энергоемкости на единицу массы все соединения, использующиеся в качестве топлива. Практически единственным продуктом его сгорания является вода [1]. В современной промышленности большую часть водорода получают паровой конверсией метана или каталитической конверсией углеводородов. Однако серьезным недостатком этих методов является наличие высоких выбросов ССЬ в атмосферу. Кроме того, в технологическом процессе получения водорода данным способами используется высокопотенциальная энергия, на получение которой в свою очередь затрачивается дефицитное ископаемое топливо (уголь, природный газ, нефтепродукты), что делает такое производство экономически не выгодным. Также водород можно синтезировать путем электролиза воды, но из-за высокой стоимости электроэнергии доля такого способа в мировом производстве не превышает 5% [7].

В связи с описанным выше актуальным является получение водорода биологическим путем. Это позволяет избежать загрязнения окружающей среды и является идеальной альтернативой топливам, получаемым из полезных ископаемых. Такой выбор обусловлен тем, что биологический процесс, в отличие от химического или электрохимического, катализируется микроорганизмами в водной среде при условиях (температуре и давлении), характерных для их жизнедеятельности, что позволяет создать экологически чистые каталитические системы производства водорода, функционирующие в отсутствие высоких температур и давления в рабочем реакторе.

На сегодняшний день методы получения водорода биологическим путем находятся на стадии технологических разработок. Достаточно много известно о темновых анаэробных процессах, осуществляемых, например, при брожении углеводов клетками Clostridium. Однако их недостатками являются низкий выход водорода и наличие побочных продуктов. С помощью микроводорослей можно реализовать прямой биофотолиз (т.е. сначала на свету в клетках микроводорослей происходит фотосинтез, затем в темноте Fe-гидрогсназы в них активируются, и выделяется водород), но токсическое действие кислорода на Fe-гидрогеназу ограничивает возможности его использования [7, 8]. Низкие эффективность и скорости процессов, осуществляемых цианобактериями, также создают ряд проблем. Перспективными являются пурпурные несерные бактерии, поэтому в последнее время интенсифицировались работы по поиску дешевых субстратов и оптимальных условий для этих микроорганизмов [7, 9].

Интересен процесс биофотолиза воды в две стадии разными микроорганизмами, который состоит из: 1) разложения воды под действием света с выделением кислорода (фотосинтез); 2) получения водорода из продуктов фотосинтеза. Этот процесс является весьма перспективным в связи с тем, что он требует единственного и исключительно чистого источника энегрии, имеющего неограниченные резервы, - света [10, 11], но вместе с тем он представляет собой малоизученную область.

Таким образом, осуществление биофотолиза воды в две стадии, т.е. накопление биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов, способных осуществлять фотосинтез, с последующей ее анаэробной конверсией клетками водород-продуцирующих бактерий, имеет огромное практическое значение с точки зрения получения альтернативных видов топлив. Применение иммобилизованных клеток в обсуждаемых процессах, как ожидается, может позволить повысить выходы конечных продуктов, упростить операции выращивания и хранения культур микроорганизмов, а также позволяет создать новую перспективную технологию получения водорода.

Кроме этого, интерес представляет собой исследование возможности «зацикливания» процесса биофотолиза, т.е. возможность использования культуральной жидкости, получаемой после анаэробной конверсии субстрата на второй стадии биофотолиза, для культивирования клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов на первой стадии.

Целью данной работы была разработка системы сопряжения процессов фоторазложения воды и образования водорода на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Принципиальная схема разрабатываемой системы с сопряжением процессов фоторазложения воды (I) и образования водорода (II) представлялась следующим образом:

Для ее реализации были сформулированы следующие основные задачи работы: 1 — разработать биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий рода С1о$1гкИит, продуцирующих водород в процессе ацетон-бутанол-этанольной 9 ферментации, оптимизировать его состав и условия его функционирования, а также определить основные каталитические характеристики биокатализатора;

2 - определить возможность использования биомассы различных кислород-продуцирующих микроорганизмов для ее конверсии иммобилизованными клетками бактерий рода Clostridium в водород, и отобрать культуры кислород-продуцирующих микроорганизмов, позволяющие накапливать биомассу, подлежащую наиболее эффективной конверсии в целевой продукт;

3 - разработать методы эффективного накопления биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов для их конверсии в водород, а также метод иммобилизации клеток этих микроорганизмов;

4 - определить возможность использования культуральной жидкости, получаемой после стадии применения иммобилизованных клеток рода Clostridium в качестве среды для накопления биомассы клеток кислород-продуцирующих микроорганизмов

5 - установить режим эффективного функционирования биокаталитической системы получения водорода биофотолизом воды из биомассы кислород-продуцирующих микроорганизмов.

1. Варфоломеев С.Д., Ефременко Е.Н., Крылова Л.П. Биотоплива. // Усп. Химии, 2010. Т.79(6). С.544 - 564.

2. Чернова Н.И., Коробкова Т.П., Киеилева C.B. Биомасса как источник энергии // Вестник РАЕН, 2010. T. 1.С.54-60.

3. Demirbas A. Use of algae as biofuel sources // Energ. Convers. Manag., 2010. V. 51. P.2738 2749.

4. Berndes G., Hoogwijk M., van den Broek R. The contribution of biomass in the future global energy supply: a review of 17 studies // Biomass Bioenerg., 2003.V. 25. P. 1 28.

5. Saxena R.C., Adhikari D.K., Goyal H.B. Biomass-based energy fuel through biochemical routes: a review // Renew. Sustain. Energ. Rev., 2009. V. 13. P. 167 178.

6. Mata T.M., Martins A.A., Caetano N.S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review // Renew. Sustain. Energ. Rev., 2010. V. 14. P. 217 232.

7. Цыганков А.А. Получение водорода // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), 2006. Т. 50(6). С. 26 33.

8. Das D., Veziroglu T. N. Advances in biological hydrogen production processes // Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 6046 6057.

9. Melis A, Melnicki M.R. Integrated biological hydrogen production // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 1563- 1573.Ю.Варфоломеев С.Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами / Изд-во Моск. унив-та, 1981. 256 с.

10. Варфоломеев С.Д., Медман Д.Я., Пинчукова Е.Е., Чан Динь Тоай. Биофотолиз воды в сопряженных по метаболитам культурах микроорганизмов // Доклады Академии Наук СССР, 1985. Т. 284(5). С. 1275 1277.

11. Das D., Veziroglu T.N. Advances in biological hydrogen production processes // Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 6046 6057.

12. Lee D.-J., Show K.-Y., Su A. Dark fermentation on biohydrogen production: Pure culture // Bioresour.Technol., 2011. V. 102. P. 8393 8402.

13. Kirtay E. Recent advances in production of hydrogen from biomass // Energ. Convers. Manag., 2011. V. 52. P. 1778- 1789.

14. Winkler M., Hemsehemeier A., Gotor C., Melis A., Happe T. Fe.- hydrogenase in green algae: photo-fermentation and hydrogen evolution under sulfur deprivation // Int. J. Hydrogen Energ., 2002. V. 27. P. 1431 1439.

15. Liu J., Bukutin V.E., Tsygankov A.A. Light energy conversion into H2 by Anabaena variables mutant PK84 dense culture exposed in nitrogen limitations // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 1591 1596.

16. Neil G., Nicholas D.J.D., Bockris J.O.M., McCann J.F. The photosynthetic production of hydrogen // Int. J. Hydrogen Energ., 1976. V. 1. P. 45 48.

17. Ozturk Y., Yucel M., Daldal F., Mandacl S., Gunduz U., Turker L. Hydrogen production by using Rhodobacter capsulatas mutants with genetically modified electron transfer chains // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 1545 1552.

18. Fabiano В., Perego P. Thermodynamic study and optimization of hydrogen production by Enterobacter aerogenes II Int. J. Hydrogen Energ., 2002. V. 27. P. 149-156.

19. Kumar N., Das D. Enhancement of hydrogen production by Enterobacter cloacae IIT-BT 08 // Process. Biochem., 2000. V. 35. P. 589 593.

20. Fang H.H.P., Zhu H., Zhang T. Phototrophic hydrogen production from glucose by pure and co-culture of Clostridium butyricum and Rhodobacter sphaeroides II Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 2223-2230.

21. Benemann J.R. Hydrogen production by microalgae // J. Appl. Phycol., 2000. V. 12. P. 291 -300.

22. Melis A., Happe T. Hydrogen production. Green algae as a source of energy // Plant Physiol., 2001. V. 127. P. 740-748.

23. Цыганков А.А. Получение водорода биологическим путем // Росс. Хим. Журнал, 2007. Т. 50(6). С. 26-33.

24. Laurinavichene T.V., Fedorov A.S., Ghirardi M.L., Seibert M., Tsygankov A.A. Demonstration of sustained hydrogen photoproduction by immobilized, sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii cells // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 659 667.

25. Miyamoto K., Matsuoka S., Miura Y., Negoro N. Immobilized cells of a unicellular green alga and a photosynthetic bacterium for use in a biophotolysis system // Appl. Biochem. Biotechnol., 1992. V. 34/35. P. 459 466.

26. Mahro В., Grimme L.H. H2-photoproduction by green algae: The significance of anaerobic pre-incubation periods and of high light intensities for H2-photoproductivity of Chlorella fusca II Arch. Microbiol., 1982. V. 132. P. 82 86.

27. Tsygankov A.A., Borodin V.B., Rao K.K., Hall D.O. H2 photoproduction by batch culture of Anabaena variabilis ATCC 29413 and its mutant PK84 in a photobioreactor // Biotechnol. Bioeng., 1999. V. 64(6). P. 709 715.

28. Eroglu i., Tabanoglu A., Gundiiz U., Eroglu E., Yiicel M. Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl in a flat plate solar bioreactor // Int. J. of Hydrogen energ., 2008. V. 33(2). P. 531 541.

29. Aoyama K., Uemura I., Miyake J., Asada Y. Photosynthetic bacterial hydrogen production with fermentation products of cyanobacterium Spirulina platensis // BioHydrogen, edited by Zaborsky et al. Plenum Press, New York, 1998. V. 38. P. 305 -309.

30. Ikuta Y., Akano Т., Shioji N., Maeda I. Hydrogen production by photosynthetic microorganisms // BioHydrogen, edited by Zaborsky et al. Plenum Press, New York, 1998. V. 40. P. 319-328.

31. Melis A., Melnicki M.R. Integrated biological hydrogen production // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 1563 1573.

32. Ren Y., Wang J., Liu Z., Ren Y., Li G. Hydrogen production from the monomelic sugars hydrolyzed from hemicellulose by Enterobacter aerogenes II Renew. Energ., 2009. V. 34(12). P. 2774-2779.

33. Kim J.K., Nhat L., Chun Y.N., Kim S.W. Hydrogen production conditions from food waste by dark fermentation with Clostridium beijerinckii KCTC 1785 // Biotechnol. Bioproc. Eng., 2008. V. 13(4). P. 499 504.

34. Jo J.H., Lee D.S., Park D., Park J.M. Biological hydrogen production by immobilized cells of Clostridium tyrobutyricum JM1 isolated from a food waste treatment process // Bioresour. Technol., 2008. V. 99(14). P. 6666 6672.

35. Hsien-Long Chin, Zu-Shia Chen, C. Perry Chou. Fedbatch operation using Clostridium acetobutylicum suspension culture as biocatalyst for enhancing hydrogen production // Biotechnol. Progr., 2003. V. 19. P. 383 -388.

36. Jianlong Wang, Wei Wan Factors influencing fermentative hydrogen production: A review // Int. J. Hydrogen Energ., 2009. V. 34. P. 799 811.

37. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С. Егорова. / М.: Издательство «Высшая школа», 1989. С. 469 472.

38. Brosseau J.D., Zajic J.E. Hydrogen-gas production with Citrobacter intermedins and Clostridium pasteurianum II J. Chem. Tech. Biotechnol., 1982. V. 32. P. 496 502.

39. Chen C., Yang M., Yeh K., Liu C., Chang J. Biohydrogen production using sequential two-stage dark and photo fermentation processes // Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 4755 4762.

40. Kotay S.M., Das D. International biohydrogen as a renewable energy resource — prospects and potentials // J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 258 263.

41. Ni Y., Sun Z. Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium cicetobutylicum in China // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009. V. 83. P. 415-423.

42. Kapdan I.K., Kargi F. Bio-hydrogen production from waste materials // Enzym. Microb. Tech., 2006. V. 38. P. 569 582.

43. Lin P.-Y., Whang L.-M., Wu Y.-R. , Ren W.-J., Hsiao C.-J., Li S.-L., Chang J.-S. Biological hydrogen production of the genus Clostridium', metabolic study and mathematical model simulation // Int. J. Hydrogen Energ., 2007. V. 32. P. 1728 1735.

44. Zhang H., Bruns M.A., Logan B.E. Biological hydrogen production by Clostridium cicetobutylicum in an unsaturated flow reactor// Water Res., 2006. V. 40. P. 728 734.

45. Pan C.-M., Fan Y.-T., Zhao P., Hou H.-W. Fermentative hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii Fanp3 // Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 5383 -5391.

46. Collet C., Adler N., Schwitzgu 1 ebel J.-P., Pleringer P. Hydrogen production by Clostridium thermolacticum during continuous fermentation of lactose // Int. J. Hydrogen Energ., 2004. V. 29. P. 1479 1485.

47. Taguchi F., Mizukami N., Taki T.S., Hasegawa K. Hydrogen production from continuous fermentation of xylose during growth of Clostridium sp. strain No-2 // Can. J. Microbiol., 1995. V. 41(6). P. 536-540.

48. Ferchichi M., Crabbe E., Hintz W., Gil G., Almadidy A. Influence of culture parameters on biological hydrogen production by Clostridium saccharoperbutylacetonicum ATCC 27021 // World J. Microbiol. Biotechnol., 2005. V. 21. P. 855 862.

49. Islam R., Cicek N., Sparling R., Levin D. Effect of substrate loading on hydrogen production during anaerobic fermentation by Clostridium thermocellum 27405 // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006. V. 72. P. 576 583.

50. Wang C.-H., Chang J.-S. Continuous biohydrogen production from starch with granulated mixed bacterial microflora // Energ. Fuel., 2008. V. 22. P. 93 97.

51. Liu G., Shen J. Effects of culture and medium conditions on hydrogen production from starch using anaerobic bacteria // J. Biosci. Bioeng., 2004. V. 98(4). P. 251 256.

52. Lay J.-J. Modeling and optimization of anaerobic digested sludge converting starch to hydrogen // Biotechnol. Bioeng., 2000. V. 68(3). P. 269 278.

53. Yokoi H., Saitsu A., Uchida H., Hirose J., Hayashi S., Takasaki Y. Microbial hydrogen production from sweet potato starch residue // J. Biosci. Bioeng., 2001. V. 91(1). P. 58 -63.

54. Yokoi H., Maki R., Hirose J., Hayashi S. Microbial production of hydrogen from starch-manufacturing wastes // Biomass Bioenerg., 2002. V. 22. P. 389 395.

55. Thang V.H., Kanda K., Kobayashi G. Production of acetone-butanol-ethanol (ABE) in direct fermentation of Cassava by Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 // Appl. Biochem. Biotechnol., 2010. V. 161. P. 157 170.

56. Cappelletti B.M., Reginatto V., Amante E.R., Antonio R.V. Fermentative production of hydrogen from cassava processing wastewater by Clostridium acetobutylicum II Renew. Energ., 2011. V. 36. P. 3367 3372.

57. Saratale G.D., Chen S.-D., Lo Y.-C., Saratale R.G., Chang G.-S.Outlook of biohydrogen production from lignocellulosic feedstock using dark fermentation a review // J. Sci. Ind. Res., 2008. V. 67. P. 962 - 979.

58. Cheng C.-L., Lo Y.-C., Lee K.-S., Lee D.-J., Lin C.-Y., Chang J.-S. Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock // Bioresour. Technol., 2011. V. 102. P. 8514 -8523.

59. Levin D.B., Carere C.R., Cicek N., Sparling R. Challenges for biohydrogen production via direct Iignocellulose fermentation // Int. J. Hydrogen Energ., 2009. V. 34. P. 7390 -7403.

60. Levin D., Islam R., Cicek N., Sparling R., Hydrogen production by Clostridium thermocellum 27405 from cellulosic biomass substrates // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 1496-1503.

61. Magnusson L., Islam R., Sparling R., Levin D., Cicek N. Direct hydrogen production from cellulosic waste materials with a single-step dark fermentation process // Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 5398 5403.

62. Pattra S., Sangyoka S., Boonmee M., Reungsang A. Bio-hydrogen production from the fermentation of sugarcane bagasse hydrolysate by Clostridium butyricum II Int. J. Hydrogen Energ., 2008. V. 33. P. 5256 5265.

63. Han S.-K., Shin H.-S. Biohydrogen production by anaerobic fermentation of food waste // Int. J. Hydrogen Energ., 2004. V. 29. P. 569 577.

64. Ren N.Q., Chua H., Chan S.Y., Tsang Y.F., Wang Y.J., Sin N. Assessing optimal fermentation type for bio-hydrogen production in continuous-flow acidogenic reactors // Bioresour. Technol., 2007. V. 98. P. 1774- 1780.

65. Ren N., Li J., Li В., Wang Y., Liu S. Biohydrogen production from molasses by anaerobic fermentation with a pilot-scale bioreactor system // Int. J. Hydrogen Energ., 2006. V. 31. P. 2147-2157.

66. Калюжный С.В. Биотехнологическое получение водорода: фундаментальные принципы и лимитирующие факторы // Катализ в промышленности, 2006. № 6. С. 33-41.

67. Ефременко Е.Н. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты. //Дисс. д.б.н., Москва, 2009. 433 с.

68. Yang X.-Y., Tian G., Jiang N., Su B.-L. Immobilization technology: a sustainable solution for biofuel cell design // Energ. Environ. Sci., 2012. V. 5. P. 5540 5563.

69. Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments // Enzym. Microb. Tech., 1998. V. 23. P.227 242.

70. Lienhardt J., Schripsema J., Qureshi N., Blaschek H.P. Butanol production by Clostridium beijerinckii BA101 in an immobilized cell biofilm reactor // Appl. Biochem. Biotechnol., 2002. V. 98-100. P. 591 598.

71. Zhang Y., Ma Y., Yang F., Zhang C. Continuous acetone-butanol-ethanol production by corn stalk immobilized cells // J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2009. V. 36. P. 1117 -1121.

72. Huang W., Ramey D.E., Yang S. Continuous production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed bioreactor // Appl. Biochem. Biotechnol., 2004. V. 113-116. P. 887-898.

73. Yokoi H., Maeda Y., Hirose J., Hayashi S., Takasaki Y. Ho production by immobilized cells of Clostridium butyricum on porous glass beads // Biotechnol. Tech., 1997. V. 11(6). P. 431 -433.

74. Zhang Z.-P., Show K.-Y., Tay J.-H., Liang D.T., Lee D.-J. Enhanced continuous biohydrogen production by immobilized anaerobic microflora // Energ. Fuel., 2008. V. 22. P. 87-92.

75. Zhang Z.-P., Show K.-Y., Tay J.-H., Liang D.T., Lee D.-J., Su A. The role of acid incubation in rapid immobilization of hydrogen-producing culture in anaerobic upflow column reactors // Int. J. Hydrogen energ., 2008. V. 33. P. 5151 5160.

76. Karube I., Urano N., Matsunaga T., Suzuki S. Hydrogen production from glucose by immobilized growing cells of Clostridium butyricum II Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1982. V. 16. P. 5 9.

77. Karube I., Suzuki S., Matsunaga T., Kuriyama S. Biochemical energy conversion by immobilized whole cells / Annals New York Academy of Sciences, 1981. P. 91 98.

78. Zhao L., Cao G„ Wang A., Guo W., Liu B., Ren H., Ren N., Ma F. .Enhanced biohydrogen production by immobilized Clostridium sp. T2 on a new biological carrier // Int. J. Hydrogen Energ., 2012. V. 37. P. 161 166.

79. Karube I., Matsunaga T., Tsuru S., Suzuki S. Continuous hydrogen production by immobilized whole cells of Clostridium butyricum II Biochim. Biophys. Acta, 1976. V. 444. P. 338-343.

80. Matsunaga T., Karube I., Suzuki S. Some observations on immobilized hydrogen-producing bacteria: behavior of hydrogen in gel membranes // Biotechnol. Bioeng., 1980. V. 22. P. 2607-2615.

81. Nguyen-Ngoc H., Tran-Minh С. Sol-gel process for vegetal cell encapsulation // Mater. Sci. Eng., 2007. V. 27(4). P. 607 611.

82. Hashimoto S., Furukawa К., Наша H. Immobilization of activated sludge and its treatment capability. // J. Japan Sewege Works Assoc., 1986. V. 23(1). P. 16 22.

83. Ariga O., Takagi H., Nishizawa H. Immobilization of microorganisms with PVA hardened by iterative freezing and thawing. // J. Ferment. Technol., 1987. V. 65(6). P. 651 -658.

84. Lozinsky V.I., Zubov A.L., Titova E.F. Swelling behavior of poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization // Enzym. Microb. Tech., 1996. V. 18. P. 561 -569.

85. Lozinsky V.I. Polymeric cryogels as a new family of macroporous and supermacroporous materials for biotechnological purposes // Russ. Chem. Bull., 2008. V. 57(5). P. 1015 -1032.

86. Kokufuta E., Jinbo E. A hydrogel capable of facilitating polymer diffusion through the gel porosity and its application in enzyme immobilization. // Macromolecules, 1992. V.25(13). P. 3549-3552.

87. Lee S., Cho М.О., Park С.Н., Chung Y., Kim J.H., Sang В., Um Y. Continuous butanol production using suspended and immobilized Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 with Supplementary Butyrate // Energ. Fuel., 2008. V. 22. P. 3459 3464.

88. Bai M.-D., Chao Y.-C., Lin Y.-H., Lu W.-C., Lee H.-T. Immobilized biofilm used as seeding source in batch biohydrogen fermentation // Renew. Energ., 2009. V. 34. P. 1969- 1972.

89. Варфоломеев С.Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами / Изд-во МГУ, 1981.256 с.

90. Maksimova I.V., Bratkovskaya L.B., Plekhanov S.E. Extracellular carbohydrates and polysaccharides of the alga Chlorella pyrenoidosa Chick S-39 // Biol. Bull., 2004. V. 31(2). P. 175-181.

91. Sameera V., Sameera C., Ravi T.Y. Current strategies involved in biofuel production from plants and algae // Microb. Biochem. Tech., 2011. V. 1. P. 1-9.

92. Harun R., Singh M., Forde G.M., Danquah M.K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products // Renew. Sustain. Energ. Rev., 2010. V. 14. P. 1037- 1047.

93. Sialve B., Bernet N., Bernard O. Anaerobic digestion of microalgae as a necessary step to make microalgal biodiesel sustainable // Biotechnol. Adv., 2009. V. 27. P. 409 416.

94. Bertocchi C., Navarini L., Cesaro A., Anastasio M. Polysaccharides from cyanobacteria //Carbohydr. Polymer., 1990. V. 12. P. 127- 153.

95. Takeda H. Classification of Chlorella strains by cell wall sugar composition // Phytochemistry, 1988. V. 27(12). P. 3823 3826.

96. Bailey J.M., Neish A.l. Starch synthesis in Chlorella vulgaris II Can. J. Biochem. Physiol., 1954. V. 32. P. 452 464.

97. Paulsen B.S., Vieira A.A.H. Structure of capsular and extracellular polysaccharides produced by the desmid Spondylosium panduriforme (Chlorophyta) // J. Phycol., 1994. V. 30. P. 638-641.

98. Kiemle S.N., Domozych D.S., Gretz M.R. The extracellular polymeric substances of desmids (Conjugatophyceae, Streptophyta): chemistry, structural analyses and implications in wetland biofilms // Phycologia, 2007. V. 46(6). P. 617 627.

99. Handbook of microalgal culture: biotechnology and applied phycology. Edited by Amos Richmond. / Blackwell Publishing Ltd, 2004. P. 3 19.

100. Brown M.R. The amino-acid and sugar composition of 16 species of microalgae used in mariculture // J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 1991. V. 145. P. 79-99.

101. Mussgnug J.H., Klassen V., Schluter A., Kruse O. Microalgae as substrates for fermentative biogas production in a combined biorefinery concept // J. Biotechnol., 2010. V. 150. P. 51 -56.

102. Forsberg C.W., Donaldson L., Gibbins L.N. Metabolism of rhamnose and other sugars by strains of Clostridium acetobutylicum and other Clostridium species // Can. J. Microbiol., 1987. V. 33. P. 21 26.

103. Lakaniemi A.-M., Hulatt C.J., Thomas D.N., Tuovinen O.H., Puhakka J.A. Biogenic hydrogen and methane production from Chlorella vulgaris and Dunaliella iertiolecta biomass // Biotechnol. Biofliels, 2011. V. 4(34). P. 1 12.

104. Chen R.H., Oswald W.J. Thermochemical treatment for algal fermentation // Environ. Int., 1998. V. 24(8). P. 889 897.

105. Sialve B., Bernet N., Bernard O. Anaerobic digestion of microalgae as a necessary step to make microalgal biodiesel sustainable // Biotechnol. Adv., 2009. V. 27(4). P. 409 -416.

106. Sun J., Yuan X., Shi X., Chu C., Guo R., Kong H. Fermentation of Chlorella sp. for anaerobic bio-hydrogen production: influences of inoculum-substrate ratio, volatile fatty acids and NADH // Bioresour. Technol., 2011. V. 102. P. 10480 10485.

107. Carver S.M., Hulatt C.J., Thomas D.N., Tuovinen O.H. Thermophilic, anaerobic co-digestion of microalgal biomassand cellulose for H2 production // Biodégradation, 2011. V. 22.1. 4. P. 805-814.

108. Yang Z., Guo R., Xu X., Fan X., Luo S. Hydrogen and methane production from lipid-extracted microalgal biomass residues // Int. J. Hydorgen Energ., 2011. V. 36(5). P. 3465 3470.

109. Yun Y.-M., Jung K.-W., Kim D.-H., Oh Y.-K., Shin H.-S. Microalgal biomass as a feedstock for bio-hydrogen production // Int. J. Hydrogen Energ., 2012. DOI: 10.1016/j.ijhydene.2012.02.017.

110. Yang Y., Gao K. Effects of C02 concentrations on the freshwater microalgae, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella pyrenoidosa and Scenedesmus obliquus (Chlorophyta) // J. Appl. Phycol., 2003. V. 15. I. 5. P. 379-389.

111. Liu C.-H., Chang C.-Y., Cheng C.-L., Lee D.-J., Chang J.-S. Fermentative hydrogen production by Clostridium butyricum CGS5 using carbohydrate-rich microalgal biomass as feedstock // Int. J. Hydrogen Energ., 2012. DOI: 10.1016/j.ijhydene.2012.04.076.

112. Prat S. Algarum, hepaticarum, muscorumque in culturis collectio. / Prague, Preslia, 1948. XXII-XXIII. P. 1 -12.

113. Tamiya H., Ywamura T., Shibata K., Hase E., Niliei T. Correlation between photosynthesis and light-independent metabolism in the growth of Chlorella II Biochim. Biophys. Acta, 1953. V. 1. P. 25-40.

114. Abou-Shanab R.A.I., Matter I.A., Kim S.N., Oh Y.K., Choi J., Jeon B.H. Characterization and identification of lipid-producing microalgae species isolated from a freshwater lake // Biomass Bioenerg., 2011. V. 35. P. 3079 3085.

115. Jin J., Yang L., Chan S.M.N., Luana T., Li Y., Tam N.F.Y. Effect of nutrients on the biodégradation of tributyltin (TBT) by alginate immobilized microalga, Chlorella vulgaris, in natural river water// J. Hazard. Mater, 2011. V. 185. P. 1582 1586.

116. Lin K.C., Lee Y.L., Chen C.Y. Metal toxicity to Chlorella pyrenoidosa assessed by a short-term continuous test // J. Hazard. Mater., 2007. V. 142. P. 236 241.

117. Mutlu Y.B., Isik O., Uslu L., Koc K., Durmaz Y. The effects of nitrogen and phosphorus deficiencies and nitrite addition on the lipid content of Chlorella vulgaris (Chlorophyceae) // Afr. J. Biotechnol., 2011. V. 10(3). P. 453 456.

118. Liu Z.Y., Wang G.C, Zhou B.C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris II Bioresour. Technol., 2008. V. 99. P. 4717 4722.

119. Chen C.-Y., Yeh K.-L., Aisyah R., Lee D.-J., Chang J.-S. Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microalgae for biodiesel production: a critical review // Bioresour. Technol., 2011. V. 102. P. 71 81.

120. Heredia-Arroyo T., Wei W., Ruan R., Hu B. Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from non-sugar materials // Biomass bioenerg., 2011. V. 35(5). P. 2245 2253.

121. Liang Y., Sarkany N., Cui Y. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions // Biotechnol. Lett., 2009. V. 31. P. 1043- 1049.

122. Wang L., Min M., Li Y., Chen P., Chen Y., Liu Y., Wang Y., Ruan R. Cultivation of green algae Chlorella sp. in different wastewaters from municipal wastewater treatment plant// Appl. Biochem. Biotechnol., 2010. V. 162. P. 1174- 1186.

123. Пульц О. Плоскостной биореактор закрытого типа для продукции биомассы микроводорослей // Физиология растения, 1994. Т. 41(2). С. 292 298.

124. Qu С.-В., Wu Z.-Y., Shi Х.-М. Phosphate assimilation by Chlorella and adjustment of phosphate concentration in basal medium for its cultivation // Biotechnol. Lett., 2008. V. 30. P. 1735- 1740.

125. Zeng X., Danquah M.K., Chena X.D., Lu Y.Microalgae bioengineering: from ССЬ fixation to biofuel production // Renew. Sustain. Energ. Rev., 2011. V. 15. P. 3252 -3260.

126. Powell E.E., Mapiour M.L., Evitts R.W., Hill G.A. Growth kinetics of Chlorella vulgaris and its use as a cathodic half cell // Bioresour. Technol., 2009. V. 100. P. 269 -274.

127. Lv J.-M., Cheng L.-H., Xu X.-H., Zhang L., Chen H.-L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions // Bioresour. Technol., 2010. V. 101. P. 6797-6804.

128. Sostaric M., Golob J., Bricelj M., Klinar D., Pivec A. Studies on the growth of Chlorella vulgaris in culture media with different carbon sources // Chem. Biochem. Eng. Q., 2009. V. 23(4). P. 471 477.

129. Kumar A., Ergas S., Yuan X., Sahu A., Zhang Q., Dewulf J., Malcata F.X., van Langenhove H. Enhanced ССЬ fixation and biofuel production via microalgae: recent developments and future directions // Trends Biotechnol., 2010. V. 28. P. 371 380.

130. Lee J.-S., Kim D.-K., Lee J.-P., Park S.-H., Koh J.-H., Cho H.S., Kim S.-W. Effects of S02 and NO on growth of Chlorella sp. KR-1 // Bioresour. Technol., 2002. V. 82. P. 1 -4.

131. Douskova I., Doucha J., Livansky K., Machat J., Novak P., Umysova D., Zachleder V., Vitova M. Simultaneous flue gas bioremediation and reduction of microalgal biomass production costs // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009. V. 82. P. 179- 185.

132. Цоглин Jl.H., Габель Б.В., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. Фотобиореакторы закрытого типа для культивирования микроводорослей // Физиология растений, 1996. Т. 43(1). С. 149- 155.

133. Phukan M.M., Chutia R.S., Konwar B.K., Kataki R. Microalgae Chlorella as a potential bio-energy feedstock // Appl. Energ., 2011. V. 88(10). P. 3307 3312.

134. Hogewoning S.W., Douwstra P., Trouwborst G., van Ieperen W., Harbinson J. An artificial solar spectrum substantially alters plant development compared with usual climate room irradiance spectra // J. Exp. Bot., 2010. V. 61(5). P. 1267 1276.

135. Wahal S., Viamajala S. Maximizing algal growth in batch reactors using sequential change in light intensity// Appl. Biochem. Biotechnol., 2010. V. 161. P. 511 522.

136. Barbosa M.J., Janssen M., Ham N., Tramper J., Wijffels R.H. Microalgae cultivation in air-lift reactors: modeling biomass yield and growth rate as a function of mixing frequency// Biotechnol. Bioeng., 2003. V. 82(2). P. 170- 179.

137. Grobbelaar J.U. Microalgal biomass production: challenges and realities // Photosynth. Res., 2010. V. 106. P. 135- 144.

138. Цоглин Jl.H., Акыев А.Я., Шапигузов Ю.М., Клячко-Гурвич Г.Л. Управление химическим составом и газообменом культуры микроводорослей посредством формирования возрастной структуры популяции // Физиология растений, 1995. Т. 42(4). С. 576-581.

139. Цоглин JI.H., Акыев А.Я. СЬ-газообмен и накопление биомассы в клеточном цикле Chlorella IPPAS С-1 в зависимости от содержания СЬ в культуральной среде //Физиология растений, 1994. Т. 41(2). С. 203-208.

140. Michelini Е., Roda A. Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes // Anal. Bioanal. Chem., 2012. V. 402. P. 1785 1797.

141. Kayano H., Matsunaga Т., Karube I., Suzuki S. Hydrogen evolution by co-immobilized Chlorella vulgaris and Clostridium butyricum cells // Biochim. Biophys. Acta, 1981. V. 638. P. 80-85.

142. Song W., Rashid N., Choi W., Lee K. Biohydrogen production by immobilized Chlorella sp. using cycles of oxygenic photosynthesis and anaerobiosis // Bioresour. Technol., 2011. V. 102(18). P. 8676-8681.

143. Ruiz-Marin A., Mendoza-Espinosa L.G., Stephenson T. Growth and nutrient removal in free and immobilized green algae in batch and semi-continuous cultures treating real wastewater// Bioresour. Technol., 2010. V. 101. P. 58-64.

144. Robinson P.K., Dainty A.L., Goulding K.H., Simpkins I., Trevan M.D. Physiology of alginate-immobilized Chlorella II Enzym. Microb. Tech., 1985. V. 7(5). P. 212 216.

145. Megharaj M., Pearson H. W., Venkateswarlu K.Removal of nitrogen and phosphorus by immobilized cells of Chlorella vulgaris and Scenedesmus bijugatus isolated from soil // Enzym. Microb. Technol., 1992. V. 14. P. 656 658.

146. Lau P.S., Tarn N.F.Y., Wong Y.S. Effect of carrageenan immobilization on the physiological activities of Chlorella vulgaris II Bioresour. Technol., 1998. V. 63(2). P. 115-121.

147. Lau P.S., Tarn N.F.Y., Wong Y.S. Wastewater nutrients (N and P) removal by carrageenan and alginate immobilized Chlorella vulgaris И Environ. Tech., 1997. V. 18(9). P. 945-951.

148. Duncan J.R., Brady D., Wilhelmi B. Immobilization of yeast and algal cells for bioremediation of heavy metals // Bioremediation Protocols (Methods in Biotechnology), 1997. V. 2. P. 91-97.

149. Nakajima A., Horikoshi Т., Sakaguchi T. Recovery of uranium by immobilized microorganisms // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1982. V. 16. P. 88 91.

150. Johnson M.B., Wen Z. Development of an attached microalgal growth system for biofuel production // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010. V. 85. P. 525 534.

151. Travieso L., Cañizares R. O., Borja R., Benítez F., Domínguez A. R., Dupeyrón R., Valiente V. Heavy metal removal by microalgae // Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1999. V. 62. P. 144- 151.

152. Trabelsi L., Ben Ouada H., Bacha H., Ghoul M. Combined effect of temperature and light intensity on growth and extracellular polymeric substance production by the cyanobacterium Arthrospira platensis II J. Appl. Phycol., 2009. V. 21. P. 405 -412.

153. Chinnasamy S., Bhatnagar A., Hunt R.W., Das K.C. Microalgae cultivation in a wastewater dominated by carpet mill effluents for biofuel application // Bioresour. Technol., 2010. V. 101(9). P. 3097-3105.

154. Matsumot G.I., Yamada S., Ohtani S., Broady P.A., Nagashima H. Biogeochemical features of hydrocarbons in cultured cyanobacteria and green algae from Antarctica // Proc. NIPR Symp. Polar. Biol., 1996. V. 9. P. 275 282.

155. Otero A., Vincenzini M. Extracellular polysaccharide synthesis by Nostoc strains as affected by N source and light intensity // J. Biotechnol., 2003. V. 102. P. 143 152.

156. Maid U., Steinmuller R., Zetsche K. Structure and expression of plastid-encoded groEL homologous heat-shock gene in a thermophilic unicellular red alga // Curr. Genet., 1992. V. 21(6). P. 521 -525.

157. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С., М.: Изд. МГУ. 1995.224с.

158. Folch J., Lees М., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem., 1957. V. 226(1). P. 497 509.

159. Dawson R.M.C., Elliott D.C., Elliott W.H., Jones K.M. Data for Biochemical Research (Third Edition) / Oxford Science Publications, OUP, Oxford, 1986. ISBN 0-19-8553587.

160. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem., 1956. V. 28(3). P.350 -356.

161. Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Люндовщих И.А., Угарова Н.Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. // Патент РФ на изобретение № 2164241. 2001.

162. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / М.: Изд. Мир. 1978.332с.

163. Практикум по микробиологии. Под ред. А.И. Нетрусова. М: Издательский центр «Академия», 2005. 571с.

164. О. I. Shapovalov, L. A. Ashkinazi. Biobutanol: Biofuel of Second Generation // Russ. J. Appl. Chem., 2008. V. 81(12). P. 2232 2236.

165. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Veremeenko D.V., Lozinsky V.I. New approaches to the production of lactic acid: Biocatalyst on the base of immobilized fungi cells // Chem. Industry, 2004. V. 58. P. 116 117.

166. Stepanov N.A., Efremenko E.N. Perspective heterogeneous biocatalyst for the wine fermentation // Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. Zaikov G.E.) : сб. науч. тр. / Nova Science Publishers Inc. N.-Y., 2006. P.67 - 75.

167. Efremenko E., Senko O., Zubaerova D., Podorozhko E., Lozinsky V. New biocatalyst with multiple enzymatic activities for treatment of complex food wastewater // Food Technol. Biotechnol., 2008. Vol. 46(2). P.208 212.

168. Efremenko E., Lyagin I., Gudkov D., Varfolomeyev S. Immobilized biocatalysts for detoxification of neurotoxic organophosphorous compounds // Biocatal. Biotransfor., 2007. Vol. 25(2-4). P.359 364.

169. Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Усп. Химии, 1998. Т. 67(7). С.641 655.

170. Riley M.R., Muzzio F.J., Reyes S.C. Experimental and modeling studies of diffusion in immobilized cell systems // Appl. Biochem. Biotechnol., 1999. V. 80. P. 151 188.

171. R. Gheshlaghi, J.M. Scharer, M. Moo-Young, C.P. Chou. Metabolic pathways of Clostridia for producing butanol // Biotechnol. Adv., 2009. V. 27. P. 764 781.

172. M.G.N. Hartmanis, T. Klason, S. Gatenbeck. Uptake and activation of acetate and butyrate in Clostridium acetobutylicum II Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984. V. 20. P. 66-71.

173. Dürre P. Handbook on Clostridia / Boca Raton, USA: CRC Press & Taylor and Francis Group, 2005. 920 p. - ISBN 0-8493-1618-9.

174. He G.Q., Kong Q., Ding L.X. Response surface methodology for optimizing the fermentation medium of Clostridium butyricum II Lett. Appl. Microbiol., 2004. V. 39. P. 363-368.

175. Y. Iwata. PIXE application for multi-element analysis of marine micro-algae and measurement of the concentration factor of zinc // J. Radioanal. Nucl. Chem., 2001. V. 249(2). P. 343 348.

176. G. Markou, D. Georgakakis. Cultivation of filamentous cyanobacteria (blue-green algae) in agro-industrial wastes and wastewaters: a review // Appl. Energ., 2011. V. 88. P. 3389-3401.

177. A.H. Scragg, J. Morrison, S.W. Shales. The use of a fuel containing Chlorella vulgaris in a diesel engine // Enzym. Microb. Tech., 2003. V. 33. P. 884 889.

178. K.-L. Yeh, J.-S. Chang. Effects of cultivation conditions and media composition on cell growth and lipid productivity of indigenous microalga Chlorella vulgaris ESP-31 // Bioresour. Technol., 2012. V. 105. P. 120- 127.

179. K.-S. Chang, M.-Z. Lai, T.-C. Chang, Y.-H. Chang, H.-D. Jang. Pretreatment and hydrolysis of cellulosic agricultural wastes with a cellulase-producing Streptomyces for bioethanol production // Biomass Bioenerg., 2011. V. 35(5). P. 1878 1884.

180. F. Yang, M.A Hanna, R. Sun. Value-added uses for crude glycerol a byproduct of biodiesel production // Biotechnol. Biofuels, 2012. V. 5. P. 13 - 23.

181. Moreno-Garrido I. Microalgae immobilization: current techniques and uses // Bioresour. Technol., 2008. V. 99. P. 3949 3964.

182. Mallick N. Biotechnological potential of immobilized algae for wastewater N, P and metal removal: a review // BioMetals, 2002. V. 15. P. 377 390.

183. Zeng X., Danquah M.K., Halim R., Yang S., Chen X.D., Lu Y. Comparative physicochemical analysis of suspended and immobilized cultivation of Chlorella sp. II J. Chem. Technol. Biotechnol., 2012. DOI: 10.1002/jctb.3821.

184. Hameed M.S.A., Ebrahim O.H. Biotechnological potential uses of immobilized algae // Int. J. Agri. Biol., 2007. V. 9(1). P. 183 192.

185. Hameed M.S.A. Continuous removal and recovery of lead by alginate beads, free and alginate-immobilized Chlorella vulgaris //Afr. J. Biotechnol., 2006. V. 5(19). P. 1819 -1823.

186. Chu W.-L., See Y.-C., Phang S.-M. Use of immobilized Chlorella vulgaris for the removal of colour from textile dyes // J. Appl. Phycol., 2009. V. 21. P. 641 648.A