Комплексная система оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.16 ВАК РФ

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи ^о-ґ ґ! /' ( (

00505 Гіои

Орлова София Ивановна

КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И КОМПЛЕКСОВ

БИОМЕТАЛЛОВ

02.00.16 - медицинская химия 02.00.08 - химия элемеитооргаиических соединений

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических паук

Москва -2012

1 з ДЕК 2012

005057380

Работа выполнена на кафедре органической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Милаева Елена Рудольфовна,

доктор химических наук, профессор

Шевцова Елена Феофановна,

кандидат химических наук

(Институт физиологически активных

веществ РАН, зав. лабораторией)

Кузнецова Светлана Александровна,

доктор химических наук (кафедра химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, ведущий научный сотрудник)

Санина Наталия Алексеевна,

доктор химических наук

(Институт проблем химической физики

РАН, зав. отделом)

Ведущая организация:

Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «19» декабря 2012 г. в И00 час. на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.69 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Химический факультет, ауд. 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 19 » ноября 2012 г.

Ученый секретарь ^

Диссертационного совета 11

доктор химических наук, профессор ' V 1 ' Т В. Магдесиева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное!!, проблемы. Одной из важных задач медицинской химии на пути создания лекарственных препаратов является отбор перспективных физиологически активных соединений с помощью системы первичного скрининга. На ранних этапах тестирования того или иного вида активности используют модельные реакции и процессы, либо in vitro биохимические системы, максимально приближенные к физиологическим условиям.

В последние годы резко возрос интерес к получению новых веществ, обладающих антиоксидантной активностью. Этот интерес во многом обусловлен массивом экспериментальных данных об участии окислительного стресса организма в патогенезе большого числа заболеваний (рак, диабет, нейродегенерация, ишемия и др.) В организме роль антиоксидантов выполняют низкомолекулярные соединения (а-токоферол, аксорбиновая кислота, глутатион) и ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), действующие по принципиально различным механизмам и на различные мишени.

При изучении антиоксидантной активности синтетических низкомолекулярных веществ - кандидатов лекарственных препаратов, как правило, выбирается один-два метода определения активности. Такой подход позволяет регистрировать активность в целом, но не дает полного представления о природе антнокепдантного действия конкретного вещества, которое определяется его реакционной способностью. Однако новые синтетические подходы, позволяющие конструировать политопные молекулы с различными реакционными центрами, требуют сочетания различных методов и различных принципов выявления антиоксидантного действия для оценки интегрального вклада каждого из возможных типов активности. Существенным многообразием реакционных маршрутов характеризуются полнфункциональные соединения, содержащие в составе молекул атомы металла/элемента. Для таких веществ можно ожидать проявления синэргизма антиоксидантного действия за счет участия не только органического фармакофора, но и вовлечения металла/элемента. Получены синтетические аналоги витамина Е, содержащие металл, или, так называемые «каталитические антиоксиданты» - мнметпки сунероксиддисмутазы, включающие Fe, Мп, Со. И, наконец, введение металла в фенольные миметики а-токоферола, как известно, приводит к стабилизации феноксильных радикалов, ответственных за механизм антиоксидантного действия, и предотвращает нежелательное образование вторичных хиноидных продуктов окисления, обладающих прооксидантным эффектом. В связи с этим возникает необходимость создания сетевой структуры методов оценки, в которой количественные характеристики антиоксидантной активности учитывают все особенности механизмов действия каждого тестируемого вещества.

Цель работы. Целью данной работы является разработка общего подхода для комплексной оценки антиоксидантной активное™ полифункциональных элементоорганических соединений н комплексов биогенных металлов. В задачи работы входило: 1) рациональный подбор методов количественного определения антиоксидантной активности, основанных на модельных химических реакциях, с целью выявления основных маршрутов реакционной способности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов металлов; 2) изучение взаимного влияния антирадикального 2,6-диалкилфенольного фрагмента и редокс-активного металлосодержащего центра при оценке общей антиоксидантной активности полифункциональных соединений; 3) применение ряда in vitro методов с использованием в качестве тест-систем липосом, митохондрий и гомогенатов мозга крыс, а также фермента липоксигеназа с целью отбора перспективных кандидатов в ряду элементоорганических соединений и комплексов металлов — полифункциональных антиоксидантов, стабилизаторов мембран и нейропротекторов.

Научная новнзна. Предложен новый подход для разработки сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов, основанный на принципе «механизм - метод».

С использованием предложенной комплексной системы тестирования показано, что введение в 2,6-ди-от/?ея1-бутнлфенолы элементоорганической группы (фосфонатные и фосфинатные), металлоорганического фрагмента (ферроцен) и металлосодержащего координационного узла (комплексы металлов с дипиколиламином) приводит к существенному возрастанию общей антиоксидантной активности по сравнению с известным органическим антиоксидантом ионолом (2,6-ди-т/7еш-бутил-4-метилфенол).

В ряду ферроценов с 2,6-ди-тре»1-бутилфенольным заместителем выявлены эффективные ингибиторы пероксидного окисления липидов гомогенатов мозга крыс со значением 1С,о 3,9 ± 1,8 рМ, что позволяет проводить на их основе поиск веществ нейропротекторного действия.

Обнаружены комплексы Мп с дипиколиламиновым лигандом, содержащим 2,6-ди-трети-бутилфенол, - высокоэффективные стабилизаторы однослойных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и кардиолипина, которые представляют интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов.

При изучении фермента липоксигеназа (LOX 1-В) и проведении молекулярного докинга найдены новые ингибиторы LOX 1 -В — комплексы Си с нптронилнитрокенльными радикалами и комплексы Sb с N.S-гстероиикличсскпми лигандами, значения IC50 для которых лежат в диапазоне 17-^29 цМ.

Практическая ценность. Для проведения первичного скрининга антиоксидантной активности и отбора веществ-лидеров предложено использовать сетевую структуру методов оценки, основанную на комплексном анализе возможных маршрутов реакционной способности тестируемых соединений. Найдены комплексы марганца, содержащие в дипиколиловом лиганде группу 2,6-ди-н!/?еш-бушлфенола, которые можно использовать в качестве перспективных стабилизаторов липосом. Предложен новый эффективный ингибитор фармакологически важной мишени - фермента липоксигеназа — комплекс меди, который представляет интерес для поиска противовоспалительных и антипролиферативных агентов

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Международной конференции по металлоорганической и координационной химии (Россия, Нижний Новгород, 2008); 9-ой и 10-ой Европейской конференции по биологической неорганической химии (Польша, Вроцлав, 2008; Греция, Салоники, 2010); XXIV и XXV Международной Чугаевской конференции но координационной химии (Россия, Санкт-Петербург, 2009; Суздаль, 2011); Всероссийской конференции «Итоги и перспективы химии элементоорганических соединений» (Москва, 2009); 1-ом Турецко-Российском симпозиуме по органической и медицинской химии (Турция, 2009); Третьем Европейском симпозиуме по лнпидным медиаторам (Франция, Париж, 2010); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010); XI Международном симпозиуме по бионеорганической химии (Польша, Кудова-Здруй, 2010); 4-ой Европейской конференции по химии наук о жизни (Венгрия, Будапешт, 2011); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей, 13 тезисов докладов, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации. Материал диссертационной работы изложен на 164 страницах, включает 13 таблиц, 28 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 172 наименования.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 08-03-00844-а, 09-03-00090-а, 10-03-01137-а, 11-03-12088-офи-м, 12-03-00776-а) и ФЦП (N Госконтракта16.512.11.2278).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы посвящен анализу известных данных о методах оценки антиоксидантной активности.

2. Обсуждение результатов посвящено разработке и использованию сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов.

Исследуемые соединения стали результатом реализации двух направлений дизайна синтетических антиоксидантов: создание фенольных аналогов а-токоферола - «ловушек» свободных радикалов и создание миметиков активных центров ферментов антиоксидантной защитной системы (супероксиддисмутазы и каталазы) - редокс-активных комплексов металлов, способных взаимодействовать с активными метаболитами кислорода (АМК). На схеме представлена условная обобщенная формула объектов исследования, отражающая механизм их антиоксидантного действия: перенос атома водорода Н (путь А) и/или перенос электрона (путь Б) (Схема 1).

Схема 1.

(К) о

(Ю<3[М1

- Н'(- е, - Н4") (путь А)

- Н'(- е, - ВТ1") (путь А)

(ИН) О

И

(ЯН) О [М]

± е

(путь Б)

0[М]

(кн)<з [мп±,|

(}|1уг

(путь Б)

В состав молекул исследуемых соединений в различной комбинации входят следующие функциональные фрагменты:

ЯН, Я - 2.6-диалкилзамещенные фенолы - миметики природных антиоксидантов, нитронилнитроксильные радикалы, орлю-семихиноны, пирокатехины;

О - координирующие группы, необходимые для обеспечения заданной геометрии комплексов, возможности введения дополнительных лигандов в окружение иона металла, а также устойчивости связи металл-лиганд при изменении степени окисления металла:

[М] - элементоорганический структурный блок, ион металла (Ре, Со, Си. Мп. №, Ъп,

БЬ).

Органическими соединениями общей формулы (ЯН)<3 - объектами исследования в данной работе, являются пространственно-затрудненные 2,6-диалкилфенолы. а также замещенные гидроксиламины - предшественники феноксильных и нитронилнитроксильных радикалов (Я )(?. Модификацию химической структуры 2,6-диалкилфенолов осуществляли заменой объемного заместителя в оршо-положениях. либо функционального фрагмента в /га/мт-положении бензольного кольца. Структурные вариации нитронилнитроксильных радикалов представлены различными заместителями в кольце имидазола. участвующего в координации с металлом. В орлго-семихиноновых комплексах варьировали сочетание различного набора пара- и диамагнитных лигандов.

Возможность введения в 2.6-ди-»г/>еш-бутилфенолы благоприятных для координации металла заместителей <3 создает возможность конструирования полифункциональных металлоорганических или координационных соединений (ЯН)(3[М] (Схема 2). Вариабельность природы /юра-заместителя в 2,6-ди-ш/>еяг-бутилфенолах является также основой для введения элементоорганических групп.

комплексы металлов

(ЯН)С>[М]

(ИНКЗ

элементо-

органические

соединения

—Р (К')2]т

Ви'

(янклр]

Схема 2.

металлоорганнческне соединения

Ви1.

«ТУ-о^

^_у

Ви'

Ре

(кьВДРе!

В молекулах металлоорганических и координационных соединений общей формулы (RH)Q[M] присутствует реакционный центр (ион металла), способный вовлекаться в процесс переноса электрона. Кроме того, собственно атом металла в парамагнитном или диамагнитном лигандном окружении комплекса может отвечать за механизм биохимического действия как но пути переноса электрона, так и по пути координации в значимых сайтах биохимических мишеней.

Таким образом, объектами исследования являются полифункциональные соединения, которые являются «ловушками» радикалов и/или переносчиками электрона, а также способны встраиваться в сайты белковых мишеней.

Для установления общей антиоксидантной активности данных полифункциональных соединений в работе предложена сетевая структура комплексной системы методов оценки (Рис.1).

С этой целью в настоящей работе использован набор 10 методов, позволяющих учесть все возможные маршруты химической реакционной способности исследуемых соединений в зависимости от строения их молекул:

1. Исследование молекулярных механизмов активности соединений с использованием модельных тестов:

1.1. ДФПГ-тест

1.2. CUPRAC-тест

1.3. Реакция с ОН

1.4. Реакция с С>2

1.5. Реакция с Н2О2

1.6. Пероксидное окисление структурного фрагмента липидов на примере олеиновой и линолевой кислот

1.7. Влияние на активность фермента липоксигеназа (LOX 1-В)

2. Исследование in vitro анти-/прооксидантной активности с использованием биологических тест-систем:

2.1. Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) митохондрий, изолированных из печени крыс

2.2. Пероксидное окисление липидов гомогенатов печени и мозга крыс. В работе осуществлено тестирование 96 соединений.

переносН' <- МЕХАНИЗМ -> перенос е"

- МЕТОД I

> • ДФПГ тест 1 • CUPRAC тест

• неферментативное * ингибирование фермента • ферментативная

пероксидное липоксигеназа система

окисление олеиновой ■ тип ингибирования ксантин/

и линолевой кислот • молекулярный докинг ксантиноксидаза

^реакция Габера-Вейса • реакция Фентона^

ОБЩАЯ in vitro АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ

пероксидное окисление липидов (ПОЛ)

митохондрий и гомогенатов печени и мозга крыс

Рис. 1. Общая схема комплекса методов оценки антиоксидантной активности.

2.1. Синтетические эталонные антиоксиданты

С целью проведения сравнительного анализа и выбора эталонов сравнения в работе использованы известные применяемые антиоксиданты фенольного типа (1-5), аскорбиновая кислота (6) и галловая кислота (7).

По результатам комплексной оценки антиоксидантной активности серии исследованных антиоксидантов интерес для дальнейшего сравнительного анализа в качестве эталонов представляют тролокс (1) и ионол (3) (Таблица I).

Таблица 1. Параметры активности эталонных антиоксидантов (1-7) по данным различных методов.

N ДФПГ CUPRAC ОН* о2 н2о2 пероксидное окисление

соеди- -тест -тест линолевой

нения ЕС50, цМ ТЕАС активность, % 1С50, цМ EC50, цМ кислоты** ингибирование, %

1 36,2 ± 1,3 1,00 ± 0,08 87,1 ±3,2 62,7 ± 6,2 83,3 ± 12 83,7 ± 5,6

2 57,1 ±6,4 0,98 ±0.14 11.1 ± 1,5 47,3 ±2,1 255,9 ±43 86,3 ± 0,7

3 102,1 ± 1,5 1,10 ± 0,03 65,4 ±2,8 > 100 188,3 ±26 50,0 ± 1,3***

4 110.6 ±7,2 0.56 ± 0.04 35,0 ±6,4 > 100 96,0 ± 31 51,9± 1,4

5 >500 1.24 ±0.10 31,5 ±0,9 > 100 150,6 ±28 46,5 ± 8,5

6 49,3 ± 6,0 1.12 ±0.04 23,0 ±2,5 36,4 ±5,8 >500 73,9 ±5,8

7 73,4 ± 0,9 1,32 ± 0.04 21,7 ±6,4 87,3 ±7,4 >500 35,0 ±9.1

* активность при концентрации соединения 1,2 мМ; ** неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты, % ингибирования при концентрации соединения 2,4 мМ: *** % ингибирования при концентрации соединения 0,8 мМ: IC50 - концентрация ингибирования на 50%, ЕС50 - эффективная концентрация антиоксиданта, необходимая для уменьшения концентрации ДФПГ на 50%; ТЕАС (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) - активность в сравнении с тролоксом (1 ).

Соединение синтезировано под руководством к.х.н. А.Ю. Спивак (Институт нефтехимии и катализа РАН, Уфа) и передано для дальнейших исследований.

2.2. 2,6-ди-трг/и-бутилфенолы с гетероциклическими заместителями

С целью выявления роли фармакофорных азотсодержащих гетероциклических фрагментов в проявлении антиоксидантной активности 2,6-ди-огргпг-бутилфенолами в работе исследованы следующие соединения общей формулы (КН)С>:

N-N

{

N=N /yN R-

rv

Ви'

.......N-N

^f N=N »'

R = H, X = N (10) R = Me, X = N (11) R = H, X = CH (12)

R = H(13):R = Me(14)

15

16

По данным ДФПГ-теста соединение 14 имеет значение ECso =32,2 ± 1,3 |iM и активнее тролокса (1) (Табл. 1). Это же соединение проявило высокую активность в CUPRAC-тесте (ТЕАС = 2,42±0,23). При изучении общей антиоксидантной активности на примере модельной реакции иероксидного окисления Z-9-октадеценовой (олеиновой) кислоты и ПОЛ гомогенатов печени крыс in vitro (Рис. 2) в сравнении с ионолом (3) показано, что максимальной активностью обладает тетразин 13. Таким образом, в качестве перспективных антиоксидантов можно рассматривать соединения, в состав молекул которых входят как 2,6-ди-т/;<2я;-бутилфенол, так и 1,2,4,5-тетразин.

□ Накопление пцроперокацов олепновоіїкпслоіьі (LOOH)

■Накопи ениеТБК-зявншыых пр одуктов rq)ll окислении ОЛеПНОВОПКПСПОТЫ

□ НакопченпеТБК-зависнмых продал ов в процессеПОЛ гомогенатов печенії крыс_

Рис. 2. Активность соединений 10-13. 16 и 3 в процессе пероксидного окисления олеиновой кислоты и липидов гомогената печени крыс in vitro (37°С; FeSOj- 4Н20: буфер HEPES; рН 7.4; 30 мин).

Соединения синтезированы под руководством к.х.н. Г. Л. Русннова (Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН) и переданы для дальнейших исследований.

2.3. 2- и 2,6-Изоборнилфенолы

Сравнительное исследование антиоксидантной активности полусинтетических орто-изоборнилфенолов* (18-25) в сопоставлении с ионолом демонстрирует перспективность данных соединений.

R - Н(18) Ме (19) СНО (20) СН;ОН (21) CH,NMe2 (22)

R

СНО

>

(23)

(24)

23. 24

Особый интерес представляет «диборнол» — аналог ионола (19) и фенол 22 (Табл.

2).

Таблица 2. Параметры активности соединений (18-25) по данным различных методов.

N ДФПГ CUPRAC ОН* о2-** н2о2*** пероксидное

соеди- -тест -тест окисление

нения линолевой

кислоты****

ЕС50, ТЕАС активность. ингибирование, активность. ингибирование.

дМ % % % %

3 102,1 ± 1.5 1.10 ±0,03 65.4 ± 2.8 14.6 ±4.7 58,9 ±6,1 50,0 ± 1,3

18 64,4 ± 6,0 0.48 ± 0.03 14,2 ± 1,7 7,6 ±2,2 17,3 ± 14.1 43,2 ± 5,0

19 72.1 ± 5.7 0,31 ±0.03 25,2 ± 7,1 11.8 ±6.5 35,9 ±8.7 52.0 ±0.6

20 284,6 ± 9.4 0.91 ±0,13 22,1 ±4.1 30,9 ±20.0 69,3 ± 14.7 41.6 ± 0.5

21 >300 0,43 ± 0.08 23.0 ± 6,0 26,6 ± 9,6 36,7 ± 20,2 39.2 ± 8.3

22 52.1 ± 7.5 1,42 ±0,11 12,4 ±2,9 14,9 ± 1,8 25,8 ± 12,4 31.9 ±2.8

23 >300 0,08 ± 0,06 13,3 ± 1,7 12,3 ± 1,5 87,0 ± 19,0 14,6 ± 7,8

24 >300 0,82 ± 0.04 14,2 ±3,3 14,2 ±4,2 41,2 ±5,2 16,3 ±8.3

25 >300 0,36 ± 0,05 6,2 ± 13.1 16,4 ±4.5 64,1 ± 6.1 35.1 ±2,7

* активность при концентрации соединения 1,2 мМ; ** % ингибирования при концентрации соединения 100 рМ *** % ингибирования при концентрации соединения 500 цМ: **** неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты. % ингибирования при концентрации соединения 0.8 мМ.

Изоборнилфенолы 18-20. 22 исследованы в качестве ингибиторов фермента липоксигеназа. Значения ІС50 представлены на рис. 3. Все соединения обладают ингибирующей активностью. Наиболее активным в ряду исследованных изоборнилфенолов является структурный аналог ионола (19) (ІС50 = 36,7 |іМ).

Исследуемые вещества (18-25) получены в Институте химии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) под руководством член-корр. РАН A.B. Кучина и переданы для дальнейших исследований.

200

180

160

140

Е 120

2.

100

U 80

60

40

20

0

Рис. 3 Значения 1С50 для соединений 18-20. 22 в процессе ингибирования фермента липоксигеназы (линолевая кислота, ЬОХ 1-В, боратный буфер, 25°С. рН 9,0).

ПОЛ

N соеди- % ингибирования при 30 цМ 1С», цм

нения 'ВНР Fe3+ (Fe3)

18 30,8 ± 1,5 87.4 ±2,3 3,8 ±0.2

19 38,3 ±8,3 89,7 ±3,4 3,9 ± 1,3

20 26,5 ± 2,6 83,9 ± 1,0 6,2 ± 0,2

22 26,8 ± 5,0 82,1 ± 1,4 4,2 ± 0,1

Таблица 3 Ингибирование in vitro ПОЛ гомогената мозга крыс соединениями 18-20 и 22 (ПОЛ, индуцированное 1,6 мМ трет-бутилгидропероксида ('ВНР) и 0.5 мМ Fe(NH4)(S04)2).

I . I I

18 19 20 22

Результаты исследования in vitro ПОЛ гомогенатов мозга крыс в присутствии 18-20, 22 показали, что при концентрации 30 цМ данные соединения ингибируют ПОЛ, индуцированное /нре/п-бутилгидропероксидом ('ВНР) на ~ 30%. Однако важно отметить, что при индукции ПОЛ с использованием Fe"+ процент ингибирования 50% наблюдается при концентрациях < 6 цМ и достигает максимума (-90%) при концентрациях 30 рМ (Табл. 3).

Несомненным лидером по совокупности методов является, таким образом, соединение 19 - структурный аналог ионола (3).

2.4. Фосфорсодержащие элементоорганичеекие соединения

В качестве элементоорганических соединений исследованы 2fi-jw-mpem-бутилфенолы с фосфонатными и фосфинатными группами (26-42). Данные представлены в Таблице 4.

Показано, что максимальной активностью обладают соединения 27, 28 и 42. Результаты ДФПГ-теста свидетельствуют о том, что большинство соединений не являются выраженными «ловушками» свободных радикалов. В эксперименте с генерацией гидроксильного радикала все соединения малоактивны. Однако результаты CUPRAC-теста показывают, что фосфонаты и фосфинаты участвуют в процессе восстановления ионов меди и являются переносчиками электрона, а также эффективно ингибируют неферментативное пероксидное окисление линолевой кислоты (до 95,4% для 30) (Табл. 4).

Соединения синтезированы под руководством к.х.н. A.A. Прищенко на кафедре органической химии Химического факультета МГУ имени М В Ломоносова и использованы для дальнейших исследований.

ЯК^Мез. Я - Я"= ОЕ1 (26); 1?=н, К - К"= 0Е1 (27); Я=Н, Г= Я"= ОН (28); Я О Я=ОН. Г= ОН (29); Я=Н. Я'= ОН, Я"= (СН2)2Р11 (30); '-^р. Я=ОН, Я'=ОН, Я"=(СН2)2И1 (31); Я=Н, Я'= ОН, Я"= (СН2)2Ру-2 (32); й" Я=ОН. К'=ОН,К"=(СН2)2Ру-2 (33); Я=Н, Я^ОН, а"=(СН2)2Ру-4 (34);

26-36

)=/ рОЕ,Ь

Вы'

37

Я=ОН. Я'=ОН, Я"=(СН2)2Ру-4 (35); Я=Н, Я'= ОН, Я"= СН(ОН)Ру-3 (36).

,Р(ОЕ1|г

гЮЕШ

(ЕЮ)А &

/V

он ' ^он

н д-он о он

39

Я=Н (40); Я-ОН (41)

42

Таблица 4. Параметры активности фосфорорганических соединений (26-43) по данным различных методов.

N соединения ДФПГ -тест ЁСчь цМ СИРИАС -тест ТЕАС ОН* активность, % о2 Юзо, цМ н2о2 ЕС зо, цМ пероксидное окисление линолсвой кислоты** ингибирование, %

26 >500 0,66 ± 0,09 19,7 ±4,6 51,6 ± 9,2 237,5 ±35,1 54,3 ± 17,1

27 203 ±31 1,03 ±0,08 14,4 ±0,9 > 100 170,7 ± 18,3 39,4 ± 6,2

28 >500 0,90 ±0,12 18,2 ± 1,3 > 100 83,3 ± 14,8 68.0 ±2,1

29 >500 0.91 ±0,13 3,7 ± 1,4 > 100 207,1 ±23,6 30,0 ± 1,7

30 >500 0,64 ± 0,05 20,2 ± 6,8 > 100 171,7 ± 21,0 95.4 ± 0,2

31 >500 1,03 ±0,14 14,1 ± 1,0 100,1 ±6,8 262,6 ± 10,2 77,5 ± 5,5

32 >500 0,86 ± 0,09 16,4 ± 1,8 96,0 ± 2,3 >500 62,9 ± 1,8

33 >500 1,27 ±0,29 26.1 ±2,1 > 100 >500 48.7 ±5,6

34 >500 0.68 ± 0,09 12,6 ± 1,5 > 100 143,9 ± 17,4 77.5 ± 0,4

35 >500 0,87 ±0,10 9,6 ± 1,6 > 100 >500 70,8 ±1,3

36 >500 0.90 ± 0,06 15,6 ±3,0 > 100 134.5 ±8,2 85.7 ±0,4

37 >500 - - - - -

38 >500 1,11 ±0,05 11,9 ± 0,3 > 100 181,1 ±23,1 45,1 ±6,3

39 >500 0,27 ± 0,02 8,6 ± 1,9 > 100 288,4 ±30,0 9,4 ± 2,9

40 >500 0.96 ±0,11 12,7 ±2,8 > 100 218,2 ± 17.4 60.2 ±5,8

41 >500 1.08 ±0.07 30,3 ± 0,2 > 100 314,6 ±21.9 73.8 ± 1,7

42 120 ±9 0,95 ±0,10 5,3 ± 2,8 > 100 68,2 ±2,4 40,3 ± 5,8

43 >500 1,09 ±0,08 11,1 ±0,6 79,1 ± 12,0 136,4± 10,0 39,4 ± 7,7

11 активность при концентрации соединений 1,2 мМ; ** % ингибирования при концентрации соединений 2 мМ.

Эфир дифосфоиовой кислоты (30) проявил крайне высокую активность как ингибитор ПОЛ митохондрий печени крыс, индуцированном FeJ+ (IC50 =1,1 цМ)> что, по-видимому, свидетельствует о преимущественном вкладе редокс-маршрута в механизм его действия.

Для водорастворимой дифосфоновой кислоты (28) была проведена серия экспериментов по определению

выживаемости культуры клеток гранулярных нейронов мозжечка (МТТ-тест) в модели окислительного стресса, индуцированного различными дозами треот-бутилгидропероксида ('ВНР) (Рис. 4). При концентрации 28 и 'ВНР 12,5 цМ наблюдается максимальный протекторный эффект дифосфоновой кислоты.

Таким образом, фосфонаты и фосфинаты могут представлять интерес с точки зрения поиска физиологически активных соединений, обладающих высокой антиоксидантной активностью и способных выступать в роли цитопротекторов.

2.5. Металлоорганическне соединения на основе ферроцена

Введение ферроценила в качестве редокс-активного заместителя в молекулу 2.6-ди-огрет-бутилфенола является одним из способов реализации идеи создания полифункциональных антиоксидантов. В настоящей работе исследована серия соединений с различными линкерами между 2,6-ди-лг/?ен/-бутилфенолом и ферроценом , что позволило оценить (Табл. 5) следующие факторы:

1) роль 2.6-ди-пгргпг-бутилфенольной группы;

2) роль редокс-активного центра ферроцена;

3) влияние природы линкера.

Доказано, что соединения, содержащие фенол, намного активнее, чем их фенильные аналоги как в ДФПГ- и CUPRAC-тестах, так и в пероксидном окислении линолевой кислоты (для фенильных аналогов характерны реакции только с участием ферроценового центра), (Табл. 5).

Соединения ферроценового ряда были получены в лабораториях биоэлементоорганической химии и физической органической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством к.х.н. H.H. Мелешонковой и использованы для дальнейших исследований.

120

0 12,5 50 ,внс, цм

Рис. 4. Выживаемость культуры клеток гранулярных нейронов мозжечка при различных концентрациях соединения 28 в условиях 'ВНР -индуцированной

токсичности.

Таблица 5. Параметры активности соединений, содержащих фрагмент ферроцена, (44-60) по данным различных методов.

N соединения ДФПГ -тест ЕС so, цМ CIIPRAC -тест ТЕАС ОН* активность, % о2" %от контроля и2о2 активность, % пероксиднос окисление лииолевой кислоты** ингибирование. %

44 29,3 ± 1,2 0,67 ± 0,03 4,1 ± 1,3 115,9± 1,3 76,5 ± 8,3 42,8 ± 3,2

45 >300 0.30 ±0.01 1,8 ±3,8 18,7 ± 1,9 62,5 ± 5,2 23.1 ± 1,5

46 80,5 ±2.1 0.68 ± 0.04 3,2 ± 9,2 82,8 ±3,5 78,0 ±7,1 79,4 ± 3.9

47 >300 0,22 ±0.01 1,2 ± 2,1 85,9 ±6,5 75,0 ± 8,6 15,0 ±8,7

48 137.5 ± 8.6 0,49 ± 0.03 5,6 ±5.0 103,5 ±9.1 57,2 ± 2,6 73,4 ± 11.4

49 >300 0,19 ±0,05 26,3 ± 1,0 107,5 ±4,9 29,1 ± 8,3 43,9 ± 11,6

50 120,8 ±3,5 0,61 ±0,01 18,3 ± 1,4 103,4 ± 1,2 72,2 ± 4,4 1,9 ±4,2

51 >300 0,57 ± 0.04 13,6 ±5,4 65,9 ± 5,4 37,9 ± 2,4 7,3 ± 6,7

52 64,9 ± 1.4 1,15 ± 0.10 0,3 ± 5,0 106,6 ± 5.9 49,4 ± 6,5 84,4 ±4,9

53 >300 0,29 ± 0.02 4.4 ± 2,5 103,6 ±0,7 30,1 ±4.3 24,5 ±4,1

54 И 9,3 ±2,8 2,05 ±0,10 23,4 ± 1,5 101,2 ±0,4 38,5 ±2,9* 52,9 ± 2,1*

55 125,3 ±4,6 1,89 ±0,18 9,2 ± 5,1 101,9 ± 1,6 33,4 ±2,1' 28,4 ±7,3'

56 >300 0,25 ± 0,05 2,1 ± 5,1 91,4 ±3,9 33,0 ±6,8' 25,6 ± 9,2s

57 >300 2,44 ± 0,20 4,5 ± 1,8 75,5 ±2,0 27,4 ± 5,0f 34,8 ± 7,6'

58 >300 2,19 ± 0.10 1,6 ±4,2 107,6 ± 1.9 23,5 ±2,6t 22,5 ± 9,3s

59 >300 0,65 ± 0.08 2,2 ±7.8 104,7 ±4.1 27,0 ± 7,2+ 6,9 ±4,4'

60 >300 0.87 ±0,12 12,9 ± 5,4 101,2± 6,6 71,7 ±2,2' 22,8 ± 9,9{

* активность при концентрации соединения 100 цМ; ** % ингибирования при концентрации соединения 1,6 мМ: * % ингибирования при концентрации соединения 150 цМ: 1 % ингибирования при концентрации соединения 214 цМ.

Изучение общей in vitro антиоксидантной активности в процессе ПОЛ гомогената мозга крыс для соединений 44-49 показало, что соединения, содержащие группу 2,6-ди-ш/гет-бутилфенола, представляет

значительный интерес по сравнению с их фенильными аналогами (Рис. 5) и могут рассматриваться как

перспективные антиоксиданты.

120

100

g 80 3.

g 60 у

40 20

44 45 46 47 43 49

Рис.5. Значения IC50 в процессе ПОЛ гомогената мозга крыс для соединений 4449

Для соединений 44 и 48. в молекулах которых существует единая система сопряжения «ферроцен-линкер-фенол», наблюдается высокая эффективность антиоксидантного действия (ІС50 составляет 3,7 и 3,9 цМ для 44 и 48 соответственно). Полученные значения ІС50 подтверждают несомненное преимущество комбинирования фрагментов фенола и ферроцена в одной молекуле (ІС50 для изолированных 2,6-ди-игреш-бутил-4-метилфенола и ферроценов 45 и 49. составляют 60,1. 70,4 и 47,8 цМ соответственно). Столь значительное повышение активности объясняется, как было показано, возможностью внутримолекулярного переноса электрона между двумя редокс-активными центрами - 2,6-ди-ш/?еш-бутилфенолом и ферроценом, что обусловливает синэргизм действия.

Таблица 6. Значения ІС50 ферроценсодержащих ингибиторов липоксигеназы LOX 1-В

№ соединения 1С50, ЦМ Заместитель R

58 18,6 ± 0,4 -О

59 37,8 ± 1,2 -О1

60 18,5 ±0,7

,'Ви

48 89,8 ± 12,2 -^VOH

\u

Выявлена зависимость структура-!

объема заместителя.

В ряду исследуемых соединений влияние на фермент липоксигеназа оказывают несколько соединений, имеющие структуру халкона и отличающиеся только заместителем в пара-положении фенильного кольца (Табл. 6).

.: величина ІС50 растет с увеличением

2.6. Комплексы металлов с диппколиламином, содержащим 2,6-аи-трет-бутилфенол

Сочетание в одной молекуле антиоксидантной 2,6-ди-/я/>еяг-бутилфенолыюй группы в лиганде и биогенного металла, способного менять степень окисления, открывает возможность для создания полифункциональных систем с различным механизмом действия*.

р^ОСОМе У^ОСОМе

М = 2г1 (62); Ре (63); Си (64); Со (65); Мп (66); N1 (67).

но-\_/

М = гп (68); Ре (69); Си (70); Со(71);Мп(72);№ (73).

Таким образом, исследуемая серия соединений позволяет не только оценить вклад иона металла, но и проследить изменение активности в зависимости от природы металла и лиганда X (С1, ОСОМе) (Табл. 7.)

Таблица 7. Параметры активности комплексов металлов с диппколиламином, содержащим

2,6-ди-упре/н-бутилфенол (61-73), по данным различных методов.

N ДФПГ СГРИАС ОН* о2- н2о2 пероксианое окисление

соеди- -тест -тест линолевон

нения кислоты**

(М) ес5„. цМ теас активность, % 1с50, цМ есэо, цМ ингибирование. %

6И-) 52,1 ± 1,0 0,24 ± 0,04 33,7 ± 2,4 - >500 53,9

62 (гп) >500 0,07 ± 0,08 36,1 ± 1,2 90,9 >500 49,4

63 (Ре) 104,3 ± 1,1 0,77 ± 0,08 4,2*** 15,0 >500 29,0***

64(Си) >500 0,08 ± 0,01 0 1,0 160,9 33,2

65 (Со) 228,5 ± 5,0 0,07 ± 0,02 0,3 **** 80,6 > 500 27,2***

66 (Мп) 74,5 ± 2,0 0,17 ±0,05 16,7 2,1 263,8 60,1

67 (№) 451,7 ±9,4 0,09 ±0,01 22,8 - 122,6 19,7

68(гп) 351,3 ±5,9 0,09 ± 0,08 3,9 - 241,6 45,5

69 (Ре) >500 0,31 ±0,04 18,1 ±2,4 - 94,1 37,9

70 (Си) >500 0,11 ±0,07 16,9 2,0 208,0 40,1

71 (Со) >500 0,09 ± 0,02 6,0 ± 1,2 - 264,9 60,8

72 (Мп) 41,8 ±0,5 0,18 ±0,01 26,5 ± 1,2 0,5 298,6 47,7

73 (№) >500 0,08 ± 0,02 11,4 ±7,8 - 90,5 46,0

* активность при концентрации соединения 2 мМ; ** % ингибирования при концентрации соединения 2 мМ;

* * * % ингибирования при концентрации соединения 0,2 мМ; **** % ингибирования при концентрации соединения 0,1 мМ.

Соединения синтезированы в лаборатории биоэлементоорганической химии кафедры органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством к.х.н. Д.Б. Шпаковского и использованы для дальнейших исследований.

Из полученных данных (Табл. 7) следует, что потенциальной антирадикалытй активностью обладают комплекс железа (63), комплексы марганца (66 и 72) и лиганд (61), причем лиганд является наиболее активным антиоксидантом по результатам ДФПГ-теста. В CUPRAC-тесте значимой активностью в ряду всех исследуемых соединений обладают только комплексы железа (63 и 69). При изучении взаимодействия соединений с Н202 обнаружено, что исходный органический лиганд (61) не проявляет активности. В ряду комплексов независимо от лиганда X наименее низкие значения ЕС50 получены для соединений Ni (122,6 цМ (67) и 90,5 рМ (73) соответственно). Из сравнения активностей хлоридов и ацетатов следует, что последние являются более активными в процессе распада Н2О1, что связано, по-видимому, с их большей гидрофильностью.

Все исследованные комплексы являются ингибиторами фермента липоксигеназа и имеют значения IC50 в области 16-41 цМ. В данном ряду наиболее эффективным ингибитором является комплекс Си (64), а наиболее слабым - комплекс Zn (62). При этом, важно отметить, что лиганд 61 не оказывает влияния на активность фермента LOX 1-В.

В качестве моделей клеточных и митохондриальных мембран для изучения пероксидного окисления были использованы малые одноламеллярные (однослойные) липосомы из фосфатидилхолина (80%) и 1,Г,2,2'-тетраолеилкардиолипина (20%) . Комплексы Мп 66 и 72 являются наиболее активными ингибиторами окислительной деструкции липосом, представляющих интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов. Соединение 72 является несомненным лидером, его значение IC50 составляет 21,0 цМ, что ниже, чем для тролокса (1) (1С50 = 98,3 цМ) и ионола (3) (IC50 = 29,3 цМ).

2.7. Ннтроннлнитроксильпые радикалы и комплексы меди (II) на их основе

В работе исследована серия нитронилнитроксильных радикалов 76 и 77, их диамагнитных предшественников 74 и 75, а также комплексов Си (78 и 79)+.

н

R - Н (74); Me (75) R = Н (76); Me (77) R = Н (78); Me (79)

Для диамагнитных предшественников нитроксильных радикалов (74 и 75), содержащих ОН-группу, способную к транспорту атома водорода, проведен ДФПГ-тест.

Липосомы получены на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова под руководством д.х.н. проф. Ярославова A.A. и предоставлены для дальнейших исследований. t Соединениня синтезированы в Международном томографическом центре СО РАН (г. Новосибирск) под руководством член-корр. РАН В.И. Овчаренко и переданы для дальнейших исследований.

Сравнение соединений 74 (ЕС50 = 58,0 рМ) и 75 (ЕС50 = 55,5 рМ), отличающихся заместителем в кольце имидазола показало, что соединение 75, содержащее дополнительную метальную группу, более активно.

Определение активности в реакции с 'ОН подтверждает обнаруженную закономерность - нитронилнитроксильный радикал с метальным заместителем более активен, как и комплекс Си (79) с данным лигандом. Аналогичные результаты получены и в С иРЯАС-тесте. По отношению к О2" сами радикалы оказались неактивны, а для комплексов Си также отчетливо проявляется влияние СНз группы (1С50 составляют 8,7 ± 0,8 и 4,4 ± 0,5 цМ для 78 и 79 соответственно).

Для комплексов Си 78 и 79 в работе проведены детальные исследования процесса ингибирования фермента липоксигеназы. Определение типа ингибирования фермента показало, что комплекс с лигандом, содержащим метальный заместитель, является неконкурентным ингибитором, а комплекс с лигандом без метального заместителя — конкурентным (Табл. 8). Полученный результат позволяет предположить, что изменение структуры (увеличение размера молекулы и пространственного расположения заместителя) приводит к полной смене типа ингибирования.

Таблица 8. Параметры ингибирования ЬОХ 1-В в присутствии комплексов 78 и 79.

Концентрация, 1С50, К * V * ' тих Тип

рМ рМ 10" моль-л"1 10"5 моль-л"'-с"' ингибирования

78 29.2 ±4.7 Конкурентный

0 0.040 8.4

12.5 0.113 7.8

20 0.156 7.5

30 0.200 7.2

79 20.1 ±3.9 Неконкурентный

0 0.040 8.4

12.5 0.039 4.7

20 0.039 3.1

30 0.039 2.0

Кт— константа Михаэлиса, !'„,„,- максимальная скорость ферментативной реакции

С целью интерпретации полученных экспериментальных данных о типе ингибирования был проведен молекулярный докинг' для соединений 78 и 79 (Рис. 6). Показано, что для обоих соединений характерно расположение в гидрофобном кармане активного центра.

Молекулярный докинг осуществлен к.х.н. Осолодкиным Д.И. на кафедре органической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

(а) (б)

Рис. 6. Результаты докинга соединений (а) 78 и (б) 79 (указаны расстояния между атомами Си (зеленый цвет) и атомом Ие (красный цвет) в 78 (7,37 А) и 79 (9,15 А) в активном центре).

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что предшественники нитронилнитроксильных радикалов соединения 74, 75 являются «ловушками» свободных радикалов. Нитронилнитроксильные радикалы 76, 77 малоактивны в реакциях с активными метаболитами кислорода, а комплексы меди 78, 79 активны по отношению к супероксид анион-радикалу, а также являются перспективными ингибиторами липоксигеназы.

2.8. Комплексы редокс-неактивных металлов с радикальными лигандами

С целью изучения влияния парамагнитного центра в органическом лиганде комплекса редокс-неактивного металла исследованы комплексы БЬ, Са, 1п, ве, 8п с сртио-семихинонами 83-86. а также их катехолатные аналоги 80-82 .

80 81 82 М — Ga (83); Ge (84); ln (85) Sn (86)

Соединения 80-82 активно восстанавливают стабильный радикал ДФПГ и имеют значения ЕС50 3 6,2 ± 0,7 (80); 56,5 ± 0,6 (81) и 54,0 ± 0,3 (82) рМ соответственно. В то же время комплексы 83-86, в лиганде которых присутствует свободный радикал, проявляют незначительную активность в ДФПГ-тесте.

* Комплексы синтезированы в Институте металлоорганической химии имени Г.А. Разуваева РАН (г. Нижний Новгород) под руководством член-корр. РАН В.К. Черкасова и переданы для дальнейших исследовании.

Можно высказать предположение о том, что механизм взаимодействия комплексов сурьмы 80-82 определяется возможностью реакции радикального замещения в лигандном окружении металла. Соединения 80-82 являются эффективными ингибиторами пероксидного окисления линолевой кислоты и имеют следующие значения ЕС50: 1,06 ± 0,04 (80); 2,95 ± 0,40 (81) и 1,25 ± 0,30 (82) мМ.

В СиРЯАС-тесте соединения 80, 81, 84 и 86 проявили активность, равную или превышающую таковую для тролокса как эталона (значения ТЕАС близки к 1, Рис. 7).

1.4

80 81 84 86

Рис. 7. Результаты СиРЯАС-теста для соединений 80. 81, 84 и 86 (25°С, ацетатный буфер. рН 7.0. 30 мин).

Изучение влияния комплексов ЭЬ. Оа, 1п. Ос и Бп на активность фермента липоксигеназа показало, что для соединений 80-82. 83 и 86 характерны высокие значения 1С5о( > 150 цМ). Значение ГС50 для комплекса 1п (85) составляет 12.1 ± 0,8 рМ, что позволяет рассматривать данное соединение как потенциальный ингибитор липоксигеназы.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что комплексы сурьмы 8082 являются активными антиоксидантами и способны взаимодействовать с активными метаболитами кислорода. В свою очередь комплексы 83-86, несмотря на имеющийся радикальный фрагмент, в целом не проявляют свойств «ловушек» свободных радикалов, однако комплексы Ое (84) и Яп (86) активно восстанавливают ион меди в СиРКАС-тесте, и могут представлять интерес в качестве редокс-ингибиторов АМК.

2.9. Комплексы сурьмы — ингибиторы липоксигеназы

Известно, что комплексы сурьмы представляют интерес как физиологически активные вещества, способные встраиваться в белковые молекулы, выступая в качестве ингибиторов различных ферментов

В работе изучено влияние серии комплексов сурьмы 87-96 на активность фермента ЬОХ 1-В с целью отбора потенциальных ингибиторов липоксигеназы. участвующих в патогенезе воспалительных и опухолевых заболеваний. Выбор гетероциклических лигандов, содержащих как атомы N. так и атомы Б, обусловлен их собственной физиологической активностью, в том числе, и в процессе канцерогенеза.

хх х

/ \ Н Н н н

\__NH ^ Ч^ % Т^

NN НМ

С-5

Х-1(87);Вг(88) X - I (89); В1 (90) Х= I (91); В| (92)

н н , ,

N X X N................I

>41

< II (

^ О" Т1

н

X = I (93); Вг (94) X = 1 (95); Вг (96)

В ряду исследуемых комплексов БЬ наиболее активными ингибиторами ЬОХ 1-В являются соединения 91 (1Сзо = 23,5 ± 4.7 цМ) и 95 (1С5о = 17,1 ± 1,6 цМ). Данные, полученные при определении типа ингибирования для комплексов 91 и 95 графически в координатах Лайнуивера-Берка, показывают, что комплексы ингибируют фермент липоксигеназа по типу бесконкурентного ингибирования.

Результаты сравнительного аналнза активности с использованием сетевой структуры методов оценки

Предложенный в работе комплексный подход для оценки антиоксидантной активности соединений, содержащих различные реакционноспособные центры, позволяет выявить вещества-лидеры.

Использование сетевой структуры методов оценки активности предполагает перекрестное сопоставление результатов (Табл. 9), полученных для различных серий соединений в соответствии с тремя основными маршрутами реакционной способности:

(1) антирадикальная активность,

(2) редокс-активность,

(3) связывание с белковой мишенью.

Соединения 87-96 получены на химическом факультете Университета Иоаннины (Греция) под руководством проф. С. Хаджикакоу и переданы для дальнейших исследований в рамках межвузовского сотрудничества.

Таблица 9. Соединения-лидеры по данным сетевой структуры методов тестирования.

ПОЛ (модельные процессы) in vitro ПОЛ (биологические процессы) Взаимодействие с АМК Ингибирование LOX

19, 30. 46. 48. 52. 66. 72. 80, 81. 82 18,12- М 44 48 22, 52, 54. 55. 64. 66, 72, 78. 79 58, 22 85- 89

ингибироваине 52% . ICso = 3,9 цМ J

11

ингибирование 95% ICso = 1Д («М Ви'ч \ о но—? у-^| ^—он Х>=/ 1 (CH2)2Ph / о^^учж В" <CH2)2Ph 30

ингибирование 73% Ви', ICso = 3,9 цМ он - -

^^—Ч / Fe -Л \ / Ви 48

ингибирование 84% ** А он 52 ТЕАС= 1,15 ^ А Bu'-'VSu он 52

ингибирование 60% - ICso = 2,1 цМ -

Ви'ч_ p^ljl .CI ^ГТ- 8и' и 66 «^гпч, Bu' II ^ 66

1С50 = 21 JJM - ICso = 0,5 цМ ICso = 25 рМ

f^¡1 Ви'ч__ p^i^OCOMe Ви' V Ч 72 Ви'ч__ p^^J^OCOMe но-у^ГТ-осом. " U 72

- - ICso = 4,4 цМ Н N ICso = 20 ММ

Си/' АА i 1 \ 2 NO-/ чУ Кч / "Х- 72

Полученные данные позволяют выбрать несколько наиболее перспективных соединений, представляющих интерес для дальнейших исследований:

АНТИОКСИДАНТ НЕЙРОПРОТЕКТОР

Ви'\ Н II НО-/ У-г" | "^ОН Ви о==5|\~-0Н (СН2)гРИ ¡4ОН \ \

СТАБИЛИЗАТОР ЛИПОСОМ ИНГИБИТОР ЛИПОКСИГЕНАЗЫ

"'и / У^Ы—Мп в, -НГ гк / \ 2 N03 N Н

Выводы

1. Предложен новый подход к разработке сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов, основанный на принципе «механизм - метод».

2. С использованием предложенной комплексной системы тестирования показано, что введение в 2.6-ди-и;реш-бутилфенолы элементоорганической группы (фосфонатные и фосфинатные), металлоорганического фрагмента (ферроцен) и металлосодержащего координационного узла (комплексы дипиколиламина) приводит к существенному возрастанию общей антиоксидантной активности по сравнению с известным органическим антиоксидантом ионолом.

3. В ряду ферроценов с 2,6-ди-лг/>ет-бутилфенольным заместителем выявлен эффективный ингибитор пероксидного окисления липидов гомогенатов мозга крыс со значением 1С50 = 3.9 рМ, что позволяет проводить на их основе поиск веществ нейропротекторного действия.

4. Обнаружены комплексы Мп с дипнколиламиновым лигандом, содержащим 2,6-ди-трет-бутилфенол, - высокоэффективные стабилизаторы однослойных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и кардиолипина, представляющих интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов.

5. При изучении фермента липоксигеназа (ЬОХ 1-В) и проведении молекулярного докинга найден новый ингибитор ЬОХ 1 -В - комплекс Си с нптронилнитроксильными радикалами, значение 1Сзо для которого составляет 20 рМ.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Е.Р. Милаева, Н.Н. Мелешонкова, Д Б. Шпаковский, В В. Павловец, С.И. Орлова, Д.И. Осолодкии, В.А. Палюлии, С В. Логинов, П.А. Стороженко, Н С. Зефиров. Политопный дипиколиламиновын комплекс цинка, содержащий фрагмент ферроцена, - новый ингибитор липоксигеназы LOX I-B. Доклады академии наук, 2012, том 443, № 2, с. 186— 188.

2. I. Ozturk, А.К. Metsios, S. Filimonova-Orlova, N. Kourkoumelis, S.K. Hadjikakou, M. Manos, A.J. Tasiopoulos, S. Karkabounas, E.R. Milaeva, N. Hadjiliadis. Study on single costal structure of the antimony(III) bromide complex with 3-methyl-2-mercaptobenzothiazoIe and biological activity of some antimony(lll) bromide complexes with thioamides. Medicinal Chemistry Research, 2012, vol. 21. p. 3523-3531.

3. Е.Р. Мнлаева, С.И. Орлова, Д.И. Осолодкии, В.А. Палюлин, Е Ю. Фурсова, В.И. Овчаренко, Н С. Зефиров. Комплексы меди с нитронилнитроксильными радикалами -ингибиторы липоксигеназы с антпоксндантной активностью. Известия Академии наук. Серия химическая, 2011, № 12, с. 2514-2521.

4. E.R. Milaeva, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), B.N. Tarasevich, А.А. Prishchenko, M.V. Livantsov, O P. Novikova, L.I. Livantsova, L.G. Dubova, E.F. Shevtsova. Novel antioxidants based on phosphonates bearing 2,6-di-/e/f-butylphenol. EUROBICW Proceedings, Medimond Publ., Italy, 2010, p. 15-23.

5. E.R. Milaeva, S.I. Filimonova (С.И. Орлова), L.G. Dubova, E.F. Shevtsova, S O. Bachurin. N.S. Zefirov. Antioxidative activity of ferrocenes bearing 2,6-di-fcrt-butylphenol moieties. Bioinorganic ChemisUy and Applications, 2010. vol. 2010, ID 165482, 6 pages.

6. 1. Ozturk, S. Filimonova (С.И. Орлова), S.K. Hadjikakou, N. Kourkoumelis, V. Dokorou, M.J. Manos, A.J. Tasiopoulos, MM. Barsan, I S. Butler, E.R. Milaeva, J. Balzarini, N. Hadjiliadis. Structural motifs and biological studies of new antimony(III) iodide complexes with thiones. Inorganic Chemistry, 2010, vol. 49, No. 2, p. 488-501.

7. В В. Павловец, С.И. Орлова. Д Б. Шпаковский, Н.Н. Мелешонкова, Е.Ф. Шевцова, Е.Г. Киреева, Л.Г. Дубова, Е.Р. Милаева. Физиологическая активность новых дипиколиламиновых комплексов металлов. XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 25-30 сентября, 2011, Волгоград, Россия, Т. 1, с. 564.

8. С.И. Орлова. Ю.А. Грачева, В.Ю. Тюрин, Е.Ф. Шевцова, Е.Р. Милаева. Комлексное т vitro биотестирование антпоксндантной активности перспективных физиологически активных веществ. XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, 25-30 сентября, 2011, Волгоград, Россия, т. 4, с. 383.

9. S.I. Orlova, N N. Meleshonkova, E.R. Milaeva, E.F. Shevtsova. The antioxidative activity mechanism of 2,6-di-im-butylphenol containing ferrocenes. 41'1 European Conference on Chemistry for Life Sciences (4ECCLS), Aug. 31- Sept. 3, 2011, Budapest, Hungary, p. 112.

10. Е.Р. Милаева, С.И. Орлова, Е Ю. Фурсова. Е В. Третьяков. В.И. Овчаренко. Комплексы меди с нитронилнитроксильными радикалами как ингибиторы липоксигеназы. XXV Международная Чугаевская конференция по координационной химии, 6-11 июня 2011, Суздаль, Россия, с. 472.

11. Y.A. Gracheva, D.B. Shpakovsky, S.i. Filimonova (С.И. Орлова), E.R. Milaeva, Multifactor antioxidative activity assay of dipicolylamine metal complexes. XI International Symposium on Bioinorganic Chemistry, 4-8 September, 2010, Kudowa Zdroj, Poland, P18.

12. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, S.i. Filimonova (C.ii. Орлова), Yu.A. Gracheva, E.F. Shevtsova, S O. Bachurin, N.S. Zefirov. Novel metal-based antioxidants - potential therapeutic candidates for prevention the oxidative stress. XI International Symposium on Bioinorganic Chemistry, 4-8 September, 2010, Kudowa Zdroj. Poland, 2010. L17.

13. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky, S.i. Filimonova (C.ii. Орлова), Y.A. Gracheva, E.F. Shevtsova, S.O. Bachurin, N.S. Zefirov. Novel metal based antioxidants as protectors against the oxidative stress. 10 European Biological Inorganic Chemistry Conference, 22-26 June, 2010, Thessaloniki, Greece, SL07.

14. S.i. Filimonova (C.ii. Орлова), Yu.A. Gracheva, E.F. Shevtsova, E.R. Milaeva. The impact of membrane active synthetic antioxidants on in vitro and ex vivo lipid peroxidation level and lipoxygenase activity. Third Europian Workshop on Lipid Mediators. Paster Institute, June 3-4, 2010, Paris, France, p. 113.

15. E.R. Milaeva, D.B. Shpakovsky. Zhang Jingwei, S.i. Filimonova (С.и. Орлова), E.F. Shevtsova, S O. Bachurin. N.S. Zefirov. Biomimetic metal based antioxidants as protectors of the oxidative stress. Is' Turkish-Russian joint meeting on organic and medicinal chemistry, October 14-17, 2009, Turkey, p. 27.

16. S. Filimonova (C.ii. Орлова). I.I. Ozturk, E.R. Milaeva, N Kourkoumelis. S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis. Biological studies of new antimony(III) iodide complexes with thioamides. The Russian Conference "Chemistry of Organoelement Compounds: Results and Prospects", devoted to 110th anniversary of academician A.N. Nesmeyanov, September 28 - October 2, 2009, Moscow, Russia, p. 290.

17. E.P. Милаева, Д.Б. Шпаковский, С.и. Филимонова (C.ii. Орлова), Е.Ф. Шевцова, С.О. Бачурии, Н С. Зефиров. Новый подход к созданию протекторов окислительного стресса на основе комплексов металлов. XXIV Международная Чугаевская конференция по координационной химии. 15-19 июня 2009 г., Санкт-Петерб}рг, Россия, с. 115.

18. Е. Milaeva, D.Slipakovsky, Zhang Jingwei, S. Filimonova (C.ii. Орлова), E. Shevtsova, S. Bachurin, Z. Zefirov. Polytopic metal complexes with 2,6-di-/<?i7-butyl phenol pendants in cellular oxidation processes. 9,h European Biological Inorganic Chemistry Conference. 2008, Wroclaw, Poland, P47.

19. S.i. Filimonova (C.ii. Орлова). L.G. Dubova. E.F. Shevtsova, E.R. Milaeva. Antioxidative activity assay of 2,6-di-terf-butyIphenols based on DPPH test and lipid peroxidation in intact mitochondria. International conference on Organometallic and Coordination Chemistry. 2008, N. Novgorod, P27.

20. H.T. Берберова, В.П. Осипова, M.H. Коляда, Н А. Антонова, Н С. Зефиров, Е.Р. Милаева, С.и. Филимонова (С.и. Орлова), Ю.А. Грачева, А.А. Прищенко, М.В. Ливанцов, Л И. Ливанцова, О.П. Новикова. Способ снижения уровня пероксидного окисления лнпидов. Патент № RU 2405032 С1. МПК СИВ 5/00 (2006.01). Заявлено 28.05.2009, опубликовано 27.11.2010. Бюл. №33.

Подписано в печать. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 150 Экз. Заказ № 2715 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Введение

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Образование и функционирование активных метаболитов кислорода

1.2. Количественное определение содержания активных метаболитов кислорода

1.3. Антиоксидантная активность

1.4. Методы определения антиоксидантной активности

1.5. Сравнение методов оценки антиоксидантной активности

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Синтетические эталонные антиоксид анты

2.2. 2,6-ди-/и/?т-бутилфенолы с гетероциклическими заместителями

2.3. 2- и 2,6-Изоборнилфенолы

2.4. Фосфорсодержащие элементоорганические соединения

2.5. Металлоорганические соединения на основе ферроцена

2.6. Комплексы металлов с дипиколиламином, содержащим 2,6-ди-/яре/я-бутилфенол

2.7. Нитронилнитроксильные радикалы и комплексы меди (И) на их основе

2.8. Комплексы редокс-неактивных металлов с радикальными лигандами

2.9. Комплексы сурьмы - ингибиторы липоксигеназы

2.10. Результаты сравнительного анализа активности с использованием сетевой структуры методов оценки

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 140 3.1. Материалы

3.2. Оборудование

3.3. Определение антирадикальной активности соединений с использованием ДФПГ-теста

3.4. Определение активности соединений в реакции переноса электрона с использованием CUPRAC-теста

3.5. Ферментативное генерирование супероксид анион-радикала 02'" в системе ксантин/ксантиноксидаза

3.6. Оценка способности соединений реагировать с гидроксильным радикалом, генерированном в реакции Габера-Вейса

3.7. Определение антиоксидантной активности по способности соединений взаимодействовать с Н2О

3.8. Оценка антиоксидантной активности соединений в процессе ингибирования неферментативного пероксидного окисления линолевой кислоты

3.9. Оценка антиоксидантной активности соединений в процессе ингибирования окисления олеиновой кислоты

3.10. Определение влияния соединений на активность фермента липоксигеназы

3.11. Определение типа ингибирования фермента липоксигеназы

3.12. Оценка антиоксидантной активности соединений в процессе ингибирования окислительной деструкции липосом

3.13. Оценка антиоксидантной активности соединений в процессе ингибирования in vitro ПОЛ

Выводы

Одной из важных задач медицинской химии на пути создания лекарственных препаратов является отбор перспективных физиологически активных соединений с помощью системы первичного скрининга. На ранних этапах тестирования того или иного вида активности используют модельные реакции и процессы, либо in vitro биохимические системы, максимально приближенные к физиологическим условиям.

В последние годы резко возрос интерес к получению новых веществ, обладающих антиоксидантной активностью. Этот интерес во многом обусловлен массивом экспериментальных данных об участии окислительного стресса организма в патогенезе большого числа заболеваний (рак, диабет, нейродегенерация, ишемия и др.) В организме роль антиоксидантов выполняют низкомолекулярные соединения (а-токоферол, аксорбиновая кислота, глутатион) и ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза), действующие по принципиально различным механизмам и на различные мишени.

При изучении антиоксидантной активности синтетических низкомолекулярных веществ - кандидатов лекарственных препаратов, как правило, выбирается один-два метода определения активности. Такой подход позволяет регистрировать активность в целом, но не дает полного представления о природе антиоксидантного действия конкретного вещества, которое определяется его реакционной способностью. Однако новые синтетические подходы, позволяющие конструировать политопные молекулы с различными реакционными центрами, требуют сочетания различных методов и различных принципов выявления антиоксидантного действия для оценки интегрального вклада каждого из возможных типов активности. Существенным многообразием реакционных маршрутов характеризуются полифункциональные соединения, содержащие в составе молекул атомы металла/элемента. Для таких веществ можно ожидать 4 проявления синергизма антиоксидантного действия за счет участия не только органической группы, но и вовлечения металла/элемента. Получены синтетические аналоги витамина Е, содержащие металл, или, так называемые, «каталитические антиоксиданты» - миметики супероксидцисмутазы, включающие Fe, Мп, Со. И, наконец, введение металла в фенольные миметики а-токоферола, как известно, приводит к стабилизации феноксильных радикалов, ответственных за механизм антиоксидантного действия, и предотвращает нежелательное образование вторичных хиноидных продуктов окисления, обладающих прооксидантным эффектом. В связи с этим возникает необходимость создания сетевой структуры методов оценки, в которой количественные характеристики антиоксидантной активности учитывают все особенности механизмов действия каждого тестируемого вещества.

Целью данной работы является разработка общего подхода для комплексной оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биогенных металлов.

В задачи работы входило: 1) рациональный подбор методов количественного определения антиоксидантной активности, основанных на модельных химических реакциях, с целью выявления основных маршрутов реакционной способности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов металлов; 2) изучение взаимного влияния антирадикального 2,6-диалкилфенольного фрагмента и редокс-активного металлосодержащего центра при оценке общей антиоксидантной активности полифункциональных соединений; 3) применение ряда in vitro методов с использованием в качестве тест-систем липосом, митохондрий и гомогенатов мозга крыс, а также фермента липоксигеназа с целью отбора перспективных кандидатов в ряду элементоорганических соединений и комплексов металлов - полифункциональных антиоксидантов, стабилизаторов мембран и нейропротекторов.

выводы

1. Предложен новый подход к разработке сетевой структуры методов оценки антиоксидантной активности полифункциональных элементоорганических соединений и комплексов биометаллов, основанный на принципе «механизм - метод».

2. С использованием предложенной комплексной системы тестирования показано, что введение в 2,6-ди-//гре/и-бутилфенолы элементоорганической группы (фосфонатные и фосфинатные), металлоорганического фрагмента (ферроцен) и металлосодержащего координационного узла (комплексы дипиколиламина) приводит к существенному возрастанию общей антиоксидантной активности по сравнению с известным органическим антиоксидантом ионолом.

3. В ряду ферроценов с 2,6-ди-/и/>е/и-бутилфенольным заместителем выявлен эффективный ингибитор пероксидного окисления липидов гомогенатов мозга крыс со значением ГС50 = 3,9 ц.М, что позволяет проводить на их основе поиск веществ нейропротекторного действия.

4. Обнаружены комплексы Мп с дипиколиламиновым лигандом, содержащим 2,6-ди-/и/>е///-бутилфенол, - высокоэффективные стабилизаторы однослойных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и кардиолипина, представляющих интерес для создания систем доставки лекарственных препаратов.

5. При изучении фермента липоксигеназа (ЬОХ 1-В) и проведении молекулярного докинга найден новый ингибитор ЬОХ 1-В - комплекс Си с нитронилнитроксильными радикалами, значение 1С5о для которого составляет 20 (хМ.

1. S.V. Avery. Molecular targets of oxidative stress. Biochem. J., 2011, 434, 201.

2. E. Cadenas and K.J. Davies. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med., 2000, 29(3-4), 222.

3. J.D. West and L.J. Marnett. Endogenous reactive intermediates as modulators of cell signaling and cell death. Chem. Res. Toxicol, 2006, 19(2), 173.

4. J. Ling and D. Soil. Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site. Proc. Natl Acad, Sci. USA, 2010,107(9), 4028.

5. E. Novo and M. Parola. Redox mechanisms in hepatic chronic wound healing and fibrogenesis. Fibrogenesis & Tissue Repair, 2008,1(1), 5.

6. P. V. Vignais. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism. Cell Mol Life Sci., 2002, 59(9), 1428.

7. B. Halliwell. The wanderings of a free radical. Free Radic. Biol Med., 2009, 46(5), 531.

8. V.J. Thannickal and B.L. Fanburg. Reactive oxygen species in cell signaling. Am. J. Physiol-Limg C., 2000, 279(6), L1005.

9. R.T. Kolamunne, M. Clare, and H.R. Griffiths. Mitochondrial superoxide anion radicals mediate induction of apoptosis in cardiac myoblasts exposed to chronic hypoxia Arch. Biochem. Biophys., 2011, 505(2), 256.

10. M. Genestra. Oxyl radicals, redox-sensitive signalling cascades and antioxidants. Cell Signal, 2007,19(9), 1807.

11. E.A. Veal, A.M. Day, and B.A. Morgan. Hydrogen peroxide sensing and signaling. Mol Cell, 2007, 26(1), 1.

12. S.E. Munns, J.K.C. Lui, and P.G. Arthur. Mitochondrial hydrogen peroxide production alters oxygen consumption in an oxygen-concentration-dependent manner. Free Radic. Biol Med., 2005, 38(12), 1594.

13. Functional Metabolism: Regulation and Adaptation. Ed. B.S. Kenneth. 2004, Wiley-Liss: New Jersey. 594.

14. G. Buonocore, S. Perrone, and M.L. Tataranno. Oxygen toxicity: chemistry and biology of reactive oxygen species. Semin. Fetal Neonatal Med., 2010, 15(4), 186.

15. S.I. Liochev and I. Fridovich. The Haber-Weiss cycle ~ 70 years later: an alternative view. Redox Rep., 2002, 7(1), 55.

16. J. Platenik, P. Stopka, M. Vejrazka, and S. Stipek. Quinolinic acid-iron(II) complexes: slow autoxidation, but enhanced hydroxyl radical production in the Fenton reaction. Free Radic. Res., 2001, 34(5), 445.

17. B.Z. Zhu, B. Kalyanaraman, and G.B. Jiang. Molecular mechanism for metal-independent production of hydroxyl radicals by hydrogen peroxide and halogenated quinones. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2007, 104(45), 17575.

18. S. De Minicis, R. Bataller, and D.A. Brenner. NADPH oxidase in the liver: defensive, offensive, or fibrogenic? Gastroenterology, 2006,131(1), 272.

19. S. De Minicis and D.A. Brenner. NOX in liver fibrosis. Arch. Biochem. Biophys., 2007, 462(2), 266.

20. P. Chiarugi and T. Fiaschi. Redox signalling in anchorage-dependent cell growth. Cell. Signal., 2007,19(4), 672.

21. W. Droge. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev., 2002, 82(1), 47.

22. R.J. Soberman. The expanding network of redox signaling: new observations, complexities, and perspectives. J. Clin. Invest., 2003, 111(5), 571.

23. P. Chiarugi and P. Cirri. Redox regulation of protein tyrosine phosphatases during receptor tyrosine kinase signal transduction. Trends Biochem. Sci., 2003, 28(9), 509.

24. B. DAutreaux and M.B. Toledano. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2007, 8(10), 813.

25. C.A. Pritsos. Cellular distribution, metabolism and regulation of the xanthine oxidoreductase enzyme system. Chem. Biol. Interact., 2000,129(1-2), 195.

26. M. Rojkind, J.A. Dominguez-Rosales, N. Nieto, and P. Greenwel. Role of hydrogen peroxide and oxidative stress in healing responses. Cell Mol. Life Sci., 2002, 59(11), 1872.

27. II. Esterbauer, R.J. Schaur, and H. Zollner. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med., 1991,11(1), 81.

28. G. Noctor and C.H. Foyer. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Phys., 1998, 49, 249.

29. Э.Д. Эллиот В., Биохимия и молекулярная биология, Москва: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002, 446.

30. A. Gomes, E. Fernandes, and J.L. Lima. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J. Biochem. Biophys. Meth., 2005, 65(2-3), 45.

31. K. Girard-Lalancette, A. Pichette, and J. Legault. Sensitive cell-based assay using DCFH oxidation for the determination of pro- and antioxidant34