Колоночная жидкостно-адсорбционая хроматография с движением элюента под действием капиллярных сил и детектированием зон аналитов в слое сорбента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ЕВТЮГИНА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

КОЛОНОЧНАЯ ЖИДКОСТНО-АДСОРБЦИОНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ДВИЖЕНИЕМ ЭЛЮЕНТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ КАПИЛЛЯРНЫХ СИЛ И ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ЗОН АНАЛИТОВ В СЛОЕ СОРБЕНТА

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 1 Ш? 2011

Санкт-Петербург - 2011

4840822

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный университет»

Защита состоится «10» марта 2011 г. в 17 часов на заседании совета Д.212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Средний пр. В.О., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета, Университетская наб.,

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Онучак Людмила Артёмовна

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Карцова Людмила Алексеевна

доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич

Ведущая организация

Воронежский государственный университет

7/9.

Автореферат разослан «¿LY»

2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Колоночная и тонкослойная жидкостно-адсорбционная хроматография широко используется в практике аналитической химии. Преимуществами тонкослойной жидкостной хроматографии (ТСХ) по сравнению с колоночной являются простота, экономичность, детектирование на слое сорбента, возможность одновременного анализа нескольких различных образцов и стандартов. Благодаря применению силикагелей с диаметром частиц 5-8 мш для получения высокоэффективных пластин, а также использованию денситометрии для детектирования сорбатов, ТСХ в настоящее время применяется для экологического мониторинга, определения наркотических веществ, продуктов микробиологической промышленности, контроля пищевых продуктов и др. В медицине и фармацевтической промышленности именно ТСХ из всех хроматографических методов наиболее широко используется для стандартизации фармпрепаратов, при контроле подлинности и качества лекарственных препаратов. Вместе с тем необходимо отметить, что тонкослойной хроматографии присущи такие недостатки, как негативное влияние газовой фазы на воспроизводимость характеристик удерживания и размывание зон, относительно большие объемы элюентов, необходимость применения специальных камер. Поэтому совершенствование доступных и экспрессных методов жидкостно-хроматографического определения широкого круга аналитов в различных объектов является актуальной задачей. При этом особое внимание следует уделить миниатюризации хроматографической системы и созданию тест-методов.

Работа поддержана проектом 02.740.11.0650 ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 — 2013 годы.

Цель работы. Разработка и оценка аналитических возможностей колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии, осуществляемой в условиях движения потока элюента под действием капиллярных сил и детектирования аналитов в слое сорбента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методику изготовления наполненных колонок малой длины и малого диаметра, выбрать способы подачи элюента в колонку и детектирования зон сорбатов в слое сорбента.

2. Изучить физико-химические закономерности колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил.

3. Сопоставить характеристики хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и традиционной ТСХ, оценить аналитические возможности и области применения разработанного метода.

4. Предложить схемы анализа действующих веществ (антибиотики, производные нитрофуранов, витамины) в готовых лекарственных

формах, основанные на применении метода колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и денситометрическим детектированием в слое сорбента.

Научная новизна.

Разработан способ осуществления хроматографического процесса в наполненной колонке малой длины и малого диаметра в потоке жидкой фазы, движущемся под действием капиллярных сил, с денситометрическим детектированием зон сорбатов в слое сорбента. Установлены закономерности движения и размывания зон, позволяющие прогнозировать оптимальные условия разделения смесей аналитов путем варьирования длины колонки, скорости капиллярной пропитки, а также геометрического строения сорбента. Теоретически и экспериментально обоснованы преимущества колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил по сравнению с традиционной ТСХ (меньшее время анализа, лучшая воспроизводимость характеристик удерживания, высокое разрешение пиков, малый расход элюента и адсорбента). Выявлены аналитические возможности предлагаемого метода для экспресс-анализа различных объектов и создания хроматографических тест-методов.

Практическая значимость работы.

Показана возможность определения действующих веществ в лекарственных формах с помощью разработанного метода колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с капиллярным поднятием элюента и денситометрическим детектированием зон аналитов в слое сорбента в видимом и УФ диапазонах спектра. Определены оптимальные условия селективного определения антибактериальных производных нитрофурана, антибиотиков групп тетрациклина и цефалоспорина, водорастворимых витаминов группы В.

На защиту выносятся:

1. Способ осуществления хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и денситометрическим детектированием зон сорбатов в слое сорбента.

2. Результаты исследования физико-химических закономерностей пропитки «сухого» сорбента, а также движения и размывания зон сорбатов в колонке с движением элюента под действием капиллярных сил.

3. Обоснование преимуществ предлагаемого способа по сравнению с традиционной ТСХ и оценка аналитических возможностей и области применения разработанного метода.

4. Схемы определения антибактериальных производных нитрофурана, антибиотиков групп тетрациклина и цефалоспорина, водорастворимых витаминов в готовых лекарственных формах, основанные на предложенном варианте колоночной жидкостно-адсорбционной

хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил в его сочетании с денситометрическим детектированием в слое сорбента.

Публикации н апробация работы. Материалы работы опубликованы в 3 статьях и 7 тезисах докладов. Основные материалы диссертации были доложены на 4-й Международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетий» (2007, Тамбов), 32-nd Interactional Symposium on Capillary Cromatography and 5-th GCxGC Symposium (2008, Riva del Garda, Italy), 2-м Международном форуме «Аналитики и аналитика» (2008, Воронеж), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (2009, Самара), Международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (2009, Санкт-Петербург), Всероссийской конференции «Хроматография -народному хозяйству» (2010, Дзержинск).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, в которых описаны результаты экспериментальных и теоретических исследований, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертация изложена na-/V<f страницах машинописного текста, содержит j33 таблицы, рисунков, список использованных источников из •/1^ наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационного исследования, сформулированы цели и задачи работы.

Глава 1 (обзор литературы) состоит из 3 разделов, в которых рассматриваются основные закономерности движения и размывания зон сорбатов в условиях хроматографии в тонком слое, приведены способы организации процесса в современной планарной тонкослойной хроматограф™. Показаны возможности и преимущества применения тонкослойной хроматографии для анализа лекарственных препаратов.

Во 2-й главе представлены характеристики объектов и методов исследования. Для нового способа жидкостно-хроматографического процесса было изготовлено свыше '400 колонок, заполненных сорбентами. В качестве колонок использовали капилляры из плавленого кварца («Phenomenex», США) длиной 5 см и внутренним диаметром dc = 0,53 мм. Геометрические размеры колонки были выбраны так, чтобы уменьшить время анализа и размывание зоны аналита в направлении, перпендикулярном направлению движения подвижной фазы. В качестве сорбента использовали силикагели для ВЭЖХ и ВЭТСХ: Силасорб-600 («Lachema Chemapol», dp = 7,5 мкм), СТХ-1ВЭ (ООО «ИМИД», dp = 8-12 мкм, УФ-254 им), силикагель с привитой фазой Сз («Манометр», dp = 8 - 12 мкм). В работе использовали также два типа стандартных пластин для ТСХ: пластины для нормально-фазовой Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ (тип сорбента - силикагель СТХ-1ВЭ), изготовленные ООО «ИМИД» (г. Краснодар), а также пластины для обращено-фазовой

хроматографии «Плазмахром» (силикагель с привитой фазой Сз), изготовленные фирмой «Манометр» (г. Санкт-Петербург).

Предлагаемый способ осуществления хроматографического процесса близок по своей сути не только ТСХ (движение элюента под действием капиллярных сил), но и колоночной жидкостной хроматографии, поэтому в нашей работе были изучены три варианта осуществления хроматографического процесса: восходящая колоночная ЖАХ с капиллярным поднятием элюента (вариант I), восходящая колоночная ЖАХ с использованием источника повышенного давления (АР = 0,58 атм) на входе в колонку (вариант II) и нисходящая колоночная ЖАХ с источником повышенного давления (АР = 0,95 атм), рис. 1.

В восходящей колоночной ЖАХ (вариант I) заполненную сорбентом капиллярную колонку вертикально погружали одним концом в элюент (на 1-2 мм). Движение элюента происходит, как и в ТСХ, под действием капиллярных сил. В варианте II восходящий поток элюента ускорялся под действием источника повышенного давления (уравнительной емкости). Емкость с элюентом и нижний конец вертикально расположенной колонки соединялись капилляром меньшего диаметра (0,3 мм). Емкость находилась на 1 см выше входа колонки. В нисходящей колоночной ЖАХ в качестве источника повышенного давления использовали поршневой микронасос.

1.

Поршень

1_4

и

Вариант I Вариант II Вариант III

Рис. 1. Схематическое изображение трех вариантов колоночной ЖАХ: 1 -капилляр с сорбентом, 2 - емкость с элюентом, 3 - уравнительная емкость с элюентом, 4 - поршневой микронасос, 5 - полимерная трубка.

Эксперименты в условиях колоночной ЖАХ и ТСХ проводили без предварительного насыщения сорбента парами элюента, за исключением ТСХ антибиотиков группы тетрациклина.

Пробы объемом 1 мкл вносили в начальную часть капиллярной колонки с помощью микрошприца. Визуально определяли расстояния, на которые распространились фронтальная зона элюента (а), и центральная часть зоны аналита (Ь). Текущие и конечные значения фактора задержки Л/ =Ь/а определяли непосредственно в ходе эксперимента и сразу после его окончания.

Так как материал стенок колонки прозрачен для видимого и УФ- света, то в качестве метода инструментального детектирования зон сорбатов был выбран

метод денситометрии, который позволяет проводить определение аналитов непосредственно в стационарной фазе, что обеспечивает повышение чувствительности. Для получения изображений зон аналитов вместо серийных денситометров использовали планшетный сканер Epson Perfection 1260 (Китай), а также использовали съемку цифровой камерой Sony (Япония) как в видимом, так и УФ диапазонах. Обработку полученных изображений проводили с использованием программного комплекса Sorbfil Videodcnsitometr TLC Quantitative Evalution (Ver. 1.7.) (г. Краснодар). Программа производит расчет изображения пластины (или колонки с сорбентом) с построением аналоговой кривой (хроматограммы) по отклонению яркости пятен от яркости фона пластины (колонки). При расчете предполагается, что размеры и яркость пятна по отношению к фону пластины (колонки) определяются количеством вещества в пятне. Для определения эффективности с помощью программного комплекса получали величину N' - число теоретических тарелок, определенное для расстояния Ь, пройденного пятном конкретного вещества. Наблюдаемую высоту, эквивалентную теоретической тарелке, (ВЭТТ, Н) для каждого исследуемого вещества рассчитывали по формуле: Н = Ы N'.

Выбор синтетических красителей в качестве объектов исследования обусловлен возможностью визуального наблюдения за движением их зон в колонке. В качестве реальных объектов были использованы готовые лекарственные формы (антибиотики групп тетрациклина и цефалоспорина, антибактериальные производные нитрофурана, водорастворимых витамины группы В).

Глава 3 посвящена изучению физико-химических закономерностей колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии в потоке элюента, движущемся под действием капиллярных сил.

Движение элюента в колонке, заполненной сорбентом, происходит под действием капиллярных сил (вариант 1). Частицы сорбента содержат внутренние поры. Внешняя пористость обеспечивается макропорами, представляющими собой пространство между упакованными частицами. При погружении колонки с «сухим» сорбентом в смачивающую жидкость начинает идти процесс капиллярной пропитки.

Рассмотрим простейшую модель пористого тела, которая включает систему транспортных пор — цилиндрических капилляров радиусом гЭфф, расположенных параллельно оси вертикально расположенной колонки. Фронт пропитки в момент времени i имеет координату а = a(t). Процесс пропитки для

одного капилляра радиусом г3фф подчиняется уравнению Пуазейля:

<■ \ 2acosG . , --Арgh

da _ г,фф dt 8r]a

(1)

где г] и а - вязкость и поверхностное натяжение жидкости, 0- угол смачивания, Др - разность плотностей жидкой и газовой фаз, g - ускорение свободного падения.

Так как для экспериментов использовали колонки малой длины, то пренебрегая влиянием силы тяжести на скорость перемещения мениска жидкости, получим:

1

Л 4т| а

Из уравнения (2) следует, что перемещение мениска от времени / определяется параболической зависимостью:

--г = (3)

2ц

где

/•,, .стсозб

к = _ОФ-. (4)

Экспериментально установлено, что распространение элюента (этанол) в колонке с кремнеземным сорбентом происходит по параболическому закону (рис. 2, линии 1 и 3). Аналогичная закономерность наблюдается и при распространении этанола по пластине в ТСХ (рис. 2, линия 2). Соответственно скорость движения элюента обратно пропорциональна пути миграции (рис. 2).

емг

40 ЗЬ 30 25 20 15 10 5

[аз /А}х ю-',

см/с

с

0

/

¿г

1000 2000 3000 4000 5000

Рис. 2. Зависимости квадрата расстояний а, пройденных элюентом (этанол), от продолжительности эксперимента I и скорости капиллярной пропитки ¿а/с1/ от расстояния а: 1 и 3 - колонки с сорбентом Силасорб-600 и СТХ-1ВЭ, соответственно; 2 - пластина для ТСХ с сорбентом СТХ-1ВЭ.

Из анализа представленных рисунков видно, что скорость капиллярной пропитки резко падает с увеличением расстояния а. При использовании одного и того же сорбента (СТХ-1ВЭ) скорость пропитки по пластине выше, чем в колонке, что связано с частичным насыщением открытого слоя сорбента парами элюента в ходе проведения эксперимента в камере.

В таблице 1 представлены экспериментальные значения величины к и рассчитанные на ее основе по уравнению 4 эффективные радиусы (гЭфф) цилиндрических пор, эквивалентных, сложным по своему геометрическому строению, транспортным порам.

Таблица 1.

Значения постоянной к и эффективных радиусов г3фф цилиндрических пор

Условия пропитки Сорбент Радиус зерен R, мкм К см /с Уэ фф> мкм 0,155-Д, мкм 0,73-R, мкм

Колонка Силасорб-600 3,75 12,08-10"3 0,13 0,58 2,74

Колонка СТХ-1ВЭ 4-6 7,82-103 0,10 0,62-0,93 2,92 - 4,38

Пластина СТХ-1ВЭ 4-6 9,17-10° 0,08 0,62 - 0,93 2,92-4,38

о = 22,8 дин/см, л = 1,2-10'2(дин-с)/см\ 9 = 0.

Рассмотренные значения эффективных радиусов пор для исследованных сорбентов оказались малы (-0,1 мкм) по сравнению с радиусом пор в межчастичном пространстве (0,155 К ^ 0,73 К). Следовательно, внутренняя пористость частиц вносит большой вклад в процесс капиллярной пропитки. Найденные значения гзфф (~0,1 мкм) соответствуют капиллярно-пористому телу, к которым относятся большинство кремнеземных сорбентов.

Наряду с описанным выше процессом пропитки под действием капиллярных сил (вариант II), были получены кинетические зависимости процесса пропитки в условиях, когда поток элюента ускоряется под действием дополнительного (к капиллярному) давления АР в условиях восходящего (вариант И) и нисходящего (вариант III) потоков, рис. 3.

14

Рис. 3. Зависимости квадрата расстояния а , пройденного элюентом (этанол) от продолжительности эксперимента t: 1 - восходящий поток (вариант I), 2 -восходящий поток с использованием повышенного давления ДР = 0,58 anuí (варинат И), 3 - нисходящий поток с использованием повышенного давления АР = 0,95 апш (вариант III); сорбент СТХ-1ВЭ.

Кинетические зависимости пропитки описываются уравнениями: вариант I - а2 = 7,82-10"3/ (ДЧ),992), вариант II - а2 = 9,98-10"3/ (R2=0,976), вариант III - а2 = 11,43-10°/ (Я2=0,988).

Так как приложенное дополнительное давление АР мало по сравнению с капиллярным давлением (Р = 2асо5В/г1фф = 4,51 атм), то параболический

закон а2 =Ш, сохраняется и для вариантов II и III. На основании экспериментальных кривых пропитки были рассчитаны линейные скорости процесса при / = 5, 20 и 40 мин. Эти данные представлены в таблице 2. Из представленных в таблице данных видно, что скорость пропитки на 20-ой минуте падает в 2 раза, а на 40-ой - почти в 3 раза.

Таблица 2.

Линейная скорость процесса <Ддг/с1/ (см/с) при различных временах пропитки

Колонка Пластина (ТСХ)

Вариант I Вариант II Вариант III

1, мин а, см da , —, см/с dt t, мин а, см da , —, см/с dt t, мин а, см — , см/с dt t. мин а, см da —, см/с dt

5 1,53 2,55-10"3 5 1,73 2,88 ТО"3 5 1,85 3,09-10"3 5 1,66 2,76-10"3

20 3,06 1,2710"3 20 3,46 1,44-10"3 20 3,70 1,54-10'3 20 3,32 1,38-10"3

- - - - - - - - - 40 4,69 0,97-10"3

Физико-химические закономерности движения и размывания зон в зависимости от способа подачи подвижной фазы изучены на примере синтепиеских красителей:

(CjH^N

.COONa

N'tCjH^Cf

.N «CjHJJCI

Флуоресцеин натрия

Родамин С

нз о

Родамин S

Эритрозин

SOjC!

Лиссамин родамин В сульфонил хлорид

Бриллиантовый зеленый

На рис. 4 сопоставлены типичные зависимости a{t) и b{t), полученные в условиях восходящей колоночной ЖАХ и ТСХ для родамина S.

Так как длина слоя сорбента в колонке меньше, чем на пластине, то конечные значения Щ аналитов в колоночной ЖАХ устанавливаются за более короткий промежуток времени, чем в ТСХ, рис. 5.

Теоретическое описание хроматографического процесса для ТСХ («сухой» сорбент) в условиях постоянно уменьшающейся скорости процесса дано Беленьким Б.Г. и Виленчиком Л.З. [1]. Дифференциальное уравнение конвективно-диффузионного переноса содержит слагаемое, учитывающее

поперечную дисперсию (рэффу). Для стандартного отклонения вдоль оси х, совпадающей с направлением распространения элюента, получено:

а = 2Я,

А^О+О-Л/^КОЛ

Р <о

(5)

или для небольшого участка слоя сорбента, в котором скорость элюента а/ постоянна:

А,

1

„ +-(1 -ЯМ)

М рч /' /

(6)

где = л[ьН , 1/(3 - характеристическое время сорбции.

Из уравнений (5) и (6) следует, что при небольшой скорости пропитки а/, когда основной вклад в размывание связан с продольной диффузией в подвижной фазе, уменьшение продолжительности анализа / приводит к меньшему размыванию зоны. В этих условиях концентрация в центре зоны максимальна, что приводит к повышению чувствительности анализа. Есть основание полагать, что именно этот фактор обусловливает более низкие значения Н (ВЭТТ) в колоночной ЖАХ по сравнению с ТСХ (таблица 3).

а) б)

Рис. 4. Зависимости расстояний а (кривые 1) и Ъ (кривые 2), пройденных элюентом (этанол) и родамином Б, от времени V. а - восходящая колоночная ЖАХ (вариант I), б - восходящая ТСХ (сорбент СТХ-1ВЭ).

р.-025

££3

0,! 5

саз

(ШЗ Щ»

Е."

(Ш-

о;о ■

0Д5 ■ 0,10' 0£5 ' с>,00-

60 ю

1!1ИН

а)

Рис. 5. Зависимости величины Я,

б)

^ родамина ь от продолжительности

эксперимента V. а - колоночная ЖАХ (вариант I), б - ТСХ (сорбент СТХ-1ВЭ, этанол).

Таблица 3.

Хроматографические характеристики красителей при их разделении на

сорбенте СТХ-1ВЭ (концентрация красителей 0,004 мг/мл, элюент - этанол)

Сорбаты Колоночная ЖАХ ТСХ

Вариант I Вариант II Вариант III

t = 20 мин L=3,l см t = 16 MUll L=3,5 см t = 13 мин L=3,0 см t = 65 мин L=6,5 см

щ н, мкм N' Rf Н, мкм N' Rf н, мкм N' Rf Я, мкм N'

Бриллиантовый зеленый 0,08 16 225 0,06 65 42 0,06 80 34 0,08 30 213

Родамин С 0,42 9 2100 0,48 31 697 0,35 40 394 0,49 12 3266

Эритрозин 0,95 14 3053 0,98 28 1575 0,99 66 675 0,94 15 5013

При увеличении давления на входе в колонку (варианты II и III) и, соответственно, скорости элюента а{ возрастает вклад в величину а] второго

слагаемого, обусловленного сопротивлением массопередаче, что приводит к увеличению размывания зон.

Таким образом, уменьшение длины сорбционного слоя и «естественное» движение элюента под действием капиллярных сил (вариант I) обеспечивают меньшее размывание зон сорбатов.

В главе 4 представлены результаты исследования аналитических возможностей метода колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил.

Экспериментальные исследования включали в себя определение воспроизводимости величин факторов задержки R, определение разрешения

пиков Rs при малой длине сорбционного слоя, возможность количественного определения аналита с использованием денситометрии как метода детектирования зон сорбата в слое сорбента и метрологическую оценку полученных результатов.

В таблице 4 сопоставлены конечные значения Rf для исследованных

красителей, полученные в колоночной ЖАХ (варианты I - III) и ТСХ. Наиболее близки друг к другу величины Rf, полученные методом восходящей ТСХ и

восходящей колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил (вариант I). Величины Rf, полученные методами колоночной

ЖАХ с принудительной подачей элюента (варианты II и III) для сорбирующихся веществ, как правило, меньше, чем полученные с помощью ТСХ и колоночной ЖАХ (вариант I).

Как видно из таблицы 4, погрешность определения Rf при использовании

колоночной ЖАХ меньше, чем в ТСХ, что, по-видимому, обусловлено отсутствием влияния неконтролируемого состава газовой фазы в камере на хроматографический процесс.

Таблица 4.

Величины фактора задержки Я/ красителей, полученных в ТСХ и колоночной ЖАХ с сорбентом СТХ-1ВЭ при различных способах подачи

Аналит Способ хроматографирования

Колоночная ЖАХ ТСХ

Вариант I Вариант II Вариант III

Бриллиантовый зелень»": 0,08±0,01 0,06±0,02 0,05±0,01 0,08±0,03

Родамин 8 0,20±0,01 0,18±0,02 0,20±0,02 0,19±0,03

Родамин С 0,42±0,02 0,45±0,03 0,40±0,02 0,48±0,03

Лиссамин Родамин В 0,90±0,02 0,75±0,02 0,69±0,02 0,89±0,03

Эритрозин 0,95±0,01 0,99±0,01 0,99±0,01 0,94±0,03

Флуоресцеин натрия 0,99±0,01 0,99±0,01 0,99±0,01 0,99±0,01

Колоночную ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил и ТСХ сопоставляли по способности к разделению смеси красителей (бриллиантовый зеленый, родамин С, эритрозин).

Хроматограммы красителей, полученные с помощью восходящей колоночной ЖАХ (вариант I) и ТСХ представлены на рис. 6.

Рис.6. Хроматограммы красителей: а - колоночная ЖАХ (вариант I), б - ТСХ; 1 - бриллиантовый зеленый, 2 - родамин С, 3 - эритрозин.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что в колоночной ЖАХ размывание зон аналитов меньше, чем в ТСХ. Однако, в связи с тем, что длина разделяющего слоя в первом случае почти в два раза меньше, чем во втором, то важно было сравнить не только Я, но и разрешение пиков /?,.. В таблице 5 представлены значения этой величины для восходящей колоночной ЖАХ (длина пути элюента Ь=3,1 см) и ТСХ (длина пути элюента Ь=6,5 см). Из данных, представленных в таблице 5, видно, что разрешение пиков красителей Лд в колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил выше (в 1,1 - 1,2 раза), чем в ТСХ, что очевидно связано с меньшим значением величины Н.

Таблица 5.

Разрешение пиков красителей Я5 (сорбент СТХ-1ВЭ, элюент этанол)

Разделяемые аналиты я,

Колоночная ЖАХ ТСХ

Родамин С / бриллиантовый зеленьц 4,1 3,8

Эритрозин / родамин С 7,4 6,1

Количественное определение красителей проводили методом абсолютной градуировки в интервале концентраций 0,002 - 0,01 мг/ мл в условиях восходящей колоночной ЖАХ (вариант I) и ТСХ с денситометрическим детектированием в слое сорбента. В таблице 6 представлены уравнения градуировочных графиков для одного из красителей (родамина С).

Таблица 6.

Уравнения градуировочных графиков для родамина С_

Сорбат Условия хроматогра-фирования Сорбент Уравнение градуировочного графика 8 (у.е.) = Ь С(мг/мл)+а

Уравнение Я2 Смин.э мкг/ мл

Родамин С Колоночная ЖАХ СТХ-1 ВЭ у=10'(2146-х-4) 0,9318 0,4

Силасорб - 600 у=103(3 8 83-х - 12) 0,9633 0,4

ТСХ СТХ-1 ВЭ у=103(1958-х + 8) 0,9945 0,4

В диапазоне исследуемых концентраций наблюдается

удовлетворительная линейная зависимость «количество вещества -денситометрический сигнал» с коэффициентом корреляции К2 > 0,93.

Метрологические характеристики количественного определения красителя с помощью колоночной ЖАХ оценивали путем определения его концентрации в контрольном растворе с известной концентрацией («введено -найдено»). Результаты статистических расчетов приведены в таблице 7.

Таблица 7.

Статистическая обработка результатов определения родамина С (Р=0,95; п=5)

Условия хроматографи-рования Сорбент Введено г ^ист, мкг/ МЛ Найдено

С » мкг/ МЛ 5 Ш\п) л, мкг/ МЛ е, %

Колоночная ЖАХ СТХ-1ВЭ 6,0 6,2 0,00023 5,33-10"8 1,94 0,6 9,24

Силасорб-600 6,0 5,8 0,00026 2,77-Ю"8 1,72 0,4 7,05

Планерная ТСХ СТХ-1ВЭ 6,0 6,1 0,00011 1,33-Ю"8 2,03 0,3 4,77

Данные, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что относительная погрешность результатов определения красителя родамина С с помощью колоночной ЖАХ £ < 10 %, что не превышает величины относительной погрешности для традиционной ТСХ. Предел обнаружения красителей составил 0,2 л/кг, что находится на уровне предела обнаружения исследуемых красителей методом ТСХ.

Проведенная сравнительная оценка возможностей ТСХ и колоночной ЖАХ показала, что последнюю можно использовать для определения действующих веществ в готовых лекарственных формах вследствие большей воспроизводимости определения фактора задержки Я/, экспрессности, миниатюризации хроматографической системы и простоты выполнения эксперимента.

Глава 5 посвящена исследованию практического применения метода колоночной жидкостно-адсорбциониой хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил для определения лекарственных веществ в готовых лекарственных формах.

Определение лекарственных веществ проводили в условиях восходящей колоночной ЖАХ без источника повышенного давления на входе в капилляр, так как именно при таком способе проведения хроматографического процесса наблюдались наименьшее размывание зон аналитов и минимальные погрешности качественного и количественного определения аналитов. Для реализации предложенного варианта колоночной ЖАХ использовали сорбенты для нормально-фазовой и обращено-фазовой хроматографии для ТСХ (СТХ-1ВЭ, силикагель с привитой фазой Сз). Подбор элюента для определения лекарственных веществ проводили экспериментально с использованием общих представлений жидкостной хроматографии, а также использовали элюенты, предложенные ранее для анализа в условиях ТСХ. Детектирование проводили в видимой и УФ- области спектра методом денситометрии, обеспечивающем определение окрашенных и бесцветных аналитов непосредственно в слое сорбента.

Определение антибактериальных производных шггрофурана.

В медицинской практике и ветеринарии для лечения бактериальных и некоторых протозойных инфекций применяются производные 5-нитрофурана:

Фурагин (РигалсПп) ц=4,77 О

Фурадонин (ШгойнаШот) ц=5,45£>

Фуразолидон (РигагоМоп) ц=7,73 О

о

}-т2

о

ж

о.

к 2 II о

^^ он

Нифуроксазид (№И1гохаг1с1е) ц=6,87

Фурацилин (№й:о&га1ит) ц=4,23 О

Подбор элюенха для селективного определения указанных сильно полярных органических соединений (дипольный момент ц молекул лежит в пределах от 4,23 до 7,73 И) на полярном сорбенте СТХ-1ВЭ осуществляли с использованием элюотропного ряда растворителей для нормально-фазовой жидкостной хроматографии. Использовали бинарный элюент хлороформ -ацетонитрил. Зависимости Rf нитрофуранов от объемной доли ф хлороформа приведены на рис.7.

С увеличением содержания хлороформа в элюенте величины Щ нитрофуранов закономерно уменьшаются. Установлено, что оптимальным элюентом для разделения препаратов группы нитрофурана является бинарная смесь хлороформ - ацетонитрил состава 1:1 (по объему). В таблице 8 представлены значения величин фактора задержки Я/ , полученных в восходящей колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил и ТСХ.

ъ

Рис. 7. Зависимости фактора задержки Я/ производных нитрофурана от состава элюента: 1 - фурацилин, 2 -фурагин, 3 - фурадонин, 4 -нифуроксазид, 5 - фуразолидон (ТСХ на пластинах БотЬП! ПТСХ-АФ-В-УФ).

О 0.1 Ц2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

'еюз

Таблица 8.

Величины Л/производных нитрофурана (сорбент СТХ-1ВЭ, элюент _ацетонитрил - хлороформ состава 1:1 по объему)_

Сорбат Колоночная ЖАХ ТСХ

я, + дл, £,%

Фурацилин 0,32±0,07 21,1 0,30±0,11 36,6

Фурагин 0,40±0,05 12,5 0,46±0,09 19,6

Фурадонин 0,52±0,05 9,6 0,67±0,09 13,4

Нифуроксазид 0,60±0,04 6,7 0,75±0,07 9,3

Фуразолидон 0,89±0,05 5,6 0,79±0,05 6,3

При использовании элюента данного состава имеет место увеличение Я/с ростом дипольного момента ц молекул этой группы лекарственных препаратов. Предел обнаружения нитрофуранов в колоночной ЖАХ составил 0,002 мг/мл.

Определение антибиотиков группы тетрациклина. Антибиотики группы тетрациклина широко применяются в медицине и ветеринарии:

н.Ск -сн, ой N

Тетрациклин (ТейасусНпе) ¡1=6,150

5 -Гидрокситетрациклин (5-Нус1гохуге1гасус1те) ц=6,45Г>

Доксиииклин (ОохусусПпс) ц=11,78 0

Для определения их подлинности используют спектрометрические методы анализа, поляриметрию и ТСХ.

В работе использовали стандартные условия для идентификации тетрациклинов в ТСХ [2]: пластины для обращенно-фазовой ТСХ (сорбент с привитой фазой Сз), элюент — 0,5 М раствор щавелевой кислоты, метанол, ацетонитрил состава 6:2:2 по объему. Хроматографированис проводили в восходящем потоке в камере, насыщенной парами элюента. В случае колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил использовали «сухой» сорбент. Из приведенных в таблице 9 данных видно, что значения Яг для тетрациклинов находятся в интервале от 0,48 до 0,62 в случае

планарной ТСХ и от 0,53 до 0,78 для колоночной ЖАХ.

Таблица 9.

Величины Я, и II, тетрациклинов, полученные с использованием ТСХ в камере с насыщением парами элюента и колоночной ЖАХ без насыщения сорбента

Аналит Колоночная ЖАХ ТСХ

Я/±АЯ/ Н, мкм е, % ЯГ±АЯ/ Н, мкм с, %

Тетрациклин 0,53±0,04 25 7,5 0,48±0,04 150 8,3

Доксициклин 0,65±0,03 13 4,8 0,51 ±0,03 109 5,9

Окситетрациклин 0,78±0,03 8 3,8 0,62±0,04 71 6,5

Различие в величинах тетрациклинов в обоих вариантах, очевидно,

связано с различной степенью насыщения сорбента парами элюента при осуществлении хромагографическпх процессов [3]. Необходимо отметить, что величина АЯтах (разница между большим и наименьшим значением Я/)

заметно выше при проведении разделения в условиях ЖАХ (0,25), чем в ТСХ с насыщением сорбента (0,14). Относительная погрешность определения величин в колоночной ЖАХ меньше, чем в ТСХ. Предел обнаружения тетрациклинов в колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил составил 0,002 мг/мл.

Определение антибиотиков группы цефапоспорина. Бесцветные антибиотики группы цефалоспорина, в основе строения которых лежат 7-аминоцефалоспориновая и 7-амино-дезцетоксицефалоспорановая кислоты, в настоящее время широко используются в медицине:

о

<ч

Цефоперазон (Cefoperazone)

Цефтриаксон (Ceftriaxone)

и г

>v

О

Дефазолин (Cefazolin)

0 " -5HjO

Цефтазидим (Ceftazidime)

Для исследования использовали 1 %-ные растворы цефалоспоринов, полученные растворением лекарственных форм (порошок) в 0,9 %-ном растворе ИаС1. Методом ТСХ с использованием пластин 8огЪй1 ПТСХ-АФ-В-УФ удалось достигнуть приемлемого селективного определения этих антибиотиков с использованием трех элюирующих систем (таблица 10), подобранных на основе элюотропных рядов и растворимости цефалоспоринов в полученных многокомпонентных системах. Детектирование зон цефалоспоринов проводили в УФ свете (Х=254 нм).

Из данных, представленных в таблице 9, видно, что применение элюентов 1 и 3 обеспечивает специфичность определения трех цефалоспоринов, но элюент 3 позволяет получить величины Яг в интервале 0,45 - 0,71, что является предпочтительным для практического применения.

Таблица 10.

Величины Rf антибиотиков группы цефалоспорина (п=5; Р=0,95)

Аналит Состав элюента

1 2 3

Этанол - 0,9 %-ый раствор NaCl (1:1; об.) Этанол - этилацетат - 0,9%-ный раствор NaCl - ледяная уксусная кислота (12:6:0,5:2; об.) 0,9 %-ый раствор NaCl - NH4OH (9,97:0.03; об.)

тех Колоночная ЖАХ тех Колоночная ЖАХ тех Колоночная ЖАХ

Цефазолин 0,90±0,03 0,95±0,03 0,71±0,03 0,83±0,01 0,71±0.0 0,73±0,03

Цефоперазон 0,87±0,02 0,92±0,02 0,64±0,02 0,75±0,02 0,56±0,0 0,60±0,01

Цефтазидим 0,63±0,02 0,51 ±0,01 0,05±0,02 0,08±0,01 0,45±0,0 0,45±0,02

Цефтриаксон 0,77±0,02 0,80±0.02 0 0 0,69±0,0 0,75±0,02

Использование элюента 2 позволяет разделить те пары цефалоспоринов, которые имеют близкие значения Rf в элюентах 1 и 3. Предел обнаружения

действующих веществ составил 0,005 г/мл.

Определение водорастворимых витаминов. Нами была проведена оценка возможности применения колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил для определения некоторых водорастворимых витаминов (Bi, В2, В3, В6, Bi2). Детектирование зон витаминов проводили в УФ-свете (а=254 им) и в видимом диапазоне спектра (витамин Вп). Использовали как стандартный элюент состава бутанол-1 - хлороформ - метанол - уксусная кислота состава 16:3:4:1:5 по объему [2], так и предложенный в настоящей работе: ацетонитрил - 1%-ный водный раствор H2SO4 состава 4:1 по объему. В таблице 11 представлены значения R; исследованных витаминов, полученные

с использованием обоих элюентов.

Таблица 11.

Величины Rf водорастворимых витаминов группы В_

Аналит Состав элюента

Ацетонитрил -1%-ный водный раствор H2S04 (4:1; об.) Бутанол - хлороформ -метанол - уксусная кислота -вода (16:3:4:1:5; об.)

Колоночная ЖАХ тех Колоночная ЖАХ тех

Витамин В] 0,23±0,02 0,21±0,03 0,18±0,02 0,21 ±0,04

Витамин В2 0,76±0,02 0,79±0,04 0,46±0,03 0,58±0,03

Витамш В3 0,90±0,01 0,95±0,02 0,50±0,01 0,63±0,05

Витамин В6 0,62±0,02 0,57±0,03 0,52±0,02 0,64±0,04

Витамин В12 0,10±0,02 0,09±0,04 0,07±0,02 0,21±0,02

Предел обнаружения (ПО) = 0,05 мг/мл

Как и в вышеописанных случаях, величины удерживания в колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с капиллярным поднятием элюента и в ТСХ близки друг к другу и порядок их не изменился, что связано с одинаковой природой взаимодействий «сорбент-сорбат». Использование предложенного в нашей работе состава элюента позволяет провести одновременное определение некоторых витаминов группы В с помощью предложенного способа колоночной ЖАХ, использование же известного состава элюента привело к перекрыванию зон некоторых витаминов (Вэ и В6) как в колонке, так и на пластине. К тому же воспроизводимость результатов определения фактора задержки Я/ исследуемых витаминов оказалась выше в колоночной ЖАХ по сравнению с ТСХ при использовании каждого их двух элюентов.

На примере витамина В12 с использованием ГСО была изучена возможность количественного определения данного витамина в диапазоне концентраций 0,1 - 0,5 л/г/ мл. В таблице 12 представлены уравнения градуировочных графиков для количественного определения витамина В12 в условиях колоночной ЖАХ и ТСХ.

Таблица 12

Уравнения градуировочных графиков для витамина В!2

Сорбат Вариант хроматографирования Уравнение градуировочного графика Б (у.е.) = Ь-С(мг/мл)+а

Уравнение Я См„н., мг/мл

Витамин Вп Колоночная ЖАХ у=103(71-х-2) 0,9506 0,02

ТСХ у=103(65-х-5) 0,9703 0,02

Как и при анализе красителей, коэффициент корреляции {К1) выше в случае данных, полученных в условиях ТСХ.

Для оценки правильности измерения использовали способ «введено-найдено». Полученный результат («найдено», С) сравнивали с заданным содержанием («введено», С„с,„). В таблице 13 представлены результаты количественного определения витамина В12 в пробе методом ТСХ и колоночной ЖАХ.

Таблица 13

Статистическая обработка результатов определения витамина В12 с использованием ТСХ и колоночной ЖАХ с движением элюента под действием

капиллярных сип (Р= 0,95, П]=П2 = 5)

Условия хроматографирования Введено, мг/мл с Найдено, мг/мл

С Б д Е,% 1(Р,п)

Колоночная ЖАХ 0,200 0,185 0,0057 3,2-10"5 0,018 9,60 2,06

ТСХ 0,200 0,193 0,0050 2,5-10"5 0,017 8,86 1,97

Данные, представленные в таблице 13, свидетельствуют о том, что относительные погрешности количественного определения витамина В12 в колоночной ЖАХ с движением элюента под действием капиллярных сил и ТСХ практически совпадают и не превышают 10 %. Таким образом, возможно применение колоночной ЖАХ для обнаружения и определения содержания витаминов группы В с достаточной достоверностью и экономичностью.

ВЫВОДЫ:

1. Предложен способ осуществления хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил. Выявлены критерии, обеспечивающие миниатюризацию хроматографнческой системы и детектирование зон в слое сорбента с использованием денситометрии.

2. Определены закономерности пропитки осушенных кремнеземных сорбентов смачивающей жидкостью (этанол). Установлено, что зависимость квадрата расстояния, пройденного элюентом, от времени является линейной как при действии только капиллярных сил (восходящий поток), так и при приложении избыточного давления на входе в колонку: АР = 0,58 атм (восходящий поток) и 0,95 атм (ниходящий) поток.

3. В рамках простейшей модели сорбента, которая включает систему транспортных пор — цилиндрических капилляров, расположенных параллельно оси колонки, произведена оценка эффективных радиусов пор. Значения г^ для сорбентов Силасорб-600 и СТХ-1ВЭ составили 0,12 и 0,08 мкм соответственно.

4. На примере синтетических красителей изучены закономерности движения и размывания зон аналитов. Теоретически и экспериментально показано, что в условиях восходящего потока элюента под действием капиллярных сил уменьшение длины пути элюента до 3-4 см в насадочной колонке приводит к уменьшению размывания зон аналитов. При приложении дополнительного (к капиллярному) давления (АР = 0,5-0,9 атм) и увеличении скорости пропитки размывание зон аналитов увеличивается.

5. В колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с капиллярным поднятием элюента воспроизводимость определения фактора задержки аналитов R/ выше, чем в ТСХ, а конечные значения R\¡ устанавливаются за меньший промежуток времени. Показано, в колоночной ЖАХ что при меньшей длине пути элюента (3-4 см) разрешение пиков Ra в 1,1 - 1,2 раза выше, чем в ТСХ.

6. На примере определения действующих веществ в готовых лекарственных формах (антибактериальные производные нитрофурана, антибиотики групп тетрациклина и цефалоспорина, витамины группы В) проведена сравнительная оценка аналитических возможностей ТСХ и колоночной ЖАХ с капиллярным поднятием элюента и денситометрическим детектированием и показаны преимущества последней: лучшая воспроизводимость характеристик удерживания, высокое разрешение пиков, экспрессность, малый расход элюента и адсорбента.

Список цитируемой литературы:

[1] Беленький Б.Г. Хроматография полимеров. / Б.Г. Беленький, JI. 3. Виленчик. - М.: Химия, 1978. С. 254 - 277.

[2] Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии / В.Д. Красиков. - СПб.: Химиздат, 2005.235 с.

[3] Гейсс, Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) / Ф.М. Гейсс. - Изд-во при совете по хроматографии РАН, 1999. Т. 1 и 2. 753 с.

Автор выражает искреннюю благодарность д.х.н., профессору Б.Г. Березкину за постановку задачи данного исследования, а также помощь и ценные замечания.

Список публикаций по теме диссертации в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ

1. Березкин В.Г., Онучак JI.A., Евтюгина E.H. Капиллярный вариант хроматографии М.С.Цвета с использованием видеоденситометрии как метода детектирования // Докл. АН. 2008. Т. 421. № 2. С. 1 - 3.

2. Березкин В.Г., Онучак Л.А., Евтюгина E.H. Применение нового варианта капиллярной тонкослойной хроматографии для анализа антибиотиков группы тетрациклина // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т.8. Вып.4. С. 570-576.

3. Березкин В.Г., Онучак JI.A., Евтюгина E.H. Капиллярная тонкослойная хроматография антибактериальных производных нитрофурана // Журнал прикл. химии 2009. Т.82. Вып.2. С. 317-321.

Список публикаций в сборниках тезисов конференций

1. Евтюгина E.H. Исследование возможности идентификации веществ методом одномерной тонкослойной хроматографии // Труды 2-го Международного форума молодых ученых (7-й Международной конференции). Самара. 2006. Ч. 10. С.16.

2. Березкин В.Г., Онучак JI.A., Евтюгина E.H. Применение капиллярной тонкослойной хроматографии для определения тетрациклинов // Тезисы докладов Международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетий». Тамбов. 2007. С. 139.

3. Евтюгина E.H., Березкин В.Г., Онучак JI.A. Капиллярная тонкослойная хроматография антибактериальных производных нитрофурана // Тезисы докладов 2-го Международного форума «Аналитика и аналитики». Воронеж. 2008. Т.2. С.525.

4. Berezkin V. G., Onuchak L.A., Evtyugina E.N. A "Micro-version" of M.S. Tswett's chromatography as an analog of thin-layer chromatography // Materials of 32-nd Interactional Symposium on Capillary Cromatography and 5-th GC*GC Symposium. Riva del Garda. Italy. 2008. P. 117.

5. Евтюгина E.H., Березкин В.Г., Онучак JI.A. Капиллярный вариант жидкостной хроматографии в тонком слое с использованием

видеоденситометрии // Тезисы докладов Международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века», г. Санкт-Петербург. 2009. С.215.

6. Евтюгина E.H., Березкин В.Г., Онучак JI. А. Капиллярная тонкослойная хроматография с использованием видеоденситометрии как метода детектирования. // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии. Самара. 2009. С. 37-38.

7. Евтюгина E.H., Березкин В.Г., Онучак JI.A., Пивоварова H.A. Применение капиллярной тонкослойной жидкостной хроматографии для определения антибиотиков // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Хроматография - народному хозяйству». Дзержинск. 2010. С. 131 - 132.

Подписано в печать Формат 60><84'/i6 Цифровая Печ. л. 1.5

21.01.2011 печать

Уч.-изд.л. 1.5 Тираж 100 Заказ 05/01

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, дом 54, офис 8)

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Движение и размывание зон сорбатов в условиях хроматографии в тонком слое под действием капиллярных сил

1.2. Способы организации процесса в современной тонкослойной хроматографии

1.3. Применение ТСХ для анализа лекарственных препаратов

2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Красители

2.1.2. Антибактериальные производные нитрофурана

2.1.3. Антибиотики группы тетрациклина и цефалоспорина

2.1.4. Водорастворимые витамины группы В

2.2. Пробоподготовка лекарственных препаратов для анализа методом тонкослойной хроматографии и колоночной жидкостноадсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил

2.3. Приготовление сорбентов и колонок

2.4. Методика хроматографического эксперимента

2.5. Методика определения хроматографических характеристик

2.6. Оценка погрешности измерений хроматографических величин удерживания '

2.7. Количественный анализ веществ методом тонкослойной хроматографии и колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил

3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КОЛОНОЧНОЙ ЖИДКОСТНО-АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПОТОКЕ ЭЛЮЕНТА, ДВИЖУЩЕМСЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ КАПИЛЛЯРНЫХ СИЛ 83 3.1. Движение элюента в колонке с сорбентом под действием капиллярных сил

3.2. Закономерности движения и размывания зон синтетических красителей в различных вариантах жидкостно-адсорбционной хроматографии в зависимости от способа подачи подвижной фазы

4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА КОЛОНОЧНОЙ ЖИДКОСТНО-АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С КАПИЛЛЯРНЫМ ПОДНЯТИЕМ ЭЛЮЕНТА

4.1. Применение колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил для качественного определения синтетических красителей

4.2. Количественное определение синтетических красителей методом колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ КОЛОНОЧНОЙ ЖИДКО-СТНО-АДСОБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ДВИЖЕНИЕМ ЭЛЮЕНТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ КАПИЛЛЯРНЫХ СИЛ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В ГОТОВЫХ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

5.1 Определение антибактериальных производных нитрофурана

5.2 Определение антибиотиков группы тетрациклина

5.3. Определение антибиотиков группы цефалоспоринов

5.4. Определение некоторых водорастворимых витаминов группы В 124 ВЫВОДЫ 134 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Актуальность темы. Колоночная и тонкослойная жидкостно-адсорбционная хроматография широко используется в практике аналитической химии. Преимуществами тонкослойной жидкостной хроматографии (ТСХ) по сравнению с колоночной являются простота, экономичность, детектирование на слое сорбента, возможность одновременного анализа нескольких различных образцов и стандартов. Благодаря применению силикагелей с диаметром частиц 5-8 мкм для получения высокоэффективных пластин, а также использованию денситометрии для детектирования сорбатов, ТСХ в настоящее время применяется для экологического мониторинга, определения наркотических веществ, продуктов микробиологической промышленности, контроля пищевых продуктов и др. В медицине и фармацевтической промышленности именно ТСХ из всех хроматографических методов наиболее широко используется для стандартизации фармпрепаратов, при контроле подлинности и качества лекарственных препаратов. Вместе с тем необходимо отметить, что тонкослойной хроматографии присущи такие недостатки, как негативное влияние газовой фазы на воспроизводимость характеристик удерживания и размывание зон, относительно большие объемы элюентов, необходимость применения специальных камер. Поэтому совершенствование доступных и экспрессных методов жидкостно-хроматографического определения широкого круга аналитов в различных объектов является актуальной задачей. При этом особое внимание следует уделить миниатюризации хроматографической системы и созданию тест-методов.

Работа поддержана проектом 02.740.11.0650 ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 — 2013 годы.

Цель работы. Разработка и оценка аналитических возможностей колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии, осуществляемой в условиях движения потока элюента под действием капиллярных сил и детектирования аналитов в слое сорбента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методику изготовления наполненных колонок малой длины и малого диаметра, выбрать способы подачи элюента в колонку и детектирования зон сорбатов в слое сорбента.

2. Изучить физико-химические закономерности колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил.

3. Сопоставить характеристики хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и традиционной ТСХ, оценить аналитические возможности и области применения разработанного метода.

4. Предложить схемы анализа действующих веществ (антибиотики, производные нитрофуранов, витамины) в готовых лекарственных формах, основанные на применении метода колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и денситометрическим детектированием в слое сорбента.

Научная новизна.

Разработан способ осуществления хроматографического процесса в наполненной колонке малой длины и малого диаметра в потоке жидкой фазы, движущемся под действием капиллярных сил, с денситометрическим детектированием зон сорбатов в слое сорбента. Установлены закономерности ч движения и размывания зон, позволяющие прогнозировать оптимальные условия разделения смесей аналитов путем варьирования длины колонки, скорости капиллярной пропитки, а также геометрического строения сорбента. Теоретически и экспериментально обоснованы преимущества колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил по сравнению с традиционной ТСХ (меньшее время анализа, лучшая воспроизводимость характеристик удерживания, высокое разрешение пиков, малый расход элюента и адсорбента). Выявлены аналитические возможности предлагаемого метода для экспресс-анализа различных объектов и создания хроматографических тест-методов.

Практическая значимость работы.

Показана возможность определения действующих веществ в лекарственных формах с помощью разработанного метода колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с капиллярным поднятием элюента и денситометрическим детектированием зон аналитов в слое сорбента в видимом и УФ диапазонах спектра. Определены оптимальные условия селективного определения антибактериальных производных нитрофурана, антибиотиков групп тетрациклина и цефалоспорина, водорастворимых витаминов группы В.

На защиту выносятся;

1. Способ осуществления хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил и денситометрическим детектированием зон сорбатов в слое сорбента.

2. Результаты исследования физико-химических закономерностей пропитки «сухого» сорбента, а также движения и размывания зон сорбатов в колонке с движением элюента под действием капиллярных сил.

3. Обоснование преимуществ предлагаемого способа по сравнению с традиционной ТСХ и оценка аналитических возможностей и области применения разработанного метода.

4. Схемы определения антибактериальных производных нитрофурана, антибиотиков групп тетрациклина и цефалоспорина, водорастворимых витаминов в готовых лекарственных формах, основанные на предложенном варианте ' колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил в его сочетании с денситометрическим детектированием в слое сорбента.

Публикации и апробация работы. Материалы работы опубликованы в 3 статьях и 7 тезисах докладов. Основные материалы диссертации были доложены на 4-й Международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетий» (2007, Тамбов), 32-nd Internetional Symposium on Capillary Cromatography and 5-th GCXGC Symposium (2008, Riva del Garda, Italy), 2-м Международном форуме «Аналитики и аналитика» (2008, Воронеж), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (2009, Самара), Международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (2009, Санкт-Петербург), Всероссийской конференции «Хроматография - народному хозяйству» (2010, Дзержинск).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время метод тонкослойной хроматографии занимает одно из ведущих мест в практике анализа фармацевтических, медико-биологических, химико-технологических и природных объектов. Простота и экспрессность метода, высокая эффективность, наглядность результатов разделения делают тонкослойную хроматографию широко используемым и доступным методом массовых анализов веществ практически всех классов [1]. Тонкослойная хроматография (ТСХ) является разновидностью варианта планарной жидкостной хроматографии, в которой разделение веществ происходит на открытом слое сорбента [2]. Метод тонкослойной хроматографии предложен в 1938 году советскими учеными Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер [3].

Предложенный в нашей работе вариант колоночной жидкостно9 адсорбционной хроматографии близок, по-нашему мнению, к тонкослойной хроматографии, так как движение элюента происходит в тонком (<0,5 мм) цилиндрическом слое сорбента под действием капиллярных сил, а детектирование осуществляется методом денситометрии в слое сорбента. Поэтому в обзоре литературы представлены как работы теоретического плана, в которых дано количественное описание закономерностей движения и размывания зон сорбатов в условиях ТСХ под действием капиллярных сил, так и работы, отражающие состояние современного аппаратурного оформления ТСХ и инструментальных средств для качественной и количественной оценки результатов разделения на тонком слое сорбента. В разделе также показаны преимущества использования метода ТСХ в анализе лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ:

1. Предложен способ осуществления хроматографического процесса в условиях колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с движением элюента под действием капиллярных сил. Выявлены критерии, обеспечивающие миниатюризацию хроматографической системы и детектирование зон в слое сорбента с использованием денситометрии.

2. Определены закономерности пропитки осушенных кремнеземных сорбентов смачивающей жидкостью (этанол). Установлено, что зависимость квадрата расстояния, пройденного элюентом, от времени является линейной как при действии только капиллярных сил (восходящий поток), так и при приложении избыточного давления на входе в колонку: АР = 0,58 атм (восходящий поток) и 0,95 атм ниходящий) поток.

3. В рамках простейшей модели сорбента, которая включает систему транспортных пор - цилиндрических капилляров, расположенных параллельно оси колонки, произведена оценка эффективных радиусов пор. Значения гэфф для сорбентов Силасорб-600 и СТХ-1ВЭ составили 0,12 и г

0,08 мкм соответственно.

4. На примере синтетических красителей изучены закономерности движения и размывания зон аналитов. Теоретически и экспериментально показано, что в условиях восходящего потока элюента под действием капиллярных сил уменьшение длины пути элюента до 3-4 см в насад очной колонке приводит к уменьшению размывания зон аналитов. При приложении дополнительного (к капиллярному) давления (АР = 0,50,9 атм) и увеличении скорости пропитки размывание зон аналитов увеличивается. *

5. В колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии с капиллярным поднятием элюента воспроизводимость определения фактора задержки аналитов Я/ выше, чем в ТСХ, а конечные значения Я/ устанавливаются за меньший промежуток времени. Показано, в колоночной ЖАХ что при меньшей длине пути элюента (3-4 см) разрешение пиков Яв в 1,1 — 1,2 раза выше, чем в ТСХ.

На примере определения действующих веществ в готовых лекарственных формах (антибактериальные производные нитрофурана, антибиотики групп тетрациклина и цефалоспорина, витамины группы В) проведена сравнительная оценка аналитических возможностей ТСХ и колоночной ЖАХ с капиллярным поднятием элюента и денситометрическим детектированием и показаны преимущества последней: лучшая воспроизводимость характеристик удерживания, высокое разрешение пиков, экспрессность, малый расход элюента и адсорбента.

1. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965. — С.346-352.

2. Сумина, Е.Г. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы иtпрактическое применение.: Учеб. метод, пособие / Е.Г. Сумина, С.Н. Штыков, Н.В. Тюрина. — Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 2002. — 108 с.

3. Измайлов, Н.А. Капельно-хроматографический метод анализа и его применение в фармации / Н.А. Измайлов, М.С. Шрайбер // Фармация. Раздел «Лекарственные препараты (производство и испытание)». — 1938. -№3.- С. 1-7.

4. Гейсс, Ф. М. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) / Ф. М. Гейсс. Изд-во при совете по хроматографии РАН, 1999. Т. 1 и 2.-753 с.

5. Sherma, J. Handbook of Thin-Layer Chromatography, 3rd edition / J. Sherma, B. Fried. New York - Basel - Hong Kong: Marcel Dekker, Inc, 2003.- 1047 p.

6. Щукин, Е.Д. Коллоидная химия. Учебник для ун-тов и хим.-технол. вузов / Е.Д. Щукин, А.В. Перцов, Е.А. Амелина. М:Высш.шк., 1992. -414 с.

7. Grinberg, N. Modern thin-layer chromatography. Chromatographic Science Series / N. Grinberg. New York: Marcel Dekker, Inc, 2003. - 481 p.

8. Айвазов, Б.В. Введение в хроматографию / Б.В. Айвазов. — М.: Высшаяршкола, 1983.-240 с.

9. Аналитическая хроматография / К.И. Сакодынский и др. — М.: Химия, 1993.-464 с.

10. Основы аналитической химии. В 2 кн. / Под^ред. Ю.А. Золотова. — М: Высш. шк., 2000. 351 с.

11. Ettre, L.S. Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993)/ L.S. Ettre. // Appl. Chem. 1993. - Vol. 65, № 4. -P. 819-872.

12. Sethi, С. P. D. Identification of drugs in pharmaceutical formulations by Thin-Layer Chromatography/C. P.D. Sethi,- New Dehli: CBS Publishers & Distributors, 2008 254 p.

13. Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография / Ю. Кирхнер, Т. 1 и 2. -М.: Мир, 1981.- 616 с.

14. Wall, P. Е. Thin-Layer Chromatography. A modern practical approach / P.E. Wall // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2006. - Vol. 386, № 2. -P. 204-205.

15. Кайзер, P.E. Высокоэффективная тонкослойная хроматография / Под ред. А. Златкиса, Р.Е.Кайзера М.: Мир, 1979. -245с.

16. Buia, К. Н. A Comparison of Polymer Separation Efficiency and Resolution by Gradient LC, GPC and TLC/ К. H. Buia, D. W. Armstronga // J. of Liquid Chromatography & Related Technologies 1984. - Vol. 7, Iss. 1. -P. 29-43.

17. Matysik, G. Gradient thin-layer chromatography of plant extracts/ G. Matysik, E. Soczewiski // Chromatographia. 1988 - Vol. 26, № 1 -P. 178-180.

18. Poblocka, L. Multiple gradient TLC and densitometric analysis of p coumaric acid in some medicinal plants from the family Solanaceae / L. Poblocka, G. Matysik, W. Cisowski // J. of Planar Chromatography -Modern TLC - 2003 - Vol. 16, № 1 - P. 76-79.

19. Warksmundzka-Hajnos. M. Thin-Layer Chromatography in Phytochemistry / M. Warksmundzka-Hajnos, J. Sherma, T. Kowalska. — Boca Raton: CRC Press, 2008. 686 c.

20. Stahla, E. New spreader for the preparation of gradient layers in thin-layer chromatography/ E. Stahla, J. Mullera // J. of Chromatography A. — 1980. — Vol. 189, Iss. 3 P. 293-297.

21. Srivastaval, S. P. TLC separation of some biologically important amino acids on pyridinium tungstoarsenate impregnated layers / S. P. Srivastaval, V. K. Dual, K. Gupta 1// Chromatographic 1979. - Vol. 12, № 9 - P. 605607. .

22. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672-03 Утв. гл. гос. санитарным врачом РФ 30.06.2003.

23. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я.Гергей. М.: Мир, 1976.-368 с.

24. Bhusan, R. Thin layer chromatography of peptides and proteins: A review / R. Bhusan, V. K. Mahesh, P. V. Mallikharjun // Biomedical Chromatography. 1989. - Vol. 3, Iss. 3 - P. 95 - 104.

25. Ryanab'E.A. Separation of amino sugars and related compounds by two-dimensional thin-layer chromatography/ E.A. Ryana, A. M. Kropinskia // J. of Chromatography A. 1980. - Vol. 195, Iss. 1 - P. 127-132.

26. Б.В.Тяглов; E.B. Дегтерев; И.И. Малахова; В.Д. Красиков; В.В. Помазанов. Способ разделения аминокислот в биологических жидкостях. Патент № 2078342 от 27.04.1997

27. Nyiredy, Sz. The bridge between TLC and HPLC:overpressured layer chromatography (OPLC). // Trends in analytical chemistry. 2001 - Vol. 20, №. 2 — P. 91-100.

28. Mincsovics, E. Hand-book of Thin-Layer Chromatography / E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihak New York: Dekker M. - 1996. - 171 p.

29. Tyihak, E. Overpressured layer chromatography and its applicability in pharmaceutical and biomedical analysis / E. Tyihak. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis —1987—Vol. 5. Issue 3 P. 191 -203.'

30. Nyiredy, Sz. Planar chromatography /Sz. Nyiredy, E. Heftmann. -Amsterdam: Elsevier 1992. - 109 p.

31. Botz, L. Applicability of long distance overpressured layer chromatography/ Botz, L.; Nyiredy, S.; Sticher, O. // J. Planar. Chromatogr. 1991. - Vol. 4 -P. 115-122.

32. Березкин, В.Г. Вибрационная тонкослойная хроматография / В.Г. Березкин, С. В. Курбатова, Г. А. Нехорошев // Журн. физ. химии. — 2005. Т.79, № 11 - С.2058-2062.

33. Березкин, В.Г. Новый вариант тонкослойной хроматографии с использованием потока газа над сорбционным слоем пластинки/ В.Г., Березкин, К.В. Седнев // ДАН 2008. - Т. 419, №3. - С. 345-348.

34. Berezkin, V.G. Study of a new version of classical thin-layer chromatography with a closed adsorbent layer / V.G. Berezkin, E.V. Kormishkina // J. Planar Chromatogr. 2006. - Vol.19. -P.81-86.

35. Березкин, В. Г. Новый вариант традиционной тонкослойной хроматографии с контактно закрытым сорбционным слоем («бескамерная» ТСХ) /В. Г. Березкин, Е. В. Кормишкина // Журн. аналит. химии. 2006 - Т.61, №10. - С. 1074-1080.

36. Березкин, В.Г. Вариант круговой тонкослойной хроматографии с закрытым сорбционным слоем / В.Г. Березкин, Е.В. Кормишкина // Журн. прикладн. химии. 2007. - Т. 80, вып. 6. - С. 932-937.

37. Shermal, J. Chronology of thin-layer chromatography focusing on instrumental progress / J. Shermal, G. Morlock // J. of Plan. Chromatography Modern TLC. - 2008.- V. 21, № 6. - P.471-477.

38. Nyiredy, Sz. Progress in forced-flow planar chromatography/ Sz. Nyiredy. J. of Chromatography A. 2003. - Vol. 1. - P. 985-999.

39. Stahl, E. Parameters of preparative centrifugal thin-layer chromatography/ E. Stahl, J. Müller // Chromatographia 1982. - Vol. 15, № 8 - P.493-497.

40. Vovk, I. Rotation planar extraction and rotation planar chromatography of oak (Quercus robur L.) bark/ I. Vovk, B. Simonovskaa, S. Andreneka, H. Vuorelab, P. Vuorelac // J. of Chromatography A 2003. - Vol. 991, Iss. 2.-P. 267-274.

41. Gupta, Sh. K. Fractionation of Moderate Molecular Weight Polysiloxanes by Centrifugal TLC. / Sh. K. Gupta, J. R. Sargent, W. P. Weber // Anal. Chem.-2001.-Vol. 73,№15.- P. 3781-3783.51 .www.iatroscan.com

42. Bharati, S. A new north sea oil-based standart for iatroscan analysis / S. Bharati, R. Patience, N. Mills, T. Hanesand // Organic Geochemistry. -1997. Vol. 26, №1-2. - P.49-57.

43. Parrish, C.C. Determination of glycoglycerolipids by chromarods thin-layer chromatography with iatroscan flame ionization detection / C.C. Parrish, G. Bodennec, P. Gentien// J. of Chromatography A 1996. - Vol. 741, № l. -P. 91-97.

44. Mossoba, M. M. Lipid Analysis and Lipidomics: NewTechniques and Applications/ M. M. Mossoba; J. K.G. Kramer, J. Th. Brenna; R. E. McDonald Ontario: AOCS Publishing, 2006. - 456 p.

45. Nyiredy S. Planar Chromatography A Retrospective View for the Third Millennium./ S. Nyiredy. Budapest: Springer Scientific Publisher, 2001. -614 p.

46. Беликов, В.Г. Общая фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.1./ В.Г. Беликов, М: Высш. школа, 1993. 432 с.

47. Глущенко, Н.Н. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред, учеб. завед. / Н.Н. Глущенко, Т.В. Плетнева, В.А. Попков; под. ред. Т.В. Плетневой. -М.: Издательский дом «Академия», 2004. 384 с.

48. Фармацевтическая химия: Учебное пособие/ Под ред. А.П: Арзамасцева. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 640 с.

49. Государсвенная фармакопея СССР: XI Изд. — Вып. 1 и 2. М.: Медицина, 1987.

50. British Pharmacopea CD 2007. V. 1, 2. System Simulation Ltd., 2007

51. Japanese Pharmacopoeia Tokio, 2006. - Электронная версия.

52. Фармакопея США — Национальный формуляр. В 2 т. М.:

53. Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007 3592 с.

54. Кабулов, Б.Д. Нанокомпозитный хитозан — кремнеземный сорбент для тонкослойной хроматографии для анализа алколоидов/ Б.Д. Кабулов, Д.Ш. Шакарова., O.A. Шпигун., С.С. Негматов // Журн. физ. химии. 2008. Т. 82, № 6. - С. 1054-1058.

55. Рыбакова, О.В. Определение токоферолов методом хроматографии в тонком слое сорбента/ О.В. Рыбакова, Е.Ф. Сафонова, А.И. Сливкин // Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т. 42, № 8. - С. 31-34.

56. Герег, Ш. Количественный анализ стероидов/ Ш. Герег. М.: Мир, 1985.-504 с

57. Фомичева, Е.А. Количественное определение флавоноидов в гомеопатической настойке чистотела методом спектрофотомерии. Фомичева, Е.А. Лякина М.Н., Костенникова З.П. // Фармация. 2001 -Т. 49, №5-С. 13-15.

58. Gupta, М./ Use of HPTLC, HPLC, and densitometry for qualitative separation of indole alkaloids from Rauvolßa serpentina roots/ M. Gupta ,

59. A. Srivastava, A. Tripathi, H. Misra //J. of Planar Chromatography-Modern TLC. P. 282-287.r

60. Бородина, E.B. Определение токоферолов методом тонкослойной хроматографии с применением программной обработки сканированных изображений хроматограмм/ Е.В. Бородина, Е.Ф. Сафонова, A.A.у

61. Назарова, Т.А. Китаева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. - Т. 6, № 3. - С. 411-414.

62. Бородина, Е.В., Определение а -токоферола и эргокальцеферола методом ТСХ/ Е.В. Бородина, Т.А. Китаева, Е.Ф. Сафонова,

63. B.Ф. Селеменев, A.A. Назарова// Журнал аналитической химии. — 2007.-Т. 62, № 11.-С. 1181-1185.

64. Hernndez-Domngueza, E. Monoterpenoid Alkaloid Quantitation by in situ Densitometry-Thin Layer Chromatography/ E. Hernndez-Domngueza; F. Vzquez-Flotaa // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2006. - Vol. 29, Iss.4. - P. 583-590.

65. Witek A. TLC-densitometric determination of bisoprolol, labetalol andfpropafenone, as dabsyl derivatives, in pharmaceutical preparations/ A. Witek, H. Hopkalal, Matysik// Chromatographic 1999. - Vol. 50, № 1-2-P. 41-44.

66. Валидация аналитических методик для производителей' лекарств: Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств/ Под. ред. В.В. Береговых -М.: Литтера, 2008. 132 с.

67. Дегтерев, Е. В. Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества/ Е. В. Дегтерев // Российский Химический Журнал 2002. - т. 19, № 46 - Р.43-51.77. www.who.int/ru/ Официальный сайт Всемирной Организации Здравоохранения.

68. Экспресс-анализ с целью выявления фальсифицированных лекарственных средств. Практическое руководство. Фторхинолоны и цефа-лоспорины / А.П. Арзамасцев и др. — М.: Издательский дом «Русский врач», 2003. 132 с.

69. Nabi, S.A. Selective separation and determination of cephalosporins by TLC on stannic oxide layers / S.A. Nabi, E. Laiq, A. Islam // Acta Chrorri^tographia 2004. -№ 14. - P. 92-101.

70. Ся, Юй. Анализ методик ТСХ для стандартизации водорастворимых витаминов/ Ся Юй, А. П. Арзамасцев //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. - № 4. - С. 37-40.

71. Красовицкий, Б. М. Органические люминофоры / Б. М. Красовицкий, Б. М. Болотин Д.: Химия, 1976.- с. 344.

72. Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques/ G.T. Hennanson- ACADEMIC PRESS, 1996. c. 785.

73. Машковский, М.Д. Лекарственные препараты/ М.Д. Машковский. M.: Медицина, 2006. 1803 с.

74. Hossu A.M. TLC Applications on separation and quantification of fat-soluble vitamins/ A.M. Hossu, M.F. Mariab, C. Radulescu// Romanian Biotechnological Letters. 2009. - Vol. 14, No. 5, P. 4615-4619.

75. Шаршунова, M. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, т. 2 / В. Шварц, Ч. Михалец. — М.: Мир, 1980- 610 с.

76. Дёрффель, К Статистика в аналитической химии/ К. Дёрффель -М.:Мир, 1994-268 с.

77. Гармаш, A.B. Метрологические основы аналитической химии. Издание 2-е, исправленное и дополненное (учебно-методическая разработка)/ A.B. Гармаш, Н.М.Сорокина М.: Химфак МГУ, ВХК РАН, 2005. -40 с.

78. РМГ 74-2004. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа. — Введен с 01.09.2006. М.: Стандартинформ, 2004. — 190 с.

79. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Использование значений точности на практике. Введен 01.11.2002. М.: Стандартинформ, 2002. — 43 с.

80. Кадис, P.JI. О терминах и понятиях «точность» и «правильность» (результатов) химического анализа/ P.JI. Кадис // Журн. аналит. химии. 2007. Т. 62, № 6 - с.566-574.

81. Лысков, A.B. Тепломассообмен / A.B. Лысков — М.: Энергия,1978. -291 е.-

82. Giddings, J.C. Zone migration in PC/ J.C.Giddings, G.H.Stewart, A.L.Ruoff // J.Chromatogr. 1960. - Vol.3. - P. 239.

83. Рудаков, О. Б. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии спутник хроматографиста/ О. Б. Рудаков, И. А. Востров, С. В. Федоров, А. А. Филиппов, В. Ф. Селеменев, А. А. Приданцева. М.; Водолей, 2004 - 528 с.

84. Дорофеев, В.Л. Выявление фальсифицированных лекарственных препаратов, содержащих фторхинолоны, с использованием методик ИК-снбктроскопии/ В.Л. Дорофеев, A.A. Коновалов, В.Ю. Кочин, А.П. Арзамасцев// Вестник ВГУ. 2004. - № 2. - С. 183-187.

85. Падейская, E.H. Фурамаг в ряду антимикробных препаратов, производных 5-нитрофурана: значение для клинической практики/ E.H. Падейская// Инфекции и антимикробная терапия. — Т. 6, №1 -С. 23-29.

86. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии // Под редакцией Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. М.: 2002

87. Международная фармакопея. Т.З. Спецификации для контроля качества фармацевтических препаратов Международная фармакопея, 1983.

88. Разделение тетрациклинов методом тонкослойнойхроматографии. Separation of tetracyclines by thin-layer chromatography

89. Chôma Irena //Chem. anal. 2001. - Vol. 46, № 1. - С. 1 - 9.

90. Беликов, В.Г. Общая фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.2./ В.Г. Беликов, М: Высш. школа, 1993. 608 с.

91. Мочалова, B.C. Высокоэффективная жидкостная хроматография водорастворимых витаминов на модифицированных сорбентах/ B.C.

92. Мочалова, Г.Д. Брыкина, O.A. Шпигун. // Вестник Московского университета. 2006. - Т. 47, № 3. - С. 206-209.

93. Чечета, О.В. Метод тонкослойной хроматографии в оценке степени чистоты масляных препаратов витамина А / О.В. Чечета, Е.Ф. Сафонова, А.И, Сливкин, Г.А. Оголь // Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т. 42, № 12. - С. 47^9.

94. Арзамасцев, А. П. Анализ методик ТСХ для стандартизации водорастворимых витаминов/ А. П. Арзамасцев //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. - № 4. - С. 37-40.

95. Vinas P. Reversed-phase liquid chromatography on an amide stationary phase for the detemination of the В group vitamins in baby foods / P. Vinas, С. Lopes-Erroz, N. Balsalobre, M. Hernandes-Cordoba //J. of Cromatogr. A. 2003. - Vol. 1007. - P.77-84.

96. Власова, И.В. Спектрофотометрический анализ смесей витаминов с применением метода множественной регрессии/ И.В. Власова, A.C. Шелпакова., E.H. Масякова // Аналитика и контроль. 2009. - Т. 13, № 2. - С. 86-90.

97. Erdal, D. Spectrophotometric quantitative determination of Cilazapril and hydrochlorothiazide in tablets by chemometric methods/ D. Erdal, B. \ Dumitru //J. Pharm, and Biomed. Anal. 2002. - V. 30. № 3.